JP6158318B2 - 核酸分析装置及びそれを用いた核酸分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、多色に標識された試料を同時検出する核酸分析装置及びそれを用いた核酸分析方法に係り、特に、ＤＮＡ、タンパク等を検出する核酸分析装置及びそれを用いた核酸分析方法に関する。

各種生物であるヒト、動物、植物、または細菌やウィルスの迅速な同定（すなわち、核酸の配列解析、もしくは特徴的なゲノム配列の塩基長解析など）に用いる分析装置には、例えば、キャピラリ電気泳動法を用いたApplied Biosystems 3500 ジェネティックアナライザ（Life technologies社）などがある。

また、解析を容易にするため、完全に集積化された（すなわち、サンプル入力から結果の出力まで集積化された）標的核酸分析のための機器および技術の開発が進められている。

標的核酸配列の分析技術は、最終ユーザーに臨床検査、法医学鑑定などの判断を可能にする。例えば、多くの一般的なヒトの疾病は、全ヒトゲノムを解析するまでもなく標的部位として、約１０００塩基未満のＤＮＡ配列塩基対に基づいて診断することができる。同様に、短鎖縦列反復配列分析(short tandem repeat analysis:以下、ＳＴＲ分析と称する)によって形成される２０個程度の特徴的なゲノム配列の塩基長解析の正確な測定は所与の個体を識別するのに用いられるようになって来ている。

従って、目的に応じて、大学や病院の研究室、患者の脇（ベッドサイド）、または法医学鑑定または環境測定の現場などで、標的核酸分析は様々な条件下で実施することが可能になって来ている。
しかしながら、解析を行うには手作業による煩雑なサンプル調整、あるいは専門的な知識を備えた研究者などによるデータ解析が伴う。

そこで、専門性を軽減し解析を容易にする工夫の例として、ＤＮＡシーケンサを用いた塩基配列解析において、ヘテロ接合によって解釈困難な二重ピークが出現した場合に効率よく解釈する方法が示されている（特許文献１参照）。これは、塩基配列解析時に二重検出されるクロマトグラムを、事前に用意される設定から母・父由来の多型の配列解析を実施する方法である。

特開２００６−８４４７１号公報

上記特許文献１に記載の方法は、ヘテロ接合における多型の配列解析を実施する上では有用であるが、配列解析では無く多重化ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を行い、多色（５〜６色）の蛍光検出を行うＳＴＲ分析では、同じタイミングに多色かつ、お互いのピークの高さの相対比に関係なく真の信号が検出されることも想定される。

しかしながら、上記文献では、プルアップピークによる疑似信号を取り除くことが考慮されておらず、プルアップピークによって誤った解析をすることも考えられ、本来解析すべき真のピークが取り除いてしまう課題が残る。つまり、専門的な知識を有する者が、解析を行わなければ高精度な解析ができないという制約が生じる。

さらに、上述した例の他に、以下に例示するように、データ解析が専門的な知識を備えた作業者によって行わなければばらない場合がある。

たとえば、ＳＴＲ分析は、多くの場合、複数の配列領域を標的とした増幅（多重化ＰＣＲ）を用いて分析する。このような分析は、一般に、生体試料から抽出されたゲノムＤＮＡ濃度を規定し、その規定範囲内において多重化ＰＣＲを実施し電気泳動を行い、得られるシグナルから反復回数を解析し、例えば個人を識別する分析である。このようなシグナルの解析において、ゲノムＤＮＡの量が少なすぎると、対立遺伝子のピーク高さのバランスの乱れ、シグナルが検出閾値以下になったりするという課題がある。

また、試料ゲノムが過剰な場合、増大したスタッター（stutter）、非特異性のバンド生成、不完全な非鋳型添加、およびプルアップピークを含むアーティファクトが生じる場合がある。これらの現象は、ＳＴＲプロファイルの解釈の過ちに結びつく場合がある。

また、複数サンプル解析する上では、シグナル検出を並列化することによりクロストークの影響も考慮しなければならない課題もある。
（１）従って、使用が容易であり研究者のように専門的な知識を有する者を必要としない核酸配列解析および特徴的なゲノム配列の塩基長解析機器が望まれる。
例えば、すべての手動プロセスを省くシステムの要求がある。効果として、少ないトレーニングで済み、例えば、看護師や警察官などの初動対応者が遭遇するような困難な環境を強いられた個人も解析システムを容易に操作することができる。

上述した専門性の軽減の他に、核酸配列解析もしくは特徴的なゲノム配列の塩基長解析には、以下に列挙する改善が求められている。
（２）迅速な解析結果が得られる解析システムが望まれる。
病院などの適切な処置法を決定するための感染病原体配列決定などの臨床用途にとって、患者が急患で到着した後、抗菌性および抗ウィルス性薬物療法での処置を短時間に実施することのできる時間は短時間（例えば、９０分以内）の解析が必要とされる。警察の初動捜査における個人の識別にとって、結果まで望まれる時間は、従来の技術を用いる数日から数週間よりも十分短い時間（例えば、９０分以内）が求められる。これらの用途にかかわらず、短時間での解析可能なデータを形成する必要がある。また、迅速な解析は同時にサンプル処理量を増加させる効果が期待できる。
（３）解析装置の小型化が望まれる。
多くの核酸配列解析システムは研究所全体および関連支援を必要とする。近年登場した、高い処理能力を持つMiSeq(illumina社)、iontrrent PGM(Life technologies社)、FLX（Roche Diagnosis社）などの核酸配列解析システムは設置にベンチ台を必要とするだけであるが、解析に必要なサンプル調整を行うために大きな解析設備を必要としている。例えば、配列解析やＳＴＲ分析は一般的に、生体試料からのゲノムＤＮＡの抽出、濃度調整、核酸増幅法による標的部位の増幅もしくは解析ライブラリーの調整と言ったサンプル調整を行う設備を必要としている。したがって、小型化は研究所および処置場所での使用ならびに現場操作の両方にとって重要である。また、サンプルあたりのコスト低減にとっても重要課題である。

