JPS63313035A - Ｄｎａ配列決定のための実時間走査電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 見匪■背員 本発明は電気泳動系における蛍光検知のための装置、特
に核酸の自動配列決定のためのその様な装置に関する。

ＤＮＡの構造分析は現代の分子生物学において次第に重
要な役割を果している。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）及び
彼の研究者により開発された酵素的即ちジデオキシ法（
Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｎ、
八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４．５４６３−５４６７　
（１９７７）、　　＾、Ｊ、Ｈ。

Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５．
５６０−５８０　（１９８０））及びマクサム（Ｍａｘ
ａｍ）及びギルバート（Ｇｉｌｌｂｅｒｔ）により開発
された化学的方法（Ｓ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　
Ｗ。

Ｇ１１ｌｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
　６５．　４９９−５９９（１９８０））の導入以来Ｄ
ＮＡの約４Ｘ１０ｈ個の塩基が配列決定された。典型的
には、特別の被分析ＤＮＡセグメントについて四つの別
々の反応が行われる。

酵素的方法においては、これらの反応はアデノシン（Ａ
）、シトシン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、或いはチミジ
ン（Ｔ）のいづれかで終了するＤＮＡ断片を生成する。

化学的方法においては、典型的にはＣ，Ｃ＋Ａ、Ｃ＋Ｔ
、或いはＣで終了する断片が生成される。いづれの場合
においても、四つの組の反応生成物は高−分解ポリアク
リルアミドゲルの隣接するレーン内において電気泳動さ
れる。ゲルのオートラジオグラフ像が生成され、及びオ
ートラジオダラムを調べて四つの反応の各々において発
生したＤＮＡ断片の相対的長さを決定する。ＤＮＡ配列
はその情報から直接に推論される。

これらの技術は共に極めて有効であるが、しかしそれら
は又高度に労働力がかかり比較的高価であり、且つラジ
オアイソトープの使用を含むものである。塩基当たり１
〜５ドルのコストでヒト−年当り配列決定される約３，
０００〜１０．０００塩基の値が代表的なものである。

これらの理由及び多くのＤＮＡが配列決定されるために
残っているので（ヒトゲノームのみにおいて３Ｘ１０９
個の塩基がある）、ＤＮＡ配列分析の自動化及び非−ア
イソトープ方法の開発に向けられた最近多くの活動があ
る。

より成功した試みの一つがカリフォルニア技術研究所（
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）におけるレロイフッド（Ｌｅｒ
ｏｙ　Ｈｏｏｄ）の実験室においてロイド・スミス（Ｌ
ｌｏｙｄ　Ｓｎ＋ｉｔｈ　）及び共同研究者により行わ
れた（Ｂｉｏ　／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、
　３＋１９８５年５月参照〕。その接近手法においては
、異った着色標識を有する四つの蛍光染料が放射活性標
識の代りに用いられた。各色は異ったヌクレオシドに対
応し、従って試料が電気泳動的に共分離される場合に、
配列決定に際して生成されるＤＮＡ断片の「はしご」が
各色が塩基Ａ、Ｇ、Ｃ。

或いはＴの一つに対応する蛍光多色横木に分離される。

カラムの長さが蛍光センサーにより走査されるにつれて
、着色バンドの順序が特別の遺伝子配列に対応する。ス
ミス等（Ｓｎ＋ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ）によって選択され
た特別の蛍光物質は５２０ｎｍに発光ピークを有するフ
ルオレッセインイソチオシアネー）　（Ｆ　ＩＴＣ）　
、５５０ｎｍで発光する４−クロロ−７−ニドロベンゾ
ー２−オキサ−１−ジアゾール（ＮＢＤクロライド）、
５８０ｎｍで発光するテトラメチルローダミンイソチオ
シアネート（ＴＭＲＩＴＣ）及び６１０ｎｍで発光する
テキサスレッドであった。これらの発光ピークは染料を
緑色、緑色−黄色、橙色−赤色、及び赤色にそれぞれ見
せる。

スミス等により用いられたこの特別の方法は一般的に一
本鎖ＤＮＡファージＭ１３において対象遺伝子のクロー
ニングを含むサンガーのジデオキシ（酵素的）方法の適
応であった。クローン化された遺伝子に隣接した相配列
に相補的なプライマー配列を用いて遺伝子の一部を複製
するＤＮＡ合成を開始する。カルテツク（Ｃａｔ　Ｔｅ
ｃｈ）グループにより工夫された方式においては、蛍光
標識の単一分子が各プライマーに結合される。クローン
化された遺伝子及びブライマーは次いで各々全ての四つ
のヌクレオシドを含有する四つの別々のＤＮＡ合成反応
を混合物に置かれる。少量のジデオキシ形態のヌクレオ
シド、　ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＣＴＰ、　ｄｄＧＴＰ、或
いはｄｄＴＴＰが各バッチに添加される。ジデオキシト
リホスフェートがランダムに通常のヌクレオシドを置換
し、合成反応における発達するＤＮＡ鎖中に導入される
と、発生期のＤＮＡが直ちに成長を停止する。その結果
、ｄｄＡＴＰを有するバッチにおける全ての鎖は配列に
アデノシンが現われる位置で終了する。他の三つの反応
バッチにおいても同様にＣ，Ｇ及びＴ位置における部位
−特異的停止が生ずる。

