JP3692983B2 - 蛍光測定方法及び蛍光測定装置 - Google Patents
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- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，核酸，蛋白質等の生体高分子の分析に用いる電気泳動装置及び電気泳動方法に使用される蛍光測定方法及びに蛍光測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ励起により蛍光を検出する電気泳動方法は，高感度と簡便さから，核酸や蛋白質等の生体高分子を分析するための基本的な技術の一つとして広く用いられている。近年，生体高分子分析の分野では，主流であったスラブゲル電気泳動に変わり，泳動時に発生するジュール熱が少ないため高電圧が使用でき，その結果，より短時間で分析できるキャピラリー電気泳動が普及しつつある。電気泳動路の長さは一般的に５０ｃｍ〜２０ｃｍであるが，分析時間の短縮と，分析システムの小型化のため，泳動路を短縮するため様々な技術が開発されている。
【０００３】
フォトリソグラフィーの技術を応用して基板上にキャピラリー状の流路を形成し，その流路で電気泳動することにより，泳動路長０．７５ｃｍ〜２．２ｃｍで複数の蛍光標識がなされたアミノ酸を分離する方法が，Science,261,895-897（1993）（従来技術−１）に記載されている。
【０００４】
単分子検出が行われる条件下では，実質的な泳動路長０．２５ｍｍで数種類のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が分離可能であることが，Anal. Chem.,67,3181〜3186（1995）（従来技術−２）に記載されている。
【０００５】
７００μｍの周期で配置される３００μｍの幅をもつ５５個の検出スリットを介して，泳動路を泳動する試料から発する蛍光を経時的に検出して，蛍光強度のフーリエ変換により，試料の速度を測定する方法が，Anal. Chem.,71,2130〜2138（1999）（従来技術−３）に記載されている。
【０００６】
蛍光物質を含む試料中に励起光の干渉縞を形成し，蛍光物質から放射された蛍光のゆらぎの相関関数を測定することにより，試料の流速を求める方法（蛍光相関法（ＦＣＳ:Fluorescence correlations）と呼ばれる手法の１種）が特開昭５３−４０５８６号公報（従来技術−４）に記載されている。
【０００７】
従来技術１と同様の構成で泳動路長を５ｍｍに短縮した時，理論段数が５８００となることが，Anal. Chem.,65,2637-2642(1993)（従来技術−５）に記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一般的な条件での従来技術の電気泳動では，電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅により，試料の泳動分離が制限され，ｍｍオーダーの泳動路長で，移動度が近接した試料に対して良好な分離を得るのは難しいという課題があった。実際に，従来技術−１では，泳動路長２．２ｃｍでは移動度の差が１０％以下の試料を分離しているが，泳動路長０．７５ｃｍでは移動度の差が２０％以上の試料しか分離できていない。
【０００９】
従来技術−３に於いても，検出スリットの周期は，注入した試料のバンド幅によって制限され，無制限に小さくできず，検出スリットの個数もまた，分離性能を左右するため任意に減らせないという課題がある。従来技術−３での検出スリットの周期は０．７ｍｍ，検出スリットの個数は５５であり，実質的な泳動長は約４ｃｍであり，従来技術−１での泳動路長より長くなっている。
【００１０】
従来技術−１，３では狭いバンド幅で試料を注入するため，基板上に流路を２本以上形成し，十字に交差させる必要があった。
【００１１】
また，これまで従来技術−４に記載される技術の電気泳動分野への利用は検討されたことがない。本発明では，従来技術４に記載される技術を改良してこれを電気泳動に適用することを検討した。
【００１２】
本発明の目的は，上記課題を解決し，電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅に制限されずに，ｍｍオーダーの泳動路長で，異なる移動度を持つ複数種類の試料を良好に分離検出できる蛍光測定方法及び蛍光測定装置を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の蛍光測定方法では，試料を電気泳動し，泳動路で試料を検出する検出領域の全体に連続して分布させて，検出領域に試料の泳動方向（電場の方向）に，試料分子のサイズより大きな周期で，周期的に変化する強度分布をもつ励起光を照射するか，または，検出領域と蛍光を検出する検出器との間に，試料分子のサイズより大きな周期で，周期的に透過率分布をもつスリットを配置して，検出領域で試料から発生する蛍光のゆらぎのパワースペクトルを求める。あるいは，蛍光を検出する検出器としてアレイ状のセンサを使用して，検出領域から発生する蛍光の泳動方向での分布を測定し，アレイ状のセンサの各検出素子で検出された蛍光の強度と所定の周期関数との積和を求め，積和のパワースペクトルを求める。
発明の原理の説明
まず，本発明の原理を以下に説明する。単色の励起光で照射される１種類の蛍光体で標識された試料を想定し，励起光により試料から発生する蛍光を光電子増倍管（photomultiplier，ＰＭ）で検出することを考える。ＰＭの出力電流ｉ（ｔ）は，位置ｒベクトル＝ｒ（ｘ，ｙ，ｚ），時刻ｔに於ける試料のモル濃度Ｃ（ｒ，ｔ）と，位置ｒに於ける励起光強度と位置ｒにある試料から発生する蛍光がＰＭの光電面に集光される効率との積Ｉ（ｒ）を用いて，（数１）により表される。
【００１４】
【数１】
ｄｒ＝ｄｘｄｙｄｚ，εは試料のモル吸光係数，Ｑは試料の蛍光量子収率，ｈはプランク定数，ｃは光速，λは励起光の波長，ηはＰＭの量子効率，ｅは電気素量，ｇはＰＭの電流増倍率である。ｇ＝１とすることにより，（数１）はフォトダイオードにも適用できる。ＦＣＳ（Fluorescence correlations:蛍光相関法）は，試料の濃度分布が熱平衡状態にある時のｉ（ｔ）のゆらぎδｉ（ｔ）＝ｉ（ｔ）−〈ｉ（ｔ）〉の解析に基づいている。なお，〈Ｘ（ｔ）〉はＸ（ｔ）のアンサンブル平均を表す。ゆらぎδｉ（ｔ）の時間依存性を表す基本量である，規格化された自己相関関数Ｇ（ｔ）を（数２）により定義する。
【００１５】
【数２】
Ｇ（ｔ）＝〈δｉ（０）δｉ（ｔ）〉／〈（δｉ（ｔ））２〉 …（数２）
更に，δｉ（ｔ）を周波数領域で解析するため，δｉ（ｔ）の規格化されたパワースペクトルＳ（ν）をδｉ（ｔ）／〈（δｉ（ｔ））２〉１／２のパワースペクトル（より詳しくは片側パワースペクトル）として定義する。Wiener-Khintchineの定理により，Ｓ（ν）は（数３）により表される。積分∫の下限は０，上限は∞である。
【００１６】
【数３】
Ｓ（ν）＝４∫Ｇ（ｔ）ｃｏｓ（２πνｔ）ｄｔ …（数３）
以下では，Ｉ（ｒ）として，（数４）で表されるように，ｘ軸方向に幅Ｌ（ｅ−２幅）のガウス状包絡線を持ち，周期ｐで正弦的に振動し，ｙ，ｚ方向にそれぞれ幅Ｗ（ｅ−２幅），Ｈ（ｅ−２幅）のガウス状プロファイルを持つ分布を考える。但し，（数５）の条件を満足するものとする。
【００１７】
【数４】
【００１８】
【数５】
１μｍ＜ｐ《Ｌ，Ｗ，Ｈ …（数５）
このようなＩ（ｒ）は，例えば，光軸をｘｙ平面上に置くｙ軸に関して対称な２本の楕円ガウシアンビームを，原点近傍に置かれた試料セル内で交錯させて干渉縞を形成し，ｚ軸方向からｙ方向にガウシアンの透過率プロファイルを持つスリットを介して蛍光を検出することにより実現できる。試料がｘ軸方向に一様な速度Ｖで動いており，試料の並進拡散係数Ｄに対して（数６）が満たされる場合には，（数４）のＩ（ｒ）に対するＧ（ｔ）は，（数７）によりで与えられる。なお，（数７）導出の詳細は後述する。
【００１９】
【数６】
Ｄ≪ＶＬ／４ …（数６）
【００２０】
【数７】
（数７）の右辺の第１項が示すように，Ｇ（ｔ）は試料の速度Ｖに比例した周波数Ｖ／ｐで振動する成分を持つ。従って，パワースペクトルＳ（ν）は試料の速度に比例した周波数のピークを持つことになる。もし試料の速度Ｖが電気泳動に由来するものであれば，Ｓ（ν）のグラフは従来の電気泳動図に相当する。
【００２１】
図１は，本発明の原理を説明する模式図である。試料１−１〜１−Ｎは泳動媒体（バッファ溶液，ゲル，高分子等）で満たされた電気泳動路２の検出領域全体にわたって分布しており，電源３と泳動媒体に接する電極４，５によって所定の速度Ｖで電気泳動される。検出領域は試料の泳動方向に周期ｐで強度が変化する励起光６で照射され，励起光により試料から発生する蛍光は，検出器７で検出され，検出器７の出力電流のゆらぎδｉ（ｔ）はスペクトル解析装置８により解析され，求められたスペクトルが表示される。
【００２２】
なお，（数４）のような周期的に変化するＩ（ｒ）を近似的に実現する代表的な方法は，大別して次の３通りである。
（１）図１に示すように，干渉縞等により励起光の強度分布に周期的な変化を与える。
（２）検出領域と検出器の間に透過率が周期的に変化するスリットを設け，このスリットを介して試料から発生する蛍光を検出する。
（３）蛍光を検出する検出器としてイメージセンサを用い，蛍光強度の分布を時間的・空間的に分解して計測してＣ（ｒ，ｔ）を求めて，周期的に変化するＩ（ｒ）に対する（数１）の右辺を計算する。
本発明に於ける分離効率の説明
異なる速度で移動する複数種類の試料を含む場合，ＰＭの出力電流及びそのゆらぎは各試料に由来する光電流とそのゆらぎの和となる。試料は十分希薄で試料間の相互作用は無視できるとすれば，ゆらぎの和のパワースペクトルもまた，各試料に由来するゆらぎのパワースペクトルの和となる。従って，適切な条件下では，Ｓ（ν）のグラフ上で，試料の種類と同数の異なる中心周波数を持つピークを分離して検出できる。以下では，本発明の方法による試料の分離効率について考察する。そのため分離効率を表す指標である理論段数（number of theoretical plate，ＮＴＰ）を導入する。ＮＴＰを，Ｓ（ν）のＶ／ｐに位置するピークの半値全幅（full width at half maximum，ＦＷＨＭ）を用いて，（数８）により定義する。
【００２３】
【数８】
ＮＴＰ＝（８ｌｎ２）｛Ｖ／（ｐ×ＦＷＨＭ）｝２ …（数８）
（数７）から明らかなように，Ｓ（ν）はガウシアンとローレンチアンの畳み込みとなるため，ＦＷＨＭを解析的に表現することは難しい。そこで，まずコヒーレンス時間τｃを，（数７）の右辺の第１項の振動部分の振幅がｅ−１になる時間として定義し，同一のコヒーレンス時間を持つ純粋なガウシアンのフーリエ変換でＳ（ν）を近似する。この近似によれば，ＮＴＰは（数９）となる。ｐ０は（数１０）により定義する。
【００２４】
【数９】
【００２５】
【数１０】
ｐ０＝π（ＤＬ／Ｖ）１／２ …（数１０）
図２（Ａ）に示す曲線は，（ＮＴＰ）１／２／（Ｌ／ｐ０）をｐ／ｐ０の関数として示す。この曲線から，ｐ以外のパラメータが固定された条件で良い分離を得るには，ｐ≒ｐ０とするのが望ましく，（ｐ／ｐ０）＝３１／４の時，分離効率は最大となる。
【００２６】
例えば，Ｌ＝１ｍｍ，ｐ＝ｐ０＝１０μｍとすると，（数９）より，ＮＴＰ≒（Ｌ／ｐ０）２／１．１８となるので，ＮＴＰ≒８４７０に達し，従来技術−５に於いて５ｍｍの泳動路長で得られている理論段数５８００の約１．５倍となる。
【００２７】
一般に，等しいＦＷＨＭをもつ２つのピークに対して，ピークの中心間の距離がＦＷＨＭ／（２ｌｎ２）１／２より大である時，２つのピークはほとんど完全に分離していると定義されている。μＡＶを２つの試料の移動度の平均値，Δμを２つの試料の移動度の差とする時，異なる移動度をもつ２種類の試料に対して，ほぼ完全な分離を得る条件は，（数１１）により表される。例えば，Δμ／μＡＶ＝０．１の場合，ＮＴＰ≧３６００を満たす必要がある。
【００２８】
【数１１】
ＮＴＰ≧３６（μＡＶ／Δμ）２ …（数１１）
本発明に於ける信号対雑音比の説明
次に，本発明の方法に於ける信号対雑音比（signal to noise ratio，ＳＮＲ）について考察する。検出される試料の分子数の平均をＮとすると，（数１２）が成り立つ。
【００２９】
【数１２】
〈｛δｉ（ｔ）｝２〉＝〈｛ｉ（ｔ）｝２〉／Ｎ …（数１２）
ＰＭの出力電流は，そのパワースペクトルを求めるため，多数の異なった中心周波数を持つ透過帯域幅Δνのバンドパスフィルタに入力される（現在では，実際にはデータの標本化と離散フーリエ変換がこのようなマルチフィルタの役目を果たす）。中心周波数νのフィルタが出力する信号電流ｉＳ（ｔ）の２乗平均値は（数１３）となる。《｛Ｘ（ｔ）｝２》はＸ（ｔ）の２乗平均値を表わすものとする。
【００３０】
【数１３】
《ｉＳ（ｔ）２》＝〈｛δｉ（ｔ）｝２〉Ｓ（ν）Δν …（数１３）
また，ショット雑音電流ｉＮＳ（ｔ）と熱雑音電流ｉＮＴ（ｔ）の２乗平均値はそれぞれ，（数１４），（数１５）となる。ｅは電気素量，ｉＢ（ｔ）はＰＭの暗電流と蛍光以外の背景光によって誘起される光電流の和，ｋＢはボルツマン定数，Ｔは絶対温度，Ｒはフィルタ出力に接続される負荷抵抗である。（数１３）〜（数１５）より，ＳＮＲは（数１６）となる。
【００３１】
【数１４】
【００３２】
【数１５】
《｛ｉＮＴ（ｔ）｝２》＝４ｋＢＴＲ−１Δν …（数１５）
【００３３】
【数１６】
《｛ｉＮＳ（ｔ）｝２》≫《｛ｉＮＴ（ｔ）｝２》，かつ，〈ｉ（ｔ）〉≫〈ｉＢ（ｔ）〉と仮定し，（数１２）の関係を用いると，（数１７）が得られる。ｉＭは（数１８）により定義する。ｉＭは，１種類の試料による蛍光によってＰＭの陰極に誘起される光電流である。
【００３４】
【数１７】
ＳＮＲ＝Ｓ（ν）ｉＭ／（２ｅ） …（数１７）
【００３５】
【数１８】
ｉＭ＝〈ｉ（ｔ）〉／（ｇＮ） …（数１８）
（数１８）から，Ｎが十分大きい極限ではＳＮＲはＮによらず一定であり，その値は単一分子あたりの光電流で決まる。また，分離効率を評価した時と同様の近似を行うと，Ｓ（ν）のν＞０に於ける極大値ＳＭＡＸ≒Ｓ（Ｖ／ｐ）は，（数１９）により表される。
【００３６】
【数１９】
図２（Ｂ）に示す曲線は，｛π１／２Ｌ／（６Ｖ）｝で規格化したＳｍａｘのｐ／ｐ０に対する依存性を示す。ＳＮＲの点からはｐ≧ｐ０が望ましい。従って，分離効率及びＳＮＲを両立させる最も好適な条件として，（数２０）が得られる。
【００３７】
【数２０】
ｐ≒ｐ０ …（数２０）
図２（Ａ），図２（Ｂ）から，分離効率及びＳＮＲを極端に劣化させることなく，種類の異なる試料を分離して検出するためには，１≦ｐ／ｐ０≦５を満たす必要がある。
（数７）の導出の詳細な説明
以下，（数７）の導出の詳細な説明を行なう。位置ベクトルｒ＝ｒ（ｘ，ｙ，ｚ），ｄｒ＝ｄｘｄｙｄｚ，ベクトル変数ｑ＝ｑ（ｑｘ，ｑｙ，ｑｚ），ｄｑ＝ｄｑｘｄｑｙｄｑｚとして，Ｉ（ｒ）の空間フーリエ変換を（数２１）に示すＩ（ｑ），（数２２）に示す濃度のゆらぎδＣ（ｒ，ｔ）の空間フーリエ変換の相関関数を（数２３）に示すＦ（ｑ，ｔ）とすると，（数２４）が成り立つ。（数２１），（数２２）に於いて，ｊは虚数単位である。
【００３８】
【数２１】
Ｉ（ｑ）＝∫Ｉ（ｒ）ｅｘｐ（ｊｑ・ｒ）ｄｒ …（数２１）
【００３９】
【数２２】
δＣ（ｑ，ｔ）＝∫δＣ（ｒ，ｔ）ｅｘｐ（ｊｑ・ｒ）ｄｒ …（数２２）
【００４０】
【数２３】
Ｆ（ｑ，ｔ）＝〈δＣ（ｑ，０）δＣ（ｑ，ｔ）〉 …（数２３）
【００４１】
【数２４】
以下では，計算の見通しを良くするため，ｋ＝２π／ｐ，σｘ＝Ｌ／４，σｙ＝Ｗ／４，σｚ＝Ｈ／４，τｉ＝σｉ／Ｄ（ｉ＝ｘ，ｙ，ｚ）とおく。（数７）のＩ（ｒ）に対しては，（数２５），（数２６）とおくことにより，Ｉ（ｑ）は（数２７）により表される。
【００４２】
【数２５】
【００４３】
【数２６】
【００４４】
【数２７】
Ｉ（ｑ）＝Ｉ０Ｉｘ（ｑｘ）Ｉｙ（ｑｙ）Ｉｚ（ｑｚ） …（数２７）
また，ｊを虚数単位として，（数２８）のように定義すると，Ｆ（ｑ，ｔ）は（数２９）となる。
【００４５】
【数２８】
Ｆｘ（ｑｘ，ｔ）＝ｅｘｐ（ｊｑｘＶｔ−ｑｘ ２Ｄｔ），
Ｆｉ（ｑｉ，ｔ）＝ｅｘｐ（−ｑｉ ２Ｄｔ）（ｉ＝ｙ，ｚ） …（数２８）
【００４６】
【数２９】
Ｆ（ｑ，ｔ）＝
Ｆ（ｑ，０）Ｆｘ（ｑｘ，ｔ）Ｆ（ｑｙ，ｔ）Ｆ（ｑｚ，ｔ） …（数２９）
（数５）より│ｑ│＞１０６であるｑに対しては，（数２５），（数２６）よりＩ（ｑ）はほとんど０となる。一方，│ｑ│＞１０６であるｑに対しては，相転移近傍を除き，Ｆ（ｑ，０）はｑによらず一定と見なせる。そこで，Ｇｉ（ｔ）を（数３０）とおけば，Ｇ（ｔ）は（数３１）となる。
【００４７】
【数３０】
【００４８】
【数３１】
Ｇ（ｔ）＝Ｇ（ｔ）ｘＧ（ｔ）ｙＧ（ｔ）ｚ …（数３１）
（数２５）より，│Ｉｘ（ｑｘ）│は（数３２）となるが，σｘｋ≫1なので，大括弧［ ］内は最初の３項以外は無視できる。そこで，積分∫の下限を−∞，上限を＋∞とし，ｊを虚数単位として，Ｂ（ｋ，ｔ）を（数３３）のように定義すると，（数３０）と（数３２）とから，Ｇｘ（ｔ）は（数３４）となる。
【００４９】
【数３２】
…（数３２）
【００５０】
【数３３】
【００５１】
【数３４】
（数４）よりσｘ≪Ｖ／τｘなので，（数３３）は，（数３５）のように近似できる。ｊは虚数単位である。
【００５２】
【数３５】
Ｂ（ｋ，ｔ）＝π１／２σｘ −１×ｅｘｐ［ｊｋＶｔ−ｋ２Ｄｔ−｛Ｖｔ／（２σｘ）｝２］…（数３５）
（数３４）と（数３５）より，Ｇｘ（ｔ）は（数３６）となる。
【００５３】
【数３６】
（数３６）の右辺と，（数７）の右辺は同一である。一方，Ｇｙ（ｔ），Ｇｚ（ｔ）は（数２６），（数２８），及び（数３０）より直ちに求められ，Ｇｉ（ｔ）は（数３７）により表されるが，（数５）より１／（ｋ２Ｄ）≪τｉ（ｉ＝ｙ，ｚ）なので，Ｇｘ（ｔ）が０に減衰する前のｔに対しては，Ｇｙ（ｔ），Ｇｚ（ｔ）は１と見なせる。従って，（数３１）及び（数３６）から（数７）を得ることができる。
【００５４】
【数３７】
Ｇｉ（ｔ）＝｛（１＋（ｔ／τｉ）｝−１／２（ｉ＝ｙ，ｚ） …（数３７）
【００５５】
【発明の実施の形態】
本発明の蛍光測定方法の第１の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，試料の泳動方向で周期的に変化する強度分布を与えた励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射し，試料から発生する蛍光を検出し，蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルを求める。上記強度分布は，単一の光源から放射された励起光を分割して２つの光束とし，２つの光束を上記領域で交錯させて干渉させて生成する，あるいは，励起光を照射する角度方向を所定の周波数で周期的に走査し，所定の周波数の整数倍の周波数で励起光を点滅させて生成する。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，励起光の強度分布の周期をｐとする時，ｐ≒π（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００５６】
本発明の蛍光測定方法の第２の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射し，試料から発生する蛍光による蛍光像を，試料の泳動方向で周期的に変化する透過率分布を持つスリット上に結像して蛍光像を検出し，蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルを求める。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，蛍光像を検出する倍率をＭ，スリットの透過率分布の周期をｐとする時，ｐ≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００５７】