そこで、本発明の目的は、使用が容易で迅速な解析を行い、小型で複数サンプルを受け入れることが可能な核酸分析装置及びそれを用いた核酸分析方法を提供することである。

上記課題を解決するために、本発明になる核酸分析方法の主な特徴は以下の通りである。
（１）複数のＤＮＡ断片を含む分析サンプルに光を照射する工程と、所定の検出時間内に分析サンプルから励起されるＤＮＡ断片に対応する蛍光を撮像素子を用いて検出する工程と、撮像素子が有する蛍光強度の検出可能な範囲内であって、分析サンプルの分析に要求される蛍光強度の下限値を設定する工程と、下限値を基にＤＮＡ断片ごとの蛍光強度を取得する工程と、ＤＮＡ断片ごとに取得された蛍光強度のピークを検出し、該ピークに対応する時間情報を決定する工程と、蛍光強度と時間情報との対応関係をＤＮＡ断片ごとに表示する工程とを有し、表示において、第１の蛍光強度を有する第１のピークと、第１の蛍光強度より弱い蛍光強度を有する第２のピークを含む少なくとも一つ以上のピークとが表示される場合にあって、下限値を所定値を用いて調整し、調整後の下限値を撮像素子が有する下限値として測定した場合の蛍光強度を、第２のピークを含む少なくとも一つ以上のピークの蛍光強度として再設定することで、第２のピークを含む少なくとも一つ以上のピークが疑似信号のピークであるか否か判別することを特徴とする。

また、本発明になる核酸分析装置の主な特徴は以下の通りである。
（２）複数のＤＮＡ断片を含む分析サンプルに光を照射する光照射部と、所定の検出時間内に分析サンプルから励起されるＤＮＡ断片に対応する蛍光強度を撮像素子を用いて検出する検出部と、撮像素子が有する蛍光強度の検出可能な範囲内であって、分析サンプルの分析に要求される蛍光強度の下限値を保存する記憶部と、各部を制御し、演算処理する演算制御部と、演算制御部の結果を表示する表示部とを備え、検出部において、下限値を基にＤＮＡ断片ごとの蛍光強度を取得し、演算制御部は、ＤＮＡ断片ごとに取得された蛍光強度のピークを検出し、該ピークに対応する時間情報を決定し、表示部は、蛍光強度と時間情報との対応関係をＤＮＡ断片ごとに表示し、表示部において、第１の蛍光強度を有する第１のピークと、第１の蛍光強度より弱い蛍光強度を有する第２のピークを含む少なくとも一つ以上のピークとが表示される場合にあって、演算制御部は、下限値を所定値を用いて調整し、調整後の下限値を撮像素子が有する下限値として測定した場合の蛍光強度を、第２のピークを含む少なくとも一つ以上のピークの蛍光強度として再設定することで、第２のピークを含む少なくとも一つ以上のピークが疑似信号のピークであるか否か判別することを特徴とする。

本発明によれば、使用が容易で迅速な解析を行い、小型で複数サンプルを受け入れることが可能な核酸分析装置及びそれを用いた核酸分析方法を提供することができる。

本実施例に係るキャピラリ電気泳動装置の概略図である。 本実施例における照射系の概略図である。 電気泳動分析手順を示すフロー図である。 蛍光色素の発光スペクトルの一例を示す図である。 ＳＴＲ解析手順を示すフロー図である。 本実施例におけるＳＴＲ解析手順を示すフロー図である。 本実施例における制御用コンピュータの入力画面の一例を示す図である。 本実施例における反応容器の概略図である。 本実施例における効果を示す信号波形の例を示す図である。 本実施例における効果を示す信号波形の例を示す図である。 本実施例における効果を示す信号波形の例を示す図である。 本実施例における効果を示す信号波形の例を示す図である。 本実施例におけるレポート出力画面の例を示す図である。

以下に、本発明の実施例を、図を用いて説明する。

≪キャピラリ電気泳動装置≫
図１は、本実施例に係るキャピラリ電気泳動装置の概略図である。以下、図１を参照し、本装置の構成について説明する。

装置本体１０１は、制御用コンピュータ１２５と通信ケーブルで接続されており、オペレータは、制御用コンピュータ１２５により装置が有する各機能を制御し、光学検出器１１２で検出するデータを授受する。制御用コンピュータは授受したデータを表示するためのデータ表示画面（図示せず）を備える。

本実施例に係るキャピラリ電気泳動装置は、事前に調整した解析試料を分離するための分離媒体を含む１本もしくは複数本のキャピラリ１０２からなるキャピラリアレイ１１４と、キャピラリ陰極端１２６にさまざまな解析容器を搬送するための搬送機１２２と、キャピラリに分離媒体を注入するためのポンプ機構１０３と、キャピラリアレイの温度を調整するための恒温槽１１５と、分離媒体に高電圧を印加するための高圧電源１０４と、コヒーレント光であるレーザ光をキャピラリに照射する光源１１１と、試料が発する蛍光を光学的に検出するための光学検出器１１２と、から構成される。