四つの塩基を区別するために、各反応混合物中において
異った蛍光標識が用いられる。それを達成するために、
Ａで終了する全てのＤＮＡコピーは緑色着色ＦＩＴＣで
標識され、Ｃで終了するものは緑色−黄色ＮＢＤクロラ
イドで標識され、Ｇで終了するものは橙色−赤色ＴＭＲ
ＩＴＣ標識で標識化され、及びＴで終了するコピーはテ
キサスレッドで標識化される。

Ｃａｌ　Ｔｅｃｈ　　自動化系においては、全ての四つ
の反応混合物からのアリコートは各種長さ断片を大きさ
により分類する単一ポリアクリルアミドチューブゲルを
通して電気泳動される。電気泳動ゲルの底部には各バン
ドをそれがゲルを移動する際に逐次照射するアルゴンイ
オンレーザ−が配置されている。レーザー光により励起
されると、蛍光物質はそれらの特性波長において発光し
、発光がセンサーにより検知され、確認される。発光色
の配列はヌクレオチド配列に転換される。

Ｃａｌ　Ｔｅｃｈ　　グループは四つのレーンを必要と
するために用いられたものを一つのレーンに持込んで配
列決定方法を自動化することが出来、且つ塩基間の易動
度の相違に関する問題を実質的に除去したが、相当な問
題がなお解決されるべく残っている。先ず、検知系統設
計が感度において最適未満である。第二に、より重要な
ことに、装置が一度に一つのカラムのみを取扱うことが
できるにすぎず、それに対してオートラジオグラフを用
いる場合にはスラブゲル上の多くのレーンが同時に配列
決定される。

必要とされるものはゲルの多くのレーン上で核酸配列決
定を同時に行うことのできる高処理量、実時間蛍光検知
装置である。更に、装置は高感度を有すべきであるが、
しかし、検知系統は熟練者による頻繁な注意を必要とす
べきではない。

光吸■概要 多くの試料について同時に拘束、最終的配列決定を提供
する実時間、自動化、核酸配列決定装置が提供される。

この装置は一度に一個より多いクローンの配列決定を可
能にしてより長い断片の配列決定に必要とされる時間を
大幅に減少させ従って、配列決定のコストを減少させる
。更に、この装置の心臓部の検知系統は高価な配列操作
を除去し、及び同時に熟練者による不断の注意の必要性
を除去するように設計されている。

その最も広義において、及び本発明の好ましい実施態様
に従えば、複数のレーンが平面配列において配置されて
いる電気泳動系における複数のレーンからの電磁放射線
を検知するための装置が提供される。この装置は複数の
レーンから発射される複数の波長における放射線を検知
するための光学系統を含む。その機能を達成するために
、この光学系統は放射線を集束させるための集光要素、
集光要素から受取った複数の波長を選択的に透過させる
ためのフィルター、及びフィルター手段から受取った放
射線の強度を測定するための検知系統から構成される。

この装置は又光学系統を載置するための及び光学系統を
集光要素を一度に一つのレーンから放射線を受取るよう
に移動させるために電気泳動レーンの平面配列に平行な
方向に動かすための移動ステージも有する。この装置は
又フィルター及びステージをコントロールするためのコ
ンピュータ系統も含む。このコンピュータ系統は又検知
器から強度データを受取り、この強度データを対応する
レーン及びフィルターにより透過された対応する波長と
実時間において相関付ける。

この装置を核酸の配列決定のために用いるために、核酸
はスミス等と同様に酵素法により調製され、標識化され
る。核酸は次いで装置内において電気泳動され、コンピ
ュータを使用して各レーンに対して強度データを時間及
び波長情報に分類して各レーンの配列に到達する。

光所■１体負脱貝 第１図及び第２Ａ図及び第２Ｂ図には本発明の好ましい
実施態様の概略図が示されており、それはポリアクリル
アミドスラブゲル１０４、強い電磁放射線源を与えるた
めのレーザー３００、レーザー光をスラブゲルに向は及
びゲル内において電気泳動される物質に結合されている
染料の蛍光を検知する光学検知計２００ををする電気泳
動装置１００により構成される。操作に際して電気泳動
袋Ｗ１００、レーザー３００、及び光学検知計は箱（図
示せず）などの光−遮断環境内に包囲されている。

電気泳動装置１００は透明な前パネル１０６及び透明な
後パネル１０５を有し、ゲル１０４がその間にはさまれ
ている。又、下部緩衝室１０１及び上部緩衝室１０９が
含まれ、それらはゲル１０４々二つの室内に含有される
緩衝液の間に連通を与えるように設計されている。これ
らの緩衝室及び板１０５及び１０６はクランプ１１３及
び１１５を有する枠１０７により相互に固定された関係
で保持されている。この電気泳動装置は又レーザー３０
０の直接の光を電気泳動装置を越えて路を横切ることを
阻止するためのビームダンプ１１１も含む。加えて、各
緩衝室はゲルを横切って電圧源を接続するための（典型
的には１０００〜１５００ボルト）バナナプラグ（１１
２及び１１４）を含む。一つの好ましい対応において、
ゲル１０４は８重量％のアルクリルアミドモノマーであ
り、よく知られた技術に従って調製される〔マニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、　　４７８頁参照〕。配列決定される試料
を電気泳動装置に導入するために、９１〜９７などの一
連のウエルが第３Ａ及び３Ｂ図に概略図示されるように
ゲルの頂部に創出される。先ず、スペーサー９８及び９
９を板１０６上においてゲル１０４の所望の厚さを規定
し、及び板１０５をＷＬｌ　０６に固定してそれらの間
に空洞を創出す。スペーサー９８及び９９のための代表
的材料はナイロン或いはＤｅｌｒｉｎ（商標）片である
。ゲルを次いで空洞内に注ぎ、櫛を頂部に置き、ゲルを
固化させる。櫛１０２を次いで取除き、一連のウェルを
ゲルの頂部に残す。

