JP4495083B2 - 蛍光相関分光解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光相関分光解析装置に関するものである。

蛍光相関分光法（ＦＣＳ）は、被測定試料中の蛍光分子の蛍光揺らぎ（蛍光強度の時間変動）を測定し、そこから自己相関関数を求めることにより、蛍光分子の並進拡散運動等を解析する手法である。ＦＣＳによれば、例えばタンパク質１分子の結合や運動を解析することができる。

ＦＣＳを用いた従来の解析装置としては、例えば文献１（特開２０００−１６６５９８号公報）、文献２（特開２００１−２７２３４６号公報）、文献３（特開２００１−１９４３０５号公報）に記載されているものがある。文献１に記載された解析装置においては、被測定試料の一点に対して点状の励起光を照射し、被測定試料で発生した蛍光を光電子増倍管（ＰＭＴ）あるいはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）等の検出器により検出している。また、文献２に記載された解析装置においては、被測定試料に対してパルス励起光を走査させつつ照射し、被測定試料からの蛍光をＣＣＤカメラにより検出している。

上記文献１に記載された解析装置においては、被測定試料の一点にのみ励起光を照射するため、被測定試料の複数点を同時に解析することができない。これでは、細胞内における物質の移動まで測定することはできない。

一方、文献２に記載された解析装置によれば、検出器にＣＣＤカメラを用いていることにより、被測定試料の複数点を同時に解析することが可能となる。しかしながら、ＣＣＤカメラを用いた場合、各画素の検出信号を一つ一つ順番に読み出す必要があるため、１フレーム分の検出信号の読出しに多大な時間を要するという問題がある。それゆえ、文献２に記載された解析装置では、例えばμｓオーダー等の高速度で検出信号を読み出すことができない。よって、従来は、μｓレベル等の微細な時間領域で蛍光分子の多点での蛍光相関分光解析を行うことが可能な解析装置が存在しなかった。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、被測定試料の多点に対して同時且つ高速に蛍光相関分光解析を行うことが可能な蛍光相関分光解析装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明による蛍光相関分光解析装置は、被測定試料の所定領域に励起光を照射する励起光照射光学系と、励起光照射光学系により励起光が照射された被測定試料の所定領域内の蛍光分子から発生した蛍光を結像する蛍光結像光学系と、蛍光結像光学系により結像された蛍光の像面位置に設けられ相互に交わる第１の方向及び第２の方向に沿って複数の画素が２次元的に配列された光検出面を有するとともに、光検出面に入射した蛍光を各画素毎に光電変換し、光電変換により発生した電荷を第１の方向及び第２の方向に転送して出力端から検出信号として出力する検出器と、光検出面に配列された全ての画素の中から、光検出面における蛍光結像光学系により結像された蛍光の入射領域に応じて選択された一部の画素からなる画素群に属する画素からの検出信号を入力し、該検出信号のそれぞれについて自己相関関数を求める解析部と、を備えることを特徴とする。

この蛍光相関分光解析装置においては、励起光照射光学系により被測定試料の所定領域に励起光が照射される。また、励起光が照射された被測定試料の所定領域内の蛍光分子から発生した蛍光は、蛍光結像光学系により検出器の光検出面に結像される。光検出面に入射した蛍光は各画素毎に光電変換される。光電変換により各画素で発生した電荷は、検出器の出力端から検出信号として出力される。検出器が出力した検出信号は、解析部に入力される。解析部においては、入力した検出信号の自己相関関数が求められる。

よって、この蛍光相関分光解析装置によれば、被測定試料における励起光が照射された領域内の多点で発生した蛍光を、それらの点に対応する検出器の複数の画素で検出することにより、被測定試料の多点を同時に蛍光相関分光解析することができる。また、電荷転送型の２次元光検出器を検出器として用いていることにより、簡単な装置構成で、被測定試料の多点で発生した蛍光を検出することができる。

さらに、解析部は、光検出面に配列された全画素のうち一部の画素からなる画素群に属する画素で発生した電荷による検出信号の自己相関関数を求める。このため、検出器においては、光検出面の全画素で発生した電荷が有効な検出信号として出力される必要がなく、少なくとも画素群に属する画素で発生した電荷が検出信号として出力されればよい。よって、この蛍光相関分光解析装置によれば、検出器から１フレーム分の電荷を出力するのに要する時間を短縮することができる。それゆえ、この蛍光相関分光解析装置によれば、被測定試料の多点に対して高速に蛍光相関分光解析を行うことができる。

光検出面において、蛍光の入射領域内の画素と画素群に属する画素とは略一致することが好適である。この場合、解析部においては、励起光が照射された被測定試料の所定領域で発生した蛍光が入射した画素で発生した電荷による検出信号の自己相関関数が求められることになる。よって、検出器の光検出面へ入射する蛍光及び被測定試料に照射される励起光が、ともに蛍光相関分光解析に有効に利用される。

励起光照射光学系により被測定試料の所定領域に照射される励起光を該被測定試料に対して走査させる走査手段を備えることが好適である。この場合、被測定試料の広範囲に対して蛍光相関分光解析を行うことができる。

走査手段は、ガルバノミラーであることが好適である。この場合、励起光を被測定試料に対して特に高精度に走査させることができる。

検出器は、第１の方向に転送される電荷を画素から受け取って蓄積し、蓄積した電荷を第２の方向に転送する水平転送レジスタと、各画素及び水平転送レジスタに対して電荷を転送するための転送信号を出力する転送制御手段とを有し、転送制御手段は、画素群に属さない画素で発生した電荷が第１の方向に重ね合わされて水平転送レジスタに蓄積された後に第２の方向に転送され、且つ画素群に属する画素で発生した電荷が第１の方向に一段毎に蓄積されて第２の方向に転送されるように、転送信号を出力することが好適である。

この場合、転送制御手段は画素群に属さない画素が光電変換した電荷を重ね合わせるように蓄積させるので、有効なデータとしては用いられない電荷をまとめることができる。すなわち、複数段に渡って配置されている画素群に属さない画素で光電変換により発生した電荷を第２の方向における一度の転送で掃き出すことができるので、画素群に属する画素で光電変換により発生した電荷をより高速に読み出すことができる。

