CN111926064B - 基于poct的荧光定量pcr仪校准方法及pcr仪 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及PCR检测装置技术领域，提供了一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法及PCR仪，PCR仪包括试管架、试剂管、光源模块和采集模块；校准方法包括将放置有试剂管的孔位标记为至少一个基准孔和若干测试孔；驱动光源模块发射激发光；通过采集模块采集图像，提取图像的灰度值；根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值；根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数；根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值。本发明克服了由于试剂管与镜头光轴的夹角不同，造成各孔位荧光存在偏差的问题，确保基因检测准确性。
Description
技术领域
本发明涉及PCR检测装置技术领域，特别是涉及一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法及PCR仪。
背景技术
传统的荧光定量PCR仪，以科研应用场景需求进行设计，反应管采用通用的八联管，荧光检测系统设置在反应管上方，激发光源从试剂管顶部射入，激发出的荧光也需要在反应管顶部检测，因此荧光检测系统需设置有热盖，热盖和反应管盖采用高透明的光学材料，同时为了避免激发光路与荧光光路相互干涉，PCR仪器需使用分光镜、合光镜等光学元件，整个光路比较复杂，体积较大，成本昂贵，生产装调工艺复杂。
为提升检测精度，PCR需要进行荧光校准，由于光源、发射滤镜、分光镜、接收器对不同光谱的响应不同及不同孔位光路光程有差异，因此需分别对每个通道、每个孔位进行荧光校准。传统的校准方法需要配制不同通道相应的染料标准品和纯水标准品，每种标准品需与设备孔位数一致，若设备孔位为96，则每种标准品都需要96支。理论上每支标准品是完全一致的，即每一支标准品在相同的激发光源的作用下检测到的荧光完全一致，然而不同支标准品的浓度、装量及耗材光学性能难免存在差异，标准品的误差会影响校准的精度。一般的，为减小标准品误差对校准精度的影响，需要加大标准品的用量和测试频次，通过计算平均等数据处理方式降低随机误差。此外，荧光染料存在光热稳定性差的问题，重复使用越多标准品间的偏差越大，因此，荧光校准须控制染料的重复使用次数，进一步推高了荧光校准的成本。复杂的光路，繁多光学元件，势必造成成本高、生产工艺复杂、调测难度大等问题，再加上荧光校准操作繁琐、标准品消耗量大，导致传统的荧光PCR制造成本高，售价高昂，限制了其推广应用。
在临床SNP基因检测上，使用传统的荧光定量PCR操作复杂，其检测的基本流程为：
(1)检测试剂准备，具体为检测试剂各组分融解、离心、混合、分装到PCR反应管；
(2)检测样本制备，具体为DNA提纯、浓度及纯度检测；
(3)样本加样，具体为用移液器将样本DNA加到已分装检测试剂的PCR反应管内。
(4)上机扩增，具体为将加样后的试剂上机，设定PCR反应程序，启动运行，结束后分析数据，出具检验报告。
由于检测操作复杂，且极易出现交叉污染，造成检测结果错误；要求检测环境及管理必须满足PCR实验室特殊要求，操作人员也必须具备PCR检测相关技能及要求。为规范临床基因检测实验室管理，确保基因检测质量和实验室生物安全，国家出台了《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》及《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》，对临床基因检测涉及的实验室审核及设置、质量管理、监督管理进行了详细的规定，同时对实验室的设计、软硬件设施(实验室区域划分、气流流向、软硬件设备配置等)要求，工作基本准则及人员要求等，均做出了明确规定，并必须按规定要求执行。
检测环境要求高、操作复杂、需要专业检验人员操作，导致SNP基因检测只能在少数建立PCR中心实验室的医院和第三方医学检验机构开展，无法在数量众多、临床需求迫切的各级医院推广应用。此外，检测流程的复杂性，操作繁琐，也造成了检测周期过长，使SNP基因检测无法在临床急救及提前干预等时效性要求高的项目开展。如心脑血管疾病，研究表明我国NICE(非致残性脑血管事件高危人群)包括TIA(短暂性脑缺血发作)和轻型缺血性卒中，该类人群约占所有缺血性脑血管病50％以上，仅TIA患者，中国每年可能新增超过200万，该类人群血栓形成还处于连续动态演变过程中，早期运用抗血小板药物干预意义重大。缺血性事件发生概率在症状出现后的最初数小时内最高，对POINT研究的分析也发现，12小时内启动DAPT治疗(氯吡格雷+阿司匹林)临床获益最高，此外，研究还发现，基因多态性影响药物疗效，因此，DAPT治疗前需进行基因检测。然而，传统的PCR实验室基因检测，结果返回到临床，通常已超过24小时，超过了NICE患者的治疗时间窗，导致临床DAPT治疗无法实施。