試料は次いで直接にウェル内に注入することができる。

試料は適当にウェルの壁により分離されており、又、核
酸計数のゲル内において極めて低いので第２Ａ図に図示
されるようなレーン１１０及び１０８などの良く規定さ
れたレーンが各ウェルに対してル−ンずつ電気泳動に際
して現われる。

７個のレーンのみしか示されていないが好ましい対応に
おいては１０インチ幅のゲルに対して１６個が典型的に
用いられる。ウェルの深さ及び幅は共に典型的に０．５
　Ｃ１１〜１ｃｍの範囲にあり、スペーサー９８及び９
９は通常約１ｃｍである。ゲル厚みは典型的には０．５
　＋ｎｍ〜１．Ｏｍｍの範囲にあり、ゲルの好ましい高
さは１５．７５インチである。仮１０５及び１０６は典
型的には３．０　ｔｔａ〜５．Ｏｔｎｍ厚さであり、透
明な、非−蛍光物質例えばパイレックスホウケイ酸塩ガ
ラスなどにより構成される。特に好ましい材料は低蛍光
、ゲルのそれ（ｎ・１．４７）に近い屈折率を有し、高
温及び熱衝撃に耐えることのできる商標ＴＥＭＰＡＸに
より公知の５ｃｈｏｔｔガラスである。（ＴＥＭＰＡＸ
　（商標）は５ｃｈｏｔｔ　　ＯｐｔｔｃａｌＣｏｍｐ
ａｎｙにより製造されている。）又、緩衝室１０９内の
緩衝液が電気泳動に際してゲルと連通ずるように板１０
６の頂部に切欠き９０がある。もう一つの好ましい態様
においては、櫛の直下のゲルの頂部２Ｃ１１〜４Ｃ１１
は５重量％のアクリルアミドゲルモノマーで注がれ、ゲ
ルの残部が８％アクリルアミドモノマーである。この組
合わせの濃度はゲルに当初入る試料物質の速度及び量を
高めるように思われる。又、もう一つの接近手法は頂部
２Ｃ１１１〜４１においてアガロースをアクリルアミド
ゲルと混合することである。

第１図に示される如く、電気泳動装置は囲い３７０の棚
は１１７上に嵌込まれるように設計されている。この棚
は電気泳動過程に際して発生する熱を均等化し、及び発
散させるために囲い３７０中に滑動して板１０６を熱移
動板１１９と接触させる。仮１１９内のスロット１２３
は各種染料の蛍光を引起こすために及びその蛍光の検知
を行うために光を板１１９を通して通過させる。囲い３
７０は緩衝室１０１がその下に滑動できるように棚１１
７の上に配置された基板２４１を含む。

囲いの構造的一体性は電気泳動装置１００が棚上に置か
れた際にその周辺に嵌合するライナー１２１により与え
られる。

光学検知系統２００は基板２４１にガイドレール２３３
を介して結合される移動ステージ２３１上に乗っている
板２３９に結合される。このステージはＤＣモータ−２
３７により駆動されるスクリュー２５２により水平方向
に前後に移動され、このステージの位置は軸エンコーダ
２３８により追跡される。光学センサー２４２及び２４
４（図示せず）を用いてステージの移動末端を追跡する
。

使用することのできる幾つかの異った移動ステージがあ
るが、その大きさ及び円滑な操作故に特に有用なものは
ＴＨＫ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、　（イリノイ州、エルクグロ
ーブビイレッジ）から市販されているベアリングトラッ
クアセンブリ一部品番号１？ＳＲ５ＷＵＵである。

前記の如く、蛍光を引起こす電磁放射線源はレーザー３
００である。好ましい実施態様においては一つは４８８
．０ナノメータ及び一つは５１４．５ナノメーターにお
いて二つの線を与える態様で操作されるアルゴンイオン
レーザ−が用いられ、これらの線は共に各線に対して約
７１であり、全電力が２０’ｍＷである等しい電力を有
する。光学検知系統２００と異り、レーザー３００は固
定されて保持されている。レーザーから出る光り２５０
は先ず４５°鏡２５３上に衝突し、次いで４５°鏡２５
１上に衝突し、その結果それは光学検知系統の移動の方
向に対して平行となる。この様に光学検知系統の動きは
光学検知系統への入射角に影否を及ぼさない。