転送制御手段は、画素群に属する画素に転送信号を出力して、画素群に属する画素で発生した電荷を第１の方向に転送させるとともに、第２の方向に沿う一の段の画素が画素群に属する画素を含むものである場合には、一の段の画素で発生した電荷が水平転送レジスタに転送される前の段において水平転送レジスタに対して転送信号を出力することが好適である。

この場合、画素群に属する画素で光電変換により発生した電荷が順次転送されて水平転送レジスタに転送される前の段において、転送制御手段がその水平転送レジスタに対して転送信号を出力するので、水平転送レジスタに蓄積されている電荷を効率よく掃き出すことができる。

第２の方向に沿う一の段の画素が画素群に属する画素と画素群に属さない画素とを含むものである場合に、転送制御手段は、一の段の画素群に属する画素に対応する水平転送レジスタから電荷が掃き出されて新たな電荷を受け入れ可能となっている場合には、一の段の画素に対して転送信号を出力することにより電荷を水平転送レジスタへ転送させることが好適である。

例えば、一の段の画素のうち中心近傍の画素が画素群に属する画素であり、両端近傍の画素が画素群に属さない画素である場合に、この一の段の前段の電荷が順次掃き出されて一の段の中心近傍の画素に対応する水平転送レジスタが新たな電荷を受け入れ可能となっている場合には、一の段の画素に対して転送信号を出力する。この場合には、両端近傍の画素で光電変換により発生した電荷は他の段の電荷と重ね合わされるけれども、両端近傍の画素が光電変換した電荷は有効な検出信号としては用いられない電荷であるから実質的な影響は極めて少ない。したがって、画素群に属する画素で光電変換により発生した電荷をより高速に読み出すことができる。

検出器は、各画素で発生した電荷を蓄積し、蓄積した電荷を第１の方向に転送する第１電荷蓄積素子と、第１の方向に転送された電荷を第１電荷蓄積素子から受け取って蓄積し、蓄積した電荷を第２の方向に転送する第２電荷蓄積素子とを有し、転送制御手段は、第１電荷蓄積素子及び第２電荷蓄積素子に対して電荷を転送するための転送信号を出力し、第２の方向に沿う一の段の画素が画素群に属する画素と画素群に属さない画素とを含むものである場合に、転送制御手段は、一の段の画素群に属する画素に対応する第２電荷蓄積素子から電荷が掃き出されて新たな電荷を受け入れ可能となっている場合には、一の段の画素に対応する第１電荷蓄積素子に対して転送信号を出力することにより電荷を第２電荷蓄積素子へ転送させることが好適である。

この場合、転送制御手段は画素群に属さない画素で光電変換により発生した電荷を重ね合わせるように蓄積させるので、有効な検出信号としては用いられない電荷をまとめることができる。すなわち、複数段に渡って配置されている画素群に属さない画素で光電変換により発生した電荷を第２の方向における一度の転送で掃き出すことができるので、画素群に属する画素で光電変換により発生した電荷をより高速に読み出すことができる。また例えば、一の段の画素のうち中心近傍の画素が画素群に属する画素であり、両端近傍の画素が画素群に属さない画素である場合に、この一の段の前段の電荷が順次掃き出されて一の段の中心近傍の画素に対応する第２電荷蓄積素子が新たな電荷を受け入れ可能となっている場合には、一の段の画素に対応する第１電荷蓄積素子に対して転送信号を出力する。この場合には、両端近傍の画素で光電変換により発生した電荷は他の段の電荷と重ね合わされる場合もあるけれども、両端近傍の画素で光電変換により発生した電荷は有効な検出信号としては用いられない電荷であるから実質的な影響は極めて少ない。したがって、画素群に属する画素で光電変換により発生した電荷をより高速に読み出すことができる。

蛍光相関分光解析装置は、光検出面に対して画素群に属さない画素で発生した電荷を掃き捨てさせるための電子シャッタ信号を出力する電子シャッタ信号出力手段を備えることが好適である。この場合、検出器から電荷を読み出す際に、水平転送レジスタ又は第２電荷蓄積素子に画素群に属する画素で発生した電荷が蓄積されている場合以外は、水平転送レジスタ又は第２電荷蓄積素子による水平転送を実行する必要がない。したがって、画素群に属する画素で光電変換により発生した電荷をより高速に読み出すことができる。

図１は、蛍光相関分光解析装置の一実施形態を示す構成図である。

図２は、図１のＣＣＤカメラを光検出面側から見たときの様子を示す平面図である。

図３は、図１の蛍光相関分光解析装置における光学系の一例を示す構成図である。

図４Ａ〜図４Ｄは、図１に示す蛍光相関分光解析装置を用いた蛍光相関分光解析の流れを説明するための図である。

図５は、蛍光相関分光解析装置においてＣＣＤカメラから検出信号を読出す動作の一例を説明するための図である。

図６Ａ〜図６Ｄは、蛍光相関分光解析装置においてＣＣＤカメラから検出信号を読出す動作の一例を説明するための図である。

図７は、図５及び図６Ａ〜図６Ｄで説明した読出し動作におけるＣＣＤカメラの動作タイミングを示すタイミングチャートである。

図８は、ＣＣＤカメラにより検出される蛍光強度の時間変化の一例を示すグラフである。

図９は、図８のグラフに基づいて求められる自己相関関数Ｇ（τ）を示すグラフである。

図１０Ａ〜図１０Ｅは、図１の蛍光相関分光解析装置の一変形例を説明するための図である。

図１１Ａ〜図１１Ｇは、図１の蛍光相関分光解析装置の他の変形例を説明するための図である。

図１２Ａ〜図１２Ｇは、図１の蛍光相関分光解析装置の他の変形例を説明するための図である。

図１３Ａ〜図１３Ｄは、図１０Ａ〜図１０Ｅ、図１１Ａ〜図１１Ｇ、図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した変形例の効果を説明するための図である。

図１４Ａ及び図１４Ｂは、図１０Ａ〜図１０Ｅ、図１１Ａ〜図１１Ｇ、図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した動作時の各ＣＣＤの動作タイミングを説明するための図である。