如何对SNP基因检测模式进行优化创新，精简操作环节、降低检测环境要求、降低操作人员技能要求、并缩短检测周期，以满足当前分级诊疗及个性化用药临床推广应用需求是亟需解决的问题。
针对传统荧光定量PCR在SNP基因检测临床应用中存在的问题，提出一种“一步法”POCT荧光PCR快速检测方案。其技术思路为：
(1)对检验试剂配方进行创新，在检验试剂中加入细胞裂解及纯化组分，使检验试剂具备细胞裂解、DNA纯化处理的效果，检验过程无需提纯操作。
(2)试剂采用单人份包装，试剂密封采用塞式配合结构，且与样本采样头一样，加样操使作用完成取样的采样头替换试剂密封塞即可。如此，检验前无需进行检验试剂准备操作，并且在整个检测过程中，无需进行样本制备，操作简单，仅有加样操作需要短暂开盖(几秒钟)，污染风险极低，普通环境也可以满足检测要求。
此方案通过试剂、取样、加样的创新，有效的精简了操作环节，缩短了检验周期，操作方便，操作人员无需特殊技能要求，同时也解决了检测环境高(必须满足PCR试验室要求)的难题。
然而，传统的荧光PCR仪的结构特征无法满足“一步法”POCT荧光PCR快速检测的需求，需对其进行系统性创新设计，以确保“一步法”核酸POCT快速检验方案的实现。
有鉴于此提出本发明。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一方面提出一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，使基于POCT的荧光定量PCR仪性能满足临床应用需求；解决了传统荧光定量PCR仪结构复杂、成本高，在临床SNP基因检测上存在操作复杂、检验周期长、检测环境高(必须满足PCR试验室要求)等突出问题。
本发明第二方面提出一种基于POCT的荧光定量PCR仪。
根据本发明第一方面实施例的一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，所述荧光定量PCR仪包括：
试管架，所述试管架上设置有若干孔位；
试剂管，对应设置于所述试管架的孔位内，用于盛放标准品；
光源模块，对应每个孔位，设置于所述试管架的侧部；
采集模块，设置于所述试管架的底部；
所述校准方法包括如下步骤：
将放置有所述试剂管的孔位标记为至少一个基准孔和若干测试孔；
驱动所述光源模块朝向对应的所述试剂管发射激发光；
通过所述采集模块采集所述试剂管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值；
根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值；
根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数；
根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值。
根据本发明的一个实施例，所述将放置有所述试剂管的孔位标记为至少一个基准孔和若干测试孔的步骤之前，还包括：
将所述试剂管分为盛放染料标准品的第一试管和盛放纯水标准品的第二试管，并将所述第一试管和所述第二试管放入所述试管架的孔位内。
具体来说，通过将试剂管分成盛放不同标准品的第一试管和第二试管，提升了对测试孔校准系数的准确性，使得计算得到的测试孔的校准系数更接近真实值，有效的消除噪声对测试的影响。
根据本发明的一个实施例，驱动所述光源模块朝向对应的所述试剂管发射激发光的步骤中，具体包括：
驱动所述光源模块朝向所述第一试管发射激发光，以激发所述第一试管内盛放的染料标准品发出荧光；
驱动所述光源模块朝向所述第二试管发射激发光，以激发所述第二试管内盛放的纯水标准品发出反射光。
具体来说，上述通过发光模块朝向第一试管、第二试管发射激发光，并激发出第一试管内盛放的染料标准品发出荧光，第二试管内盛放的纯水标准品发出反射光中，第一试管和第二试管处于不同的孔位，即，上述得到的是两个或多个孔位的数据，其中放置第一试管的孔位发出荧光，放置第二试管的孔位发出反射光。
进一步地，在第一试管内，虽然盛放的是染料标准品，但其由于染料也是通过水进行溶解的，因此第一试管内发出的荧光其实也包含了反射光，即，第一试管内染料标准品激发出的荧光含有噪声。
根据本发明的一个实施例，通过所述采集模块采集所述试剂管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值的步骤中，具体包括：
