KR102106384B1 - 유세포 분석 산란 파형 분석을 사용하여 샘플들 사이의 기포 검출을 위한 방법 - Google Patents
유세포 분석 산란 파형 분석을 사용하여 샘플들 사이의 기포 검출을 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
유체 유동 스트림의 분리 가스를 검출하는 방법이 본원에 제공된다. 일 예시에서, 전압 출력 신호는 복수의 가스-분리된 샘플들의 유동 스트림이 유세포 측정기를 통과함에 따라 유세포 측정기의 산란 검출기에 의해 생성된다. 전압 출력 신호는 샘플링되고, 타임스탬프 및 전압 값은 분리 갭 임계 값보다 큰 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압에 대해 기록된다. 일부 실시 예들에서, 분리 갭 임계 값은 샘플들의 최대 전압 출력보다 적어도 2 배 더 크다. 이러한 방법 단계들을 수행하도록 구성된 소프트웨어를 포함하는 유세포 분석 시스템에 대해서도 설명된다.
Description
본 출원은 2016년 6월 7일자로 출원된, "유세포 분석 전방 산란 파형 분석을 이용하여 샘플들 사이의 기포 검출 방법" 명칭의, 미국 가출원 제62/346,739호의 우선권 이익을 주장하며, 그 내용은 전체가 본원에 참고로 인용된다.
고-처리량(high-throughput) 유세포 분석 시스템은 펌프 시스템을 사용하여 마이크로 플레이트(microplate)의 웰로부터 흡인되고 기포 갭들에 의해 다른 하나로부터 분리된 개별 샘플 입자 현탁액(suspensions)의 스트림으로 샘플 튜빙 라인을 채운다. 전체 샘플 스트림은 유세포 측정기로 지속적으로 전달되어 마이크로 플레이트의 모든 샘플로부터의 데이터가 습득되고 단일 데이터 파일에 저장된다. 고해상도 시간 파라미터가 데이터 습득 중에도 기록된다. 입자 검출의 시간적 갭들은 공기 갭들의 통과에 의해 데이터 스트림에 생성되어 개별 입자 현탁액이 구별되고 시간 파라미터와 함께 플롯팅될 때 별도로 평가될 수 있다. 이 시간의 분포에 기초하여, 데이터 피크들이 식별되고 마이크로 플레이트의 개별 웰들에 할당된다. 그러나, 많은 경우에, 이러한 시간의 분포는 개별 샘플 웰들을 정확하게 식별하기에 충분하지 않으며 때때로 식별 오류가 발생한다.
기포들에 의해 분리된 샘플들의 연속적인 유체 스트림에서 기포들을 검출하기 위한 방법 및 시스템이 본 명세서에 개시된다. 일 실시 예에서, 유세포 측정기의 산란 검출기의 산란 파형 출력이 기포들을 검출하는 데 사용된다.
본 발명의 일부 실시 예들은 복수의 샘플들을 포함하는 유동 스트림으로서 전압 출력 신호를, 산란 검출기로, 생성하는 것으로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 일정 기간 동안 유세포 측정기를 통과하는, 상기 산란 전압 출력 신호를 생성하고; 전압 출력 신호를 샘플링하며; 분리 갭 임계 값보다 큰 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압에 대한 타임스탬프 및 전압 값을 기록하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법들은 생성 단계 전에, 입자들을 포함하는 복수의 샘플들을 유동 스트림으로 이동시키는 단계; 유동 스트림에서 상기 샘플들을 서로 분리시키기 위해 복수의 샘플들 중 인접한 샘플들 사이에 분리 가스를 주입하는 단계로서, 유동 스트림은 가스-분리된 샘플 유동 스트림을 구성하는, 분리 가스를 주입하는 단계; 분리된 샘플들 및 분리 유체를 포함하는 유체-분리된 샘플 유동 스트림을 상기 유세포 측정기로 가이드하고 상기 유세포 측정기를 통해 가이드하는 단계; 및 가스-분리된 유동 스트림을 집중시키고 유체 유동 스트림이 유세포 측정기를 통과할 때 산란 검출기에 의해 산란된 광을 검출하기 위해 유세포 측정기를 연속적으로 동작 시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 추가의 실시 예에서, 상기 방법은 이동 시키는 단계에 앞서, 복수의 샘플 웰들을 갖는 플레이트로부터 복수의 샘플들을 획득하는 단계를 포함할 수 있고, 복수의 샘플들의 각각의 샘플은 복수의 웰들의 각각의 웰들로부터 획득된다.
본 개시의 실시 예들은 프로세서로 하여금 본원에 개시된 방법들을 수행하도록 실행 가능한 내부에 저장된 명령들을 갖는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 더 포함한다.
본 개시의 추가 실시 예들은 산란 검출기를 포함하는 유세포 측정기; 산란 검출기의 출력과 통신하는 프로세서; 및 프로세서로 하여금 본원에 개시된 방법들을 수행하도록 실행 가능한 내부에 저장된 명령들을 갖는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는 시스템을 포함한다.
도 1a는 유세포 분석 장치의 개략도이다.
도 1b는 도 1a의 유세포 분석 장치의 도관 내의 바로 인접한 샘플들의 단면 개략도이다.
도 2는 전방 산란 검출기로부터의 샘플 이벤트 파형 출력의 예시적인 플롯을 도시한다.
도 3은 전방 산란 검출기로부터의 기포 갭 파형 출력의 예시적인 플롯을 예시한다.
