CN103328950B - 自动化分子病理学系统的闭环监测 - Google Patents

自动化分子病理学系统的闭环监测 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于使生物学样品染色的闭环自动化方法。所述方法包括提供生物学样品，通过在试剂中流动使至少一部分生物学样品染色，监测生物学样品的一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性计算品质因数。还提供了用于使生物学样品重复染色的自动化装置。

Description

自动化分子病理学系统的闭环监测
背景
本发明总体上涉及用于使生物学样品重复染色的自动化方法和装置，用于成像应用。
生物学样品用于分析和诊断目的，例如在分子水平诊断病变组织。生物学样品(例如在其上固定组织样品的组织微阵列(TMA))通常用形态学染色剂或生物标记物染色。随后用显微镜手动分析染色的TMA，或者可获取TMA的图像用于随后的分析或比较。在施用第一染色剂并成像后，可施用一种或多种连续或相继的染色剂或生物标记物，并且可再次分析TMA。可随后比较两个或更多个连续图像。单一染色循环可包括以下步骤：使染色剂(抗体)流动经过组织，使染色剂孵育适当的时间，漂洗去掉染色剂，以降低背景荧光，使载玻片成像，和漂白去掉染色剂。作为开发用于荧光成像的多重技术(multiplexing technique)的一部分，需要序贯染色、漂洗和脱色循环。对于多种染色剂，可随后重复染色循环。对于多重应用，TMA需要用多种分子探针染色，以定量或定性研究蛋白质表达或空间分布。
染色过程通常使用易受误差影响的耗时手动技术来实施。因此，总的操作时间为这些步骤的每一个乘以施用的染色剂的总数的总和。目前，基于每一个步骤所需的流体的量确定每一个步骤的时间。每一个步骤的时间固定，不依赖于施用哪一种抗体(染色剂)。因此，非常弱的染色剂将经历与强得多的染色剂相同的漂白时间，尽管较短的漂白时间可能足够。用于染色过程的试剂通常昂贵并且具有有限的保存期限，从而需要专门的处理技术。
因此，期望提供一种用于在染色循环中优化一个或多个步骤的方法。还期望使过程自动化并且减少手动介入，以使得过程时间有效和可靠。
发明概述
在一种实施方案中，提供了用于使生物学样品重复染色的自动化装置。所述自动化装置包括与染色剂单元和漂白剂单元流体连通的流动池，其中所述流动池包含表面，所述表面设置为与样品操作地接合，用于照明至少一部分生物学样品的照明来源，与流动池操作地偶联并且设置为用于在施用至少一种染色剂和脱色剂之前、期间和/或之后监测生物学样品的一个或多个光学特性的监测单元。所述装置还包括用于基于生物学样品的至少一个光学特性确定品质因数的处理单元，和与处理单元和流动池连通的控制器单元，其中所述控制器单元设置为至少部分基于品质因数来控制至少一种染色剂和脱色剂的施用。
在另一种实施方案中，提供了一种用于使生物学样品染色的闭环(closed loop)自动化方法。所述方法包括提供生物学样品，通过在试剂中流动使至少一部分生物学样品染色，监测生物学样品的一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性计算品质因数。
附图简述
当参考附图，阅读以下详细说明时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中在整个附图中，相同的符号标记代表相同的部分，其中：
图1为本发明的闭环自动化系统的一个实例的示意图；和
图2为用于分子病理学系统的闭环监测的方法的实例步骤的流程图。
发明详述
实施方案涉及自动化分子病理学系统的闭环监测的方法和系统，用于分子成像。所述方法和系统能够在分子成像中优化操作。在某些实施方案中，可操作自动化分子病理学系统，通过降低或消除转移样品(例如，在流动池内在载玻片上的组织样品)的需要，具有最少的操作者介入。所述系统和方法可降低或消除样品在染色组件和成像组件之间移位的需要。闭环监测使得在系统内试剂体积和试剂停留时间二者最小化，从而节省昂贵的试剂，例如荧光标记的抗体，和使得试剂分解或副反应最小化。
