JP7318122B2 - 電気泳動装置及び分析方法 - Google Patents

Description

本開示は、電気泳動装置及び分析方法に関する。

ＤＮＡの塩基配列又は塩基長を分析する手法として、電気泳動法が広く知られている。電気泳動を用いた分析方法のひとつとしてキャピラリ電気泳動がある。キャピラリ電気泳動は、キャピラリと呼ばれる細い管にアクリルアミドなどの分離媒体を充填し、電気泳動を行う技術である。より具体的には、ＤＮＡを含む試料をキャピラリの一端に配置し、その状態でキャピラリの両端に高電圧を印加すると、負に帯電した荷電粒子であるＤＮＡは、自らの大きさ即ち塩基長に依存してキャピラリ内を陽極側に移動する。そして試料が一定距離（通常はキャピラリの試料注入端からシグナル検出部まで）を泳動するまでに要した時間を計測することにより、ＤＮＡの塩基長を分析することができる。各ＤＮＡは蛍光色素で標識されており、励起光の照射により蛍光を発する。前記蛍光は光検出器で検出される。

キャピラリ電気泳動によるＤＮＡの分析において、分析の迅速化を図る目的で複数の蛍光色素を用いることがある。複数の蛍光色素は、励起光の照射を受けてそれぞれ異なる蛍光を発する。この蛍光を分光して、光検出器上で取得したスペクトルを蛍光スペクトルと呼ぶ。各蛍光色素はそれぞれ異なる蛍光スペクトルを有しているが、それらはシャープではなく、各々の蛍光色素同士が重なりをもっている。したがって、光検出器において、異なる蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片が同程度の断片長をもつ場合は、光検出器で得られる蛍光のスペクトルは、複数種類の蛍光色素の蛍光スペクトルの線形和、すなわち重みづけ和となる。この状態から各々の蛍光色素の信号強度（蛍光強度）を求めるためには、光検出器で得られるスペクトルから、このスペクトルを構成する各蛍光色素のスペクトルの線形係数、すなわち重み値を求めればよい。

この重み値を求めるためには、各蛍光スペクトルが予め既知でなければならない。各蛍光スペクトルは、本来は装置に依存せず蛍光色素や分離媒体によって一元的に決められるものである。しかしながら実際の装置では、様々な理由により蛍光スペクトルが変動する。その中で良く知られているのがキャピラリと光検出器の位置関係である。このため、キャピラリの交換の際には、分析対象のサンプル（以下、「実サンプル」と表記する）を電気泳動にかける前に、予め該装置及び該キャピラリにおける蛍光スペクトルを求める操作が必要となる。この操作を「スペクトラルキャリブレーション」と呼ぶ。なお、キャピラリを複数並べたキャピラリアレイを用いて、複数サンプルに対して同時に電気泳動を行う場合には、各々のキャピラリに対して蛍光スペクトルを求めておく必要がある。

ここで、従来技術に係るスペクトラルキャリブレーションの一例を説明する。

図１は、マルチキャピラリ電気泳動装置の光検出器に結像される回折格子像（下段）及び回折格子像のＡ－Ａ’方向に対応するキャピラリの信号強度分布を示す図（上段）である。マルチキャピラリ電気泳動装置は、特定の波長のレーザ光をキャピラリに照射することにより各蛍光色素から放射される蛍光を回折格子によって波長方向に分離し、分離した光をＣＣＤ等の光検出器にて検出し、回折格子像を取得する。そして、回折格子像のから信号強度分布（スペクトル）を取得する。

図１の下段は、キャピラリが４本並べられたキャピラリアレイに対してレーザ光を照射したときの回折格子像であり、縦軸がキャピラリの配列方向を示し、横軸が波長方向を示す。図１の上段は、縦軸が信号強度（輝度値（ＲＦＵ））を示し、横軸が波長を示す。なお、図１は回折格子を用いて連続的（実際は画素毎に離散的）にスペクトルを計測した例を示しているが、上記のスペクトルを広い波長間隔でサンプリングしたデータであってもよい。例えば、図１の回折格子像に示すように、各キャピラリに対し、２０個の波長λ（０）～λ（１９）における信号強度のみを取得してもよい。また、波長λ（０）～λ（１９）のそれぞれの波長の近傍の信号強度の加算平均をとってもよい。

図２は、従来のスペクトラルキャリブレーション方法を示すフローチャートである。

ステップＳ１０１において、オペレータは、マトリクススタンダードの電気泳動を行う。マトリクススタンダードは、蛍光スペクトルを取得し、後述するマトリクスを得るための試薬である。マトリクススタンダードは、それぞれ異なる蛍光色素で標識された長さの異なる４種類のＤＮＡ断片を含んでいる。各々の蛍光色素に対応するＤＮＡ断片の長さ、もしくは長さの順序の情報は既知である。

図３Ａは、マトリクススタンダードの電気泳動を行うことで得られる信号強度の波形を示す図であり、縦軸が信号強度を示し、横軸が時刻を示す。ステップＳ１０１では４種類の蛍光色素（ＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ）の蛍光スペクトルを得ることを想定しており、図３Ａは、各蛍光色素の信号強度波形を一つのグラフに重ねた状態を示している。図３Ａに示すように、それぞれの蛍光色素が標識されたＤＮＡ断片の長さに相当する時刻に鋭いピークが現れる。長さの異なるＤＮＡ断片がそれぞれ異なる蛍光色素で標識されているため、各ピーク時刻（ｔ０，ｔ１，ｔ２，ｔ３）で各蛍光色素が単独で発光している。したがって、特定の蛍光色素のみが発光している時刻（図３Ａでは、ｔ０，ｔ１，ｔ２，ｔ３，ｔ４）におけるスペクトルを取得することで、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルを得られる。

図２に戻り、ステップＳ１０２において、マルチキャピラリ電気泳動装置の演算制御回路は、ステップＳ１０１で得られた信号強度の各時刻のスペクトルから蛍光強度を算出する。本ステップの処理は各々のスキャン時刻に対して行ってもよいし、一定の時間間隔分のスペクトルデータを蓄積した後に行ってもよい。

ステップＳ１０３において、演算制御回路は、図３Ａの信号強度波形のピーク時刻を検出する。前述のように、各々の蛍光色素が標識されたＤＮＡ断片の長さに対応するピークの出現順序が既知であることから、ピークの出現時刻により蛍光色素の種類が同定できる。図３Ａでは、時刻ｔ０ではＲＯＸが、時刻ｔ１ではＴＭＲが、時刻ｔ２ではＲ１１０が、時刻ｔ３ではＲ６Ｇがそれぞれ単独で発光している様子を示している。各時刻のスペクトルは、各蛍光スペクトルに相当する。つまり、各々のピーク時刻のスペクトルを取得することで、各蛍光スペクトルが分かる。

図３Ｂは、図３Ａの信号強度波形から取得される蛍光スペクトルであり、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は波長を示す。図３Ｂに示すように、演算制御回路は、信号強度波形に基づいて各蛍光色素の蛍光スペクトルを取得する。

図２に戻り、ステップＳ１０４において、演算制御回路は、各蛍光スペクトルを用いてマトリクスＭを取得する。以下の数式１は、２０個の波長λ（０）～λ（１９）における信号強度を取得した場合のマトリクスＭの一例を示している。マトリクスＭの要素は、各ピーク時刻で、各々の波長における各々の蛍光色素の信号強度の強度比率に相当する。この比率は、例えば各蛍光色素の波長間での最大値に対する割合である。例えば、数式１の要素ＷＸ１は、時刻ｔ０、波長λ（１）における、蛍光色素ＲＯＸの蛍光強度の比率である。この値が高いほど、その波長の蛍光強度への寄与が高いことを意味する。マトリクスＭは、光検出器で得られるスペクトル波形から各々の蛍光強度を得るために用いられる。

以上、ステップＳ１０１～Ｓ１０４までの操作がスペクトラルキャリブレーションである。キャピラリが複数本ある場合には、各々のキャピラリに対してマトリクスＭを取得する必要がある。また、スペクトラルキャリブレーションは、キャピラリ設置や部品交換などを行う度に実施する必要がある。

スペクトラルキャリブレーションで得られたマトリクスＭは基準スペクトルとも呼ばれ、理想的には実サンプルの蛍光スペクトルと同一である。しかし実際には、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルとの間に乖離が生じることがある。乖離が生じると重み値が正しく算出されず、間違った蛍光強度が記録されてしまう。甚だしい場合は、主ピークと同じピーク時刻に疑似ピークが出現する。

図４は、疑似ピークが出現した場合の蛍光スペクトルである。疑似ピークは、各色の蛍光スペクトルの重なりによって生じ得るものであり、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトル間に乖離が生じた際に、この重なりによる影響が大きく観測される。また、この疑似ピークは、主ピークが複数ある場合には、その全ての主ピークにおいて観測される。

基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトル間の乖離は、おおむねスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時の蛍光色素や泳動条件の差異に起因して発生する。つまり、オペレータは実サンプルで用いる蛍光色素や泳動条件を変えるたびに、スペクトラルキャリブレーションをやり直す必要があるので、手間と費用が増大してしまう。

特許文献１は、「実際のサンプルの電気泳動の際に使用される既知のＤＮＡ断片情報である、サイズスタンダードとアレリックラダーとを用いて基準蛍光スペクトルを得ることを特徴とし、アレリックラダーを用いないキャピラリに対しては、サイズスタンダードの蛍光スペクトルのシフト量を検出し、このシフト量を用いて基準蛍光スペクトルをシフトさせて蛍光スペクトルを計算することで、スペクトルキャリブレーションを行う」遺伝子解析装置を開示している（同文献の要約参照）。これにより、特別なマトリクススタンダードを用いて電気泳動を行う必要がなくなるため、短時間かつ低コストでスペクトラルキャリブレーションを実現することができる。

サイズスタンダードとは、特定の蛍光色素で標識された既知のＤＮＡ断片の混合物である。アレリックラダーとは、実サンプルと同じ蛍光色素で標識された既知のＤＮＡ断片の混合物である。特許文献１に記載の運用では、サイズスタンダードは電気泳動の際に試料全てに対して混合される。そしてアレリックラダーは実サンプルとは別個のキャピラリで分析される。

