JPH0814537B2 - Ｄｎａ配列決定のための実時間走査電気泳動装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は電気泳動系における蛍光検知のための装置、
特に核酸の自動配列決定のためのその様な装置に関す
る。

DNAの構造分析な現代の分子生物学において次第に重
要な役割を果している。サンガー（Sanger）及び彼の研
究者により開発された酵素的即ちジデオキシ法〔Sanger
et al. Proc.Natn.Acad.Sci.U.S.A.74,5463−5467（19
77）,A.J.H.Smith,Meth,Enzymol.65,560−580（198
0）〕及びマクサム（Maxam）及びギルバート（Gillber
t）により開発された化学的方法〔S.M.Maxam and W.Gil
lbert,Meth.Enzymol.65,499−599（1980）〕の導入以来
DNAの約４×10⁶個の塩基が配列決定された。典型的に
は、特別の被分析DNAセグメントについて四つの別々の
反応が行われる。酵素的方法においては、これらの反応
はアデノシン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアノシン
（Ｇ），或いはチミジン（Ｔ）のいづれかで終了するDN
A断片を生成する。化学的方法においては、典型的には
G,G＋A,C＋T,或いはＣで終了する断片が生成される。い
づれの場合においても、四つの組の反応生成物は高−分
解ポリアクリルアミドゲルの隣接するレーン内において
電気泳動される。ゲルのオートラジオグラフ像が生成さ
れ、及びオートラジオグラムを調べて四つの反応の各々
において発生したDNA断片の相対的長さを決定する。DNA
配列はその情報から直接に推論される。

これらの技術は共に極めて有効であるが、しかしそれ
らは又高度に労働力がかかり比較的高価であり、且つラ
ジオアイソトープの使用を含むものである。１塩基当た
り１〜５ドルのコストで１人当り１年につき配列決定さ
れる約3,000〜10,000塩基の値が代表的なものである。
これらの理由のため及び多くのDNAが配列決定されるた
めに残っているので（ヒトゲノムのみにおいて３×10⁹
個の塩基がある）、DNA配列分析の自動化及び非−アイ
ソトープ方法の開発に向けられた最近多くの活動があ
る。

より成功した試みの一つがカリフォルニア技術研究所
（California Institute of Technology）におけるレロ
イ・フッド（Leroy Hood）の実験室においてロイド・ス
ミス（Lloyd Smith）及び共同研究者により行われた〔B
io/Technolgy,Vol.3,1985年５月参照〕。その接近手法
においては、異った着色標識を有する四つの蛍光材料が
放射活性標識の代りに用いられた。各色は異ったヌクレ
オシドに対応し、従って試料が電気泳動的に共分離され
る場合に、配列決定に際して生成されるDNA断片の「は
しご」が各色が塩基A,G,C,或いはＴの一つに対応する蛍
光多色横木に分離される。カラムの長さが蛍光センサー
により走査されるにつれて、着色バンドの順序が特別の
遺伝子配列に対応する。スミス等（Smith et al）によ
って選択された特別の蛍光物質は520nmに発光ピークを
有するフルオレッセインイソチオシアネート（FITC）、
550nmで発光する４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−
オキサ−１−ジアゾール（NBDクロライド）、580nmで発
光するテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TM
RITC）及び610nmで発光するテキサスレッドであった。
これらの発光ピークは染料を緑色、緑色−黄色、橙色−
赤色、及び赤色にそれぞれ見せる。

スミス等により用いられたこの特別の方法は一般的に
一本鎖DNAファージM13において対象遺伝子のクローニン
グを含むサンガーのジデオキシ（酵素的）方法の適応で
あった。クローン化された遺伝子に隣接した相配列に相
補的なプライマー配列を用いて遺伝子の一部を複製する
DNA合成を開始する。カルテック（Cal Tech）グループ
により工夫された方式においては、蛍光標識の単一分子
が各プライマーに結合される。クローン化された遺伝子
及びプライマーは次いで各々全ての四つのヌクレオシド
を含有する四つの別々のDNA合成反応混合物に入れる。
少量のジデオキシ形態のヌクレオシド,ddATP,ddCTP,ddG
TP,或いはddTTPが各バッチに添加される。ジデオキシト
リホスフェートがランダムに通常のヌクレオシドを置換
し、合成反応における発達するDNA鎖中に導入される
と、発生期のDNAコピーが直ちに成長を停止する。その
結果、ddATPを有するバッチにおける全ての鎖は配列に
アデノシンが現われる位置で終了する。他の三つの反応
バッチにおいても同様にC,G及びＴ位置における部位−
特異的停止が生ずる。