キャピラリアレイ１１４は、一本もしくは複数本（例えば、２〜９６本）のキャピラリ１０２からなる交換部材であり、ロードヘッダ１２４、検出部１１３、キャピラリヘッドを含む。キャピラリアレイ１１４の一端は、キャピラリ内に解析試料を導入するためのロードヘッダ１２４を有し、負電圧を印加するための陰極端をなす。他端は、キャピラリヘッドにより複数本のキャピラリが一つに束ねられており、耐圧機密構造でゲルブロック１０６と接続される。ロードヘッダ１２４とキャピラリヘッドの間に、レーザ光が照射される検出部１１３を有する。

キャピラリアレイ１１４は、測定に応じて、異なる本数や長さのキャピラリから構成されるものに置き換え可能である。また、キャピラリに破損や品質の劣化がみられたとき、新品のキャピラリアレイに交換する。

キャピラリ１０２は、内径数十〜数百μｍ、外径数百μｍのガラス管で、強度向上のためその表面はポリイミド被膜で覆われている。ただし、レーザ光が照射される箇所およびその近傍は、キャピラリの表面のポリイミド被膜は除去されている。キャピラリの内部には、解析試料中のＤＮＡ分子を分離するための分離媒体が充填される。分離媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲル（以下、ポリマーと称する）である。
なお、本実施例では、ガラス管などを材料とするキャピラリを分離媒体の保持担体として例を挙げたが、これに限定されるものではない。マイクロフルイディクスとしてガラス基板や樹脂基板を用いてもよい。

ポンプ機構１０３は、シリンジ１０５とそのシリンジを加圧するための機構系で構成される。ゲルブロック１０６は、シリンジ１０５、キャピラリアレイ１１４、陽極バッファ容器１０８、およびポリマー容器１０７をそれぞれ連結する接続部である。キャピラリ内に分離媒体であるポリマーを充填する際には、電動バルブ１１０を閉じ、シリンジ１０５を押し込むことによって、シリンジ１０５内のポリマーをキャピラリに注入する。

恒温槽１１５は、キャピラリアレイ１１４の温度を制御するための温度制御機構である。恒温槽１１５は、槽内の温度を一定に保つために断熱材で覆われ、加熱冷却機構１１７により温度を制御する。これにより、キャピラリアレイの大部分の温度を、例えば６０℃などの一定温度に保つ。

搬送機１２２は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備えており、上下、左右、前後の３軸方向に移動可能である。また、搬送機１２２の移動ステージ１２３には、少なくとも１つ以上の容器を載せることができる。搬送機１２２は、移動ステージ１２３上のバッファ容器１１８、洗浄容器１１９、廃液容器１２０、サンプル容器１２１のそれぞれをキャピラリの陰極端１２６まで搬送する。

光学検出部は、検出部１１３に励起光を照射するための光源１１１を有する照射系と、検出部１１３からの発光を検出するための光学検出器１１２で構成される。光学検出器１１２で検出したデータ１２８は、制御基板１２７を介して制御用コンピュータ１２５に転送される。光学検出部は、回折格子やプリズムなどを用いて分光した後に撮像素子としてＣＣＤやＣＭＯＳなどを用いて光学検出してもよい。もしくは、複数のダイクロイックミラーおよび光電子増倍管の組合せによって光検出を行ってもよい。

≪照射系≫
図２に、本実施例における照射系の概略を示す。図２（ａ）は側面図で、図２（ｂ）は正面図である。照射系は、レーザ光２０１を発振する光源１１１、レーザ光を分岐するビームスプリッタ２０３、レーザ光の進行方向を変える反射ミラー２０２、およびキャピラリアレイの検出部１１３にレーザ光を集光するための集光レンズ２０４から構成される。なお、フィルタ、偏光子、波長板等の光学素子は簡略化のため省略する。光源１１１から発振されたレーザ光２０１は、反射ミラー２０２により進行方向を変え、ビームスプリッタ２０３で２つに分光され、反射ミラー２０２、集光レンズ２０４を経て検出部１１３のキャピラリに上下から照射される。検出部から発せられる蛍光を光学検出器１１２で観測することにより、事前処理されたサンプルのシグナルを検出する。

光源１１１は、試料成分を励起する励起光を発する。光源１１１としては、液体レーザ、気体レーザ、半導体レーザを適宜使用でき、ＬＥＤで代用しても良い。例えば、光源１１１は波長５１５.５ｎｍ、出力５０ｍＷの半導体レーザである。励起波長は事前処理した蛍光に依存するが、例えば５０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、６３３ｎｍも適宜使用できる。

さらに、キャピラリ配列の片側からのみ励起光を照射し、光源の点灯時間の変化や光軸上にシャッタを用意し、キャピラリアレイ１１４への照射を適宜に可変としても良い。例えばキャピラリへの励起光の照射を、５０ｍｓｅｃ照射、データ転送（データ転送中は照射を行わない）を一つの照射条件とし繰り返してもかまわないが、５０ｍｓｅｃ照射、データ転送、１００ｍｓｅｃ照射、データ転送を一つの照射サイクル条件とし、繰り返して照射することも可能である。前記一つの照射時間条件で得た蛍光シグナルデータ点数より少なくなるが、１００ｍｓｅｃ照射の蛍光シグナルデータも得られる為、蛍光シグナルの検出範囲を拡大することもできる。この検出範囲の拡大は、大きな効果を生み出す。研究者等による解析においては、事前にゲノムＤＮＡ量を調整し、電気泳動装置の検出レンジに収める必要があった。

