KR101884490B1 - 자동화 분자 병리진단 시스템의 폐루프 모니터링 - Google Patents
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Abstract
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법이 제공된다. 상기 방법은 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 시약을 유동시켜 생물학적 샘플의 적어도 일부를 착색하는 단계; 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계; 및 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여, 성능 지수를 계산하는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치도 제공된다.
Description
본 발명은 일반적으로 영상화 분야에서 생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 방법 및 장치에 관한 것이다.
생물학적 샘플은 이병 조직의 분자 수준의 진단과 같은 분석 및 진단 목적으로 사용된다. 조직 샘플이 고정되어 있는 조직 마이크로 어레이 (TMA)와 같은 생물학적 샘플은 통상 형태학적 착색제(stain) 또는 바이오마커(biomarker)에 의해 착색된다. 착색된 TMA는 이후 현미경으로 수동적으로 분석되거나, 또는 후속 분석 또는 비교를 위해 TMA의 영상이 촬영될 수 있다. 제1 착색제가 적용되고 촬영된 후, 하나 이상의 일련의 또는 연속적인 착색제 또는 바이오마커가 적용될 수 있으며, TMA는 다시 분석될 수 있다. 이후, 2개 이상의 일련의 영상이 비교될 수 있다. 단착색 사이클(single staining cycle)은 착색제 (항체)를 조직 위에 유동시키는 단계, 적절한 시간 동안 착색제를 배양하는 단계, 착색제를 세척(rinsing) 제거하여 배경부 형광을 감소시키는 단계, 슬라이드를 영상화하는 단계, 착색제를 표백 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 형광 영상화를 위해 개발된 다중화 기술의 일부로서, 순차적 착색, 세척 및 탈색 사이클이 요구된다. 착색 사이클은 이후 다수의 착색을 위해 반복될 것이다. 다중화 분야의 경우, TMA는 단백질 발현 또는 공간 분포를 정성적으로 또는 정량적으로 조사하기 위해서 다중 분자 프로브와 함께 착색될 필요가 있다.
착색 공정은 통상 실수하기 쉬운 시간-소모 수동 기술을 사용하여 수행된다. 따라서, 전체 작업 시간은 각각의 이들 단계의 총합에 적용되는 착색제의 총 개수를 곱한 것이다. 현재, 각 단계의 시간은 각 단계에서 필요한 유체량에 기초하여 결정된다. 각 단계의 시간은 항체 (착색제)가 적용되는 것과는 관계없이 고정적이다. 따라서, 매우 약한 착색은 더 짧은 표백 시간이 충분할지라도, 훨씬 더 강한 착색과 동일한 표백 시간이 소요될 것이다. 착색 공정에서 사용되는 시약은 종종 값이 비싸고 보관 수명이 제한적이어서 특별한 취급 기술이 필요하다.
따라서, 착색 사이클에서 하나 이상의 단계를 최적화하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 공정을 자동화하고 수동 개입을 저감시켜 공정을 시간 효율적이고 신뢰성 있게 하는 것이 바람직하다.
일 실시양태에서, 생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치가 제공된다. 자동화 장치는 착색제 유닛 및 표백제 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플과 작동식으로 결합하도록 구성되는 표면을 포함하는 유동 셀(flow cell), 생물학적 샘플의 적어도 일부를 조명하기 위한 조명원, 및 상기 유동 셀과 작동식으로 결합되고, 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 적용 이전, 도중 및/또는 이후에 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하도록 구성되는 모니터링 유닛을 포함한다. 장치는 생물학적 샘플의 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여 성능 지수(figure of merit)를 결정하기 위한 프로세싱 유닛, 및 프로세싱 유닛 및 유동 셀과 통신하고, 적어도 부분적으로 성능 지수에 기초하여 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 적용을 제어하도록 구성되는 제어기 유닛을 더 포함한다.
다른 실시양태에서, 생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법이 제공된다. 방법은 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 시약에 유동시켜 생물학적 샘플의 적어도 일부를 착색하는 단계, 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계, 및 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여, 성능 지수를 계산하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 이하의 상세한 설명을 판독하면 보다 잘 이해할 수 있을 것이며, 도면 전체에 동일한 참조부호는 동일한 구성요소를 나타낸다:
도 1은 본 발명의 폐루프 자동화 시스템의 일례의 개략도이고,
도 2는 분자 병리진단 시스템의 폐루프 모니터링을 위한 방법의 예시적인 단계의 흐름도이다.
도 1은 본 발명의 폐루프 자동화 시스템의 일례의 개략도이고,
도 2는 분자 병리진단 시스템의 폐루프 모니터링을 위한 방법의 예시적인 단계의 흐름도이다.
실시양태는 분자 영상화를 위한 자동화 분자 병리진단 시스템의 폐루프 모니터링을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 방법 및 시스템은 분자 영상화에서 최적화된 작동을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 자동화 분자 병리진단 시스템은 샘플 (예를 들어, 유동 셀 내의 슬라이드 상의 조직 샘플) 이동의 필요를 감소시키거나 또는 제거함으로써 최소한의 작업자 개입 하에 작동할 수 있다. 시스템 및 방법은 착색 성분과 영상화 성분 사이에 샘플을 배치시켜야 하는 필요를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 폐루프 모니터링은 시약 체적 및 시스템 내에서 시약의 체류 시간을 최소화하여 비싼 시약, 예컨대 형광 표지된 항체를 절약하고, 시약 분해 또는 부 반응을 최소화할 수 있다.
특정 실시양태에서, 생물학적 샘플을 착색하기 위한 폐루프 자동화 방법은 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 생물학적 샘플의 적어도 일부를 착색하는 단계, 착색 동안에 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계, 및 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여 성능 지수를 결정하는 단계를 포함한다. 방법은 생물학적 샘플의 적어도 일부를 세척하는 단계, 세척 동안에 생물학적 샘플의 일부로부터 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계, 및 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여 성능 지수를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 방법은 생물학적 샘플의 적어도 일부를 탈색하는 단계, 탈색 동안에 생물학적 샘플의 일부로부터 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계, 및 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여 성능 지수를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 착색된 이후에 항체가 생물학적 샘플 내의 분자와 결합하기에 충분한 시간을 제공하도록 소정 기간의 시간 동안 배양될 수 있다. 착색 단계에 대한 영상화는 배양 기간 동안 수행될 수 있다. 일례에서, 하나 이상의 착색, 탈색 및 세척 동안에 모니터링하는 단계는 생물학적 샘플의 영상을 획득하는 단계를 포함하고, 성능 지수를 결정하는 단계는 획득된 영상을 사용하여 생물학적 샘플의 일부로부터 광 강도를 결정하는 단계를 포함한다. 세척 동안에 모니터링하는 단계는 생물학적 샘플로부터 떨어져 있는 구역으로부터 영상을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 영상은 생물학적 샘플 외부의 구역으로부터 획득될 수 있다.
