CN105143469B - 核酸分析装置及使用其的核酸分析方法 - Google Patents

核酸分析装置及使用其的核酸分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种核酸分析装置及使用其的核酸分析方法，所述核酸分析装置不需要由研究人员那样经高度训练的操作者手动处理，使用容易，能够进行快速解析，小型且能够收容多个样品。该装置及方法的特征在于，使用多个曝光时间进行检测，且提供用于信号检测的阈值的确定程序，对微弱的信号峰是否为假信号的峰进行判别。

Description

核酸分析装置及使用其的核酸分析方法
技术领域
本发明涉及对已被标记为多种颜色的试样进行同时检测的核酸分析装置及使用其的核酸分析方法，尤其涉及对DNA、蛋白等进行检测的核酸分析装置及使用其的核酸分析方法。
背景技术
用于人、动物、植物或细菌、病毒等各种生物的快速鉴定(即核酸序列解析、或特征性基因组序列的碱基长度解析等)的分析装置包括例如使用了毛细管电泳法的AppliedBiosystems 3500遗传分析仪(Life technologies公司)等。
此外，为了便于解析，正在推进完全集成化(即，将从样品输入至结果输出集成化)的用于靶核酸分析的机器及技术的开发。
靶核酸序列分析技术能够使最终用户进行临床检查、法医学鉴定等判断。例如，多种常见的人类疾病能够基于作为靶部位的小于约1000碱基的DNA序列碱基对进行诊断，而根本不必进行完整的人基因组解析。同样，利用短链纵列重复序列分析(short tandemrepeat analysis，以下称为STR分析)而形成的20个左右的特征性基因组序列的碱基长度解析的准确测定已经逐渐用于供体的个体识别。
因此，已经逐渐能够根据目的在大学、医院的研究室、患者身边(bedside)或法医学鉴定或环境测定的现场等在各种条件下实施靶核酸分析。
但是，为了进行解析，伴随有手工操作上繁杂的样品调制、或由具备专业知识的研究人员等进行的数据解析。
因此，作为努力降低专业性、使解析更易于进行的例子，公开了如下的方法：在使用DNA测序仪的碱基序列解析中，因异质接合出现难以解释的双峰时，可高效地进行解释的方法(参照专利文献1)。其为如下方法：对于碱基序列解析时检测到双峰的色谱图，基于事先准备的设定，来实施来自父母的多态性序列解析的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2006－84471号公报
发明内容
发明要解决的课题
上述专利文献1所述的方法虽然在实施异质接合中的多态性序列解析方面有用，但是也设想在不进行序列解析而是进行多重PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链式反应)、对多种颜色(5～6种颜色)的荧光进行检测的STR分析中，以同一时机对多种颜色且彼此的峰高度的相对比例无关地检测真信号。
但是，上述文献中没有考虑拔起峰所引起的假信号的去除，虽然也考虑了由拔起峰所导致的错误解析，但留下了本来欲解析的真正的峰被去除的课题。即，产生了如果不是由具有专业知识的人进行解析则不能进行高精度解析的制约。
进而，除了上述例子以外，如下所述，还存在必须由具备专业知识的操作者进行数据解析的情况。
例如，多数情况下，STR分析使用以多个序列区域为靶标的扩增(多重PCR)进行分析。这样的分析中，通常对由生物试样提取的基因组DNA浓度加以规定，在该规定范围内实施多重PCR并进行电泳，由获得的信号反复进行解析，例如进行个人识别的分析。在这样的信号解析中，基因组DNA的量过少时，存在等位基因的峰高度的平衡被扰乱、信号在检测阈值以下等课题。
此外，试样基因组过多时，有时会产生增大了的影子带(stutter)、产生非特异性条带、不完全的非模板添加、及包含拔起峰的假象(アーティファクト)。这些现象有时与STR谱图的解释错误密切相关。
此外，在解析多个样品方面，还存在由于平行进行信号检测而必须考虑串扰的影响的课题。
(1)因此，期待一种使用容易，不需要如研究人员那样具有专业知识的人员的核酸序列解析及特征性基因组序列的碱基长度解析的机器。
例如，对于省略掉所有的手动处理的系统存在需求。效果是经过少量训练即可，例如，迫于像护士、警察等最初应对人员遭遇那样的困难环境的个人，也能够容易地操作解析系统。
除了上述降低专业性以外，对于核酸序列解析或特征性基因组序列的碱基长度解析，还谋求以下列举的改进。
(2)期待快速获得解析结果的解析系统。