図１５Ａ及び図１５Ｂは、図１０Ａ〜図１０Ｅ、図１１Ａ〜図１１Ｇ、図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した動作時の各ＣＣＤの動作タイミングを説明するための図である。

図１６Ａ〜図１６Ｌは、蛍光相関分光解析装置においてＣＣＤカメラから検出信号を読出す動作の他の例を説明するための図である。

図１７Ａ〜図１７Ｋは、蛍光相関分光解析装置においてＣＣＤカメラから検出信号を読出す動作の他の例を説明するための図である。

以下、図面とともに本発明による蛍光相関分光解析装置の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による蛍光相関分光解析装置の一実施形態を示す構成図である。蛍光相関分光解析装置１は、被測定試料に励起光を照射し、励起光の照射により被測定試料中の蛍光分子から発生した蛍光を検出し、その検出信号に基いて蛍光揺らぎの自己相関関数を求めることにより、蛍光分子の並進拡散運動等を解析するための装置である。蛍光相関分光解析装置１は、励起光照射光学系２１、蛍光結像光学系２２、ＣＣＤカメラ１５（検出器）、及びデータ解析装置１６（解析部）を備えている。

励起光照射光学系２１は、励起光を出力する光源と、光源から出力された励起光を導光する導光光学系とを有しており、光軸が被測定試料Ｓを向くように配置されている。励起光照射光学系２１は、被測定試料Ｓの所定領域Ｒに励起光を照射する。この励起光が照射される領域Ｒは、被測定試料Ｓのうち蛍光相関分光解析を行いたい領域を含むように選ばれる。

蛍光結像光学系２２は、光軸を被測定試料Ｓに向けて配置されており、被測定試料Ｓにおける励起光が照射された領域内の蛍光分子から発生した蛍光を結像する。蛍光結像光学系２２は、その光軸が励起光照射光学系２１の光軸と平行になるように配置されてもよいし、励起光照射光学系２１の光軸と互いに所定の角度をなすように配置されてもよい。

蛍光結像光学系２２には、ＣＣＤカメラ１５が接続されている。ＣＣＤカメラ１５は、光検出面３２、転送制御部１５２、及び電子シャッタ信号出力部１５４を有している。ＣＣＤカメラ１５は、その光検出面３２が励起光照射光学系２１により結像された蛍光の像面位置にあたるように配置されている。光検出面３２には、垂直方向（第１の方向）及び水平方向（第２の方向）に沿って複数の画素Ｐが２次元的に配列されている。ＣＣＤカメラ１５は、光検出面３２に入射した蛍光を各画素Ｐ毎に光電変換し、光電変換により発生した電荷を垂直方向及び水平方向に転送して出力端に導き、出力端に導かれた電荷を出力端から検出信号として出力する。

光検出面３２において、蛍光結像光学系２２により結像された蛍光が入射する領域を図中に斜線で示している。この領域が蛍光入射領域３２ａである。また、蛍光入射領域３２ａに応じて選択された画素からなる画素群が解析対象画素群３３ａである。ここでは、解析対象画素群３３ａは、その領域が蛍光入射領域３２ａと一致するように選択されている。なお、解析対象画素群３３ａは、光検出面３２に配列された全画素のうちの一部を占める複数の画素から構成される。

転送制御部１５２は、光検出面３２の各画素Ｐ、及び水平転送レジスタ（図示せず）に対して電荷を転送するための転送信号を出力する転送制御手段である。電子シャッタ信号出力部１５４は、光検出面３２に対して、解析対象画素群３３ａに属さない画素で発生した電荷を掃き捨てさせるための電子シャッタ信号を出力する電子シャッタ信号出力手段である。なお、電子シャッタ信号出力部１５４を設けることは必須ではない。

ＣＣＤカメラ１５には、データ解析装置１６が接続されている。データ解析装置１６は、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２に配列された画素Ｐのうち解析対象画素群３３ａに属する画素において光電変換により発生した電荷による検出信号を入力し、入力した検出信号のそれぞれについて自己相関関数を演算する。データ解析装置１６は、必要に応じて、演算した自己相関関数に基づいて被測定試料Ｓの蛍光分子の拡散運動を解析する。

また、データ解析装置１６は、ＣＣＤカメラ１５から入力した検出信号と各検出信号に対応する画素Ｐとを関連付けて処理するため、ＣＣＤカメラ１５の転送制御部１５２による転送制御に関する情報を入力する。さらに、データ解析装置１６は、光検出面３２における蛍光入射領域３２ａに応じて、解析対象画素群３３ａを構成する画素を選択する。データ解析装置１６は、必要に応じて、ＣＣＤカメラ１５の転送制御部１５２及び電子シャッタ信号出力部１５４に対して、それぞれ転送制御に関する指示及び電子シャッタ信号の出力に関する指示を与える。データ解析装置１６は、例えば画像取得用ボード及び計算機から構成される。

上記構成の蛍光相関分光解析装置１においては、励起光照射光学系２１により被測定試料Ｓの所定領域に励起光が照射される。また、被測定試料Ｓの励起光が照射された領域内の蛍光分子から発生した蛍光は、蛍光結像光学系２２によりＣＣＤカメラ１５の光検出面３２に結像される。光検出面３２に入射した蛍光は各画素毎に光電変換される。光電変換により各画素で発生した電荷は、垂直方向及び水平方向に必要に応じて転送された後、ＣＣＤカメラ１５の出力端から検出信号として出力される。ＣＣＤカメラ１５が出力した検出信号は、データ解析装置１６に入力される。データ解析装置１６においては、入力した検出信号の自己相関関数が求められ、その自己相関関数に基づいて蛍光分子の拡散運動の解析が行われる。

蛍光相関分光解析装置１の効果を説明する。蛍光相関分光解析装置１によれば、被測定試料Ｓにおける励起光が照射された領域内の多点で発生した蛍光を、それらの点に対応するＣＣＤカメラ１５の複数の画素で検出することにより、被測定試料Ｓの多点を同時に蛍光相関分光解析することができる。また、電荷転送型の２次元光検出器の一つであるＣＣＤカメラ１５を検出器として用いていることにより、簡単な装置構成で、被測定試料Ｓの多点で発生した蛍光を検出することができる。