청구되는 발명의 대상을 보다 명확하고 간결하게 기재하기 위해서, 이하의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어에 대해서 이하의 정의가 제공된다. 명세서를 통해서, 특정 용어의 예시는 비제한적인 예로서 간주되어야 한다.
본원에서 사용된, 용어 "생물학적 샘플"은 체내 또는 체외에서 얻어지는 생물학적 조직 또는 유체 유래의 샘플을 포함하는 생물학적 대상으로부터 얻어지는 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 인간을 포함한 포유동물로부터 단리되는 조직, 분획물 및 세포일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 결장, 정상 흉부 조직, 전립선암, 결장암, 흉부 조직 마이크로어레이, 흉부 TMA 또는 정상 결장의 조직 부분을 포함한다. 조직 부분은 조직 샘플의 단일부 또는 단일편, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 얇은 조각의 조직 또는 셀을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 다수의 부분이 취해지고 분석될 수 있지만, 단 본원에 개시된 방법은 적어도 2개의 상이한 표적에 대하여 (형태학적 또는 분자 수준에서) 조직 샘플의 동일 부분에 대한 분석에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일 부분은 적어도 4개의 상이한 표적에 대하여 (형태학적 또는 분자 수준에서) 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일 부분은 4개보다 많은 상이한 표적에 대하여 (형태학적 또는 분자 수준에서) 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일 부분은 형태학적 및 분자 수준 양자 모두에서 분석될 수 있다. 조직 부분이 생물학적 샘플로서 적용되는 경우, 약 100 마이크로미터 미만의 범위, 약 50 마이크로미터 미만의 범위, 약 25 마이크로미터 미만의 범위, 또는 약 10 마이크로미터 미만의 범위의 두께를 가질 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "프로브"는 바인더 및 신호 발생기를 포함하는 제제를 의미한다. 일부 실시양태에서, 프로브의 바인더 및 신호 발생기는 단일 독립체 (예를 들어, 표적과 결합할 수 있는 방사성 또는 형광성 분자)로 구현된다. 다른 실시양태에서, 바인더 및 신호 발생기는 별도의 독립체 (예를 들어, 표적과 결합할 수 있는 일차 항체 및 일차 항체와 결합할 수 있는 표지 이차 항체)로 구현된다.
본원에서 사용된, 용어 "바인더"는 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 표적에 비공유적으로 결합할 수 있는 생물학적 분자를 의미한다. 바인더는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 바인더는 1종 이상의 천연 또는 개질된 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 에피바디(affibody), 또는 앱타머(aptamer)), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 또는 앱타머); 다당류 (예를 들어, 렉틴, 당), 지질, 효소, 효소 기질 또는 억제제, 리간드, 수용체, 항원, 합텐 등을 포함할 수 있다. 적합한 바인더는 분석될 샘플 및 검출에 이용가능한 표적에 따라서 선택될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "신호 발생기"는 하나 이상의 검출 기술 (예를 들어, 분광분석법, 열량측정법, 분광법, 또는 육안 검사)을 사용하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 분자를 의미한다. 검출가능한 신호의 적합한 예는 광학 신호 및 전기 신호 또는 방사성 신호를 포함할 수 있다. 일례에서, 신호 발생기는 발광단(lumiphore) 또는 형광단을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "발광단"은 화학발광, 생물발광, 인광발광, 및 광발광을 포함하는 발광을 나타내는 화학적 화합물을 의미한다. 대표예는 루미놀, 루시게닌, 아크리단, 아크리디늄 에스테르 및 디옥세탄 및 형광단을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "형광단"은 특정 파장의 광에 노출됨으로써 여기될 때에 상이한 파장에서 발광하는 화학적 화합물을 의미한다. 형광단은 이들의 방출 프로파일 또는 "색상" 관점에서 기재될 수 있다. 그린 형광단 (예를 들어, Cy3, FITC, 및 오레곤 그린(Oregon Green))은 일반적으로 515 내지 540 나노미터 범위의 파장에서 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 레드 형광단 (예를 들어, 텍사스 레드(Texas Red), Cy5, 및 테트라메틸로다민)은 일반적으로 590 내지 690 나노미터 범위의 파장에서 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 형광단의 예는 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘, 아크리딘의 유도체 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디술포네이트 (루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow), 쿠머린, 쿠머린 유도체, 7-아미노-4-메틸쿠머린 (AMC, 쿠머린 120), 7-아미노-트리플루오로메틸쿠루아린 (쿠마런(Coumaran) 151), 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-술포네프탈레인 (브로모피로갈롤 레드(Bromopyrogallol Red)), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)4-메틸쿠머린, 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산, 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (DNS, 단실 클로라이드), 에오신, 에오신 이소티오시아네이트와 같은 에오신의 유도체, 에리트로신, 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트와 같은 에리트로신의 유도체; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일) 아미노플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), QFITC (XRITC); 플루오레사민 유도체 (아민과 반응시 형광성); IR144; IR1446; 말라카이트 그린(Malachite Green) 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드(Phenol Red), B-피코에리트린; o-프탈디알데히드 유도체 (아민과 반응시 형광성); 피렌 및 유도체, 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리엑티브 레드(Reactive Red) 4 (시바크론(Cibacron) .RTM. 브릴리언트 레드 3B-A), 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리쓰아민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA); 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC); 리보플라빈; 로졸산 및 란탄계 킬레이트 유도체, 퀀텀 도트(quantum dot), 시아닌 및 스쿠아레인을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "산화제" 또는 "산화 제제"는 발광단을 실질적으로 불활성화시키는 탈색제를 의미한다. 일 실시양태에서, 탈색제는 표백제를 포함한다. 대표적인 산화 제제는 활성 산소종, 히드록실 라디칼, 일중항 산소, 과산화수소, 또는 오존 예컨대 과산화수소, 과망간산칼륨, 중크롬산나트륨, 수성 브롬, 요오드-요오드화칼륨 또는 t-부틸 히드로퍼옥시드를 포함한다.
