JP2003130795A

JP2003130795A - サンプル・アナライザを校正する方法

Info

Publication number: JP2003130795A
Application number: JP2002153071A
Authority: JP
Inventors: Klaus W Berndt; ダブリュ．バーントクラウス
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2001-05-25
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2003-05-08
Also published as: EP1260810A2; MXPA02005109A; US6468803B1; EP1260810A3

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】血液試料中の単一赤血球容積（ＲＣＶ）等を測
定するための、使い捨てサンプル・アナライザを、高精
度に成形された校正ツールを必要としないで、正確に校
正する方法を提供すること。【解決手段】少なくとも２つの異なる厚さの領域をも
つ光学キュベットのようなチャンバ内に試料を入れ、蛍
光色素を含む試料を励起光で照射して、蛍光顕微鏡の結
像光検出器で検出する。次に、光学キュベットの単一細
胞領域の高さを求めて、校正されたサンプル高さを得
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、定量顕微分光法の
分野に関し、特に、好ましくは使い捨てのサンプル・ア
ナライザであるサンプル・アナライザを校正する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘマトクリット（「ＨＣＴ」）、単一赤
血球容積（「ＲＣＶ」）、平均赤血球容積（「ＭＣ
Ｖ」）及び赤血球分布幅（「ＲＤＷ」）などのような血
液パラメータの測定は、際立った臨床上の関心事であ
る。普通は、電気インピーダンス測定に基づくシステム
（コールターカウンタ）か又は光散乱に基づくシステム
（フローサイトメータ）が使用される（例えば、Ｊ．
Ｂ．Ｈｅｎｒｙ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓ
ｉｓａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｂｙｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙｍｅｔｈｏｄｓ（検査室手法による臨床
診断と管理）」、フィラデルフィア、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎ
ｄｅｒｓＣｏｍｐａｎｙ社、１９９６年、５４８ペー
ジ以下か又は、Ｄ．Ｈ．Ｔｙｃｋｏ、Ｍ．Ｈ．Ｍｅｔ
ｚ、Ｅ．Ａ．Ｅｐｓｔｅｉｎ、Ａ．Ｇｒｉｎｂａｕｍ、
「Ｆｌｏｗ‐ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｌｉｇｈｔｓｃ
ａｔｔｅｒｉｎｇｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｒ
ｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｖｏｌｕｍｅａｎｄ
ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（赤血球容積とヘモグロビン濃度の光散乱フローサイト
メトリー測定）」、ＡｐｐｌｉｅｄＯｐｔｉｃｓ２
４（１９８５）、１３５５−１３６５ページを参照され
たい）。インピーダンス計数器は、複雑で高価な機器で
あり、機器とサンプル・パラメータの非常に慎重な調整
と制御が必要とされる。フローサイトメータの主な欠点
は、光散乱パラメータが、細胞の容積だけでなく細胞の
形状にも左右されるという事実である。

【０００３】１９８３年に、ＧｒａｙとＨｏｆｆｍａｎ
とＨａｎｓｅｎが、フローサイトメータ中の細胞の容積
を測定するための新しい光学的方法を提案した（Ｍ．
Ｌ．Ｇｒａｙ、Ｒ．Ａ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｗ．Ｐ．Ｈａ
ｎｓｅｎ、「Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｅ
ｌｌｖｏｌｕｍｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｂａｓ
ｅｄｏｎｖｏｌｕｍｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｏｆ
ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅ（蛍光色素を排
除した容積に基づく細胞容積の新しい測定方法）」、Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ３（１９８３）ｐ４２８−４３
２）。この方法において、細胞が、細胞膜に浸透し得な
い蛍光色素の中に懸濁される。細胞懸濁液の狭い流れ
が、合焦されたレーザ・ビームによって励起された時に
生じる蛍光レベルは、細胞が照光領域に到達するまで一
定のままであり、これにより、細胞容積に正比例して蛍
光強度が低下することになる。フローサイトメータにお
いて、単一の細胞が、レーザ照射されるスポットをほぼ
１０□秒以内で通過する。データ収集の時間間隔が短い
ことから、電子検出のバンド幅を比較的広くとる必要が
あり、その結果、容積測定における信号対雑音比が低く
なり、精度が低くなる。

【０００４】利用可能なデータ収集時間は、静止した試
料中に細胞を懸濁させて、デジタル画像蛍光顕微鏡検査
法を適用することで、顕著に増加させることができる
（Ｐ．Ｌ．Ｂｅｃｋｅｒ、Ｆ．Ｓ．Ｆａｙ、「Ｃｅｌｌ
‐Ｖｏｌｕｍｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｕｓｉｎｇ
ｔｈｅｄｉｇｉｔａｌｉｍａｇｉｎｇｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（デジタル画
像蛍光顕微鏡を用いる細胞容積の測定）」、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ４９（１９８６）、Ａ
４６５を参照されたい）。デジタル蛍光顕微鏡検査法の
手法において、細胞容積を求めるのに校正手順が必要と
される。Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄとその共同研究者ら
は、細胞と一緒に懸濁された光学的に透明な非蛍光ミク
ロスフェアを用いて校正を行う方法を紹介した（Ｄ．Ｒ
ｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ、Ｊ．Ｐｈｉ‐Ｗｉｌｓｏｎ、
Ｂ．Ｖｅｒｗｅｒ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｄｉｇｉｔａｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（デジタル顕微鏡検査法を用いる
蛍光定量）」ＪｏｕｒｎａｌＰｈｙｓｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ９７（１９９３）、２８６８−２８７
０ページ）。個々の球体の容積は、顕微鏡でそれらの投
影面積を測定し、この数を体積に変換して、理想の球形
とみなすことで求められる。蛍光の発光から除外されて
いる球体の容積を、所要の校正パラメータとして用いた
結果として、蛍光強度が低下することになる。この手法
の利点は、校正用粒子が試料自体の中に存在するという
事実によって与えられる。言い換えれば、校正は、全く
同じ試料容器で実行され、付加的な校正試料を必要とし
ない。