四つの塩基を区別するために、各反応混合物中におい
て異った蛍光標識が用いられる。それを達成するため
に、Ａで終了する全てのDNAコピーは緑色着色FITCで標
識され、Ｃで終了するものは緑色−黄色NBDクロライド
で標識され、Ｇで終了するものは橙色−赤色TMRITC標識
で標識化され、及びＴで終了するコピーはテキサスレッ
ドで標識化される。

Cal Tech 自動化系においては、全ての四つの反応混
合物からのアリコートは各種長さ断片を大きさにより分
類する単一ポリアクリルアミドチューブゲルを通して電
気泳動される。電気泳動ゲルの底部には各バンドをそれ
がゲルを移動する際に逐次照射するアルゴンイオンレー
ザーが配置されている。レーザー光により励起される
と、蛍光物質はそれらの特性波長において発光し、発光
がセンサーにより検知され、確認される。発光色の配列
はヌクレオチド配列に転換される。

Cal Tech グループは四つのレーンを必要とするため
に用いられたものを一つのレーンを持込んで配列決定方
法を自動化することが出来、且つ塩基間の移動度の相違
に関する問題を実質的に除去したが、相当な問題がなお
解決されるべく残っている。先ず、検知系統設計が感度
において最適ではない。第二に、より重要なことに、装
置が一度に一つのカラムのみを取扱うことができるにす
ぎず、それに対してオートラジオグラフを用いる場合に
はスラブゲル上の多くのレーンが同時に配列決定され
る。

必要とされるものはゲルの多くのレーン上で核酸配列
決定を同時に行うことのできる高処理量、実時間蛍光検
知装置である。更に、装置は高感度を有すべきである
が、しかし、検知系統は熟練者による頻繁な注意を必要
とすべきではない。

発明の概要 多くの試料について同時に高速、最終的配列決定を提
供する実時間、自動化、核酸配列決定装置が提供され
る。この装置は一度に一個より多いクローンの配列決定
を可能にしてより長い断片の配列決定に必要とされる時
間を大幅に減少させ従って、配列決定のコストを減少さ
せる。更に、この装置の心臓部の検知系統は高価な配列
操作を除去し、及び同時に熟練者による不断の注意の必
要性を除去するように設計されている。

その最も広義において、及び本発明の好ましい実施態
様に従えば、複数のレーンが平面配列において配置され
ている電気泳動系における複数のレーンからの電磁放射
線を検知するための装置が提供される。この装置は複数
のレーンから発射される複数の波長における放射線を検
知するための光学系統を含む。その機能を達成するため
に、この光学系統は放射線を集束させるための集光要
素、集光要素から受取った複数の波長を選択的に透過さ
せるためのフィルター、及びフィルター手段から受取っ
た放射線の強度を測定するための検知系統から構成され
る。この装置は又光学系統を載置するための及び光学系
統を集光要素を一度に一つのレーンから放射線を受取る
ように移動させるために電気泳動レーンの平面配列に平
行な方向に動かすための移動ステージも有する。この装
置は又フィルター及びステージをコントロールするため
のコンピュータ系統も含む。このコンピュータ系統は又
検知器から強度データを受取り、この強度データを対応
するレーン及びフィルターにより透過された対応する波
長と実時間において相関付ける。

この装置を核酸の配列決定のために用いるために、核
酸はスミス等と同様に酵素法により調製され、標識化さ
れ、核酸は次いで装置内において電気泳動され、コンピ
ュータを使用して各レーンに対して強度データを時間及
び波長情報に分類して各レーンの配列に到達する。

発明の具体的説明 第１図及び第2A図及び第2B図には本発明の好ましい実
施態様の概略図が示されており、それぞれポリアクリル
アミドスラブゲル104、強い電磁放射線源を与えるため
のレーザー300、レーザー光をスラブゲルに向け及びゲ
ル内において電気泳動される物質に結合されている染料
の蛍光を検知する光学検知計200を有する電気泳動装置1
00により構成される。操作に際して電気泳動装置100、
レーザー300、及び光学検知計は箱（図示せず）などの
光−遮断環境内に包囲されている。