도 4는 프리- 플레이트 프라임 기포들의 샘플 이벤트 데이터, 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 인터-로우 쉐이크(inter-row shake)를 갖는 샘플 플레이트의 제1 열 A 및 샘플 플레이트의 열 B의 첫 두 개의 웰들의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 5는 도 4의 일부분의 확대된 도면이다.
도 6은 도 4의 일부 확대된 도면이다.
도 7은 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 완전한 96-웰 플레이트의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 8은 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 처리된 FSC-A 출력의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 9는 유세포 측정기의 측방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 처리된 SSC-A 출력의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 1b는 도 1a의 유세포 분석 장치의 도관 내의 바로 인접한 샘플들의 단면 개략도이다.
도 2는 전방 산란 검출기로부터의 샘플 이벤트 파형 출력의 예시적인 플롯을 도시한다.
도 3은 전방 산란 검출기로부터의 기포 갭 파형 출력의 예시적인 플롯을 예시한다.
도 4는 프리- 플레이트 프라임 기포들의 샘플 이벤트 데이터, 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 인터-로우 쉐이크(inter-row shake)를 갖는 샘플 플레이트의 제1 열 A 및 샘플 플레이트의 열 B의 첫 두 개의 웰들의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 5는 도 4의 일부분의 확대된 도면이다.
도 6은 도 4의 일부 확대된 도면이다.
도 7은 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 완전한 96-웰 플레이트의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 8은 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 처리된 FSC-A 출력의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
도 9는 유세포 측정기의 측방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 처리된 SSC-A 출력의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다.
문맥상 명확하게 다르게 요구하지 않는 한, 설명 및 청구 범위를 통해, 단어 "포함하다", "포함하는" 등은 배타적인 또는 포괄적인 의미와 반대되는 포괄적인 의미로 해석되어야 한다; 즉 "포함하지만 이에 국한되지 않음"의 의미로 사용된다. 단수 또는 복수의 단어를 사용하는 단어는 각각 복수 및 단수를 포함한다.
본 개시/예시들의 실시 예들에 대한 설명은 개시된 정확한 형태로 본 발명을 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 특정 실시 예들 및 본 개시에 대한 예시들이 설명의 목적으로 여기에 설명되었지만, 관련 기술 분야의 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 다양한 동등한 수정이 본 개시의 범위 내에서 가능하다.
본 발명의 임의의 양태의 모든 실시 예들은 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 본원에서 사용되는 용어 "샘플(sample)"은 입자 분석기에 의해 검출 가능한 관심 입자 또는 마커 입자를 함유할 수 있는 임의의 양의 액체를 지칭한다. 보다 구체적으로, 샘플은 본원에 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하여 검출 및/또는 분석될 관심 입자 또는 마커 입자를 함유하는 유액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 샘플에서 관심 입자는 형광 태그와 같이 태그될 수 있다. 관심 입자는 또한 비드, 수용체 또는 다른 유용한 단백질 또는 폴리펩티드(polypeptide)에 결합될 수 있으며, 또는 셀 용해물(cell lysate)에서 자연적으로 발견되는 입자, 세포 용해물로부터 정제된 입자, 조직 배양물의 입자와 같은 자유 입자로서 존재할 수 있다. 샘플은 관심 입자와 반응을 일으키는 데 사용되는 유기 또는 무기 화학 물질을 포함할 수 있다. 관심 입자가 생체 물질인 경우, 생체 물질 입자에서 반응 또는 응답을 일으키는 약물이 샘플에 첨가될 수 있다. 샘플이 샘플 소스 웰 또는 화학 물질에 있을 때 화학 물질, 약물 또는 기타 첨가제가 샘플에 첨가되어 혼합될 수 있고, 약물 또는 기타 첨가제는 샘플이 오토샘플러에 의해 흡수된 후에 유체 유동 스트림의 샘플에 첨가될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "생체 물질"은 살아 있는 또는 사체의 유기체로부터 얻어진 임의의 유기 물질을 의미한다. 용어 "생체 물질"은 또한 합성된 올리고뉴클레오타이드(synthesized oligonucleotides), 합성된 폴리 펩타이드(synthesized polypeptides) 등과 같은 합성된 생물학적 물질을 지칭한다. 합성된 생물학적 물질은 자연적으로 발생하는 생물학적 물질의 합성된 형태 일 수도 있고 예를 들어 융합 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드가 자연적으로 정상적으로 결합하지 않는 공유 결합 또는 비공유의 펩타이드에 결합된 DNA 또는 RNA와 같은 올리고뉴클레오타이드와 같은 함께 결합된 두 개의 생물학적 물질과 같은 자연적으로 발생하는 생물학적 물질의 일부분으로 만들어진 자연적으로 발생하지 않는 생물학적 형태일 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, RNA, PNA들(펩티드 핵산) 및 천연 또는 합성, 유도된 또는 유도되지 않은 핵산의 임의의 서열을 포함하는 임의의 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사 된 "펩티드(peptide)"는 펩타이드, 단백질, 폴리 펩타이드, 단백질 서열, 아미노산 서열, 변성된 단백질, 항원, 종양 유전자 및 종양 유전자의 일부를 포함하는 모든 종류의 펩티드 및 접합된 펩타이드를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "유기체"는 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등뿐만 아니라 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등으로부터 수득된 유기 물질로 제조된 세포 배양물, 복제된 올리고 뉴클레오타이드 등을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약물"은 일반적으로 약물로 간주되는 임의의 유형의 물질을 지칭한다. 약물은 개인의 중추 신경계에 작용하는 물질 일 수 있고, 예를 들어 마약 성, 환각제, 바르비투르레이트(barbiturate) 또는 향정신성 약물일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물은 질병 유발 감염 생물을 사멸 또는 불 활성화시키는 물질일 수도 있다. 또한, 약물은 특정 세포, 신체 기관 또는 기능의 활동에 영향을 미치는 물질일 수 있다. 약물은 유기 또는 무기 화학 물질, 생체 물질 등일 수 있다.