【０００５】細胞懸濁液中で校正球体を使用することに
は、問題がないというわけではない。第１に、球体の導
入は、作業の流れにおける付加的なステップとなる。流
量が高くなるように設計されたシステムにおいて、この
付加的なステップは、不利益となる。第２に、Ｒｅｃｋ
ｔｅｎｗａｌｄとその共同研究者らは、蛍光色素分子が
球体の表面上に沈降して、誤差を生じさせる傾向がある
ことを観測している。第３に、球体の光学的屈折率が、
液体の屈折率とマッチしない場合には、球体の縁に、計
測した蛍光強度における屈折に基づくアーチファクトが
生じる。さらに、最後に、例えば数マイクロメートルか
又はそれ以下のオーダーの薄い試料の厚さが必要とされ
る場合に、ミクロスフェアの使用は、問題となることが
ある。

【０００６】従来技術の問題を克服するために、Ｗａｒ
ｄｌａｗに付与された米国特許第６，１２７，１８４号
に、細胞懸濁液のための、異なる領域に異なる光路長を
もつキュベット状の光学試料容器が提案されている。少
なくとも１つの領域において、希釈されていない血液の
液層の厚さが非常に薄く（２ミクロンから７ミクロ
ン）、分離されたＲＢＣの単層が形成される。別の領域
において、液層は、より厚く（７ミクロンから４０ミク
ロン）、通常はＲＢＣの鎖状の集合体（「Ｒｏｌｅａｕ
ｘ」）が形成される。厚い領域は、ＨＣＴを求めるのに
使用され、薄い領域は、単一赤血球容積（ＲＣＶ）を求
めるのに使用される。従来技術のように、血漿が、ＲＢ
Ｃ中に浸透しない蛍光色素で染色される。

【０００７】米国特許第６，１２７，１８４号に記載さ
れた方法及び装置において、全血試料のＨＣＴが、次式
によって求められる。

【０００８】

【数１０】

【０００９】式（１）において、Ｂ_ｔは、無細胞の血漿
領域内の既知サイズの面積から発現する蛍光強度であ
る。Ｂ_ａは、Ｒｏｌｅａｕｘ構成体のＲＢＣを含む同じ
サイズの別の面積から発現した蛍光強度である。実際に
は、Ｂ_ｔは、或る無細胞領域の蛍光強度を計測して、大
きいサイズに外挿することで求められる。興味深いこと
に、ＨＣＴを求めるために、キュベットの高さを測定す
る必要はない。

【００１０】次式を用いて、単一赤血球容積ＲＣＶを求
めることができる。

【００１１】

【数１１】

【００１２】ここで、式（１）と同様に、Ｂ_Ｐは、無細
胞の血漿領域内の既知サイズＡの面積から発現する蛍光
強度である。Ｂ_ＲＢＣは、単一のＲＢＣを含む同じサイ
ズの別の面積から発現する蛍光強度である。実際には、
Ｂ_Ｐは、特定のＲＢＣ近傍の無細胞領域の蛍光強度を測
定して、標準サイズＡに外挿することで求められる。Ｈ
ＣＴ測定とは対照的に、絶対面積Ａと、液層の絶対高さ
ｄを知る必要がある。これはまた、単一のＲＢＣが包埋
される絶対容積を知る必要があるとも言える。

【００１３】

【数１２】

【００１４】面積Ａは、顕微鏡で容易に測定することが
できる。ＲＢＣ近傍の高さｄの測定には、「校正」とい
う、より複雑な問題がある。

【００１５】米国特許第６，１２７，１８４号に、光学
キュベットを「校正」する、すなわち高さｄを求める幾
つかの方法が開示されている。選択肢の１つにおいて、
既知容積の矩形のキャピラリが、キュベットと一体化さ
れる。このキャピラリから再発現する蛍光強度を計測す
ることで、１つには校正パラメータＣ＝強度／容積が得
られる。単位面積当たりの蛍光強度は、キュベットの高
さに比例すると考えられることから、再発現する蛍光強
度により、どの位置における高さをも求めることができ
る。別の方法としては、米国特許第６，１２７，１８４
号に、深さが正確に調整された井戸のような、成形され
た校正標準を使用することが開示されている。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、既知容
積の矩形のキャピラリを一体化させたり、深さが正確に
調整された井戸状のものを使用したりすると、複雑さが
増して、これにより、キュベット状の光学試料容器のコ
ストが増すことになる。したがって、一体化されるか又
は成形される高精度の校正ツールのいずれも必要としな
い、使い捨てのサンプル・アナライザを校正する方法に
ついての必要性も存在している。