電気泳動装置100は透明な前パネル106及び透明な後パ
ネル105を有し、ゲル104がその間にはさまれている。
又、下部緩衝室101及び上部緩衝室109が含まれ、それら
はゲル104と二つの室内に含有される緩衝液の間に連通
を与えるように設計されている。これらの緩衝室及び板
105及び106はクランプ113及び115を有する枠107により
相互に固定された関係で保持されている。この電気泳動
装置は又レーザー300の直接の光を電気泳動装置を越え
て路を横切ることを阻止するためのビームダンプ111も
含む。加えて、各緩衝室はゲルを横切って電圧源を接続
するための（典型的には1000〜1500ボルト）バナナプラ
グ（112及び114）を含む。一つの好ましい対応におい
て、ゲル104は８重量％のアルクリルアミドモノマーで
あり、よく知られた技術に従って調製される〔マニアテ
ィス（Maniatis）等、Molecular Cloning,478頁参
照〕。配列決定される試料を電気泳動装置に導入するた
めに、91〜97などの一連のウェルが第3A図及び3B図に概
略図示されるようにゲルの頂部に創出される。先ず、ス
ペーサー98及び99を板106上においてゲル104の所望の厚
さを規定し、及び板105を板106に固定してそれらの間に
空洞を創出す。スペーサー98及び99のための代表的材料
はナイロン或いはDelrin（商標）片である。ゲルを次い
で空洞内に注ぎ、櫛を頂部に置き、ゲルを固化させる。
櫛102を次いで取除き、一連のウェルをゲルの頂部に残
す。試料は次いで直接にウェル内に注入することができ
る。試料は適当にウェルの壁により分離されており、
又、核酸係数がゲル内において極めて低いので第2A図は
図示されるようなレーン110及び108などの良く規定され
たレーンが各ウェルに対して１レーンずつ電気泳動に際
して現われる。７個のレーンのみしか示されていないが
好ましい対応においては10インチ幅のゲルに対して16個
が典型的に用いられる。ウェルの深さ及び幅は共に典型
的に0.5cm〜1cmの範囲にあり、スペーサー98及び99は通
常約1cm幅である。ゲル厚みは典型的には0.5mm〜1.0mm
の範囲にあり、ゲルの好ましい高さは15.75インチであ
る。板105及び106は典型的には3.0mm〜5.0mm厚さであ
り、透明な、非−蛍光物質例えばパイレックスホウケイ
酸塩ガラスなどにより構成される。特に好ましい材料は
低蛍光、ゲルのそれ（ｎ＝1.47）に近い屈折率を有し、
高温及び熱衝撃に耐えることのできる商標TEMPAXにより
公知のSchottガラスである。（TEMPAX（商標）はSchott
Optical Compnyにより製造されている。）また、緩衝
室109内の緩衝液が電気泳動に際してゲルと連通するよ
うに板106の頂部に切欠き90がある。もう一つの好まし
い態様においては、櫛の直下のゲルの頂部2cm〜4cmは５
重量％のアクリルアミドゲルモノマーで注がれ、ゲルの
残部が８％アクリルアミドモノマーである。この組合わ
せの濃度はゲルに当初入る試料物質の速度及び量を高め
るように思われる。又、もう一つの接近手法は頂部2cm
〜4cmにおいてアガロースをアクリルアミドゲルと混合
することである。

第１図に示される如く、電気泳動装置は囲い370の棚1
17上に嵌込まれるように設計されている。この棚は電気
泳動過程に際して発生する熱を均等化し、及び発散させ
るために囲い370中に滑動して板106を熱移動板119と接
触させる。板119内のスロット123は各種染料の蛍光を引
起こすために及びその蛍光の検知を行うために光を板11
9を通して通過させる。囲い370は緩衝室101がその下に
滑動できるように棚117の上に配置された基板241を含
む。囲いの構造的一体性は電気泳動装置100が棚上に置
かれた際にその周辺に嵌合するライナー121により与え
られる。

光学検知系統200は基板241にガイドレール233を介し
て結合される移動ステージ231上に乗っている板239に結
合される。このステージはDCモーター237により駆動さ
れるスクリュー252により水平方向に前後に移動され、
このステージの位置は軸エンコーダ238により追跡され
る。光学センサー242及び244（図示せず）を用いてステ
ージの移動末端を追跡する。使用することのできる幾つ
かの異った移動ステージがあるが、その大きさ及び円滑
な操作故に特に有用なものはTHK Co.Ltd.（イリノイ
州、エルクグローブビィレッジ）から市販されているベ
アリングトラックアセンブリー部品番号RSR 5WUUであ
る。

前記の如く、蛍光を引起こす電磁放射線源はレーザー
300である。好ましい実施態様においては一つは488.0ナ
ノメーター及び一つは514.5ナノメーターにおいて二つ
の線を与える態様で操作されるアルゴンイオンレーザー
が用いられ、これらの線は共に各線に対して約7mWであ
り、全電力が20mWである等しい電力を有する。光学検知
系統200と異り、レーザー300は固定されて保持されてい
る。レーザーから出る光り250は先ず45゜鏡253上に衝突
し、次いで45゜鏡251上に衝突し、その結果それは光学
検知系統の移動の方向に対して平行となる。この様に光
学検知系統の動きは光学検知系統への入射角に影響を及
ぼさない。