본 명세서에 사용 된 "부분 표본(aliquot)"은 유세포 측정기의 프로브를 통해 웰에서 채취된 샘플의 시프(sip)이다.
본원에 사용된 용어 "도관(conduit)"은 유체 흐름이 유동하는 튜브, 채널 등과 같은 장치를 의미한다. 도관은 다수의 연결된 또는 결합된 튜빙 조각 또는 튜빙 단일체를 단독으로 또는 채널 또는 다른 상이한 장치와 조합하여 여러 개의 개별 장치로 구성될 수 있다. 다양한 실시 예들에서, 도관은 연동 펌프가 분리 가스에 의해 분리된 샘플 또는 마커 입자의 표본을 인접 샘플이 서로 섞이지 않도록 분당 6 개 이상의 샘플 속도로 튜브를 통과하도록 움직이는 것을 허용하는 압축 특성을 가진 연동 펌프와 함께 사용될 수 있는 임의의 튜브를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "마커 입자"는 대조군 입자, 비드 또는 마이크로 비드를 포함할 수 있으며 분석될 관심 입자를 갖는 것으로 의심되는 샘플의 분액을 샘플 용기로부터 취입할 수 있는 유세포 측정기 시스템(예컨대, 미국 특허 제6,878,556호 및 제WO20010005617호에 기재된 시스템)에 의해 검출 가능한 하나 이상의 입자를 추가로 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 본원에서 사용되는 용어 "입자(particle)"는 샘플에 존재할 수 있고 유세포 분석 장치를 사용하여 검출될 수 있는 작은 대상을 지칭하며, 비 제한적인 예로서 분자, 세포, 단백질, 단백질 응집체, 핵과 같은 세포질 및 미토콘드리아, 미생물 및 바이러스를 포함한 미생물, 마이크로 스피어, 마이크로 비드 및 합성 화합물 및 화학적 응집체와 같은 합성 입자와 같은 생물학적 입자를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "샘플"은 관심 입자를 함유할 수 있는 유체 용액 또는 현탁액을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 본원에서 사용된 용어 "웰(well)"은 분석될 샘플, 마커 입자의 컨트롤 또는 부분 표본을 함유하는 임의의 구조를 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 본원에 사용된 용어 "플레이트", "마이크로 플레이트"및 "마이크로타이터 플레이트"는 분석될 샘플, 컨트롤 또는 마커 입자의 부분 표본을 포함하는 구조를 지칭한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "약"은 열거된 파라미터의 ± 5 %를 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "검출기"는 PMT들(photomultiplier tubes) 및 SPAD들(single-photon avalanche diodes)를 포함하여 산란된 빛을 검출할 수 있는 모든 검출기를 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "분리 가스"는 인접한 샘플들 사이 또는 샘플과 버퍼 유체 사이에 가스 기포 또는 비혼화성 유체를 형성하는데 사용될 수 있는 공기, 불활성 가스(inert gas) 또는 유체 등의 임의의 가스를 지칭한다. 혼합될 수 없는 유체는 샘플과 실질적으로 섞이지 않고 오염시키지 않는 유체이다.
본 발명의 목적을 위해, "인접 샘플들"이라는 용어는 기포와 같은 분리 가스에 의해서만 서로 분리되는 유체 유동 스트림 내의 두 개의 샘플들을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "유세포 측정기"는 이에 국한되지는 않지만, 미국 특허 제5,895,764; 5,824,269; 5,395,588; 4,661,913호에 개시된 유세포 측정기들을 포함하는 임의의 유세포 분석 장치를 포함하며, 그 전체 내용 및 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 유세포 측정기에서, 샘플들은 알려진 방법을 사용하여 입자 별로 입자 단위로 정렬될 수 있다.
본 발명은 유세포 측정기 검출기의 산란 파형 출력을 사용하여 기포들에 의해 분리된 샘플들의 연속적인 유체 스트림에서 기포들을 검출하는 신규한 시스템 및 방법을 기술한다.
도 1a는 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 예시적인 유세포 분석 장치(flow cytometry apparatus)(100)를 도시한다. 유세포 분석 장치(100)는 중공 프로브(hollow probe)(106)가 장착된 조정 가능한 암(adjustable arm)(101)을 갖는 종래의 자동 샘플러(autosampler)(102)를 포함한다. 암(104)이 전후(도 1a의 좌측 및 우측) 좌우(도 1a의 평면 내외로)로 움직이면서, 프로브(106)는 웰 플레이트(well plate)(110)의 개별 소스 웰들(source wells)(108) 내로 하강되어 유세포 분석 장치(100)를 사용하여 분석될 입자들(이는 형광 태그(도 1a에 도시되지 않음)로 태그될 수 있다)을 포함하는 샘플을 얻는다. 각각의 소스 웰들(108)로부터의 인-테이킹(in-taking) 샘플 물질 사이에서, 프로브(106)는 분리 유체(separation fluid)(예를 들어, 공기)의 부분 표본들(aliquots)을 섭취하도록 허용되어, 유체 흐름 스트림 내의 연속 샘플들 사이에 분리 기포(separation bubble)를 형성한다.