通过所述采集模块采集所述第一试管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值，得到该孔位的孔位灰度值；
通过所述采集模块采集所述第二试管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值，得到该孔位的反射光灰度值。
具体来说，通过光源模块激发第一试管内的染料标准品发出荧光，得到该孔位下的图像灰度值，该孔位灰度值为包含了荧光灰度值和反射光灰度值的图像灰度值，即存在一定的噪声，影响测试结果的准确性，使得孔位的校准系数存在偏差。
进一步地，通过光源模块激发第二试管内的纯水标准品发出反射光，得到该孔位下的反射光灰度值，即得到了该孔位的噪声，校准时可以先进行降噪处理，消除噪声影响，有效的提升校准精度。
根据本发明的一个实施例，所述根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值的步骤之前，还包括：
将全部所述试剂管沿孔位的正向或反向调整至相邻的孔位后，执行所述光源模块发射激发光和所述采集模块采集图像的步骤；
重复上述步骤，直至每一个孔位将全部所述试剂管在该孔位的图像采集完毕。
具体来说，传统的测试方法中，由于同组相同浓度、不同支的标准品对应的孔位不同，不同支标准品的浓度、装量及耗材光学性能难免存在差异，标准品的误差会影响校准的精度；同时，单次测量容易产生随机误差，影响孔位的校准系数的准确性，因此通过将每支试剂管按顺序依次在每个孔位进行测量，可以有效消除不同支标准品误差造成的影响，同时可以降低随机误差，保证了数据的准确性和稳定性，同时也保证了校准效率。
进一步地，沿孔位的正向或反向调整至相邻的孔位指的是，所有试剂管可以向同向相邻的孔位进行移动，随后光源模块发射激发光、采集模块采集相应图像，如此重复，直至每一个孔位将所有的试剂管图像都采集完毕，这样设置将同组测试内误差尽可能的减小，并提升测试效率。
根据本发明的一个实施例，所述根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值的步骤中，具体包括：
逐一将各孔位提取到的所有所述第一试管的孔位灰度值求和并取平均值，得到各孔位的孔位平均灰度值；
根据基准孔和测试孔，将孔位平均灰度值分为基准孔平均灰度值和测试孔平均灰度值。
具体来说，通过将同一孔位测得的所有第一试管的孔位灰度值求和并取平均值，有效的消除了标准传统校准方法同组相同浓度不同支染料标准品对不同孔位校准产生的误差，并根据测试孔和基准孔，将孔位平均灰度值分为各测试孔的测试孔平均灰度值和基准孔的基准孔平均灰度值。
根据本发明的一个实施例，所述根据基准孔和测试孔，将孔位平均灰度值分为基准孔平均灰度值和测试孔平均灰度值的步骤之后，还包括：
逐一将各孔位提取到的所有所述第二试管在每个孔位的反射光灰度值求和并取平均值，得到该孔位的平均反射光灰度值；
根据基准孔和测试孔，将各孔位的平均反射光灰度值分为基准孔平均反射光灰度值和测试孔平均反射光灰度值。
具体来说，通过将同一孔位测得的所有第二试管的反射光灰度值求和并取平均值，有效的消除了标准传统校准方法同组相同浓度不同支纯水标准品对不同孔位校准产生的误差，并根据测试孔和基准孔，将孔位的平均灰度值分为测试孔平均反射光灰度值和基准孔平均反射光灰度值，这样设置可以获得每个孔位对应的平均反射光灰度值，即，获得了每个孔位的灰度值噪声，并且此灰度值更接近真实值。
根据本发明的一个实施例，所述根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数的步骤中，具体包括：
对基准孔提取到的基准孔平均灰度值和各测试孔提取到的测试孔平均灰度值进行降噪处理；
其中，所述降噪处理包括将基准孔提取到的基准孔平均灰度值减去基准孔平均反射光灰度值得到基准孔荧光灰度值；将各测试孔提取到的测试孔平均灰度值减去对应孔位的测试孔平均反射光灰度值得到测试孔荧光灰度值；
根据基准孔的基准孔荧光灰度值与各测试孔的测试孔荧光灰度值，计算得到各测试孔的校准系数。
具体来说，各孔位灰度值为荧光灰度值和反射光灰度值之和，荧光灰度值即荧光数据由荧光染料激发产生，与染料浓度成正比；反射光灰度值即为噪声，由光学系统光源和光路特征来决定，强度固定不变。
进一步地，通过将某一测试孔的测试孔平均灰度值减去该孔位的测试孔平均反射光灰度值，即，得到该孔位去掉噪声的荧光灰度值，再将基准孔的基准孔荧光灰度值与该孔位的测试孔荧光灰度值相比，便可得到该孔位去掉噪声后的校准系数。
根据本发明的一个实施例，所述根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值的步骤中，具体包括：
所述采集模块采集所述试剂管被激发光照射时的图像，并提取各孔位灰度值；