对于医院等为了确定合适处置方法而需要确定感染病原体序列等临床用途而言，患者由于突发而入院后，为了在短时间内实施抗菌性及抗病毒性药物疗法的处置，需要在短时间内(例如，90分钟以内)进行解析。对于警察的紧急搜查中的个人识别而言，至获得结果为止的期望时间在使用现有技术时为数天至数周，需要缩短为足够短的时间(例如，90分钟以内)。即使这些用途之外，也需要在短时间内形成能够解析的数据。此外，快速解析可期待同时使样品处理量增加的效果。
(3)期待解析装置的小型化。
多数核酸序列解析系统需要研究所整体及相关支持。近年出现的具有高处理能力的MiSeq(illumina公司)、iontrrent PGM(Life technologies公司)、FLX(RocheDiagnosis公司)等核酸序列解析系统在设置上仅需要工作台，但为了进行解析所必须的样品调制，则需要大型解析设备。例如，序列解析、STR分析通常需要进行如下的样品调制的设备，所述样品调制为：由生物试样提取基因组DNA、浓度调整、利用核酸扩增方法进行靶部位的扩增或制备解析文库。因此，小型化对于研究所及处置场所中的使用、以及现场操作两者都是重要的。此外，对于每个样品的成本降低而言也是重要的课题。
因此、本发明的目的在于，提供使用容易，能够进行快速解析，小型且能够收容多个样品的核酸分析装置及使用其的核酸分析方法。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明的核酸分析方法的主要特征如下所述。
(1)所述方法的特征在于，具有下述工序：对包含多个DNA片段的分析样品照射光的工序，在规定的检测时间内使用摄像元件检测由分析样品被激发出的与DNA片段对应的荧光的工序，对处于摄像元件所具有的能够检测的荧光强度的范围内的、分析样品的分析中所需的荧光强度的下限值进行设定的工序，以下限值为基础取得每个DNA片段的荧光强度的工序，检测对每个DNA片段取得的荧光强度的峰、确定与该峰对应的时间信息的工序，以及，将荧光强度与时间信息的对应关系按照每个DNA片段来显示的工序；在显示中，显示具有第1荧光强度的第1峰、和包含具有比第1荧光强度弱的荧光强度的第2峰的至少一个以上的峰时，使用规定值调整下限值，将以调整后的下限值作为摄像元件所具有的下限值进行测定时的荧光强度，再设定为包含第2峰的至少一个以上的峰的荧光强度，从而对包含第2峰的至少一个以上的峰是否为假信号的峰进行判别。
此外，本发明的核酸分析装置的主要特征如下所述。
(2)所述装置的特征在于，具备：对包含多个DNA片段的分析样品照射光的光照射部，在规定的检测时间内使用摄像元件检测由分析样品被激发出的与DNA片段对应的荧光强度的检测部，保存荧光强度的下限值的存储部，所述荧光强度的下限值为处于摄像元件所具有的能够检测荧光强度的范围内的、分析样品的分析中所需的荧光强度的下限值，控制各部且进行运算处理的运算控制部，显示运算控制部的结果的显示部；在检测部中，以下限值为基础，取得每个DNA片段的荧光强度；运算控制部检测对每个DNA片段取得的荧光强度的峰，确定与该峰对应的时间信息；显示部将荧光强度和时间信息的对应关系按照每个DNA片段来显示；显示部中显示具有第1荧光强度的第1峰、和包含具有比第1荧光强度弱的荧光强度的第2峰的至少一个以上的峰时，运算控制部使用规定值调整下限值，将以调整后的下限值作为摄像元件所具有的下限值进行测定时的荧光强度，再设定为包含第2峰的至少一个以上的峰的荧光强度，从而对包含第2峰的至少一个以上的峰是否为假信号的峰进行判别。
发明的效果
根据本发明，能够提供使用容易、能够进行快速解析、小型且能够收容多个样品的核酸分析装置及使用其的核酸分析方法。
附图说明
图1为本实施例的毛细管电泳装置的概略图。
图2为本实施例中的照射系统的概略图。
图3为示出电泳分析次序的流程图。
图4为示出荧光染料的发光光谱的一个例子的图。
图5为示出STR解析次序的流程图。
图6为示出本实施例中的STR解析次序的流程图。
图7为示出本实施例中的控制用计算机的输入画面的一个例子的图。
图8为本实施例中的反应容器的概略图。
图9A为示出显示本实施例的效果的信号波形的例子的图。
图9B为示出显示本实施例的效果的信号波形的例子的图。
图9C为示出显示本实施例的效果的信号波形的例子的图。
图9D为示出显示本实施例的效果的信号波形的例子的图。
图10为示出本实施例中的报告输出画面的例子的图。
具体实施方式
以下使用附图对本发明的实施例进行说明。
《毛细管电泳装置》
图1为本实施例的毛细管电泳装置的概略图。以下参照图1对本装置的构成进行说明。
装置主体101通过通信电缆与控制用计算机125连接，操作者通过控制用计算机125对装置所具有的各功能进行控制，接收通过光学检测器112检测的数据。控制用计算机具备用于显示所接受的数据的数据显示画面(未图示)。