本発明の蛍光測定方法の第３の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射し，試料から発生する蛍光による蛍光像を，試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備するアレイセンサにより検出し，泳動方向に配列される光電変換素子のｉ番目の光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とする時，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，Ｑのパワースペクトルを求める。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，光電変換素子が配列されるピッチをｐ１，蛍光像を検出する倍率をＭ，所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）の周期をｐ２とする時，ｐ１ｐ２≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。試料を電気泳動する複数の電気泳動路のそれぞれの少なくとも一部を同一の平面上に平行に配置し，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を電気泳動路に垂直に照射する。
【００５８】
本発明の蛍光測定装置の第１の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，励起光を発生する光源と，試料の泳動方向で周期的に変化する強度分布を与えた励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射して，試料から発生する蛍光を検出する手段とを有する。蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルは演算装置により求める。単一の光源から放射された励起光を分割して２つの光束とする分割手段を具備し，２つの光束を上記領域で交錯させて干渉させて上記強度分布を生成する，または励起光を照射する角度方向を所定の周波数で周期的に走査する手段と，所定の周波数の整数倍の周波数で励起光を点滅させる手段とによって上記強度分布を生成する，あるいは，励起光を照射する角度方向を所定の周波数で周期的に走査する手段と，所定の周波数の整数倍の周波数で励起光の強度の強弱を変化させる手段とによって上記強度分布を生成する。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，励起光の強度分布の周期をｐとする時，ｐ≒π（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００５９】
本発明の蛍光測定装置の第２の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，試料から発生する蛍光による蛍光像を，試料の泳動方向で周期的に変化する透過率分布を持つスリット上に結像するレンズと，蛍光像を検出する検出器とを有し，スリットが領域と検出器との間に配置される。蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルは演算装置により求められる。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，レンズの倍率をＭ，スリットの透過率分布の周期をｐとする時，ｐ≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００６０】
本発明の蛍光測定装置の第３の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備し，試料から発生する蛍光による蛍光像を検出するアレイセンサと，泳動方向に配列される光電変換素子のｉ番目の光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とする時，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有する。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，光電変換素子が配列されるピッチをｐ１，蛍光像を検出する倍率をＭ，所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）の周期をｐ２とする時，ｐ１ｐ２≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。複数の電気泳動路を具備し，各電気泳動路の少なくとも一部を同一の平面上に平行に配置し，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を各電気泳動路に垂直に照射する。
【００６１】
本発明の蛍光測定装置の第４，第５の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる各電気泳動路の少なくとも一部が同一の平面上に平行に配置される複数の電気泳動路と，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源とを具備する。
【００６２】
本発明の蛍光測定装置の第４の構成では，さらに，試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備し，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を各電気泳動路に垂直に照射して，試料から発生する蛍光による蛍光像を検出する２次元検出器と，泳動方向に配列される光電変換素子のｉ番目の光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とする時，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有する。
【００６３】
本発明の蛍光測定装置の第５の構成では，さらに，試料の泳動方向に配列したＮ１(Ｎ１≧２)個の光電変換素子で構成されたアレイを，試料の泳動方向に直交する方向にＮ２(Ｎ２≧２)列並べて構成され，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を各電気泳動路に垂直に照射して，試料から発生する蛍光による蛍光像を検出する２次元検出器と，蛍光像を光電変換素子の面に結像するレンズと，光電変換素子の２次元配列の試料の泳動方向でｉ番目にあり，光電変換素子の２次元配列の試料の泳動方向と直交する方向でｊ番目にある光電変換素子により検出される蛍光強度をｑｉｊとし，Ｋを絶対値１を含む定数，変数ｉを変数とする所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）とする時，１≦ｎ１<ｎ２≦Ｎ２を満たす整数ｎ１,ｎ２に対し，１≦ｉ≦Ｎ１，ｎ１≦ｊ≦ｎ２を満たすｉ，ｊに対する積和Ｑ＝Σｑｉｊを求め，Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有する。
【００６４】
本発明の構成によれば，蛍光強度の測定のみから試料の泳動速度を測定でき，従来の電気泳動で必要とされる試料注入点から試料検出点までの長い距離での，試料の泳動が不要となり，電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅に起因する泳動分離の低下も起こらないため，泳動路長の著しい短縮が期待できる。
【００６５】
本発明の蛍光測定方法及び蛍光測定装置は，ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸又は核酸断片，アミノ酸，蛋白質等の荷電をもつ生体分子の分析，荷電をもつ蛍光色素等の分子を結合させた糖等の中性分子の分析を行なう電気泳動方法及び電気泳動装置に好適に適用される。
（第１の実施例）
図３は本発明の第１の実施例の蛍光測定装置の外観図である。装置本体９は直方体の形状をしており，その内部は点線で示される隔壁１３によって２つの領域に分離される。扉１２を含む領域（試料室）には，試料，電気泳動路，泳動媒体が置かれ，温度調節がなされる。他方の領域には，光源，光源の電源，コンピュータとの通信を制御するユニット，モーターのコントローラ等が設置され，光源から発生した熱は排気孔１４から放熱される。装置本体９はパーソナルコンピュータ１０と接続ケーブル１１を介して接続され，ケーブル１１を介して装置本体の制御とデータの通信が行われる。データはパーソナルコンピュータ１０内部のプロセッサにより解析され，解析結果はディスプレイに表示される。第１の実施例の詳細な説明を行うため，図３に示すように装置本体の各辺に平行な座標軸を持つｘｙｚ座標系を用いる。ｙｚ平面は，励起光束の光軸及び電気泳動路の中心軸を含む面に平行である。
【００６６】
図４は第１の実施例の装置本体９の，ｙｚ平面に平行で励起光束の光軸を通る断面を，ｘ軸方向から見た図である。光源１５は波長４８８ｎｍ，出力１０ｍＷのアルゴンイオンレーザである。光源１５からの光を，波長４８８±１０ｎｍの光だけを通すフィルタ１７を透過させて，フィルタの透過光１８が試料の励起光として用いられる。フィルタ１７はホルダー１６によって光源１５に取付けられる。励起光１８はビームスプリッター１９によって強度比１：１で振幅分割され，ビームスプリッターの透過光２１はミラー２２で反射されてビームスプリッターによる反射光２０と電気泳動路２の位置で交わり，干渉縞を形成する。電気泳動路は角型石英製キャピラリーの内部に形成され，電気泳動路の断面形状は，内周が一辺７５μｍの正方形，外周が一辺３５０μｍの正方形である。電気泳動路の全長は３０ｍｍであり，キャピラリーは泳動方向がｚ軸となるよう設置される。
【００６７】
キャピラリーの下端から励起光の照射点，即ち，蛍光の検出点（検出領域）までは１０ｍｍである。反射光２０と透過光２１の径を，電気泳動路を効率良く照射するよう円筒面レンズ２３により，光束の電気泳動路に直交する方向（ｘ方向）で絞る。光源１５は直径（ｅ−２直径）１ｍｍの平行光束を出力する。円筒面レンズの焦点距離は５０ｍｍである。電気泳動路上での励起光束の断面の強度分布は，直径（ｅ−２直径）が，ｚ方向で１ｍｍ，ｘ方向で５０μｍの楕円状ガウシアンである。また，電気泳動路に照射される励起光のパワーは，フィルタ，レンズ等の損失により，７ｍＷとなる。
【００６８】
キャピラリー２の下端は，所定の濃度の試料２４に浸かっており，試料２４を介して電極４に接続される。キャピラリーの上端は分岐ブロック２５を介して泳動媒体で満たされたシリンジ２６に接続される。シリンジ２６がステッピングモーターを組み込んだ自動直進ステージ２８で押されることにより，シリンジ内の泳動媒体がキャピラリー内に充填される。シリンジ２６と自動直進ステージ２８の間には圧力センサ２７が設けられており，モーターのコントローラが泳動媒体のキャピラリー内への充填時の圧力をモニタしてフィードバックすることにより，所定の一定圧力を保ちつつ泳動媒体がキャピラリー２に充填される。キャピラリーの全長が３０ｍｍと非常に短いため，１ｋｇｆの圧力で２０秒間充填することにより，泳動媒体が３％のポリアクリルアミド水溶液である場合，キャピラリ内容積の８倍以上に相当する量の泳動媒体を充填できる。以下の説明では，キャピラリー下端を試料注入端，キャピラリー上端を泳動媒体注入端と呼ぶ。
【００６９】
図５は第１の実施例の装置本体９の，ｘｚ平面に平行で励起光束２１の光軸を通る断面を，ｙ軸の負方向から見た図である。光源１５は鉛直下向きに光を出力するようブラケット２９に取付けられる。ビームスプリッター１９は，直進ステージ３１−ａに搭載される回転ステージ３２−ａにマウントされ，ミラー２２は，直進ステージ３１−ｂに搭載される回転ステージ３２−ｂにマウントされており，ビームスプリッター１９とミラー２２の位置と角度を微調整できる。ビームスプリッターの反射光２０の光軸と，ビームスプリッター１９の透過光２１のミラー２２による反射光の光軸とがなす角の２等分線が，泳動路２と垂直になるように，ビームスプリッター１９とミラー２２の位置と角度が調整される。この状態で，キャピラリー及び泳動媒体の屈折率によらず，電気泳動路上での干渉縞の周期ｐが，（数３８）で与えられる。
【００７０】
【数３８】
ｐ＝λ／（２ｓｉｎ（θ／２）） …（数３８）
θはビームスプリッターの反射光２０の光軸と，ビームスプリッター１９の透過光２１のミラー２２による反射光の光軸とが，空気中でなす角度である。第１の実施例ではθを１．５°〜６°の範囲の任意の値に設定でき，その結果，ｐは約５μｍ〜２０μｍの範囲で連続的に設定できる。光源１５で発生した熱はファン３０により放熱される。
【００７１】
図６は装置本体９の試料室内を，扉１２を開いて前方（ｙ軸方向）から見た図である。試料室は，装置本体の外壁３３と装置内部の隔壁１３により囲まれており，内部には送風機４６による風が常に循環し，温度が一様に保持される。
【００７２】
試料の分析が開始すると，ヒーター４７と温度センサ４８により，風の温度はパーソナルコンピュータ上で設定された値に制御される。温度センサ４８は白金測温抵抗体である。分岐ブロック２５はシリンジ２６とキャピラリー２をフェラル３４を介して接続するだけでなく，中央部のＴ字分岐によって，チューブ３６とニップル３５−ａ，３５−ｂを介して，バッファータンク３７とキャピラリー２の泳動媒体注入端を接続する。バッファータンク内は泳動用のバッファーで満たされており，電極５がバッファーに浸るように，バッファータンクを設ける。電極５に正の高圧が印加され試料の注入と泳動が行われる。第１の実施例で用いた泳動用バッファーは，８９ｍＭのＴｒｉｓ，８９ｍＭのホウ酸，１ｍＭのＥＤＴＡの組成を持つＴＢＥである。
【００７３】
なお，第１の実施例では負イオンであるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を主な分析対象としているため，試料注入端の電極４に対して泳動媒体注入端に接続された電極５の電位を正としているが，正に帯電した試料を分析する場合は，電圧の極性を逆にすれば良い。
【００７４】
バッファータンク内の流路はソレノイド３９に固定されたピストン３８によって開閉が制御され，泳動媒体注入時には流路が閉じられ，泳動時は開かれる。分析される試料２４，２４−２は自動回転ステージ４０及び自動ｚ軸ステージ４１の上に搭載される。自動回転ステージ４０には，直径１００ｍｍの円周上に，２４本の試料と洗浄用水槽６０と泳動媒体廃棄用水槽６１を配置できる穴をもつ。
【００７５】
自動ｚ軸ステージ４１の上下動と自動回転ステージ４０の回転及び自動直進ステージ２８が連動することにより，キャピラリーの試料注入端の洗浄，泳動媒体の充填，２４本までの試料の分析が自動で実行される。試料をセットする穴には１〜２４の番号がついており，以後この番号を試料番号と呼ぶ。
【００７６】
キャピラリー内の試料から発生する蛍光は，レンズ４２によって集光されて平行光束にされた後に，蛍光の波長成分のみを通し，励起光を遮断するフィルタ４３を透過し，レンズ４４によってスリット４５上に実像を結ぶ。第１の実施例ではフィルタ４３の透過域は５１０ｎｍ−５６０ｎｍであり，フルオロセイン，シアゾールオレンジ，オキサゾ―ルイエロー系の蛍光色素で標識された試料に好適に使用できる。スリット４５は，キャピラリーの中心軸に平行な細長い穴を有する厚さ０．１ｍｍのステンレス板であり，励起光のキャピラリー表面に於ける散乱光を遮断し，試料からの蛍光を通すためのものである。
【００７７】
２つのレンズ４２，４４から構成されるレンズ系の倍率は２０倍，開口数は０．４であり，スリット上のキャピラリー像の大きさは，外壁の幅が７．２ｍｍ，内側の泳動路の幅が１．５ｍｍである。外壁に於ける散乱光を良く遮断し，泳動路からの蛍光を効率良く通すため，レンズ系によるボケと収差の影響を考慮してスリット４５の穴の幅は４ｍｍとしてある。スリット４５の穴を通過した光は検出器７によって検出される。検出器７はヘッドオン型の光電子増倍管（photomultiplier，ＰＭ）であり，量子効率は約１０％，電流増倍率は約５０万倍，光電面は直径２５ｍｍの円形である。
【００７８】
図７は第１の実施例に於ける，検出器の出力信号の処理と，自動ステージ等の制御の流れを示す系統図である。検出器７の出力電流は，電流電圧変換回路４９によって電圧信号に変換された後に，ハイパスフィルタ５０でＤＣ成分が遮断され，更に，ローパスフィルタ５１で周波数帯域が制限された後に，アナログデジタル（ＡＤ）変換ユニット５２によって，２５０Ｈｚのサンプリング周波数で，１６ビットの分解能でデジタル信号として標本化される。
【００７９】
電流電圧変換回路４９のゲインは１０６Ｖ／Ａ，ハイパスフィルタ５０はＡＣ結合の増幅器を兼ねており，そのゲインは０．２Ｈｚ〜５０ｋＨｚに於いて２０±０．５ｄＢである。また，ローパスフィルタは８次の連立チェビシェフ型で，そのゲインは，ＤＣ〜９６Ｈｚの範囲で±０．２ｄＢ以内で平坦であり，１５０Ｈｚ以上では−８０ｄＢ以下となっており，サンプリング周波数２５０Ｈｚでは１００Ｈｚ以下でのエイリアスは−８０ｄＢ以下に押さえられる。従って，周波数範囲０．２Ｈｚ〜９６Ｈｚの範囲で有効な，精度±０．７ｄＢ以内，ダイナミックレンジ８０ｄＢのスペクトル解析を行うことが可能である。
【００８０】
ＡＤ変換ユニット５２による変換結果は，装置本体９の内部に組み込まれた中央処理ユニット５３とＬＡＮコントローラ５４を介し，パーソナルコンピュータ１０内のメモリに転送される。パーソナルコンピュータ１０内のマイクロプロセッサはユーザによって設定された所定の個数のデータを基にＰＭの出力電流のゆらぎのパワースペクトルを計算し，結果をディスプレイに表示する。
【００８１】
なお，第１の実施例では，一連のデータを高速フーリエ変換（ＦＦＴ）によってフーリエ変換し，その絶対値の２乗として，パワースペクトルを求める。ユーザはＦＦＴに用いるデータの個数を１２８〜４０９６の間の任意の２のべき乗の値に設定できる。
【００８２】
第１の実施例では装置本体９とパーソナルコンピュータ１０の間のインタフェースとして，ＬＡＮインタフェースを採用したが，ＲＳ−２３２Ｃ，ＧＰ−ＩＢ，ＵＳＢ等標準的なインタフェースならば何でも良い。信号と同様に，パーソナルコンピュータ１０で設定された試料室内の温度，シリンジを押す圧力，時間，泳動電圧，分析する試料の番号は，ＬＡＮインタフェースを介して中央処理ユニット５３に送られる。
【００８３】
中央処理装置５３は，モーターコントローラ５５を介して自動直進ステージ２８，自動回転ステージ４０，自動ｚ軸ステージ４１を制御し，また，温度コントローラ５６を介してヒーター４７へ入力される電力を制御する。モータコントローラ５５は圧力センサ２７の出力を基に自動直進ステージ２８の移動速度を制御し，温度コントローラ５６は温度センサ４８の抵抗値を基にヒーター４７へ入力する電力を制御する。
【００８４】
また，中央処理装置５３は，デジタル出力５８を介して高圧電源３のオンオフ，ソレノイド３９によるバッファータンク３７の開閉，光源１５の電源５９のオンオフを制御し，低電圧のアナログ出力５７を介して高圧電源３の出力電圧を制御する。
【００８５】