将各孔位灰度值进行降噪处理，得到各测试孔荧光灰度值；
基于各测试孔的测试孔荧光灰度值和各测试孔的校准系数，得到各测试孔校准后的测试孔荧光灰度值。
根据本发明的一个实施例，还包括所述第一试管内盛放的染料标准品浓度不同时，建立染料标准品浓度梯度模型，求出每个梯度内同一测试孔的校准系数后，将不同梯度的校准系数求和并取平均值，将求得的平均值作为该测试孔的平均校准系数。
具体来说，由于在实际使用中，不同样本检测对染料的浓度需求不同，染料浓度与荧光值也存在一定的非线性关系，同时各试剂管与镜头光学系统光轴的夹角不同，造成各孔位相同的荧光存在位置差异，叠加后的误差效果更大，因此通过对不同浓度的染料标准品，建立浓度梯度模型，求得相应的测试孔校准系数后，再取平均值，减小染料荧光非线性误差带来的影响实验准确性的问题。
根据本发明的一个实施例，所述第一试管盛放的染料标准品为一种或多种染料混合液。
具体来说，可以同时对一个或多个通道进行校准，大大提升校准效率。
根据本发明第二方面实施例的一种基于POCT的荧光定量PCR仪，通过上述的一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法进行校准。
本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：本发明提供的校准方法，克服了各试剂管孔位与镜头光学系统光轴的夹角不同，造成各孔位相同的荧光存在位置差异的问题，同时使本发明提出的基于POCT荧光定量PCR仪的性能满足行业标准要求，确保基因检测准确性；解决了传统荧光定量PCR仪结构复杂、成本高，临床SNP基因检测上存在操作复杂、检验周期长、检测环境高(必须满足PCR试验室要求)等突出题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的荧光定量PCR仪校准方法的逻辑流程示意图；
图2是本发明实施例提供的荧光定量PCR仪的装置布局第一示意图；
图3是本发明实施例提供的荧光定量PCR仪的装置布局第二示意图；
图4是本发明实施例提供的试剂管沿正向或反向调整至相邻孔位的示意图。
附图标记：
1：试管架；2：试剂管；3：孔位；4：帕尔贴；5：散热器；6：发光源；7：激发滤光镜；8：散射片；9：导光柱；10：发射滤镜；11：镜头；12：工业相机。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明实施例的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
图1是本发明实施例提供的荧光定量PCR仪校准方法的逻辑流程示意图，主要用来展示本发明校准方法的逻辑流程，本发明的荧光定量PCR仪中设置有若干孔位3，各孔位3的光源反射光和荧光经过发射滤镜10、光学镜头11投射到工业相机12上，工业相机12成像像素点根据感应到光信号强度差异输出相应的灰度数据。由于，不同孔位3的光路与光学系统光轴存在夹角，因此，相同条件下(激发光源6和标准品一致)不同孔位3图像对应的灰度值不同，且存在线性关系，即，基准孔灰度值与该孔位灰度值的比值为定值，为该孔位3的校准系数，因此获得该孔位3的校准系数后，在实验中，将获得的该孔位3荧光灰度值乘以该孔位3校准系数，则得到该孔位3荧光灰度值的校准值，即，更接近真实值的荧光灰度值。
图2是本发明实施例提供的荧光定量PCR仪的装置布局第一示意图，从图2中可以看出，本发明提供的荧光定量PCR仪包括试管架1、试剂管2，其中为了便于展示，将试管架1做了简化，试管架1上设置有若干孔位3，试剂管2插入孔位3内，荧光定量PCR仪还设置有帕尔贴4和散热器5，用于在荧光定量PCR仪校准和平时使用中，对试剂管2内的温度进行控制，此外光源模块对应每个孔位3，设置于试管架1的侧部。光源模块包括发光源6、激发滤光镜7、散射片8和导光柱9；采集模块设置于试管架1的底部，采集模块包括发射滤镜10、镜头11和工业相机12，其中工业相机12可以是CMOS或者CCD等感光装置，本发明光学系统设计简单，不需要复杂的光学器件进行光学校准或切换，各孔位3的荧光便可实现快速、同步的采集。
进一步地，本发明的光学系统采用激发光侧面进光，荧光底部采集方式设计，试剂管2采用透明PP材料制作，具备较好的热导和通光性，如图2所示，试剂管2上部开口，可以与密封塞/采样头紧密配合达到密封效果，底部为圆形平面结构，方便荧光采集。试管架1为试剂的加热和固定部件，试剂管2插入试管架1的孔位3内，孔位3处的侧面和底面分别开有通光孔。光源模块发射的激发光，沿侧面通光孔轴线方向照射到试剂管2下半部的试剂上，激发出荧光，荧光从试剂管2底部及孔位3底面的通光孔射出，被试管架1底部采集装置采集。
需要说明的是，光源模块中的激发滤光镜7和采集模块中的发射滤镜10通道为两个或者两个以上，PCR仪可以同时获取多通道图像数据。