【００１７】本発明の目的は、好ましくは使い捨てのサ
ンプル・アナライザであるサンプルアナライザを校正す
る方法、具体的には、血液試料中のＲＣＶ測定のため
の、サンプル・アナライザ内に高精度の成形された校正
ツールを必要としない正確な校正方法を提供することで
ある。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記の
目的は、好ましくは全血である生物学的流体の試料を、
例えば、少なくとも２つの異なる厚さの領域をもつ光学
キュベットのようなチャンバ内に配置することで達成さ
れ、好適な実施形態において、血漿は、赤血球の中に拡
散しない蛍光色素を含む。試料を、蛍光顕微鏡のような
光学式走査機器に置き、血漿が蛍光発光するように励起
光で照射して、顕微鏡の結像光検出器で検出する。蛍光
色素は、励起光と発光した蛍光のいずれも、赤血球に著
しく吸収されないように選択される。

【００１９】次いで、次のステップからなるプロセスを
実行することで、光学キュベットの単一細胞領域の高さ
の値を求める。（ａ）十分な高さの校正領域内の無細胞位置における蛍
光強度値を計測し、（ｂ）無細胞条件下であると思われ
るサイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度Ｉ
ｃａｌを外挿し、（ｃ）単一細胞領域内の無細胞位置に
おける蛍光強度値を計測し、（ｄ）無細胞条件下である
と思われるサイズＡの全校正面積について積分された蛍
光強度Ｉｓｃａを外挿し、（ｅ）次式を用いて有効高さ
Ｈを求め、

【００２０】

【数１３】

【００２１】ここで、

【００２２】

【数１４】

【００２３】このとき、

【００２４】

【数１５】

【００２５】ここで、

【００２６】

【数１６】

【００２７】ここで、

【００２８】

【数１７】

【００２９】ここで、ＮＡは、顕微鏡の対物レンズの開
口数であり、λ_ｅｘは、励起中心波長であり、λ
_ｅｍは、発光中心波長であり、ｚは、顕微鏡の結像光学
系に平行な軸上の試料内の位置であり、（ｆ）次式によ
って量Ｋを計算し、

【００３０】

【数１８】

【００３１】ｋ）次式の解である積分極限ｄを求める。

【００３２】

【数１９】

【００３３】ここで、ｄは、求める単一細胞領域におけ
る未知のサンプル高さ（キュベットの高さに等しい）に
等しい。

【００３４】

【発明の実施の形態】本発明の方法によれば、好適には
血液、より好適には懸濁した赤血球（「ＲＢＣ」）を含
む希釈されていない血液のような生物学的流体の試料
を、例えば、少なくとも２つの異なる厚さの領域をもつ
光学キュベットのようなチャンバの中に入れる。キュベ
ットは、比較的薄く、好適には試料が対物レンズを通し
て照射されるＥＰＩ構成の蛍光顕微鏡である蛍光顕微鏡
の試料ステージに位置決めされるのに適していることが
好ましい。本発明は、共焦点顕微鏡が使用される場合に
も適用可能である。

【００３５】液体試料に蛍光色素を加え、均一に分散さ
せる。色素は、ＲＢＣの中に漏出しないように選択され
る。言い換えれば、血漿だけが蛍光色素で染色される。
色素は、ＲＢＣ内での吸収が微弱なスペクトル領域内
で、励起光を吸収するべきである。ヘモグロビンが、Ｒ
ＢＣにおける優勢な吸収体であることから、励起波長
を、好ましくは６００ｎｍより長くするべきである。好
適な実施形態において、６４０ｎｍ付近の波長範囲内で
励起可能な色素ＴＯ‐ＰＲＯ‐３（例えば、オレゴン州
ユージーン所在のモレキュラー・プローブス社から販売
されている）を使用することができる。別の好適な色素
は、同じくＲＢＣの中に浸透せず、７５０ｎｍ付近で励
起可能な、ＴＯ‐ＰＲＯ‐５（同じくモレキュラー・プ
ローブス社から販売されている）である。

【００３６】「ＥＰＩ構成」とは、蛍光顕微鏡検査法で
使用される一般的な用語である。これは、ほぼ平行な励
起光が、対物レンズに向けて（普通は下向きに）導かれ
るということを意味している。接近する励起光が、対物
レンズによって試料上に合焦され、照射強度の高い小領
域が形成される。試料の小領域内で発生した蛍光が、全
く同じ対物レンズによって集光されて、上向きに進む平
行な蛍光ビームが形成される。平行ビームは、試料が対
物レンズの焦点面にほぼ正確に配置されることから形成
される。このとき、対物レンズの上に２つの重なり合う
ビーム（下向きに進む励起ビームと、上向きに進む蛍光
ビーム）が存在する。例えば、ダイクロイック・ビーム
・スプリッタを挿入することで、ビームの一方が９０度
の角度で分離される。これは、蛍光放射が、励起光より
長波長であることから可能となる。多くの顕微鏡におい
て、励起ビームが分離される。言い換えれば、ほぼ平行
な励起ビームが、ダイクロイック・ブロックに到達し
て、対物レンズに向けて導かれる。試料で発生した蛍光
は、ダイクロイック・ブロックを直線的に通り抜けて、
結像光検出器か又は観測者の眼に到達することになる。