일단 샘플이 프로브(106)에 의해 픽업되면, 그것은 유체 흐름 스트림으로 도입되고, 연동 펌프(peristaltic pump)(112)는 자동 샘플러(102)로부터 연동 펌프(112)를 통해 유동 셀(118) 및 레이저 질의(interrogation) 장치(120)를 포함하는 유세포 측정기(flow cytometer)(116)로 연장되는 도관(conduit)(114)을 통해 샘플을 강제시킨다. 유동 셀(118)은 유체 유동 스트림을 포커싱하고 유체 우동 스트림이 유세포 측정기를 통과할 때 복수의 샘플들 각각의 입자를 분석하기 위해 연속적으로 작동될 수 있다. 레이저 질의 장치(120)는 레이저 질의 지점(122)에서 유동 셀(118)로부터 흐르는 개별 샘플들을 검사한다.
도 1b는 도관(114) 내의 분리 기포들(136, 138)에 의해 서로 분리되어 기포-분리된 유체 유동 스트림을 형성하는 일련의 샘플들(130, 132 및 134)을 나타낸다. 도 1b에서, 샘플(130)은 샘플(132)에 바로 인접하고, 샘플(132)은 샘 (134)에 바로 인접해 있다. 샘플들(130, 132 및 134)이 레이저 질의 지점(122)을 통과할 때, 샘플들 내의 입자들은 유세포 측정기(116)에 의해 감지된다. 전방 산란된 광은 전방 산란 검출기(forward scatter detector)(124)에 의해 검출된다. 유동 셀 내의 태그된 입자들로부터 방출된 형광은 형광 검출기(126)에 의해 검출된다. 측면 산란된 광은 측면 산란 검출기(128)에 의해 검출된다. 대조적으로, 기포들(136, 138)이 레이저 질의 지점(122)을 통과 할 때, 어떠한 입자도 감지되지 않는다. 따라서, 유세포 측정기를 사용하여 분석된 일련의 샘플들에 대해 시간 대 감지된 형광의 데이터 포인트들의 그래프는 구별되는 그룹들을 형성할 것이고, 각각은 입자들을 포함하는 샘플들이 레이저 질의 포인트를 통과하는 시간과 정렬된다. 이러한 그래프는 전방 산란 검출기(124), 형광 검출기(126) 및/또는 측면 산란 검출기(128) 모두의 출력에 의해 생성될 수 있다.
유세포 측정기의 출력 데이터를 분석하고 사용하는 데 있어 각 샘플이 채취된 샘플 웰을 정확하게 식별하는 것이 중요하다. 일부 고-처리량(high-throughput) 유세포 분석 시스템 방법들에서, 프로브 시프(sip) 시간(프로브가 웰에 있는 기간), 프로브 업 시간(프로브가 웰의 외부에서 잠시 멈추어 공기 중으로 당겨지는 시간의 양), 멀티웰 쉐이크(multiwell shakes) 및 린스 단계(rinse steps), 샘플링 순서뿐만 아니라 이벤트 피크들의 높이와 그 사이의 간격과 같은 파라미터를 포함하는 샘플링 프로토콜은 전체 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 대한 데이터 파일을 개별 웰 데이터로 세그먼트화 하는데 사용된다. 그러나 이러한 요소들을 사용하더라도 웰 식별 오류가 여전히 발생한다.
본 발명의 일 실시 예에서, 분리 기포 갭들(gaps)의 검출은 개개의 샘플 웰들의 정확한 식별에 사용된다. 이것은, 어떤 경우에는, 이미 사용된 파라미터에 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 분리 기포 갭들은 복수의 분리 가스 분리된 샘플들을 갖는 유동 스트림이 유세포 측정기를 일정 기간 동안 통과함에 따라, 유세포 측정기의 전방 검출기(124) 또는 측면 산란 검출기(128)와 같은 산란 검출기에 의해 생성된 전압 출력 신호를 분석함으로써 식별된다. 유동 흐름에서 각각 관심의 입자들을 포함할 것으로 예상되는 샘플들이 유세포 측정기 유동 셀을 통해 이동하는 동안, 입자에 의해 트리거되는 각 이벤트는 약 4μs와 10μs 사이의 지속 시간과 약 1.4 ~ 1.6 볼트 사이의 피크-피크 검출기 전압 출력을 갖는 상당히 일정한 산란 파형 패턴을 생성한다. 전방 산란 검출기 출력에 연결된 오실로스코프를 통해 얻어진 샘플 이벤트 파형이 도 2에 도시되어있다
유세포 측정기 유동 셀을 통과하는 샘플을 따르는 분리 기포 갭은 상당히 일정한 산란 파형 패턴을 생성한다. 파형 패턴은 도 3에 도시되어 있고, 샘플 이벤트 파형보다 약 7 내지 9 배 큰 50μs 내지 90μs 사이의 시간 지속 특성을 갖고, 샘플 이벤트 파형보다 약 3 배 큰 약 4.2 내지 4.8 볼트 사이의 피크-피크 검출기 전압 출력을 갖는다. 유동 셀을 통과함에 따라, 기포가 거울처럼 작용하여 여기(excitation) 레이저 광의 상당 부분을 전방 산란 검출기에 반사시킨다. 이러한 산란된 광의 세기는, 파형에 도시된 것과 같이, 검출기가 최대 전압을 갖는 신호를 출력하도록 한다.