さらに、データ解析装置１６は、光検出面に配列された全画素のうち一部の画素からなる解析対象画素群３３ａに属する画素で発生した電荷による検出信号の自己相関関数を求める。このため、ＣＣＤカメラ１５においては、光検出面の全画素で発生した電荷が有効な検出信号として出力される必要がなく、少なくとも解析対象画素群に属する画素で発生した電荷が検出信号として出力されればよい。よって、蛍光相関分光解析装置１によれば、ＣＣＤカメラ１５から１フレーム分の電荷を出力するのに要する時間を短縮することができる。それゆえ、蛍光相関分光解析装置１によれば、被測定試料Ｓの多点に対して高速に蛍光相関分光解析を行うことができる。

また、蛍光相関分光解析装置１においては、データ解析装置１６が設けられているため、測定者は、蛍光相関分光解析の結果を容易に知ることができる。蛍光相関分光解析の結果の内容としては、例えば、被測定試料Ｓ中において蛍光分子がどのように結合及び移動したか、並びにそれに伴い被測定試料Ｓの各位置において蛍光分子の大きさ及び数がどう変化したか等である。

また、光検出面において蛍光の入射領域内の画素と解析対象画素群に属する画素とが略一致する場合、データ解析装置１６においては、被測定試料Ｓの励起光が照射された領域で発生した蛍光が入射した画素で発生した電荷による検出信号の自己相関関数が求められることになる。よって、ＣＣＤカメラ１５の光検出面へ入射する蛍光が、蛍光相関分光解析に有効に利用される。

蛍光相関分光解析装置１は、ＣＣＤカメラ１５の光検出面の１画素に対応する被測定試料Ｓの部分に蛍光分子が１個〜数個しか存在しないような濃度条件下でも、好適に用いることができる。この場合、高速フレームレートで蛍光強度の情報を取得すると、その蛍光強度により、光検出面の解析対象画素群の各画素に対応する被測定試料Ｓの部分に、平均何分子が存在しているかがわかる。

蛍光相関分光解析装置１によれば、上述のように被測定試料Ｓの多点を同時に蛍光相関分光解析することができ、且つＣＣＤカメラ１５から検出信号を高速度で読み出すことができるため、被測定試料Ｓのある領域に対して蛍光相関分光解析を同時に行うことができる。これにより、細胞内の物質の移動を評価すること、及びｉｎ−ｖｉｔｒｏで数種類のサンプルを同時に解析することが可能となり、蛍光相関分光解析装置１は、タンパク質の結合過程の解析、及びドラッグスクリーニング等に広く応用が可能である。

ところで、被測定試料の多点で蛍光相関分光解析を行うことのできる解析装置は、上記文献３にも記載されている。しかしながら、文献３に記載された解析装置は、走査型ＦＣＳ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ ＦＣＳ）という手法を用いており、点状の励起光を被測定試料に対して走査しつつ、光検出器のイメージ部による光電子の偏向を制御することによりＦＣＳによるイメージを取得するものである。このように、文献３に記載された解析装置は、点状の励起光をスキャンしながら、空間のイメージを作成し直すものであり、複数の画素が光検出面に２次元的に配列されたＣＣＤカメラ１５を用いて空間分解している蛍光相関分光解析装置１とは方式を異にしている。

また、走査型ＦＣＳにおいて、細胞等の被測定試料全体について蛍光相関分光解析を行おうとした場合、試料の拡散速度によってはイメージ取得を更に高速化する必要性が生じる。しかしながら、走査型ＦＣＳの場合、点状の励起光を走査しつつイメージを取得するため、１イメージ当たりの一点の露光時間が、被測定試料Ｓの所定領域Ｒ全体に励起光を照射する上記実施形態の場合に比べて非常に短い。したがって、操作型ＦＣＳにおいてイメージ取得を高速化した場合には、光検出器における感度が不足するという問題が生じ得る。

図２を参照しつつ、図１のＣＣＤカメラ１５の構成を説明する。図２は、ＣＣＤカメラ１５を光検出面側から見たときの様子を示す平面図である。ただし、図１に示す転送制御部１５２及び電子シャッタ信号出力部１５４については、図示を省略している。ＣＣＤカメラ１５は、光検出部３１と蓄積部３６とを別々に有するフレームトランスファー型（フレーム転送型）のものである。ＣＣＤカメラ１５の表面には、垂直方向（図中上下方向）及び水平方向（図中左右方向）に沿って複数の画素Ｐが２次元的に配列されている。ここでは、全部で１２０個の画素Ｐが、垂直方向に１２段に分けられて配列されている場合を例にとって説明する。このとき、各段には、水平方向に沿って１０個の画素が配列されている。

これらの画素Ｐは、光検出部３１を構成する画素と蓄積部３６を構成する画素とに分けられている。すなわち、全画素Ｐのうち上半分（上から１段目から６段目まで）に含まれる６０個の画素は光検出部３１を構成し、下半分（上から７段目から１２段目まで）に含まれる６０個の画素は蓄積部３６を構成している。光検出部３１の表面が光検出面３２である。光検出部３１を構成する各画素Ｐにおいては、入射した蛍光が光電変換され、光電変換により発生した電荷が一段ずつ垂直方向に転送される。光検出部３１の最下段の画素から垂直方向に転送された電荷は、蓄積部３６の最上段の画素に受け渡される。蓄積部３６を構成する各画素においては、光検出部３１から受け渡された電荷が垂直方向に一段ずつ転送される。

また、蓄積部３６の最下段に隣接して水平転送レジスタ３８が設けられている。蓄積部３６の最下段の画素から垂直方向に転送された電荷は、水平転送レジスタ３８に受け渡される。水平転送レジスタ３８においては、蓄積部３６から受け渡された電荷を水平方向に転送することにより出力端３８ａに導く。出力端３８ａに導かれた電荷は、検出信号として出力される。水平転送レジスタ３８の出力端３８ａには、読出し回路３９が接続されている。水平転送レジスタ３８の出力端３８ａから出力された検出信号は、読出し回路３９により読み出される。