【００３７】本発明に係る（使い捨ての）サンプル・ア
ナライザを校正する方法は、次の７つのステップに要約
することができる。ステップ１十分な高さの校正領域内の無細胞位置における蛍光強度
値を計測する。ステップ２無細胞条件下であると思われるサイズＡの全校正面積に
ついて積分された蛍光強度Ｉｃａｌを外挿する。ステップ３単一細胞領域内の無細胞位置における蛍光強度値を計測
する。ステップ４無細胞条件下であると思われるサイズＡの全校正面積に
ついて積分された蛍光強度Ｉｓｃａを外挿する。ステップ５次式を用いることで有効高さＨを求める。

【００３８】

【数２０】

【００３９】ここで、

【００４０】

【数２１】

【００４１】このとき、

【００４２】

【数２２】

【００４３】ここで、

【００４４】

【数２３】

【００４５】また、

【００４６】

【数２４】

【００４７】ここで、ＮＡは、顕微鏡の対物レンズの開
口数であり、λ_ｅｘは、励起中心波長であり、λ
_ｅｍは、発光中心波長であり、ｚは、顕微鏡の結像光学
系に平行な軸上の試料内の位置である。ステップ６次式によって量Ｋを計算する。

【００４８】

【数２５】

【００４９】ステップ７次式の解である積分極限ｄを求める。

【００５０】

【数２６】

【００５１】ここで、ｄは、求められた単一細胞領域に
おける未知のサンプル高さ（キュベットの高さに等し
い）に等しい。以下に、本発明に係るステップ１からス
テップ７までを、さらに詳細に説明する。

【００５２】ステップ１説明のために、図１に、ＥＰＩ構成の典型的な蛍光顕微
鏡の対物レンズの下に形成された、励起光のダブルコー
ンを概略的に示す。図１には、光学キュベット内の光の
みが示されており、（１）は上部窓であり、（２）はベ
ース・プレートであり、（３）はキュベット内の液体試
料であり、（４）はダブル・コーンであり、（５）はビ
ーム・ウェストである。最大励起強度が、ビーム・ウェ
スト領域から得られるということは明白である。図２の
プロットは、Ｚ位置の関数としての液体試料内の軸上の
強度を示している。入射ひとみを均一に照らす理想のレ
ンズが、開口数ＮＡ＝０．４、波長λ＝６００ｎｍであ
るとみなす。図２のキュベットの高さは、３２ミクロン
（−１６・・・＋１６）である。このプロットは、液体
の容積の一部のみが最大発光強度を受光し、しかも、こ
の受光部分内での強度が一定ではないということを示し
ている。

【００５３】図２から、以下の結論を引き出すことがで
きる。高さが変化するキュベットを使用する場合には、
計測された蛍光強度は、最初は、キュベットの高さが増
加するのに伴い増加する。しかしながら、キュベットの
高さが図２に示す強度分布曲線より大きい値に到達する
と、計測された蛍光強度が上限に達することになる。言
い換えれば、キュベットの高さがさらにいくら上昇して
も、計測された蛍光強度はそれ以上増加しないことにな
る。

【００５４】図３は、対物レンズのＮＡ＝０．４、励起
中心波長λ_ｅｘ＝５００ｎｍ、発光中心波長λ_ｅｍ＝６
００ｎｍのときの、キュベットの高さの関数としての蛍
光強度を示している。本発明のステップ１は、「十分
な」高さの校正領域で実行される。ここでの「十分な」
とは、蛍光の上限が計測されるような高さを意味する。

【００５５】本発明に係る校正に使用可能な所要の最小
高さが、対物レンズの開口数ＮＡと、励起波長範囲Δλ
_ｅｘと、蛍光発光波長範囲Δλ_ｅｍと、に基づいている
ということに注目されたい。顕微鏡の結像光検出器によ
って「見られる」ような一定の面積Ａのとき、図２に示
すプロットが、キュベット内のＺ位置の関数としての励
起強度Ｅ（ｚ）だけでなく、Ｚに依存するフォトン収集
効率Ｄ（ｚ）も表すことから、射出波長範囲は、ここに
含まれる。言い換えれば、ＮＡとΔλ_ｅｘとΔλ_ｅｍに
より特徴付けられる特定の実験条件のいずれかにおい
て、この使い捨てのものを校正するのに十分な最小高さ
を、数学的に求めることができる。波長範囲の代わり
に、中心波長λ_ｅｘとλ_ｅｍをそれぞれ使用することも
できる。上述のように、図３のプロットは、開口数が
０．４、励起中心波長が５００ｎｍ、発光中心波長が６
００ｎｍのときに当てはまる。校正するのに「十分な」
キュベットの高さは、その高さが１０ミクロンより増加
しても蛍光強度が増加しないことから、１０ミクロンよ
り上の高さのどれかである。

【００５６】ステップ２ステップ２において、顕微鏡の結像光検出器によって見
られるような面積Ａの全体の、すなわち積分された蛍光
強度Ｉｃａｌが求められる。これは、ピクセル・ヒスト
グラムか又は画像処理の分野で知られている一般的な手
順を用いることで達成可能である。ステップ１とステッ
プ２で求められるような積分された蛍光強度が、無細胞
領域に対応するということは重要である。