上記に示した検出範囲の拡大により、事前のゲノムＤＮＡ量調整が不要になれば研究者の操作が不要になる。解析装置としても、濃度調整機能を保有する必要もなくなり、迅速で小型化された安価な装置を提供することが可能になる。

≪電気泳動装置の操作手順≫
まず、電気泳動装置の基本的な操作手順について説明しておく。図３に示すように、操作手順は、順に、事前準備、泳動媒体充填３０３、予備泳動３０６、サンプル導入３０９、および電気泳動３１２である。

次に、上記事前準備について説明する。装置オペレータは、電気泳動バッファ液の入ったバッファ容器１１８、キャピラリ洗浄用の洗浄容器１１９、キャピラリ中のポリマーを排出するための廃液容器１２０、分離媒体となるポリマーが入ったポリマー容器１０７、および被測定サンプルが入ったサンプル容器１２１を装置に架設する。

なお、オペレータの操作を簡便にするために、バッファ容器１１８、洗浄容器１１９、廃液容器１２０、サンプル容器１２１を一体型の容器にひとまとめにした図８に示すような反応容器を使用し、架設してもよい。

図８に示す反応容器は、ゲノムＤＮＡを増幅することも可能である。本容器底部に、ゴム等の弾性体などを使用し、ダイヤフラムの原理を用いて各所の試薬等の液体を送液する構造としてもよい。ゲノムＤＮＡを試料添加槽８００に入れ、ＤＮＡポリメラーゼ等を利用した核酸増幅法であるＲＣＲ反応もしくはＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法のような等温増幅反応に使用する核酸増幅試薬を格納した増幅試薬槽８０１へ流し込む。増幅法は、これらに限定されるものではない。流し込んだ試料は、良く混合したのちに、温調機能を有した反応槽８０２へ混合液を流し、目的核酸配列を増幅する。増幅産物はサンプル容器部１２１に流し込まれる。

また、測定開始前に、ポンプ機構１０３を用いて電気泳動に利用されるキャピラリを含む流路すべてにポリマーを充填する。なお、装置を連続使用する際には、流路はポリマーで満たされているため、本作業は不要である。

≪電気泳動分析の手順≫
以下、図１、図３、図４、図８を参照して、電気泳動分析の手順（ステップ（１）〜（１４））について説明する。
（１）ステップ３００：まず、任意のサンプルを分析する前に波長校正を行う。
波長校正として蛍光シグナルの検出は、光学検出器１１２で行う。光学検出器１１２として、例えばＣＣＤを用いた場合は、各蛍光波長に対応した素子部を指定し検出する。光学検出器１１２は、回折格子等により分光された複数の蛍光色素群それぞれを最も感度よく検出するように設定される。

このような蛍光色素群の例として、６ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＬＩＺと呼ばれる蛍光色素からなるＡｍｐＦＬＳＴＲキット（Life Technologies社）の蛍光色素など挙げられる。これらの各蛍光色素の発光スペクトルを図４に示す。各蛍光色素の発光スペクトルは、図に示す様にブロードなパターンを持っている。

例えば、ＮＥＤで標識されているサンプルを検出するＣＣＤ素子が得る信号は強度の差はあるが、ＮＥＤ以外の波長の蛍光からの信号も検出する。またＮＥＤが放つ蛍光は、目的の素子以外の他波長検出素子上でも検出される。しかし、各蛍光の信号強度の比率は理論上一定なので、この値をもとに逆変換すれば、純粋に目的蛍光波長だけのピーク波形が得られることになる。これは他の波長の蛍光色素についても同じであり、蛍光スペクトルが別の蛍光スペクトルと重なっている場合にも、検出される波形は単なるスペクトルの加算と考えられる。

したがって、複数の蛍光色素についての信号強度比率が得られれば、それを行列に表し、その逆行列を元の検出されたピーク波形にかければ、各蛍光色素のピーク波形が得られる。この信号強度比率を事前に校正サンプル等を用いて電気泳動を行い正確に求められる（例えば、特表２００２−５２５５７６号公報、あるいは特開２０１１−３０５０２号公報、あるいは特開２００２−７８５００号公報を参照）。なお、一般的に本作業（波長校正）は、劣化や長さ変更に伴うキャピラリの交換時に必ず行う。
（２）ステップ３０１：本装置は、オペレータによる制御用コンピュータ１２５からの命令により、分析を開始する。
（３）ステップ３０２：はじめに、搬送機１２２により廃液容器１２０をキャピラリ陰極端１２６に搬送する。
（４）ステップ３０３：その後、ポンプ機構１０３によりマルチキャピラリアレイ１１４にポリマーを注入する（泳動媒体充填）。
（５）ステップ３０４：所定量のポリマーの注入が終了した後、搬送機１２２は洗浄容器１１９をキャピラリ陰極端１２６に搬送し、キャピラリ陰極端を溶液に浸して洗浄する。
（６）ステップ３０５：キャピラリ洗浄後、搬送機１２２はバッファ容器１１８をキャピラリ陰極端１２６に搬送する。
（７）ステップ３０６：続いて、予備泳動を行う。予備泳動は、本来の分析工程に先立って行い、キャピラリ内のポリマーを分析に適した状態にするために行う。通常、数〜数十ｋＶ程度の電圧を数〜数十分間印加する。
（８）ステップ３０７：予備泳動終了後、再び洗浄容器１１９でキャピラリ陰極端１２６を洗浄する。
（９）ステップ３０８：キャピラリ陰極端にサンプル容器１２１を搬送する。
（１０）ステップ３０９：次に、キャピラリ陰極に数ｋＶ程度の電圧を印加すると、サンプル液と陽極電極１０９の間に電界が発生し、サンプル液中のサンプルがキャピラリ内に導入される。
（１１）ステップ３１０：サンプル導入後、再びキャピラリ陰極端１２６を洗浄容器１１９で洗浄する。
（１２）ステップ３１１：バッファ容器１１８をキャピラリ陰極端１２６に搬送する。
（１３）ステップ３１２：その後、所定の電圧を印加して電気泳動を開始する。