다중화 또는 다중화된 분석은 일반적으로 동일한 검출 메카니즘을 사용하여 생물학적 샘플 중의 다중 표적을 분석하는 것을 의미한다.
분자 영상화에서, 신호 발생기 (예컨대, 형광단)는 여기될 수 있고, 얻어진 신호 (예컨대, 형광성 신호)가 디지털 신호 (예를 들어, 디지털화 영상) 형태로 관찰되고 기록될 수 있다. 다중화의 경우, 적절한 형광 필터를 사용하여 샘플 중에 결합되어 있는 복수의 상이한 신호 발생기 (존재하는 경우)에 대하여 유사한 절차가 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 프로브는 생물학적 샘플과 순차적으로 접촉하여 생물학적 샘플의 다중화된 분석결과를 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 프로브 세트 (1개의 세트에서 최대 4개의 프로브를 포함함)는 생물학적 샘플과 순차적으로 접촉하여 생물학적 샘플의 다중화된 분석결과를 얻을 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "성능 지수"는 광 강도, 영상의 콘트라스트, 브레너 구배(Brenner gradient), 또는 신호 대 배경 비를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
모니터링 단계는 착색 사이클의 둘 이상의 프로세싱 단계에서 수행될 수 있다. 각각의 착색 사이클은 생물학적 샘플의 적어도 일부를 착색하는 단계와, 배경부 형광을 감소시키기 위해 착색제를 세척 제거하는 단계와, 착색제를 탈색하는 단계를 포함할 수 있다. 착색 사이클은 다수의 착색제에 대해 반복될 수 있다. 착색 단계 동안, 샘플은 정해진 시간의 주기 동안 배양될 수 있다. 착색 사이클의 하나 이상의 단계 동안, 생물학적 샘플의 대응 부분에 의해 또는 생물학적 샘플로부터 떨어져 있는 부분들에 의해 발생된 신호들은, 착색량, 탈색량, 및/또는 세척량을 판단하기 위해 사용될 수 있다. 일례에서, 모니터링 단계는 영상화 단계를 포함한다. 영상화 단계는 착색 사이클 동안 생물학적 샘플에 이뤄지는 착색량, 탈색량, 및/또는 세척량을 나타내는 신호들을 획득하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 모니터링 유닛은 카메라에 작동식으로 결합되는 현미경을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 사용자는 샘플 중에 착색된 다수의 독립체 위치를 확인하여 매핑하도록 샘플 슬라이드의 하나 초과의 영역에서의 영상을 기록하기 위해 모니터링 유닛을 이용할 수 있다. 모니터링 유닛은 샘플이 영상화 유닛의 관측 시야 내에 위치되도록 유동 셀의 영상 캡처 윈도우에 작동식으로 결합될 수 있다. 일례에서, 모니터링 유닛은 유동 셀에 인접하여 배치될 수 있다. 영상 캡처 윈도우는 샘플이 배치되는 기판(예컨대, 현미경 슬라이드)에 의해 정해질 수 있다. 영상 캡처 윈도우는 슬라이드 수용 부재의 밑면에 광투과성 물질을 포함할 수 있다.
착색 단계, 세척 단계, 표백 단계 각각은 유동 셀 내에 위치되는 생물학적 샘플 위에 특정 시약을 함유한 용액을 유동시킴으로써 달성될 수 있다. 이하의 파라미터는, 즉 (1) 유동 셀의 내부 체적, (2) 유동 셀의 내부 온도, (3) 산화 용액(예컨대, 과산화수소 및 탄산수소나트륨)의 구성 성분의 혼합 시간, (4) 용액이 샘플을 지나갈 때 용액의 교반 정도, 및 (5) 유동 셀의 버블 제거 또는 가스 제거와 같은 파라미터는, 반응성을 향상시켜 결과적으로 시약의 사용량을 감소시키도록 제어될 수 있다. 이들 파라미터의 적절한 조절은 또한 샘플의 성능 저하를 감소시킬 수 있고, 이는 단일 샘플로부터 보다 많은 데이터의 산출을 가능케 한다.
가열 요소 또는 교반 요소(예컨대, 음향 압전 구성요소)와 같은 보조 장치가 유동 셀에 작동식으로 결합될 수 있다. 일례에서, 보조 장치는 영상 캡처 윈도우로부터 떨어져 배치될 수 있고, 상기 영상 캡처 윈도우를 통해 카메라에 연결된 현미경이 다양한 프로세싱 단계 동안 샘플의 영상을 캡처할 수 있다.
개시된 상기 방법은 영상 캡처 윈도우를 통해 샘플로의 향상된 접근이 가능하도록 구성된 유동 셀을 포함하는 시스템에서 수행될 수 있다. 생물학적 샘플을 착색하기 위한 자동화 방법은, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는, "(생물학적 샘플의 반복적 착색)ITERATIVE STAINING OF BIOLOGICAL SAMPLES"이라는 발명의 명칭으로 출원된 미국 특허 출원 공개공보 제2009/0253163호에 개시된 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
도 1에는 자동화 분자 병리진단 시스템을 위한 폐루프 시스템이 개시되어 있다. 시스템은 조직 샘플 위쪽에 위치하는 폐쇄형 유동 챔버를 갖는 유동 셀(10)을 포함한다. 유동 셀(10)은 중실 지지-수용 부재(12)와, 슬라이드(16) 상에 위치한 조직 샘플을 수용하도록 구성된 중앙 개구를 구비한 개스킷(14)과, 리드(18)와, 입구 포트(20)와, 출구 포트(22)를 포함할 수 있다. 유동 셀(10)은 슬라이드(16)가 슬라이드-수용 부재(12)에 위치되고 개스킷(14)이 슬라이드(16)와 리드(18) 사이에 개재되면 폐쇄형 챔버를 한정한다. 유동 챔버가 유동 셀(10) 내부에 수납되면, 유체 증발 및 이에 따른 시약 손실이 최소화된다. 또한, 폐쇄 구조는 온도 제어를 개선한다.