【００５７】ステップ３ステップ３は、ステップ１の繰り返しであるが、使い捨
てのものの単一細胞領域で実行され、この単一細胞領域
は、ＲＢＣが単層で存在し、好ましくは互いから幾らか
の距離だけ離間されている領域である。後者は、画像処
理を容易にし、ＲＣＶ測定における精度を向上させるこ
とができる。

【００５８】ステップ４ステップ４は、ステップ２と同じであるが、単一細胞領
域で繰り返される。

【００５９】ステップ５ステップ５における式（４）は、結像光検出器によって
見られるような面積Ａから期待される最終積分された蛍
光強度の計算を表す。強度Ｉｃａｌは、次式で与えられ
る。

【００６０】

【数２７】

【００６１】ここでηは、蛍光体の量子収量と、幾何学
的形状と、光検出器の感度と、電子利得の寄与が考慮に
入れられている。Ｉ_０は、最大励起強度であり、Ａは、
前と同じく顕微鏡の結像光検出器によって見られるよう
なフォトンの収集面積である。Ｉｃａｌはまた、次のよ
うにも書き表される。

【００６２】

【数２８】

【００６３】ここで、

【００６４】

【数２９】

【００６５】また、

【００６６】

【数３０】

【００６７】式（１４）は式（４）と同一である。式
（１２）と式（１３）の量Ｃは、校正定数と考えられる
が、本発明に係る手順により消去することができるとい
うことが後で分かる。

【００６８】式（１４）における量Ｈは、Ｚ方向に沿っ
た一定の励起強度と一定のフォトン収集効率が、高さＨ
（式（１２）参照）を横切るとみなされる場合に、「有
効高さ」と考えることができる。上述のように、Ｈの値
は、ＮＡとλ_ｅｘとλ_ｅｍが分かっている場合に計算す
ることができる。ＮＡ＝０．４、λ_ｅｘ＝５００ｎｍ、
λ_ｅｍ＝６００ｎｍのとき、Ｈ＝４．５１３ミクロンが
得られる。この計算は、実際の蛍光強度計測には必要な
いということを強調しておく。

【００６９】校正領域についての式（１１）と同じく、
次式により、単一細胞領域から期待される積分された蛍
光強度を計算することができ、

【００７０】

【数３１】

【００７１】ここで、ｄは、求める必要がある単一細胞
領域の未知キュベット高さを表す。式（１５）を式（１
１）で割り、幾分再整理することで、結果として、

【００７２】

【数３２】

【００７３】が得られる。式（１６）は、式の右辺の値
に等しい左辺の積分値を与える積分極限ｄを求める、と
いう最短でできる形態の本発明の核心を含んでおり、こ
の右辺は、理論値Ｈと、２つの実験的に求められる積分
された蛍光強度ＩｓｃａとＩｃａｌの各々との組み合わ
せを含んでいる。上記のように、式（１５）を式（１
１）で割ることで、最大励起強度と他の実験パラメータ
を含む式（１３）による校正定数Ｃが消去される。

【００７４】ステップ６本発明のステップ６において、理論量Ｈと、２つの実験
的に求められる積分された蛍光強度ＩｓｃａとＩｃａｌ
に基づく、式（１６）の右辺に等しい量Ｋが求められ
る。一例において、ＮＡ＝０．４、λ_ｅｘ＝５００ｎ
ｍ、λ_ｅｍ＝６００ｎｍ、単一細胞領域においてキュベ
ットの高さが３ミクロンであるとみなされるときに、Ｉ
ｓｃａとＩｃａｌの期待値を計算することができる。こ
れらと（式（１４）を解くことで上記で得られたよう
な）Ｈ＝４．５１３ミクロンとを組み合わせることで、
Ｋ＝２．７０５ミクロンが得られる。次のステップにお
いて、このＫ値は、単一細胞領域の真の高さを計算する
のに使用される。

【００７５】ステップ７ステップ７は図４に示されており、図４には、Ｋ値の
２．７０５が破線で示され、式（１６）の左辺からの積
分値が示されている。キュベットの高さｄが増加する
と、積分値も増加する。ｄ＝３ミクロンのとき、積分値
はＫ＝２．７０５に等しく、期待通りに真のキュベット
高さに対応する。ＮＡとλ_ｅｘとλ_ｅｍで特徴付けられ
る与えられた実験条件において、単調に増加する一続き
の「推定された」キュベットの高さについての式（１
６）の積分値を求めることができる。次いで、このデー
タを、ルックアップ・テーブルの形態で保存することが
できる。したがって、ＩｃａｌとＩｓｃａの実験値が考
慮に入れられた量Ｋを求め、次いで、特定のキュベット
高さｄのどれが現在のＨ値に対応するのかをテーブルか
ら索引することで、本発明に係る方法を実行することが
できる。