本实施例的毛细管电泳装置由下述部分构成：包含1根或多根毛细管102的毛细管阵列114，所述毛细管102含有用于对事先调制的解析试样进行分离的分离介质；传送机122，用于将各种解析容器传送到毛细管阴极端126；泵机构103，用于将分离介质注入毛细管；恒温槽115，用于调整毛细管阵列的温度；高压电源104，用于对分离介质施加高电压；光源111，用于对毛细管照射作为相干光的激光；以及光学检测器112，用于通过光学方式检测试样所发出的荧光。
毛细管阵列114为包含一根或多根(例如，2～96根)毛细管102的可更换构件，包含路径集管(Road Header)124、检测部113、毛细管头部。毛细管阵列114的一端具有用于将解析试样导入毛细管内的路径集管124，为用于施加负电压的阴极端。另一端则通过毛细管头部将多根毛细管捆扎成一束，通过耐压机密构造与凝胶块106连接。在路径集管124和毛细管头部之间具有被激光照射的检测部113。
毛细管阵列114可根据测定需要而置换为由不同根数、长度的毛细管构成的毛细管阵列。此外，在观察到毛细管有破损、品质劣化时，更换为新的毛细管阵列。
毛细管102是内径为数十～数百微米、外径为数百微米的玻璃管，为了提高强度，其表面可覆盖聚酰亚胺覆膜。但是，在照射激光的位置及其附近，毛细管表面的聚酰亚胺覆膜被除去。毛细管的内部填充有用于对解析试样中的DNA分子进行分离的分离介质。分离介质例如为各公司销售的电泳用聚丙烯酰胺系分离凝胶(以下称为聚合物)。
需要说明的是，本实施例中，作为分离介质的保持载体列举的是以玻璃管等为材料的毛细管的例子，但并非仅限于此。作为微流体(microfluidics)，还可以使用玻璃基板、树脂基板。
泵机构103由注射器105和用于对该注射器加压的机构系统构成。凝胶块106为将注射器105、毛细管阵列114、阳极缓冲液容器108、及聚合物容器107分别连结的连接部。当在毛细管内填充作为分离介质的聚合物时，关闭电动阀门110，通过挤压注射器105将注射器105内的聚合物注入毛细管。
恒温槽115是用于控制毛细管阵列114的温度的温度控制机构。恒温槽115为了使槽内的温度保持恒定而被绝热材料覆盖，通过加热冷却机构117控制温度。由此，使毛细管阵列的大部分的温度保持在例如60℃等恒定的温度。
传送机122具备3个电动机和线型促动器，能够沿着上下、左右、前后这3个轴方向移动。此外，传送机122的移动平台123能够承载至少1个以上的容器。传送机122将移动平台123上的缓冲液容器118、清洗容器119、废液容器120、样品容器121分别传送至毛细管的阴极端126。
光学检测部由用于对检测部113照射激发光的具有光源111的照射系统以及用于检测来自检测部113的发光的光学检测器112构成。由光学检测器112检测的数据128介由控制基板127传输至控制用计算机125。光学检测部也可以在用衍射光栅、棱镜等分光后使用作为摄像元件的CCD、CMOS等进行光学检测。或者，也可以利用多个分色镜及光电倍增管的组合进行光检测。
《照射系统》
图2示出本实施例中的照射系统的概略。图2的(a)为侧视图，图2的(b)为主视图。照射系统由发射激光201的光源111、使激光分岔的分束器203、改变激光的行进方向的反射镜202、及用于使激光在毛细管阵列的检测部113聚光的聚光透镜204构成。需要说明的是，为了简化而省略了滤光器、偏振片、波长板等光学元件。由光源111发射的激光201通过反射镜202而改变行进方向，通过分束器203而分光成2束，经由反射镜202、聚光透镜204从上方和下方照射检测部113的毛细管。通过用光学检测器112观测由检测部发出的荧光，从而检测事先处理过的样品的信号。
光源111发出用于对试样成分进行激发的激发光。作为光源111，可以适当使用液体激光器、气体激光器、半导体激光器，也可以以LED代替。例如，光源111是波长为515.5nm、输出功率为50mW的半导体激光器。激发波长取决于事先处理过的荧光，例如，也可以适当使用505nm、488nm、532nm、633nm。
进而，可以仅从毛细管序列的单侧照射激发光、改变光源的点亮时间、在光轴上准备快门，从而适当改变对毛细管阵列114的照射。例如，对于向毛细管的激发光照射，可以以50msec照射、数据传输(数据传输中不进行照射)作为一个照射条件反复进行，还可以以50msec照射、数据传输、100msec照射、数据传输作为一个照射循环条件反复进行照射。虽然与上述一个照射时间条件下获得的荧光信号数据点数相比变少，但为了也获得100msec照射的荧光信号数据，还可以扩大荧光信号的检测范围。该检测范围的扩大产生较大效果。在研究人员等进行的解析中，需要事先调整基因组DNA量、将其限制在电泳装置的检测范围内。