光学検知系統２００は入射ビームの大きさを減少させ、
光をゲルレーン上に集束するためのレンズ２５７及び２
５９を有する集束テレスコープ２６０により構成される
。集束テレスコープからの光路はＢｒｅ匈ｓ　ｔｅｒ角
度鏡２５５により窓１２５を介してゲルの方向に進路を
変えられ、窓及び鏡はステージ２３１に対して固定され
ている。鏡２５５における入射角度は蛍光検知を妨害す
る偏向レーザー光散乱を対象にするためにＢｒｅｗｓ　
ｔｅｒ角度に選ばれた。個々のレーンはステージをガイ
ドレール２３３に添って前後に動かすことによってアク
セスされた。レーザー３００からの光がレーン内の染料
を打撃するにつれてレーン１０８に示された様に染料が
蛍光を発する。集光レンズ２２１はこの蛍光光線の一部
を集めそれをホイールの四分円形部品として配置されて
いる四つの色フィルターにより構成されているフィルタ
ーホイールに向ける。このフィルターホイールが回転さ
れるにつれて、フィルターの通過バンドは選択的に蛍光
光線の特別の波長を一度に一つずつレンズ２２５及び２
２７により構成されているｐａｂｒｙレンズグループ２
２６に透過させる。

Ｆａｂｒｙグループは集光レンズ２２１の焦点に位置し
ており、レーン自体をイメージ形成するよりもむしろＨ
ａｍａｍａ　ｔｓｕから市販されているＲ９２８などの
側面光電子増倍管２２９の活性領域内に集光レンズをメ
メージ形成するように形成されている。一般的に、光陰
種出力信号は活性領域上の光信号の位置と共に変化する
。レーンの代りに集光レンズをイメージ形成することに
より光電子増倍管上の光の位置はゲル上の照射位置が偏
向された場合にも安定である。よって、ゲル上の照射位
置が何等かの理由例えば不完全な配列により偏向されて
も光電子増倍管出力信号においてスプリアスの変化は見
ない。Ｆａｂｒｙグループのために一対のレンズを用い
るもう一つの目的は配列誤差から生ずる収差成分に対し
て更に系を不感性にすることである。集光レンズを合理
的な距離内において光電子増倍管に集束するためにＦａ
ｂｒｙグループは比較的高電力を有さなければならない
。高電力を達成するために一つのレンズを用いると場の
湾曲及び幾何学的歪みが生じ、それらは補正されなけれ
ば活性表面上の像を照射面積が測定に際して横方向に変
化する場合に例えばそれが適当に配列されないか或いは
ゲル板がしわを有するような場合、焦点の内外に移動さ
せる。よって、二つのレンズ群が用いられ、Ｆａｂｒｙ
レンズ２２７は非球面上であり、その結果、場の湾曲及
び幾何学的歪みは共に除去される。よって、配列ミス或
いはしわがある場合にも光電子増倍管上の像は極めて安
定であり大きさが変化しない。

系に用いられる特別の色フィルターは染料の選択と共に
変化する。好ましい態様においては、各染料は四つの組
の染料の別々のものから選択される。それらの染料に対
して、選ばれるフィルターは５４０ｎｍ、　　５６０ｎ
ｍ、　　５８０ｎｍ及び６１０ｒｖの呼中心波長を有し
、全て１０ｎｎ＋の帯域のものである（５０％透過率的
において測定）。その様なフィルターは例えばバーモン
ト州バドルボローのＯＭ　Ｅ　Ｇ　Ａ　　０ｐｔｉｃａ
ｌから市販されている。四つの組の染料は下記の通りで
ある。組■は５或いは６炭素位置のいずれかにおける結
合官能基でモノ−誘導化されたフルオレッセインよりな
る（カラーインデックス付番系により測定）。組Ｉの構
成員の具体例としては フルオレッセインー５−イソチオシアネート、フルオレ
ッセイン−６−イソチオシアネート（−５−及び−６−
形態は集合的にＦＩＴＣと称される）、 フルオレツヤイン−５−スクシニミジルカルボキシレー
ト、 フルオレッセイン−６−スクシニミジル力ルポキシレー
ト、 フルオレッセイン−６−スクシニミドリルカルボキシレ
ート、 フルオレツナイン−５−ヨードアセタミド、フルオレツ
ナイン−６−ヨードアセタミド、フルオレッセインー５
−マレイミド、及びフルオレッセイン−６−マレイミド などが挙げられる。これらのＭｉＩの構成員の具体例は
例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ　（
オレゴン州ジャンクシゴン市）から市販されており、例
えば標準的技術を用いて合成することができる。組■は
５或いは６炭素位置（炭素はカラーインデックス付番系
に従って確認される）において結合官能基でモノ−誘導
化された２’、７’−ジメトキシ−４’、５’　−ジク
ロロフルオレッセインより構成される。組■の構成員は
米国特許４，３１８，８４６号明細書に開示される２、
７−ジメトキシ４，５−ジクロロ−９−（２’、４’　
−ジカルボキシフェニル）−６−ヒドロキシ−３Ｈ−キ
サンチン−３−オン及び２，７−シメトキシー４．５−
ジクロロ−９−（２’　、５’　−ジカルボキシフェニ
ル）＝６−ヒドロキシ−３Ｈ−キサンチン−３−オン（
Ｉ　ＵＰＡＣ表示）の標準的変成により得ることができ
る。例えばこれらの化合物の４′及び５′カルボキシを
ジシクロへキシルカルボジイミドを用いてＮ−ヒドロキ
シスクシニミドと縮合させて上記特許（２８〜２９欄）
の実施例６及び８に例示されるアミン−選択性結合官能
基を形成することができる。カサイ等（Ｋａｓａｉ　ｅ
ｔ　ａｌ、）は八ｎａｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｖｏｌ、　４７．３４〜３７頁（１９７５年
）において、その様な縮合の基本的技術を開示する。