【００７６】これまでは、試料が対物レンズを通して照
らされる（ＥＰＩ構成）蛍光顕微鏡を考えてきた。ＥＰ
Ｉ構成を用いることには、励起光を必要とする通常の顕
微鏡作業において利点がある。通常の蛍光顕微鏡検査法
において、同じように制約されるＺ軸に沿う励起が重な
ると、シャープな画像を得ることを可能にするＺ軸に沿
ったフォトン収集効率が制約される。ＨＣＴとＲＣＶを
求めるここでの課題において、例えば、照射経路に対物
レンズを含まずに試料を背面か又は側面から照らすこと
で、Ｚ軸に沿った均質照射に切り換えることができる。
これに関連して、本発明に係る校正方法が、上記の場合
にも適用可能であるということに注目されたい。数学的
に、式（５）、式（１０）、式（１１）、式（１４）、
式（１５）、及び式（１６）のＥ（ｚ）に定数Ｅ_０＝１
を代入する。その他の点では、これらのプロセス・ステ
ップは同一になる。図５は、均質照射が第１平坦域に到
達し、次いで、キュベットの厚さが増加するのに伴って
僅かな増加傾向を示す場合の校正強度Ｉｃａｌを表して
いる。この場合、これは、厚さがおよそ１５ミクロンの
キュベット領域か又は厚さがおよそ３０ミクロンのキュ
ベット領域を使用することができるということを意味し
ている。また、正確な厚さを知る必要はない。図６は、
均質照射のための最終プロセス・ステップを表す。

【００７７】実際には、式（５）から式（８）までは、
Ｚ軸に沿った照射強度とフォトン収集効率における実際
の軸上分布をいつも表すわけではないということが分か
っている。この理由はマニホルドである。一例として、
式（５）から式（８）までは、試料内での光の散乱や、
顕微鏡の光学系統の不完全性、キュベットの上部窓にお
ける光の屈折その他類似のものなどのような小さいアー
チファクトが考慮されていない。したがって、式（４）
における関数Ｅ（ｚ）とＤ（ｚ）を、実験的に求める必
要がある。しかしながら、Ｅ（ｚ）とＤ（ｚ）とを、実
際に別々に求める必要はない。次の関数Ｆ（ｚ）を用い
ることにより、Ｅ（ｚ）とＤ（ｚ）とが組み合わされた
結果だけを考慮に入れることで十分である。

【００７８】

【数３３】

【００７９】さらに、関数Ｆ（ｚ）を求める必要もな
い。代わりに、式（４）、式（１０）及び式（１６）に
係る、変化するキュベットの高さの関数としての蛍光強
度分布を積分することが必要とされる。式（４）と式
（１０）と式（１６）が、同一の照射分布とフォトン収
集分布を示すという事実から、キュベットの高さの関数
としての一連の計測された蛍光強度の１つのみの計測が
必要とされ、関係Ｈ（ｄ）を確立して、式（４）に従い
「有効高さ」値Ｈ（ｈ）を求めることができ、同様に、
ｈは、「十分な」高さである。Ｈ（ｄ）とＨ（ｈ）の両
方は、定数因子を含んでおり、その値は、使用される特
定の機器に基づいている。しかしながら、Ｈ（ｄ）が式
（１０）の左辺に等しく、Ｈ（ｈ）が式（９）の右辺の
Ｈに等しいことから、式（９）と式（１０）との組み合
わせは、定数因子が消去されるということを示してい
る。

【００８０】上述の校正計測は、例えば、高さの値が分
かっている校正キュベットを使用するか又はガラスのよ
うな透明な材料の２枚の堅いプレートからくさび形のキ
ュベットを形成することで実行可能である。くさび形の
キュベットの厚い端に、高さの分かっているスペーサが
使用される場合には、くさび内の適切な位置を選択する
ことで、明確な高さの値を確立することができる。与え
られた蛍光顕微鏡検査法における積分値Ｈ（ｄ）とＨ
（ｈ）が求められると、前述のように本発明を実行する
ことができる。

【００８１】図３から分かるように、式（１０）と式
（１６）の積分値は、５ミクロン以下の非常に小さいキ
ュベットの高さ値、すなわち、単一細胞領域に使用され
る高さ値において、ほぼ直線的な挙動を示す。Ｐが定数
因子である、次の近似式（１８）を用いると、式（１
６）は、式（１９）として書き表すこともできる。

【００８２】

【数３４】

【００８３】

【数３５】

【００８４】式（４）で定義されるような式（１９）に
おける量Ｈは、ＮＡとλ_ｅｘとλ_ｅｍその他などのよう
なパラメータに基づいている。与えられた蛍光顕微鏡の
構成において、Ｈは一定となる。したがって、式（１
９）は、次のように書き表すことができる。

【００８５】

【数３６】

【００８６】このとき、Ｇ＝Ｈ／Ｐであり、これは、特
定の顕微鏡構成について一度だけ求める必要がある別の
定数である。式（２０）は、本発明を実行するための最
も簡単な方法を表す。一回校正して、定数Ｇの値を得た
後に、単一細胞領域の無細胞位置におけるサイズＡの面
積から再発現した蛍光強度Ｉｓｃａを求め、次いで、
「十分な」高さの無細胞位置におけるサイズＡの面積か
ら再発現した蛍光強度Ｉｃａｌを求めて、最終的に、式
ｄ＝Ｇ＊（Ｉｓｃａ／Ｉｃａｌ）により、単一細胞領域
内の位置であるキュベットの高さｄが計算される。一回
校正は、小さいが高さｄ’が分かっているチャンバを使
用して、Ｐ＝Ｈ（ｄ’）／ｄ’のような第１校正定数を
求めることで実行可能である。次いで、量Ｈ（ｈ）を与
える「十分な」高さｈにおいて第２計測を行う。次い
で、最終的な校正定数Ｇが、Ｇ＝Ｈ（ｈ）／Ｐとして得
られる。