이러한 파형들을 사용하여, 유세포 측정기의 일부로 통합되거나 유세포 측정기와 통신하는 프로세서는 시간 경과에 따른 전압 출력을 분석하여 다음과 같은 신호 패턴들 중 하나와 매칭시킨다: 백그라운드(background)(측정 된 이벤트 없음), 측정된 이벤트, 또는 전술한 파형들에 기초하여 측정된 기포. 그런 다음 이러한 패턴들을 사용하여 데이터 스트림의 각 소스 웰을 식별할 수 있다.
특히, 유체 유동 스트림의 분리 가스를 검출하는 방법은, (a) 복수의 샘플들을 포함하는 유동 스트림으로서 산란된 광의 세기를 나타내는 산란 전압 출력 신호를, 산란 검출기로, 생성하는 단계로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 일정 기간 동안 유세포 측정기를 통과하는, 상기 생성 단계, (b) 상기 산란 전압 출력 신호를 샘플링하는 단계, 및 (c) 분리 갭 임계 값보다 큰 산란 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압에 대한 타임스탬프 및 전압 값을 기록하는 단계를 포함한다. 일 예시에서, 복수의 샘플들 각각은 관심 있는 입자를 함유하는 것으로 의심된다. 이 방법은 또한 산란 전압 출력 신호의 각 샘플링된 전압을 분리 갭 임계 값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
작동 중에, 프로세서는 산란 검출기의 전압 출력 신호를 샘플링하고, 분리 간격 임계 값보다 큰 전압 값을 기록한다. 일부 실시 예들에서, 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압은 분리 갭 임계 값과 비교된다. 분리 갭 임계 값은, 일부 예들에서, 유세포 측정기의 유형 및 전방 산란 검출기의 전자 장치(electronics)에 의존할 수 있는 복수의 샘플들의 최대 전압 출력보다 적어도 2 배 큰 값을 갖는다. 아래에 제시된 실험 데이터와 관련하여, 전방 산란 검출기에 의해 검출될 수 있는 최대 전압은 5V이고, 3.9V의 분리 갭 임계 값이 선택되었다((800/1023) * 5V에 대응하는). 이 임계 값은 전방 산란 검출기로부터 1.6V의 최대 예상된 샘플 출력의 두 배 이상이다. 또한, 전압 출력 신호는 주파수에서 샘플링 된다. 일부 실시 예들에서, 샘플링 주파수는 5kHz 내지 500kHz 사이이다. 추가의 실시 예에서, 약 10MHz까지의 샘플링 주파수가 사용된다.
프로세서에 의해 실행되는 분석 소프트웨어 알고리즘은 연속적인 유세포 측정기 데이터 스트림으로부터 개별 마이크로플레이트 웰들을 기술하기 위해 초기 시간 상관(initial time correlation)과 기포 갭 이벤트 타이밍의 두 부분으로 구성될 수 있다. 기포-갭 이벤트 타이밍 알고리즘은, 상술한 것과 같은, 다른 웰 식별 파라미터들과 함께 사용될 수 있다.
산란 데이터가 수집되면, 임계 값을 초과하는 각 샘플링된 전압이 발생한 시간에 타임스탬프(timestamp)가 기록된다. 따라서, 유세 분석 시스템 또는 그 안에 통합되거나 그와 통신되는 프로세서에는 시계가 포함될 수 있다. 이 타임스탬프는 검출된 패턴들을 유세포 측정기로부터의 데이터 스트림과 상관시키는 데 사용된다. 유세포 분석 시스템은 또한 임계 값 위의 샘플링된 전압 값들과 타임스탬프들이 기록되는 메모리를 포함하거나 이와 통신할 수 있다.
또한, 마이크로플레이트 샘플링 실행의 시작 시, 제1 마이크로 플레이트 웰이 샘플링되기 전에, 시작 시간 교정(calibration) 시퀀스가 수행될 수 있다. 이러한 실시 예에서, 상기 방법은 또한 생성 단계 전에, 입자들을 포함하는 복수의 샘플들을 유동 스트림으로 이동시키는 단계, 상기 복수의 샘플들 중 인접한 샘플들 사이에 분리 가스를 삽입하여 상기 샘플을 상기 유동 스트림 내에서 상기 샘플들을 서로 분리시키는 단계로서, 상기 우동 스트림은 가스-분리된 샘플 유동 스트림을 구성하고, 상기 분리된 샘플들 및 상기 분리 유체를 포함하는 상기 유체-분리된 샘플 유동 스트림을 유세포 측정기로 그리고 유체포 측정기를 통해 가이드하는 단계, 및 유세포 측정기를 연속적으로 작동시켜 가스-분리된 유동 흐름을 집중시키고, 유체 유동 스트림이 유세포 측정기를 통과할 때 산란 검출기에 의해 산란된 광을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시 예에서, 상기 방법은 또한 이동 단계 전에, 복수의 샘플 웰들을 갖는 플레이트로부터 복수의 샘플들을 얻는 단계를 포함하고, 상기 복수의 샘플들의 각각의 샘플은 상기 복수의 웰들 중 각각의 웰로부터 얻어진다.