중실 지지-수용 부재(12)는 화학적 변화와 온도 변화의 범위에 양립할 수 있다. 일 실시예에서, 슬라이드 홀더는 챔버에 슬라이드를 고정하기 위한 핀 또는 탭 시스템과, 기부로 구성될 수 있다.
일부 실시예에서, 유동 셀(10)은 모니터링 프로세스를 위해 현미경 스테이지에 고정될 수 있다. 이에 의해 샘플은 수동적 개입 없이 일련의 시약에 노출될 수 있고, 이에 의해 영상 획득 또는 영상 등록을 위한 현미경 스테이지 상에서의 샘플의 재정렬이 배제된다. 이는 각각의 착색 단계 이후에 획득된 영상들이 합성 영상을 형성하도록 중첩될 수 있기 때문에 다중 착색 및 영상화에 특히 유효하다. 유동 셀(10)은 현미경 스테이지 상에 끼워지도록 구성된 모듈 유닛일 수 있다. 대안적으로, 유동 셀(10)은 마이크로 스테이지를 포함하는 통합 유닛일 수 있다.
유동 셀(10)은 유체 취급 유닛(13)에 작동식으로 결합될 수 있으며, 상기 유체 취급 유닛은 (도시되지 않은) 착색제 유닛과, (도시되지 않은) 탈색제 유닛을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 착색제 유닛은 복수개의 착색제를 적용하도록 구성된다. 또한, 유동 셀(10)은 유동 셀(10)에 배치되는 생물학적 샘플의 적어도 일부를 조사하기 위한 조명원(15)에 연결될 수 있다. 조명원의 비-제한적 예로서는 메탈 할라이드 광원, 머큐리 아크 램프, 또는 발광 다이오드를 포함할 수 있다. 조명원(15)의 (도시되지 않은) 셔터는 영상화 유닛이 생물학적 샘플로부터 영상들을 획득하지 않을 때에는 폐쇄될 수 있다. 셔터의 폐쇄는 생물학적 샘플에 대한 광 표백의 양을 감소시킬 수 있다. 지속적인 영상화의 경우, 조명원의 셔터는 영상화 지속 기간에 전체에 걸쳐 개방된 상태로 유지될 수 있다.
시스템은 유동 셀(10)의 내부 챔버 내에서의 유체 전달 및 용액 온도를 제어하기 위해 유체 및 온도 제어 서브시스템을 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 유체 제어 시스템은 또한 저장소와, 유동 센서와, 혼합 챔버와, 유동 셀로 주입하기 전에 하나 이상의 시약을 준비하기 위한 탈기 장치(degasser)를 포함할 수 있다. 이런 서브시스템의 장점은 안정성 또는 저장 수명을 제한할 수 있는 시약을 예비혼합하는 단계 및 저장하는 단계의 필요성을 배제시킬 수 있다는 것이다. 유체 제어 서브시스템은 유동의 입구 포트(20) 및 출구 포트(22)와 유체 연통한다.
유동 셀(10)의 상류에 위치하는 예비혼합기는 챔버 디자인 또는 튜브 디자인에 기초할 수 있다. 챔버 디자인은 입구 및 출구 포트를 구비한 소형 도관과, 기계적 혼합기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 용액은 시약이 유동 셀(10)로 도입되기 직전에 반응물을 산재시키도록 예비혼합기를 이용하여 분자 수준으로 혼합된다. 혼합 시간은 시약을 생성하기에 충분할 정도로 길어야 하고 분해를 방지하도록 적절히 제한되어야만 한다.
개스킷(14)은 슬라이드 상에 위치된 조직 샘플을 수용하도록 구성된 중앙 개구를 포함할 수 있다. 개스킷(14)은 유동 챔버에 적용되는 액체를 보유하는 변형 가능하며 화학적으로 비활성인 고무 또는 플라스틱으로 제조될 수 있다. 개스킷의 중앙 개구는 영상 획득 윈도우의 시야를 최대화하도록 크기가 정해질 수 있다.
입구 포트(20) 및 출구 포트(22)는 영상 획득 윈도우로부터 떨어져 배치되는 것이 바람직하다. 즉, 입구 및 출구 포트는 개스킷(14)에 또는 리드(18) 상에 위치될 수 있다. 입구 포트(20) 및 출구 포트(22)는, 유입량 및 유출량이 공동 작용하여 샘플을 지나가는 소정의 유속을 달성하도록 유사하게 크기가 정해질 수 있다.
온도 제어 유닛은 온도 제어를 위한 열전기 스테이지(17)와, 온도 측정을 위한 저항 온도 검출기 또는 서미스터를 포함할 수 있다. 온도 제어 유닛의 바닥 표면이 유체와 직접 접촉하는 구성에서, 접촉 표면(24)은 스테인리스 강 또는 티타늄을 비롯한 내화학 약품 재료로 제조될 수 있다. 프레임(26)이 온도 제어 유닛의 구성요소를 위치 설정하기 위해 이용될 수도 있다.
일부 실시예에서, 본 발명은 또한 유동 챔버에 연결되고 음향 에너지로의 저-전압 전기 신호의 변환에 의해 유동 챔버 내에 진동을 생성할 수 있는 압전 소자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 압전 소자는 세라믹, 석영(SiO2) 또는 티탄산 바륨(BaTiO3)을 포함할 수 있다. 압전 소자의 구성은 초음파 교반을 제공하고 유체 챔버를 통한 시약의 유동 프로파일에 영향을 준다. 이는 원하는 착색 반응이 확산 제한되고 종래의 기계적 혼합이 유동 셀 구조에 의해 제한되는 경우에 특히 유리하다.