图3是本发明实施例提供的荧光定量PCR仪的装置布局第二示意图，为了便于展示，图3作了简化，从图3中可以看出，试剂管2相邻等间距布置，试剂管2的下部设置有采集模块，采集模块主要包括发射滤镜10、镜头11和工业相机12，为实现设备的紧凑小巧、荧光快速采集的要求，本发明的光学系统采集装置直接用高品质的光学镜头11对多支排列的试剂管2平面底部进行精密对焦，然后用高动态感光范围的CMOS或者CCD等感光装置进行荧光采集。
进一步地，本发明光学系统统结构简单、紧凑，适合即时检验测场景应用需求。由于，荧光采集端直接用高品质的光学镜头11对多支排列的试剂管2平面底部进行精密对焦，然后用高动态感光范围的CMOS或者CCD等感光装置进行荧光采集。该即时检验方案光学系统简单、性能可靠。
图4是本发明实施例提供的试剂管2沿正向或反向调整至相邻孔位3的示意图。图4中仅仅只是展示了一种调节形式，并非限定只能按照图4中所展示的方向进行调整，也未限定正向和反向的明确方向，图4仅仅作为一种示意图。
总的来说，由于各试剂管2孔位3与镜头11光学系统光轴的夹角不同，造成各孔位3的荧光存在差异。需要对荧光进行校准，使仪器的荧光一致性满足行业标准要求，确保基因检测准确性。
在本发明实施例的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明实施例中的具体含义。
在本发明实施例中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在一个具体实施方案中，如图1至图4所示，本发明提供一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，包括：试管架1，试管架1上设置有若干孔位3；试剂管2，对应设置于试管架1的孔位3内，用于盛放标准品；光源模块，对应每个孔位3，设置于试管架1的侧部；采集模块，设置于试管架1的底部。
校准方法包括如下步骤：
将放置有试剂管2的孔位3标记为至少一个基准孔和若干测试孔；
驱动光源模块朝向对应的试剂管2发射激发光；
通过采集模块采集试剂管2被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值；
根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值；
根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数；
根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值。
具体来说，对测试孔校准系数的计算，通过以下公式实现：
Ki＝Xd/Xi，
上式中，Ki为第i孔灰度值校准系数；
Xi为第i孔灰度值；
Xd为基准孔的灰度值。
通过上式，可以求得第i孔的灰度值校准系数。
需要说明的是，本发明提供的校准方法，克服了各试剂管2孔位3与镜头11光学系统光轴的夹角不同，造成各孔位3相同的荧光存在位置差异的问题，使仪器的荧光一致性满足行业标准要求，确保基因检测准确性。
还需要说明的是，虽然光源模块，对应每个孔位3，设置于试管架1的侧部，但光源模块发射的激发光则是发射至孔位3内盛放标准品的试剂管2，进而激发试剂管2内盛放的标准品激发出荧光或者反射光，因此此处限定并不矛盾。
在一个具体实施方案中，本发明提供一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，由于各孔位3的灰度值为荧光和反射光灰度值之和，荧光灰度值即荧光数据由荧光染料激发产生，与染料浓度成正比，反射光灰度值为噪声，在反射光灰度值存在的情况下，会影响孔位3校准系数的准确性，进而导致获得的荧光灰度值准确度下降，与实际值产生偏差。
基于上述靠考虑，本实施方案提出如下方法：
通过将试剂管2内盛放的标准品进行分类，分为能够激发出荧光的染料标准品，和能激发反射光的纯水标准品，并对两种试剂管2进行采集，分别获得含有噪声的孔位灰度值和孔位3内只含有噪声的反射光灰度值。
采取降噪处理，将孔位灰度值减去反射光灰度值，即，在某一孔位3处，将孔位灰度值的噪声去掉，保留荧光灰度值，进而将基准孔荧光灰度值与测试孔荧光灰度值进行相应的计算，得到去除噪声的、更接近真实值的测试孔的校准系数。
具体步骤如下：
首先，将放置有试剂管2的孔位3标记为至少一个基准孔和若干测试孔之前，还包括标准品的制备步骤，上述制备步骤如下：
将试剂管2分为盛放染料标准品的第一试管和盛放纯水标准品的第二试管，并将第一试管和第二试管放入试管架1的孔位3内。
具体来说，通过将试剂管2分成盛放不同标准品的第一试管和第二试管，增加了噪声获取和降噪处理步骤，提升了对测试孔校准系数的准确性，使得计算得到的测试孔的校准系数更接近真实值。