特開２０１４－１１７２２２号公報

しかしながら、特許文献１は、キャピラリ間での蛍光スペクトルのシフト量を特定の蛍光色素を用いて算出しており、前記シフト量が蛍光色素により異なる場合を想定していない。そのため、蛍光色素によっては適切な基準スペクトルが得られず、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルとの間に乖離が生じ、疑似ピークが発生することがある。また、特許文献１の実施例３では、キャピラリ毎にスペクトルキャリブレーションを行う例が挙げられている。しかしそのためには、単色の蛍光色素から成るピークが必要になる。したがって、複数のピークが重なり合うようなサンプルにおいては基準スペクトルが得られない場合がある。結果として、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルの間に乖離が生じうる。以上のことから特許文献１の手法は、任意の蛍光色素、任意のサンプルへの適用が難しいので、泳動条件や蛍光色素を変更する度にスペクトラルキャリブレーションをやり直す必要がある。したがって、オペレータの手間と費用が増大する。

そこで、本開示は、オペレータの手間と費用を軽減した電気泳動装置及び分析方法を提供する。

上記課題を解決するために、本開示の電気泳動装置は、サンプルの電気泳動路と、前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光する分光素子と、前記分光素子により分光された光を検出する光検出器と、前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求める演算部と、を備え、前記演算部は、泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正することを特徴とする。

また、本開示の他の電気泳動装置は、サンプルの電気泳動路と、前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光する分光素子と、前記分光素子により分光された光を検出する光検出器と、前記光検出器の信号に基づき、前記光の信号強度を算出する演算部と、を備え、前記光検出器は、複数の蛍光色素のスペクトル間の相関係数が所定値以上となるように設定された信号取得幅で、前記信号を取得することを特徴とする。

本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。

本開示によれば、泳動条件や蛍光色素を変更する度にスペクトラルキャリブレーションをやり直す必要がなくなる。結果としてオペレータの手間と費用が軽減される。上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。

マルチキャピラリ電気泳動装置で検出される蛍光の信号強度（上段）及び波長（下段）を示す図である。 従来のスペクトラルキャリブレーション方法を示すフローチャートである。 従来技術に係るスペクトラルキャリブレーションの概要を説明するための図である。 従来技術に係るスペクトラルキャリブレーションの概要を説明するための図である。 疑似ピークを説明するための図である。 第１の実施形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を示す概略図である。 恒温槽内の光学系の構成を示す概略図である。 第１の実施形態に係る補正係数の算出方法を示すフローチャートである。 第１の実施形態におけるマトリクスＭ’の算出の概要を説明する図である。 第１の実施形態におけるマトリクスＭ’の算出の概要を説明する図である。 実サンプルの電気泳動における補正係数の適用方法を示すフローチャートである。 実サンプルの電気泳動方法のフローチャートである。 ガウスフィッティングを説明するための図である。 第２の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。 実験例１の結果を示す図である。 第３の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。 実験例２において使用される蛍光色素を示す図である。 実験例２の結果を示す図である。 第５の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。 実験例３で取得される蛍光スペクトルである。 実験例３の対照実験で取得される蛍光スペクトルである。 第６の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。

以下、添付図面を参照して実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本開示の技術の原理に則った実施形態と実装例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示の技術を限定的に解釈するために用いられるものではない。本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定するものではない。

本実施形態では、当業者が本開示を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。したがって、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。

［第１の実施形態］
背景技術で述べたように、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルとの間に乖離が生じると、正しい重み値が算出されず、誤った蛍光強度が記録される。この乖離は、主に蛍光色素の変性によりスペクトルが変化することで生じる。蛍光色素の変性は、不適切なｐＨ、不適切な温度での保管、色素の過剰な励起によって生じる。また、蛍光色素の変性は、スペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時で泳動電圧が異なる場合にも起こり得る。複数のキャピラリを備えた電気泳動装置においては、励起光強度がキャピラリ毎に異なるため、乖離が生じ得る。上記に挙げた例のそれぞれで、変性の程度は蛍光色素により異なることにも留意すべきである。また実サンプルが、マトリクススタンダードと異なる蛍光色素で標識されている場合にも、当然のこととして乖離が生じる。

そこで、第１の実施形態では、マルチキャピラリ電気泳動装置を購入したオペレータによるスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時とで泳動電圧が異なる場合の運用（蛍光スペクトルの補正）について説明する。なお、本明細書において、マルチキャピラリ電気泳動装置のメーカーが当該装置の出荷前に実施するスペクトラルキャリブレーションを「第１のスペクトラルキャリブレーション」と呼び、マルチキャピラリ電気泳動装置を購入したオペレータによるスペクトラルキャリブレーションを「第２のスペクトラルキャリブレーション」と呼ぶ場合がある。

＜マルチキャピラリ電気泳動装置の構成例＞
図５は、第１の実施形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置５００の構成を示す概略図である。図５に示すように、マルチキャピラリ電気泳動装置５００は、装置本体５０１と、制御用コンピュータ５０２とを備える。

装置本体５０１は、演算制御回路５０３、光検出器５０４、恒温槽５０５、キャピラリアレイ５０６、光源５０７、光照射部５０８、ロードヘッダ５０９、陰極用バッファ容器５１１、サンプル容器５１２、ポリマカートリッジ５１３、陽極用バッファ容器５１４、陽極５１５、高圧電源５１６、アレイヘッダ５１７、搬送機５１８、シリンジ機構５２０、加熱冷却機構５２３及び回折格子５２４を備える。

装置本体５０１は、制御用コンピュータ５０２と通信可能に接続されている。オペレータは、制御用コンピュータ５０２を操作して装置本体５０１が有する各部を制御することができる。制御用コンピュータ５０２は、装置本体５０１で取得するデータ（光検出器５０４の検出信号など）を受信する。制御用コンピュータ５０２は、受信したデータを表示するディスプレイを備える。なお、制御用コンピュータ５０２は、装置本体５０１に内包されていてもよい。

演算制御回路５０３は、光検出器５０４の検出信号に基づいて測定値（蛍光強度）の演算処理を実行すると共に、測定値（蛍光強度）に対し補正を実行する。また、演算制御回路５０３は、制御用コンピュータ５０２からの入力や命令に従い、装置本体５０１を制御する。

光検出器５０４は、光源５０７からキャピラリアレイ５０６に照射された励起光としてのレーザ光によって発生した蛍光を検出する光センサである。光源５０７としては、液体レーザ、気体レーザ、半導体レーザなどを適宜使用でき、ＬＥＤで代用することも可能である。光源５０７は、キャピラリアレイ５０６の配列の両側から励起光を照射するようにしてもよく、また、励起光を時分割で照射するように構成されていてもよい。

恒温槽５０５は、キャピラリアレイ５０６の温度を制御するための温度制御機構である。恒温槽５０５は、槽内に温度を一定に保つために断熱材で覆われ、加熱冷却機構５２３により温度が制御される。これにより、キャピラリアレイ５０６の大部分の温度を、例えば６０℃程度の一定温度に維持することができる。

キャピラリアレイ５０６は、複数本（図５の例では４本）のキャピラリ５１９（電気泳動路）を配列して構成される。キャピラリアレイ５０６は、破損や品質の劣化が確認された場合には、適宜新品と交換可能な交換部材として構成され得る。また、キャピラリアレイ５０６は、測定に応じて、異なる本数や長さのキャピラリを有する別のキャピラリアレイに置き換え可能である。

キャピラリアレイ５０６を構成する複数のキャピラリ５１９の各々は、内径数十～数百μｍ、外径数百μｍのガラス管で構成され得る。また、強度向上のため、ガラス管の表面はポリイミド被膜で被覆されていてもよい。ただし、レーザ光が照射される箇所及びその近傍は、キャピラリ５１９の表面のポリイミド被膜は除去されている。キャピラリ５１９の内部には、生体試料（サンプル）中のＤＮＡ分子を分離するための分離媒体が充填される。ここでは電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲル（以下、「ポリマ」と表記する）を用いるものとする。

光照射部５０８は、キャピラリアレイ５０６の一部に配置されている。光照射部５０８は、後述するように、光源５０７からのレーザ光（励起光）を共通に複数のキャピラリ５１９に入射させ、複数のキャピラリ５１９から発する蛍光を光検出器５０４に導光可能に構成されている。具体的に光照射部５０８は、キャピラリアレイ５０６に設けられた光照射部位に測定光であるレーザ光を照射するため、光ファイバやレンズなどの投光光学系を有する。回折格子５２４（分光素子）は、キャピラリ５１９からの光を分光し、光検出器５０４に入射させる。

本開示において、励起光の照射による蛍光色素からの蛍光を光検出器５０４により検出する例を説明しているが、検出する光は蛍光に限定されず、吸光、発光などであってもよい。

ロードヘッダ５０９は、キャピラリアレイ５０６の一端に設けられている。ロードヘッダ５０９は、キャピラリ５１９内に生体試料（サンプル）を導入するための負電圧を印加される陰極として機能する。キャピラリアレイ５０６の他端にはアレイヘッダ５１７が設けられ、アレイヘッダ５１７は複数本のキャピラリ５１９を１つに束ねている。また、アレイヘッダ５１７は、その下面に、ポリマカートリッジ５１３に挿入するための尖部５２１を備えている。

搬送機５１８は、その上面に陰極用バッファ容器５１１、サンプル容器５１２、ポリマカートリッジ５１３及び陽極用バッファ容器５１４が載置され、これらを搬送するよう構成されている。一例として、搬送機５１８は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備え、上下、左右、前後の３軸方向に移動可能とすることができる。

陰極用バッファ容器５１１及び陽極用バッファ容器５１４は、泳動用のバッファを保持する容器であり、サンプル容器５１２は、測定対象の試料（サンプル）を保持する容器である。

ポリマカートリッジ５１３は、泳動用のポリマを保持する容器である。ポリマカートリッジ５１３は、上部５２２がゴム又はシリコーンなどの可塑性の高い素材で密閉され、ポリマを充填するためのシリンジ機構５２０及び搬送機５１８と連結されている。

キャピラリ５１９内にポリマカートリッジ５１３からポリマを充填させる際の手順は以下の（１）～（３）の通りである。
（１）搬送機５１８が動作し、アレイヘッダ５１７がポリマカートリッジ５１３の上側に移動する。
（２）アレイヘッダ５１７の尖部５２１がポリマカートリッジ５１３の上部５２２を貫通する。この時、可塑性の高いポリマカートリッジ５１３の上部５２２がアレイヘッダ５１７の尖部５２１を包み込むことで両者が密着し、ポリマカートリッジ５１３とキャピラリ５１９が密閉状態で連結される。
（３）シリンジ機構５２０がポリマカートリッジ５１３内部のポリマを押し上げて、ポリマをキャピラリ５１９に注入する。