모니터링 유닛(28)은 광전자 증배관 또는 광 다이오드와, 전하 결합 소자와, 카메라와, 다른 적절한 영상 수신 장치를 포함할 수 있다. 모니터링 유닛(28)은 이에 제한되는 것은 아니지만 카메라와 같은 영상 수신 장치에 작동식으로 결합되는 현미경을 포함할 수 있다. 도시되지는 않았으나, 모니터링 유닛(28)은 이에 제한되는 것은 아니지만 대물 렌즈와 같은 광학 요소를 더 포함할 수 있다. 영상 수신 장치는 샘플이 슬라이드와 유동 채널 하우징 사이에 배치되었을 때 샘플의 영상을 기록할 수 있다. 모니터링 유닛(28)은 카메라에 작동식으로 결합되어 유동 셀에 대해 카메라의 위치를 조정하도록 구성된 액추에이터와 같은 위치 설정 장치를 포함할 수도 있다. 위치 설정 장치는 샘플의 여러 관심 대상 영역으로 대물 렌즈를 이동시켜 샘플에 대한 자동 초점 작동을 수행할 수 있다.
일부 실시예에서, 모니터링 유닛(28)은 프로세싱 유닛(30)과 통신할 수 있다. 프로세싱 유닛(30)은 이어서 제어기 유닛(32)과 통신할 수 있다. 일부 실시예에서, 모니터링 유닛(28) 및/또는 프로세싱 유닛(30)은, 착색 단계, 탈색 단계, 또는 세척 단계 동안 광 강도 값의 포화 상태를 식별하도록 구성될 있다. 프로세싱 유닛(30)의 비-제한적 예로서는 영상 프로세싱 유닛을 포함할 수 있다.
제어기 유닛(32)은 제어 입력 또는 유저 인터페이스(도시됨, 34)와 통신할 수 있다. 제어기 유닛(32)은 영상화 시스템에 의해 생성된 영상의 적어도 일부에 기초하여 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 적용을 제어하도록 구성될 수 있다. 제어기 유닛(32)은, 예컨대 열 제어 유닛, 예비혼합기, 진동 유닛, 및 펌프를 포함하여, 유동 셀 시스템의 다양한 구성요소들을 제어할 수 있다. 조합된 샘플 프로세싱 및 영상 획득 시스템에 유동 셀(10)이 통합되는 경우, 영상 획득 구성요소(예컨대, 현미경 또는 카메라)는 컴퓨터에 의해 제어될 수도 있다.
프로세싱 유닛(30)은 모니터링 유닛(28)에 의해 획득된 영상을 분석하도록 구성될 수 있다. 일례에서, 모니터링 유닛(28)은 실시간으로 영상을 획득할 수 있다. 이 예에서, 영상 프로세싱 유닛(30)은 실시간으로 영상을 프로세싱할 수 있다. 프로세싱 유닛(30)은 획득된 영상으로부터 광 강도 또는 색상을 판단할 수 있다. 일례에서, 착색 단계 동안, 광 강도가 시간의 함수로 표시될 수 있다. 제어기 유닛(32)은 광 강도가 포화점에 도달되었을 때를 알려줄 수 있다. 폐루프 시스템에서, 제어기 유닛(32)은, 유동 셀이 착색 단계를 중지하고 세척 단계와 같은 다음 단계로 이동할 것을 지시하는 신호를 유동 셀(10)로 전송할 수 있다. 이와 유사하게, 표백 및 세척 단계 동안, 광 강도가 시간에 대해 플롯팅될 수 있으며, 광 강도 값이 안정화되면 또는 광 강도의 변화율이 특정 비율 이하로 도달하면 상응하는 프로세스(표백 단계 또는 세척 단계)가 중지될 수 있고, 착색 사이클의 다음 단계가 개시될 수 있다. 광 강도의 변화율은 유저 인터페이스(34)를 이용하여 시스템에 사전-제공될 수 있다. 일 실시예에서, 실제 광 강도 값 또는 광 강도 값의 변화율은 사전-제공된 값들과 비교될 수 있으며, 필요에 따라, 사전-제공된 값은 업데이트될 수 있고 대응하는 생물학적 샘플 또는 신호 발생기에 상호 연관될 수 있다. 일부 실시예에서, 모니터링 유닛(28) 및/또는 프로세싱 유닛(30)은 또한 착색 사이클의 하나 이상의 단계에서 샘플에 대한 노출 시간을 결정하도록 구성될 수 있다.
자동화는, 이에 제한되는 것은 아니지만 착색 시약 및 산화제의 추가를 비롯하여 착색 사이클에 포함된 하나 이상의 프로세싱 단계에 대한 컴퓨터 제어를 통해 달성될 수 있다. 조합된 샘플 프로세싱 및 영상 획득 시스템에 유동 셀 시스템이 통합된 경우, 영상 획득 구성요소(예컨대, 현미경 또는 카메라)는 LabVIEW 또는 C로 구성된 프로그램과 같은 소프트웨어에 의해 제어될 수도 있다.
일부 실시예에서, 관찰하는 단계 또는 상호 연관시키는 단계 중 하나 이상의 단계가 컴퓨터 지원 수단을 이용하여 수행될 수 있다. 신호 발생기로부터의 신호(들)이 디지털 영상(들)의 형태로 저장될 수 있는 실시예에서, 영상(들)의 컴퓨터 지원 분석이 실시될 수 있다. 일부 실시예에서, 영상[예컨대, 프로브(들) 및 형태적 착색으로부터의 신호들)은 생물학적 샘플의 완성 정보, 예컨대 기하학적 정보 및 상관 관계 정보를 수득하기 위해 컴퓨터 지원 합성을 이용하여 중첩될 수 있다.