図３は、図１の蛍光相関分光解析装置１における光学系の一例を示す構成図である。図３において、ＣＣＤカメラ１５は、その光検出面３２が入射する蛍光の光軸方向（図中左右方向）と垂直になるように配置されている。また、紙面に垂直な方向がＣＣＤカメラ１５の光検出面３２の水平方向であり、図中上下方向が光検出面３２の垂直方向である。蛍光相関分光解析装置１が備える励起光照射光学系２１には、レーザ光源１１、ミラー１２１、シリンドリカルレンズ１２２、ダイクロイックミラー１３１、ガルバノミラー１３２、レンズ１３３、及び対物レンズ１３４が、被測定試料Ｓへと向かう光路に沿ってこの順に設けられている。

レーザ光源１１は、被測定試料Ｓ中の蛍光分子を励起するためのレーザ光（励起光）を出力する。レーザ光源１１は、ＣＷレーザ光源であることが望ましい。ＣＷレーザ光源としては、例えば波長４８８ｎｍのＡｒレーザを用いることができる。

ミラー１２１は、レーザ光源１１から出力された励起光が入射する位置に設けられている。ミラー１２１は、入射した励起光をシリンドリカルレンズ１２２へと向けて反射する。

ミラー１２１により反射された励起光が入射する位置には、シリンドリカルレンズ１２２が設けられている。シリンドリカルレンズ１２２は、入射した励起光を成形する励起光成形手段である。すなわち、シリンドリカルレンズ１２２は、入射した励起光を一方向にのみ屈折させることにより励起光の光束の光軸に垂直な平面での断面形状を成形して、成形した励起光を出射する。成形される励起光の形状としては、例えば長方形状（スリット状）が挙げられる。この場合、被測定試料Ｓには長方形状の励起光が照射されることになる。また、シリンドリカルレンズ１２２は、長方形の長辺方向がＣＣＤカメラ１５の光検出面３２における水平方向に対応するように配置されている。

シリンドリカルレンズ１２２により出射された励起光が入射する位置には、ダイクロイックミラー１３１が設けられている。ダイクロイックミラー１３１は、シリンドリカルレンズ１２２から出射された励起光をガルバノミラー１３２へと向けて反射する。また、ダイクロイックミラー１３１は、後述するように、ガルバノミラー１３２により反射された蛍光を透過させるとともに、このとき被測定試料Ｓ等により反射されて入射してきた励起光を除去する。

ダイクロイックミラー１３１により反射された励起光が入射する位置には、ガルバノミラー１３２が設けられている。ガルバノミラー１３２は、ダイクロイックミラー１３１により反射された励起光をレンズ１３３へと向けて反射する。また、ガルバノミラー１３２は、ドライバ（図示せず）により駆動されることにより、励起光を被測定試料Ｓに対して１次元的に走査させる走査手段である。ガルバノミラー１３２による励起光の走査方向は、例えば、シリンドリカルレンズ１２２により励起光が長方形に形成された場合であれば、その長方形の短辺方向に設定される。また、上記したドライバはデータ解析装置１６（図１参照）に接続されており、ドライバはデータ解析装置１６からの指示に基づいてガルバノミラー１３２を駆動する。

ガルバノミラー１３２により反射された励起光が入射する位置には、レンズ１３３が設けられている。レンズ１３３は、ガルバノミラー１３２により反射された励起光を対物レンズ１３４へと導く。

レンズ１３３により導かれた励起光が入射する位置には、対物レンズ１３４が設けられている。対物レンズ１３４は、レンズ１３３により導かれて入射してきた励起光を被測定試料Ｓに照射する。

上述のダイクロイックミラー１３１、ガルバノミラー１３２、レンズ１３３及び対物レンズ１３４は、蛍光顕微鏡１３を構成している。蛍光顕微鏡１３は、ダイクロイックミラー１３１、ガルバノミラー１３２、レンズ１３３及び対物レンズ１３４に加えて、ステージ１３５、ミラー１３６、及び接眼レンズ１３７を有して構成されている。ステージ１３５は、被測定試料Ｓを載置するためのものである。ミラー１３６は、後述する蛍光結像光学系２２に含まれ、ダイクロイックミラー１３１を透過した蛍光の光路を変換するためのものである。また、接眼レンズ１３７は、励起光が照射されている被測定試料Ｓの様子を測定者が必要に応じて見ることができるように設けられている。接眼レンズ１３７を必要とする場合には、被測定試料Ｓからの蛍光の一部を接眼レンズ１３７に導くため、ミラー１３６としてハーフミラーを用いればよい。あるいは、ミラー１３６を移動可能に設けておくことにより、接眼レンズ１３７を用いるときにミラー１３６を蛍光の光路から外すようにしてもよい。

また、蛍光相関分光解析装置１が備える蛍光結像光学系２２には、対物レンズ１３４、レンズ１３３、ガルバノミラー１３２、ダイクロイックミラー１３１、ミラー１３６、レンズ１４１、及びシャープカットフィルタ１４２が、被測定試料ＳからＣＣＤカメラ１５へと向かう光路に沿ってこの順に設けられている。なお、ダイクロイックミラー１３１、ガルバノミラー１３２、レンズ１３３、及び対物レンズ１３４は、励起光照射光学系２１と蛍光結像光学系２２とで共通に設けられている。

対物レンズ１３４は、被測定試料Ｓで発生した蛍光を入射し、入射した蛍光をレンズ１３３へと導く。レンズ１３３は、対物レンズ１３４により導かれて入射してきた蛍光をガルバノミラー１３２へと導く。ガルバノミラー１３２は、レンズ１３３により導かれて入射してきた蛍光をダイクロイックミラー１３１へと向けて反射する。ダイクロイックミラー１３１は、ガルバノミラー１３２により反射された蛍光を透過させる。

ダイクロイックミラー１３１を透過した蛍光が入射する位置には、ミラー１３６が設けられている。ミラー１３６は、ダイクロイックミラー１３１を透過して入射してきた蛍光を反射することにより、蛍光の光路を変換し、蛍光の光路をＣＣＤカメラ１５の撮像軸に一致させる。