組Ｈの染料の具体例は２’、７’−ジメトキシ−４’、
５’　−ジクロロフルオレツヤイン−５−スクシニミジ
ルカルボキシレート及び２’、７’　ジメトキシ−４’
、５’−ジクロロフルオレツヤイン−６−スクシニミジ
ルカルボキシレート（−５−及び−６−形態は集合的に
ＤＤＦＣ３と称される）が挙げられる。組■は５或いは
６炭素位置のいづれかにおいて結合官能基によりモノ誘
導化されたテトラメチルローダミンより構成される。組
■の構成員の具体例としては テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、 テトラメチルローダミン−６−イツシオシアネート（−
５−及び−６−形態は集合的にＴＭＲＩＴＣと称される
）、 テトラメチルローダミン−５−ヨードアセタミド、テト
ラメチルローダミン−６−ヨードアセタミド、テトラメ
チルローダミン−５−スクシニミジルカルボキシレート
、 テトラメチルローダミン−６−スクシニミジルカルボキ
シレート、 テトラメチルローダミン−５−マレイミド、及び テトラメチルローダミン−６−マレイミドなどが挙げら
れる。これらの例示の染料は例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ
　ＰｒｏｂｅｓＩｒ＋ｃ、から市販されており標準的技
術を用いて合成子ることができる。組■は分子の酸素複
素環に結合した置換フェニルを有し、置換基の一つがフ
ェニルの４′或いは５′炭素（ＩＵＰＡＣ付番）に結合
した結合官能基であり、２′炭素に結合した酸性アニオ
ン基であるローダミンＸ誘導体よりなる。組■の構成員
の具体例としてはテキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ。

の商標名）、ローダミン、Ｘ−５−イソチオシアネート
、ローダミンＸ−６−インチオシアネート、ローダミン
Ｘ−５−ヨードアセタミド、ローダミンＸ−６−ヨード
アセタミド、ローダミンＸ−５−スクシニミジルカルボ
キシレート、ローダミンＸ−６−スクシニミジルカルボ
キシレート、ローダミンＸ−５−マレイミド、及びロー
ダミンＸ−６−マレイミドが挙げられる。これらの例示
染料の殆んどは例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ
ｓ、　Ｉｎｃ、から市販されており、或いは標準的技術
を用いて合成することが出来る。例えばテキサスレッド
の場合にはそれはチタス等（Ｔｔｔｕｓ　ｅｔ　ａｌ、
）　　”Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ＋ａ　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌ
ｉｃ、Ｒｅｄ−Ｅｏ＋ｉｔｔｉｎｇＦｌｕｏｒｏｐｈｏ
ｒｅ　ｆｏｒＵｓｅ　Ｗｉｔｈ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ
ｎ　ｉｎ　Ｄｕａｌ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ＦｌｏｗＭ
ｉｃｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎｄ　Ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　　５ｔｕ
ｄｉｅｓ　”　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌ。

１５０．１９３〜２０４頁（１９８２年）に開示される
方法に従って構成することができる。

光学検知系を構成する光学組立物の詳細は第４Ａに４Ｃ
図及び第５Ａ〜５０図に与えられており、これらは各種
レンズ要素の相対的位置及びレンズの仕様を示している
。レンズの寸法は第６図の表に与えられている。

第７Ａ〜７Ｄ図には光学検知系統２００の機械的詳細が
示されている。ハウジング７０１は集束テレスコープ２
６０及びＢｒｅｉｎｓ　ｔｅｒ角度鏡２５５を保持し、
及び集光レンズ２２１及びスロット１２５を含有する。

集光レンズからの光はチューブ７０３の下をホイールハ
ウジング７０５内に含有されるフィルターホイール２２
３に向けられる。Ｆａｂｒｙグループ２２６は光電子増
倍管２２９に隣接したハウジング７０７内に含まれる。

光電子増倍管に対する電力供給源７０９は管の一端に位
置しており、回路板７１１が光電子増倍管及びフィルタ
ーホイールのための電子的コントロールを与える。

ステッパーモーター７１３を用いてプーリー７１５及び
７１７上に載せられた駆動ベルト７１６を介してフィル
ターホイールを駆動し、プーリー７１５はフィルターホ
イールに連結された軸７１４を駆動させるために用いら
れる。インデックスホイール７１９を用いて光学エンコ
ーダ７２１を用いてフィルターホイールの位置をコード
化する。第７Ｅ図は光学検知系統２００の関連する機械
的寸法を有する表を与える。

第８図には光学検知系統の操作をコントロールするため
の及び必要なデータ分析を行うためのコンピュータ系統
４００の概略図が示される。系４００はＩＢＭｐｃなど
の中心コンピュータ８０１を含み、それはそれらの３８
１　ＤＮＡシンセサイザー内においてＡｐｐ−１ｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（カリフォルニア州、フォス
ターシティ）により用いられている２８０基本マイクロ
コンピュータなどのプロセスコントロールコンピュータ
８０２に連結されている。このプロセスコントロールコ
ンピュータ８０２は追跡或いはコントロールを必要とす
る光学系統の要素と連通ずるためにインターフェイス８
０３に連結されている。それらの要素はステラッパーモ
ーター７１３、フィルターホイールのためのエンコーダ
７２１、光電子増倍管２２９からの出力、ステージ２３
１のための駆動モーター２３７、ステージ２３１のため
の軸エンコーダ２３８及び制限スイッチ２４２及び２４
４を包合する。配列決定過程の際に得られた強度情報の
分析は中心コンピュータ８０１により行われる。