ここで、電気泳動とは、陰極・陽極バッファ間に生じた電界作用により、キャピラリ中のサンプルに移動度を与え、サンプルの性質に依存する移動度の差によりサンプルを分離することである。サンプルがＤＮＡの場合は、塩基長により移動度に差が生じ、移動度が速い塩基長の短いＤＮＡから順に検出部を通過する。ＤＮＡにはあらかじめ蛍光物質が取り付けられているため、塩基長の短いＤＮＡから順番に検出部で光学的に検出される。通常は、泳動時間の一番長いサンプルに合わせて測定時間および電圧印加時間を設定する。
（１４）ステップ３１３：電圧印加開始から所定時間が経過したのち、データ取得後に電圧印加を停止し、分析を終了する。
以上が基本的な電気泳動の手順である。

≪一般のＳＴＲ分析手順≫
次に、一般的なＳＴＲ分析の解析手順を、図５を参照しながら説明する。
（１）ステップ５００：電気泳動によりシグナルデータを得る。
（２）ステップ５０１：事前に入手した、検出器１１２内におけるキャピラリ位置情報を添加する。
（３）ステップ５０２：さらに、波長校正情報３００を添加する。

以下のステップ５０３〜５０５は、ＳＴＲ解析処理に相当する。
（４）ステップ５０３：目的の信号のみを抽出する。この信号から、各ピークの検出時間、高さ、幅などの情報を算出する（Peak検出）。
（５）ステップ５０４：ステップ５０３で得られた情報と、既知のＤＮＡ断片サイズも試料サンプルと同時に電気泳動したピーク検出情報から、分析試料サンプルのサイジング（Sizing）を行う。
（６）ステップ５０５：このサイジングを行った情報から、解析目的の対立遺伝子（Allele）の事前情報と紐付を行う（Allele Calling）。
（７）ステップ５０６：塩基長もしくは配列の繰り返し回数と算出し、Profileデータを得る。
（８）ステップ５０７：このProfileデータは、専門家の知識及び経験から検証が行われデータ解釈される。

≪本願のＳＴＲ分析手順≫
次に、図６を用いて、本発明における電気泳動装置を用いたＳＴＲ解析手順を説明する。なお、図５では、一般的なＳＴＲ解析手順を説明したが、図６は本発明に係る解析手順を示す。特に、図５と異なる手順は、図中のステップ６００〜６０２、及び６０８〜６０９である。これらの手順により、使用が容易であり研究者のように専門的な知識を有する者を必要としない解析が可能となる。

以下には、ＳＴＲ解析手順を示すが、本解析手順は、ＳＴＲ解析に限らずに、ＤＮＡ塩基配列解析にも適用できる。
（１）ステップ６００：初めに行うのは、信号解析条件設定である。
これは、装置メーカーもしくは装置管理者が事前に設定することによりProfileデータの解釈を専門家ではなく、迅速にルーチン作業としてデータを解釈することが可能になる。

ここで、特に着目しなければならないのが、疑似ピークの解釈である。疑似ピークは主に、装置光学系が持つ暗電流をはじめとしたハードウエアから来るノイズピーク、あるいは前の解析に使用したサンプルから来るキャリーオーバーするピーク、あるいは検出部のキャピラリが複数存在する場合に僅かならに漏れてくるクロストークピーク、あるいは波長校正によるマトリックス変換を行っているが僅かに現れるプルアップピーク、あるいは核酸増幅法に起因する目的外増幅物Stutterなどによるピークが主な疑似ピークの要因である。データを解釈する専門家は、これまでの経験から固定の閾値を設けての解析や、得られたProfileのパターンから疑似ピークを判断する。

これに対し専門家による解析を不要とする本実施例では第一に、図７に示すシグナル解析の条件設定画面によって疑似ピークの自動解釈の為の条件設定がなされる。本設定は、装置提供者または解析ユーザーによって様々な設定が行われる。

図７に示す画面は、得られる信号の閾値設定（上限閾値及び下限閾値）を行う画面である。
上限閾値では、検出器の検出上限を設定するかまたは、得る信号の定量性を維持するために、微弱な信号から強力な信号において直線性の得られる値を設定してもよい。
下限閾値における設定項目としてまず、ハードウェアノイズ、キャリーオーバー、クロストークがある。本項目は装置性能を良く理解した製造元によって定義されるのが望ましい。装置オペレータが製造元推奨の値を元に、分析条件、使用条件や環境によって値を変更しても構わない。