在某些实施方案中，用于使生物学样品染色的闭环自动化方法包括提供生物学样品，使至少一部分生物学样品染色，在染色期间监测生物学样品的一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性确定品质因数。所述方法还可包括漂洗至少一部分生物学样品，在漂洗期间从一部分生物学样品监测一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性确定品质因数。所述方法还可包括使至少一部分生物学样品脱色，在脱色期间从一部分生物学样品监测一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性确定品质因数。在染色后，可将生物学样品孵育确定的时间段，以提供足够的时间使抗体与生物学样品中的分子结合。可在孵育期期间实施用于染色步骤的成像。在一个实例中，在染色、脱色和漂洗中的一个或多个期间，监测包括获取生物学样品的图像，确定品质因数包括使用获取的图像确定一部分生物学样品的光强度。在漂洗期间监测可包括从远离生物学样品的区域获取图像。例如，可从生物学样品之外的区域获取图像。
为了更清楚和简明地描述要求保护的本发明的主题，对于具体的术语，提供以下定义，其用于以下描述和所附权利要求书。在整个说明书中，具体术语的举例应看作是非限制性实例。
本文使用的术语“生物学样品”是指由生物学对象得到的样品，包括体内或体外得到的生物学组织或流体来源的样品。这样的样品可为但不限于从哺乳动物(包括人)分离的组织、级分和细胞。
在一些实施方案中，生物学样品包括结肠、正常的乳腺组织、前列腺癌、结肠腺癌、乳腺组织微阵列、乳腺TMA或正常前列腺(prostate)的组织切片。组织切片可包括组织样品的单一部分或块，例如，从组织样品切割的组织或细胞的薄片。在一些实施方案中，可取多个组织切片样品并对其进行分析，条件是本文公开的方法可用于关于至少两个不同的靶标(在形态学或分子水平)分析组织样品的相同切片。在一些实施方案中，可关于至少四个不同的靶标(在形态学或分子水平)分析组织样品的相同切片。在一些实施方案中，可关于多于四个不同的靶标(在形态学或分子水平)分析组织样品的相同切片。在一些实施方案中，可在形态学和分子水平二者分析组织样品的相同切片。如果用作生物学样品，组织切片的厚度可在小于约100微米范围，在小于约50微米范围，在小于约25微米范围，或者在小于约10微米范围。
本文使用的术语“探针”是指包括结合剂和信号发生剂(signal generator)的剂。在一些实施方案中，探针的结合剂和信号发生剂包括在单一实体(例如，能结合靶标的放射性或荧光分子)中。在备选的实施方案中，结合剂和信号发生剂包括在离散的实体(例如，能结合靶标的第一抗体和能结合第一抗体的标记的第二抗体)中。
本文使用的术语“结合剂”是指可与生物学样品中的一个或多个靶标非共价结合的生物学分子。结合剂可与靶标特异性结合。合适的结合剂可包括以下的一种或多种：天然或修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体(affibodies)或适体)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或适体)；多糖(例如，凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原、半抗原等。可根据待分析的样品和可用于检测的靶标来选择合适的结合剂。
本文使用的术语“信号发生剂”是指使用一种或多种检测技术(例如，光谱测定法、量热法、光谱学或视觉检查)能提供可检测信号的分子。可检测信号的合适实例可包括光学信号和电信号或放射性信号。在一个实例中，信号发生剂可包括发光团或荧光团。
本文使用的术语“发光团”是指显示发光(包括化学发光、生物发光、磷光和光致发光)的化合物。代表性实例包括但不限于鲁米诺、光泽精(lucigenin)、9,10-二氢化吖啶、吖啶酯和二氧杂环丁烷和荧光团。