【００８７】本発明は、単一細胞領域の蛍光強度を計測
して、第２領域の別の蛍光強度を計測することで、単一
細胞領域の高さが求められ、このとき、第２領域の正確
な高さを知る必要がないという驚くべき事実に基づいて
いる。第２領域の高さが「十分な」ものであるというこ
とのみが必要とされ、ここでの「十分な」とは、与えら
れた顕微鏡構成において、蛍光強度が高さに依存しなく
なることを意味する。ｄの関数としての式（１０）をプ
ロットし（図３参照）、蛍光強度が平坦域に達する高さ
を選択することにより、十分な高さの推定を行うことが
できる。本発明を実行するのに実際の高さの値は必要と
されない、ということに注目することは重要である。

【００８８】式（１６）と式（２０）から分かるよう
に、本発明に係る方法は、２つの計測された蛍光強度、
すなわちＩｓｃａとＩｃａｌとの比を用いるものであ
る。この両方の強度は、励起強度と、光学系の透過と、
フィルタの透過と、ＣＣＤ検出器の感度その他などのよ
うな因子に比例することから、これらのパラメータの全
てにおけるアーチファクトの変化又はドリフトが消去さ
れる。したがって、本発明に係る方法は、正確な結果を
与える。

【００８９】ここで開示された校正方法を、血液分析器
だけでなく、懸濁した粒子を含む又は含まない他の液体
試料を分析する分析器にも用いることは、もちろん本発
明の範囲内にある。この場合には、他の試料中で粒子が
存在しない位置が、血液試料中で細胞が存在しない位置
に対応することになる。したがって、粒子が互いに間隔
をおいて存在している、高さの低いキュベット領域（単
粒子領域）が、血液試料中の単一細胞領域に対応するこ
とになる。また、この校正方法を、顕微鏡だけでなく、
他の光学式走査機器に適用することも、本発明の範囲内
にある。

【００９０】要約すると、本発明は、好ましくは使い捨
てのサンプル・アナライザであるサンプル・アナライザ
を校正する方法に向けられており、Ｚ軸に沿う典型的な
非均一照射と非均一フォトン収集効率で十分機能し、使
い捨て内に成形された高精度の校正特徴を必要としな
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＥＰＩ構成の典型的な蛍光顕微鏡の対物レンズ
の下に形成された励起光のダブルコーンを概略的に示す
図である。

【図２】入射ひとみを均一に照らす理想のレンズの開口
数ＮＡ＝０．４、波長λ＝６００ｎｍ、キュベットの高
さが３２ミクロン（−１６．．．プラス１６）であると
きのＺ位置の関数としての液体試料内の軸上強度を表す
図である。

【図３】対物レンズのＮＡ＝０．４、励起中心波長λ
_ｅｘ＝５００ｎｍ、蛍光中心波長λ_ｅｍ＝６００ｎｍの
ときの、キュベットの高さの関数としての蛍光強度を表
す図である。

【図４】破線で示す量Ｋと、対物レンズのＮＡ＝０．
４、励起中心波長λ_ｅｘ＝５００ｎｍ、蛍光中心波長λ
_ｅｍ＝６００ｎｍ、単一細胞領域におけるキュベットの
高さが３ミクロンのときの、積分極限ｄの関数としての
式（１０）の積分値とを表す図である。