図８は第１の実施例によるＤＮＡ試料の実際の分析結果例であり，同一の試料に対して，泳動媒体を泳動バッファと同一のＴＢＥとして，４種の泳動電圧５０，１００，１５０，２００Ｖ／ｃｍで泳動を行った時の蛍光のゆらぎのパワースペクトルを示す。泳動電圧以外の条件は共通であり，干渉縞の周期ｐ＝１０μｍ，温度は３０°Ｃ，ＦＦＴを実行するためのデータの収集個数は２５６個，時間的には約１秒間である。データの収集は，５０Ｖ／ｃｍでの試料の注入を開始してから約２分待ち，キャピラリー内の検出領域（泳動方向の長さＬ＝１ｍｍ）の全体に試料が分布してから行い，その後，泳動電圧を１００，１５０，２００Ｖ／ｃｍに変化させて，それぞれの泳動電圧の場合に，約１秒ずつデータを収集した。
【００８６】
試料は，蛍光色素ＴＯＴＯ−１を結合した塩基長約４８０００ｂｐの２本鎖λ−ＤＮＡである。濃度０．１μＭのＴＯＴＯ−１のジメチルスルホオキシド（DMSO）溶液１０μＬと，試料溶液を，濃度５００ｎｇ／ｍＬのλ−ＤＮＡのＴＢＥ溶液１５０μＬを混合することにより調整した。蛍光色素ＴＯＴＯ−１はモレキュラープローブ社から発売されているシアゾールオレンジの誘導体の２量体であり，２０塩基〜３０塩基に１分子の割合で２本鎖ＤＮＡと結合し，その吸収ピークは５１４ｎｍ，蛍光ピークは５３３ｎｍである。
【００８７】
図８に示すスペクトルのピークの中心周波数は１７Ｈｚ，３３Ｈｚ，５２Ｈｚ，６８Ｈｚであり，対応する試料の泳動速度はそれぞれ，０．１７ｍｍ／ｓ，０．３３ｍｍ／ｓ，０．５２ｍｍ／ｓ，０．６８ｍｍ／ｓとなり，ほぼ泳動電圧に比例する。これらの結果から求めたＴＢＥ中に於けるλ−ＤＮＡの移動度は，３．４×１０−８ｍ２Ｖ−１ｓ−１となり，従来技術−２に記載の図３から求めた移動速度の値，約３．５×１０−８ｍ２Ｖ−１ｓ−１と良く一致する。
【００８８】
図９は，第１の実施例に於いて複数の異なる試料を，連続自動運転により分析する時のフローチャートである。このフローチャートは，泳動媒体として３％のポリアクリルアミドのＴＢＥ溶液を用い，泳動電圧２００Ｖ／ｃｍ，温度３０°Ｃで，１００ｂｐ〜１０００ｂｐのＴＯＴＯ−１で染色されたＤＮＡの分析を想定している。この条件でのＤＮＡの泳動速度は，０．２６ｍｍ／ｓ〜０．４５ｍｍ／ｓの範囲であるので，注入開始から検出点（検出領域）に試料が到達するには４０秒あれば十分である。分析する試料は，試料１，試料２，…，試料ＮのＮ個である。
【００８９】
装置本体は，電源投入時の初期動作として，キャピラリの試料注入端が泳動媒体廃棄用水槽６１に浸かるようになっており，測定は必ずこの状態からスタートする。測定が開始時に１の値に初期化されるパラメータｎとＮとの大小を比較して，測定すべき試料がまだ残っているかどうか判断し，無ければ測定終了となる。測定すべき試料があれば，設定温度を目標として温度制御を開始し，温度の実測値が目標値と±０．１°Ｃ以内で一致する場合，ゲル充填を２０秒行う。その後，キャピラリの試料注入端を洗浄用の水槽６０に浸して１０秒間待ち，キャピラリ試料注入端を洗浄した後に，測定すべき試料を連続的に注入し始め，４０秒後から設定されたデータの収集数に応じた時間，データを収集する。
【００９０】
データ収集終了後は泳動用の電源をオフし，キャピラリーの試料注入端を再び泳動媒体廃棄用水槽６１へ戻し，ｎ＝ｎ＋１としてから，次の測定サイクルへと進む。第１の実施例では，泳動媒体廃棄用の水槽と洗浄用の水槽を分離し，キャピラリーの試料注入端が，洗浄用水槽６０へ浸る前に必ず泳動媒体廃棄用水槽６１に浸るプロトコルとなっており，キャピラリ先端に付着した試料が洗浄用水槽６０へ混ざりこむのを防ぎ，試料の連続測定に於けるキャリーオーバーをほぼ完全に防いでいる。
【００９１】
１００ｂｐ〜１０００ｂｐのＤＮＡの核酸係数Ｄをほぼ１０−１１ｍ２／ｓのオーダーと見積もり，この値とＬ＝１ｍｍ，Ｖ＝０．３ｍｍ／ｓを用い，（数１０）よりｐ０を求めると，ｐ０＝１８μｍとなる。１００ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲のＤＮＡの分析時には，ｐ＝２０μｍとする。他の試料を分析する場合には，その試料の泳動速度と拡散係数に応じて，（数２０）に従ってｐを設定すれば良い。
【００９２】
第１の実施例の条件（Ｌ＝１ｍｍ，ｐ＝２０μｍ，ｐ０＝１８μｍ）では，（数９）から理論段数（ＮＴＰ）＝２８１０であり，（数１１）より，移動度の平均値がμＡＶ，移動度の差がΔμである２種の検体に対してほぼ完全な分離が得られる条件は，Δμ／μＡＶ≧０．１１３となる。
【００９３】
図１０は，図９のプロトコルを用いて，図８の測定と同様にＴＯＴＯ−１で染色された２本鎖ＤＮＡ試料の分析の,（数３）と（数７）を用いた数値シミュレーション結果例を表すパワースペクトルである。図１０（Ａ）は，３００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，図１０（Ｂ）は，４００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例を，図１０（Ｃ）は，４５０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例を，図１０（Ｄ）は，４９０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例を，それぞれ示す図である。なお，泳動電圧２００Ｖ／ｃｍに於ける，３００ｂｐ，４００ｂｐ，４５０ｂｐ，４９０ｂｐ，５００ｂｐのＤＮＡの泳動速度をそれぞれ，０．３４７ｍｍ／ｓ，０．３２３ｍｍ／ｓ，０．３１３ｍｍ／ｓ，０．３０５ｍｍ／ｓ，０．３０３ｍｍ／ｓとし，Ｌ＝１ｍｍ，ｐ＝２０μｍ，ｐ０＝１８μｍ，Ｄ＝１×１０−１１ｍ２／ｓとした。
【００９４】
図１０（Ａ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．１３５であり，２つのピークの裾野の間はノイズレベルまで下がっており，２つのピークは，ピーク全体として完全に分離されている。図１０（Ｂ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．０６４であり，２つのピークは，２つのピークの裾野の間でわずかにオーバーラップしており，２つのピークはピーク全体として理想的に完全に分離されていない。図１０（Ｃ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．０３２であり，２つのピークは，２つのピークの間でオーバーラップしており，ピーク位置は分離して検出されるが，２つのピークは全体として分離されていない。図１０（Ｄ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．００７であり，２つのピークは，重複しており分離されていない。
【００９５】
図１０のスペクトルは，約８秒間収集した４０９６点のデータから計算したパワースペクトルを直接表示しており，ノイズが見られるが，データの収集とパワースペクトルの計算を繰返し，得られるパワースペクトルを積算すればＳＮＲを向上できる。
【００９６】
第１の実施例では，試料を標識する蛍光色素としてＴＯＴＯ−１を使用したが，ＹＯＹＯ−１（モレキュラープローブ社から発売されている）を使用しても，殆ど同様の解析が可能である。ＹＯＹＯ−１は，ＤＮＡに結合する数がＴＯＴＯ−１よりも多いため，より高いＳＮＲを得ることが可能である。色素に応じて光源１５とフィルタ４３を交換すれば他の色素，例えば，ローダミン系色素等も好適に使用できる。また，２量体によって予め染色するのではなく，泳動媒体中にＴＯ−ＰＲＯ−１，ＹＯ−ＰＲＯ−１（モレキュラープローブ社から発売されている）等の単量体色素を分散させておき，無標識のＤＮＡを注入して電気泳動路内で，ＤＮＡに色素に結合させても良い。
（第２の実施例）
図１１は本発明に於ける第２の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図である。第２の実施例の構成要素は，光干渉系を用いない点，スリット４５の構成の点で第１の実施例と異なる。第２の実施例では，出力１０ｍＷ，波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザ（光源１５）から，励起光が，直径（ｅ−２直径）１ｍｍの円形断面を持つ平行光束として，水平方向に射出される。励起光は，励起光フィルタ１７を透過した後に，円筒面レンズ２３で鉛直方向の径を５０μｍに絞られ，水平方向に配置される第１の実施例と同じ寸法を持つ角型石英製キャピラリーに形成される電気泳動路２に照射される。電気泳動路中の試料から発生する蛍光は，レンズ４２，フィルタ４３，レンズ４４，スリット４５，検出器７からなる検出光学系で検出される。検出光学系の構造は，光軸が鉛直下向きになっている他は第１の実施例とほぼ同じであり，スリット４５が置かれた位置に倍率２０倍で検出領域の実像が結像される。
【００９７】
図１２は第２の実施例に使用されるスリット４５の拡大図である。スリット４５は，表面を黒色処理され，３つの長方形の穴を持つ金属板である。長方形の穴のそれぞれに，試料が電気泳動される方向で透過率が，三角関数又は矩形関数に従い周期的に変化する基板６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃが埋め込まれる。検出領域の実像が形成される位置に置かれる基板は，スリット４５を長手方向にスライドさせて，３種類の基板から任意に選択できる。
【００９８】
基板６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃの透過率が変化する周期ｐは，それぞれ，０．２ｍｍ，０．４ｍｍ，０．８ｍｍである。図１２に示す基板６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃの例では，透過率の大の部分（白色部）と透過率の小の部分（黒色部）の対はそれぞれ，１００個，５０個，２５個形成されている。
【００９９】
基板に結像される像の倍率が２０倍であるので，これらの基板を像位置に設置することは，（数４）に於いてそれぞれ，ｐ＝１０μｍ，ｐ＝２０μｍ，ｐ＝４０μｍとすることとほぼ等価となる。第２の実施例で分析する試料は，第１の実施例で用いた３００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合溶液，４００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料，４５０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料，４９０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料であるので，ｐ＝２０μｍを選択し，第１の実施例と同様に検出器７の出力を処理することにより，第１の実施例と同一の結果を得ることが出来る。より一般的には，スリット４５上に結像される像の倍率をＭとすると，（数２０）は（数３９）に相当する。
【０１００】
【数３９】
ｐ／Ｍ〜ｐ０ …（数３９）
第２の実施例では励起光の照射光学系に光干渉系を使用しないため，振動や衝撃に強いという効果があり，その結果，ポータブルの装置とすることが可能である。また，ｐの変更は，スリット４５をスライドするだけで迅速に実行でき，微動ステージの調整等の作業が不要であり，試料の拡散係数が未知で複数のｐに対して分析を行なう場合等に好適である。
【０１０１】
図１３は，第２の実施例の蛍光測定装置の電気泳動路２の周辺の，泳動路を含む鉛直な面による拡大断面図である。図１４は，図１３に示された電気泳動路の周辺部を下方から見た図である。キャピラリーで構成される電気泳動路２は，透明なポリカーボネート製の支持体６３に埋め込まれ，電気泳動路２の両端は支持体６３に穿たれた試料槽６４とバッファー槽６５に連結する。試料槽６４とバッファー槽６５の底はそれぞれ，表面が絶縁処理された厚さ０．１ｍｍのステンレス製の底板６７−ａ，６７−ｂで封じられる。
【０１０２】
支持体６３，電気泳動路２，底板６７−ａ，６７−ｂは，相互に接着剤によりシールされる。穴６６−ａ，６６−ｂは，支持体６３を検出光学系に固定するための穴である。まず，バッファー槽６５及び電気泳動路２に，シリンジによって泳動バッファーを兼ねた泳動媒体が充填される。試料槽６４に，マイクロピペットにより試料が分注された後に，電極４と電極５によって電気泳動が実行される。
【０１０３】
第２の実施例では，キャピラリーの全長は６ｍｍであり，検出領域は，その中心に位置し，幅１ｍｍである。従って，泳動を開始してから，検出領域全体に試料が分布するまでに必要な泳動長さは，わずか３．５ｍｍであり，例えば，０．３ｍｍ／ｓ〜０．４ｍｍ／ｓの泳動速度を持つ試料については，泳動開始からデータ収集までの待ち時間は１０秒前後で済むという利点がある。更に，泳動路の全長がわずか６ｍｍであるので，例えば，２００Ｖ／ｃｍの電圧勾配の時の両端の電位差は１２０Ｖにすぎず，従来の電気泳動に用いられたような１０ｋＶ以上の高圧電源は不要であり，高圧用の絶縁対策も不要である。
【０１０４】
また，図１３のような構造にして，下方から蛍光を検出を行なうので，作動距離の短い非常に明るいレンズを使用でき，第１の実施例に比べて，高い感度を実現できる。第２の実施例では，レンズ４２として開口数０．７５，作動距離０．６１ｍｍの対物レンズを使用する。
【０１０５】
第２の実施例では，図１３に示した支持体６３と電気泳動路２の部分は，使い捨てであり，意図しない異なる試料の混入が起こらず，空気中の浮遊物質等の混入の危険も，電気泳動路を繰返し使用する場合より低く押さえることができ，ＲＮＡや蛋白質のように酵素と反応しやすく，ＤＮＡよりも不安定な物質でも安全に分析できる。
（第３の実施例）
図１５は本発明の第３の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図である。第３の実施例では，点滅するビームスポットを高速にスキャンして，三角関数又は矩形関数に従い周期的に変化する強度分布を持つ励起光を電気泳動路の検出領域に照射する。光源１５として，波長λ＝５３２ｎｍ，出力１０ｍＷ，ビーム直径３ｍｍのガウシアンビームを出力するネオジウムヤグ（ＮｄＹＡＧ）の第２高調波レーザを使用する。
【０１０６】
光源１５から放射された光束を，中心波長５３２ｎｍ，半値幅１０ｎｍのフィルタ１７を透過させて，スペクトル純度を高めた後に，音響光学偏向器（ＡＯＤ）７０に入力される。ＡＯＤ７０は，超音波トランスデューサ７５が貼り付けられたモリブデン酸塩の単結晶である。超音波トランスデューサ７５は，ＡＯＤドライバー７１から入力されたラジオ周波数（ＲＦ）信号を超音波に変換する。超音波はＡＯＤ７０内を伝搬する。
【０１０７】
ＡＯＤ７０に入力された光束は，この超音波によって回折を受け，ＲＦ信号の周波数に応じて，その進行方向を変える。図１３では，ＡＯＤ７０による回折を受けなかった時の透過光を点線で，回折光を太い実線で示す。ＲＦ信号がオフの時は，ＡＯＤ７０に入力された光は回折を受けず全て透過光となり，ビームストップ７６に吸収される。ＲＦ信号の周波数νと，回折角θの間には（数４０）の関係が有る。ｃｓはＡＯＤ内の音速であり，第３の実施例では，ｃｓ＝３６３０ｍ／ｓである。
【０１０８】
【数４０】
θ＝２ｓｉｎ−１｛λν／（２ｃｓ）｝ …（数４０）
ＡＯＤドライバ７１には，ＲＦ信号の出力端子の他に，変調信号と同調信号との２つの入力端子がある。ＲＦ信号の振幅は，０〜１Ｖの範囲の変調信号ＶＭに比例して，０から最大出力まで振れられる。回折光の強度は，ＲＦ信号の振幅に比例するので，その結果，変調信号に比例する。また，ＲＦ信号の周波数νと，２Ｖ〜１２Ｖの範囲の同調信号ＶＴ［Ｖ］との間には，（数４１）の関係があり，６０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲で変調できる。
【０１０９】
【数４１】
ν＝４（ＶＴ−２）＋６０［ＭＨｚ］ …（数４１）
ＡＯＤドライバ７１の変調信号入力に任意波形発生器７２の出力ｏｕｔ１が入力され，ＡＯＤドライバ７１の同調信号入力に任意波形発生器７２の出力ｏｕｔ２が入力される。ｏｕｔ１から最小値が０Ｖ，最大値が１Ｖの正弦波が出力され，ｏｕｔ２から最小値が２Ｖ，最大値が１２Ｖの鋸波が出力される。ｏｕｔ１とｏｕｔ２は，任意波形発生器７２に内蔵された共通の２００ＭＨｚの基準クロック信号から生成され，出力信号の周波数比を正確に整数とし，位相を完全に同期させることができる。
【０１１０】
ＡＯＤ７０による回折光は，波長５５０ｎｍ以下の光を反射し，波長５５０ｎｍ以上の光を透過させるダイクロイックミラー７３で反射させられ，レンズ４２で直径２０μｍに絞られ，石英基板７４の上に彫られた電気泳動路２の中心に照射される。
【０１１１】
電気泳動路２の泳動方向の長さは１．５ｍｍであり，電気泳動路２の泳動方向に直交する断面は，幅，深さともに５０μｍの正方形である。レンズ４２は，明るさ０．９５，焦点距離ｆ＝１０５ｍｍのカメラレンズである。レンズ４２の光軸は，ＡＯＤドライバ７１のＲＦ信号の周波数が平均値νｍ＝８０ＭＨｚの時のＡＯＤ７０による回折光の光軸と一致させてある。
【０１１２】
石英基板７４には，電気泳動路２に連結した試料槽６４とバッファー槽６５が設けられる。マイクロピペットにより泳動媒体をバッファー槽６５と電気泳動路２に満たし，マイクロピペットにより試料を試料槽６４に満たす。その後，電源３により，試料槽の中に設けられた電極５とバッファー槽の中に設けられた電極４との間に電圧が印可され，試料が電気泳動される。
【０１１３】
第３の実施例では，泳動路長は１．５ｍｍであるから，２００Ｖ／ｃｍの電圧を印加しても必要とされる電源電圧は３０Ｖにすぎず，弱電用の電源で十分であり，高圧用の絶縁対策は不要である。
【０１１４】
試料から発生する蛍光は，レンズ４２によって集光され，平行光束となってダイクロイックミラー７３と，中心波長５７０ｎｍ，半値幅４０ｎｍのフィルタ４４，スリット４５を透過し，レンズ４４でスリット４５上に結像し，検出器７で検出される。
【０１１５】
第３の実施例は，ＰＯＰＯ−３（モレキュラープローブ社から発売されている）等で標識された試料に好適に適用できる。第３の実施例では，レンズ４４の焦点距離を２１０ｍｍとして倍率２倍の結像系を構成し，スリット４５の幅は５０μｍである。
【０１１６】
検出器７の出力は，第１の実施例と全く同様に処理され，サンプリング周波数２５０Ｈｚで標本化される。第３の実施例の条件の下では，（数４０）は，θ＝λν／ｃｓと近似できるので，ビームスポットの中心位置からの変位δは（数４２）により表され，ビームスポットは変調信号の周波数で点滅しながら同調信号の周波数で走査される。
【０１１７】
【数４２】
δ＝ｆλ（ν−νｍ）／ｃｓ …（数４２）
同調信号の周波数が十分高ければ，（数４）に於いて，Ｌを（数４３）とし，ｐを（数４４）とした場合と同一の効果を実現できる。νＭＡＸはＲＦ信号周波数の最大値であり，νＭＩＮはＲＦ信号周波数の最小値である。第３の実施例では，νＭＡＸ＝１００ＭＨｚ，νＭＩＮ＝６０ＭＨｚである。ｍは変調信号と同調信号の周波数比である。第３の実施例では，同調信号の周波数を１０ｋＨｚとしており，これは検出器出力のサンプリング周波数２５０Ｈｚに比べ十分高い。（数４２）に第３の実施例での数値を代入すると，Ｌ＝０．５９ｍｍとなる。
【０１１８】
図１６は，ｍ＝１０の場合の，変調信号，同調信号，及びＲＦ信号周波数のタイミングチャートであり，ｐ＝５９μｍである。
【０１１９】
【数４３】
Ｌ＝ｆλ（νＭＡＸ−νＭＩＮ）／ｃｓ …（数４３）
【０１２０】
【数４４】
ｐ＝Ｌ／ｍ …（数４４）
第３の実施例では，励起光照射用のレンズと蛍光集光用のレンズを共通にしているため，レンズの枚数及び光学系の調整個所を減少させるという利点がある。また，第２の実施例と同様，光学系に干渉系を含まないため振動や衝撃に強く，野外での使用にも適する。更に，励起光強度分布の周期ｐの変更を，機械的な可動部なしで純電気的に行えるので，同一の試料に対して多くのｐの値に対するデータを自動的に取得する測定に適する。