■立方法 先ず、被配列決定試料を発明の背景において前記したサ
ンガーの酵素的方法に従って調製する。

緩衝室に適当な緩衝液を充填し、電気泳動装置を滑動機
１１７に付加する。ゲルを次いで約半時間予備−電気泳
動して如何なる蛍光不純物も除去する。試料を次いでゲ
ルの頂部のウェル中に注入し、緩衝室の間に高電圧を接
続して電気泳動操作を開始する。

操作の検知部分を開始するために、レーザーを入れ、コ
ンピュータ８０１にフィルターホイールを第一のフィル
ターに指示し、及びステージ２３１にゲル１０４の１６
個の垂直レーンを横切って光学検知系統を動かせる。各
レーンはロイドスミス等により用いられた単一カラムと
同様に全ての四つの染料を用いる別々の配列決定操作に
対応する。

ステージはゲルを横切って約１秒以内に動かされる及び
１９２光強度測定はこの走査内に行われる。

光強度の各測定はほぼ０．８ｍｍの距離に亘り及びｏ、
ｏｏｓ秒の時間に亘ってとられた平均であり、これらの
測定は以下チャンネルと称される。第一の走査の終りに
、コンピュータは第二のフィルターを検知される光路に
おける所定位置に回転させる（約０．５秒）。ステージ
２３１の方向を次いで反転させ、及び光検知系統２００
はこの反転走査上の検知を再開し、再び１９２チヤンネ
ルを測定する。この過程を次いで第三及び第四のフィル
ターについて繰返す。

好ましい態様において、ゲル内の各レーンはゲルを調製
する際の櫛設計により決定されるように約４ＩＩＩＩａ
幅に設計され、各レーンは約４ｍｍ隔てられている。騒
音対信号比を増大するために、特別のレーンに対応する
チャンネルに伴う強度データが合計される。ある特別の
レーンを通過する四つの帯域が次いでその時点における
そのレーンに対する四つの色データを提供する。各６秒
以内（４フイルター×（１１秒／走査＋０．５秒／フィ
ルター変化））の間に各レーンに対して四つの色データ
点が記録される。この四つの色データを次いで多成分分
析を用いて分析して以下に説明されるような所望配列情
報を与えることが出来る。上記方法を図示するフローチ
ャートは第９図に示される。

試料ＤＮＡがレーンを下って動く速度に対比して、四つ
の色データを得るために必要とされる６秒の時間はほぼ
同時である。その結果、ゲルを下りる固定距離における
電気泳動に際して各時間単位に対して四つの波長発光ス
ペクトルが測定される。多成分分析によればこれらの四
つの波長に対するデータはレーンを下りて動く染料−標
識化ＤＮＡの四つの相対的濃度についての情報をもたら
す。ある特別の染料標識のピーク濃度は次いでＤＮＡ配
列内の特別の塩基に対応する。濃度対時間の四つのプロ
ットが重層され、及びピークが決定され、ピークとＤＮ
Ａ塩基との組合せが配列をもたらす。

分析的には、多成分分析は四つの未知数において四つの
方程式を解くことに相当する。この分析の一般式は次の
通りである： Σ　　ＡｉｊＣｊ　　−Ｆｉ　　　　　　ｉ＝１．　２
．　３゜ｊ＝１ （式中Ａｉｊはフィルター波長ｉにおける染料ｊの標準
的蛍光であり、及びＣｊ　は染料ｊの濃度でありＦｉは
フィルターｉを通して測定される蛍光強度である。） 上記方程式を解くと、時間内の任意の点における独特の
濃度の組をもたらす。完全に自動化された分析のために
は、標準騒音減少及びピーク発見アルゴリズムを用いて
配列を呼出すことが出来、或いは熟練者がその濃度の組
を検査して配列に到達することができる。操作に際して
の便宜上、これらの四つの成分の濃度をゲルが電気泳動
に際して走査されている際にコンピュータ系８０１上の
色モニター上に同時にプロットされる。

標準蛍光計数Ｃｔｊは各染料の公知の単位濃度がゲル内
に存在する場合に一度に一つの染料ずつ各フィルターで
蛍光を測定することにより決定される。その様な測定の
ために、染料標識化したプライマーの単一バンドを用い
ることができる。一般的には、これらの計数はレーザー
波長及び強度、ゲル特性、光学フィルター及び光電子増
倍管応答の関数である。

衾肌見宜里二 第１０図及び１１図はＤＮＡポリメラーゼ、フレノウ断
片を用いてバクテリオファージＭ１３のクローニングベ
クターｍｐ８の塩基１２０〜１９０について本発明によ
って行ったＤＮＡ配列決定運転の結果を図示する。示さ
れた結果は、１６のレーン中の一つに対応し、他のレー
ンはそこで配列決定された特別の試料に対する同種の情
報を与える。この運転に対応する特別の染料はフルオレ
クセイン−５−イソチオシアネート、２’、７’　−ジ
メトキシ−４’、５’　−ジクロロフルオレッセイン、
テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、及
びテキサスレッドである。第１０図は配列決定運転に際
して各塩基に対して時間の関数として記録された相対強
度を示す。第１１図は四つの異った強度を他の頂部に一
つをプロットして示すものであり、それはピーク間の関
係がより明らかとなるので配列の呼出しを幾分より容易
にする。この関係はコンピュータ８０１上で色モニター
を用いた際に更に明らかでありその結果各基基に対する
強度が異った色において一つを他の頂部にプロットされ
る。示された如く、殆んどの場合において、呼出しは一
義的ではない。しかしながら、ある種の低い信号ピーク
が実際に生ずる。