【図５】Ｚ軸に沿って均質な励起が与えられた状態の、
図３に対応する図である。

【図６】Ｚ軸に沿って均質な励起が与えられた状態の、
図４に対応する図である。

【符号の説明】

１上部窓２ベース・プレート３液体試料４ダブル・コーン５ビーム・ウェスト

フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者クラウスダブリュ．バーントアメリカ合衆国 21093 メリーランド州ティモニウムロックビューテラス 305 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA01 EA01 FA02 HA01 HA09 JA02 KA02 KA05 LA03 NA01 NA13 2H052 AA07 AA09 AE05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光学式走査機器内に保持されたサンプル
・アナライザのチャンバの中の試料のサンプル高さを校
正する方法であって、ａ）サンプル・アナライザに、試料を受容するための前
記チャンバを設け、ｂ）前記チャンバに、蛍光色素を含む試料を入れ、ｃ）前記試料を励起光により照射し、ｄ）前記試料を前記機器で走査して該試料からの蛍光を
検出し、ｅ）計測された蛍光強度が高さ値に左右されないような
高さｈの校正領域における粒子の存在しない位置の蛍光
強度値を計測し、ｆ）サイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度
Ｉｃａｌを外挿し、ｇ）単一粒子領域内の粒子の存在しない位置における蛍
光強度値を計測し、ｈ）サイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度
Ｉｓｃａを外挿し、ｉ）次式を用いて、校正領域における有効高さＨを求
め、【数１】ここで、【数２】このとき、【数３】ここで、【数４】ここで、【数５】ここで、ＮＡは、走査機器の対物レンズの開口数であ
り、λ_ｅｘは、励起中心波長であり、λ_ｅｍは、発光中
心波長であり、ｚは、走査機器の結像光学系に平行な軸
上の試料内の位置であり、ｊ）次式によって量Ｋを計算し、【数６】ｋ）次式の解である積分極限ｄを求め、【数７】ここで、ｄは、単一細胞領域における求める未知のサン
プル高さに等しく、ｌ）校正されたサンプル高さを得る、ことを含むことを
特徴とする方法。
【請求項２】光学式走査機器内に保持されたサンプル
・アナライザのチャンバの中の試料のサンプル高さを校
正する方法であって、ａ）サンプル・アナライザに、試料を受容するための前
記チャンバを設け、ｂ）前記チャンバに、蛍光色素を含む試料を入れ、ｃ）前記試料を励起光により照射し、ｄ）前記試料を前記機器で走査して該試料からの蛍光を
検出し、ｅ）計測された蛍光強度が高さ値に左右されないような
高さｈの校正領域における粒子の存在しない位置の蛍光
強度値を計測し、ｆ）サイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度
Ｉｃａｌを外挿し、ｇ）単一粒子領域内の粒子の存在しない位置における蛍
光強度値を計測し、ｈ）サイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度
Ｉｓｃａを外挿し、ｉ）校正のために、変えることができるが高さｄは分か
っている一組のチャンバを用いることにより、同一の機
器で高さに左右されない蛍光強度Ｈ（ｄ）を計測し、ｊ）蛍光強度Ｈ（ｈ）を計測し、ｋ）次式の解である１つのｄ値を求め、【数８】ここで、ｄは、求める単一細胞領域における未知のサン
プル高さに等しく、ｌ）校正されたサンプル高さを得る、ことを含むことを
特徴とする方法。
【請求項３】前記高さに左右されない蛍光強度Ｈ
（ｄ）のデータと、ステップ（ｉ）及び（ｊ）による蛍
光強度Ｈ（ｈ）のデータが、前の校正から得られること
を特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】光学式走査機器内に保持されたサンプル
・アナライザのチャンバの中の試料のサンプル高さを校
正する方法であって、ａ）サンプル・アナライザに、試料を受容するための前
記チャンバを設け、ｂ）前記チャンバに、蛍光色素を含む試料を入れ、ｃ）前記試料を励起光により照射し、ｄ）前記試料を前記機器で走査して該試料からの蛍光を
検出し、ｅ）計測された蛍光強度が高さ値に左右されないような
高さｈの校正領域における粒子の存在しない位置の蛍光
強度値を計測し、ｆ）サイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度
Ｉｃａｌを外挿し、ｇ）単一粒子領域内の粒子の存在しない位置における蛍
光強度値を計測し、ｈ）サイズＡの全校正面積について積分された蛍光強度
Ｉｓｃａを外挿し、ｉ）校正するために、小さい、高さｄ’が分かっている
チャンバを用いることにより、同一の機器で蛍光強度Ｈ
（ｄ’）＝Ｐ＊ｄ’を計測し、ｊ）第１校正定数Ｐ＝Ｈ（ｄ’）／ｄ’を求め、ｋ）蛍光強度Ｈ（ｈ）を計測し、ｌ）最終校正定数Ｇ＝Ｈ（ｈ）／Ｐを求め、ｍ）次式の解である１つのｄ値を求め、【数９】ここで、ｄは、求める単一細胞領域における未知のサン
プル高さに等しく、ｎ）校正されたサンプル高さを得る、ことを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】ステップ（ｉ）から（ｌ）までによる定
数Ｇの値が、前の校正から得られることを特徴とする請
求項４に記載の方法。
【請求項６】光学式走査機器内に保持されたサンプル
・アナライザの第１チャンバの中の試料のサンプル高さ
を校正する方法であって、ａ）前記サンプル・アナライザに、試料を受容するため
の前記第１チャンバを設け、ｂ）前記チャンバに、蛍光色素を含む試料を入れ、ｃ）前記試料を励起光により照射し、ｄ）前記試料を前記機器で走査して該試料からの蛍光を
検出し、ｅ）計測された蛍光強度が高さ値に左右されないような
高さの校正領域における粒子の存在しない位置の蛍光強
度値を計測し、ｆ）単一粒子領域内の粒子の存在しない位置における蛍
光強度値を計測し、ｇ）校正のために、小さい、高さｄ’が分かっている、
蛍光性の液体が入れられた第２チャンバを用いることに
より、同一の機器で蛍光強度を計測し、ｈ）校正のために、同じく蛍光性の液体が入れられた、
計測された蛍光強度が高さ値に左右されないような高さ
の第３チャンバを用いることにより、同一の機器で蛍光
強度を計測し、ｉ）校正定数を求め、ｊ）２つの計測された前記蛍光強度値と前記校正定数か
ら、前記第１チャンバの前記単一粒子領域内のサンプル
高さを求めて、ｋ）校正されたサンプル高さを得る、ことを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】前記校正定数の値が、前の校正から得ら
れることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記試料が、血液又は全血であることを
特徴とする請求項１、請求項２、請求項４、又は請求項
６に記載の方法。
【請求項９】前記チャンバが、光学キュベットか又は
使い捨てのチャンバであることを特徴とする請求項１、
請求項２、請求項４、又は請求項６に記載の方法。
【請求項１０】前記光学式走査機器が、顕微鏡である
ことを特徴とする請求項１、請求項２、請求項４、又は
請求項６に記載の方法。