本文使用的术语“荧光团”是指化合物，当通过暴露于特定波长的光来激发时，所述化合物发射不同波长的光。荧光团可根据其发射特性或“颜色”描述。绿色荧光团(例如Cy3、FITC和Oregon Green)的特征可为其通常在515-540纳米范围的波长下发射。红色荧光团(例如Texas Red、Cy5和四甲基若丹明)的特征可为其通常在590-690纳米范围的波长下发射。荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸根合芪-2,2′-二磺酸；吖啶；吖啶衍生物和异硫氰酸吖啶；5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素；香豆素衍生物；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)；7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)；四氯四溴荧光素(cyanosine)、4′,6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚 (DAPI)；5′,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基) 4-甲基香豆素；4,4′-二异硫氰酸根合二氢-芪-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫氰酸根合芪-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；伊红；伊红衍生物，例如异硫氰酸伊红；赤藓红；赤藓红衍生物，例如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；溴乙啶；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′,7′-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC (XRITC)；荧光胺衍生物(与胺反应时发荧光)；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基-7-羟基香豆素；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红、B-藻红蛋白；邻苯二甲醛衍生物(与胺反应时发荧光)；芘和衍生物，例如芘、芘丁酸酯(pyrenebutyrate)和1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯(sucinimidyl 1-pyrene butyrate)；活性红4(Cibacron.RTM.亮红3B-A)；若丹明和衍生物，例如6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、异硫氰酸若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系螯合物衍生物、量子点(quantum dots)、花菁和方酸菁(squaraines)。
本文使用的术语“氧化剂”或“氧化试剂”是指使发光团基本上失活的脱色剂。在一种实施方案中，脱色剂包含漂白剂。代表性氧化试剂包括活性氧物类、羟基、单线态氧、过氧化氢或臭氧，例如过氧化氢、高锰酸钾、重铬酸钠、含水溴、碘-碘化钾或叔丁基氢过氧化物。
多重或多路分析通常是指使用相同的检测机理分析生物学样品中的多个靶标。
在分子成像中，可将信号发生剂(例如，荧光团)激发，并且可观察得到的信号(例如，荧光信号)，并且以数字信号(例如，数字化的图像)形式记录。对于多重分析(multiplexing)，使用适当的荧光滤光片(filter)，可重复类似的程序用于在样品中结合的多个不同的信号发生剂(如果存在)。在一些实施方案中，一系列探针可采用序贯方式与生物学样品接触，以得到生物学样品的多重分析。在一些实施方案中，一系列探针组(在一组中包括至多4个探针)可采用序贯方式与生物学样品接触，以得到生物学样品的多重分析。