ミラー１３６により反射された蛍光が入射する位置には、レンズ１４１が設けられている。レンズ１４１は、ミラー１３６により反射された蛍光をＣＣＤカメラ１５へと導くとともに、蛍光をＣＣＤカメラ１５の光検出面３２上に結像させる。

レンズ１４１とＣＣＤカメラ１５との間の光路上には、シャープカットフィルタ１４２が設けられている。シャープカットフィルタ１４２としては、被測定試料Ｓで発生する蛍光の波長成分を透過させる一方で、被測定試料Ｓに照射される励起光の波長成分を実質的に透過させない性質を有する光学フィルタが用いられる。したがって、シャープカットフィルタ１４２は、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２に入射する蛍光を透過させる一方で、蛍光と同様の光路に沿ってＣＣＤカメラ１５の光検出面３２に入射しようとする励起光を除去する。この励起光は、被測定試料Ｓ等により反射されたものである。

図３の光学系においては、ガルバノミラー１３２により励起光を被測定試料Ｓに対して走査させている。これにより、被測定試料Ｓの広範囲に対して蛍光相関分光解析を行うことができる。さらに、走査手段がガルバノミラー１３２であることにより、励起光を被測定試料Ｓに対して特に高精度に走査させることができる。ただし、励起光を走査させる必要がなければ、ガルバノミラー１３２を設けなくともよい。また、ガルバノミラー１３２によらず、蛍光顕微鏡１３のステージ１３５を動かすことにより、励起光を被測定試料Ｓに対して走査させる構成としてもよい。

さらに、ガルバノミラー１３２は、励起光照射光学系２１と蛍光結像光学系２２とで共通に設けられている。そのため、被測定試料Ｓに照射される励起光及び被測定試料Ｓで発生した蛍光は、ともにガルバノミラー１３２により反射されることになる。したがって、ガルバノミラー１３２により被測定試料Ｓに対する励起光の照射位置を変位させても、その変位は蛍光がガルバノミラー１３２により反射されるときに打ち消されるので、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２における蛍光の入射位置は変位しない。このため、励起光を被測定試料Ｓに対して走査しつつ蛍光相関分光解析を行う場合、被測定試料Ｓにおける励起光の照射位置に関わらず、ＣＣＤカメラ１５における電荷の転送及び読出しの制御のパターンを変える必要がない。よって、蛍光相関分光解析装置１によれば、被測定試料Ｓ全体についての蛍光相関分光解析を容易に行うことができる。

また、レーザ光源１１としてＣＷレーザ光源を用いた場合には、パルス光源を用いる場合に比してコストを低く抑えることができる。

図４Ａ〜図４Ｄは、図１に示す蛍光相関分光解析装置１を用いた蛍光相関分光解析の流れを説明するための図である。まず、励起光照射光学系２１（図３参照）により、蛍光顕微鏡１３のステージ１３５上に載置された被測定試料Ｓに対して励起光を照射する。このとき、励起光照射光学系２１のシリンドリカルレンズ１２２により励起光を長方形に成形することにより、被測定試料Ｓには長方形状の励起光が照射される（図４Ａ）。ここで、図４Ａにおいて破線Ｌ１で囲まれた領域が、励起光が照射されている領域である。

ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２上には、励起光が照射された被測定試料Ｓで発生した蛍光が蛍光結像光学系２２により結像される。このとき、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２のうち蛍光が入射する領域が、蛍光入射領域３２ａである（図４Ｂ）。蛍光入射領域３２ａは長方形状をしており、その長手方向は光検出面３２の水平方向（図中左右方向）に一致している。

また、高速フレームレートでＣＣＤカメラ１５を駆動することにより、蛍光入射領域３２ａ内の各画素における蛍光強度の時間変化を測定する。そして、その時間変化から自己相関関数を求めることにより、蛍光入射領域３２ａ内の全ての画素について測定データＤを同時に得ることができる（図４Ｃ）。ここでは、蛍光入射領域３２ａ内の全ての画素が解析対象画素群３３ａに属する画素として選択される。さらに、ガルバノミラー１３２（図３参照）により、励起光を被測定試料Ｓに対して走査させることにより、被測定試料Ｓ全体について測定データＤを得る（図４Ｄ）。この走査方向は、被測定試料Ｓに照射される長方形状の励起光の長手方向に直交する方向である。ＦＣＳ法により得られる測定データＤは、例えば、自己相関関数の緩和時間及びｙ切片等である。緩和時間及びｙ切片は、細胞（被測定試料Ｓ）中の蛍光分子の大きさ及び数を反映しているので、細胞のどの部分で分子同士が結合・移動し、それに伴い細胞の各位置において分子の大きさ及び数がどう変化したかという情報を細胞全体について高速に取得することができる。

図５及び図６Ａ〜図６Ｄを参照しつつ、蛍光相関分光解析装置１においてＣＣＤカメラ１５から検出信号を読出す動作の一例を説明する。図５は、被測定試料Ｓからの蛍光により露光されたＣＣＤカメラ１５の光検出面３２を示している。光検出面３２は、垂直方向（図中上下方向）に沿って第１段３２１〜第６段３２６に分けられており、各段３２１〜３２６には、それぞれ水平方向（図中左右方向）に１０個の画素が配列されている。すなわち、光検出面３２は、全部で６０個の画素が２次元的に配列されてなっている。これらの６０個の画素のうち、第５段３２５及び第６段３２６に属する２０個の画素にのみ蛍光が入射している。この蛍光が入射している領域が蛍光入射領域３２ａである。ここでは、解析対象画素群３３ａは、蛍光入射領域３２ａを構成する画素、すなわち第５段３２５及び第６段３２６に属する２０個の画素からなるように選択される。

図６Ａ〜図６Ｄは、ＣＣＤカメラ１５の蓄積部３６及び水平転送レジスタ３８を示している。図５の光検出面３２の各画素において蛍光が光電変換されることにより発生した電荷は、蓄積部３６へ向けて垂直方向に一段ずつ転送される。図６Ａは、光検出面３２の解析対象画素群３３ａに属する各画素で発生した電荷が蓄積部３６まで転送された直後の状態を示している。