陽極用バッファ容器５１４には、泳動のための正電圧を印加する陽極５１５が、バッファと接触するように配置されている。高圧電源５１６は、陽極５１５と、陰極としてのロードヘッダ５０９との間に接続されている。

搬送機５１８は、陰極用バッファ容器５１１及びサンプル容器５１２をキャピラリ５１９の陰極端５１０まで搬送する。この時、陽極用バッファ容器５１４が連動して、キャピラリ５１９の陽極端に相当する尖部５２１に移動する。

サンプル容器５１２は、キャピラリ５１９と同数のサンプルチューブを内包する。オペレータはサンプルチューブにＤＮＡを分注する。

演算制御回路５０３（演算部）は、測定値演算部５０３２、補正係数演算部５０３３、補正係数データベース５０３４及び補正部５０３５を備える。

測定値演算部５０３２は、光検出器５０４の検出信号に基づいて測定値（蛍光強度）を算出する。補正係数演算部５０３３は、測定値演算部５０３２で算出された測定値を補正するための補正係数を算出する。補正係数データベース５０３４は、補正係数演算部５０３３で算出された補正係数を記憶する。また、補正部５０３５は、測定値演算部５０３２の測定値に対し、補正係数データベース５０３４に記憶された補正係数を適用して、補正された測定値を算出する。上記の演算制御回路５０３の各部の演算処理は、例えばＣＰＵ、ＭＰＵなどのプロセッサがプログラムを実行することにより実現することができる。

図６は、恒温槽５０５内の光学系の構成を示す概略図である。図６に示すように、光照射部５０８は、一例として、複数（図６では２つ）の反射ミラー６０２及び集光レンズ６０３を有する。反射ミラー６０２は、光源５０７からのレーザ光６０１の進行方向を変化させる。また、集光レンズ６０３は、キャピラリアレイ５０６の光照射部位にレーザ光を集光する。これにより、レーザ光６０１は、複数のキャピラリ５１９に次々に入射する。各キャピラリ５１９内の蛍光色素はレーザ光６０１により励起され、情報光（サンプルに依存した波長を有する蛍光）を発する。この情報光は回折格子５２４により波長方向に分光される。分光された情報光は光検出器５０４に検出される。この時、光検出器５０４は連続的（実際は画素毎に離散的）にスペクトルを計測することも可能であるが、本実施形態では一例として、２０個の波長λ（０）～λ（１９）における信号強度のみを取得するものとする。

このように、レーザ光６０１の入射により発せられる蛍光の蛍光強度を光検出器５０４で観測することにより、電気泳動中のＤＮＡの分析が可能になる。電気泳動とは、陰極・陽極バッファ間に生じた電界作用により、キャピラリ１１９中のサンプルに移動度を与え、サンプルの性質に依存する移動度の差によりサンプルを分離することである。ここではサンプルがＤＮＡの場合を例にとって説明する。

ＤＮＡは二重螺旋の骨格にあたるホスホジエステル結合により、ポリマ中で負の電荷をもつ。そのため、ＤＮＡ電界中で陽極側へ移動する。この時、ポリマが網目状構造を有するため、ＤＮＡの移動度は、網目の潜りやすさ、換言すればＤＮＡのサイズに依存する。塩基長の短いＤＮＡは網目状構造を潜り抜けやすく、移動度も高くなり、塩基長の長いＤＮＡではその逆になる。ＤＮＡには予め蛍光物質（蛍光体）が標識されるため、塩基長の短いＤＮＡから順番に光検出器５０４で光学的に検出される。通常は、泳動時間の一番長いサンプルに合わせて測定時間及び電圧印加時間が設定される。

＜補正係数の算出方法＞
上述のように、本実施形態は、スペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時とで泳動電圧が異なる場合の蛍光スペクトルの補正方法を提案する。マルチキャピラリ電気泳動装置５００のメーカーは、装置の出荷前に、実サンプルの泳動時に取得される蛍光スペクトルを補正するための補正係数を求め、演算制御回路５０３の補正係数データベース５０３４に登録しておく。

図７は、補正係数の算出方法を示すフローチャートである。補正係数の算出方法を概説すると、まずステップＳ１において、メーカーは、マトリクススタンダードを用いてスペクトラルキャリブレーションを行い、演算制御回路５０３により基準となるマトリクスＭを取得する。次にステップＳ２において、演算制御回路５０３により補正に用いるマトリクスＭ’を取得する。最後にステップＳ３において、演算制御回路５０３により補正係数マトリクスＫを取得する。

（ステップＳ１）
ステップＳ１において、メーカーは、任意の蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片を含むマトリクススタンダードを用いてスペクトラルキャリブレーション（第１のスペクトラルキャリブレーション）を行う。本実施形態では一例として、蛍光色素としてＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇを用いる。泳動電圧は、後述する実サンプル泳動前のスペクトラルキャリブレーション（第２のスペクトラルキャリブレーション）における泳動電圧と同じにすべきである。本実施形態では一例として１５ｋＶとするが、泳動電圧はこれに限定されない。

メーカーは、制御用コンピュータ５０２の入力装置の操作により、蛍光色素の種類と泳動電圧を演算制御回路５０３に登録する。測定値演算部５０３２は、この条件でマトリクスＭを求めるものとする。

ここで、本開示で解決すべき課題の一つは、オペレータによるスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時で泳動電圧が異なると、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトル間に乖離が生じることである。泳動電圧は、電気泳動に要する時間や、分析時の重要な品質指標の一つである分離能に影響する。そのため、マルチキャピラリ電気泳動装置を使用する際、オペレータは必要に応じて実サンプルの泳動電圧を頻繁に変更する。そしてオペレータは、実サンプルの泳動電圧を変更数するたびに、実サンプルと同じ泳動電圧でスペクトラルキャリブレーションをやり直す必要がある。

この課題を解決するために、本実施形態では、マルチキャピラリ電気泳動装置の出荷前に様々な泳動電圧で第１のスペクトラルキャリブレーションを行い、そこで見出されるスペクトル間の乖離を定量化することで、乖離を最小化するような補正係数を予め演算制御回路５０３に登録しておくことを提案する。補正係数は、使用した蛍光色素、泳動電圧などの情報と共に登録される。

装置を購入したオペレータは、演算制御回路５０３に登録されたものの中から任意の泳動電圧を選択し、第２のスペクトラルキャリブレーションを行った後に、同じく演算制御回路５０３に登録された任意の泳動電圧で実サンプルを泳動することが可能になる。つまり、演算制御回路５０３に登録された範囲で、実サンプルの泳動電圧を何度変更しても、オペレータはそのたびにスペクトラルキャリブレーションをやり直す必要がない。

以上の運用を想定すると、ステップＳ１において、メーカーは１５ｋＶだけでなく複数の電圧でマトリクススタンダードの泳動を行うべきである。そして、取得した全てのマトリクスＭを泳動電圧及び蛍光色素の情報と共に演算制御回路５０３に登録するべきである。

マトリクスＭの算出方法については上述した通りである。

（ステップＳ２）
ステップＳ２において、メーカーは、実サンプルと同じ蛍光色素及び同じ泳動条件でマトリクススタンダードを泳動する。ここでは実サンプルがステップＳ１で用いたマトリクススタンダードと同じ蛍光色素で標識され、７．５ｋＶで泳動されるものとする。この時、メーカーは、制御用コンピュータ５０２の入力装置の操作により、蛍光色素の種類と泳動電圧を演算制御回路５０３に登録する。

上述したようにマトリクススタンダードには、それぞれ異なる蛍光色素で標識されていた長さの異なるＤＮＡ断片が含まれるため、各ピーク時刻（ｔ０’，ｔ１’，ｔ２’，ｔ３’）では各蛍光色素が単独で発光する。また、各々の蛍光色素に対応するピーク時刻の出現順序が既知であることから、各々のピーク時刻に対応する蛍光色素の種類が同定できる。

図８Ａは、マトリクススタンダードの電気泳動を行うことで得られる信号強度の波形を示す図であり、縦軸が信号強度を示し、横軸が時刻を示す。図８Ａに示すように、時刻ｔ’０ではＲＯＸが、時刻ｔ’１ではＴＭＲが、時刻ｔ’２ではＲ１１０が、時刻ｔ’３ではＲ６Ｇがそれぞれ単独で発光している。各々の時刻のスペクトルが、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルに相当する。よって、演算制御回路５０３は、各々のピーク時刻のスペクトルを取得することで各蛍光色素の蛍光スペクトルを取得する。

図８Ｂは、図８Ａの信号強度波形から取得される蛍光スペクトルであり、縦軸は蛍光強度を示し、横軸は波長を示す。

測定値演算部５０３２は、各蛍光スペクトルを用いてマトリクスＭ’を算出する。以下の数式２は、２０個の波長λ（０）～λ（１９）における信号強度を取得した場合のマトリクスＭ’の一例を示している。マトリクスＭ’の要素は、各ピーク時刻（ｔ’０、ｔ’１、ｔ’２、ｔ’３）で、各々の波長における各々の蛍光色素の強度比率に相当する。例えば、数式２の要素Ｗ’Ｘ１は、時刻ｔ’０、波長λ（１）における、蛍光色素ＲＯＸの蛍光強度の比率である。

なお、ステップＳ２においても、ステップＳ１で述べたような理由から、実際の運用では７．５ｋＶを含む複数の電圧でマトリクススタンダードを泳動し、取得される全てのマトリクスＭ’を泳動電圧、蛍光色素などの情報と共に演算制御回路５０３に登録する。

（ステップＳ３）
図７に戻り、ステップＳ３において、測定値演算部５０３２は、算出したマトリクスＭ及びＭ’を補正係数演算部５０３３に送信する。補正係数演算部５０３３は、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを取得する。補正係数マトリクスＫの要素は、蛍光色素ｉ、波長ｊにおいて、補正係数マトリクスＫの要素ｋ（ｉｊ）＝ｗ’（ｉｊ）／ｗ（ｉｊ）と定義する。既に述べたようにステップＳ１とステップＳ２で用いた蛍光色素及び泳動電圧は演算制御回路５０３に登録されている。したがってｋ（ｉｊ）は算出に用いた泳動条件及び蛍光色素の情報と共に補正係数データベース５０３４に蓄積することができる。この時、ステップＳ１及びＳ２で述べたように、複数の泳動電圧でマトリクスＭ及びＭ’が取得されている場合は、補正係数演算部５０３３は、そのすべての組み合わせで補正係数マトリクスＫを算出し、泳動電圧及び蛍光色素の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録する。