光学検知系統200は入射ビームの大きさを減少させ、
光をゲルレーン上に集束するためのレンズ257及び259を
有する集束テレスコープ260により構成される。集束テ
レスコープからの光路はBrewster角度鏡255により窓125
を介してゲルの方向に進路を変えられ、窓及び鏡はステ
ージ231に対して固定されている。鏡255における入射角
度は蛍光検知を妨害する偏光したレーザー光散乱を最小
にするためにBrewster角度に選ばれた。個々のレーンは
ステージをガイドレール233に添って前後に動かすこと
によってアクセスされる。レーザー300からの光がレー
ン内の染料を照らすにつれてレーン108に示された様に
染料が蛍光を発する。集光レンズ221はこの蛍光光線の
一部を集めそれをホイールの四分円形部品として配置さ
れている四つの色フィルターにより構成されているフィ
ルターホイールに向ける。このフィルターホイールが回
転されるにつれて、フィルターの通過バンドは選択的に
蛍光光線の特別の波長を一度に一つずつレンズ225及び2
27により構成されているFabryレンズグループ226に透過
させる。

Fabryグループは集光レンズ221の焦点に位置してお
り、レーン自体をイメージ形成するよりもむしろHamama
tsuから市販されているR928などの側面光電子増倍管229
の活性領域内に集光レンズをイメージ形成するように形
成されている。一般的に、光陰極出力信号は活性領域上
の光信号の位置と共に変化する。レーンの代りに集光レ
ンズをイメージ形成することにより光電子増倍管上の光
の位置はゲル上の照射位置が変わった場合にも安定であ
る。よって、ゲル上の照射位置が何等かの理由例えば不
完全な配列により変わっても光電子増倍管出力信号にお
いてスプリアスの変化は見ない。Fabryグループのため
に一対のレンズを用いるもう一つの目的は配列誤差から
生ずる収差成分に対して更に系の感度を減らすことであ
る。集光レンズを合理的な距離内において光電子増倍管
に集束するためにFabryグループは比較的高い倍率を有
さなければならない。高い倍率を達成するために一つの
レンズを用いると像面の湾曲及び幾何学的歪みが生じ、
それらは補正されなければ活性表面上の像を照射面積が
測定に際して横方向に変化する場合に例えばそれが適当
に配列されないか或いはゲル板がしわを有するような場
合、焦点の内外に移動される。よって、二つのレンズ群
が用いられ、Fabryレンズ227は非球面であり、その結
果、像面の湾曲及び幾何学的歪みは共に除去される。よ
って、配列ミス或いはしわがある場合にも光電子増倍管
上の像は極めて安定であり大きさが変化しない。