若通过上述所示的检测范围的扩大而不需要事先调整基因组DNA量，则不需要研究人员的操作。作为解析装置，也不再需要保有浓度调整功能，能够提供快速、小型化的廉价装置。
《电泳装置的操作次序》
首先，对电泳装置的基本操作次序进行说明。如图3所示，操作次序依次为：事前准备、电泳介质的填充303、预备电泳306、样品导入309、及电泳312。
接着，对上述事前准备进行说明。装置操作者将装入了电泳缓冲液的缓冲液容器118、毛细管清洗用的清洗容器119、用于排放毛细管中的聚合物的废液容器120、装入了成为分离介质的聚合物的聚合物容器107、及装入了被测定样品的样品容器121架设在装置上。
需要说明的是，为了简化操作者的操作，也可以使用将缓冲液容器118、清洗容器119、废液容器120、样品容器121汇总到一体型容器中而成的、图8所示那样的反应容器进行架设。
图8所示的反应容器还能够对基因组DNA进行扩增。还可以采取以下构造：在该容器底部使用橡胶等弹性体等，利用隔膜(diaphragm)的原理对各处的试剂等液体进行输送。将基因组DNA加入试样添加槽800，并使其流向收纳有核酸扩增试剂的扩增试剂槽801，所述核酸扩增试剂用于作为利用了DNA聚合酶等的核酸扩增方法的RCR反应或LAMP法、NASBA法那样的等温扩增反应。扩增方法不限于这些方法。在流入的试样进行充分混合后，使混合液流向具有温度调节功能的反应槽802，对目标核酸序列进行扩增。扩增产物流入样品容器部121。
此外，在测定开始前，使用泵机构103将聚合物填充到电泳中使用的包含毛细管在内的全部流路中。需要说明的是，在连续使用装置时，流路是被聚合物填满的，因此不需要该操作。
《电泳分析的次序》
以下参照图1、图3、图4、图8，对电泳分析的次序(步骤(1)～(14))进行说明。
(1)步骤300：首先，在分析任意的样品前，进行波长校正。
作为波长校正，用光学检测器112进行荧光信号的检测。例如，使用CCD作为光学检测器112时，指定与各荧光波长对应的元件部并对其进行检测。光学检测器112按照对被衍射光栅等分光的多个荧光染料组分别进行最灵敏地检测的方式进行设定。
作为这样的荧光染料组的例子，可以列举包含被称为6FAM、VIC、NED、PET、LIZ的荧光染料的AmpFLSTR试剂盒(Life Technologies公司)的荧光染料等。这些荧光染料的发光光谱如图4所示。如图所示，各荧光染料的发光光谱具有宽的图案。
例如，对用NED标记的样品进行检测的CCD元件，其获得的信号存在强度差异，对来自NED以外的波长的荧光的信号也进行检测。此外，NED放出的荧光也在目标元件以外的其它波长检测元件上进行检测。但是，各荧光的信号强度的比率在理论上是恒定的，因此以该值为基础进行逆变换，则纯粹地获得仅目标荧光波长的峰波形。这对于其他波长的荧光染料也同样，在荧光光谱与其它荧光光谱重叠时，可认为所检测的波形是单纯的光谱叠加。
因此，若获得多个荧光染料的信号强度比率，将其表示为行列式，将它的逆行列式描绘为起始检测到的峰波形，从而获得各荧光染料的峰波形。事先用校正样品等进行电泳，可准确地求出该信号强度比率(例如，参照日本特表2002－525576号公报、或日本特开2011－30502号公报、或日本特开2002－78500号公报)。需要说明的是，通常，伴随着劣化、长度变更而更换毛细管时，必须进行该操作(波长校正)。
(2)步骤301：本装置根据由操作者下达的、来自控制用计算机125的命令而开始分析。
(3)步骤302：首先，利用传送机122将废液容器120传送至毛细管阴极端126。
(4)步骤303：然后，利用泵机构103将聚合物注入多根毛细管阵列114(电泳介质的填充)。
(5)步骤304：完成规定量聚合物的注入后，传送机122将清洗容器119传送到毛细管阴极端126，将毛细管阴极端浸入溶液中进行清洗。
(6)步骤305：清洗毛细管后，传送机122将缓冲液容器118传送到毛细管阴极端126。
(7)步骤306：然后，进行预备电泳。预备电泳在真正的分析工序之前进行，是为了使毛细管内的聚合物呈现适合分析的状态而进行的。通常，施加数kV～数十kV左右的电压数分钟～数十分钟。
(8)步骤307：预备电泳结束后，再次用清洗容器119清洗毛细管阴极端126。
(9)步骤308：将样品容器121传送到毛细管阴极端。
(10)步骤309：然后，在对毛细管阴极施加数kV左右的电压时，在样品液和阳极电极109之间产生电场，样品液中的样品被导入毛细管内。
(11)步骤310：导入样品后，再次用清洗容器119清洗毛细管阴极端126。
(12)步骤311：将缓冲液容器118传送到毛细管阴极端126。
(13)步骤312：然后，施加规定的电压，开始电泳。