すなわち、図６Ａにおいて、解析対象画素群３３ａで発生した電荷は、蓄積部３６の第１段３７１及び第２段３７２の各画素に蓄積されている。解析対象画素群３３ａに属する画素で発生した電荷が蓄積されている画素には、図中丸印を付している。このように解析対象画素群３３ａで発生した電荷が全て蓄積部３６まで転送されると、その直後に光検出面３２に電子シャッタ信号が送られ、光検出面３２における解析対象画素群３３ａに属さない画素で発生した電荷が全て掃き捨てられる。

さらに、光検出面３２においては、電荷が掃き捨てられた直後に、次の露光が行われ、この露光により解析対象画素群３３ａで発生した電荷は蓄積部３６へと転送される。図６Ｂは、この露光により解析対象画素群３３ａで発生した電荷が蓄積部３６まで転送された直後の状態を示している。このとき、前回の露光により解析対象画素群３３ａで発生した電荷は、第３段３７３及び第４段３７４まで転送されている。図６Ｂにおいて、前回の露光（「１回目の露光」と呼ぶ）により発生した電荷が蓄積されている画素に丸印、今回の露光（「２回目の露光」と呼ぶ）で発生した電荷が蓄積されている画素に三角印を付している。

上述の動作が繰り返され、図６Ｃに示すように、蓄積部３６の第１段３７１〜第６段３７６全てに解析対象画素群３３ａで発生した電荷が順次蓄積された後、これらの電荷は一段ずつ水平転送レジスタ３８に転送され、水平転送レジスタ３８により順次電荷が読出し回路３９へ向けて転送される。この動作の間にも、光検出面３２における露光は行われる。ただし、この露光時間は、水平転送レジスタ３８が１段分の電荷全てを転送するのに要する時間以下に設定する必要がある。

図６Ｃにおいては、１回目の露光により発生した電荷が第５段３７５及び第６段３７６に、２回目の露光により発生した電荷が第３段３７３及び第４段３７４に蓄積されており、第１段３７１及び第２段３７２には、３回目の露光により発生した電荷が蓄積されている（図中四角印で示す）。また、図６Ｄは、１回目の露光により解析対象画素群３３ａのうち光検出面３２の第６段３２６で発生した電荷が水平転送レジスタ３８まで転送された状態を示している。

なお、図６Ｄにおいて実際には第１段３７１に４回目の露光により発生した電荷が蓄積されるが、図示を省略している。水平転送レジスタ３８は、この段の電荷を全て読出し回路３９へ向けて転送すると、続いて次の段の電荷の転送を行う。以上より、ＣＣＤカメラ１５で検出された１フレーム分の検出信号の読出しが完了する。このように、本例による読出し動作では、光検出面３２の解析対象画素群３３ａに属する画素で光電変換により発生した電荷のみがＣＣＤカメラ１５から実質的な検出信号として出力される。

本例においては、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２に対して電子シャッタ信号出力部１５４が電子シャッタ信号を出力することにより、解析対象画素群３３ａに属さない各画素で発生した電荷を掃き捨てさせている。これにより、解析対象画素群３３ａ（図５における第５段３２５及び第６段３２６に属する画素）で発生した電荷のみを繰返し蓄積部へ転送することができる。また、水平転送レジスタ３８による転送は光検出面３２における露光中も行われているので、解析対象画素群３３ａで発生した電荷を水平転送レジスタ３８が水平転送する時間を最小として、高繰り返しにデータを取得することができる。

本例では特に、光検出面３２において蓄積部３６に隣接する第６段３２６の画素を含むように解析対象画素群３３ａを設定しているため、解析対象画素群３３ａを構成する垂直方向の数ライン（本例では２ライン）分の電荷を転送する時間間隔で、ＣＣＤカメラ１５から１フレーム分の蛍光情報を隙間なく次々と読み出すことができる。それゆえ、蛍光相関分光解析装置１において、検出信号を特に高速度で読み出すことが可能となる。

図７は、図５及び図６Ａ〜図６Ｄで説明した読出し動作におけるＣＣＤカメラ１５の動作タイミングを示すタイミングチャートである。図７において、各チャートは、上から順に、電子シャッタのタイミング、露光のタイミング、電荷転送のタイミング、及び制御のタイミングを示している。

電子シャッタのタイミングは、電子シャッタを切るタイミング、すなわち電子シャッタ信号出力部１５４が光検出面３２（図５参照）に対して電子シャッタ信号を出力するタイミングを表している。電子シャッタは、露光を開始する直前に切られる。露光のタイミングは、光検出面３２の各画素が露光するタイミングを表している。露光時間は、例えば１０μｓとされる。電荷転送のタイミングは、光検出面３２の解析対象画素群３３ａで発生した電荷を垂直方向に蓄積部３６まで転送するタイミングを表している。電荷転送は、露光が終了した直後から開始される。制御のタイミングは、露光開始から次の露光開始するまでの制御タイミングを表している。

図８及び図９を用いて、図１のデータ解析装置１６の動作の一例を説明する。図８は、ＣＣＤカメラ１５により検出される蛍光強度の時間変化の一例を示すグラフである。グラフの縦軸は蛍光強度、横軸は時間を表している。縦軸及び横軸は、ともに任意スケールである。図９は、図８のグラフに基づいて求められる自己相関関数Ｇ（τ）を示すグラフである。グラフの縦軸はＧ（τ）、横軸は時間τを表す。縦軸及び横軸は、ともに任意スケールである。この自己相関関数Ｇ（τ）は、時間をｔ、時間ｔにおける蛍光強度をＩ（ｔ）として、下記式、