本文使用的术语“品质因数”包括但不限于光强度、图像的对比度、Brenner梯度或信号与背景比率。
可在染色循环中在两个或更多个处理步骤实施监测。每一个染色循环可包括使至少一部分生物学样品染色，漂洗去掉染色剂，以降低背景荧光，使染色剂脱色。对于多种染色剂，可重复染色循环。在染色期间，样品可孵育确定的时间段。在染色循环中在一个或多个步骤期间，通过生物学样品相应的部分或远离生物学样品的部分产生的信号可用于确定染色、脱色和/或漂洗的量。在一个实例中，监测包括成像。成像可用于得到代表在染色循环期间在生物学样品中发生的染色、脱色和/或漂洗的量的信号。在一些实施方案中，监测单元可包含与照相机操作地偶联的显微镜。在一些实施方案中，使用者可利用监测单元以在样品载玻片上在多于一个视野中记录图像，以定位和绘制样品中的多个染色实体。监测单元可与流动池的图像捕获窗口操作地偶联，使得样品位于成像单元的视野内。在一个实例中，监测单元可与流动池相邻布置。图像捕获窗口可通过在其上布置样品的基底(例如，显微镜载玻片)来限定。图像捕获窗口可包括在载玻片-接受构件的底面上的光学透射的材料。
染色、漂洗和漂白步骤中的每一个可通过使含有特定试剂的溶液流动经过位于流动池内的生物学样品来完成。可控制以下参数来增强反应性，从而降低试剂消耗：(1) 流动池内部体积；(2) 流动池内部温度；(3) 氧化溶液(例如，过氧化氢和碳酸氢钠)的组成部分的混合的时间安排；(4) 当溶液通过样品时其搅动程度；和(5) 流动池的气泡去除或脱气。这些参数的适当调节也可减少样品降解，允许单个样品得到更多数据。
附属装置，例如加热元件或搅动元件(例如，声压电组件)可与流动池操作地偶联。在一个实例中，附属装置可位于远离图像捕获窗口，通过该图像捕获窗口，与照相机偶联的显微镜在处理的各个阶段期间可捕获样品的图像。
所公开的方法可在包括流动池的系统中实施，该流动池设置为通过图像捕获窗口能够增强接近样品。用于使生物学样品染色的自动化方法可通过采用在题为“ITerativeSTAINING of Biological Samples(生物学样品的重复染色)”的美国专利申请公布号2009/0253163中公开的技术来实施，其通过引用结合到本文中。
图1说明用于自动化分子病理学系统的闭环系统。该系统包括具有位于组织样品之上的封闭的流动室的流动池10。流动池10可包括固体载体-接受构件12、具有设置为接受位于载玻片16上的组织样品的中心开口的垫圈(gasket) 14、盖18、入口孔20和出口孔22。当载玻片16位于载玻片-接受构件12中并且垫圈14夹在载玻片16和盖18之间时，流动池10限定封闭的室。由于流动室被包围在流动池10内部，流体蒸发和因此试剂损失最小化。另外，封闭的构造改进温度控制。
固体载体-接受构件12与一定范围的化学品和温度变量相容。在一种实施方案中，载玻片支持物(slide holder)可由基底和用于将载玻片固定在室中的针或接头(tab)系统组成。
在一些实施方案中，流动池10可固定在显微镜载物台上，用于监测过程。这使得样品暴露于一系列试剂，而无需手动介入，从而消除样品在显微镜载物台上重新排列(用于图像获取或对准)。由于在每一个染色步骤之后获取的图像可叠加以形成复合图像，这一点对于多重染色和成像特别有用。流动池10可为适于装配到显微镜载物台上的模块单元。或者，流动池10可为包括显微镜载物台的集成单元。
流动池10可与可包括染色剂单元(未显示)和脱色剂单元(未显示)的流体处理单元13可操作地偶联。在一种实施方案中，染色剂单元设置为施用多种染色剂。流动池10还可与照明来源15偶联，用于照明至少一部分在流动池10中布置的生物学样品。照明来源的非限制性实例可包括金属卤化物来源、汞弧灯或发光二极管。当成像单元由生物学样品未获取图像时，可将照明来源15的光闸(shutter) (未显示)关闭。关闭光闸可降低生物学样品的光-漂白的量。在连续成像的情况下，在成像的整个持续时间期间，照明来源的光闸可保持打开。
所述系统还可包括流体和温度控制子系统，以控制流体递送和在流动池10的内部室中的溶液温度。在一种实施方案中，流体控制系统还可包括储器、流动传感器、混合室和脱气器，以在注入流动池之前制备一种或多种试剂。这样的子系统的优点是避免需要预先混合和储存可能具有有限的稳定性或保存期限的试剂。流体控制子系统与流的入口孔20和出口孔22流体连通。