하나의 특정 실시 예에서, 세 개의 분리 기포 갭들이 도입되고, 각각은 1 초의 탈이온수(deionized water)에 의해 분리되고, 8 초의 탈 이온수가 뒤 따른다. 유세포 측정기로부터 샘플 이벤트 데이터 수집(acquisition)이 시작되면, 기포-갭 검출기 마이크로프로세서가 영(zero)의 타임스탬프로 시작된다. 이 교정 시퀀스를 사용하여, 기포 갭 검출기의 타임스탬프 출력(분리 가스 타이밍 데이터)을 유세포 측정기 샘플 이벤트 데이터 타이밍과 상관시켜 플레이트 샘플링 실행의 시작을 동기화 할 수 있다. 동작 시, 산란 검출기의 출력이 설정된 전압 임계 값을 초과할 때 인가되는, 포획된 산란 전압 신호 및 대응하는 타임 스탬프로부터 생성된 분리 가스 타이밍 데이터. 이 분리 가스 타이밍 데이터는 타이밍에 기초하여 유세포 측정기로부터의 샘플 이벤트들 데이터와 동기화된다. 분리 가스 타이밍 데이터는 웰 식별에 사용되는 샘플 이벤트들 대 시간 히스토그램으로 플롯팅된다(plotted). 따라서 기포 검출 패턴 타이밍 출력은 마이크로 기포들, 파편들(debris), 불충분한 샘플, 샘플 준비 에러 또는 캐리오버(carryover)가 시간에 따른 이벤트 카운트들(event counts)만을 사용하는 것만을 어렵게 하는 웰 기포 갭들 사이를 기술하는데 사용될 수 있다.
일 예시에서, 산란 검출기는 도 4 내지 도 8과 관련하여 이하에서 더 상세하게 설명되는 바와 같이 전방 산란 검출기를 포함한다. 또 다른 예에서, 산란 검출기는 도 9와 관련하여 이하에서 더 상세하게 설명되는 바와 같은 측면 산란 검출기를 포함한다. 산란 검출기가 전방 산란 검출기를 포함하는 실시 예에서, 상기 방법은 또한 복수의 샘플들을 포함하는 유동 스트림으로서 측면 산란된 광의 강도를 나타내는 측면 산란 전압 출력 신호를, 측면 산란 검출기로, 생성하는 단계로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 일정 기간 동안 유세포 측정기를 통과하는, 상기 생성하는 단계, 복수의 샘플들을 포함하는 유동 스트림으로서 방출된 형광의 광의 강도를 나타내는 형광 전압 출력 신호를, 형광 검출기로, 생성하는 단계로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 일정 기간 동안 유세포 측정기를 통과하는, 상기 생성하는 단계, 및 전방 산란 전압 출력 신호, 측면 산란 전압 출력 신호 및 형광 전압 출력 신호에 적어도 부분적으로 기초하여 샘플 이벤트들 데이터를 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 예시적인 기포 검출기는 기포들 및 샘플들의 전방 산란 유세포 측정기 파형들을 먼저 측정하고 두 가지 유형들의 파형들을 구별하는 방법을 결정함으로써 실험적으로 테스트되었다. 생성된 분리 가스 타이밍 데이터는 샘플 검출 데이터 히스토그램과 함께 플롯팅된 도 4 내지 도7에 예시되어있다. 유세포 측정기는 전방 산란, 측면 산란 및 형광 검출기들의 출력들을 기초로 샘플 검출 데이터를 생성한다. 웰 식별 알고리즘에 의해 식별된 웰들의 수와 샘플 플레이트의 전체 웰들의 수는 히스토그램의 상단에 표시된다. 이러한 도면들에서, 시간 히스토그램 상의 키가 큰 수직 선들은 유동 셀을 통과하는 기포들과 상관되며 짧은 수직 선들은 샘플의 이벤트들의 수와 상관된다. 분리 기포들의 검출은 도 4에 도시된 프리-플레이트 프라이밍 시퀀스(pre-plate priming sequence)의 특히 잘 볼 수 있으며, 도 4는 또한 인터-로우 쉐이크(inter-row shake)로 마이크로 플레이트를 흔들어서(shaking) 샘플들의 임의의 입자를 재 현탁 시킴으로써 뒤따르는 웰 플레이트의 제1 열 A의 샘플링으로부터의 검출기 출력을 도시하고, 열 B의 첫 번째 두 개의 웰들의 샘플링으로부터의 검출기 출력을 도시한다. 도 5는 도 4의 일부분, 특히 마이크로플레이트 쉐이킹에 의해 뒤따르는 웰 플레이트의 제1 열 A의 샘플링으로부터의 검출기 출력 및 열 B의 첫 번째 두 개의 웰들의 샘플링으로부터의 검출기 출력의 확대도이다. 도 6은 또한 도 4의 일부분, 특히 웰 플레이트의 열 A의 처음 6 개의 웰들의 샘플링으로부터의 검출기 출력의 확대도이다. 도 7은 샘플링된 완전한 96-웰 플레이트로부터의 검출기 출력의 히스토그램이다. 유세포 분석 장치를 작동시키기 위한 제어 소프트웨어는, 어떤 경우, 사용자가 예를 들어, 특정 개수의 웰들이 샘플링된 후에 수행되는 프로브 린스들의 세트 및/또는 마이크로 플레이트 쉐이킹 시퀀스를 포함할 수 있는 맞춤 샘플링 프로토콜을 프로그램 할 수 있게 한다. 예시된 실시 예에서, 96 웰 마이크로 플레이트는 각 로우(row) 이후에 마이크로 플레이트가 쉐이킹하는 상태에서 로우-바이-로우(row-by-row)로 샘플링되었다.