其中，电泳是指利用在阴极缓冲液和阳极缓冲液间产生的电场作用而对毛细管中的样品赋予移动度，根据由样品性质决定的移动度差异而将样品分离。样品为DNA时，根据碱基长而使移动度产生差异，从移动度快、碱基长较小的DNA开始，依次地通过检测部。由于DNA上预先连接有荧光物质，因此，从碱基长较短的DNA开始，依次地在检测部通过光学方式被检测。通常根据泳动时间最长的样品来设定测定时间及电压施加时间。
(14)步骤313：从施加电压开始经过规定时间之后，在取得数据后停止施加电压，结束分析。
以上为基本的电泳次序。
《一般的STR分析次序》
下面，参照图5说明一般的STR分析的解析次序。
(1)步骤500：通过电泳获得信号数据。
(2)步骤501：添加事先获得的、检测器112内的毛细管位置信息。
(3)步骤502：进而，添加波长校正信息300。
以下的步骤503～505相当于STR解析处理。
(4)步骤503：仅提取目标信号。由该信号算出各峰的检测时间、高度、宽度等信息(Peak检测)。
(5)步骤504：由步骤503中获得的信息、以及将已知尺寸的DNA片段与试样样品同时进行电泳的峰检测信息，进行分析试样样品的分级(Sizing)。
(6)步骤505：由进行该分级而得的信息，与解析目标等位基因(Allele)的事先信息进行匹配(Allele Calling：等位基因分型)。
(7)步骤506：算出碱基长或序列的重复次数，获得概况分析数据(Profile data)。
(8)步骤507：根据专业人士的知识及经验对该概况分析数据进行验证，并对数据进行解释。
《本申请的STR分析次序》
接着，使用图6对本发明中的使用电泳装置的STR解析次序进行说明。需要说明的是，图5中说明了常规STR解析次序，图6示出本发明的解析次序。尤其是，与图5不同的次序为图中的步骤600～602、及608～609。根据这些次序，使用更容易，无需研究人员那样具有专业知识的人士，也能够进行解析。
以下示出STR解析次序，本解析次序并非限定于STR解析，也可以适用于DNA碱基序列解析。
(1)步骤600：首先进行的是信号解析条件设定。
该步骤通过事先由装置制造商或装置管理者进行设定，从而使得概况分析数据的解释能够不经过专业人士也可快速地以例行操作形式对数据进行解释。
其中，必须特别关注的是伪峰的解释。伪峰主要是：以装置的光学系统所具有的暗电流为首的来自硬件的噪音峰、或来自此前的解析中使用的样品的遗留(carry over)峰、或检测部存在多个毛细管时极微量的泄露的串扰峰、或虽然利用波长校正进行了矩阵变换但仍少量出现的拔起峰、或由于核酸扩增方法而引起的目标外扩增物影子带等所产生的峰，这些是主要的伪峰成因。进行数据解释的专业人士会根据此前的经验来设定固定的阈值进行解析、或由获得的轮廓的图案来判断伪峰。
与此相对地，不需要专业人士解析的本实施例中，首先通过图7所示的信号解析的条件设定画面，进行用于伪峰的自动解释的条件设定。本设定由装置提供者或解析用户来进行各种设定。
图7所示的画面为进行获得的信号的阈值设定(上限阈值及下限阈值)的画面。
上限阈值可以设为检测器的检测上限、或者为了维持所得信号的定量性而设为由微弱信号在强信号中线性获得的值。
作为下限阈值中的设定项目，首先有硬件噪音、遗留污染、串扰。期望该项目由更了解装置性能的制造商来定义。装置操作者也可以以制造商推荐的值为依据基于分析条件、使用条件、环境来改变该值。
然后是关于拔起峰(Pull-Up)的设定项目。作为设定方法，可以有以下所示的两个选项。其一是对作为装置性能的、事先在使用条件下获得的拔起峰进行计测评价，并将其设定为固定值。另一选项为以相对于作为拔起的亲峰的比例形式来设定。拔起在检测时极大地依赖于在同一时刻下获得的其它波长的信号强度。根据该关连性，通过经常地相对于在同一时刻下获得的其它波长的信号(亲峰)算出某一比例并作为伪峰即拔起峰，从而排除伪峰。在有多个亲峰时，可以对每个波长分开计算。此外，也可以将该算出的值相加作为拔起峰。期望这些比例与固定值的设定同样地在事先进行评价。拔起峰取决于各装置以及检测系统、扩增试剂、利用行列式计算进行的矩阵变换，因此可以在这些因子每次发生变更时事先进行评价、变更设定值。此外，可以根据核酸序列分析、短链纵列重复序列分析等的分析方法而变更阈值。
或者，图8所示的反应容器是与扩增试剂一体化而成的，可以通过在粘贴于反应容器的条码中加入该信息，从而使装置取得依赖于试剂的比例。
事先评价是指，若能获得分析中所用的试剂中的多个荧光染料的信号强度比率，并将其表示为行列式，将它的逆行列式描绘为起始检测到的峰波形，则可获得各荧光染料的峰波形。是指事先使用校正样品等进行电泳并求出该信号强度比率。此外，也可以使用校正样品在电泳后自动地反映于拔起峰的设定项目。