＜実サンプルの電気泳動による分析方法＞
図９は、オペレータによる実サンプルの電気泳動における補正係数の適用方法を示すフローチャートである。

（ステップＳ１１）
上述のステップＳ１～Ｓ３までは、オペレータがマルチキャピラリ電気泳動装置５００を購入した時点で既に終了している。オペレータは、ステップＳ１１以降の操作だけを行えばよい。なお、購入の際（ステップＳ３の後）、装置の運搬のため、キャピラリが脱着され、光検出器５０４とキャピラリ５１９の位置関係が変化したものとする。つまり、装置は再度スペクトラルキャリブレーションが必要な状態である。

ステップＳ１１において、オペレータは、ステップＳ１と同様にして、マトリクススタンダードを用いてスペクトラルキャリブレーションを行う。便宜上、オペレータが行うスペクトラルキャリブレーションを「第２のスペクトラルキャリブレーション」と呼ぶ。第２のスペクトラルキャリブレーションにおける泳動電圧は、補正係数データベース５０３４に登録されている泳動電圧であれば任意に選択することができる。本実施形態では一例として１５ｋＶで泳動することとする。また、蛍光色素については、マトリクススタンダードがＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇで標識されているものとする。ステップＳ１１の第２のスペクトラルキャリブレーションで測定値演算部５０３２により取得されるマトリクスＭをマトリクスＭ（ｒ）とする。

（ステップＳ１２）
ステップＳ１２において、オペレータは、実サンプルの泳動を行う。実サンプルは未知のサンプルであるが、蛍光色素の種類と泳動電圧は既知であるとする。実サンプルの泳動条件は、ステップＳ２での７．５ｋＶとする。蛍光色素については、実サンプルもマトリクススタンダードと同様にＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇで標識されているものとする。

図１０は、ステップＳ１２における実サンプルの電気泳動方法のフローチャートである。図１０に示すように、電気泳動の基本的手順は、サンプル準備（ステップＳ１２１）、分析開始（ステップＳ１２２）、分離媒体充填（ステップＳ１２３）、予備泳動（ステップＳ１２４）、サンプル導入（ステップＳ１２５）、及び泳動分析（ステップＳ１２６）を含む。

（ステップＳ１２１）
ステップＳ１２１において、オペレータは、分析開始前のサンプル準備として、サンプル及び試薬をマルチキャピラリ電気泳動装置５００にセットする。より具体的には、まず、オペレータは、図５に示した陰極用バッファ容器５１１と陽極用バッファ容器５１４に、通電路の一部を形成する緩衝液を満たす。緩衝液は、例えば、市販されている電気泳動用の電解質液を用いることができる。また、オペレータは、サンプル容器５１２のウェル内に、分析対象である実サンプルを分注する。実サンプルは、例えばＤＮＡのＰＣＲ産物である。また、オペレータは、シリンジ機構５２０内に、サンプルを電気泳動する為の分離媒体を注入する。分離媒体には上述のポリマを用いるものとする。さらに、キャピラリ５１９の劣化が予想される場合や、キャピラリ５１９の長さを変更する場合、オペレータは、キャピラリアレイ５０６を交換する。

（ステップＳ１２２）
ステップＳ１２２において、オペレータは、制御用コンピュータ５０２の入力装置の操作により、実サンプルに用いる蛍光色素の種類と泳動電圧を演算制御回路５０３に登録する。そして、オペレータは、制御用コンピュータ５０２に分析開始の指示を入力する。制御用コンピュータ５０２は、分析開始の指示が入力されると、当該指示を装置本体５０１に送信する。これにより、装置本体５０１は分析を開始する。

（ステップＳ１２３）
ステップＳ１２３において、装置本体５０１は、キャピラリ５１９内へのポリマ充填を開始する。ポリマ充填とは、キャピラリ５１９内に新しいポリマを充填し、泳動路を形成する手順である。

本実施形態におけるポリマ充填では、まず、図５に示した搬送機５１８により陰極用バッファ容器５１１をロードヘッダ５０９の直下に運び、キャピラリ５１９の陰極端５１０から排出される使用済のポリマを受け止められるようにする。そして、シリンジ機構５２０を駆動して、キャピラリ５１９に新しいポリマを充填し、使用済のポリマを廃棄する。最後に、分離媒体の乾燥を防ぐため陰極用バッファ容器５１１内の緩衝液に陰極端５１０を浸す。

（ステップＳ１２４）
ステップＳ１２４において、装置本体５０１は、予備泳動を実施する。予備泳動とは、ポリマに所定の電圧を印加し、ポリマを電気泳動に適した状態にする手順である。

本実施形態における予備泳動では、まず、搬送機５１８により、陰極用バッファ容器５１１内の緩衝液に陰極端５１０を浸し、通電路を形成する。そして、高圧電源５１６により、ポリマに数～数十キロボルト程度の電圧を数～数十分間印加し、ポリマを電気泳動に適した状態とする。最後に、ポリマの乾燥を防ぐため陰極用バッファ容器５１１内の緩衝液に陰極端５１０を浸す。

（ステップＳ１２５）
ステップＳ１２５において、装置本体５０１は、泳動路へサンプル成分を導入する。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、制御用コンピュータ５０２から制御信号が送信されることによって行われてもよい。

本実施形態におけるサンプル導入では、まず、搬送機５１８により、サンプル容器５１２のウェル内に保持されたサンプルに陰極端５１０を浸す。これにより、通電路が形成され、泳動路にサンプル成分を導入することが可能な状態となる。そして、高圧電源５１６によりパルス電圧を通電路に印加し、泳動路にサンプル成分を導入する。最後に、ポリマの乾燥を防ぐため陰極用バッファ容器５１１内の緩衝液に陰極端５１０を浸す。

（ステップＳ１２６）
ステップＳ１２６において、装置本体５０１は泳動分析を実施する。泳動分析では、電気泳動により、サンプル中に含まれる各サンプル成分が分離分析される。

本実施形態における泳動分析では、まず、搬送機５１８により、陰極用バッファ容器５１１内の緩衝液に陰極端５１０を浸し、通電路を形成する。次に、高圧電源５１６により、通電路に７．５ｋＶの高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各サンプル成分は、各サンプル成分の性質に依存した速度で光照射部５０８へ移動する。つまり、サンプル成分は、その移動速度の差により分離される。そして、光検出器５０４は、光照射部５０８に到達したサンプル成分から順番に検出する。

例えば、サンプルが、塩基長の異なるＤＮＡを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いＤＮＡから順に光照射部５０８に到達する。各ＤＮＡには、解析対象に応じた蛍光色素が結合されている。光源５０７から光照射部５０８に励起光が照射されると、サンプルから情報光（サンプルに依存した波長を有する蛍光）が生じ、外部に放出される。この情報光は回折格子５２４で波長方向に分光され、光検出器５０４により検出される。光検出器５０４にて検出された画像の一例が図１である。泳動分析中は、光検出器５０４では、一定の時間間隔でこの情報光を検出し、画像データを演算制御回路５０３へ送信する。あるいは、送信する情報量を減らすために、光検出器５０４は、画像データではなく、画像データ中の一部の領域のみの輝度（信号強度）を送信してもよい。例えば、キャピラリ毎に、一定間隔の波長位置のみの信号強度を送信してもよい。

本実施形態では上記の画像データのうち、図１の説明で述べたように、キャピラリ毎に２０の波長λ（０）～λ（１９）における信号強度データのみが、演算制御回路５０３へ送信されるものとする。この信号強度データは、各キャピラリにおける各ＤＮＡサンプルのスペクトルを表しており、このスペクトルが測定値演算部５０３２へ格納される。測定値演算部５０３２には、上記の泳動分析中の全ての検出時刻における全キャピラリ５１９のスペクトルが格納される。なお、全ての検出時刻のスペクトルを測定値演算部５０３２に格納することができるが、特定のピーク時刻のみがオペレータにとって重要である場合には、特定時刻周辺のみのスペクトルが格納されていてもよい。

（ステップＳ１２７）
ステップＳ１２７において、装置本体５０１は、予定していた画像データを取得し終えたら電圧印加を停止し、泳動分析を終了する。

以上が、図９における電気泳動処理（ステップＳ１２）の処理の一例である。なお、ステップＳ１２３～Ｓ１２７は、装置本体５０１により自動的に行われてもよいし、逐次、制御用コンピュータ５０２から制御信号が送信されることによって行われてもよい。

（ステップＳ１３）
図９に戻り、ステップＳ１３において、補正部５０３５は、補正係数データベース５０３４から、マトリクスＭ（ｒ）の取得時及びステップＳ１２の実サンプルと同じ泳動電圧、蛍光色素の組み合わせを持つ補正係数マトリクスＫを呼び出し、マトリクスＭ（ｒ）の各要素にマトリクスＫの各要素ｋ（ｉｊ）を乗じてマトリクスＭ（ｒ）ｋを算出する。

（ステップＳ１４）
ステップＳ１４において、補正部５０３５は、蛍光強度を算出する。具体的には、補正部５０３５は、上述の電気泳動処理（ステップＳ１２）で得られた画像データから、各蛍光色素の強度を算出する。本ステップＳ１４においては、各々の時刻における各々のキャピラリ５１９のスペクトルに対し、波長λ（０）～λ（１９）における、各蛍光色素の強度比率を掛けて足し合わせればよい。これを行列で表現すると以下の数式３のようになる。

ここで、ベクトルＣは、使用した各蛍光色素の蛍光強度を表している。したがって、ベクトルＣの要素ＣＸ、ＣＴ、ＣＲ、ＣＧはそれぞれ、ＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇの蛍光強度を表している。ベクトルｆは、光検出器５０４が観測した信号強度を表している。ベクトルｆの要素ｆ０～ｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）～λ（１９）における信号強度を表している。要素ｆ０～ｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）～λ（１９）の近傍の信号強度の加算平均などであってもよい。