次に、プルアップピーク(Pull-Up)に関する設定項目である。設定方法として以下に示す二つの選択肢を持っても良い。一つは、装置性能として事前に使用条件下で得られるプルアップピークを計測評価し、固定値として設定する。もう一つは、プルアップの親となるピークに対して割合で設定する。プルアップは検出時において、同じタイミングで得られる他波長のシグナルの強さに大きく依存する。その関連性から、同じタイミングで得られる他波長のシグナル（親ピーク）に対してある割合を疑似ピークであるプルアップピークとして常に算出することによって疑似ピークを排除する。親ピークが複数ある場合は、波長ごとに分けて算出してもよい。また、その算出した値を合算し、プルアップピークとしてもよい。これらの割合は、固定値による設定と同様に、事前に評価されるのが望ましい。プルアップピークは装置ごと、さらには検出系、増幅試薬、行列計算によるマトリックス変換に依存する為、これらの因子が変更となるごとに事前評価し、設定値を変更してもよい。また、核酸配列分析、短鎖縦列反復配列分析などと言った分析方法によって閾値を変更してもよい。

もしくは、図８に示す反応容器は、増幅試薬と一体となっているので、反応容器に張り付けられるバーコードにこの情報を加味することによって試薬に依存する割合を装置が入手してもよい。

事前評価とは、分析に使用する試薬の複数の蛍光色素についての信号強度比率が得られれば、それを行列に表し、その逆行列を元の検出されたピーク波形にかければ、各蛍光色素のピーク波形が得られる。この信号強度比率を事前に校正サンプル等を用いて電気泳動を行い求めることを指す。また、校正サンプルを用いて電気泳動後に自動的にプルアップピークの設定項目に反映してもよい。

次に、Stutterに関する項目である。設定方法として以下に示す二つの選択肢を持っても良い。一つは、各Alleleピークに対し得られるStutterによるシグナルの情報（例えば、Alleleに対すピークの割合）を試薬提供企業もしくはユーザーによって事前に得られた情報から、AlleleごとにStutterによる疑似ピーク値を得る方法である。もう一つは、固定値として設定する方法である。Stutterに関しては、ピークとして得られる個所は推定可能である為、Alleleピークが近傍にいない場合はStutterによる影響を考慮しない条件を事前情報から設定することも可能である。
下限閾値においては、ここで設定した値の合算した値から、基本下限閾値となり検出器が得る信号を判断する。
上記の項目の設定により得られる閾値により信号が解析される。

図７に示す解析の為の他項目は、例えば、表示されるタブに示す「Detection」がある。検出器が得る信号は、蛍光強度と検出時間の点としての情報として得られる。この点情報を繋ぎ、ピークとして認識する為に例えば多項式近似等によりカーブフィッティングを行う為のさまざまな方法が設定される。

表示されるタブに示す「Quality」の項目では、カーブフィッティング等で得られたピークの品質をチェックする。ここで設けられる条件によって、得られたピークが望ましいものか否かを判断する。品質チェック項目としては、半値幅がある一定の幅を超えていないか否かを判断する。ある一定値を超えている場合は、ピークがブロード過ぎて正しくサイジングが出来ない可能性がある。

表示されるタブに示す「Allele」項目の例としては、得られたAlleleのピークが、片方のピーク強度がもう一方のピーク強度に対し、ある一定の強度がある時にHeterozygousであるか否かなどを判断する。他の設定項目としては、Allele辺りに得られるピークの本数を設定する。通常１か２本のピークが得られるが、それ以外の本数のピークが現れた時、解析結果に明確に知らせるための設定値などを設けてもよい。

以上に示す項目が信号解析条件設定（６００）であるが、本項目に限定されるわけではない。
（２）ステップ６０１：次のステップとして、試薬情報の読取を行う。
ここで、図８は、増幅試薬等を含んだ反応容器を装置に架設した場合を示す。具体的には、本装置には、試料添加槽８００、増幅試薬槽８０１、反応槽８０２及びサンプル容器１２１を備える。

図８に示す様な増幅試薬等を含んだ反応容器を装置に架設する場合、反応容器の保管期間によって反応効率が異なってくる。例えば、核酸増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼは保管期間が長くなるほど活性が低下する。短い期間保管された容器と長い期間保管された容器では同じサンプルを添加しても、得られる信号の強さが異なってくるため、検知器にとってはより一層のダイナミックレンジが要求される。