【０１２１】
なお，第３の実施例では，励起光の進行方向を変化させてスキャンするために音響光学偏向器を用いたが，ガルバノミラーを用いても良い。また，第３の実施例では，レーザビームスポットの強度を，三角関数に従い周期的に変調したが，矩形関数に従い周期的に強弱をつけて，検出領域を高速にスキャンし，周期的に変化する強度分布を持つ励起光を照射しても良い。
【０１２２】
以下に説明する実施例では，周期的に変化する強度分布を持つ励起光を照射しないで，一様な強度をもつ励起光を検出領域に照射し，１次元又は２次元の光検出器を使用して試料から発生する蛍光を検出して，演算処理装置により検出された蛍光のパワースペクトルを求める。
（第４の実施例）
図１７は本発明の第４の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図である。第４の実施例の構成は，第２の実施例と類似の構成である。即ち，光源１５からの励起光を電気泳動路２に照射して，試料から発生する蛍光をレンズ４４で結像するまでは同一である。第４の実施例では，第２の実施例でのスリット４５を使用せず，検出器７として１次元のイメージセンサを用いる。電気泳動される試料の像が動く方向と，イメージセンサの各光電変換素子が並ぶ方向とを一致させて配置する。イメージセンサの光電変換素子の面はレンズ４４の結像位置に置かれる。
【０１２３】
図１８は，検出器７として用いたイメージセンサの光電変換素子の面の拡大図である。２４．５ｍｍ×１ｍｍの光電変換素子の面のエリアが，１０２４個の光電変換素子８０−１〜８０−１０２４に分割される。各光電変換素子のサイズは０．０２４ｍｍ×１ｍｍである。検出器７では，（１）８ｍｓの露光，（２）その後の２ｍｓの時間で，各光電変換素子に蓄積された電荷の読み出しからなるサイクルが繰り返される。
【０１２４】
読み出された電荷はＡＤ変換され，ＡＤ変換結果はパーソナルコンピュータ１０のメモリに転送される。パーソナルコンピュータ１０のマイクロプロセッサは，光電変換８０−１〜８０−１０２４に蓄積された電荷の値ｑ１〜ｑ１０２４を基に，（数４５）の値ｑを計算する。Σｉは，ｉ＝１〜１０２４について行なう。ｐ２は周期関数の周期であり，ｋ２＝２π／ｐ２は，試料を含む溶液の性質に応じて定められべき定数である。ｑの値は（数１）に（数４６）を代入して得られる値に近似的に比例する。
【０１２５】
【数４５】
ｑ＝Σｉ｛ｑｉｃｏｓ（ｋ２ｉ）｝ …（数４５）
【０１２６】
【数４６】
Ｉ（ｒ）＝Ｉ０ｅｘｐ｛−８（ｘ／Ｌ）２｝ｅｘｐ｛２πＭｘ／（ｐ１ｐ２）｝×ｅｘｐ｛−８（ｙ／Ｗ）２｝ｅｘｐ｛−８（ｚ／Ｈ）｝ …（数４６）
ｐ１は，光電変換素子８０−１〜８０−１０２４のピッチ，Ｍは光電変換素子の面に結像される像の倍率，第４の実施例では，ｐ１＝０．０２４ｍｍ，Ｍ＝２０である。Ｌは，電気泳動路２上での励起光束の泳動方向の幅である，Ｈは，電気泳動路２上での励起光束の泳動方向に直角な方向の幅である。Ｗは，（光電変換素子の泳動方向に直交する方向の長さ）／（倍率Ｍ）の値である。第４の実施例では，Ｌ＝１ｍｍ，Ｈ＝０．０５ｍｍ，Ｗ＝０．０５ｍｍである。
【０１２７】
（数４５）のｑのパワースペクトルの計算により，第４の実施例に於いても，他の実施例とほぼ同様の結果を得ることができる。第４の実施例では，１回のデータの収集だけで，（数４５）に於けるｋ２の値を変えた計算により，第１の実施例に於いてｐを変えて複数回のデータの収集を行うのと同じ結果が得られるという利点がある。第４の実施例では，第１の実施例に於いてｐ＝２０μｍとしたのと同様の効果を得るため，ｐ２＝１６．７μｍとする。より一般的には，（数４７）が（数２０）に相当する。
【０１２８】
【数４７】
ｐ１ｐ２／Ｍ≒ｐ０ …（数４７）
（第５の実施例）
本発明の第５の実施例では，図１７に示す励起光照射及び蛍光検出をする光学系は第４の実施例の構成と殆ど同一の構成であり，検出器７として２次元のイメージセンサを用いる。電気泳動路の周辺部の構造は，第２の実施例及び第４の実施例での電気泳動路の周辺部の構造と類似であるが，第５の実施例では，複数の電気泳動路を集積化し，同時に複数種類の試料を分析できる構成である。
【０１２９】
図１９は，電気泳動路の周辺部を下方から見た拡大図であり，第２の実施例に於ける図１４に相当する。電気泳動路２−１〜２−４は，円形断面をもつ，外径２００μｍ，内径５０μｍの石英製キャピラリーである。キャピラリー２−１〜２−４は，励起光が照射される蛍光の検出点（検出領域）の近傍で，０．２４ｍｍピッチで同一平面をなすように配置される。検出領域の近傍のキャピラリー２−１〜２−４は励起光に垂直に配置される。励起光は，キャピラリー２−１〜２−４が検出領域の近傍でなす平面に平行な方向から照射される。
【０１３０】
キャピラリー２−１を透過した励起光束は，円形断面をもつキャピラリー自身がもつレンズ効果によって，電気泳動路２−２，２−３，２−４の中心に次々と集光される。キャピラリー２−１〜２−４の一端はそれぞれ，別々の試料を注入できるよう，個別の試料槽６４−１〜６４−４へ接続される。キャピラリー２−１〜２−４他端は，一つの共通のバッファー槽６５に接続される。試料槽６４−１〜６４−４，バッファー槽６５にそれぞれ，電気泳動のための電極が配置される。
【０１３１】
２次元イメージセンサとして，正方形の光電変換素子を１０２４行×１０２４列ならべた冷却ＣＣＤを使用する。冷却ＣＣＤの光電変換素子は，キャピラリー２−１〜２−４を試料が泳動する泳動方向，及び，泳動方向と直交する方向の２方向のそれぞれに，ピッチ２４μｍで配列される。励起光が照射されたキャピラリー２−１〜２−４の部分（検出領域）の実像が，倍率２０倍で冷却ＣＣＤの光電変換素子の面に結像される。
【０１３２】
ｉ行ｊ列の光電変換素子に蓄積された電荷量をｑｉｊとして，（数４８）で表されるｑｎを，ｎ＝１，２，３，４のそれぞれの場合に対して計算する。Σｊはｊ＝１〜１０２４についての加算，Σｉはｉ＝２００ｎ＋９２〜２００ｎ＋１３１（ｎ＝１，２，３，４）についての加算を示す。この結果，電気泳動路２−１〜２−４のそれぞれに対して，（数４５）の値を計算した場合と同一の結果が得られ，各ｑｎのパワースペクトルの計算により，試料槽６４−１〜６４−４の試料を同時に分析できる。
【０１３３】
【数４８】
ｑｎ＝Σｊ｛ｃｏｓ（ｋ２ｊ）｝Σｉ｛ｑｉｊ｝ …（数４８）
第５の実施例では，共通の一台の光源から生成された単一の励起光束を，電気泳動路自身がもつレンズ効果を利用して，全ての電気泳動路に同時に照射する。また，電気泳動用の電源も全ての電気泳動路で共通である。その結果，第４の実施例とほぼ同額の部品コストで，４倍のスループットを実現できる。
（第６の実施例）
本実施例では，第１の実施例と同一の構成を用いて，本発明をヒト血液から抽出したゲノムＤＮＡの品質評価に応用した。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR)のテンプレートとしてゲノムＤＮＡを好適に用いるには，ゲノムＤＮＡ断片長が数１０ｋｂｐ以上に分布していることが望まれる。しかし，抽出時の攪拌や保管時の凍結解凍などの影響により，ゲノムＤＮＡが数ｋｂｐ以下の長さに切断される場合がある。そこでPCRにあたっては，随時ゲノムＤＮＡの品質評価をすることが好ましい。
【０１３４】
本実施例で評価したゲノムＤＮＡは，ヒト全血１００μＬを原料とし，キアゲン (Qiagen) 社から市販されているＤＮＡ抽出キットを使用して，以下のプロトコルに従って抽出した。全血１００μＬに，キットに添付されたプロテアーゼＫを１０μＬとライシスバッファーを１００μＬ加え，攪拌した後に，５６℃で１０分間インキュベートし，その後エタノールを加え，攪拌する。反応液を抽出カラムに移し，１分間遠心分離を行い，ろ過液を廃棄する。その後，抽出カラムに洗浄液５００μＬを注いで１分間遠心分離を行うという工程を２回繰り返す。その後７０℃の溶離液をカラムに加え，５分間インキュベート後，１分間遠心分離し，ゲノムＤＮＡを回収する。
【０１３５】
本実施例で用いた試料は，上記のプロトコルでヒト血液から抽出したゲノムＤＮＡのＴＢＥ溶液と，分子量マーカーとして用いる１０ｋｂｐと４８ｋｂｐと９７ｋｂｐのＤＮＡの混合ＴＢＥ溶液であり，ＤＮＡは第一の実施例と同様にして蛍光色素ＴＯＴＯ-1で染色し，トータルのＤＮＡ濃度を３０ｎｇ／ｍＬに調整した。
【０１３６】
本実施例では分離媒体としてヒドロキシプロピルメチルセルロースの濃度０．２５％のＴＢＥ溶液を用い，泳動電圧は５０Ｖ/ｃｍ，観測領域の長さＬ＝1ｍｍとした。この条件で数１０ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡの泳動速度はＶ＝０．１５〜０．３ｍｍ／ｓ, 並進拡散係数Ｄ≒１０−１２ｍ２／ｓであり，（数１０）から求めたｐ０＝７．６〜１０．７μｍとなるので，本実施例においてはｐ＝１０μｍとした。
【０１３７】
図２０（Ａ）は分子量マーカーである１０ｋｂｐと４８ｋｂｐと９７ｋｂｐのＤＮＡの混合溶液に対する,（数３）と（数７）を用いた数値シミュレーション結果であり，３つのバンドが良好に分離されている。図２０（Ｂ）はゲノムＤＮＡ溶液に対する,（数３）と（数７）を用いた数値シミュレーション結果である。ゲノムＤＮＡは分子量マーカーのように単分散でないため，ピークが広がったスペクトルとなっており，そのためＳＮＲが図２０（Ａ）に比べ低下しているが，ＤＮＡ断片長さが数１０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐに分布していることを明瞭に示している。従って本実施例に用いたゲノムＤＮＡはＰＣＲのテンプレートとして好適に用いることが可能である。
【０１３８】
数１０ｋｂｐ以上のＤＮＡ分析はアガロース電気泳動などで数１０分〜数時間かけて行われていたが，本実施例の分析結果は１試料あたり２分以内で得られており，大幅な時間短縮がなされている。その結果，ＰＣＲ度にテンプレートを評価することも容易である。
【０１３９】
【発明の効果】
従来の電気泳動で必要とされた，複数種の試料を空間的に分離する泳動が不要となる。電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅により生じる，泳動分離の低下の影響を受けない。泳動路及び分析時間の著しい短縮が可能となり，装置の小型化，軽量化が可能となる。また，試料を狭いバンド幅で注入する必要がなく，試料を単に注入するだけですむ。試料を短時間だけ電気泳動させて，試料を連続的に検出領域に分布させれば良いので，泳動路長は，励起光を照射して試料からの蛍光を検出する検出領域の長さであれば良く，泳動用の電源も低電圧電源ですむ。更に，試料濃度が，単分子検出が行われるような超希薄濃度に限定されず，広い範囲の試料濃度に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明する模式図。
【図２】本発明の蛍光測定方法に於ける，（Ａ）分離効率，及び，（Ｂ）信号対雑音比の励起光強度分布の周期に対する依存性を示す図。
【図３】本発明の第１の実施例の蛍光測定装置の外観図。
【図４】本発明の第１の実施例の装置本体の断面図。
【図５】本発明の第１の実施例の装置本体の断面図。
【図６】本発明の第１の実施例の装置本体の試料室内部を説明する図。
【図７】本発明の第１の実施例に於ける，検出器の出力信号の処理と，自動ステージ類の制御の流れを示す系統図。
【図８】本発明の第１の実施例に於ける，ＴＯＴＯ−１で標識したλ−ＤＮＡ試料の分析結果例を示す図。
【図９】本発明の第１の実施例に於いて，複数の異なる試料を連続自動運転により分析する時のフローチャート。
【図１０】本発明の第１の実施例に於いて，（Ａ）３００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，（Ｂ）４００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，（Ｃ）４５０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，（Ｄ）４９０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例をそれぞれ示す図。
【図１１】本発明の第２の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図。
【図１２】本発明の第２の実施例に使用されるスリットの拡大図。
【図１３】本発明の第２の実施例の蛍光測定装置の電気泳動路の周辺部の電気泳動路を含む鉛直な面による拡大断面図。
【図１４】図１３に示された電気泳動路の周辺部を下方から見た図。
【図１５】本発明の第３の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図。
【図１６】本発明の第３の実施例に於ける変調信号，同調信号，及びＲＦ信号周波数のタイミングチャート。
【図１７】本発明の第４の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図。
【図１８】本発明の第４の実施例で使用するイメージセンサの光電変換素子の面の拡大図。
【図１９】本発明の第５の実施例に於ける電気泳動路の周辺部の拡大図。
【図２０】本発明の第６の実施例に於ける，ＴＯＴＯ−１で標識した分子量マーカーとゲノムＤＮＡの分析の数値シミュレーション結果例を示す図。
【符号の説明】
１−１〜１−Ｎ…試料，２，２−１〜２−４…電気泳動路，３…電源，４…電極，５…電極，６…励起光，７…検出器，８…スペクトル解析装置，９…装置本体，１０…パーソナルコンピュータ，１１…接続ケーブル，１２…扉，１３…隔壁，１４…排気孔，１５…光源，１６…ホルダー，１７…フィルター，１８…励起光，１９…ビームスプリッター，２０…反射光，２１…透過光，２２…ミラー，２３…円筒面レンズ，２４，２４−２…試料，２５…分岐ブロック，２６…シリンジ，２７…圧力センサ，２８…自動直進ステージ，２９…ブラケット，３０…ファン，３１−ａ，３１−ｂ…直進ステージ，３２−ａ，３２−ｂ…回転ステージ，３３…外壁，３４…フェラル，３５−ａ，３５−ｂ…ニップル，３６…チューブ，３７…バッファータンク，３８…ピストン，３９…ソレノイド，４０…自動回転ステージ，４１…自動ｚ軸ステージ，４２…レンズ，４３…フィルタ，４４…レンズ，４５…スリット，４６…送風機，４７…ヒーター，４８…温度センサ，４９…電流電圧変換回路，５０…ハイパスフィルタ，５１…ローパスフィルタ，５２…アナログデジタル変換ユニット，５３…中央処理ユニット，５４…ＬＡＮコントローラ，５５…モーターコントローラ，５６…温度コントローラ，５７…アナログ出力，５８…デジタル出力，５９…光源の電源，６０…洗浄用水槽，６１…泳動媒体廃棄用水槽，６３…支持体，６４…試料槽，６５…バッファー槽，６６−ａ，６６−ｂ…穴，６７−ａ，６７−ｂ…底板，６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃ…基板，７０…音響光学偏向器，７１…音響光学偏向器ドライバー，７２…任意波形発生器，７３…ダイクロイックミラー，７４…基板，７５…トランスデューサ，７６…ビームストップ，８０−１〜８０−１０２４…光電変換素子。
【発明の属する技術分野】
本発明は，核酸，蛋白質等の生体高分子の分析に用いる電気泳動装置及び電気泳動方法に使用される蛍光測定方法及びに蛍光測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ励起により蛍光を検出する電気泳動方法は，高感度と簡便さから，核酸や蛋白質等の生体高分子を分析するための基本的な技術の一つとして広く用いられている。近年，生体高分子分析の分野では，主流であったスラブゲル電気泳動に変わり，泳動時に発生するジュール熱が少ないため高電圧が使用でき，その結果，より短時間で分析できるキャピラリー電気泳動が普及しつつある。電気泳動路の長さは一般的に５０ｃｍ〜２０ｃｍであるが，分析時間の短縮と，分析システムの小型化のため，泳動路を短縮するため様々な技術が開発されている。
【０００３】
フォトリソグラフィーの技術を応用して基板上にキャピラリー状の流路を形成し，その流路で電気泳動することにより，泳動路長０．７５ｃｍ〜２．２ｃｍで複数の蛍光標識がなされたアミノ酸を分離する方法が，Science,261,895-897（1993）（従来技術−１）に記載されている。
【０００４】
単分子検出が行われる条件下では，実質的な泳動路長０．２５ｍｍで数種類のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が分離可能であることが，Anal. Chem.,67,3181〜3186（1995）（従来技術−２）に記載されている。
【０００５】
７００μｍの周期で配置される３００μｍの幅をもつ５５個の検出スリットを介して，泳動路を泳動する試料から発する蛍光を経時的に検出して，蛍光強度のフーリエ変換により，試料の速度を測定する方法が，Anal. Chem.,71,2130〜2138（1999）（従来技術−３）に記載されている。
【０００６】
蛍光物質を含む試料中に励起光の干渉縞を形成し，蛍光物質から放射された蛍光のゆらぎの相関関数を測定することにより，試料の流速を求める方法（蛍光相関法（ＦＣＳ:Fluorescence correlations）と呼ばれる手法の１種）が特開昭５３−４０５８６号公報（従来技術−４）に記載されている。
【０００７】
従来技術１と同様の構成で泳動路長を５ｍｍに短縮した時，理論段数が５８００となることが，Anal. Chem.,65,2637-2642(1993)（従来技術−５）に記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一般的な条件での従来技術の電気泳動では，電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅により，試料の泳動分離が制限され，ｍｍオーダーの泳動路長で，移動度が近接した試料に対して良好な分離を得るのは難しいという課題があった。実際に，従来技術−１では，泳動路長２．２ｃｍでは移動度の差が１０％以下の試料を分離しているが，泳動路長０．７５ｃｍでは移動度の差が２０％以上の試料しか分離できていない。
【０００９】
従来技術−３に於いても，検出スリットの周期は，注入した試料のバンド幅によって制限され，無制限に小さくできず，検出スリットの個数もまた，分離性能を左右するため任意に減らせないという課題がある。従来技術−３での検出スリットの周期は０．７ｍｍ，検出スリットの個数は５５であり，実質的な泳動長は約４ｃｍであり，従来技術−１での泳動路長より長くなっている。
【００１０】
従来技術−１，３では狭いバンド幅で試料を注入するため，基板上に流路を２本以上形成し，十字に交差させる必要があった。
【００１１】
また，これまで従来技術−４に記載される技術の電気泳動分野への利用は検討されたことがない。本発明では，従来技術４に記載される技術を改良してこれを電気泳動に適用することを検討した。
【００１２】