接着，是关于影子带的项目。作为设定方法，可以具有以下所示的二个选项。一种方法是：基于由试剂提供企业或用户事先获得对于各等位基因峰获得的影子带所产生的信号信息(例如，相对于等位基因的峰比例)的信息，对于各等位基因获得由影子带产生的伪峰值。另一方法是设为固定值的方法。关于影子带，能够获得峰的位置是能够推测的，因此当等位基因不在附近时，也可以根据事先信息而设定不考虑影子带所产生的影响的条件。
下限阈值是以这里所设定的值的合计值作为基本下限阈值，对检测器所获得的信号进行判断。
基于通过设定上述项目而获得的阈值，可进行信号解析。
图7所示的用于解析的其它项目，有例如所显示的标签所示的“检测”。检测器所获得的信号以荧光强度和检测时间的点的信息形式而获得。为了将该点信息串起并识别出峰，设定了用于例如利用多项式近似等进行曲线拟合的各种的方法。
显示的标签所示的“品质”项目中，对曲线拟合等获得的峰的品质进行确认。根据其中设定的条件，来判断获得的峰是否为期望的峰。作为品质确认项目，对半值宽度是否超过一定宽度进行判断。超过一定值时，存在峰过宽、从而不能准确地分级的可能性。
作为显示的标签所示的“等位基因”项目的例子，对获得的等位基因峰在一个峰强度相对于另一个峰强度有一定强度时，进行是否为杂合体(Heterozygous)等的判断。作为其他设定项目，设定在等位基因附近获得的峰的个数。通常会获得1～2个峰，当出现个数在此之外的峰时，可以设定一个设定值等，用于在解析结果中明确地告知。
以上所示的项目为信号解析条件设定(600)，但并不受该项目限制。
(2)步骤601：作为之后的步骤，进行试剂信息的读取。
这里，图8示出将含有扩增试剂等的反应容器架设在装置上的情况。具体而言，本装置具备试样添加槽800、扩增试剂槽801、反应槽802及样品容器121。
图8所示的将含有扩增试剂等的反应容器架设在装置上的情况下，根据反应容器的保管期的不同，反应效率也不同。例如，保管期越长，核酸扩增中使用的DNA聚合酶的活性越降低。短期保管的容器和长期保管的容器中，即使添加相同的样品，所获得的信号的强度也不同，因此要求检测器具有更宽的动态范围。
但是，在制造反应容器时会用条码等记载试剂的制造年月日，在反应容器架设后装置读取条码等，由此，装置能够获知试剂的保管状态。将该信息、事先调查获得的试剂活性信息、检测器的动态范围信息综合考虑，来确定扩增工序中的温度调节条件。若扩增反应为PCR反应则增加或减少温度循环，若为等温扩增方法则增加或缩短反应时间。通过调整温度调节条件，从而可获得期望的信号强度，因此无需具备宽的动态范围。
(3)步骤602：然后进行电泳。
期望在电泳时适当改变激发光的照射。通过多个曝光时间而获得信号可扩大由检测器捕捉的信号强度的宽度，因此无需具备宽的动态范围的检测器，因此可实现廉价且简便的解析。或者，无需调整基因组DNA的浓度，可实现快速且简便的装置。
(4)步骤603：通过电泳获得数据。
(5)步骤604：添加事先获得的、检测器112内的毛细管位置信息。
(6)步骤605：进而，添加波长校正信息(605)。
(7)步骤606：仅提取目标信号。由该信号算出各峰的检测时间、高度、宽度等信息(Peak检测)。
(8)步骤607：由这些信息、以及已知尺寸的带荧光的DNA片段同时进行电泳的峰检测信息，进行试样样品的分级(Sizing)。
(9)步骤608：然后，对在各波长区域内获得的各颜色的信号峰的检测时间进行比较。当同一样品中存在在不同的检测波长、但相同的检测时间下被检测的峰时，基于亲峰的荧光强度和信号解析条件设定(600)中设定的值，仅对该峰改变下限阈值。
其中，使用图9A、9B、9C，以使用长、短2个曝光时间检测信号的例子进行说明。关于依赖于曝光时间的下限阈值要素，根据曝光时间的长度而变更。例如，硬件噪音依赖于曝光时间，时间越长则噪音越大、时间越短则噪音越小。在一个曝光时间下获得信号的数据如图9A所示。在添加了染料A的试样中，信号饱和(900)，存在无法解析峰的高度的数据。因此，无法算出拔起峰为何种程度，从而无法判断染料B中获得的峰(901)是因为拔起而获得的峰还是由试样获得的峰。
但是，如图9B、9C所示，通过使用长、短2个曝光时间进行检测，例如，即使信号如图9B那样饱和，也能够在短曝光时间中所检测的数据中检测峰的高度。
其中，图9B示出长曝光时间的情况，图9C示出短曝光时间的情况。
其结果是，能够获知拔起峰的影响为何种程度。若不改变下限阈值，则如图9C的902所示，将判断为是阈值以上的峰。如图9D所示，通过再次计算阈值并改变下限阈值，从而能够如903所示那样判断其是受拔起峰的影响的伪峰。
进而，如图9所示使用长、短2个曝光时间检测时，即使在例如长曝光时间下捕捉到峰、但短曝光时间下未捕捉到峰时，也可以按照上述记载的次序使用最适的阈值、并将长短2个曝光时间的数据汇总从而使能够判断的峰形成一个数据。例如，在短曝光时间下为下限阈值以下、但长曝光时间下超过下限阈值时，则采用长曝光时间的峰数据。