도 4 내지 도 7의 각각에서 문자 및 숫자로 라벨링된 게이트들은 본 발명의 방법에 의해 확인된 웰 플레이트의 각 웰에 상응한다. 기포 갭들을 검출하기 위해 전방 산란 출력을 이용하는 이 새로운 방법은 이전 방법과 비교하여 웰 식별 오류를 제한한다. 샘플링 프로토콜과 함께 사용되는 본 명세서에 기재된 전방 산란 분석은 샘플 자체의 검출과 무관하게 샘플들 사이의 기포 갭들뿐만 아니라 로우 또는 칼럼 플레이트 흔들림 및 프로프 린스(probe rinses)와 같은 샘플링 프로토콜 특징들의 정확한 식별 및 검증을 허용할 수 있다. 전방 산란 파형 분석에서, 샘플들 사이의 낮은 이벤트 카운트의 시퀀스가 아니라 검출된 기포들의 시퀀스가 샘플들을 묘사하는 데 사용된다. 이렇게 하면 예를 들어, 샘플 준비 오류, 부정확하게 분배된 샘플, 관심 입자가 거의 없는 샘플(예를 들어, 독성 분석), 샘플의 재현성 부족, 유체 샘플 튜빙의 막힘 등에 의한 샘플의 낮은 이벤트 카운트의 시퀀스가 발생할 수 있는 오류를 제거할 수 있다. 또한, 전방 산란 파형 분석은 샘플 프로브에서부터 유동 세포까지의 유체 경로의 막힘을 검출하는 데 사용될 수 있는 유동 셀의 기포 갭들의 일관성에 대한 실시간 피드백을 제공할 수 있다.
도 8은 유세포 측정기의 전방 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 처리된 FSC-A 출력의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다. 이와 같이, 도 8에 도시된 예에서, 유세포 측정기 검출기 자체(외부 장치가 아님)는 전방 산란 PMT로부터의 전압 출력을 각 이벤트에 대한 처리된 FSC-A 디지털 출력 값으로 변환한다. 분리 가스와 액체 샘플 사이의 경계는 FSC-A 값을 갖는 하나 이상의 이벤트들이 검출의 최고 한계에 있게 하며(예를 들어, 유세포 측정기가 생성한 최고 값), 도 8에 도시된 바와 같이 최상위 FSC-A 이벤트 값들 주위에 게이트들을 형성한다. 유세포 측정기는 기록된 모든 이벤트에 대한 타임스탬프도 기록한다. 이 정보로 분리 가스 타이밍 데이터는 타이밍에 따라 유세포 측정기의 샘플 이벤트 데이터와 동기화된다. 분리 가스 타이밍 데이터는 웰 식별에 사용되는 샘플 이벤트 대 시간 히스토그램으로 플롯팅 된다. 따라서, 기포 감지 패턴 타이밍 출력은 미세 기포, 부스러기, 불충분한 샘플, 샘플 준비 오류 또는 이월 캐리오버로 인해 시간이 지남에 따라 이벤트 수를 사용하는 것이 어려워지는 기포 갭들을 묘사하는데 사용될 수 있다
도 9는 유세포 측정기의 측면 산란 검출기로부터 획득된 분리 가스 타이밍 출력 데이터로 플롯팅된 유세포 측정기로부터 획득된 처리된 SSC-A 출력의 샘플 이벤트 데이터의 예시적인 히스토그램을 도시한다. 도 9에 도시된 예에서, 유세포 측정기 검출기 그 자체는(외부 장치가 아님) 측면 산란 PMT로부터의 전압 출력을 각 이벤트에 대한 처리된 SSC-A 디지털 출력 값으로 변환한다. 유세포 측정기는 기록된 모든 이벤트에 대한 타임스탬프도 기록한다. 이 정보로, 분리 가스 타이밍 데이터는 타이밍에 따라 유세포 측정기의 샘플 이벤트 데이터와 동기화된다. 분리 가스 타이밍 데이터는 웰 식별에 사용되는 샘플 이벤트 대 시간 히스토그램으로 플롯팅 된다.
다양한 양태들 및 실시 예들이 본 명세서에 개시되었지만, 다른 양태들 및 실시 예들은 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태들 및 실시 예들은 예시의 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아니며, 진정한 범위는 다음의 청구 범위에 의해 표시된다.