しかし、反応容器の製造時にバーコード等で試薬の製造年月日を記し、反応容器を架設後に装置がバーコード等を読み取ることにより、試薬の保管状態を装置が知ることが可能である。この情報と、事前に調査した試薬活性情報、検知器のダイナミックレンジ情報を加味し、増幅工程における温調条件を決定する。増幅反応がＰＣＲ反応であれば、温度サイクルを増減し、等温増幅法であれば反応時間を増減させる。温調条件を調整することにより、望ましい信号強度が得られるため広いダイナミックレンジを備える必要が無くなる。
（３）ステップ６０２：次に、電気泳動を行う。
電気泳動時における励起光の照射を適宜に可変とするのが望ましい。複数の露光時間で信号を得ることは、検出器が捉える信号強度の幅が拡大するため、広いダイナミックレンジの検出器を備える必要が無い為、安価で簡便な解析を実現する。もしくは、ゲノムＤＮＡの濃度調整が不要になり、迅速で簡便な装置を実現する。
（４）ステップ６０３：電気泳動によりデータを得る。
（５）ステップ６０４：事前に入手した、検出器１１２内におけるキャピラリ位置情報を添加する。
（６）ステップ６０５：さらに、波長校正情報（６０５）を添加する。
（７）ステップ６０６：目的の信号のみを抽出する。この信号から、各ピーク検出時間、高さ、幅などの情報を算出する（Peak検出）。
（８）ステップ６０７：これらの情報と、既知のサイズの蛍光付加ＤＮＡ断片も同時に電気泳動したピーク検出情報から、試料サンプルのサイジング（Sizing）を行う。
（９）ステップ６０８：次に、各波長領域で得た各色の信号ピークの検出時間の比較を行う。同一サンプル内で、異なる検出波長ではあるが、同じ検出時間で検出されたピークがある場合は親ピークの蛍光強度と信号解析条件設定（６００）において設定した値に基づき、このピークのみ下限閾値を変更する。

ここで、図９Ａ、９Ｂ、９Ｃを用いて、長短２つの露光時間を用いて信号を検出した例を用いて説明する。露光時間に依存する下限閾値要素に関しては、露光時間の長さに応じて変更する。例えば、ハードウェアノイズは露光時間に依存し、長いほど大きくなり、短いほど小さくなる。一つの露光時間で信号を得たデータを図９Ａに示す。色素Ａを付加した試料において、信号がサチレーション（９００）してしまいピークの高さが解析できないデータがある。その為、プルアップピークがどの程度か算出することが出来ないので、色素Ｂにおいて得られたピーク（９０１）がプルアップで得られたピークなのか試料から得られたピークなのか判断出来ない。

しかし、図９Ｂ、９Ｃに示す様に長短２つの露光時間を用いて検出することにより、例えば図９Ｂのように信号がサチレーションしたとしても、短い露光時間で検出したデータにおいてピークの高さを検出することが可能となる。
ここで、図９Ｂは、長い露光時間の場合を示し、図９Ｃは、短い露光時間の場合を示している。

その結果、プルアップピークの影響がどの程度か知ることが出来る。下限閾値を変更しなければ、図９Ｃの９０２に示す様に閾値以上のピークであると判断してしまう。図９Ｄに示す様に閾値を再計算し、下限閾値を変更することによって９０３に示す様にプルアップピークの影響を受けた疑似ピークである事を判断出来る。

さらに、図９のように長短２つの露光時間を用いて検出した場合、例えば長い露光時間ではピークを捉えているが、短い露光時間では捉えていない場合があっても、前記記載の手順に従い最適な閾値を用いた上で判断可能なピークを長短２つの露光時間のデータを持ち寄り、一つのデータとしてもよい。例えば、短い露光時間では下限閾値以下であっても、長い露光時間で下限閾値を上回る場合は、長い露光時間のピークデータを採用する。
（１０）ステップ６０９：また、ステップ６０７において用いた既知のサイズの蛍光付加ＤＮＡ断片から得られる蛍光強度が各キャピラリ間でも信号強度が等しいという観点から、信号強度をある一定値に揃える正規化を行った場合は、その正規化に伴い、閾値にも正規化に用いた係数を適用させ再計算および再設定する。
（１１）ステップ６１０：再計算された閾値を用いて、解析目的の対立遺伝子（Allele）の事前情報と紐付を行う(Allele Calling)。
（１２）ステップ６１１：塩基長もしくは配列の繰り返し回数と算出し、Profileデータとして得る。この得られたProfileデータは、専門家などによる解釈を不要になる。

図６に示したフローチャートは一例であり、解析の順序は入れ替えてもよい。例えば、プルアップピークを判断する６０８の工程を、６０３の信号を得た後に６０６のピーク検出後に実施してもよい。一般に、電気泳動装置上で電気泳動され、そのデータは別解析ソフトで解析がされる。上記の手順で解析を行うことにより電気泳動装置上でプルアップピークの表示や、予めプルアップ分の影響を考慮し影響を受ける他色の蛍光信号ピークから差し引いて表示してもよい。

得られたデータのレポートは、制御用コンピュータに表示することや印刷することが可能である。図１０はレポートの一例を示す。レポートには、解析に用いたソフトウェアやそのバージョン、試薬種、試料のタイプ、閾値の条件などが記載される。図７に示す設定画面で、各閾値を適用するか否かはチェックボタン等で選択され、選択した閾値の項目や値をレポートに示してもよい。レポートには、実際の波形データを示し各Alleleの情報（繰り返し回数など）を示してもよい。本発明における閾値が再設定されたピークに関しては、以下のように示してもよい。図１０のDyeがBlueの波形表示に示すように、閾値を点線として示し、再設定がなされた箇所には「Pull-up Threshold」といった表示をしてもよい。

図１０において、閾値修正の要因となったPull-upであることを表示しているが、適用している閾値を全て表示してもよい。制御コンピュータ画面上で、各閾値の付加・取り除く操作などといった、閾値の変更を行ってもよい。