系に用いられる特別の色フィルターは染料の選択と共
に変化する。好ましい態様においては、各染料は四つの
組の染料の別々のものから選択される。それらの染料に
対して、選ばれるフィルターは540nm,560nm,580nm及び6
10nmの公称の中心波長を有し、全て10nmの帯域のもので
ある（50％透過点において測定）。その様なフィルター
は例えばバーモント州バトルボローのOMEGA Opticalか
ら市販されている。四つの組の染料は下記の通りであ
る。組Ｉは５或いは６炭素位置のいずれかにおける結合
官能基でモノー誘導化されたフルオレッセインよりなる
（カラーインデックス付番系により測定）。組Ｉの構成
員の具体例としては フルオレッセイン−５−イソチオシアネート、 フルオレッセイン−６−イソチオシアネート（−５−及
び−６−形態は集合的にIFTCと称される）、 フルオレッセイン−５−スクシニミジカルボキシレー
ト、 フルオレッセイン−６−スクシニミジカルボキシレー
ト、 フルオレッセイン−６−スクシニミドリルカルボキシレ
ート、 フルオレッセイン−５−ヨードアセタミド、 フルオレッセイン−６−ヨードアセタミド、 フルオレッセイン−５−マレイミド、及び フルオレッセイン−６−マレイミド などが挙げられる。これらの組Ｉの構成員の具体例は例
えばMolecular Probes Inc（オレゴン州ジャンクション
市）から市販されており、例えば標準的技術を用いて合
成することができる。組IIは５或いは６炭素位置（炭素
はカラーインデックス付番系に従って確認される）にお
いて結合官能基でモノー誘導化された２′,7′−ジメト
キシ−４′,5′−ジクロロフルオレッセインより構成さ
れる。組IIの構成員は米国特許4,318,846号明細書に開
示される2,7−ジメトキシ4,5−ジクロロ−９−（２′,
4′−ジカルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−3H−
キサンテン−３−オン及び2,7−ジメトキシ−4,5−ジク
ロロ−９−（２′,5′−ジカルボキシフェニル）−６−
ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−オン（IUPAC表示）
の標準的変成により得ることができる。例えばこれらの
化合物の４′及び５′カルボキシをジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを用いてＮ−ヒドロキシスクシニミドと縮
合させて上記特許（28〜29欄）の実施例６及び８に例示
されるアミン−選択性結合官能基を形成することができ
る。カサイ等（Kasai et al.）はAnal.Chem.Vol.47、34
〜37頁（1975年）において、その様な縮合の基本的技術
を開示する。組IIの染料の具体例は２′,7′−ジメトキ
シ−４′,5′−ジクロロフルオレッセイン−５−スクシ
ニミジカルボキシレート及び２′,7′ジメトキシ−
４′,5′−ジクロロフルオレッセイン−６−スクシニミ
ジカルボキシレート（−５−及び６−形態は集合的にDD
FCSと称される）が挙げられる。組IIIは５或いは６炭素
位置のいづれかにおいて結合官能基によりモノ誘導化さ
れたテトラメチルローダミンより構成される。組IIIの
構成員の具体例としては テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、 テトラメチルローダミン−６−イソシオシアネート（−
５−及び−６−形態は集合的にTMRITCと称される）、 テトラメチルローダミン−５−ヨードアセタミド、 テトラメチルローダミン−６−ヨードアセタミド、 テトラメチルローダミン−５−スクシニミジルカルボキ
シレート、 テトラメチルローダミン−６−スクシニミジルカルボキ
シレート、 テトラメチルローダミン−５−マレイミド、及び テトラメチルローダミン−６−マレイミド などが挙げられる。これらの例示の染料は例えばMolecu
lar Probes Inc.から市販されており標準的技術を用い
て合成することができる。組IVは分子の酸素複素環に結
合した置換フェニルを有し、置換基の一つがフェニルの
４′或いは５′炭素（IUPAC付番）に結合した結合官能
基であり、２′炭素に結合した酸性アニオン基であるロ
ーダミンＸ誘導体よりなる。組IVの構成員の具体例とし
てはテキサスレッド（Molecular Probes,Inc.の商標
名）、ローダミン、Ｘ−５−イソチオシアネート、ロー
ダミンＸ−６−イソチオシアネート、ローダミンＸ−５
−ヨードアセタミド、ローダミンＸ−６−ヨードアセタ
ミド、ローダミンＸ−５−スクシニミジカルボキシレー
ト、ローダミンＸ−６−スクシニミジカルボキシレー
ト、ローダミンＸ−５−マレイミド、及びローダミンＸ
−６−マレイミドが挙げられる。これらの例示染料の殆
んどは例えばMolecular Probes,Inc.から市販されてお
り、或いは標準的技術を用いて合成することが出来る。
例えばテキサスレッドの場合にはそれはチタス等（Titu
s et al.）“Texas Red,a Hydrophilic,Red−Emitting
Fluorophore for Use With Fluorescein in Dual Param
eter Flow Microfluorometric and Fluorescence Micro
scopic Studies",J.Immunological Methods,Vol.150,1
93〜204頁（1982年）に開示される方法に従って構成す
ることができる。

光学検知系を構成する光学組立物の詳細は第4A〜4C図
及び第5A〜5C図に与えられており、これらは各種レンズ
要素の相対的位置及びレンズの仕様を示しており、レン
ズの寸法は第６図の表に与えられている。

第7A〜7D図には光学検知系統200の機械的詳細が示さ
れている。ハウジング701は集束テレスコープ260及びBr
ewster角度鏡255を保持し、及び集光レンズ221及びスロ
ット125を含有する。集光レンズからの光はチューブ703
の下をホイールハウジング705内に含有されるフィルタ
ーホイール223に向けられる。Fabryグループ226は光電
子増倍管229に隣接したハウジング707内に含まれる。光
電子増倍管に対する電力供給源709は管の一端に位置し
ており、回路板711が光電子増倍管及びフィルターホイ
ールのための電子的コントロールを与える。ステッパー
モータ713を用いてプーリー715及び717上に載せられた
駆動ベルト716を介してフィルターホイールを駆動し、
プーリー715はフィルターホイールに連結された軸714を
駆動させるために用いられる。インデックスホイール71
9を用いて光学エンコーダ721を用いてフィルターホイー
ルの位置をコード化する。第7E図は光学検知系統200の
関連する機械的寸法を有する表を与える。