其次，光源模块朝向对应的试剂管2发射激发光中，包括如下步骤：
光源模块朝向第一试管发射激发光，激发第一试管内盛放的染料标准品发出荧光；
光源模块朝向第二试管发射激发光，激发第二试管内盛放的纯水标准品发出反射光。
具体来说，上述通过发光模块朝向第一试管、第二试管发射激发光，并激发出第一试管内盛放的染料标准品发出荧光，第二试管内盛放的纯水标准品发出反射光中，第一试管和第二试管处于不同的孔位3，即，上述得到的是两个或多个孔位3的数据，其中放置第一试管的孔位3发出荧光，放置第二试管的孔位3发出反射光。
进一步地，在第一试管内，虽然盛放的是染料标准品，但其由于染料也是通过水进行溶解的，因此第一试管内发出的荧光其实也包含了反射光，即，第一试管内染料标准品激发出的荧光含有噪声。
然后，采集模块采集试剂管2被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值中，包括如下步骤：
采集模块采集第一试管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值，得到该孔位3的孔位灰度值；
采集模块采集第二试管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值，得到该孔位3的反射光灰度值。
具体来说，通过光源模块激发第一试管内的染料标准品发出荧光，得到该孔位3下的图像灰度值，该孔位灰度值为包含了荧光灰度值和反射光灰度值的综合图像灰度值，即存在一定的噪声，影响测试结果的准确性，使得孔位3的校准系数存在偏差。
进一步地，通过光源模块激发第二试管内的纯水标准品发出反射光，得到该孔位3下的反射光灰度值，即得到了该孔位3的噪声，校准时可以先进行降噪处理，消除噪声影响，有效的提升校准精度。
最后，将该孔位3的孔位灰度值减去该孔位3的反射光灰度值，得到该孔位3的荧光灰度值，将基准孔的基准孔灰度值减去基准孔的基准孔反射光灰度值，得到基准孔的荧光灰度值。
根据基准孔的荧光灰度值与该孔位3的荧光灰度值，计算得到该孔位3的校准系数。
具体来说，对测试孔校准系数的计算，通过以下公式实现：
Ki＝(xd+Bd)/(xi+Bi)，
上式中，Ki为第i孔灰度值校准系数；
xi为第i荧光灰度值；
Bi为第i的噪声；
xd为基准孔荧光灰度值；
Bd为基准孔的噪声。
进而可知，ki＝xd/xi，
ki即为第i孔去掉噪声值的灰度值校准系数。
在一个具体实施方案中，本发明提供一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，从图4中可知，由于传统的测试方法中，由于同组相同浓度、不同支的标准品对应的孔位3不同，不同支标准品的浓度、装量及耗材光学性能难免存在差异，标准品的误差会影响校准的精度，同时，单次测量容易产生随机误差，影响孔位3的校准系数的准确性，因此通过将每支试剂管2按顺序依次在每个孔位3进行测量，可以有效消除不同支标准品误差造成的影响，同时可以降低随机误差，保证了数据的准确性和稳定性，同时也保证了校准效率。
基于上述靠考虑，本实施方案提出如下方法：
将第一试管和第二试管依次沿正向或者反向，在孔位3内循环采集，光源模块向对应孔位3发射激发光，采集模块采集全部孔位3的图像，直至每一个孔位3将全部试剂管2在该孔位3的灰度值采集完毕。
对每个孔位3采集到的孔位灰度值和反射光灰度值，进行求和并取平均值。
采取降噪处理，将孔位灰度值减去反射光灰度值，即，在某一孔位3处，将孔位灰度值的噪声去掉，保留荧光灰度值，进而将测试孔荧光灰度值与基准孔荧光灰度值进行计算，得到去除噪声的、更接近真实值的测试孔的校准系数。
具体步骤如下：
将全部试剂管2沿正向或反向调整至相邻的孔位3后，执行光源模块发射激发光和采集模块采集图像的步骤；重复上述步骤，直至每一个孔位3将全部试剂管2在该孔位3的图像采集完毕。
需要说明的是，沿正向或反向调整至相邻的孔位3指的是，所有试剂管2可以向同向相邻的孔位3进行移动，随后采集模块采集相应图像，如此重复，直至每一个孔位3将所有的试剂管2图像都采集到了为止，，这样设置将同组测试内误差尽可能的减小，并提升测试效率。
根据测试孔和基准孔，根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值的步骤中，具体包括：
逐一将各孔位3提取到的所有第一试管的孔位灰度值求和并取平均值，得到各孔位3的孔位平均灰度值；
根据基准孔和测试孔，将孔位平均灰度值分为基准孔平均灰度值和测试孔平均灰度值。
需要说明的是，通过将同一孔位3测得的所有孔位灰度值求和并取平均值，有效的消除了标准传统校准方法同组相同浓度不同支染料标准品对不同孔位3校准产生的随机误差，并根据测试孔和基准孔，将孔位平均灰度值分为测试孔平均灰度值和基准孔平均灰度值，通过测试孔平均灰度值和基准孔平均灰度值的比值，对测试孔的校准系数进行获取，使得测试孔的校准系数更贴近真实值，误差更小。