例えば、塩基１７４及び１８１参照。未知の試料におい
て、配列におけるその様な塩基は見過されてよい。しか
しながら、ラジオグラフィによる配列決定においてさえ
も典型的であるように、当業者はしばしば特別の選ばれ
た化学により引起こされたあいまいな塩基呼出を排除す
るために典型的にはその他の配列決定酵素を用いて一回
を越える配列決定運転を行う。例えばシトシン配列は大
きさにおいて大きな変化を有することが当業者によく知
られている。よって、シトシン呼出しの結集をチェック
するために、相補的銀についても又配列決定が典型的に
行われる。もう一つの接近手法は完全に異る酵素例えば
逆転写酵素を用いることである。

よって、本発明の自動化方法及び装置を用いて多くの試
料について同時に高速の決定的配列決定分析を提供する
ことが出来る。これは−個より多いクローンを一度に決
定することを可能にし、より大きな断片を配列決定する
ために必要とされる時間を大幅に減少させ、従ってコス
トを減少させる。加えて、設計される如く、−皮糸が構
成されると、更に熟練者による配列が操作終了時におい
て殆んど必要とされない。更にラジオグラフィ法に比べ
て、実時間配列決定方法は多くの利点を有する。先ず、
配列決定が四つの別々のレーンではなく、一つのレーン
内において全ての四つの塩基について行われ、従ってレ
ーン間の易動度変化問題が回避される。第二に、放射性
物質が必要とされず、及び用いられる物質が放射性物質
よりも相当に長い貯蔵時間を有する。第三に、系が実時
間であるので、全ラジオグラフィの配列決定が終了する
まで待って単にその運転が悪かったことが判明する代り
に運転を途中で停止して再び行うことが出来る。