第８図には光学検知系統の操作をコントロールするた
めの及び必要なデータ分析を行うためのコンピュータ系
統400の概略図が示される。系400はIBMpcなどの中心コ
ンピュータ801を含み、それはそれらの381DNAシンセサ
イザー内においてApplied Biosystems（カリフォルニア
州、フォスターシティ）により用いられているZ80基本
マイクロコンピュータなどのプロセスコントロールコン
ピュータ802に連結されている。このプロセスコントロ
ールコンピュータ802は追跡或いはコントロールを必要
とする光学系統の要素と連通するためにインターフェイ
ス803に連結されている。それらの要素はステッパーモ
ーター713、フィルターホイールのためのエンコーダ72
1、光電子増倍管229からの出力、ステージ231のための
駆動モーター237、ステージ231のための軸エンコーダ23
8及び制限スイッチ242及び244を包合する。配列決定過
程の際に得られた強度情報の分析は中心コンピュータ80
1により行われる。

操作方法 先ず、被配列決定試料を発明の背景において前記した
サンガーの酵素的方法に従って調製する。緩衝室に適当
な緩衝液を充填し、電気泳動装置を滑動棚117に付加す
る。ゲルを次いで約半時間予備−電気泳動して如何なる
蛍光不純物も除去する。試料を次いでゲルの頂部のウェ
ル中に注入し、緩衝室の間に高電圧を接続して電気泳動
操作を開始する。

操作の検知部分を開始するために、レーザーを入れ、
コンピュータ801にフィルターホイールを第一のフィル
ターに指示し、及びステージ231にゲル104の16個の垂直
レーンを横切って光学検知系統を動かせる。各レーンは
ロイドスミス等により用いられた単一カラムと同様に全
ての四つの染料を用いる別々の配列決定操作に対応す
る。ステージはゲルを横切って約１秒以内に動かされる
及び192光強度測定はこの走査内に行われる。光強度の
各測定はほぼ0.8mmの距離に亘り及び0.005秒の時間に亘
ってとられた平均であり、これらの測定は以下チャンネ
ルと称される。第一の走査の終りに、コンピュータは第
二のフィルターを検知される光路における所定位置に回
転させる（約0.5秒）。ステージ231の方向を次いで反転
させ、及び光検知系統200はこの反転走査上の検知を再
開し、再び192チャンネルを測定する。この過程を次い
で第三及び第四のフィルターについて繰返す。

好ましい態様において、ゲル内の各レーンはゲルを調
製する際の櫛設計により決定されるように約4mm幅に設
計され、各レーンは約4mm隔てられている。騒音対信号
比を増大するために、特別のレーンに対応するチャンネ
ルに伴う強度データが合計される。ある特別のレーンを
通過する四つの帯域が次いでその時点におけるそのレー
ンに対する四つの色データを提供する。各６秒以内（４
フィルター×（11秒／走査＋0.5秒／フィルター変
化））の間に各レーンに対して四つの色データ点が記録
される。この四つの各データを次いで多成分分析を用い
て分析して以下に説明されるような所望配列情報を与え
ることが出来る。上記方法を図示するフローチャートは
第９図に示される。

試料DNAがレーンを下って動く速度に対比して、四つ
の色データを得るために必要とされる６秒の時間はほぼ
同時である。その結果、ゲルを下りる固定距離における
電気泳動に際して各時間単位に対して四つの波長発光ス
ペクトルが測定される。多成分分析によればこれらの四
つの波長に対するデータはレーンを下りて動く染料−標
識化DNAの四つの相対的濃度についての情報をもたら
す。ある特別の染料標識のピーク濃度は次いでDNA配列
内の特別の塩基に対応する。濃度対時間の四つのプロッ
トが重層され、及びピークが決定され、ピークとDNA塩
基との組合せが配列をもたらす。

分析的には、多成分分析は四つの未知数において四つ
の方程式を解くことに相当する。この分析の一般式は次
の通りである： （式中Aijはフィルター波長ｉにおける染料ｊの標準的
蛍光であり、及びCjは染料ｊの濃度でありFiはフィルタ
ーｉを通して測定される蛍光強度である。） 上記方程式を解くと、時間内の任意の点における独特
の濃度の組をもたらす。完全に自動化された分析のため
には、標準騒音減少及びピーク発見アルゴリズムを用い
て配列を呼出すことが出来、或いは熟練者がその濃度の
組を検査して配列に到達することができる。操作に際し
ての便宜上、これらの四つの成分の濃度はゲルが電気泳
動に際して走査されている際にコンピュータ系801上の
色モニター上に同時にプロットされる。