なお、光検出器５０４で検出される、個々の波長λ（０）～λ（１９）の計測信号には、蛍光色素による信号に加え、キャピラリ５１９内に充填されるポリマからのラマン散乱光がベースライン信号として含まれている。このため、ベクトルｆの算出の際には、このベースライン信号を予め除去しておく必要がある。

ベースライン信号の除去方法の一例としては、装置の出荷前に予めラマン散乱光のスペクトルを求め、これをベースライン信号として演算制御回路５０３に格納しておく。そして各々の時刻における計測信号から、このベースライン信号を引くことで、蛍光色素による信号を求め、これをベクトルｆとしてよい。もしくは各時刻の近傍の最小値を、その時刻におけるベースライン信号値としてもよい。

計測スペクトルｆの、蛍光強度ベクトルへの変換に当たってはマトリクスＭ（ｒ）ｋを用いる。

補正部５０３５は、上記数式３により計測スペクトルから各蛍光色素の蛍光強度を算出する。この処理を各時刻の各キャピラリ５１９のスペクトルに対して行うことで、各キャピラリ５１９の蛍光強度の時系列データを得ることができる。以降、この蛍光強度の時系列データを蛍光強度波形と呼ぶ。

（ステップＳ１５）
ステップＳ１５において、補正部５０３５は、上記の蛍光強度波形に対してピーク検出を行う。ピーク検出では、主に、ピークの中心位置（ピーク時刻）、ピークの高さ、及びピークの幅が重要である。ピークの中心位置はＤＮＡ断片長に対応する。ピークの高さはサンプル中のＤＮＡ濃度の大小等の品質評価に用いられる。ピークの幅も、サンプルや電気泳動結果の品質を評価する上で重要である。このような実データのピークパラメータを推定する手法の一つとして、既知技術であるガウシアンフィッティングを用いることができる。

図１１は、ガウシアンフィッティングの概念を示す図である。図１１に示すように、ガウシアンフィッティングとは、一定区間の実データに対し、ガウス関数ｇが最もよく実データを近似するようなパラメータ（平均値μ、標準偏差σ、及び最大振幅値Ａ）を計算する処理である。実データの近似の程度を表す指標としては、実データとガウス関数値との最小二乗誤差が多く用いられる。この最小二乗誤差を最小するような数値計算手法として、ガウスニュートン法などの手法を用いてパラメータを最適化することができる。その他にも、２つ以上のピーク波形が混合している場合や、ピーク周辺のデータが非対称である場合などの精度を向上させるような手法を適用してもよい。そしてガウス関数ｇの分散σが定まれば、その半値全幅（ＦＷＨＭ：Ｆｕｌｌ Ｗｉｄｔｈ ａｔ Ｈａｌｆ Ｍａｘｉｍｕｍ）は、図１１中に示す式で得られる。この値をピーク幅とすることができる。

このようにして、補正部５０３５は、全ての蛍光色素の蛍光強度波形に対してピークパラメータを求める。この際、ピーク幅やピークの高さが予め定められた閾値条件を満たさない場合には、ピークから除外してもよい。

以上の操作により、１５ｋＶの泳動電圧で得られたマトリクスＭを用いて、７．５ｋＶの泳動で得られた実サンプルの信号強度が正しく算出される。本実施形態では特定の泳動電圧の組み合わせを例示したが、実際には、オペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）の泳動電圧を任意に選択することができる。

＜技術的効果＞
以上のように、第１の実施形態において、マルチキャピラリ電気泳動装置５００の出荷前に、複数の泳動電圧で第１のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルと同じ条件での泳動が行われ、泳動電圧の組み合わせ毎に、スペクトルの乖離を補正するための補正係数マトリクスＫが取得され、蛍光色素の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。装置を購入したオペレータは、補正係数データベース５０３４に登録されている任意の泳動電圧の組み合わせで、第２のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルの泳動を実施することができる、また、オペレータが実サンプル泳動時の電圧を変更しても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離しないので、第２のスペクトラルキャリブレーションをやり直さなくても、正しい蛍光強度を取得することができる。

［第２の実施形態］
第１の実施形態では、マトリクススタンダードを用いてマトリクスＭ’を取得したが、第２の実施形態では既知のＤＮＡサンプルを用いてマトリクスＭ’を取得する方法を提案する。既知のＤＮＡサンプルとは、ＤＮＡのＰＣＲ産物や市販の標準サンプルなどである。本実施形態では一例としてマトリクススタンダード、既知のＤＮＡサンプル、実サンプル共にＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇで標識されたものとする。また、既知のＤＮＡサンプルの泳動中、各蛍光色素が単独で発光する時刻（ｔ０’、ｔ１’、ｔ２’、ｔ３’）は既知であるものとする。

図１２は、第２の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。

ステップＳ２１において、メーカーは、ステップＳ１と同様にして、マトリクススタンダードを用いてスペクトラルキャリブレーションを行い、測定値演算部５０３２は、マトリクスＭを取得する。泳動電圧は１５ｋＶとする。

ステップＳ２２において、メーカーは、既知のＤＮＡサンプルを泳動する。

ステップＳ２３において、測定値演算部５０３２は、各蛍光色素が単独で発光している時刻（ｔ０’、ｔ１’、ｔ２’、ｔ３’）におけるスペクトルを取得し、各々の蛍光色素の強度比率からマトリクスＭ’を作成する。泳動電圧は７．５ｋＶとする。

ステップＳ２４において、補正係数演算部５０３３は、ステップＳ３と同様にして、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、泳動電圧及び蛍光色素の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。第１の実施形態のステップＳ１で述べたように、実際の運用においてはステップＳ２１及びＳ２２を様々な泳動電圧で行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。複数の電圧で泳動した場合は、すべての補正係数マトリクスＫを登録する。

第１の実施形態と同様に、ステップＳ２１～Ｓ２４まではメーカー側でマルチキャピラリ電気泳動装置５００の出荷前に実施され、補正係数マトリクスＫが既に補正係数データベース５０３４に登録されている。装置を購入したオペレータが実際に行う作業は、次のステップＳ２５以降になる。ここで、ステップＳ２４の後、運搬の際にキャピラリ５１９の脱着が行われ、光検出器５０４とキャピラリ５１９の位置関係が変化したものとする。もしステップＳ２４以降にキャピラリ５１９の脱着が行われていないならば、ステップＳ２１で得られたマトリクスＭから、実サンプル泳動（ステップＳ２６）と同じ泳動電圧のものを選択し、後述のマトリクスＭ（ｒ）ｋとすることができる。

ステップＳ２５において、オペレータは、ステップＳ１１と同様にして、第２のスペクトラルキャリブレーションを行い、測定値演算部５０３２は、マトリクスＭ（ｒ）を取得する。ステップＳ２５における泳動電圧は一例として１５ｋＶとするが、実際の運用では補正係数データベース５０３４に登録されている泳動電圧の中から任意のものを選択することができる。

ステップＳ２６において、オペレータは、ステップＳ１２と同様にして、実サンプルの泳動を行う。ここでの泳動電圧は一例として７．５ｋＶとするが、実用に当たっては補正係数データベース５０３４に登録されている中から任意で選択することができる。

ステップＳ２７～Ｓ２９については、第１の実施形態で説明したステップＳ１３～Ｓ１５（図９）と同様であるので、説明を省略する。

以上の操作により、第１のスペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ２１）と実サンプル泳動時（ステップＳ２５）で泳動電圧が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定の泳動電圧の組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ２５）と実サンプル泳動（ステップＳ２６）の泳動電圧を任意に選択することができる。

＜技術的効果＞
以上のように、第２の実施形態において、第１の実施形態と同様に、装置を購入したオペレータは、補正係数データベース５０３４に登録されている任意の泳動電圧の組み合わせで、第２のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルの泳動を実施することができる、また、オペレータが実サンプル泳動時の電圧を変更しても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離しないので、第２のスペクトラルキャリブレーションをやり直さなくても、正しい蛍光強度を取得することができる。

＜実験例１＞
以下の手順で第２の実施形態の効果を確認した。

（試料）
第１のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ２１）時のマトリクススタンダードとして、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｄｙｅ Ｓｅｔ Ｚ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。既知のＤＮＡサンプル（ステップＳ２２）と実サンプル（ステップＳ２６）には、共に３５００／３５００ｘＬ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ， ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。以上のサンプルはいずれも蛍光色素として、ＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇが使用されている。

（分析手順）
実験例１では、第２の実施形態の検証としてステップＳ２１～Ｓ２６はそれぞれ、ステップＳ１、Ｓ１２、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ１１、Ｓ１２に記載の要領で行った。泳動時のキャピラリ長は３６ｃｍであり、サンプル注入時の印加電圧は１．６ｋＶであり、泳動時の印加電圧は第１のスペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ２１）では１５ｋＶであり、既知サンプル泳動及び実サンプル泳動時の電圧は７．５ｋＶであった。

次に、ステップＳ２７～Ｓ２９をステップＳ１３～Ｓ１５に記載の要領で実行した。

第２の実施形態の対照として、補正係数マトリクスＫを適用せず、マトリクスＭを用いて実サンプルの光強度計算とピーク検出を行った。第２の実施形態とその対照とで疑似ピークの信号強度を比較した。

（実験結果）
図１３は、実験例１の結果を示す図である。図１３には、ステップＳ２１、Ｓ２３及びＳ２４で得られたマトリクスＭ、マトリクスＭ’及び補正係数マトリクスＫが示されている。

図１３中のグラフは、横軸がピーク時刻、縦軸が蛍光強度を示す。対照においては疑似ピークが確認されるが、第２の実施形態の手法では軽減されていることが明らかである。

［第３の実施形態］
第１及び第２の実施形態では第２のスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時とで泳動電圧が異なる場合について説明したが、第３の実施形態では蛍光色素が異なる場合について説明する。本実施形態では一例として、第１のスペクトラルキャリブレーションに使用するマトリクススタンダードがＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲで標識されているものとする。また、実サンプルはＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識されているものとする。

図１４は、第３の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。

ステップＳ３１において、メーカーは、ステップＳ１と同様にして、マトリクススタンダードを用いてスペクトラルキャリブレーションを行い、測定値演算部５０３２は、マトリクスＭを取得する。ただし、サンプルにはＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲで標識されたマトリクススタンダードを用いる。

ステップＳ３２において、メーカーは、ステップＳ１と同様にして、マトリクスＭ’を取得する。ただし、サンプルにはＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識されたマトリクススタンダードを用いる。