位于流动池10上游的预混器可基于室设计或管设计。室设计可包括具有入口和出口孔并且含有机械混合机的小的容器。在一些实施方案中，通过使用预混器在分子水平混合溶液，以恰在将试剂引入流动池10之前，使反应物散布。混合时间应足够长以产生试剂并且足够有限以防止分解。
垫圈14可包括设置为接受位于载玻片上的组织样品的中心开口。垫圈14可由可变形的化学惰性的橡胶或塑料制成，其保留施用于流动室的液体。垫圈的中心开口可具有一定尺寸，使得图像获取窗口的视野最大化。
入口和出口孔20和22优选远离图像获取窗口放置。因此，入口和出口孔可位于垫圈14中或盖18上。入口和出口孔20和22可具有类似的尺寸，使得流入速率和流出速率同等，以实现穿过样品的期望的流动速率。
温度控制单元可包括热电平台17 (用于温度控制)和电阻温度检测器或热敏电阻(用于温度测量)。对于其中温度控制单元的底表面与流体直接接触的构造，接触表面24可由耐化学品的材料制成，例如不锈钢或钛。框架26也可用于安置温度控制单元的组件。
在一些实施方案中，本发明还可包括与流动室连接并且能通过将低电压电信号转化为声能而在流动室内产生振动的压电元件。在一个优选的实施方案中，压电元件可由陶瓷、石英(SiO2)或钛酸钡(BaTiO3)组成。压电元件的构造提供超声搅拌并且影响试剂通过流体室的流动特性。这是特别有利的，其中期望的染色反应扩散受限，并且通过流动池几何形状防止常规的机械混合。
监测单元28可包括光电倍增管或光电二极管、电荷耦合器件、照相机和其它合适的图像-接受装置。监测单元28可包括与图像-接受装置(例如但不限于照相机)操作地偶联的显微镜。虽然未说明，但监测单元28还可包括光学元件，例如但不限于物镜。图像-接受装置能记录样品的图像，而样品在载玻片和流动通道外壳(housing)之间布置。监测单元28还可包括安置装置，例如与照相机操作地偶联并且设置为用于调节照相机相对于流动池的位置的促动器。安置装置可将物镜移动至在样品上不同的目标视野，并且相对于样品实施自动聚焦操作。
在一些实施方案中，监测单元28可与处理单元30连通。处理单元30进而可与控制器单元32连通。在一些实施方案中，监测单元28和/或处理单元30可设置为用于鉴定在染色、脱色或漂洗步骤期间光强度值的饱和。处理单元30的非限制性实例可包括图像处理单元。
控制器单元32可与控制输入或使用者界面(显示) 34连通。控制器单元32可设置为用于至少部分基于通过成像系统产生的图像，控制至少一种染色剂和脱色剂的施用。控制器单元32可控制流动池系统的各种组件，包括例如热控制单元、预混器、振动单元和泵。当流动池10并入到合并的样品处理和图像获取系统中时，图像获取组件(例如，显微镜或照相机)还可通过计算机控制。
处理单元30可设置为分析通过监测单元28获取的图像。在一个实例中，监测单元28可实时获取图像。在该实例中，图像处理单元30可实时处理图像。处理单元30可由获取的图像确定光强度或颜色。在一个实例中，对于染色步骤，光强度可绘制作为时间的函数。当光强度达到饱和点时，可启动(intimated)控制器单元32。在闭环系统中，控制器单元32可将信号传输至流动池10，指示流动池停止染色步骤和移动至下一步骤，例如漂洗步骤。类似地，对于漂白和漂洗步骤，可关于时间绘制光强度，并且当光强度值稳定或者当光强度的变化速率达到低于某一速率时，可停止相应的过程(漂白或漂洗)，并且可开始在染色循环中的下一个步骤。利用使用者界面34，可在系统中前馈(pre-fed)光强度的变化速率。在一种实施方案中，实际的光强度值或光强度值的变化速率可与前馈的值比较，并且如果需要，可更新前馈的值，并且与相应的生物学样品或信号发生剂共同关联。在一些实施方案中，监测单元28和/或处理单元30可进一步设置为在染色循环中，对于一个或多个步骤，确定样品的暴露时间。
通过计算机控制染色循环涉及的一个或多个过程步骤，可实现自动化，例如但不限于加入染色试剂和氧化剂。当将流动池系统并入到合并的样品处理和图像获取系统时，图像获取组件(例如，显微镜或照相机)还可通过软件(例如用LabVIEW或C编写的程序)来控制。