標準蛍光係数Cijは各染料の公知の単位濃度がゲル内
に存在する場合に一度に一つの染料ずつ各フィルターで
蛍光を測定することにより決定される。その様な測定の
ために、染料標識化したプライマーの単一バンドを用い
ることができる。一般的には、これらの計数はレーザー
波長及び強度、ゲル特性、光学フィルター及び光電子増
倍管応答の関数である。

発明の有用性 第10図及び11図はDNAポリメラーゼ、クレノウ断片を
用いてバクテリオファージM13のクローニングベクターm
P8の塩基120〜190について本発明によって行ったDNA配
列決定運転の結果を図示する。示された結果は、16のレ
ーン中の一つに対応し、他のレーンはそこで配列決定さ
れた特別の試料に対する同種の情報を与える。この運転
に対応する特別の染料はフルオレッセイン−５−イソチ
オシアネート、２′,7′−ジメトキシ−４′,5′−ジク
ロロフルオレッセイン、テトラメチルローダミン−５−
イソチオシアネート、及びテキサスレッドである。第10
図は配列決定運転に際して各塩基に対して時間の関数と
して記録された相対強度を示す。第11図は四つの異った
強度を他の頂部に一つをプロットして示すものであり、
それはピーク間の関係がより明らかとなるので配列の呼
出しを幾分より容易にする。この関係はコンピュータ80
1上で色モニターを用いた際に更に明らかでありその結
果各塩基に対する強度が異った色において一つを他の頂
部にプロットする。示された如く、殆んどの場合におい
て、呼出しは一義的ではない。しかしながら、ある種の
低い信号ピークが実際に生ずる。例えば、塩基174及び1
81参照。未知の試料において、配列におけるその様な塩
基は見過されてよい。しかしながら、ラジオグラフィに
よる配列決定においてさえも典型的であるように、当業
者はしばしば特別の選ばれた化学により引起こされたあ
いまいな塩基呼出を排除するために典型的にはその他の
配列決定酵素を用いて一回を越える配列決定運転を行
う。例えばシトシン配列は大きさにおいて大きな変化を
有することが当業者によく知られている。よって、シト
シン呼出しの結果をチェックするために、相補的鎖につ
いても又配列決定が典型的に行われる。もう一つの接近
手法は完全に異る酵素例えば逆転写酵素を用いることで
ある。

よって、本発明の自動化方法及び装置を用いて多くの
試料について同時に高速の決定的配列決定分析を提供す
ることが出来る。これは一個より多いクローンを一度に
決定することを可能にし、より大きな断片を配列決定す
るために必要とされる時間を大幅に減少させ、従ってコ
ストを減少させる。加えて、設計される如く、一度系が
構成されると、更に熟練者による配列が操作終了時にお
いて殆んど必要とされない。更にラジオグラフィ法に比
べて、実時間配列決定方法は多くの利点を有する。先
ず、配列決定が四つの別々のレーンではなく、一つのレ
ーン内において全ての四つの塩基について行われ、従っ
てレーン間の移動変化問題が回避される。第二に、放射
性物質が必要とされず、及び用いられる物質が放射性物
質よりも相当に長い貯蔵時間を有する。第三に、系が実
時間であるので、全ラジオグラフィの配列決定が終了す
るまで待って単にその運転が悪かったことを見出す代り
に運転を途中で停止して再び行うことが出来る。