ステップＳ３３において、補正係数演算部５０３３は、ステップＳ３と同様にして、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、泳動電圧及び蛍光色素の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。第１の実施形態のステップＳ１で述べたように、実際の運用においてはステップＳ３１及びＳ３２を様々な蛍光色素の組み合わせで、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。複数の蛍光色素の組み合わせで泳動した場合は、すべての補正係数マトリクスＫを登録する。

第１の実施形態と同様に、ステップＳ３１～Ｓ３３まではメーカー側でマルチキャピラリ電気泳動装置５００の出荷前に実施され、補正係数マトリクスＫが既に補正係数データベース５０３４に登録されている。装置を購入したオペレータが実際に行う作業は、次のステップＳ３４以降になる。ここで、ステップＳ３３の後、運搬の際にキャピラリ５１９の脱着が行われ、光検出器５０４とキャピラリ５１９の位置関係が変化したものとする。もしステップＳ３３以降にキャピラリ５１９の脱着が行われていないならば、ステップＳ３１で得られたマトリクスＭから、実サンプル泳動（ステップＳ３５）と同じ蛍光色素のものを選択し、後述のマトリクスＭ（ｒ）ｋとすることができる。

ステップＳ３４において、オペレータは、ステップＳ１１と同様にして、第２のスペクトラルキャリブレーションを行い、測定値演算部５０３２は、マトリクスＭ（ｒ）を取得する。ステップＳ３４における蛍光色素は、本実施形態ではＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲを用いるが、実用に当たっては補正係数データベース５０３４に登録されている蛍光色素の中から任意のものを選択することができる。

ステップＳ３５において、オペレータは、ステップＳ１２と同様にして、実サンプルの泳動を行う。実サンプルは一例としてＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識されているものとする。しかし実用に当たっては、補正係数データベース５０３４に登録されている蛍光色素の中から任意のものを選択することができる。

ステップＳ３６～Ｓ３８については、第１の実施形態で説明したステップＳ１３～Ｓ１５（図９）と同様であるので、説明を省略する。

以上の操作により、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ３１）と実サンプル泳動時（ステップＳ３５）で蛍光色素が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定の蛍光色素の組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ３４）と実サンプル泳動（ステップＳ３５）の蛍光色素を任意に変更することができる。

＜技術的効果＞
以上のように、第３の実施形態において、マルチキャピラリ電気泳動装置５００の出荷前に、異なる蛍光色素のセットで標識されたサンプルを用いて、第１のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルと同じ条件での泳動が行われ、蛍光色素の組み合わせ毎に、スペクトルの乖離を補正するための補正係数マトリクスＫが取得され、補正係数データベース５０３４に登録される。装置を購入したオペレータは、補正係数データベース５０３４に登録されている任意の蛍光色素の組み合わせで、第２のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルの泳動を実施することができる、また、オペレータが実サンプル泳動時の蛍光色素を変更しても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離しないので、第２のスペクトラルキャリブレーションをやり直さなくても、正しい蛍光強度を取得することができる。

＜実験例２＞
以下の手順で第３の実施形態の効果を確認した。

（試料）
第１のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ３１）時のマトリクススタンダードとして、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）４Ｃ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。マトリクスＭ’（ステップＳ３２）の取得にはＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｄｙｅ Ｓｅｔ Ｚ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。実サンプル（ステップＳ３５）には、３５００／３５００ｘＬ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ， ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。

図１５Ａは、実験例２において使用される蛍光色素を示す図である。図１５Ａに示すように、マトリクススタンダード（ステップＳ３１）には蛍光色素としてＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲが使用されている。またステップＳ３２及びＳ３５のサンプルには、共に蛍光色素として、ＲＯＸ、ＴＭＲ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇが使用されている。

（分析手順）
実験例２では第３の実施形態の検証としてステップＳ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、Ｓ３４はそれぞれ、ステップＳ１、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ１１に記載の要領で行った。泳動時のキャピラリ長は３６ｃｍであり、サンプル注入時の印加電圧は１．６ｋＶであり、泳動時の印加電圧は第１のスペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ３１）ではすべてのステップで１５ｋＶである。

次に、ステップＳ３５～Ｓ３８をステップＳ１２～Ｓ１５に記載の要領で実行した。

第３の実施形態の対照として、補正係数マトリクスＫを適用せず、マトリクスＭを用いて実サンプルの光強度計算とピーク検出を行った。第３の実施形態とその対照とで疑似ピークの信号強度を比較した。

（実験結果）
図１５Ｂは、実験例２の結果を示す図である。図１５Ｂには、ステップＳ３１～Ｓ３３で得られたマトリクスＭ、マトリクスＭ’及び補正係数マトリクスＫが示されている。

図１５Ｂのグラフは、横軸がピーク時刻、縦軸が蛍光強度を示す。対照においては疑似ピークが確認されるが、第３の実施形態の手法では軽減されていることが明らかである。

［第４の実施形態］
第１の実施形態では、特定の装置で得られた補正係数マトリクスＫを同じ装置で得られた実サンプルのデータに適用していた。第４の実施形態ではある特定の装置で得られた補正係数マトリクスＫを、別の装置で得られた実サンプルのデータに適用させる手法を提案する。

本実施形態では一例として、第３の実施形態と同様に蛍光色素が異なる場合（図１４）を例に説明する。一例として、第１のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ３１）に使用するマトリクススタンダードはＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲで標識されているものとする。さらに実サンプルはＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識されているものとする。

第１のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ３１）、マトリクスＭ’の取得（ステップＳ３２）、補正係数マトリクスＫの算出（ステップＳ３３）は、メーカー側で特定のマルチキャピラリ電気泳動装置Ａで第３の実施形態と同様に行う。装置Ａは、例えばネットワークを介して補正係数マトリクスＫを異なる装置（複数の装置）に送信し、それぞれの補正係数データベース５０３４に登録させる。例えば出荷前のマルチキャピラリ電気泳動装置の全てに補正係数マトリクスＫを登録してもよい。

ステップＳ３４以降は、装置Ａと同じ補正係数マトリクスＫが登録された任意の装置で実施することができる。

＜技術的効果＞
以上のように、第４の実施形態においては、特定のマルチキャピラリ電気泳動装置を用いて取得された補正係数マトリクスＫを、その他の装置にも登録する。これにより、補正係数マトリクスＫを各装置で計測する必要がなくなるので、メーカー側の費用と手間が軽減される。

［第５の実施形態］
第１の実施形態では、第２のスペクトラルキャリブレーションで得られたマトリクスＭ（ｒ）に補正係数マトリクスＫを乗じることで、マトリクスＭ（ｒ）と実サンプルの蛍光スペクトル間の乖離を防いでいた。第５の実施形態では、光検出器が検出する信号の波長幅（信号取得幅）を変更しておくことで乖離を防ぐ手法を提案する。第１の実施形態と同様の処理については説明を省略する。

図１６は、第５の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。

本実施形態において、マルチキャピラリ電気泳動装置５００の光検出器５０４は、データをサンプリングする際に、２０個の波長λ（０）～λ（１９）における信号強度を計測するものとする。ここではあくまで一例として２０個の波長を挙げたが、実際には波長λ（０）～λ（１９）のそれぞれの波長の近傍の信号強度の加算平均をとってもよい。また、マトリクススタンダードはＣＸＲで標識され、実サンプルはＲＯＸで標識されているものとする。これらの蛍光色素の蛍光スペクトルは既知であり、しかも一致しない。

本実施形態の光検出器５０４は２０個の波長のみを検出するので、ＣＸＲの蛍光スペクトルは２０個の要素からなるベクトルＶｍで表され、ＲＯＸの蛍光スペクトルは２０個の要素からなるベクトルＶｓで表される。

ステップＳ５１において、測定値演算部５０３２は、ベクトルＶｍとベクトルＶｓの相関係数が最大になるように２０個の波長（信号取得幅）を定義する。この時、スペクトルの極大あるいはその近傍に重みをつけてもよい。また、実用上差し支えなければ、相関係数を充分に高くすればよく、必ずしも最大値にする必要はない。つまり、相関係数が所定値以上となるように信号取得幅を定義する。

ステップＳ５２において、オペレータは、ステップＳ１と同様にしてスペクトラルキャリブレーションを行う。この時、測定値演算部５０３２は、２０個の要素からなるベクトルＶｃを算出する。

ステップＳ５３において、オペレータは、ステップＳ１２と同様にして実サンプルの泳動を行う。ここで測定値演算部５０３２が取得するベクトルｆは、光検出器５０４が観測した信号強度を表している。その要素ｆ０～ｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）～λ（１９）における信号強度を表している。

ステップＳ５４において、補正部５０３５は、蛍光強度を算出する。具体的には、各々の時刻における各々のキャピラリ５１９のスペクトルに対し、波長λ（０）～λ（１９）のそれぞれの波長における、各蛍光色素の強度比率を掛けて足し合わせればよい。これを行列で表現すると以下の数式４のようになる。

ベクトルｃは、蛍光強度ベクトルである。ベクトルｆは、光検出器５０４が検出した信号強度を表している。その要素ｆ０～ｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）～λ（１９）における信号強度を表している。

なお、第１の実施形態のステップＳ１４で述べたように、光検出器５０４で検出される、個々の波長λ（０）～λ（１９）の計測信号には、蛍光色素による信号に加え、キャピラリ内に充填されるポリマからのラマン散乱光がベースライン信号として含まれている。このため、ベクトルｆの算出の際には、このベースライン信号を予め除去しておく必要がある。ベースライン除去はステップＳ１４に記載の方法で行っても良い。

ステップＳ５５において、補正部５０３５は、ステップＳ１５と同様にしてピーク検出を行う。

以上の操作により、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）で蛍光色素が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。

＜技術的効果＞
以上のように、第５の実施形態において、光検出器５０４は、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの相関係数が大きくなるような波長幅でキャピラリ５１９からの光を検出する。これにより、泳動時にマトリクスＭ（ｒ）ｋを必要としないため、分析に必要な時間を短縮でき、しかも演算制御回路５０３への負担を軽減できる。

＜実験例３＞
以下の手順で第５の実施形態の効果を確認した。

（装置）
第１の実施形態で説明したマルチキャピラリ電気泳動装置５００（図５）を用いることができる。ただし、本実施形態における一例として、光検出器５０４は５２０ｎｍ～６９０ｎｍまでの間の２０個の波長における信号強度を検出するものとする。本実験例３では、二つのスペクトルの相互相関係数を充分に高くするための信号取得幅は既知であるとする。この２０個分の波長をベクトルで表したものをλｔｅｓｔとする。また対照として、同じ区間を８．９ｎｍずつ等間隔に信号を取得する場合を想定し、この２０個分の波長をベクトルでλｃｔｒｌと表す。以下の数式５は、λｔｅｓｔ及びλｃｔｒｌの要素を示している。