根据测试孔和基准孔，根据基准孔和测试孔，将孔位平均灰度值分为基准孔平均灰度值和测试孔平均灰度值的步骤之后，还包括：
逐一将各孔位3提取到的所有第二试管在每个孔位3的反射光灰度值求和并取平均值，得到各孔位3的平均反射光灰度值；
根据基准孔和测试孔，将各孔位3的平均反射光灰度值分为基准孔平均反射光灰度值和测试孔平均反射光灰度值。
需要说明的是，通过将同一孔位3测得的所有反射光灰度值求和并取平均值，有效的消除了标准传统校准方法同组相同浓度不同支纯水标准品对不同孔位3校准产生的误差，并根据测试孔和基准孔，将孔位3的平均灰度值分为测试孔平均反射光灰度值和基准孔平均反射光灰度值，这样设置可以获得每个孔位3对应的平均反射光灰度值，即，获得了每个孔位3的灰度值噪声，并且此灰度值更接近真实值，有效的消除噪声对测试的影响。
根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数的步骤中，具体包括：
对基准孔提取到的基准孔平均灰度值和各测试孔提取到的测试孔平均灰度值进行降噪处理；
其中，降噪处理包括将基准孔提取到的基准孔平均灰度值减去基准孔平均反射光灰度值得到基准孔荧光灰度值；将各测试孔提取到的测试孔平均灰度值减去对应孔位的测试孔平均反射光灰度值得到测试孔荧光灰度值；
根据基准孔的基准孔荧光灰度值与各测试孔的测试孔荧光灰度值，计算得到各测试孔的校准系数。
需要说明的是，各孔位3的灰度值为荧光灰度值和反射光灰度值之和，荧光灰度值即荧光数据由荧光染料激发产生，与染料浓度成正比；反射光灰度值即为噪声，由光学系统光源和光路特征来决定，强度固定不变。
还需要说明的是，通过将某一测试孔的测试孔平均灰度值减去该孔位3的测试孔平均反射光灰度值，即，得到该孔位3去掉噪声的荧光灰度值，再将基准孔的基准孔荧光灰度值与该孔位3的测试孔荧光灰度值相比，便可得到该孔位3去掉噪声后的校准系数。
在一个具体实施方案中，如图1至图3所示，本发明提供一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，还包括全部第一试管内盛放的染料标准品浓度不同时，建立染料标准品浓度梯度模型，求出每个梯度内同一测试孔的校准系数后，将不同梯度的校准系数求和并取平均值，将求得的平均值作为该测试孔的综合校准系数。
具体来说，由于在实际使用中，不同样本对染料的浓度需求不同，染料浓度与荧光值也存在一定的非线性关系，同时由于各试剂管2与镜头11光学系统光轴的夹角不同，造成各孔位3相同的荧光存在位置差异，叠加后的误差效果更大，因此通过对不同浓度的染料标准品，建立浓度梯度模型，求得相应的测试孔校准系数后，再取平均值，减小了误差带来的影响实验准确性的问题。
在一个实施例中，所述第一试管盛放的染料标准品为一种或多种染料混合液。
具体来说，可以同时对一个或多个通道进行校准，大大提升校准效率。
在一个具体实施方案中，如图1至图3所示，本发明提供一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值的步骤中，具体包括：
采集模块采集试剂管2被激发光照射时的图像，并提取各孔位3的灰度值；
将各孔位3的灰度值进行降噪处理，得到各测试孔荧光灰度值；
基于各测试孔的测试孔荧光灰度值和各测试孔的校准系数，得到各测试孔校准后的测试孔荧光灰度值。
具体来说，对某一孔位3校准后的荧光数据的计算，通过以下公式实现：
yi＝(Xi-Bi)×ki，
上式中，yi为某一孔位3校准后的荧光数据；
Xi为第i孔灰度值；
Bi为第i的噪声；
ki为第i孔去掉噪声值的灰度值校准系数。
在一个具体实施方案中，本实施方案提供一种基于POCT的荧光定量PCR仪，通过上述的一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法进行校准。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明实施例的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (2)
1.一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法，其特征在于，所述荧光定量PCR仪包括：
试管架，所述试管架上设置有若干孔位；
试剂管，对应设置于所述试管架的孔位内，用于盛放标准品；
光源模块，对应每个孔位，设置于所述试管架的侧部；
采集模块，设置于所述试管架的底部；