当業者は本発明の範囲内の上記装置及び方法に多くの
変化があることを理解するであろう。例えば、スラブケ
ルの代りに電気泳動レーンに対して線形配列に配置され
た一連の独立のカラムを用いることが可能である。又、
全スラブのために異ったパーセントのゲルを用いること
が可能であり或いは異った大きさの断片を分離するため
のタンパク質電気泳動に用いられる堆積ゲルと同様にし
て異ったパーセントのゲルをスラブの隣接レーン内に用
いることも可能である。更に、異ったステージ及び駆動
系統並びに異った電磁放射線源を用いることも可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による電気泳動装置及び囲いを例示す
る。 第2A図は光学系統を通して水平に切断された本発明の概
略図を示す。 第2B図は光学系統を通して垂直方向に切断された本発明
の概略図である。 第3A図及び3B図は電気泳動装置におけるウェルの構成を
図示する。 第4A図は本発明による集束テレスコープを図示する。 第4B及び4C図は集束テレスコープ内に用いられるレンズ
の詳細を示す。 第5A図は本発明による集光レンズ及びFabryレンズグル
ープを図示する。 第5B,5C及び5Dは第5A図に図示されたレンズの詳細を示
す。 第６図はレンズ及び光学系の詳細な寸法を示す表であ
る。 第7A〜7D図は光学系統の機械的立体配置を四面図で図示
するものである。 第7E図は第7A〜7D図に示された機械的立体配置に対する
寸法の表である。 第８図は本発明によるコンピュータ系統の概略図であ
る。 第９図は電気泳動及び時間データから核酸配列に到達す
るためのコンピュータ論理を図示するフロチャートであ
る。 第10A〜10D図は四つの波長の各々に対して本発明の装置
によりとられた強度データのプロットである。 第11図は第10A〜10Dのプロットの重ね合わせである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウイリアム ジェイ．モーダン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94087 サニーヴェイル パイパー アベ ニュー 813 (72)発明者 ジョン ディー．ライトル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95120 サン ホセ オリーブ ブランチ レーン 1134 (72)発明者 ジョン エー．ブリッグハム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010 ヒルズボロー ブレワー ドライ ブ 635 (56)参考文献 特開 昭61−62843（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−204437（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】電気泳動系内の複数のレーンの蛍光標識さ
   れた核酸から蛍光を検知するための装置において、該複
   数のレーンが、 該蛍光を集光及び集束するための集光器具、 該集光器具から該蛍光を受取り、そして該集光器具から
   受取った該蛍光の該複数の波長を選択的に透過させるた
   めのフィルター器具、 該フィルター器具から受取った蛍光の強度を測定するた
   めの検知器具、 からなる該複数のレーンから出る複数の波長にて該蛍光
   を検知するための光学器具； 該光学器具を取付けるための、及び該レーンから一度に
   一つのレーンから蛍光を受取るように該集光器具を移動
   させるために該光学器具を該平面配列に平行で該レーン
   を横切る方向に移動させるためのステージ器具、および 該フィルター器具及び該ステージ器具をコントロールし
   て電気泳動中に該複数のレーンを横切って該ステージ器
   具が蛍光標識された核酸の電気泳動速度に関して実質的
   に同時の並進を与えるための、該検知器具から強度のデ
   ータを受取るための、及び該強度のデータを該電気泳動
   系の対応するレーンと該フィルター器具により透過され
   た対応する波長と関連付けるための、該フィルター器具
   と該ステージ器具に連結したコンピュータ器具、 を含んでなる平面配列内に配置されていることを特徴と
   する装置。
2. 【請求項２】更に発光ビームを提供し、そして該ビーム
   を該平面配列に対して平行な方向に向けるための光源を
   含んでなり、 該蛍光標識された核酸が発光するように、該光学器具が
   更に、該ステージ器具に対して固定され、該発光ビーム
   を該平面配列に平行な該方向から該平面配列に向って偏
   向させるための偏向器具、 を含んでなる特許請求の範囲第１項記載の装置。
3. 【請求項３】核酸の塩基配列を決定するための装置にお
   いて、該核酸が断片化され、そしてその断片が４つの異
   ったピークにて蛍光を発する４つの異った染料で標識化
   されており、各染料がＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシ
   ン）、Ｔ（チミジン）、或いはＣ（シトシン）の異った
   １つに終端する断片に結合している装置であって、 第一の方向に発光ビームを提供するための光源、 該第一の方向に平行な平面内に互いに平行に配置されて
   いる複数のレーンを有するように構成され、各レーンは
   該発光ビームに対して透明な物質により拘束された側面
   を有し、該複数のレーン内に同時に該核酸を電気泳動さ
   せるための電気泳動器具、及び 蛍光検知系からなり、 該蛍光検知系が 該光源からの該発光ビームを該レーンに向って該透明な
   物質上に入射する方向に偏向させるための偏向器具、 該発光ビームによる発光に応答して該レーンに生成した
   蛍光を集光するための集光器具、 該集光器具からの蛍光を受け取り、該４つの異った蛍光
   ピークから蛍光を選択的に透過させるためのフィルター
   器具、 該フィルター器具により透過された蛍光を受取り、そし
   て４つの蛍光ピークの各々における蛍光強度に相関関係
   がある信号を提供するための検知器具、 該蛍光検知系を保持し、そして該レーンの蛍光標識され
   た核酸の電気泳動速度に関して実質的に同時の速さにて
   該平面に平行な方向で該複数のレーンを横切って前後に
   移動させるためのステージ器具、 該蛍光検知系をコントロールし、そして該検知器具から
   の信号を分析して電気泳動の際に該レーンの各々を横切
   る該染料の時間順序配列を決定するためのコンピュータ
   器具、 からなることを特徴とする装置。