（試料）
スペクトラルキャリブレーション（ステップＳ５２）時のマトリクススタンダードには、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）４Ｃ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に含まれる４本のピークの内、ＣＸＲで標識された１本を用いた。実サンプルの泳動（ステップＳ５３）にはＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｄｙｅ Ｓｅｔ Ｚ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に含まれる４本のピークの内、ＲＯＸで標識された１本を用いた。

（分析手順）
実験例３では、第５の実施形態の検証としてステップＳ５２及びＳ５３はそれぞれ、ステップＳ１１及びＳ１２に記載の要領で行った。泳動時のキャピラリ長は３６ｃｍであり、サンプル注入時の印加電圧は１．６ｋＶであり、泳動時の印加電圧はスペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ５２）と実サンプル泳動時（ステップＳ５３）共に１５ｋＶである。

（実験結果）
図１７Ａは、実験例３で取得される蛍光スペクトルである。図１７Ａには、λｔｅｓｔで得られた蛍光スペクトルが示されている。以下の数式６は、λｔｅｓｔにおけるベクトルＶｍとベクトルＶｓの信号強度を示している。数式６に示すように、λｔｅｓｔ（第５の）実施形態を適用した場合のベクトルＶｍとベクトルＶｓの相関係数（ｃｏｒｒ．）は０．９９８となった。

図１７Ｂは、実験例３の対照実験で取得される蛍光スペクトルである。図１７Ｂには、λｃｔｒｌで得られた蛍光スペクトルが示されている。以下の数式７は、λｃｔｒｌにおけるベクトルＶｍとベクトルＶｓの信号強度を示している。数式７に示すように、λｃｔｒｌの場合のベクトルＶｍとベクトルＶｓの相関係数（ｃｏｒｒ．）は０．９８６となった。

数式６及び７から明らかなように、λｔｅｓｔ即ち第５の実施形態を適用した場合に、対照（λｃｔｒｌ）よりも相互相関係数が高くなっていることが分かる。

［第６の実施形態］
第１～第３の実施形態では、泳動電圧又は蛍光色素が第２のスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時で異なる場合について説明した。第６の実施形態では泳動電圧及び蛍光色素の両方が異なる場合について説明する。本実施形態では一例として、第１のスペクトラルキャリブレーションに使用するマトリクススタンダードはＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲで標識されているものとする。また、実サンプルはＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識されているものとする。スペクトラルキャリブレーション時の泳動電圧は１５ｋＶとし、実サンプル泳動時の泳動電圧は７．５ｋＶとする。

図１８は、第６の実施形態に係るサンプルの分析方法を示すフローチャートである。

ステップＳ６１において、メーカーは、ステップＳ１と同様にして、マトリクススタンダードを用いてスペクトラルキャリブレーションを行い、測定値演算部５０３２は、マトリクスＭを取得する。泳動電圧は１５ｋＶとする。

ステップＳ６２において、メーカーは、ステップＳ２と同様にして、マトリクスＭ’を取得する。ただし、サンプルにはＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識されたマトリクススタンダードを用いる。この時の泳動電圧は７．５ｋＶである。

ステップＳ６３において、補正係数演算部５０３３は、ステップＳ３と同様にして、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、泳動電圧及び蛍光色素の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。第１の実施形態のステップＳ１で述べたように、実際の運用においてはステップＳ６１及びＳ６２を様々な泳動電圧と蛍光色素の組み合わせで行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。複数の泳動電圧、複数の蛍光色素で泳動した場合は、すべての補正係数マトリクスＫを登録する。

第１の実施形態と同様に、ステップＳ６１～Ｓ６３まではメーカー側でマルチキャピラリ電気泳動装置５００の出荷前に実施され、補正係数マトリクスＫが既に補正係数データベース５０３４に登録されている。装置を購入したオペレータが実際に行う作業は、次のステップＳ６４以降になる。ここで、ステップＳ６３の後、運搬の際にキャピラリ５１９の脱着が行われ、光検出器５０４とキャピラリ５１９の位置関係が変化したものとする。もしステップＳ６３以降にキャピラリ５１９の脱着が行われていないならば、ステップＳ６１で得られたマトリクスＭから、実サンプル泳動（ステップＳ６５）と同じ蛍光色素のものを選択し、後述のマトリクスＭ（ｒ）ｋとすることができる。

ステップＳ６４において、オペレータは、ステップＳ１１と同様にして、第２のスペクトラルキャリブレーションを行い、測定値演算部５０３２は、マトリクスＭ（ｒ）を取得する。ステップＳ６４における泳動電圧及び蛍光色素は、一例として第１のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ６１）と同じとすることができるが、実際には補正係数データベース５０３４に登録されている中から任意のものを選択することができる。

ステップＳ６５において、オペレータは、実サンプルの泳動を行う。ここで使用する泳動電圧と蛍光色素は、一例としてマトリクスＭ’の取得時（ステップＳ６２）と同じであるが、実際には補正係数データベース５０３４に登録されているものから任意のものを選択することができる。

ステップＳ６６～Ｓ６８についても、第１の実施形態で説明したステップＳ１３～Ｓ１５（図９）と同様であるので、説明を省略する。

以上の操作により、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ６１）と実サンプル泳動時（ステップＳ６５）で使用する蛍光色素と泳動電圧の双方が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定の蛍光色素と泳動電圧の組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ６４）と実サンプル泳動（ステップＳ６５）の泳動電圧と蛍光色素を任意に変更することができる。

＜技術的効果＞
以上のように、第６の実施形態において、マルチキャピラリ電気泳動装置５００の出荷前に、異なる蛍光色素のセットで標識されたサンプルを用いて、異なる泳動電圧で第１のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルの泳動が行われ、蛍光色素及び泳動電圧の組み合わせ毎に、スペクトルの乖離を補正するための補正係数マトリクスＫが取得され、補正係数データベース５０３４に登録される。装置を購入したオペレータは、補正係数データベース５０３４に登録されている任意の蛍光色素及び泳動電圧の組み合わせで、第２のスペクトラルキャリブレーション及び実サンプルの泳動を実施することができる。これにより、本実施形態は、第１～第３の実施形態と比較して、オペレータの用いる蛍光色素や泳動電圧の自由度が向上する。

［第７の実施形態］
第１～第３の実施形態では、泳動電圧又は蛍光色素が第２のスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時で異なる場合について説明したが、第７の実施形態ではポリマの化学的特性又は組成が異なる場合について説明する。上述したように、ポリマはあくまで分離媒体の一例であるので、同じ運用がポリマ以外の分離媒体に適用できることは言うまでもない。

第７の実施形態に係る分析方法は、例えば第１の実施形態と同様のフローで実施することができるので、以下では相違点のみ説明する。

第７の実施形態では一例として、スペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１及びＳ１１）に使用するポリマは４％のポリアクリルアミドを含有するものとする。さらに実サンプル泳動時（ステップＳ２及びＳ１２）に使用するポリマは７％のポリアクリルアミドを含有するものとする。マトリクススタンダードと実サンプルはいずれもＲ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＭＲ、ＲＯＸで標識され、泳動電圧はいずれも１５ｋＶとする。

第１の実施形態で述べたように、実際の運用においてはステップＳ１及びＳ２を様々な種類のポリマの組み合わせで行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。ここで言う様々な種類のポリマとは、一例として様々な濃度のポリアクリルアミドを含有するポリマである。

ステップＳ３において、補正係数演算部５０３３は、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、ポリマの種類などの情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。複数のポリマを用いて泳動した場合はすべての補正係数マトリクスＫを登録する。

本実施形態の手法によれば、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）でポリマの組成が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定の組成の組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）のポリマの化学的特性を任意に変更することができる。また本実施形態の手法はポリマの組成が異なる場合にも適用できる。

［第８の実施形態］
第１～第３の実施形態では、泳動電圧又は蛍光色素がスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時で異なる場合について説明したが、第８の実施形態ではキャピラリ５１９の長さが異なる場合について説明する。

第８の実施形態に係る分析方法は、例えば第１の実施形態と同様のフローで実施することができるので、以下では相違点を説明する。

第８の実施形態では一例として、スペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１及びＳ１１）時のキャピラリ長は５０ｃｍとし、実サンプル泳動時（ステップＳ２及びＳ１２）のキャピラリ長は３６ｃｍとする。

第１の実施形態で述べたように、実際の運用においてはステップＳ１及びＳ２を様々なキャピラリ長の組み合わせで行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。

ステップＳ３において、補正係数演算部５０３３は、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、キャピラリ長の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。複数のキャピラリ長で泳動した場合はすべての補正係数マトリクスＫを登録する。

本実施形態の手法によれば、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）でキャピラリ長が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定の長さの組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）のキャピラリ長を任意に変更することができる。

［第９の実施形態］
第１～第３の実施形態では、泳動電圧又は蛍光色素がスペクトラルキャリブレーション時と実サンプル泳動時で異なる場合について説明したが、第９の実施形態では陽極バッファの組成又は化学的特性が異なる場合について説明する。

第９の実施形態に係る分析方法は、例えば第１の実施形態と同様のフローで実施することができるので、以下では相違点を説明する。

第９の実施形態では一例として、スペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１及びＳ１１）に使用する陽極バッファのｐＨが７．５であるとする。実サンプル泳動時（ステップＳ２及びＳ１２）の陽極バッファのｐＨが８．０であるとする。

第１の実施形態で述べたように、実際の運用においてはステップＳ１及びＳ２を様々なｐＨの陽極バッファの組み合わせで行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。

ステップＳ３において、補正係数演算部５０３３は、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、陽極バッファのｐＨの情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。複数のｐＨの陽極バッファを用いて泳動した場合はすべての補正係数マトリクスＫを登録する。

本実施形態の手法によれば、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）で陽極バッファのｐＨが異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定のｐＨの組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）の陽極バッファのｐＨを任意に変更することができる。また本実施形態の手法は陽極バッファの組成が異なる場合にも適用できる。

［第１０の実施形態］
第９の実施形態では、陽極バッファの化学的特性が異なる場合について説明したが、第１０の実施形態では陰極バッファの組成又は化学的特性が異なる場合について説明する。