以上述べたように、本発明によれば、事前評価した信号特性と同じ検出時間に得られる信号からプルアップピークを見積もることが出来、さらに専門家の知識や経験則から来る判断を不要とし、自動的に疑似ピークの見極めが出来るので解析が簡略化する効果がある。

また、複数の励起光照射時間と事前評価したシグナル特性と同じ検出時間に得られる信号からプルアップピークを見積ることを組み合わせることにより、得られたピークが他波長で発生したサチレーションによるプルアップの影響による疑似ピークか否かを判断が可能になる。

さらに、親ピークを割り出し、プルアップピークを算出することにより、予め固定値としてプルアップピークを含む疑似信号の最大値を見積もり、過大な閾値を設ける必要もなくなるので、最大値を見積もるが故にこれまで排除されていた真のピークを排除しないという効果がある。言い換えれば、下限の検出領域の拡大により、例えばサンプル濃度調整機能が不要になり、迅速で小型化された装置となる効果もある。

１０１：装置本体、
１０２：キャピラリ、
１０３：ポンプ機構、
１０４：高圧電源、
１０５：シリンジ、
１０６：ゲルブロック、
１０７：ポリマー容器、
１０８：陽極バッファ容器、
１０９：陽極電極、
１１０：電動バルブ、
１１１：光源、
１１２：光学検出器、
１１３：検出部、
１１４：マルチキャピラリアレイ、
１１５：恒温槽、
１１６：ファン、
１１７：加熱冷却機構、
１１８：バッファ容器、
１１９：洗浄容器、
１２０：廃液容器、
１２１：サンプル容器、
１２２：搬送機、
１２３：移動ステージ、
１２４：ロードヘッダ、
１２５：制御用コンピュータ、
１２６：キャピラリ陰極端、
１２７：制御基板、
１２８：検出データ、
２０１：レーザ光、
２０２：反射ミラー、
２０３：ビームスプリッタ、
２０４：集光レンズ。

Claims (10)

1. 複数のＤＮＡ断片を含む分析サンプルに光を照射する工程と、
   所定の検出時間内に前記分析サンプルから励起される前記ＤＮＡ断片に対応する蛍光を撮像素子を用いて検出する工程と、
   前記撮像素子が有する蛍光強度の検出可能な範囲内であって、前記分析サンプルの分析に要求される蛍光強度の下限閾値を設定する工程と、
   前記下限閾値を基に前記ＤＮＡ断片ごとの蛍光強度を取得する工程と、
   前記ＤＮＡ断片ごとに取得された蛍光強度のピークを検出し、該ピークに対応する時間情報を決定する工程と、
   前記蛍光強度と時間情報との対応関係を前記ＤＮＡ断片ごとに表示する工程と、を有し、
   前記表示において、第１の蛍光強度を有する第１のピークと、前記第１の蛍光強度より弱い蛍光強度を有する第２のピークとが同じタイミングで表示される場合にあって、
   疑似ピークに関する設定項目として前記第１のピークの蛍光強度を基に設定した設定値に基づき変更した前記下限閾値により、前記第２のピークが疑似信号のピークであるか否か判別する、
   ことを特徴とする核酸分析方法。
2. 前記設定値は、前記第１のピークを基準として、予め設定された比率である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析方法。
3. 前記設定値は、前記分析サンプルの分析方法によって変更される、
   ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析方法。
4. 前記所定の検出時間が、少なくとも２通りで互いに異なる照射時間である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析方法。
5. 変更した前記下限閾値を含む情報をレポート形式で表示する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析方法。
6. 複数のＤＮＡ断片を含む分析サンプルに光を照射する光照射部と、
   所定の検出時間内に前記分析サンプルから励起される前記ＤＮＡ断片に対応する蛍光強度を撮像素子を用いて検出する検出部と、
   前記撮像素子が有する蛍光強度の検出可能な範囲内であって、前記分析サンプルの分析に要求される蛍光強度の下限閾値を保存する記憶部と、
   前記各部を制御し、演算処理する演算制御部と、
   前記演算制御部の結果を表示する表示部と、を備え、
   前記検出部において、前記下限閾値を基に前記ＤＮＡ断片ごとの蛍光強度を取得し、
   前記演算制御部は、前記ＤＮＡ断片ごとに取得された蛍光強度のピークを検出し、該ピークに対応する時間情報を決定し、
   前記表示部は、前記蛍光強度と時間情報との対応関係を前記ＤＮＡ断片ごとに表示し、
   前記表示部において、第１の蛍光強度を有する第１のピークと、前記第１の蛍光強度より弱い蛍光強度を有する第２のピークとが同じタイミングで表示される場合にあって、
   前記演算制御部は、疑似ピークに関する設定項目として前記第１のピークの蛍光強度を基に設定した設定値に基づき変更した前記下限閾値により、前記第２のピークが疑似信号のピークであるか否か判別する、
   ことを特徴とする核酸分析装置。
7. 前記設定値は、前記第１のピークを基準として、予め設定された比率である、
   ことを特徴とする請求項６に記載の核酸分析装置。
8. 前記設定値は、前記分析サンプルの分析方法によって変更される、
   ことを特徴とする請求項６に記載の核酸分析装置。
9. 前記所定の検出時間が、少なくとも２通りで互いに異なる照射時間である、
   ことを特徴とする請求項６に記載の核酸分析装置。
10. 変更した前記下限閾値を含む情報をレポート形式で表示部に表示する、
    ことを特徴とする請求項６に記載の核酸分析装置。

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