(10)步骤609：此外，从由步骤607中使用的已知尺寸的带荧光的DNA片段获得的荧光强度在各毛细管间的信号强度相等的观点出发，在进行使信号强度统一为某一定值的标准化时，随着该标准化，使阈值也应用标准化中所用的系数并进行再计算及再设定。
(11)步骤610：使用再计算而得到的阈值，与解析目标等位基因(Allele)的事先信息进行匹配(Allele Calling：等位基因分型)。
(12)步骤611：算出碱基长或序列的重复次数，获得概况分析数据。该获得的概况分析数据无需由专业人士等进行解释。
图6所示的流程图是一个例子、解析的顺序也可以更换。例如，可以在603获得信号后、606峰检测后实施判断拔起峰的608工序。通常，在电泳装置上进行电泳，其数据另外通过解析软件进行解析。通过以上述次序进行解析，可以在电泳装置上进行拔起峰的显示、预先考虑拔起部分的影响而从受到影响的其它颜色的荧光信号峰中减去后进行显示。
获得的数据的报告可以显示于控制用计算机、或打印。图10示出报告的一个例子。报告中记载了解析中使用的软件及其版本、试剂种类、试样类型、阈值的条件等。在图7所示的设定画面中，可以通过确认按钮等来选择是否应用各阈值，并将选择的阈值项目、值在报告中示出。报告中可以示出实际的波形数据、各等位基因的信息(重复次数等)。本发明中的阈值进行过再设定的峰可以按照下述方式来显示。如图10的染料为蓝色的波形显示所示，阈值以虚线显示，进行过再设定的位置带有“拔起峰阈值”的标识。
图10中虽然示出了作为阈值修正的原因的拔起，但也可以显示出所应用的全部阈值。还可以在控制计算机的画面上进行各阈值的添加·去除操作等阈值的变更。
如上所述，本发明具有以下效果：能够由在与事先评价过的信号特性相同的检测时间点获得的信号预估拔起峰，进而，不需要专业人士的知识、经验来进行判断，能够自动地鉴定伪峰，因此解析更加简化。
此外，通过将多个激发光照射时间和由在与事先评价过的信号特性相同的检测时间点获得的信号预估拔起峰组合，能够判断获得的峰是否为受到在其它波长下发生的饱和所引起的拔起的影响而产生的伪峰。
进而，通过对亲峰推算、算出拔起峰，从而预先预估含有拔起峰的假信号的最大值作为固定值，不必设置过大的阈值，因此具有由于预估了最大值，从而此前被排除的真正的峰也不会再被排除的效果。换言之，通过扩大下限的检测区域，还具有例如不需要样品浓度调整功能、制成快速且小型化的装置的效果。
符号的说明
101：装置主体、
102：毛细管、
103：泵机构、
104：高压电源、
105：注射器、
106：凝胶块、
107：聚合物容器、
108：阳极缓冲液容器、
109：阳极电极、
110：电动阀门、
111：光源、
112：光学检测器、
113：检测部、
114：多根毛细管阵列、
115：恒温槽、
116：风扇、
117：加热冷却机构、
118：缓冲液容器、
119：清洗容器、
120：废液容器、
121：样品容器、
122：传送机、
123：移动平台、
124：路径集管、
125：控制用计算机、
126：毛细管阴极端、
127：控制基板、
128：检测数据、
201：激光、
202：反射镜、
203：分束器、
204：聚光透镜。

Claims (12)

1.一种非诊断、治疗目的的核酸分析方法，其特征在于，具有下述工序：
对包含多个DNA片段的分析样品照射光的工序，
在规定的检测时间内使用摄像元件检测由所述分析样品被激发出的与所述DNA片段对应的荧光的工序，
对处于所述摄像元件所具有的能够检测的荧光强度的范围内的、所述分析样品的分析中所需的荧光强度的下限值进行设定的工序，
以所述下限值为基础取得每个所述DNA片段的荧光强度的工序，
对每个所述DNA片段取得的荧光强度的峰进行检测、并确定与该峰对应的时间信息的工序，以及，
对每个所述DNA片段显示所述荧光强度与时间信息的对应关系的工序；
在所述显示中显示具有第1荧光强度的第1峰和包含具有比所述第1荧光强度弱的荧光强度的第2峰的至少一个以上的峰时，
使用规定值调整所述下限值，将以调整后的所述下限值作为所述摄像元件所具有的下限值进行测定时的荧光强度，作为包含所述第2峰的至少一个以上的峰的荧光强度进行再设定，从而对包含所述第2峰的至少一个以上的峰是否为假信号的峰进行判别，
所述规定值为基于用于所述分析样品的分析的装置性能、及该装置的使用条件预先设定的固定值。
2.一种非诊断、治疗目的的核酸分析方法，其特征在于，具有下述工序：
对包含多个DNA片段的分析样品照射光的工序，
在规定的检测时间内使用摄像元件检测由所述分析样品被激发出的与所述DNA片段对应的荧光的工序，