本発明の目的は，上記課題を解決し，電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅に制限されずに，ｍｍオーダーの泳動路長で，異なる移動度を持つ複数種類の試料を良好に分離検出できる蛍光測定方法及び蛍光測定装置を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の蛍光測定方法では，試料を電気泳動し，泳動路で試料を検出する検出領域の全体に連続して分布させて，検出領域に試料の泳動方向（電場の方向）に，試料分子のサイズより大きな周期で，周期的に変化する強度分布をもつ励起光を照射するか，または，検出領域と蛍光を検出する検出器との間に，試料分子のサイズより大きな周期で，周期的に透過率分布をもつスリットを配置して，検出領域で試料から発生する蛍光のゆらぎのパワースペクトルを求める。あるいは，蛍光を検出する検出器としてアレイ状のセンサを使用して，検出領域から発生する蛍光の泳動方向での分布を測定し，アレイ状のセンサの各検出素子で検出された蛍光の強度と所定の周期関数との積和を求め，積和のパワースペクトルを求める。
発明の原理の説明
まず，本発明の原理を以下に説明する。単色の励起光で照射される１種類の蛍光体で標識された試料を想定し，励起光により試料から発生する蛍光を光電子増倍管（photomultiplier，ＰＭ）で検出することを考える。ＰＭの出力電流ｉ（ｔ）は，位置ｒベクトル＝ｒ（ｘ，ｙ，ｚ），時刻ｔに於ける試料のモル濃度Ｃ（ｒ，ｔ）と，位置ｒに於ける励起光強度と位置ｒにある試料から発生する蛍光がＰＭの光電面に集光される効率との積Ｉ（ｒ）を用いて，（数１）により表される。
【００１４】
【数１】
【００１５】
【数２】
Ｇ（ｔ）＝〈δｉ（０）δｉ（ｔ）〉／〈（δｉ（ｔ））２〉 …（数２）
更に，δｉ（ｔ）を周波数領域で解析するため，δｉ（ｔ）の規格化されたパワースペクトルＳ（ν）をδｉ（ｔ）／〈（δｉ（ｔ））２〉１／２のパワースペクトル（より詳しくは片側パワースペクトル）として定義する。Wiener-Khintchineの定理により，Ｓ（ν）は（数３）により表される。積分∫の下限は０，上限は∞である。
【００１６】
【数３】
Ｓ（ν）＝４∫Ｇ（ｔ）ｃｏｓ（２πνｔ）ｄｔ …（数３）
以下では，Ｉ（ｒ）として，（数４）で表されるように，ｘ軸方向に幅Ｌ（ｅ−２幅）のガウス状包絡線を持ち，周期ｐで正弦的に振動し，ｙ，ｚ方向にそれぞれ幅Ｗ（ｅ−２幅），Ｈ（ｅ−２幅）のガウス状プロファイルを持つ分布を考える。但し，（数５）の条件を満足するものとする。
【００１７】
【数４】
【数５】
１μｍ＜ｐ《Ｌ，Ｗ，Ｈ …（数５）
このようなＩ（ｒ）は，例えば，光軸をｘｙ平面上に置くｙ軸に関して対称な２本の楕円ガウシアンビームを，原点近傍に置かれた試料セル内で交錯させて干渉縞を形成し，ｚ軸方向からｙ方向にガウシアンの透過率プロファイルを持つスリットを介して蛍光を検出することにより実現できる。試料がｘ軸方向に一様な速度Ｖで動いており，試料の並進拡散係数Ｄに対して（数６）が満たされる場合には，（数４）のＩ（ｒ）に対するＧ（ｔ）は，（数７）によりで与えられる。なお，（数７）導出の詳細は後述する。
【００１９】
【数６】
Ｄ≪ＶＬ／４ …（数６）
【００２０】
【数７】
【００２１】
図１は，本発明の原理を説明する模式図である。試料１−１〜１−Ｎは泳動媒体（バッファ溶液，ゲル，高分子等）で満たされた電気泳動路２の検出領域全体にわたって分布しており，電源３と泳動媒体に接する電極４，５によって所定の速度Ｖで電気泳動される。検出領域は試料の泳動方向に周期ｐで強度が変化する励起光６で照射され，励起光により試料から発生する蛍光は，検出器７で検出され，検出器７の出力電流のゆらぎδｉ（ｔ）はスペクトル解析装置８により解析され，求められたスペクトルが表示される。
【００２２】
なお，（数４）のような周期的に変化するＩ（ｒ）を近似的に実現する代表的な方法は，大別して次の３通りである。
（１）図１に示すように，干渉縞等により励起光の強度分布に周期的な変化を与える。
（２）検出領域と検出器の間に透過率が周期的に変化するスリットを設け，このスリットを介して試料から発生する蛍光を検出する。
（３）蛍光を検出する検出器としてイメージセンサを用い，蛍光強度の分布を時間的・空間的に分解して計測してＣ（ｒ，ｔ）を求めて，周期的に変化するＩ（ｒ）に対する（数１）の右辺を計算する。
本発明に於ける分離効率の説明
異なる速度で移動する複数種類の試料を含む場合，ＰＭの出力電流及びそのゆらぎは各試料に由来する光電流とそのゆらぎの和となる。試料は十分希薄で試料間の相互作用は無視できるとすれば，ゆらぎの和のパワースペクトルもまた，各試料に由来するゆらぎのパワースペクトルの和となる。従って，適切な条件下では，Ｓ（ν）のグラフ上で，試料の種類と同数の異なる中心周波数を持つピークを分離して検出できる。以下では，本発明の方法による試料の分離効率について考察する。そのため分離効率を表す指標である理論段数（number of theoretical plate，ＮＴＰ）を導入する。ＮＴＰを，Ｓ（ν）のＶ／ｐに位置するピークの半値全幅（full width at half maximum，ＦＷＨＭ）を用いて，（数８）により定義する。
【００２３】
【数８】
ＮＴＰ＝（８ｌｎ２）｛Ｖ／（ｐ×ＦＷＨＭ）｝２ …（数８）
（数７）から明らかなように，Ｓ（ν）はガウシアンとローレンチアンの畳み込みとなるため，ＦＷＨＭを解析的に表現することは難しい。そこで，まずコヒーレンス時間τｃを，（数７）の右辺の第１項の振動部分の振幅がｅ−１になる時間として定義し，同一のコヒーレンス時間を持つ純粋なガウシアンのフーリエ変換でＳ（ν）を近似する。この近似によれば，ＮＴＰは（数９）となる。ｐ０は（数１０）により定義する。
【００２４】
【数９】
【数１０】
ｐ０＝π（ＤＬ／Ｖ）１／２ …（数１０）
図２（Ａ）に示す曲線は，（ＮＴＰ）１／２／（Ｌ／ｐ０）をｐ／ｐ０の関数として示す。この曲線から，ｐ以外のパラメータが固定された条件で良い分離を得るには，ｐ≒ｐ０とするのが望ましく，（ｐ／ｐ０）＝３１／４の時，分離効率は最大となる。
【００２６】
例えば，Ｌ＝１ｍｍ，ｐ＝ｐ０＝１０μｍとすると，（数９）より，ＮＴＰ≒（Ｌ／ｐ０）２／１．１８となるので，ＮＴＰ≒８４７０に達し，従来技術−５に於いて５ｍｍの泳動路長で得られている理論段数５８００の約１．５倍となる。
【００２７】
一般に，等しいＦＷＨＭをもつ２つのピークに対して，ピークの中心間の距離がＦＷＨＭ／（２ｌｎ２）１／２より大である時，２つのピークはほとんど完全に分離していると定義されている。μＡＶを２つの試料の移動度の平均値，Δμを２つの試料の移動度の差とする時，異なる移動度をもつ２種類の試料に対して，ほぼ完全な分離を得る条件は，（数１１）により表される。例えば，Δμ／μＡＶ＝０．１の場合，ＮＴＰ≧３６００を満たす必要がある。
【００２８】
【数１１】
ＮＴＰ≧３６（μＡＶ／Δμ）２ …（数１１）
本発明に於ける信号対雑音比の説明
次に，本発明の方法に於ける信号対雑音比（signal to noise ratio，ＳＮＲ）について考察する。検出される試料の分子数の平均をＮとすると，（数１２）が成り立つ。
【００２９】
【数１２】
〈｛δｉ（ｔ）｝２〉＝〈｛ｉ（ｔ）｝２〉／Ｎ …（数１２）
ＰＭの出力電流は，そのパワースペクトルを求めるため，多数の異なった中心周波数を持つ透過帯域幅Δνのバンドパスフィルタに入力される（現在では，実際にはデータの標本化と離散フーリエ変換がこのようなマルチフィルタの役目を果たす）。中心周波数νのフィルタが出力する信号電流ｉＳ（ｔ）の２乗平均値は（数１３）となる。《｛Ｘ（ｔ）｝２》はＸ（ｔ）の２乗平均値を表わすものとする。
【００３０】
【数１３】
《ｉＳ（ｔ）２》＝〈｛δｉ（ｔ）｝２〉Ｓ（ν）Δν …（数１３）
また，ショット雑音電流ｉＮＳ（ｔ）と熱雑音電流ｉＮＴ（ｔ）の２乗平均値はそれぞれ，（数１４），（数１５）となる。ｅは電気素量，ｉＢ（ｔ）はＰＭの暗電流と蛍光以外の背景光によって誘起される光電流の和，ｋＢはボルツマン定数，Ｔは絶対温度，Ｒはフィルタ出力に接続される負荷抵抗である。（数１３）〜（数１５）より，ＳＮＲは（数１６）となる。
【００３１】
【数１４】
【数１５】
《｛ｉＮＴ（ｔ）｝２》＝４ｋＢＴＲ−１Δν …（数１５）
【００３３】
【数１６】
【００３４】
【数１７】
ＳＮＲ＝Ｓ（ν）ｉＭ／（２ｅ） …（数１７）
【００３５】
【数１８】
ｉＭ＝〈ｉ（ｔ）〉／（ｇＮ） …（数１８）
（数１８）から，Ｎが十分大きい極限ではＳＮＲはＮによらず一定であり，その値は単一分子あたりの光電流で決まる。また，分離効率を評価した時と同様の近似を行うと，Ｓ（ν）のν＞０に於ける極大値ＳＭＡＸ≒Ｓ（Ｖ／ｐ）は，（数１９）により表される。
【００３６】
【数１９】
【００３７】
【数２０】
ｐ≒ｐ０ …（数２０）
図２（Ａ），図２（Ｂ）から，分離効率及びＳＮＲを極端に劣化させることなく，種類の異なる試料を分離して検出するためには，１≦ｐ／ｐ０≦５を満たす必要がある。
（数７）の導出の詳細な説明
以下，（数７）の導出の詳細な説明を行なう。位置ベクトルｒ＝ｒ（ｘ，ｙ，ｚ），ｄｒ＝ｄｘｄｙｄｚ，ベクトル変数ｑ＝ｑ（ｑｘ，ｑｙ，ｑｚ），ｄｑ＝ｄｑｘｄｑｙｄｑｚとして，Ｉ（ｒ）の空間フーリエ変換を（数２１）に示すＩ（ｑ），（数２２）に示す濃度のゆらぎδＣ（ｒ，ｔ）の空間フーリエ変換の相関関数を（数２３）に示すＦ（ｑ，ｔ）とすると，（数２４）が成り立つ。（数２１），（数２２）に於いて，ｊは虚数単位である。
【００３８】
【数２１】
Ｉ（ｑ）＝∫Ｉ（ｒ）ｅｘｐ（ｊｑ・ｒ）ｄｒ …（数２１）
【００３９】
【数２２】
δＣ（ｑ，ｔ）＝∫δＣ（ｒ，ｔ）ｅｘｐ（ｊｑ・ｒ）ｄｒ …（数２２）
【００４０】
【数２３】
Ｆ（ｑ，ｔ）＝〈δＣ（ｑ，０）δＣ（ｑ，ｔ）〉 …（数２３）
【００４１】
【数２４】
【００４２】
【数２５】
【数２６】
【数２７】
Ｉ（ｑ）＝Ｉ０Ｉｘ（ｑｘ）Ｉｙ（ｑｙ）Ｉｚ（ｑｚ） …（数２７）
また，ｊを虚数単位として，（数２８）のように定義すると，Ｆ（ｑ，ｔ）は（数２９）となる。
【００４５】
【数２８】
Ｆｘ（ｑｘ，ｔ）＝ｅｘｐ（ｊｑｘＶｔ−ｑｘ ２Ｄｔ），
Ｆｉ（ｑｉ，ｔ）＝ｅｘｐ（−ｑｉ ２Ｄｔ）（ｉ＝ｙ，ｚ） …（数２８）
【００４６】
【数２９】
Ｆ（ｑ，ｔ）＝
Ｆ（ｑ，０）Ｆｘ（ｑｘ，ｔ）Ｆ（ｑｙ，ｔ）Ｆ（ｑｚ，ｔ） …（数２９）
（数５）より│ｑ│＞１０６であるｑに対しては，（数２５），（数２６）よりＩ（ｑ）はほとんど０となる。一方，│ｑ│＞１０６であるｑに対しては，相転移近傍を除き，Ｆ（ｑ，０）はｑによらず一定と見なせる。そこで，Ｇｉ（ｔ）を（数３０）とおけば，Ｇ（ｔ）は（数３１）となる。
【００４７】
【数３０】
【数３１】
Ｇ（ｔ）＝Ｇ（ｔ）ｘＧ（ｔ）ｙＧ（ｔ）ｚ …（数３１）
（数２５）より，│Ｉｘ（ｑｘ）│は（数３２）となるが，σｘｋ≫1なので，大括弧［ ］内は最初の３項以外は無視できる。そこで，積分∫の下限を−∞，上限を＋∞とし，ｊを虚数単位として，Ｂ（ｋ，ｔ）を（数３３）のように定義すると，（数３０）と（数３２）とから，Ｇｘ（ｔ）は（数３４）となる。
【００４９】
【数３２】
【００５０】
【数３３】
【数３４】
【００５２】
【数３５】
Ｂ（ｋ，ｔ）＝π１／２σｘ −１×ｅｘｐ［ｊｋＶｔ−ｋ２Ｄｔ−｛Ｖｔ／（２σｘ）｝２］…（数３５）
（数３４）と（数３５）より，Ｇｘ（ｔ）は（数３６）となる。
【００５３】
【数３６】
【００５４】
【数３７】
Ｇｉ（ｔ）＝｛（１＋（ｔ／τｉ）｝−１／２（ｉ＝ｙ，ｚ） …（数３７）
【００５５】
【発明の実施の形態】
本発明の蛍光測定方法の第１の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，試料の泳動方向で周期的に変化する強度分布を与えた励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射し，試料から発生する蛍光を検出し，蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルを求める。上記強度分布は，単一の光源から放射された励起光を分割して２つの光束とし，２つの光束を上記領域で交錯させて干渉させて生成する，あるいは，励起光を照射する角度方向を所定の周波数で周期的に走査し，所定の周波数の整数倍の周波数で励起光を点滅させて生成する。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，励起光の強度分布の周期をｐとする時，ｐ≒π（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００５６】
本発明の蛍光測定方法の第２の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射し，試料から発生する蛍光による蛍光像を，試料の泳動方向で周期的に変化する透過率分布を持つスリット上に結像して蛍光像を検出し，蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルを求める。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，蛍光像を検出する倍率をＭ，スリットの透過率分布の周期をｐとする時，ｐ≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００５７】
本発明の蛍光測定方法の第３の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射し，試料から発生する蛍光による蛍光像を，試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備するアレイセンサにより検出し，泳動方向に配列される光電変換素子のｉ番目の光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とする時，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，Ｑのパワースペクトルを求める。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，光電変換素子が配列されるピッチをｐ１，蛍光像を検出する倍率をＭ，所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）の周期をｐ２とする時，ｐ１ｐ２≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。試料を電気泳動する複数の電気泳動路のそれぞれの少なくとも一部を同一の平面上に平行に配置し，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を電気泳動路に垂直に照射する。
【００５８】
本発明の蛍光測定装置の第１の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，励起光を発生する光源と，試料の泳動方向で周期的に変化する強度分布を与えた励起光を，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射して，試料から発生する蛍光を検出する手段とを有する。蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルは演算装置により求める。単一の光源から放射された励起光を分割して２つの光束とする分割手段を具備し，２つの光束を上記領域で交錯させて干渉させて上記強度分布を生成する，または励起光を照射する角度方向を所定の周波数で周期的に走査する手段と，所定の周波数の整数倍の周波数で励起光を点滅させる手段とによって上記強度分布を生成する，あるいは，励起光を照射する角度方向を所定の周波数で周期的に走査する手段と，所定の周波数の整数倍の周波数で励起光の強度の強弱を変化させる手段とによって上記強度分布を生成する。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，励起光の強度分布の周期をｐとする時，ｐ≒π（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００５９】
本発明の蛍光測定装置の第２の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，試料から発生する蛍光による蛍光像を，試料の泳動方向で周期的に変化する透過率分布を持つスリット上に結像するレンズと，蛍光像を検出する検出器とを有し，スリットが領域と検出器との間に配置される。蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルは演算装置により求められる。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，レンズの倍率をＭ，スリットの透過率分布の周期をｐとする時，ｐ≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。
【００６０】
本発明の蛍光測定装置の第３の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備し，試料から発生する蛍光による蛍光像を検出するアレイセンサと，泳動方向に配列される光電変換素子のｉ番目の光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とする時，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有する。試料の並進拡散係数をＤ，試料の泳動速度をＶ，試料の泳動方向での励起光が照射される領域の長さをＬ，光電変換素子が配列されるピッチをｐ１，蛍光像を検出する倍率をＭ，所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）の周期をｐ２とする時，ｐ１ｐ２≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２とする。複数の電気泳動路を具備し，各電気泳動路の少なくとも一部を同一の平面上に平行に配置し，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を各電気泳動路に垂直に照射する。
【００６１】
本発明の蛍光測定装置の第４，第５の構成では，荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる各電気泳動路の少なくとも一部が同一の平面上に平行に配置される複数の電気泳動路と，試料の濃度分布が熱平衡状態にあり，試料が泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源とを具備する。
【００６２】
本発明の蛍光測定装置の第４の構成では，さらに，試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備し，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を各電気泳動路に垂直に照射して，試料から発生する蛍光による蛍光像を検出する２次元検出器と，泳動方向に配列される光電変換素子のｉ番目の光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とする時，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有する。
【００６３】
本発明の蛍光測定装置の第５の構成では，さらに，試料の泳動方向に配列したＮ１(Ｎ１≧２)個の光電変換素子で構成されたアレイを，試料の泳動方向に直交する方向にＮ２(Ｎ２≧２)列並べて構成され，各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，上記平面に平行又は垂直な方向から励起光を各電気泳動路に垂直に照射して，試料から発生する蛍光による蛍光像を検出する２次元検出器と，蛍光像を光電変換素子の面に結像するレンズと，光電変換素子の２次元配列の試料の泳動方向でｉ番目にあり，光電変換素子の２次元配列の試料の泳動方向と直交する方向でｊ番目にある光電変換素子により検出される蛍光強度をｑｉｊとし，Ｋを絶対値１を含む定数，変数ｉを変数とする所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）とする時，１≦ｎ１<ｎ２≦Ｎ２を満たす整数ｎ１,ｎ２に対し，１≦ｉ≦Ｎ１，ｎ１≦ｊ≦ｎ２を満たすｉ，ｊに対する積和Ｑ＝Σｑｉｊを求め，Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有する。