第１０の実施形態では一例として、スペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１及びＳ１１）に使用する陰極バッファのｐＨが７．５であるとする。実サンプル泳動時（ステップＳ２及びＳ１２）の陰極バッファのｐＨが８．０であるとする。その他の点は第９の実施形態と同様であるので、説明を省略する。

本実施形態の手法によれば、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）で陰極バッファのｐＨが異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定のｐＨの組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）の陽極バッファのｐＨを任意に変更することができる。また本実施形態の手法は陰極バッファの組成が異なる場合にも適用できる。

［第１１の実施形態］
第９の実施形態では陽極バッファ、第１０の実施形態では陰極バッファの化学的特性が異なる場合について説明したが、第１１の実施形態ではサンプル溶液の化学的特性又は組成が異なる場合について説明する。

第１１の実施形態に係る分析方法は、例えば第１の実施形態と同様のフローで実施することができるので、以下では相違点を説明する。

第１１の実施形態では一例として、スペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１及びＳ１１）に使用するマトリクススタンダードの溶液のｐＨが７．５であるとする。ステップＳ２及びＳ１２で用いる実サンプルの溶液のｐＨが８．０とする。

第１の実施形態で述べたように、実際の運用においてはステップＳ１及びＳ２を様々なｐＨのサンプルの組み合わせで行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。

ステップＳ３において、補正係数演算部５０３３は、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、サンプル溶液のｐＨの情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。複数のｐＨのサンプルを用いて泳動した場合はすべての補正係数マトリクスＫを登録する。

本実施形態の手法によれば、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）でサンプル溶液のｐＨが異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは特定のｐＨのサンプル溶液の組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）のサンプル溶液のｐＨを任意に変更することができる。また本実施形態の手法はサンプル溶液の組成が異なる場合にも適用できる。

［第１２の実施形態］
第１２の実施形態では、恒温槽５０５の温度が異なる場合について説明する。

第１２の実施形態に係る分析方法は、例えば第１の実施形態と同様のフローで実施することができるので、以下では相違点を説明する。

第１２の実施形態では一例として、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１及びＳ１１）の恒温槽５０５の温度が４２℃であるとする。そして実サンプル泳動時（ステップＳ２及びＳ１２）の恒温槽５０５の温度が６０℃であるとする。

第１の実施形態で述べたように、実際の運用においてはステップＳ１及びＳ２を様々な温度の組み合わせで行い、複数のマトリクスＭ及びＭ’を取得する。

ステップＳ３において、補正係数演算部５０３３は、マトリクスＭ及びＭ’に基づいて補正係数マトリクスＫを算出する。補正係数マトリクスＫは、恒温槽５０５の温度の情報と共に補正係数データベース５０３４に登録される。恒温槽５０５を複数の温度として泳動した場合はすべての補正係数マトリクスＫを登録する。

本実施形態の手法によれば、スペクトラルキャリブレーション時（ステップＳ１）と実サンプル泳動時（ステップＳ１２）で恒温槽５０５の温度が異なっていても、基準スペクトルと実サンプルの蛍光スペクトルが乖離せず、実サンプルの蛍光強度が正しく算出される。ここでは恒温槽５０５の温度の特定の組み合わせを例示したが、実際にはオペレータは補正係数データベース５０３４に登録されている範囲内で、第２のスペクトラルキャリブレーション（ステップＳ１１）と実サンプル泳動（ステップＳ１２）の恒温槽５０５の温度を任意に変更することができる。

［顕現性について］
本開示の侵害を確認する手法の一例として、以下の検証が挙げられる。図９を基に説明する。

対象の装置において、ステップＳ１１（スペクトラルキャリブレーション）を行う。この時泳動電圧は１５ｋＶでありながら、実際には７．５ｋＶ相当になるような泳動速度で分析する。泳動速度はサンプルに適切な量の塩を加えることで調整できる。あるいは、装置上では１５ｋＶと登録しておきながら、実際には７．５ｋＶで泳動しても良い。その後、第１の実施形態の手法に従い、実サンプルを分析する（ステップＳ１３～Ｓ１５）。この時、疑似ピークが第１の実施形態の時よりも増大するようであれば、対象の装置が泳動電圧ごとに定められた補正係数をマトリクススタンダードの蛍光スペクトルに適用している可能性が高い。

また、以下の様な検証も可能である。図１４を基に説明する。この場合、ステップＳ３１において実際とは異なる蛍光色素を登録する。実サンプル分析後（ステップＳ３４～Ｓ３６）に、プルアップが第３の実施形態よりも増大している様であれば、蛍光色素毎に定められた補正係数をマトリクススタンダードの蛍光スペクトルに適用している可能性が高い。

［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。

１０１…装置本体、１０２…制御用コンピュータ、１０３…演算制御回路、１０４…光検出器、１０５…恒温槽、１０６…キャピラリアレイ、１０７…光源、１０８…光照射部、１０９…ロードヘッダ、１１０…陰極端、１１１…陰極用バッファ容器、１１２…サンプル容器、１１３…ポリマカートリッジ、１１４…陽極用バッファ容器、１１５…陽極、１１６…直流電源、１１７…アレイヘッダ、１１８…搬送機、１１９…キャピラリ、１２０…シリンジ機構、１２１…尖部、１２２…ポリマカートリッジ上部、１２３…加熱冷却機構、２０１…レーザ光、２０２…反射ミラー、２０３…集光レンズ。

Claims (13)

1. 電気泳動装置であって、
   サンプルの電気泳動路と、
   前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光する分光素子と、
   前記分光素子により分光された光を検出する光検出器と、
   前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求める演算部と、を備え、
   前記演算部は、
   泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正し、
   前記補正係数が、特定の前記電気泳動装置を用いて取得されたものである
   ことを特徴とする電気泳動装置。
2. サンプルの電気泳動路と、
   前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光する分光素子と、
   前記分光素子により分光された光を検出する光検出器と、
   前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求める演算部と、を備え、
   前記演算部は、
   泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正し、
   前記演算部は、第１の蛍光色素の第１のスペクトルと、第２の蛍光色素の第２のスペクトルとの間の相対関係を表す数値を、前記補正係数として算出し、
   前記演算部は、前記第１の蛍光色素と同じ第３の蛍光色素の第３のスペクトルに対して前記補正係数を適用することにより、前記第３のスペクトルを前記相対関係にしたがって補正する
   ことを特徴とする電気泳動装置。
3. サンプルの電気泳動路と、
   前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光する分光素子と、
   前記分光素子により分光された光を検出する光検出器と、
   前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求める演算部と、を備え、
   前記演算部は、
   泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正し、
   前記演算部は、第１の泳動条件で取得される第１のスペクトルと、第２の泳動条件で取得される第２のスペクトルとの間の相対関係を表す数値を、前記補正係数として算出し、
   前記演算部は、前記第１の泳動条件と同じ第３の泳動条件で取得される第３のスペクトルに対して前記補正係数を適用することにより、前記第３のスペクトルを前記相対関係にしたがって補正する
   ことを特徴とする電気泳動装置。
4. 前記補正係数が、前記サンプルの電気泳動時の電圧毎に定められていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の電気泳動装置。
5. 前記補正係数が、前記サンプルの電気泳動時のバッファのｐＨ又は前記サンプルの溶液のｐＨ毎に定められていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の電気泳動装置。
6. 前記補正係数が、前記電気泳動路の長さ毎に定められていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の電気泳動装置。
7. 前記電気泳動路を収容する恒温槽をさらに備え、
   前記補正係数が、前記恒温槽の設定温度毎に定められていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の電気泳動装置。
8. 前記補正係数が、前記電気泳動路内の分離媒体の組成又は化学的特性毎に定められていることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の電気泳動装置。
9. 複数の前記電気泳動路をさらに備え、
   前記演算部は、前記複数の前記電気泳動路のそれぞれに対し前記補正係数を設定することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の電気泳動装置。
10. サンプルの電気泳動路と、
    前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光する分光素子と、
    前記分光素子により分光された光を検出する光検出器と、
    前記光検出器の信号に基づき、前記光の信号強度を算出する演算部と、を備え、
    前記光検出器は、
    複数の蛍光色素のスペクトル間の相関係数が所定値以上となるように設定された信号取得幅で、前記信号を取得することを特徴とする電気泳動装置。
11. 電気泳動装置が備える電気泳動路においてサンプルを電気泳動することと、
    分光素子により、前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光することと、
    光検出器により、前記分光素子により分光された光を検出することと、
    演算部により、前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求めることと、を含み、
    前記光のスペクトルを求めることは、
    前記演算部により、泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正することを含み、
    前記補正係数が、特定の前記電気泳動装置を用いて取得されたものである
    ことを特徴とする分析方法。
12. 電気泳動路においてサンプルを電気泳動することと、
    分光素子により、前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光することと、
    光検出器により、前記分光素子により分光された光を検出することと、
    演算部により、前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求めることと、を含み、
    前記光のスペクトルを求めることは、
    前記演算部により、泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正することを含み、
    前記演算部は、第１の蛍光色素の第１のスペクトルと、第２の蛍光色素の第２のスペクトルとの間の相対関係を表す数値を、前記補正係数として算出し、
    前記演算部は、前記第１の蛍光色素と同じ第３の蛍光色素の第３のスペクトルに対して前記補正係数を適用することにより、前記第３のスペクトルを前記相対関係にしたがって補正する
    ことを特徴とする分析方法。
13. 電気泳動路においてサンプルを電気泳動することと、
    分光素子により、前記電気泳動路内の前記サンプルからの光を分光することと、
    光検出器により、前記分光素子により分光された光を検出することと、
    演算部により、前記光検出器からの信号に基づき、前記光のスペクトルを求めることと、を含み、
    前記光のスペクトルを求めることは、
    前記演算部により、泳動条件又は蛍光色素毎に定められた補正係数を用いて前記スペクトルを補正することを含み、
    前記演算部は、第１の泳動条件で取得される第１のスペクトルと、第２の泳動条件で取得される第２のスペクトルとの間の相対関係を表す数値を、前記補正係数として算出し、
    前記演算部は、前記第１の泳動条件と同じ第３の泳動条件で取得される第３のスペクトルに対して前記補正係数を適用することにより、前記第３のスペクトルを前記相対関係にしたがって補正する
    ことを特徴とする分析方法。

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