对处于所述摄像元件所具有的能够检测的荧光强度的范围内的、所述分析样品的分析中所需的荧光强度的下限值进行设定的工序，
以所述下限值为基础取得每个所述DNA片段的荧光强度的工序，
对每个所述DNA片段取得的荧光强度的峰进行检测、并确定与该峰对应的时间信息的工序，以及，
对每个所述DNA片段显示所述荧光强度与时间信息的对应关系的工序；
在所述显示中显示具有第1荧光强度的第1峰和包含具有比所述第1荧光强度弱的荧光强度的第2峰的至少一个以上的峰时，
使用规定值调整所述下限值，将以调整后的所述下限值作为所述摄像元件所具有的下限值进行测定时的荧光强度，作为包含所述第2峰的至少一个以上的峰的荧光强度进行再设定，从而对包含所述第2峰的至少一个以上的峰是否为假信号的峰进行判别，
所述规定值以所述第2峰与所述第1峰的比例来设定。
3.根据权利要求1或2所述的非诊断、治疗目的的核酸分析方法，其特征在于，所述规定值根据所述分析样品的分析方法而变更。
4.根据权利要求1或2所述的非诊断、治疗目的的核酸分析方法，其特征在于，所述规定的检测时间为至少2种彼此不同的照射时间。
5.根据权利要求1或2所述的非诊断、治疗目的的核酸分析方法，其特征在于，以报告形式来显示包含所述调整后的下限值在内的信息。
6.根据权利要求2所述的非诊断、治疗目的的核酸分析方法，其特征在于，从包含所述第2峰的至少一个以上的峰减去以所述第1峰为基准使用所述比例算出的规定值，从而求出所述调整后的峰值。
7.一种核酸分析装置，其特征在于，具备：
对包含多个DNA片段的分析样品照射光的光照射部，
在规定的检测时间内使用摄像元件检测由所述分析样品被激发出的与所述DNA片段对应的荧光强度的检测部，
保存荧光强度的下限值的存储部，所述荧光强度的下限值为处于所述摄像元件所具有的能够检测的荧光强度的范围内的、所述分析样品的分析中所需的荧光强度的下限值，
控制所述各部且进行运算处理的运算控制部，
显示所述运算控制部的结果的显示部；
在所述检测部中，以所述下限值为基础，取得每个所述DNA片段的荧光强度，
所述运算控制部对每个所述DNA片段取得的荧光强度的峰进行检测，确定与该峰对应的时间信息，
所述显示部对每个所述DNA片段显示所述荧光强度和时间信息的对应关系，
在所述显示部中显示具有第1荧光强度的第1峰和包含具有比所述第1荧光强度弱的荧光强度的第2峰的至少一个以上的峰时，
所述运算控制部使用规定值调整所述下限值，将以调整后的所述下限值作为所述摄像元件所具有的下限值进行测定时的荧光强度，作为包含所述第2峰的至少一个以上的峰的荧光强度进行再设定，从而对包含所述第2峰的至少一个以上的峰是否为假信号的峰进行判别，
所述规定值为基于用于所述分析样品的分析的装置性能、及该装置的使用条件预先设定的固定值。
8.一种核酸分析装置，其特征在于，具备：
对包含多个DNA片段的分析样品照射光的光照射部，
在规定的检测时间内使用摄像元件检测由所述分析样品被激发出的与所述DNA片段对应的荧光强度的检测部，
保存荧光强度的下限值的存储部，所述荧光强度的下限值为处于所述摄像元件所具有的能够检测的荧光强度的范围内的、所述分析样品的分析中所需的荧光强度的下限值，
控制所述各部且进行运算处理的运算控制部，
显示所述运算控制部的结果的显示部；
在所述检测部中，以所述下限值为基础，取得每个所述DNA片段的荧光强度，
所述运算控制部对每个所述DNA片段取得的荧光强度的峰进行检测，确定与该峰对应的时间信息，
所述显示部对每个所述DNA片段显示所述荧光强度和时间信息的对应关系，
在所述显示部中显示具有第1荧光强度的第1峰和包含具有比所述第1荧光强度弱的荧光强度的第2峰的至少一个以上的峰时，
所述运算控制部使用规定值调整所述下限值，将以调整后的所述下限值作为所述摄像元件所具有的下限值进行测定时的荧光强度，作为包含所述第2峰的至少一个以上的峰的荧光强度进行再设定，从而对包含所述第2峰的至少一个以上的峰是否为假信号的峰进行判别，
所述规定值以所述第2峰与所述第1峰的比例来设定。
9.根据权利要求7或8所述的核酸分析装置，其特征在于，所述规定值根据所述分析样品的分析方法而变更。
10.根据权利要求7或8所述的核酸分析装置，其特征在于，所述规定的检测时间为至少2种彼此不同的照射时间。
11.根据权利要求7或8所述的核酸分析装置，其特征在于，在显示部以报告形式来显示包含所述调整后的下限值的信息。
12.根据权利要求8所述的核酸分析装置，其特征在于，从包含所述第2峰的至少一个以上的峰减去以所述第1峰为基准使用所述比例算出的规定值，从而求出所述调整后的峰值。
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