【００６４】
本発明の構成によれば，蛍光強度の測定のみから試料の泳動速度を測定でき，従来の電気泳動で必要とされる試料注入点から試料検出点までの長い距離での，試料の泳動が不要となり，電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅に起因する泳動分離の低下も起こらないため，泳動路長の著しい短縮が期待できる。
【００６５】
本発明の蛍光測定方法及び蛍光測定装置は，ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸又は核酸断片，アミノ酸，蛋白質等の荷電をもつ生体分子の分析，荷電をもつ蛍光色素等の分子を結合させた糖等の中性分子の分析を行なう電気泳動方法及び電気泳動装置に好適に適用される。
（第１の実施例）
図３は本発明の第１の実施例の蛍光測定装置の外観図である。装置本体９は直方体の形状をしており，その内部は点線で示される隔壁１３によって２つの領域に分離される。扉１２を含む領域（試料室）には，試料，電気泳動路，泳動媒体が置かれ，温度調節がなされる。他方の領域には，光源，光源の電源，コンピュータとの通信を制御するユニット，モーターのコントローラ等が設置され，光源から発生した熱は排気孔１４から放熱される。装置本体９はパーソナルコンピュータ１０と接続ケーブル１１を介して接続され，ケーブル１１を介して装置本体の制御とデータの通信が行われる。データはパーソナルコンピュータ１０内部のプロセッサにより解析され，解析結果はディスプレイに表示される。第１の実施例の詳細な説明を行うため，図３に示すように装置本体の各辺に平行な座標軸を持つｘｙｚ座標系を用いる。ｙｚ平面は，励起光束の光軸及び電気泳動路の中心軸を含む面に平行である。
【００６６】
図４は第１の実施例の装置本体９の，ｙｚ平面に平行で励起光束の光軸を通る断面を，ｘ軸方向から見た図である。光源１５は波長４８８ｎｍ，出力１０ｍＷのアルゴンイオンレーザである。光源１５からの光を，波長４８８±１０ｎｍの光だけを通すフィルタ１７を透過させて，フィルタの透過光１８が試料の励起光として用いられる。フィルタ１７はホルダー１６によって光源１５に取付けられる。励起光１８はビームスプリッター１９によって強度比１：１で振幅分割され，ビームスプリッターの透過光２１はミラー２２で反射されてビームスプリッターによる反射光２０と電気泳動路２の位置で交わり，干渉縞を形成する。電気泳動路は角型石英製キャピラリーの内部に形成され，電気泳動路の断面形状は，内周が一辺７５μｍの正方形，外周が一辺３５０μｍの正方形である。電気泳動路の全長は３０ｍｍであり，キャピラリーは泳動方向がｚ軸となるよう設置される。
【００６７】
キャピラリーの下端から励起光の照射点，即ち，蛍光の検出点（検出領域）までは１０ｍｍである。反射光２０と透過光２１の径を，電気泳動路を効率良く照射するよう円筒面レンズ２３により，光束の電気泳動路に直交する方向（ｘ方向）で絞る。光源１５は直径（ｅ−２直径）１ｍｍの平行光束を出力する。円筒面レンズの焦点距離は５０ｍｍである。電気泳動路上での励起光束の断面の強度分布は，直径（ｅ−２直径）が，ｚ方向で１ｍｍ，ｘ方向で５０μｍの楕円状ガウシアンである。また，電気泳動路に照射される励起光のパワーは，フィルタ，レンズ等の損失により，７ｍＷとなる。
【００６８】
キャピラリー２の下端は，所定の濃度の試料２４に浸かっており，試料２４を介して電極４に接続される。キャピラリーの上端は分岐ブロック２５を介して泳動媒体で満たされたシリンジ２６に接続される。シリンジ２６がステッピングモーターを組み込んだ自動直進ステージ２８で押されることにより，シリンジ内の泳動媒体がキャピラリー内に充填される。シリンジ２６と自動直進ステージ２８の間には圧力センサ２７が設けられており，モーターのコントローラが泳動媒体のキャピラリー内への充填時の圧力をモニタしてフィードバックすることにより，所定の一定圧力を保ちつつ泳動媒体がキャピラリー２に充填される。キャピラリーの全長が３０ｍｍと非常に短いため，１ｋｇｆの圧力で２０秒間充填することにより，泳動媒体が３％のポリアクリルアミド水溶液である場合，キャピラリ内容積の８倍以上に相当する量の泳動媒体を充填できる。以下の説明では，キャピラリー下端を試料注入端，キャピラリー上端を泳動媒体注入端と呼ぶ。
【００６９】
図５は第１の実施例の装置本体９の，ｘｚ平面に平行で励起光束２１の光軸を通る断面を，ｙ軸の負方向から見た図である。光源１５は鉛直下向きに光を出力するようブラケット２９に取付けられる。ビームスプリッター１９は，直進ステージ３１−ａに搭載される回転ステージ３２−ａにマウントされ，ミラー２２は，直進ステージ３１−ｂに搭載される回転ステージ３２−ｂにマウントされており，ビームスプリッター１９とミラー２２の位置と角度を微調整できる。ビームスプリッターの反射光２０の光軸と，ビームスプリッター１９の透過光２１のミラー２２による反射光の光軸とがなす角の２等分線が，泳動路２と垂直になるように，ビームスプリッター１９とミラー２２の位置と角度が調整される。この状態で，キャピラリー及び泳動媒体の屈折率によらず，電気泳動路上での干渉縞の周期ｐが，（数３８）で与えられる。
【００７０】
【数３８】
ｐ＝λ／（２ｓｉｎ（θ／２）） …（数３８）
θはビームスプリッターの反射光２０の光軸と，ビームスプリッター１９の透過光２１のミラー２２による反射光の光軸とが，空気中でなす角度である。第１の実施例ではθを１．５°〜６°の範囲の任意の値に設定でき，その結果，ｐは約５μｍ〜２０μｍの範囲で連続的に設定できる。光源１５で発生した熱はファン３０により放熱される。
【００７１】
図６は装置本体９の試料室内を，扉１２を開いて前方（ｙ軸方向）から見た図である。試料室は，装置本体の外壁３３と装置内部の隔壁１３により囲まれており，内部には送風機４６による風が常に循環し，温度が一様に保持される。
【００７２】
試料の分析が開始すると，ヒーター４７と温度センサ４８により，風の温度はパーソナルコンピュータ上で設定された値に制御される。温度センサ４８は白金測温抵抗体である。分岐ブロック２５はシリンジ２６とキャピラリー２をフェラル３４を介して接続するだけでなく，中央部のＴ字分岐によって，チューブ３６とニップル３５−ａ，３５−ｂを介して，バッファータンク３７とキャピラリー２の泳動媒体注入端を接続する。バッファータンク内は泳動用のバッファーで満たされており，電極５がバッファーに浸るように，バッファータンクを設ける。電極５に正の高圧が印加され試料の注入と泳動が行われる。第１の実施例で用いた泳動用バッファーは，８９ｍＭのＴｒｉｓ，８９ｍＭのホウ酸，１ｍＭのＥＤＴＡの組成を持つＴＢＥである。
【００７３】
なお，第１の実施例では負イオンであるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を主な分析対象としているため，試料注入端の電極４に対して泳動媒体注入端に接続された電極５の電位を正としているが，正に帯電した試料を分析する場合は，電圧の極性を逆にすれば良い。
【００７４】
バッファータンク内の流路はソレノイド３９に固定されたピストン３８によって開閉が制御され，泳動媒体注入時には流路が閉じられ，泳動時は開かれる。分析される試料２４，２４−２は自動回転ステージ４０及び自動ｚ軸ステージ４１の上に搭載される。自動回転ステージ４０には，直径１００ｍｍの円周上に，２４本の試料と洗浄用水槽６０と泳動媒体廃棄用水槽６１を配置できる穴をもつ。
【００７５】
自動ｚ軸ステージ４１の上下動と自動回転ステージ４０の回転及び自動直進ステージ２８が連動することにより，キャピラリーの試料注入端の洗浄，泳動媒体の充填，２４本までの試料の分析が自動で実行される。試料をセットする穴には１〜２４の番号がついており，以後この番号を試料番号と呼ぶ。
【００７６】
キャピラリー内の試料から発生する蛍光は，レンズ４２によって集光されて平行光束にされた後に，蛍光の波長成分のみを通し，励起光を遮断するフィルタ４３を透過し，レンズ４４によってスリット４５上に実像を結ぶ。第１の実施例ではフィルタ４３の透過域は５１０ｎｍ−５６０ｎｍであり，フルオロセイン，シアゾールオレンジ，オキサゾ―ルイエロー系の蛍光色素で標識された試料に好適に使用できる。スリット４５は，キャピラリーの中心軸に平行な細長い穴を有する厚さ０．１ｍｍのステンレス板であり，励起光のキャピラリー表面に於ける散乱光を遮断し，試料からの蛍光を通すためのものである。
【００７７】
２つのレンズ４２，４４から構成されるレンズ系の倍率は２０倍，開口数は０．４であり，スリット上のキャピラリー像の大きさは，外壁の幅が７．２ｍｍ，内側の泳動路の幅が１．５ｍｍである。外壁に於ける散乱光を良く遮断し，泳動路からの蛍光を効率良く通すため，レンズ系によるボケと収差の影響を考慮してスリット４５の穴の幅は４ｍｍとしてある。スリット４５の穴を通過した光は検出器７によって検出される。検出器７はヘッドオン型の光電子増倍管（photomultiplier，ＰＭ）であり，量子効率は約１０％，電流増倍率は約５０万倍，光電面は直径２５ｍｍの円形である。
【００７８】
図７は第１の実施例に於ける，検出器の出力信号の処理と，自動ステージ等の制御の流れを示す系統図である。検出器７の出力電流は，電流電圧変換回路４９によって電圧信号に変換された後に，ハイパスフィルタ５０でＤＣ成分が遮断され，更に，ローパスフィルタ５１で周波数帯域が制限された後に，アナログデジタル（ＡＤ）変換ユニット５２によって，２５０Ｈｚのサンプリング周波数で，１６ビットの分解能でデジタル信号として標本化される。
【００７９】
電流電圧変換回路４９のゲインは１０６Ｖ／Ａ，ハイパスフィルタ５０はＡＣ結合の増幅器を兼ねており，そのゲインは０．２Ｈｚ〜５０ｋＨｚに於いて２０±０．５ｄＢである。また，ローパスフィルタは８次の連立チェビシェフ型で，そのゲインは，ＤＣ〜９６Ｈｚの範囲で±０．２ｄＢ以内で平坦であり，１５０Ｈｚ以上では−８０ｄＢ以下となっており，サンプリング周波数２５０Ｈｚでは１００Ｈｚ以下でのエイリアスは−８０ｄＢ以下に押さえられる。従って，周波数範囲０．２Ｈｚ〜９６Ｈｚの範囲で有効な，精度±０．７ｄＢ以内，ダイナミックレンジ８０ｄＢのスペクトル解析を行うことが可能である。
【００８０】
ＡＤ変換ユニット５２による変換結果は，装置本体９の内部に組み込まれた中央処理ユニット５３とＬＡＮコントローラ５４を介し，パーソナルコンピュータ１０内のメモリに転送される。パーソナルコンピュータ１０内のマイクロプロセッサはユーザによって設定された所定の個数のデータを基にＰＭの出力電流のゆらぎのパワースペクトルを計算し，結果をディスプレイに表示する。
【００８１】
なお，第１の実施例では，一連のデータを高速フーリエ変換（ＦＦＴ）によってフーリエ変換し，その絶対値の２乗として，パワースペクトルを求める。ユーザはＦＦＴに用いるデータの個数を１２８〜４０９６の間の任意の２のべき乗の値に設定できる。
【００８２】
第１の実施例では装置本体９とパーソナルコンピュータ１０の間のインタフェースとして，ＬＡＮインタフェースを採用したが，ＲＳ−２３２Ｃ，ＧＰ−ＩＢ，ＵＳＢ等標準的なインタフェースならば何でも良い。信号と同様に，パーソナルコンピュータ１０で設定された試料室内の温度，シリンジを押す圧力，時間，泳動電圧，分析する試料の番号は，ＬＡＮインタフェースを介して中央処理ユニット５３に送られる。
【００８３】
中央処理装置５３は，モーターコントローラ５５を介して自動直進ステージ２８，自動回転ステージ４０，自動ｚ軸ステージ４１を制御し，また，温度コントローラ５６を介してヒーター４７へ入力される電力を制御する。モータコントローラ５５は圧力センサ２７の出力を基に自動直進ステージ２８の移動速度を制御し，温度コントローラ５６は温度センサ４８の抵抗値を基にヒーター４７へ入力する電力を制御する。
【００８４】
また，中央処理装置５３は，デジタル出力５８を介して高圧電源３のオンオフ，ソレノイド３９によるバッファータンク３７の開閉，光源１５の電源５９のオンオフを制御し，低電圧のアナログ出力５７を介して高圧電源３の出力電圧を制御する。
【００８５】
図８は第１の実施例によるＤＮＡ試料の実際の分析結果例であり，同一の試料に対して，泳動媒体を泳動バッファと同一のＴＢＥとして，４種の泳動電圧５０，１００，１５０，２００Ｖ／ｃｍで泳動を行った時の蛍光のゆらぎのパワースペクトルを示す。泳動電圧以外の条件は共通であり，干渉縞の周期ｐ＝１０μｍ，温度は３０°Ｃ，ＦＦＴを実行するためのデータの収集個数は２５６個，時間的には約１秒間である。データの収集は，５０Ｖ／ｃｍでの試料の注入を開始してから約２分待ち，キャピラリー内の検出領域（泳動方向の長さＬ＝１ｍｍ）の全体に試料が分布してから行い，その後，泳動電圧を１００，１５０，２００Ｖ／ｃｍに変化させて，それぞれの泳動電圧の場合に，約１秒ずつデータを収集した。
【００８６】
試料は，蛍光色素ＴＯＴＯ−１を結合した塩基長約４８０００ｂｐの２本鎖λ−ＤＮＡである。濃度０．１μＭのＴＯＴＯ−１のジメチルスルホオキシド（DMSO）溶液１０μＬと，試料溶液を，濃度５００ｎｇ／ｍＬのλ−ＤＮＡのＴＢＥ溶液１５０μＬを混合することにより調整した。蛍光色素ＴＯＴＯ−１はモレキュラープローブ社から発売されているシアゾールオレンジの誘導体の２量体であり，２０塩基〜３０塩基に１分子の割合で２本鎖ＤＮＡと結合し，その吸収ピークは５１４ｎｍ，蛍光ピークは５３３ｎｍである。
【００８７】
図８に示すスペクトルのピークの中心周波数は１７Ｈｚ，３３Ｈｚ，５２Ｈｚ，６８Ｈｚであり，対応する試料の泳動速度はそれぞれ，０．１７ｍｍ／ｓ，０．３３ｍｍ／ｓ，０．５２ｍｍ／ｓ，０．６８ｍｍ／ｓとなり，ほぼ泳動電圧に比例する。これらの結果から求めたＴＢＥ中に於けるλ−ＤＮＡの移動度は，３．４×１０−８ｍ２Ｖ−１ｓ−１となり，従来技術−２に記載の図３から求めた移動速度の値，約３．５×１０−８ｍ２Ｖ−１ｓ−１と良く一致する。
【００８８】
図９は，第１の実施例に於いて複数の異なる試料を，連続自動運転により分析する時のフローチャートである。このフローチャートは，泳動媒体として３％のポリアクリルアミドのＴＢＥ溶液を用い，泳動電圧２００Ｖ／ｃｍ，温度３０°Ｃで，１００ｂｐ〜１０００ｂｐのＴＯＴＯ−１で染色されたＤＮＡの分析を想定している。この条件でのＤＮＡの泳動速度は，０．２６ｍｍ／ｓ〜０．４５ｍｍ／ｓの範囲であるので，注入開始から検出点（検出領域）に試料が到達するには４０秒あれば十分である。分析する試料は，試料１，試料２，…，試料ＮのＮ個である。
【００８９】
装置本体は，電源投入時の初期動作として，キャピラリの試料注入端が泳動媒体廃棄用水槽６１に浸かるようになっており，測定は必ずこの状態からスタートする。測定が開始時に１の値に初期化されるパラメータｎとＮとの大小を比較して，測定すべき試料がまだ残っているかどうか判断し，無ければ測定終了となる。測定すべき試料があれば，設定温度を目標として温度制御を開始し，温度の実測値が目標値と±０．１°Ｃ以内で一致する場合，ゲル充填を２０秒行う。その後，キャピラリの試料注入端を洗浄用の水槽６０に浸して１０秒間待ち，キャピラリ試料注入端を洗浄した後に，測定すべき試料を連続的に注入し始め，４０秒後から設定されたデータの収集数に応じた時間，データを収集する。
【００９０】
データ収集終了後は泳動用の電源をオフし，キャピラリーの試料注入端を再び泳動媒体廃棄用水槽６１へ戻し，ｎ＝ｎ＋１としてから，次の測定サイクルへと進む。第１の実施例では，泳動媒体廃棄用の水槽と洗浄用の水槽を分離し，キャピラリーの試料注入端が，洗浄用水槽６０へ浸る前に必ず泳動媒体廃棄用水槽６１に浸るプロトコルとなっており，キャピラリ先端に付着した試料が洗浄用水槽６０へ混ざりこむのを防ぎ，試料の連続測定に於けるキャリーオーバーをほぼ完全に防いでいる。
【００９１】
１００ｂｐ〜１０００ｂｐのＤＮＡの核酸係数Ｄをほぼ１０−１１ｍ２／ｓのオーダーと見積もり，この値とＬ＝１ｍｍ，Ｖ＝０．３ｍｍ／ｓを用い，（数１０）よりｐ０を求めると，ｐ０＝１８μｍとなる。１００ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲のＤＮＡの分析時には，ｐ＝２０μｍとする。他の試料を分析する場合には，その試料の泳動速度と拡散係数に応じて，（数２０）に従ってｐを設定すれば良い。
【００９２】
第１の実施例の条件（Ｌ＝１ｍｍ，ｐ＝２０μｍ，ｐ０＝１８μｍ）では，（数９）から理論段数（ＮＴＰ）＝２８１０であり，（数１１）より，移動度の平均値がμＡＶ，移動度の差がΔμである２種の検体に対してほぼ完全な分離が得られる条件は，Δμ／μＡＶ≧０．１１３となる。
【００９３】
図１０は，図９のプロトコルを用いて，図８の測定と同様にＴＯＴＯ−１で染色された２本鎖ＤＮＡ試料の分析の,（数３）と（数７）を用いた数値シミュレーション結果例を表すパワースペクトルである。図１０（Ａ）は，３００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，図１０（Ｂ）は，４００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例を，図１０（Ｃ）は，４５０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例を，図１０（Ｄ）は，４９０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例を，それぞれ示す図である。なお，泳動電圧２００Ｖ／ｃｍに於ける，３００ｂｐ，４００ｂｐ，４５０ｂｐ，４９０ｂｐ，５００ｂｐのＤＮＡの泳動速度をそれぞれ，０．３４７ｍｍ／ｓ，０．３２３ｍｍ／ｓ，０．３１３ｍｍ／ｓ，０．３０５ｍｍ／ｓ，０．３０３ｍｍ／ｓとし，Ｌ＝１ｍｍ，ｐ＝２０μｍ，ｐ０＝１８μｍ，Ｄ＝１×１０−１１ｍ２／ｓとした。
【００９４】
図１０（Ａ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．１３５であり，２つのピークの裾野の間はノイズレベルまで下がっており，２つのピークは，ピーク全体として完全に分離されている。図１０（Ｂ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．０６４であり，２つのピークは，２つのピークの裾野の間でわずかにオーバーラップしており，２つのピークはピーク全体として理想的に完全に分離されていない。図１０（Ｃ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．０３２であり，２つのピークは，２つのピークの間でオーバーラップしており，ピーク位置は分離して検出されるが，２つのピークは全体として分離されていない。図１０（Ｄ）に示す例では，Δμ／μＡＶ＝０．００７であり，２つのピークは，重複しており分離されていない。
【００９５】
図１０のスペクトルは，約８秒間収集した４０９６点のデータから計算したパワースペクトルを直接表示しており，ノイズが見られるが，データの収集とパワースペクトルの計算を繰返し，得られるパワースペクトルを積算すればＳＮＲを向上できる。
【００９６】