Claims (23)
- 유체 유동 스트림(fluid flow stream)의 분리 가스(separation gas)를 검출하는 방법은,
산란된 광(scattered light)의 강도를 복수의 샘플들을 포함하는 유동 스트림으로서 나타내는 산란 전압 출력 신호를, 산란 검출기로, 생성하는 단계로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 일정 기간 동안 유세포 측정기(flow cytometer)를 통과하는, 상기 산란 전압 출력 신호를 생성하는 단계;
상기 산란 전압 출력 신호를 샘플링하는 단계; 및
분리 갭 임계 값(separation gap threshold)보다 큰 상기 산란 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압에 대한 타임스탬프(timestamp) 및 전압 값을 기록하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 산란 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압을 상기 분리 갭 임계 값과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 분리 갭 임계 값은 상기 복수의 샘플들의 최대 전압 출력보다 적어도 2 배 큰 값을 갖는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기록하는 단계는 메모리에 저장하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 샘플들 각각은 관심 입자들(particles of interest)을 함유하는 것으로 의심되는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타임스탬프는 상기 분리 갭 임계 값보다 큰 샘플링된 전압이 발생한 시간을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플링하는 단계는 주파수에서 발생하는, 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 주파수는 5kHz 내지 500kHz인, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생성 단계 전에, 입자들을 포함하는 상기 복수의 샘플들을 상기 유동 스트림으로 이동시키는 단계;
상기 유동 스트림에서 상기 샘플들을 서로 분리시키기 위해 상기 복수의 샘플들 중 인접한 샘플들 사이에 상기 분리 가스를 주입하는 단계로서, 상기 유동 스트림은 가스-분리된 샘플 유동 스트림을 구성하는, 상기 분리 가스를 주입하는 단계;
상기 분리된 샘플들 및 상기 분리 유체를 포함하는 상기 유체-분리된 샘플 유동 스트림을 상기 유세포 측정기로 가이드하고 상기 유세포 측정기를 통해 가이드하는 단계; 및
상기 가스-분리된 유동 스트림을 집중시키고 상기 유체 유동 스트림이 상기 유세포 측정기를 통과할 때 상기 산란 검출기에 의해 산란된 광을 검출하기 위해 상기 유세포 측정기를 연속적으로 동작 시키는 단계를 더 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이동시키는 단계에 앞서, 복수의 샘플 웰들을 갖는 플레이트(plate)로부터 복수의 샘플들을 얻는 단계를 더 포함하고, 상기 복수의 샘플들의 각각의 샘플은 상기 복수의 웰들 중 각각의 웰로부터 얻어지는, 방법. - 청구항 10에 있어서,
상기 대응하는 타임 스탬프 및 상기 분리 갭 임계 값 및 보다 큰 상기 산란 전압 출력 신호의 각각의 샘플링된 전압에 대한 상기 기록된 전압 값을 포함하는 분리 가스 타이밍 데이터를 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분리 가스 타이밍 데이터에 적어도 부분적으로 기초하여 상기 복수의 샘플 웰들 중 각각의 샘플 웰을 식별하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산란 검출기는 전방 산란 검출기를 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산란 검출기는 측면 산란 검출기를 포함하는, 방법.
- 청구항 13에 있어서,
측면 산란된 광의 강도를 상기 복수의 샘플들을 포함하는 유동 스트림으로서 나타내는 측면 산란 전압 출력 신호를, 측면 산란 검출기로, 생성하는 단계로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 상기 일정 기간 동안 상기 유세포 측정기를 통과하는, 상기 측면 산란 전압 출력 신호를 생성하는 단계;
상기 복수의 샘플들을 포함하는 상기 유동 스트림으로서 방출된 형광의 광의 강도를 나타내는 형광 전압 출력 신호를, 형광 검출기로, 생성하는 단계로서, 분리 가스에 의해 분리된 각각의 샘플은 상기 일정 기간 동안 상기 유세포 측정기를 통과하는, 상기 형광 전압 출력 신호를 생성하는 단계; 및
상기 전방 산란 전압 출력 신호, 측면 산란 전압 출력 신호 및 형광 전압 출력 신호에 적어도 부분적으로 기초하여 샘플 이벤트들 데이터를 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분리 가스 타이밍 데이터와 상기 샘플 이벤트들 데이터를 적어도 부분적으로 시간에 기초하여 상관시키는 단계를 더 포함하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
상기 상관된 분리 가스 타이밍 데이터와 상기 샘플 이벤트들 데이터를 플로팅(plotting)하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 프로세서로 하여금 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 실행 가능한 내부에 저장된 명령들을 갖는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 매체.
- 시스템에 있어서,
산란 검출기를 포함하는 유세포 측정기;
상기 산란 검출기의 출력과 통신하는 프로세서; 및
상기 프로세서로 하여금 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 실행 가능한 내부에 저장된 명령들을 갖는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는, 시스템. - 청구항 19에 있어서,
복수의 각각의 소스 웰들로부터의 입자들을 포함하는 복수의 샘플들을 유체 유동 스트림 내로 삽입하기 위한 오토샘플러를 더 포함하는, 시스템. - 청구항 20 항에 있어서, 상기 유세포 측정기는 도관(conduit)을 통해 상기 오토샘플러와 통신하고, 상기 도관에 의해 상기 오토샘플러로부터 전달된 상기 유체 유동 스트림을 집중시키고 상기 유체 유동 스트림이 상기 유세포 측정기를 통과할 때 상기 복수의 샘플들 각각의 상기 입자들을 선택적으로 분석하도록 구성된, 시스템.
- 청구항 20 항에 있어서,
상기 단일 길이의 튜빙(tubing)을 따라 상기 유체 유동 스트림의 상기 복수의 샘플들을 이동시키기 위한 펌프를 더 포함하고,
상기 오토샘플러와 상기 펌프는 상기 유체 유동 스트림의 상기 샘플들 중 연속적인 샘플들 사이에 분리 유체의 표본들(aliquots)을 도입하여 상기 유체 유동 스트림을 기포-분리된 유체 유동 스트림으로 구성하도록 협력하는, 시스템 - 청구항 20 항에 있어서, 상기 산란 검출기는 전방 산란 검출기를 포함하고, 유세포 측정기는 측면 산란 검출기 및 형광 검출기를 더 포함하는, 시스템.
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