所述校准方法包括如下步骤：将放置有所述试剂管的孔位标记为至少一个基准孔和若干测试孔；驱动所述光源模块朝向对应的所述试剂管发射激发光；通过所述采集模块采集所述试剂管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值；根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值；根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数；根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值；
其中，所述将放置有所述试剂管的孔位标记为至少一个基准孔和若干测试孔的步骤之前，还包括：将所述试剂管分为盛放染料标准品的第一试管和盛放纯水标准品的第二试管，并将所述第一试管和所述第二试管放入所述试管架的孔位内；
其中，驱动所述光源模块朝向对应的所述试剂管发射激发光的步骤中，具体包括：驱动所述光源模块朝向所述第一试管发射激发光，以激发所述第一试管内盛放的染料标准品发出荧光；驱动所述光源模块朝向所述第二试管发射激发光，以激发所述第二试管内盛放的纯水标准品发出反射光；
其中，通过所述采集模块采集所述试剂管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值的步骤中，具体包括：通过所述采集模块采集所述第一试管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值，得到该孔位的孔位灰度值；通过所述采集模块采集所述第二试管被激发光照射时的图像，并提取图像的灰度值，得到该孔位的反射光灰度值，通过将试剂管内盛放的标准品进行分类，分为能够激发出荧光的染料标准品，和能激发反射光的纯水标准品，并对两种试剂管进行采集，分别获得含有噪声的孔位灰度值和孔位内只含有噪声的反射光灰度值；
其中，所述根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值的步骤之前，还包括：将全部所述试剂管沿孔位的正向或反向调整至相邻的孔位后，执行所述光源模块发射激发光和所述采集模块采集图像的步骤；重复上述步骤，直至每一个孔位将全部所述试剂管在该孔位的图像采集完毕；
其中，所述根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值的步骤中，具体包括：逐一将各孔位提取到的所有所述第一试管的孔位灰度值求和并取平均值，得到各孔位的孔位平均灰度值；根据基准孔和测试孔，将孔位平均灰度值分为基准孔平均灰度值和测试孔平均灰度值；逐一将各孔位提取到的所有所述第二试管在每个孔位的反射光灰度值求和并取平均值，得到各孔位的平均反射光灰度值；根据基准孔和测试孔，将孔位的平均灰度值分为基准孔平均反射光灰度值和测试孔平均反射光灰度值；
其中，所述根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数的步骤中，具体包括：对基准孔提取到的基准孔平均灰度值和各测试孔提取到的测试孔平均灰度值进行降噪处理；其中，所述降噪处理包括将基准孔提取到的基准孔平均灰度值减去基准孔平均反射光灰度值得到基准孔荧光灰度值；将各测试孔提取到的测试孔平均灰度值减去对应孔位的测试孔平均反射光灰度值得到测试孔荧光灰度值；根据基准孔的基准孔荧光灰度值与各测试孔的测试孔荧光灰度值，计算得到各测试孔的校准系数；对测试孔校准系数的计算，通过以下公式实现：Ki＝(xd+Bd)/(xi+Bi)，上式中，Ki为第i孔灰度值校准系数，xi为第i荧光灰度值；Bi为第i的噪声；xd为基准孔荧光灰度值；Bd为基准孔的噪声；进而可知，ki＝xd/xi，ki即为第i孔去掉噪声值的灰度值校准系数；所述根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值的步骤中，具体包括：所述采集模块采集所述试剂管被激发光照射时的图像，并提取各孔位灰度值；将各孔位灰度值进行降噪处理，得到各测试孔荧光灰度值；基于各测试孔的测试孔荧光灰度值和各测试孔的校准系数，得到各测试孔校准后的测试孔荧光灰度值，即yi＝(Xi-Bi)×ki，上式中，yi为某一孔位校准后的荧光数据；Xi为第i孔灰度值；Bi为第i的噪声；ki为第i孔去掉噪声值的灰度值校准系数；还包括：所述第一试管内盛放的染料标准品浓度不同时，建立染料标准品浓度梯度模型，求出每个梯度内同一测试孔的校准系数后，将不同梯度的校准系数求和并取平均值，将求得的平均值作为该测试孔的平均校准系数；所述第一试管盛放的染料标准品为一种或多种染料混合液。
2.一种基于POCT的荧光定量PCR仪，其特征在于，通过上述权利要求1所述的一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法进行校准。
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