第１の実施例では，試料を標識する蛍光色素としてＴＯＴＯ−１を使用したが，ＹＯＹＯ−１（モレキュラープローブ社から発売されている）を使用しても，殆ど同様の解析が可能である。ＹＯＹＯ−１は，ＤＮＡに結合する数がＴＯＴＯ−１よりも多いため，より高いＳＮＲを得ることが可能である。色素に応じて光源１５とフィルタ４３を交換すれば他の色素，例えば，ローダミン系色素等も好適に使用できる。また，２量体によって予め染色するのではなく，泳動媒体中にＴＯ−ＰＲＯ−１，ＹＯ−ＰＲＯ−１（モレキュラープローブ社から発売されている）等の単量体色素を分散させておき，無標識のＤＮＡを注入して電気泳動路内で，ＤＮＡに色素に結合させても良い。
（第２の実施例）
図１１は本発明に於ける第２の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図である。第２の実施例の構成要素は，光干渉系を用いない点，スリット４５の構成の点で第１の実施例と異なる。第２の実施例では，出力１０ｍＷ，波長４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザ（光源１５）から，励起光が，直径（ｅ−２直径）１ｍｍの円形断面を持つ平行光束として，水平方向に射出される。励起光は，励起光フィルタ１７を透過した後に，円筒面レンズ２３で鉛直方向の径を５０μｍに絞られ，水平方向に配置される第１の実施例と同じ寸法を持つ角型石英製キャピラリーに形成される電気泳動路２に照射される。電気泳動路中の試料から発生する蛍光は，レンズ４２，フィルタ４３，レンズ４４，スリット４５，検出器７からなる検出光学系で検出される。検出光学系の構造は，光軸が鉛直下向きになっている他は第１の実施例とほぼ同じであり，スリット４５が置かれた位置に倍率２０倍で検出領域の実像が結像される。
【００９７】
図１２は第２の実施例に使用されるスリット４５の拡大図である。スリット４５は，表面を黒色処理され，３つの長方形の穴を持つ金属板である。長方形の穴のそれぞれに，試料が電気泳動される方向で透過率が，三角関数又は矩形関数に従い周期的に変化する基板６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃが埋め込まれる。検出領域の実像が形成される位置に置かれる基板は，スリット４５を長手方向にスライドさせて，３種類の基板から任意に選択できる。
【００９８】
基板６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃの透過率が変化する周期ｐは，それぞれ，０．２ｍｍ，０．４ｍｍ，０．８ｍｍである。図１２に示す基板６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃの例では，透過率の大の部分（白色部）と透過率の小の部分（黒色部）の対はそれぞれ，１００個，５０個，２５個形成されている。
【００９９】
基板に結像される像の倍率が２０倍であるので，これらの基板を像位置に設置することは，（数４）に於いてそれぞれ，ｐ＝１０μｍ，ｐ＝２０μｍ，ｐ＝４０μｍとすることとほぼ等価となる。第２の実施例で分析する試料は，第１の実施例で用いた３００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合溶液，４００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料，４５０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料，４９０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料であるので，ｐ＝２０μｍを選択し，第１の実施例と同様に検出器７の出力を処理することにより，第１の実施例と同一の結果を得ることが出来る。より一般的には，スリット４５上に結像される像の倍率をＭとすると，（数２０）は（数３９）に相当する。
【０１００】
【数３９】
ｐ／Ｍ〜ｐ０ …（数３９）
第２の実施例では励起光の照射光学系に光干渉系を使用しないため，振動や衝撃に強いという効果があり，その結果，ポータブルの装置とすることが可能である。また，ｐの変更は，スリット４５をスライドするだけで迅速に実行でき，微動ステージの調整等の作業が不要であり，試料の拡散係数が未知で複数のｐに対して分析を行なう場合等に好適である。
【０１０１】
図１３は，第２の実施例の蛍光測定装置の電気泳動路２の周辺の，泳動路を含む鉛直な面による拡大断面図である。図１４は，図１３に示された電気泳動路の周辺部を下方から見た図である。キャピラリーで構成される電気泳動路２は，透明なポリカーボネート製の支持体６３に埋め込まれ，電気泳動路２の両端は支持体６３に穿たれた試料槽６４とバッファー槽６５に連結する。試料槽６４とバッファー槽６５の底はそれぞれ，表面が絶縁処理された厚さ０．１ｍｍのステンレス製の底板６７−ａ，６７−ｂで封じられる。
【０１０２】
支持体６３，電気泳動路２，底板６７−ａ，６７−ｂは，相互に接着剤によりシールされる。穴６６−ａ，６６−ｂは，支持体６３を検出光学系に固定するための穴である。まず，バッファー槽６５及び電気泳動路２に，シリンジによって泳動バッファーを兼ねた泳動媒体が充填される。試料槽６４に，マイクロピペットにより試料が分注された後に，電極４と電極５によって電気泳動が実行される。
【０１０３】
第２の実施例では，キャピラリーの全長は６ｍｍであり，検出領域は，その中心に位置し，幅１ｍｍである。従って，泳動を開始してから，検出領域全体に試料が分布するまでに必要な泳動長さは，わずか３．５ｍｍであり，例えば，０．３ｍｍ／ｓ〜０．４ｍｍ／ｓの泳動速度を持つ試料については，泳動開始からデータ収集までの待ち時間は１０秒前後で済むという利点がある。更に，泳動路の全長がわずか６ｍｍであるので，例えば，２００Ｖ／ｃｍの電圧勾配の時の両端の電位差は１２０Ｖにすぎず，従来の電気泳動に用いられたような１０ｋＶ以上の高圧電源は不要であり，高圧用の絶縁対策も不要である。
【０１０４】
また，図１３のような構造にして，下方から蛍光を検出を行なうので，作動距離の短い非常に明るいレンズを使用でき，第１の実施例に比べて，高い感度を実現できる。第２の実施例では，レンズ４２として開口数０．７５，作動距離０．６１ｍｍの対物レンズを使用する。
【０１０５】
第２の実施例では，図１３に示した支持体６３と電気泳動路２の部分は，使い捨てであり，意図しない異なる試料の混入が起こらず，空気中の浮遊物質等の混入の危険も，電気泳動路を繰返し使用する場合より低く押さえることができ，ＲＮＡや蛋白質のように酵素と反応しやすく，ＤＮＡよりも不安定な物質でも安全に分析できる。
（第３の実施例）
図１５は本発明の第３の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図である。第３の実施例では，点滅するビームスポットを高速にスキャンして，三角関数又は矩形関数に従い周期的に変化する強度分布を持つ励起光を電気泳動路の検出領域に照射する。光源１５として，波長λ＝５３２ｎｍ，出力１０ｍＷ，ビーム直径３ｍｍのガウシアンビームを出力するネオジウムヤグ（ＮｄＹＡＧ）の第２高調波レーザを使用する。
【０１０６】
光源１５から放射された光束を，中心波長５３２ｎｍ，半値幅１０ｎｍのフィルタ１７を透過させて，スペクトル純度を高めた後に，音響光学偏向器（ＡＯＤ）７０に入力される。ＡＯＤ７０は，超音波トランスデューサ７５が貼り付けられたモリブデン酸塩の単結晶である。超音波トランスデューサ７５は，ＡＯＤドライバー７１から入力されたラジオ周波数（ＲＦ）信号を超音波に変換する。超音波はＡＯＤ７０内を伝搬する。
【０１０７】
ＡＯＤ７０に入力された光束は，この超音波によって回折を受け，ＲＦ信号の周波数に応じて，その進行方向を変える。図１３では，ＡＯＤ７０による回折を受けなかった時の透過光を点線で，回折光を太い実線で示す。ＲＦ信号がオフの時は，ＡＯＤ７０に入力された光は回折を受けず全て透過光となり，ビームストップ７６に吸収される。ＲＦ信号の周波数νと，回折角θの間には（数４０）の関係が有る。ｃｓはＡＯＤ内の音速であり，第３の実施例では，ｃｓ＝３６３０ｍ／ｓである。
【０１０８】
【数４０】
θ＝２ｓｉｎ−１｛λν／（２ｃｓ）｝ …（数４０）
ＡＯＤドライバ７１には，ＲＦ信号の出力端子の他に，変調信号と同調信号との２つの入力端子がある。ＲＦ信号の振幅は，０〜１Ｖの範囲の変調信号ＶＭに比例して，０から最大出力まで振れられる。回折光の強度は，ＲＦ信号の振幅に比例するので，その結果，変調信号に比例する。また，ＲＦ信号の周波数νと，２Ｖ〜１２Ｖの範囲の同調信号ＶＴ［Ｖ］との間には，（数４１）の関係があり，６０ＭＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲で変調できる。
【０１０９】
【数４１】
ν＝４（ＶＴ−２）＋６０［ＭＨｚ］ …（数４１）
ＡＯＤドライバ７１の変調信号入力に任意波形発生器７２の出力ｏｕｔ１が入力され，ＡＯＤドライバ７１の同調信号入力に任意波形発生器７２の出力ｏｕｔ２が入力される。ｏｕｔ１から最小値が０Ｖ，最大値が１Ｖの正弦波が出力され，ｏｕｔ２から最小値が２Ｖ，最大値が１２Ｖの鋸波が出力される。ｏｕｔ１とｏｕｔ２は，任意波形発生器７２に内蔵された共通の２００ＭＨｚの基準クロック信号から生成され，出力信号の周波数比を正確に整数とし，位相を完全に同期させることができる。
【０１１０】
ＡＯＤ７０による回折光は，波長５５０ｎｍ以下の光を反射し，波長５５０ｎｍ以上の光を透過させるダイクロイックミラー７３で反射させられ，レンズ４２で直径２０μｍに絞られ，石英基板７４の上に彫られた電気泳動路２の中心に照射される。
【０１１１】
電気泳動路２の泳動方向の長さは１．５ｍｍであり，電気泳動路２の泳動方向に直交する断面は，幅，深さともに５０μｍの正方形である。レンズ４２は，明るさ０．９５，焦点距離ｆ＝１０５ｍｍのカメラレンズである。レンズ４２の光軸は，ＡＯＤドライバ７１のＲＦ信号の周波数が平均値νｍ＝８０ＭＨｚの時のＡＯＤ７０による回折光の光軸と一致させてある。
【０１１２】
石英基板７４には，電気泳動路２に連結した試料槽６４とバッファー槽６５が設けられる。マイクロピペットにより泳動媒体をバッファー槽６５と電気泳動路２に満たし，マイクロピペットにより試料を試料槽６４に満たす。その後，電源３により，試料槽の中に設けられた電極５とバッファー槽の中に設けられた電極４との間に電圧が印可され，試料が電気泳動される。
【０１１３】
第３の実施例では，泳動路長は１．５ｍｍであるから，２００Ｖ／ｃｍの電圧を印加しても必要とされる電源電圧は３０Ｖにすぎず，弱電用の電源で十分であり，高圧用の絶縁対策は不要である。
【０１１４】
試料から発生する蛍光は，レンズ４２によって集光され，平行光束となってダイクロイックミラー７３と，中心波長５７０ｎｍ，半値幅４０ｎｍのフィルタ４４，スリット４５を透過し，レンズ４４でスリット４５上に結像し，検出器７で検出される。
【０１１５】
第３の実施例は，ＰＯＰＯ−３（モレキュラープローブ社から発売されている）等で標識された試料に好適に適用できる。第３の実施例では，レンズ４４の焦点距離を２１０ｍｍとして倍率２倍の結像系を構成し，スリット４５の幅は５０μｍである。
【０１１６】
検出器７の出力は，第１の実施例と全く同様に処理され，サンプリング周波数２５０Ｈｚで標本化される。第３の実施例の条件の下では，（数４０）は，θ＝λν／ｃｓと近似できるので，ビームスポットの中心位置からの変位δは（数４２）により表され，ビームスポットは変調信号の周波数で点滅しながら同調信号の周波数で走査される。
【０１１７】
【数４２】
δ＝ｆλ（ν−νｍ）／ｃｓ …（数４２）
同調信号の周波数が十分高ければ，（数４）に於いて，Ｌを（数４３）とし，ｐを（数４４）とした場合と同一の効果を実現できる。νＭＡＸはＲＦ信号周波数の最大値であり，νＭＩＮはＲＦ信号周波数の最小値である。第３の実施例では，νＭＡＸ＝１００ＭＨｚ，νＭＩＮ＝６０ＭＨｚである。ｍは変調信号と同調信号の周波数比である。第３の実施例では，同調信号の周波数を１０ｋＨｚとしており，これは検出器出力のサンプリング周波数２５０Ｈｚに比べ十分高い。（数４２）に第３の実施例での数値を代入すると，Ｌ＝０．５９ｍｍとなる。
【０１１８】
図１６は，ｍ＝１０の場合の，変調信号，同調信号，及びＲＦ信号周波数のタイミングチャートであり，ｐ＝５９μｍである。
【０１１９】
【数４３】
Ｌ＝ｆλ（νＭＡＸ−νＭＩＮ）／ｃｓ …（数４３）
【０１２０】
【数４４】
ｐ＝Ｌ／ｍ …（数４４）
第３の実施例では，励起光照射用のレンズと蛍光集光用のレンズを共通にしているため，レンズの枚数及び光学系の調整個所を減少させるという利点がある。また，第２の実施例と同様，光学系に干渉系を含まないため振動や衝撃に強く，野外での使用にも適する。更に，励起光強度分布の周期ｐの変更を，機械的な可動部なしで純電気的に行えるので，同一の試料に対して多くのｐの値に対するデータを自動的に取得する測定に適する。
【０１２１】
なお，第３の実施例では，励起光の進行方向を変化させてスキャンするために音響光学偏向器を用いたが，ガルバノミラーを用いても良い。また，第３の実施例では，レーザビームスポットの強度を，三角関数に従い周期的に変調したが，矩形関数に従い周期的に強弱をつけて，検出領域を高速にスキャンし，周期的に変化する強度分布を持つ励起光を照射しても良い。
【０１２２】
以下に説明する実施例では，周期的に変化する強度分布を持つ励起光を照射しないで，一様な強度をもつ励起光を検出領域に照射し，１次元又は２次元の光検出器を使用して試料から発生する蛍光を検出して，演算処理装置により検出された蛍光のパワースペクトルを求める。
（第４の実施例）
図１７は本発明の第４の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図である。第４の実施例の構成は，第２の実施例と類似の構成である。即ち，光源１５からの励起光を電気泳動路２に照射して，試料から発生する蛍光をレンズ４４で結像するまでは同一である。第４の実施例では，第２の実施例でのスリット４５を使用せず，検出器７として１次元のイメージセンサを用いる。電気泳動される試料の像が動く方向と，イメージセンサの各光電変換素子が並ぶ方向とを一致させて配置する。イメージセンサの光電変換素子の面はレンズ４４の結像位置に置かれる。
【０１２３】
図１８は，検出器７として用いたイメージセンサの光電変換素子の面の拡大図である。２４．５ｍｍ×１ｍｍの光電変換素子の面のエリアが，１０２４個の光電変換素子８０−１〜８０−１０２４に分割される。各光電変換素子のサイズは０．０２４ｍｍ×１ｍｍである。検出器７では，（１）８ｍｓの露光，（２）その後の２ｍｓの時間で，各光電変換素子に蓄積された電荷の読み出しからなるサイクルが繰り返される。
【０１２４】
読み出された電荷はＡＤ変換され，ＡＤ変換結果はパーソナルコンピュータ１０のメモリに転送される。パーソナルコンピュータ１０のマイクロプロセッサは，光電変換８０−１〜８０−１０２４に蓄積された電荷の値ｑ１〜ｑ１０２４を基に，（数４５）の値ｑを計算する。Σｉは，ｉ＝１〜１０２４について行なう。ｐ２は周期関数の周期であり，ｋ２＝２π／ｐ２は，試料を含む溶液の性質に応じて定められべき定数である。ｑの値は（数１）に（数４６）を代入して得られる値に近似的に比例する。
【０１２５】
【数４５】
ｑ＝Σｉ｛ｑｉｃｏｓ（ｋ２ｉ）｝ …（数４５）
【０１２６】
【数４６】
Ｉ（ｒ）＝Ｉ０ｅｘｐ｛−８（ｘ／Ｌ）２｝ｅｘｐ｛２πＭｘ／（ｐ１ｐ２）｝×ｅｘｐ｛−８（ｙ／Ｗ）２｝ｅｘｐ｛−８（ｚ／Ｈ）｝ …（数４６）
ｐ１は，光電変換素子８０−１〜８０−１０２４のピッチ，Ｍは光電変換素子の面に結像される像の倍率，第４の実施例では，ｐ１＝０．０２４ｍｍ，Ｍ＝２０である。Ｌは，電気泳動路２上での励起光束の泳動方向の幅である，Ｈは，電気泳動路２上での励起光束の泳動方向に直角な方向の幅である。Ｗは，（光電変換素子の泳動方向に直交する方向の長さ）／（倍率Ｍ）の値である。第４の実施例では，Ｌ＝１ｍｍ，Ｈ＝０．０５ｍｍ，Ｗ＝０．０５ｍｍである。
【０１２７】
（数４５）のｑのパワースペクトルの計算により，第４の実施例に於いても，他の実施例とほぼ同様の結果を得ることができる。第４の実施例では，１回のデータの収集だけで，（数４５）に於けるｋ２の値を変えた計算により，第１の実施例に於いてｐを変えて複数回のデータの収集を行うのと同じ結果が得られるという利点がある。第４の実施例では，第１の実施例に於いてｐ＝２０μｍとしたのと同様の効果を得るため，ｐ２＝１６．７μｍとする。より一般的には，（数４７）が（数２０）に相当する。
【０１２８】
【数４７】
ｐ１ｐ２／Ｍ≒ｐ０ …（数４７）
（第５の実施例）
本発明の第５の実施例では，図１７に示す励起光照射及び蛍光検出をする光学系は第４の実施例の構成と殆ど同一の構成であり，検出器７として２次元のイメージセンサを用いる。電気泳動路の周辺部の構造は，第２の実施例及び第４の実施例での電気泳動路の周辺部の構造と類似であるが，第５の実施例では，複数の電気泳動路を集積化し，同時に複数種類の試料を分析できる構成である。
【０１２９】
図１９は，電気泳動路の周辺部を下方から見た拡大図であり，第２の実施例に於ける図１４に相当する。電気泳動路２−１〜２−４は，円形断面をもつ，外径２００μｍ，内径５０μｍの石英製キャピラリーである。キャピラリー２−１〜２−４は，励起光が照射される蛍光の検出点（検出領域）の近傍で，０．２４ｍｍピッチで同一平面をなすように配置される。検出領域の近傍のキャピラリー２−１〜２−４は励起光に垂直に配置される。励起光は，キャピラリー２−１〜２−４が検出領域の近傍でなす平面に平行な方向から照射される。
【０１３０】
キャピラリー２−１を透過した励起光束は，円形断面をもつキャピラリー自身がもつレンズ効果によって，電気泳動路２−２，２−３，２−４の中心に次々と集光される。キャピラリー２−１〜２−４の一端はそれぞれ，別々の試料を注入できるよう，個別の試料槽６４−１〜６４−４へ接続される。キャピラリー２−１〜２−４他端は，一つの共通のバッファー槽６５に接続される。試料槽６４−１〜６４−４，バッファー槽６５にそれぞれ，電気泳動のための電極が配置される。
【０１３１】
２次元イメージセンサとして，正方形の光電変換素子を１０２４行×１０２４列ならべた冷却ＣＣＤを使用する。冷却ＣＣＤの光電変換素子は，キャピラリー２−１〜２−４を試料が泳動する泳動方向，及び，泳動方向と直交する方向の２方向のそれぞれに，ピッチ２４μｍで配列される。励起光が照射されたキャピラリー２−１〜２−４の部分（検出領域）の実像が，倍率２０倍で冷却ＣＣＤの光電変換素子の面に結像される。
【０１３２】
ｉ行ｊ列の光電変換素子に蓄積された電荷量をｑｉｊとして，（数４８）で表されるｑｎを，ｎ＝１，２，３，４のそれぞれの場合に対して計算する。Σｊはｊ＝１〜１０２４についての加算，Σｉはｉ＝２００ｎ＋９２〜２００ｎ＋１３１（ｎ＝１，２，３，４）についての加算を示す。この結果，電気泳動路２−１〜２−４のそれぞれに対して，（数４５）の値を計算した場合と同一の結果が得られ，各ｑｎのパワースペクトルの計算により，試料槽６４−１〜６４−４の試料を同時に分析できる。
【０１３３】
【数４８】
ｑｎ＝Σｊ｛ｃｏｓ（ｋ２ｊ）｝Σｉ｛ｑｉｊ｝ …（数４８）
第５の実施例では，共通の一台の光源から生成された単一の励起光束を，電気泳動路自身がもつレンズ効果を利用して，全ての電気泳動路に同時に照射する。また，電気泳動用の電源も全ての電気泳動路で共通である。その結果，第４の実施例とほぼ同額の部品コストで，４倍のスループットを実現できる。
（第６の実施例）
本実施例では，第１の実施例と同一の構成を用いて，本発明をヒト血液から抽出したゲノムＤＮＡの品質評価に応用した。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR)のテンプレートとしてゲノムＤＮＡを好適に用いるには，ゲノムＤＮＡ断片長が数１０ｋｂｐ以上に分布していることが望まれる。しかし，抽出時の攪拌や保管時の凍結解凍などの影響により，ゲノムＤＮＡが数ｋｂｐ以下の長さに切断される場合がある。そこでPCRにあたっては，随時ゲノムＤＮＡの品質評価をすることが好ましい。