在一些实施方案中，使用计算机辅助的方式，可实施一个或多个观察或关联步骤。在其中来自信号发生剂的信号可以数字图像形式储存的实施方案中，可进行图像的计算机辅助分析。在一些实施方案中，使用计算机辅助的叠加可重叠图像(例如，来自探针和形态学染色剂的信号)，以得到生物学样品的完整信息，例如拓扑学和关联信息。
在某些实施方案中，提供了一种用于生物学样品的染色循环的闭环自动化方法。所述方法包括在流动池中在显微镜载玻片上安置生物学样品(例如组织切片)，以允许发光团和样品之间足够的接触时间(通常在30-60分钟范围)的方式向样品施用荧光标记或发光团，取决于所用的标记的浓度和类型，通过施用洗涤溶液(例如适当的缓冲溶液)来漂洗生物学样品，以洗去任何未结合的荧光标记或发光团，获取标记的样品的图像，确定光强度的饱和，和漂白。其中获取信号包括通过图像获取窗口获取信号。在一次或多次染色、漂洗和漂白之后，可实施成像。或者，在每一次染色、漂洗和漂白之后，可实施成像。所述方法还包括测量产生的信号的光强度值和使信号与生物标记物的特异性标记关联。可以大于样品的暴露时间的时间间隔实施成像。
在整个染色循环中，或者通过在染色循环中的特定步骤，可连续进行成像。在一些实施方案中，所述方法包括实时监测至少一部分组织以及实时确定是否已达到期望的状态(即，已发生多少漂白/染色/漂洗)。在这些实施方案中，图像可为在染色、脱色或漂洗期间连续获取的图像。在其它实施方案中，所述方法包括对于在染色循环中特定的步骤，间歇监测生物学样品。在这些实施方案中，可在染色、脱色或漂洗期间间歇获取图像。例如，对于特定的步骤，例如染色步骤，可以恒定的时间间隔实施成像。或者，对于特定的步骤，可以不同的时间间隔进行成像，随着时间的进展，时间间隔减小。可以大于生物学样品对照明来源的暴露时间的时间间隔获取图像。在间歇成像的情况下，当样品不成像时，可关闭照明光闸，以降低样品光-漂白的量。
在一种实施方案中，成像可为亮场成像。亮场成像可使得能够鉴定荧光成像以外的标记。成像可用于收集相应于颜色和/或光强度的数据。
本发明的实施方案涉及对于染色循环的一个或多个步骤，监测一个或多个光学特性。在一种实施方案中，来自染色样品的荧光的光强度可用于确定用于进行染色/漂白或漂洗步骤的时间段。
在步骤50，提供了一种生物学样品。生物学样品在流动池中布置。在步骤52，至少一部分生物学样品被染色。任选，在步骤51，在使样品染色之前可获取初始图像。来自初始图像或背景图像的数据可用于归一化来自随后的图像的强度数据。任选，在步骤53，所述方法可包括在获取染色前样品的初始图像之前，洗涤生物学样品溶液的步骤。例如，在提供样品(步骤50)后，可将基本上无色的洗涤溶液引入流动通道或在其上操作地接合样品的表面和载玻片之间限定的空间。通过使样品和组成样品的生物学实体与液体接触，可冲洗洗涤溶液，以调整或启动(prime)样品。洗涤步骤还可提供使光强度数据归一化的合适参考。
通过多种洗涤和/或流体应用技术可完成用于施用染色剂和施用漂白剂的各种方法步骤。例如，通过多种已知的实验室程序可完成施用洗涤溶液、染色剂和/或脱色剂，所述程序包括但不限于移液；吸入；混合；离心；和这些过程的组合。
在一些实施方案中，一个或多个步骤可自动化并且可使用自动化系统实施。在一些实施方案中，使用自动化系统可实施染色循环的所有步骤。
在步骤54，关于生物学样品的一个或多个光学特性监测生物学样品。在一种实施方案中，监测包括使生物学样品成像。成像可为全视野成像。可使生物学样品成像，以确定对于至少一部分生物学样品染色的量。随着成像的进行，生物学样品的光强度提高。一个或多个光学特性可达到饱和状态。例如，在染色期间，当染色完成时，光强度达到饱和水平。可进行成像来确定光强度何时达到饱和水平。在监测后，可基于至少一个光学特性来计算品质因数。可在每一个监测步骤之后确定品质因数。可基于生物学样品、标记物或染料的性质来选择品质因数。在成像的情况下，在步骤55，可分析由图像获取的数据，以确定光强度何时达到其饱和水平。可在每一个成像步骤(步骤54)之后实施步骤55。