특정 실시예에서, 생물학적 샘플의 착색 사이클을 위한 폐루프 자동화 방법이 제공된다. 상기 방법은 현미경 슬라이드 상의 조직 섹션과 같은 생물학적 샘플을 유동 셀에 위치 설정하는 단계와, 샘플과 발광단 사이에 충분한 접촉 시간, 통상적으로는 사용된 표지의 유형 및 농도에 따라 30분 내지 60분 범위의 접촉 시간을 허용하는 방식으로 형광 표지 또는 발광단을 샘플에 적용하는 단계와, 바인딩되지 않은 임의의 형광 표지 또는 발광단을 세정(washing)하기 위해 세정 용액, 예컨대 적절한 완충액을 적용함으로써 생물학적 샘플을 세척하는 단계와, 표지된 샘플의 영상을 획득하여 광 강도의 포화상태를 판단하는 단계와, 표백하는 단계를 포함한다. 신호를 획득하는 단계는 영상 획득 윈도우를 통해 신호를 획득하는 단계를 포함한다. 영상화 단계는 착색 단계, 세척 단계 및 표백 단계 중 하나 이상의 단계 후에 수행될 수 있다. 대안적으로, 영상화 단계는 착색 단계, 세척 단계, 및 표백 단계 각각 이후에 수행될 수 있다. 상기 방법은 발생된 신호의 광 강도 값을 측정하는 단계와, 상기 신호를 바이오마커의 특정 표지와 상호 연관시키는 단계를 더 포함한다. 영상화 단계는 샘플의 노출 시간보다 큰 시간 간격을 두고 수행될 수 있다.
영상화 단계는 착색 사이클 전체에 걸쳐 연속적으로, 또는 착색 사이클의 특정 단계를 통해 실시될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 원하는 상태에 도달되었는지(즉, 표백/착색/세척이 어느 정도 이뤄졌는지)에 대한 실시간 판단과 함께 조직의 적어도 일부를 실시간 모니터링하는 단계를 포함한다. 이들 실시예에서, 영상들은 착색 단계, 탈색 단계, 또는 세척 단계 동안 지속적으로 획득될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 착색 사이클의 특정 단계에서 생물학적 샘플을 간헐적으로 모니터링하는 단계를 포함한다. 이들 실시예에서, 영상들은 착색 단계, 탈색 단계, 또는 세척 단계 동안 간헐적으로 획득될 수 있다. 예를 들면, 영상화 단계는 착색 단계와 같은 특정 단계에서 일정한 시간 간격을 두고 실시될 수 있다. 대안적으로, 영상화 단계는 시간의 진행에 따라 시간 간격을 줄이면서, 특정 단계에서 다양한 시간 간격을 두고 실시될 수 있다. 영상들은 조명원에 대한 생물학적 샘플의 노출 시간보다 큰 시간 간격을 두고 획득될 수 있다. 간헐적 영상화의 경우, 샘플에 대한 광 표백의 양을 감소시키기 위해 샘플이 영상화되지 않을 때 조명 셔터는 폐쇄될 수 있다.
일 실시예에서, 영상화 단계는 명-시야 영상화(bright field imaging) 단계일 수 있다. 명-시야 영상화 단계는 형광 영상화와는 달리 표지 인식이 가능할 수 있다. 영상화 단계는 색상 및/또는 광 강도에 대응하는 데이터를 수집하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예들은 착색 사이클의 하나 이상의 단계에 대한 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 것에 관한 것이다. 일 실시예에서, 착색된 샘플로부터의 형광 발광의 광 강도는 착색/표백 또는 세척 단계를 실행하기 위한 기간을 결정하는데 사용될 수 있다.
단계(50)에서, 생물학적 샘플을 제공한다. 생물학적 샘플을 유동 셀에 배치한다. 단계(52)에서, 생물학적 샘플의 적어도 일부를 착색한다. 선택적으로, 단계(51)에서, 샘플을 착색하기 전에 초기 영상을 획득할 수 있다. 후속 영상으로부터의 강도 데이터를 정규화하기 위해, 초기 영상 또는 배경 영상으로부터의 데이터를 사용할 수 있다. 선택적으로, 단계(53)에서, 상기 방법은 착색 전의 샘플의 초기 영상을 획득하기에 앞서, 생물학적 샘플 용액을 세정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플을 제공하는 단계(단계(50)) 후에, 실질적으로 무색인 세정 용액을 유동 채널 내에, 또는 샘플이 작동적으로 결합되는 표면과 슬라이드 사이에 형성되는 공간에 도입할 수 있다. 샘플 및 샘플을 이루는 생물학적 개체를 액체와 접촉시킴으로써, 샘플을 조절하고 준비시키기 위해 세정 용액을 흘려 보낼 수 있다. 세정 단계는 또한, 광 강도 데이터를 정규화하는데 적합한 참조를 제공할 수 있다.
다양한 세정 및/또는 유체 적용 기술에 의해, 착색제 적용 및 표백제 적용을 위한 다양한 방법 단계들을 실행할 수 있다. 예를 들어, 세정 용액, 착색제, 및/또는 탈색제의 적용은 피펫팅(pipetting); 흡인; 혼합; 원심 분리; 및 이러한 공정들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 공지된 다양한 실험실 절차에 의해 실행될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 단계들 중 하나 이상의 단계를 자동화할 수 있고, 자동화 시스템을 사용하여 실행할 수 있다. 일부 실시예에서, 착색 사이클의 모든 단계를 자동화 시스템을 사용하여 실행할 수 있다.
단계(54)에서, 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성에 대해 생물학적 샘플을 모니터링한다. 일 실시예에서, 모니터링은 생물학적 샘플을 영상화하는 것을 포함한다. 영상화는 전 영역(full field) 영상화일 수 있다.
생물학적 샘플의 적어도 일부에 대한 착색량을 결정하기 위해, 생물학적 샘플을 영상화할 수 있다. 영상화가 진행됨에 따라, 생물학적 샘플의 광 강도가 증가한다. 광학적 특성 중 하나 이상의 특성이 포화 상태에 도달할 수 있다. 예를 들어, 착색 중에, 광 강도는 착색이 완료된 때에 포화 수준에 도달한다. 광 강도가 포화 수준에 도달하는 시기를 결정하기 위해, 영상화를 실행할 수 있다. 모니터링에 후속하여, 광학적 특성들 중 하나 이상의 특성에 기초하여, 성능 지수를 계산할 수 있다. 성능 지수는 각각의 모니터링 단계 후에 결정될 수 있다. 생물학적 샘플, 마커 또는 염료의 특질에 기초하여, 성능 지수를 선택할 수 있다. 영상화의 경우, 단계(55)에서, 광 강도가 포화 수준에 도달하는 시기를 결정하기 위해, 영상으로부터 획득한 데이터를 분석할 수 있다. 각각의 영상화 단계(단계(54)) 후에 단계(55)를 실행할 수 있다. 광 강도가 포화 수준에 도달한 경우, 시스템은 세척을 행하는 다음 단계로 이동할 수 있다. 단계(56)에서, 상기 방법은 생물학적 샘플의 적어도 일부를 세척하는 단계를 더 포함한다. 단계(58)에서, 생물학적 샘플의 적어도 일부에 대한 세척량을 결정하기 위해, 샘플을 모니터링, 예를 들어 영상화한다. 단계(59)에서, 세척 단계의 진행정도를 결정하기 위해, 영상으로부터 획득한 데이터를 분석한다. 원하는 진행정도에 다다른 경우, 즉 배경 신호가 세척의 경우에서의 일부 임계치 미만으로 떨어진 경우, 세척 단계를 정지하고, 계획서 상의 다음 단계를 개시할 수 있다. 이러한 방식으로, 각각의 동작에는 모든 경우 작업에 필요한 전체적으로 명시된 더 긴 시간과 달리 필요한 시간만 주어진다. 일 실시예에서, 세척 중에, 세척 정도를 결정하기 위해, 생물학적 샘플로부터 떨어져 있는 영역에서 영상화를 실행할 수 있다.