【０１３４】
本実施例で評価したゲノムＤＮＡは，ヒト全血１００μＬを原料とし，キアゲン (Qiagen) 社から市販されているＤＮＡ抽出キットを使用して，以下のプロトコルに従って抽出した。全血１００μＬに，キットに添付されたプロテアーゼＫを１０μＬとライシスバッファーを１００μＬ加え，攪拌した後に，５６℃で１０分間インキュベートし，その後エタノールを加え，攪拌する。反応液を抽出カラムに移し，１分間遠心分離を行い，ろ過液を廃棄する。その後，抽出カラムに洗浄液５００μＬを注いで１分間遠心分離を行うという工程を２回繰り返す。その後７０℃の溶離液をカラムに加え，５分間インキュベート後，１分間遠心分離し，ゲノムＤＮＡを回収する。
【０１３５】
本実施例で用いた試料は，上記のプロトコルでヒト血液から抽出したゲノムＤＮＡのＴＢＥ溶液と，分子量マーカーとして用いる１０ｋｂｐと４８ｋｂｐと９７ｋｂｐのＤＮＡの混合ＴＢＥ溶液であり，ＤＮＡは第一の実施例と同様にして蛍光色素ＴＯＴＯ-1で染色し，トータルのＤＮＡ濃度を３０ｎｇ／ｍＬに調整した。
【０１３６】
本実施例では分離媒体としてヒドロキシプロピルメチルセルロースの濃度０．２５％のＴＢＥ溶液を用い，泳動電圧は５０Ｖ/ｃｍ，観測領域の長さＬ＝1ｍｍとした。この条件で数１０ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡの泳動速度はＶ＝０．１５〜０．３ｍｍ／ｓ, 並進拡散係数Ｄ≒１０−１２ｍ２／ｓであり，（数１０）から求めたｐ０＝７．６〜１０．７μｍとなるので，本実施例においてはｐ＝１０μｍとした。
【０１３７】
図２０（Ａ）は分子量マーカーである１０ｋｂｐと４８ｋｂｐと９７ｋｂｐのＤＮＡの混合溶液に対する,（数３）と（数７）を用いた数値シミュレーション結果であり，３つのバンドが良好に分離されている。図２０（Ｂ）はゲノムＤＮＡ溶液に対する,（数３）と（数７）を用いた数値シミュレーション結果である。ゲノムＤＮＡは分子量マーカーのように単分散でないため，ピークが広がったスペクトルとなっており，そのためＳＮＲが図２０（Ａ）に比べ低下しているが，ＤＮＡ断片長さが数１０ｋｂｐ〜１００ｋｂｐに分布していることを明瞭に示している。従って本実施例に用いたゲノムＤＮＡはＰＣＲのテンプレートとして好適に用いることが可能である。
【０１３８】
数１０ｋｂｐ以上のＤＮＡ分析はアガロース電気泳動などで数１０分〜数時間かけて行われていたが，本実施例の分析結果は１試料あたり２分以内で得られており，大幅な時間短縮がなされている。その結果，ＰＣＲ度にテンプレートを評価することも容易である。
【０１３９】
【発明の効果】
従来の電気泳動で必要とされた，複数種の試料を空間的に分離する泳動が不要となる。電気泳動路の試料注入端に注入した試料のバンド幅により生じる，泳動分離の低下の影響を受けない。泳動路及び分析時間の著しい短縮が可能となり，装置の小型化，軽量化が可能となる。また，試料を狭いバンド幅で注入する必要がなく，試料を単に注入するだけですむ。試料を短時間だけ電気泳動させて，試料を連続的に検出領域に分布させれば良いので，泳動路長は，励起光を照射して試料からの蛍光を検出する検出領域の長さであれば良く，泳動用の電源も低電圧電源ですむ。更に，試料濃度が，単分子検出が行われるような超希薄濃度に限定されず，広い範囲の試料濃度に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理を説明する模式図。
【図２】本発明の蛍光測定方法に於ける，（Ａ）分離効率，及び，（Ｂ）信号対雑音比の励起光強度分布の周期に対する依存性を示す図。
【図３】本発明の第１の実施例の蛍光測定装置の外観図。
【図４】本発明の第１の実施例の装置本体の断面図。
【図５】本発明の第１の実施例の装置本体の断面図。
【図６】本発明の第１の実施例の装置本体の試料室内部を説明する図。
【図７】本発明の第１の実施例に於ける，検出器の出力信号の処理と，自動ステージ類の制御の流れを示す系統図。
【図８】本発明の第１の実施例に於ける，ＴＯＴＯ−１で標識したλ−ＤＮＡ試料の分析結果例を示す図。
【図９】本発明の第１の実施例に於いて，複数の異なる試料を連続自動運転により分析する時のフローチャート。
【図１０】本発明の第１の実施例に於いて，（Ａ）３００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，（Ｂ）４００ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，（Ｃ）４５０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例，（Ｄ）４９０ｂｐのＤＮＡと５００ｂｐのＤＮＡの混合試料の分析の数値シミュレーション結果例をそれぞれ示す図。
【図１１】本発明の第２の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図。
【図１２】本発明の第２の実施例に使用されるスリットの拡大図。
【図１３】本発明の第２の実施例の蛍光測定装置の電気泳動路の周辺部の電気泳動路を含む鉛直な面による拡大断面図。
【図１４】図１３に示された電気泳動路の周辺部を下方から見た図。
【図１５】本発明の第３の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図。
【図１６】本発明の第３の実施例に於ける変調信号，同調信号，及びＲＦ信号周波数のタイミングチャート。
【図１７】本発明の第４の実施例の蛍光測定装置の主要部の構成を示す図。
【図１８】本発明の第４の実施例で使用するイメージセンサの光電変換素子の面の拡大図。
【図１９】本発明の第５の実施例に於ける電気泳動路の周辺部の拡大図。
【図２０】本発明の第６の実施例に於ける，ＴＯＴＯ−１で標識した分子量マーカーとゲノムＤＮＡの分析の数値シミュレーション結果例を示す図。
【符号の説明】
１−１〜１−Ｎ…試料，２，２−１〜２−４…電気泳動路，３…電源，４…電極，５…電極，６…励起光，７…検出器，８…スペクトル解析装置，９…装置本体，１０…パーソナルコンピュータ，１１…接続ケーブル，１２…扉，１３…隔壁，１４…排気孔，１５…光源，１６…ホルダー，１７…フィルター，１８…励起光，１９…ビームスプリッター，２０…反射光，２１…透過光，２２…ミラー，２３…円筒面レンズ，２４，２４−２…試料，２５…分岐ブロック，２６…シリンジ，２７…圧力センサ，２８…自動直進ステージ，２９…ブラケット，３０…ファン，３１−ａ，３１−ｂ…直進ステージ，３２−ａ，３２−ｂ…回転ステージ，３３…外壁，３４…フェラル，３５−ａ，３５−ｂ…ニップル，３６…チューブ，３７…バッファータンク，３８…ピストン，３９…ソレノイド，４０…自動回転ステージ，４１…自動ｚ軸ステージ，４２…レンズ，４３…フィルタ，４４…レンズ，４５…スリット，４６…送風機，４７…ヒーター，４８…温度センサ，４９…電流電圧変換回路，５０…ハイパスフィルタ，５１…ローパスフィルタ，５２…アナログデジタル変換ユニット，５３…中央処理ユニット，５４…ＬＡＮコントローラ，５５…モーターコントローラ，５６…温度コントローラ，５７…アナログ出力，５８…デジタル出力，５９…光源の電源，６０…洗浄用水槽，６１…泳動媒体廃棄用水槽，６３…支持体，６４…試料槽，６５…バッファー槽，６６−ａ，６６−ｂ…穴，６７−ａ，６７−ｂ…底板，６８−ａ，６８−ｂ，６８−ｃ…基板，７０…音響光学偏向器，７１…音響光学偏向器ドライバー，７２…任意波形発生器，７３…ダイクロイックミラー，７４…基板，７５…トランスデューサ，７６…ビームストップ，８０−１〜８０−１０２４…光電変換素子。
Claims (23)
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，前記試料の泳動方向で周期的に変化する強度分布を与えた励起光を，前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する工程と，前記試料から発生する蛍光を検出する工程とを有することを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項１に記載の蛍光測定方法に於いて，単一の光源から放射された前記励起光を分割して２つの光束とし，前記２つの光束を前記領域で交錯させて干渉させて，前記強度分布を生成することを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項１に記載の蛍光測定方法に於いて，前記励起光を照射する方向を所定の周波数で周期的に走査し，前記所定の周波数の整数倍の周波数で前記励起光を点滅させることを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項１に記載の蛍光測定方法に於いて，前記蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルを求めることを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項１に記載の蛍光測定方法に於いて，前記試料の並進拡散係数をＤ，前記試料の泳動速度をＶ，前記試料の泳動方向での前記励起光が照射される前記領域の長さをＬ，前記励起光の前記強度分布の周期をｐとするとき，ｐ≒π（ＤＬ／Ｖ）１／２であることを特徴とする蛍光測定方法。
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，励起光を前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する工程と，前記試料から発生する蛍光による蛍光像を，前記試料の泳動方向で周期的に変化する透過率分布を持つスリット上に結像し，前記蛍光像を検出する工程とを有し、前記試料の並進拡散係数をＤ，前記試料の泳動速度をＶ，前記試料の泳動方向での前記励起光が照射される前記領域の長さをＬ，前記蛍光像を検出する倍率をＭ，前記スリットの前記透過率分布の周期をｐとするとき，ｐ≒πＭ（ＤＬ／Ｖ） １／２ であることを特徴とする蛍光測定方法。
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させて，励起光を前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する工程と，前記試料から発生する蛍光による蛍光像を，前記試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備するアレイセンサにより検出する工程と，前記泳動方向に配列される前記光電変換素子のｉ番目の前記光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とするとき，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求める工程とを有することを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項７に記載の蛍光測定方法に於いて，前記Ｑのパワースペクトルを求めることを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項７に記載の蛍光測定方法に於いて，前記試料の並進拡散係数をＤ，前記試料の泳動速度をＶ，前記試料の泳動方向での前記励起光が照射される前記領域の長さをＬ，前記光電変換素子が配列されるピッチをｐ１，前記蛍光像を検出する倍率をＭ，前記所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）の周期をｐ２とするとき，ｐ１ｐ２≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２であることを特徴とする蛍光測定方法。
- 請求項７に記載の蛍光測定方法に於いて，前記試料を電気泳動する複数の電気泳動路のそれぞれの少なくとも一部を同一の平面上に平行に配置し，前記各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，前記励起光を前記電気泳動路に垂直に照射することを特徴とする蛍光測定方法。
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，励起光を発生する光源と，前記試料の泳動方向で周期的に変化する強度分布を与えた前記励起光を，前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射して，前記試料から発生する蛍光を検出する手段とを有することを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１１に記載の蛍光測定装置に於いて，単一の前記光源から放射された前記励起光を分割して２つの光束とする分割手段を具備し，前記２つの光束を前記領域で交錯させて干渉させて，前記強度分布を生成することを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１１に記載の蛍光測定装置に於いて，前記励起光を照射する方向を所定の周波数で周期的に走査する手段と，前記所定の周波数の整数倍の周波数で前記励起光を点滅させる手段とを有することを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１１に記載の蛍光測定装置に於いて，前記励起光を照射する方向を所定の周波数で周期的に走査する手段と，前記所定の周波数の整数倍の周波数で前記励起光の強度の強弱を変化させる手段とを有することを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１１に記載の蛍光測定装置に於いて，前記蛍光の強度のゆらぎのパワースペクトルを求める演算装置を有することを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１１に記載の蛍光測定装置に於いて，前記試料の並進拡散係数をＤ，前記試料の泳動速度をＶ，前記試料の泳動方向での前記励起光が照射される前記領域の長さをＬ，前記励起光の前記強度分布の周期をｐとするとき，ｐ≒π（ＤＬ／Ｖ）１／２であることを特徴とする蛍光測定装置。
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，前記試料から発生する蛍光による蛍光像を，前記試料の泳動方向で周期的に変化する透過率分布を持つスリット上に結像するレンズと，前記蛍光像を検出する検出器とを有し，前記スリットが前記領域と前記検出器との間に配置され、前記試料の並進拡散係数をＤ，前記試料の泳動速度をＶ，前記試料の泳動方向での前記励起光が照射される前記領域の長さをＬ，前記レンズの倍率をＭ，前記スリットの透過率分布の周期をｐとするとき，ｐ≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２であることを特徴とする蛍光測定装置。
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる電気泳動路と，前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，前記試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備し，前記試料から発生する蛍光による蛍光像を検出するアレイセンサと，前記泳動方向に配列される前記光電変換素子のｉ番目の前記光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とするとき，ｉ＝１，２，…，に対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求める演算装置とを有することを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１９に記載の蛍光測定装置に於いて，前記演算装置は前記Ｑのパワースペクトルを求めることを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１９に記載の蛍光測定装置に於いて，前記試料の並進拡散係数をＤ，前記試料の泳動速度をＶ，前記試料の泳動方向での前記励起光が照射される前記領域の長さをＬ，前記光電変換素子が配列されるピッチをｐ１，前記蛍光像を検出する倍率をＭ，前記所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）の周期をｐ２とするとき，ｐ１ｐ２≒πＭ（ＤＬ／Ｖ）１／２であることを特徴とする蛍光測定装置。
- 請求項１９に記載の蛍光測定装置に於いて，複数の前記電気泳動路を具備し，前記各電気泳動路の少なくとも一部を同一の平面上に平行に配置し，前記各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，前記励起光を前記各電気泳動路に垂直に照射することを特徴とする蛍光測定装置。
- 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる各電気泳動路の少なくとも一部が同一の平面上に平行に配置される複数の電気泳動路と，前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，前記試料の泳動方向に配列される複数個（Ｎとする）の光電変換素子を具備し，前記各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，前記励起光を前記各電気泳動路に垂直に照射して，前記試料から発生する蛍光による蛍光像を検出する２次元検出器と，前記泳動方向に配列される前記光電変換素子
のｉ番目の前記光電変換素子で検出される蛍光強度をｑｉとし，Ｋを絶対値１を含む定数として，変数ｉを変数とする所定の周期関数をｆ（Ｋｉ）とするとき，ｉ＝１，２，…，Ｎに対する積和Ｑ＝Σｑｉｆ（Ｋｉ）を求め，前記Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有することを特徴とする蛍光測定装置。 - 荷電を有し異なる移動度を持つ複数種類の試料を，泳動媒体中で電場を印加して電気泳動させる各電気泳動路の少なくとも一部が同一の平面上に平行に配置される複数の電気泳動路と，前記試料が前記泳動媒体中に連続して分布する領域に照射する励起光を発生する光源と，前記試料の泳動方向に配列したＮ１(Ｎ１≧２)個の光電変換素子で構成されたアレイを，前記試料の泳動方向に直交する方向にＮ２(Ｎ２≧２)列並べて構成され，前記各電気泳動路が平行に並ぶ部分で，
前記励起光を前記各電気泳動路に垂直に照射して，前記試料から発生する蛍光による蛍光像を検出する２次元検出器と，前記蛍光像を前記光電変換素子の面に結像するレンズと，前記光電変換素子の２次元配列の前記試料の泳動方向でｉ番目にあり，前記光電変換素子の２次元配列の前記試料の泳動方向と直交する方向でｊ番目にある前記光電変換素子により検出される蛍光強度をｑｉｊとし，Ｋを絶対値１を含む定数，変数ｉを変数とする所定の周期関数ｆ（Ｋｉ）とするとき，１≦ｎ１＜ｎ２≦Ｎ２を満たす整数ｎ１,ｎ２に対し，１≦ｉ≦Ｎ１，ｎ１≦ｊ≦ｎ２を満たすｉ，ｊに対する積和Ｑ＝Σｑｉｊを求め，前記Ｑのパワースペクトルを求める演算装置とを有することを特徴とする蛍光測定装置。
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