如果光强度已达到饱和水平，系统可移动至下一个步骤，其为漂洗。在步骤56，所述方法还包括漂洗至少一部分生物学样品。在步骤58，监测样品，例如，成像，以确定对于至少一部分生物学样品的漂洗的量。在步骤59，分析由图像获取的数据，以确定漂洗步骤的进展。如果已发生期望的进展，即，在漂洗的情况下，背景信号已下降低于某一阈值，可停止漂洗步骤并且可开始方案的下一步骤。采用这种方式，仅给予每一个操作所需的那么多时间，与对于所有情况需要工作的总体指定的较长时间相对。在一种实施方案中，在漂洗期间，可在远离生物学样品的区域实施成像，以确定漂洗的程度。
为了使成像期间的光-漂白作用最小化，可在确定的时间间隔获取图像，用于实时监测。用于获取图像的确定的时间间隔可大于暴露时间。或者或此外，可将抗褪色剂加入到生物学样品中，以降低样品的任何光-漂白。
在步骤60，将至少一部分生物学样品脱色或漂白。在步骤62，当脱色时，监测样品以确定对于至少一部分生物学样品脱色的量。在一种实施方案中，可使样品成像。成像可用于确定生物学样品何时漂白至合适的程度。
随着脱色的进行，光学特性(例如光强度)降低，并且当完成脱色后，达到最小值。在步骤61，分析在监测期间由生物学样品获取的数据，以评价脱色的程度。例如，分析由图像获取的数据，以确定脱色步骤的进展。可分析数据以确定光强度减少是否已达到饱和水平。如果已发生期望的进展，可停止脱色步骤，并且可开始染色循环的下一步骤。例如，可将新的抗体引入流动室或者可提供另一种生物学样品(步骤64)。在一个实例中，通过在脱色步骤期间使样品连续成像，可确定强度减少的饱和。
自动化脱色步骤允许操作者重新探测单一样品，同时保持初始记录(registration)。加入氧化剂导致生物学样品脱色，这是由于基本去除由发光团产生的信号。无论脱色是通过化学改变发光团还是通过分离而完成，信号降低至少80%并优选大于90%。可测量该信号的下降作为相对于染色的生物学样品(the stained biological)的初始绝对强度，在特定波长下的染色后强度，以调节背景信号的伴随降低或由于脱色步骤引起的自发荧光。
任选，在脱色之前，可使样品成像，以鉴定需要监测的最亮区域。接着，可获取初始图像并且可鉴定需要监测的最亮区域。
在一个实例中，可在系统中前馈在染色循环中用于进行每一个步骤的时间段。在该实例中，可进行成像以证实前馈的时间段是否正确。如果在染色循环中一个或多个步骤的时间段不同于前馈的时间段，则在系统中可更新前馈的时间段。这些更新时间段可后来被系统使用，将来用于类似的样品。在一个实例中，所述方法可包括使光强度值与生物标记物的特异性标记关联。
在一些实施方案中，可观察在生物学样品中信号的位置。在一些实施方案中，可使用形态学染色剂观察在生物学信号中信号的定位。在一些实施方案中，可观察两个或更多个信号的相对位置。信号的位置可与在生物学样品中靶标的位置关联，提供关于在生物学样品中不同靶标的定位的信息。在一些实施方案中，可关联信号的强度值和信号的位置以得到关于在生物学样品中不同靶标的定位的信息。例如，相对于细胞核，某些靶标可能在细胞质中更多表达，或者反之亦然。在一些实施方案中，通过比较两个或更多个信号的位置和强度值，可得到关于靶标的相对定位的信息。
本发明的方法使得在完整的染色剂/抗体组内的循环时间最小化，从而改进通过(through)。使用本发明的方法，可采用新的染色剂，而无需广泛测试。
本文公开的系统和方法可用于各种领域，例如但不限于在生物学和医学中分析、诊断和治疗应用。在一些实施方案中，本文公开的系统和方法可用于组织化学，特别是，免疫组织化学。根据本文描述的方法，患者的细胞或组织样品的分析可在诊断上(例如，以鉴定已患有特定的疾病、已暴露于特定的毒素或者对特定的治疗或器官移植充分应答的患者)和预后(例如，以鉴定可能发展特定的疾病、对特定的治疗充分应答或者接受特定的器官移植的患者)采用。本文公开的方法可促进精确和可靠地分析来自同一生物学样品的多个(例如，可能无限数量)的靶标(例如，疾病标记物)。
虽然本文仅说明和描述本发明的某些特征，但是本领域技术人员可以想到许多修改和变化。因此，应理解的是，所附权利要求书旨在涵盖落入本发明范围内的所有这些修改和变化。