当業者は本発明の範囲内の上記装置及び方法に多くの変
化があることを理解するであろう。例えば、スラブゲル
の代りに電気泳動レーンに対して線形配列に配置された
一連の独立のカラムを用いることが可能である。又、全
スラブのために異ったパーセントのゲルを用いることが
可能であり或いは異った大きさの断片を分離するために
タンパク質電気泳動に用いられる堆積ゲルと同様にして
異ったパーセントのゲルをスラブの隣接レーン内に用い
ることも可能である。更に、異ったステージ及び駆動系
統並びに異った電磁放射線源を用いることも可能である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による電気泳動装置及び囲いを例示する
。 第２Ａ図は光学系統を通して水平に切断された本発明の
概略図を示す。 第２Ｂ図は光学系統を通して垂直方向に切断された本発
明の概略図である。 第３Ａ図及び３Ｂ図は電気泳動装置におけるウェルの構
成を図示する。 第４Ａ図は本発明による集束テレスコープを図示する。 第４Ｂ及び４０図は集束テレスコープ内に用いられるレ
ンズの詳細を示す。 第５Ａ図は本発明による集光レンズ及びＦａｂｒｙレン
ズグループを図示する。 第５Ｂ、５Ｃ及び５Ｂ図は第５Ａ図に図示されたレンズ
の詳細を示す。 第６図はレンズ及び光学系の詳細な寸法を示す表である
。 第７Ａ〜７Ｄ図は光学系統の機械的立体配置を四面図で
図示するものである。 第７Ｅ図は第７Ａ〜７Ｄ図に示された機械的立体配置に
対する寸法の表である。 第８図は本発明によるコンピュータ系統の概略図である
。 第９図は電気泳動及び時間データから核酸配列に到達す
るためのコンピュータ論理を図示するフロチャートであ
る。 第１０Ａ〜１０Ｄ図は四つの波長の各々に対して本発明
の装置によりとられた強度データのプロットである。 第１１図は第１０Ａ〜ＩＯＤのプロットの重ね合わせで
ある。 ＦＩＧ、　３Ａ　　　　　　　　　　　　ＦＩＧ、　３
ＢＡ　＝＝　１５．５ Ｂ＝３３ ０１　：　、４５６ ０３　＝＋　、６７Ｇ Ｄ４　！　１．０３７ ０５　：２．０上、１ ０６　ｍ　２６．５　土、０５ ０７　：　１０．００十〇、・、０２ ０８　！　７．５８上、０５ Ｄ９　＋＝　８．０上、１ Ｄｌｏ　＝　１０．００　＋　Ｏ，−，０２０１１：　
１９．８土、１ ０１２　：　、３５７ ０１３冨３．９００ Ｄ１４　＋＝　、５００ ＤＩ５　ｇ　、０８Ｂ ＤＩ６　Ｋ　１．１２　　上、０１ ０１７　：０．８００÷、ｏｏｏ、　−、ｏｏｓ０１Ｂ
雪、２００土、００５ Ｄ１９　：　、６６６土、００５ Ｄ２０　：　、２００土、００５ Ｄ２１　＝　０．８００　＋　、０００．−．００５Ｄ
２２　！　６．００土、２ Ｄ２３　＝　１６．００　＋　、ＯＱ、　−，０２Ｄ２
４　＝＝　、２７０ Δｘ＝ｏ、２ｓ ｘｌ　＝３．６５６ Ｘ２　＝　ｓ、ｏｏ。 Ｘ３　：　１．７５０ Ｘ４　：　６．０００ Ｘ５　：　１．７５０ Ｘ６　：　２．９０６ Ｘ７　、３．９３７ Ｙｌ　＝・、２６０ Ｙ２：！、３７５ Ｙ３＝、８４３ Ｙ４　：　３．２５０ Ｙ５　＋＝　３．３１２ Ｙ６　！　３．８１１７ Ｙ７　ｇ４．００２ Ｙ８　：４．１２５ Ｙ９　！　４．４３７ ＹｌＧ　＝４．５００ Ｙｌｌ　　ｅ　５．２５０ Ｙｌ２　＝　６．０００ Ｙｌ３　：　６．１２５ Ｙｌ４　：　８．３１２ Ｙｌ５　：　７．０６２ Ｙｌ６　：　７．３１２ Ｙｌ７　ｍ　７．８６５ ２１　　ｍ　１．２５０ ２２　ｍ　２．０００ ２３　：　４．１２５ Ｚ４　：　３．０９３ Ｚ５　：　２．１２５ ＦＩＧ、　９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気泳動系内の複数のレーンから電磁放射線を検知
   するための装置であって、該複数のレーンが下記手段を
   含んでなる平面配列内に配置されていることを特徴とす
   る装置： 該放射線を該複数のレーンから放射される複数の波長に
   おいて検知するための光学的手段であって、 該放射線を集光及び集束するための集光手段、該集光手
   段から該放射線を受取るための及び該集光手段から受取
   った該放射線の該複数の波長を選択的に透過させるため
   のフィルター手段、該フィルター手段から受取った放射
   線の強度を測定するための検知手段を含んでなる手段；
   該光学的手段を取付けるための及び該集光手段を移動さ
   せて該レーンから一度に一つのレーンから放射線を受取
   るようにするために該光学手段を該平面配列に平行な方
   向に移動させるためのステージ手段、 該フィルター手段及び該ステージ手段をコントロールす
   るための、該検知手段から強度データを受取るための及
   び該強度データを該電気泳動系の対応するレーン及び該
   フィルター手段により透過された対応する波長と関連付
   けるためのコンピュータ手段。 ２、更に該電磁放射線を提供するための及び該放射線を
   該平面配列に対して平行な方向に向けるための源手段を
   含んでなり、 及び該光学手段が更に該ステージ手段に対して固定され
   た該放射線を該平面配列に平行な該方向から該平面配列
   に向って偏向させるための偏向手段を含んでなる 特許請求の範囲第１項記載の装置。 ３、核酸の塩基配列を決定するための装置において、該
   核酸が断片化されて及び断片が四つの異った波長におい
   て蛍光を発する四つの異った染料で標識化されており、
   各染料がＡ、Ｇ、Ｔ、或いはＣの異ったものに終了する
   断片に結合している装置であって、下記手段を含んでな
   ることを特徴とする装置： 第一の方向に電磁放射線を提供するための源手段、 複数のレーンを有するように構成され、該レーンが該第
   一の方向に対して平行な線内に配置されており、各レー
   ンは該源手段からの放射線に対して透明な物質により拘
   束された側面を有する該複数のレーン内に同時に該核酸
   を電気泳動させるための電気泳動手段、 下記手段を含んでなる放射線検知系統： 該源手段からの該放射線を該レーンの線に向って該透明
   物質上に入射する方向に偏向させるための偏向手段、 該レーンから蛍光発光した光を該源手段から放射線を受
   取ることに応答して集光するための集光手段、 各バンドが四つの染料の組の異った染料に対応している
   該集光手段から受取った放射線の四つの波長のバンドを
   一度に一つのバンドを選択的に透過させるためのフィル
   ター手段、 該フィルター手段により透過された放射線を受取るため
   の及び受取られた放射線の強度に機能的に関連した信号
   を提供するための検知手段、該放射線検知系統を保持す
   るための及び該核酸が電気泳動される際に該放射線検知
   系統を該レーンの線に平行な方向に該複数のレーンを横
   切って前後に移動させるためのステージ手段及び 放射検知系統をコントロールするための及び検知手段か
   らの信号を分析して電気泳動の際に該レーンの各々を横
   切る該染料の時間順序配列を決定するためのコンピュー
   タ手段。 ４、電気泳動装置の複数のレーンからの蛍光を検知する
   方法において、 該レーン内の蛍光染料を結合し、電気泳動により該レー
   ン内を移動する分子に電磁波放射線を照射し、 該染料の蛍光から生ずる光を電気泳動に際して該レーン
   を横切って集光レンズを移動させることにより集光し、 該集光された光を該集光レンズと共に移動する強光感受
   性装置上に集束して該集光レンズが該レーンを横切って
   移動するにつれて強度プロフィールを与え、及び 該強度プロフィールを時間で分類して該レーンの各々を
   横切る染料の時間順序配列を識別することを特徴とする
   方法。