영상화 중에 백화 현상(photo-bleaching)의 효과를 최소화하기 위해, 실시간 모니터링을 위해 결정된 시간 간격으로 영상을 획득할 수 있다. 영상을 획득하기 위해 결정된 시간 간격은 노출 시간보다 길 수 있다. 대안적으로 또는 부수적으로, 샘플의 임의의 백화 현상을 줄이기 위해, 퇴색 방지제를 생물학적 샘플에 첨가할 수 있다.
단계(60)에서, 생물학적 샘플의 적어도 일부를 탈색하거나 표백한다. 단계(62)에서, 탈색 도중에, 생물학적 샘플의 적어도 일부에 대한 탈색량을 결정하기 위해, 샘플을 모니터링한다. 일 실시예에서, 샘플을 영상화할 수 있다. 생물학적 샘플이 적당한 정도로 표백되는 시기를 결정하기 위해, 영상화를 사용할 수 있다.
탈색이 진행됨에 따라, 광 강도와 같은 광학적 특성은 감소하고, 탈색 완료 시 최소값에 도달한다. 단계(61)에서, 탈색의 정도를 평가하기 위해, 모니터링 중에 생물학적 샘플로부터 획득한 데이터를 분석한다. 예를 들어, 탈색 단계에서의 진행정도를 결정하기 위해, 영상으로부터 획득한 데이터를 분석한다. 광 강도 감소가 포화 수준에 도달했는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 데이터를 분석할 수 있다. 원하는 진행정도에 다다른 경우, 탈색 단계를 정지하고, 착색 사이클의 다음 단계를 개시할 수 있다. 예를 들어, 유동 챔버 내에 새로운 항체를 도입할 수 있으며, 또는 다른 생물학적 샘플을 제공할 수 있다(단계(64)). 일 예에서, 탈색 단계 중에 샘플을 연속적으로 영상화함으로써, 강도 감소에 있어서의 포화를 결정할 수 있다.
자동화 탈색 단계는 원래의 레지스트레이션을 유지하면서 작업자가 단일 샘플을 재탐지할 수 있게 한다. 산화제의 첨가는 발광단에 의해 생성되는 신호의 실질적인 제거로 인해 생물학적 샘플의 탈색을 야기한다. 탈색이 발광단을 화학적으로 변경시켜 이루어지든, 분리에 의해 이루어지든, 신호는 적어도 80%, 그리고 바람직하게는 90%를 초과하여 감소된다. 이러한 신호의 감소는 탈색 단계로부터 비롯되는 자가형광 또는 배경 신호에 있어서의 동반 감소를 조정하기 위해, 착색된 생물학적 샘플의 초기 절대 강도에 대한 특정 파장에서의 착색 후 강도로서 측정될 수 있다.
선택적으로, 탈색에 앞서, 모니터링할 필요가 있는 가장 밝은 구역을 식별하기 위해 샘플을 영상화할 수 있다. 다음으로, 초기 영상을 획득할 수 있고, 모니터링될 필요가 있는 가장 밝은 구역을 식별할 수 있다.
일 예에서, 착색 사이클의 단계들 각각을 실행하기 위한 기간을 시스템에 미리 제공할 수 있다. 본 예에서, 미리 제공된 기간이 올바른지 여부를 확인하기 위해, 영상화를 실행할 수 있다. 착색 사이클의 단계들 중 하나 이상의 단계에 대한 기간이 미리 제공된 기간과 상이한 경우, 시스템에서 미리 제공된 시간을 업데이트할 수 있다. 이렇게 업데이트된 기간은 나중에, 장래 유사한 샘플에 대해 상기 시스템에 의해 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 광 강도 값을 바이오마커의 특정 표지에 상호 연관시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 생물학적 샘플에서의 신호의 위치를 관측할 수 있다. 일부 실시예에서, 형태학적 착색제를 사용하여 생물학적 샘플에서의 신호의 위치를 관측할 수 있다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 신호의 상대적 위치를 관측할 수 있다. 신호의 위치는 생물학적 샘플에서의 목표물의 위치에 상호 연관될 수 있으며, 이에 따라 생물학적 샘플의 상이한 목표물의 위치에 관한 정보를 제공한다. 일부 실시예에서, 생물학적 샘플에서의 상이한 목표물의 위치에 관한 정보를 획득하기 위해, 신호의 강도 값 및 신호의 위치를 상호 연관시킬 수 있다. 예를 들어, 소정의 목표물은 핵에 비해 세포질에 더 많이 나타날 수 있으며, 또는 그 반대일 수 있다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 신호의 위치 및 강도 값을 비교함으로써, 목표물의 상대적 위치에 관한 정보를 획득할 수 있다.