Claims (25)

1.一种用于使生物学样品重复染色的闭环自动化装置，所述装置包含：
与染色剂单元和脱色剂单元流体连通的流动池，其中所述流动池包含表面，所述表面设置为与样品操作地接合；
用于照明至少一部分生物学样品的照明来源；
监测单元，其与流动池操作地偶联并且设置为用于在施用至少一种染色剂和脱色剂之前、期间和/或之后监测生物学样品的一个或多个光学特性直至一个或多个光学特性中的至少一个饱和；和
处理单元，其用于基于生物学样品的一个或多个光学特性中的至少一个确定品质因数；
与处理单元和流动池连通的控制器单元，其中所述控制器单元设置为至少部分基于品质因数来控制至少一种染色剂和脱色剂的施用，并在一个或多个光学特性中的至少一个饱和之后停止至少一种染色剂和脱色剂的流动；
所述闭环自动化装置设置为能够对生物学样品进行重复染色，以及分析同一生物学样品中的多个靶标。
2.权利要求1的闭环自动化装置，其中所述监测单元包含照相机、电荷耦合器件、光电倍增管或光电二极管。
3.权利要求1的闭环自动化装置，其中所述监测单元与照相机操作地偶联。
4.权利要求1的闭环自动化装置，其中所述监测单元设置为经由存在于流动池中的图像获取窗口来获取图像。
5.权利要求1的闭环自动化装置，所述装置还包含用于显示一个或多个光学特性的显示装置。
6.权利要求1的闭环自动化装置，所述装置还包含预混器，以恰在将一种或多种溶液引入流动池之前，混合一种或多种溶液。
7.权利要求1的闭环自动化装置，其中所述染色剂单元设置为施用多种染色剂。
8.一种用于使生物学样品重复染色的闭环自动化方法，所述方法包括：
提供生物学样品；
通过在试剂中流动使至少一部分生物学样品染色；
监测生物学样品的一个或多个光学特性；和
基于一个或多个光学特性中的至少一个计算品质因数，其中所述方法还包括监测一个或多个光学特性直至一个或多个光学特性中的至少一个饱和，和在一个或多个光学特性中的至少一个饱和之后停止至少一种染色剂和脱色剂的流动；
所述方法使得能够对生物学样品进行重复染色，以及分析同一生物学样品中的多个靶标。
9.权利要求8的方法，其中所述品质因数包含光强度、图像的对比度、Brenner梯度或信号与背景比率中的一个或多个。
10.权利要求8的方法，其中监测包括在染色期间从一部分生物学样品获取图像。
11.权利要求10的方法，所述方法包括当不成像时关闭照明光闸。
12.权利要求8的方法，所述方法还包括向生物学样品中加入一种或多种抗褪色剂，以降低生物学样品的任何光-漂白。
13.权利要求8的方法，所述方法还包括：
使至少一部分生物学样品脱色；
监测生物学样品的一个或多个光学特性；
基于生物学样品的一个或多个光学特性中的至少一个计算品质因数。
14.权利要求13的方法，其中监测包括在脱色期间从一部分生物学样品获取图像。
15.权利要求8的方法，所述方法还包括：
漂洗至少一部分生物学样品；和
监测生物学样品的一个或多个光学特性；和
基于生物学样品的一个或多个光学特性的至少一个计算品质因数。
16.权利要求15的方法，其中监测包括在漂洗期间从一部分生物学样品获取图像。
17.权利要求15的方法，所述方法包括使远离生物学样品的漂洗部分的区域成像。
18.权利要求8的方法，所述方法还包括在染色之前获取生物学样品的初始图像。
19.权利要求18的方法，所述方法还包括在获取初始图像之前用缓冲溶液漂洗生物学样品。
20.权利要求8的方法，其中监测包括在染色、脱色或漂洗期间连续获取图像。
21.权利要求20的方法，所述方法包括实时监测生物学样品。
22.权利要求8的方法，其中监测包括在染色、脱色或漂洗期间间歇获取图像。
23.权利要求22的方法，其中间歇获取图像包括以大于生物学样品对照明来源的暴露时间的时间间隔获取图像。
24.权利要求8的方法，其中确定品质因数包括使光强度值与生物标记物的特异性标记关联。
25.权利要求1的闭环自动化装置，其中所述品质因数包含光强度、图像的对比度、Brenner梯度或信号与背景比率中的一个或多个。
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