본 발명의 방법은 착색제/항체의 완전한 세트에 대해 사이클 시간의 최소화를 허용하여, 처리능을 개선한다. 광범위한 시험 없이, 본 발명의 방법을 사용하여, 새로운 착색제를 채용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은, 생물학 및 의학에 있어서의 분석, 진단 및 치료 응용예를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 분야에서의 응용예를 찾을 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 조직 화학, 특히 면역 조직 화학에서의 응용예를 찾을 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 따른, 환자로부터의 세포 또는 조직 샘플의 분석은 진단을 목적으로(예를 들어, 특정 질병이 있거나, 특정 독소에 노출되었거나, 또는 특별한 치료상의 이식 또는 장기 이식에 잘 반응하는 환자를 식별하기 위해) 사용되거나, 예후적으로(예를 들어, 특정 질병이 진행할 것 같거나, 특별한 치료상의 이식에 잘 반응할 것 같거나, 또는 특정 장기 이식을 수용할 수 있을 환자를 식별하기 위해) 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 동일한 생물학적 샘플로부터 복수(예를 들어, 무한수)의 목표물(예를 들어, 질병 마커)의 정밀하고 신뢰할 수 있는 분석을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 특정 특징들만이 본 명세서에 예시되고 설명되었지만, 당업자는 많은 변형 및 변경을 도출할 것이다. 따라서, 이하의 특허청구범위는 본 발명의 범주 내에 속하는 모든 변형 및 변경을 포함하고자 함을 이해해야 한다.
Claims (27)
- 생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치이며,
착색제 유닛 및 탈색제 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플과 작동식으로 결합하도록 구성되는 표면을 갖는 유동 셀;
생물학적 샘플의 적어도 일부를 조명하기 위한 조명원;
상기 유동 셀에 작동식으로 결합되고, 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 적용 이전, 도중, 이후, 또는 이들의 임의의 조합으로 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하도록 구성되는 모니터링 유닛;
생물학적 샘플의 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여, 성능 지수(figure of merit)를 결정하기 위한 프로세싱 유닛; 및
상기 프로세싱 유닛 및 유동 셀과 통신하는 제어기 유닛
을 포함하고,
제어기 유닛은 적어도 부분적으로 성능 지수에 기초하여, 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 적용을 제어하고 하나 이상의 광학적 특성 중 적어도 하나의 포화 후 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 유동을 중지하도록 구성되는
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치. - 제1항에 있어서,
상기 모니터링 유닛이 카메라, 전하 결합 소자, 광전자 증배관, 또는 광 다이오드를 포함하는
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 모니터링 유닛은 상기 유동 셀에 존재하는 영상 획득 윈도우를 통해 영상을 획득하도록 구성되는
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치. - 제1항에 있어서,
하나 이상의 광학적 특성을 표시하기 위한 디스플레이 장치를 더 포함하는
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치. - 제1항에 있어서,
상기 유동 셀에 용액을 도입하기 직전에 하나 이상의 용액을 혼합하는 예비 혼합기를 더 포함하고, 착색 유닛은 복수의 착색을 적용하도록 구성되는
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치. - 삭제
- 생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법이며,
생물학적 샘플을 제공하는 단계;
시약을 유동시켜 생물학적 샘플의 적어도 일부를 착색하는 단계;
생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계;
광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여, 성능 지수를 계산하는 단계
를 포함하고
상기 방법은 광학적 특성 중 적어도 하나의 포화 시까지 생물학적 샘플의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계, 및 하나 이상의 광학적 특성 중 적어도 하나의 포화 후 착색제 및 탈색제 중 적어도 하나의 유동을 중지하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 삭제
- 제8항에 있어서,
성능 지수는 광 강도, 영상의 콘트라스트, 브레너 구배(Brenner gradient), 또는 신호 대 배경 비 중 하나 이상을 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
모니터링하는 단계는 생물학적 샘플의 착색 중인 부분으로부터 영상을 획득하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제11항에 있어서,
영상화하지 않을 때 조명 셔터를 닫는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
생물학적 샘플의 임의의 백화 현상(photo-bleaching)을 감소시키기 위해, 생물학적 샘플에 하나 이상의 퇴색 방지제를 첨가하는 단계를 더 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
생물학적 샘플의 적어도 일부를 탈색하는 단계;
생물학적 샘플의 탈색된 부분의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계; 및
생물학적 샘플의 탈색된 부분의 하나 이상의 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여, 성능 지수를 계산하는 단계
를 더 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제14항에 있어서,
생물학적 샘플의 탈색된 부분의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계는 탈색 동안에 생물학적 샘플의 탈색된 부분으로부터 영상을 획득하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
생물학적 샘플의 적어도 일부를 세척(rinsing)하는 단계;
생물학적 샘플의 세척된 부분의 하나 이상의 광학적 특성을 모니터링하는 단계; 및
생물학적 샘플의 세척된 부분의 하나 이상의 광학적 특성 중 적어도 하나에 기초하여, 성능 지수를 계산하는 단계
를 더 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제16항에 있어서,
모니터링하는 단계는 생물학적 샘플의 세척 중인 부분으로부터 영상을 획득하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제16항에 있어서,
생물학적 샘플로부터 떨어져 있는 구역을 영상화하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
착색 전의 생물학적 샘플의 초기 영상을 획득하는 단계를 더 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제19항에 있어서,
초기 영상을 획득하는 단계에 앞서 완충액으로 생물학적 샘플을 세척하는 단계를 더 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
모니터링하는 단계는 착색, 탈색 또는 세척 동안 영상을 연속적으로 획득하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제21항에 있어서,
생물학적 샘플을 실시간으로 모니터링하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
모니터링하는 단계는 착색, 탈색 또는 세척 동안 영상을 간헐적으로 획득하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제23항에 있어서,
영상을 간헐적으로 획득하는 단계는 조명원에 대한 생물학적 샘플의 노출 시간보다 긴 시간 간격으로 영상을 획득하는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제8항에 있어서,
성능 지수를 결정하는 단계는 광 강도 값을 바이오마커의 특정 표지와 상호 연관시키는 단계를 포함하는
생물학적 샘플의 착색을 위한 폐루프 자동화 방법. - 제1항에 있어서,
성능 지수는 광 강도에 기초하는
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치. - 제26항에 있어서,
(a) 광 강도가 포화점에 도달했을 때 착색제의 유동이 중지되거나;
(b) 광 강도가 감소 포화 수준에 도달했을 때 탈색제의 유동이 중지되거나; 또는 이들의 조합인
생물학적 샘플의 반복적 착색을 위한 자동화 장치.
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