Ｇ（τ）＝＜Ｉ（ｔ）・Ｉ（ｔ＋τ）＞／＜Ｉ（ｔ）＞^２
で定義される。ただし、＜Ｉ（ｔ）＞は、Ｉ（ｔ）の平均値を表す。

データ解析装置１６は、ＣＣＤカメラ１５により検出される検出信号に基づいて光検出面３２の解析対象画素群３３ａに属する各画素についてそれぞれ自己相関関数Ｇ（τ）を求め、さらに自己相関関数Ｇ（τ）から緩和時間τ_０及びｙ切片Ｇ（０）を算出する。緩和時間τ_０及びｙ切片Ｇ（０）は、それぞれ蛍光分子の大きさ及び数の関数となっているため、緩和時間τ_０及びｙ切片Ｇ（０）から蛍光分子の大きさ及び数を求めることができる。ここで、緩和時間τ_０は、Ｇ（τ）＝（１／２）Ｇ（０）となるときのτで定義される。データ解析装置１６においては、自己相関関数Ｇ（τ）に基づいて、細胞（被測定試料Ｓ）のどの部分で分子同士が結合、移動し、それにより分子の大きさ、数がどう変化したかという情報を細胞全体について短時間で取得することができる。

図１０Ａ〜図１０Ｅは、図１の蛍光相関分光解析装置１の一変形例を説明するための図である。本変形例においては、転送制御部１５２によるＣＣＤカメラ１５の制御の方法が図１の蛍光相関分光解析装置１と相違する。その他の構成は、図１の蛍光相関分光解析装置１と同様である。

図１０Ａは、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２における各画素で発生した電荷が、蓄積部３６の対応する画素まで転送された後の状態を示している。本変形例では、図６Ａの場合とは異なり、光検出面３２の解析対象画素群３３ａに属さない画素に対して電子シャッタ信号出力部１５４により電子シャッタ信号が出力されない。そのため、解析対象画素群３３ａに属さない画素に対応する第１段３７１、第２段３７２、第５段３７５及び第６段３７６に属する画素に蓄積される電荷は０とは限らない。図において、解析対象画素群３３ａに属する画素で発生した電荷が蓄積されている画素を丸印で、一方解析対象画素群３３ａに属さない画素で発生した電荷が蓄積されている画素を一重斜線で示している。

図１０Ａの状態から蓄積部３６の各画素には転送制御部１５２から転送信号が入力される。蓄積部３６の各画素の電荷は一段づつ水平転送レジスタ３８方向に転送される。したがって、図１０Ｂのように蓄積部３６の第６段３７６の画素に蓄積された電荷は、水平転送レジスタ３８に受け渡される。

さらに、転送制御部１５２から蓄積部３６に転送信号が入力されると、図１０Ａにおける第５段３７５の画素に蓄積された電荷も、水平転送レジスタ３８に受け渡される。したがって、図１０Ｃにおいては、図１０Ａにおける第５段３７５及び第６段３７６の画素に蓄積されていた電荷が、水平転送レジスタ３８において重ね合わされていることとなる。図１０Ｃで水平転送レジスタ３８の各領域に二重斜線が記入されているのは、このように２段に渡る電荷が重ね合わされていることを示している。

図１０Ｃの状態から、転送制御部１５２から水平転送レジスタ３８へは転送信号が入力され、水平転送レジスタ３８に蓄積された電荷が順次掃き出される（図１０Ｄ）。ここで、図１０Ｃの状態から更に図１０Ａにおける第４段３７４の画素に蓄積されていた電荷を水平転送レジスタ３８に受け渡さないのは、図１０Ａにおける第４段３７４の画素は、解析対象画素群３３ａに属する画素に対応し、検出信号として読み出される電荷を蓄積しているためである。したがって、水平転送レジスタ３８に蓄積された電荷が全て掃き出された後に、転送制御部１５２から蓄積部３６に転送信号が入力されて、図１０Ａにおける第４段３７４の画素に蓄積されていた電荷を水平転送レジスタ３８に受け渡すこととなる（図１０Ｅ）。その後、転送制御部１５２から水平転送レジスタ３８に転送信号が入力されて、図１０Ａにおける第４段３７４の画素に蓄積されていた電荷が検出信号として読出し回路３９へ出力される。

図１１Ａ〜図１１Ｇは、図１の蛍光相関分光解析装置１の他の変形例を説明するための図である。本変形例においては、転送制御部１５２によるＣＣＤカメラ１５の制御の方法が図１の蛍光相関分光解析装置１と相違する。また、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２における解析対象画素群が、解析対象画素群３３ａと相違する。解析対象画素群は、光検出面３２の第３段３２３及び第４段３２４（図５参照）における左から４〜７番目の画素（全８画素）からなっている。その他の構成は、図１の蛍光相関分光解析装置１と同様である。

図１１Ａは、ＣＣＤカメラ１５の光検出面３２における各画素で発生した電荷が、蓄積部３６の対応する画素まで転送された後の状態を示している。本変形例では、図１０Ａの場合と同様に、光検出面３２の解析対象画素群に属さない画素に対して電子シャッタ信号出力部１５２による電子シャッタ信号の出力がない。図において、解析対象画素群に属する画素で発生した電荷が蓄積されている画素を丸印で、一方解析対象画素群に属さない画素で発生した電荷が蓄積されている画素を一重斜線で示している。

図１１Ａの状態から蓄積部３６の各画素には転送制御部１５２から転送信号が入力される。蓄積部３６の各画素の電荷は一段ずつ水平転送レジスタ３８方向に転送される。したがって、図１１Ｂのように蓄積部３６の第６段３７６の画素に蓄積された電荷は、水平転送レジスタ３８に受け渡される。さらに、転送制御部１５２から蓄積部３６に転送信号が入力されると、図１１Ａにおける第５段３７５の画素に蓄積された電荷も、水平転送レジスタ３８に受け渡される。したがって、図１１Ｃにおいては、図１１Ａにおける第５段３７５及び第６段３７６の画素に蓄積されていた電荷が、水平転送レジスタ３８において重ね合わされていることとなる。図１１Ｃで水平転送レジスタ３８の各領域に二重斜線が記入されているのは、このように２段に渡る電荷が重ねあわされていることを示している。

図１１Ｃの状態から、転送制御部１５２から水平転送レジスタ３８へは転送信号が入力され、水平転送レジスタ３８に蓄積された電荷が順次掃き出される。図１１Ｄに示すように、水平転送レジスタ３８に蓄積された電荷が順次掃き出されて、図１１Ａにおける第４段３７４の丸印を付した画素に対応する水平転送レジスタ３８の電荷蓄積素子の電荷が掃き出されて、その電荷蓄積素子が新たな電荷を受け入れ可能な状態になった時点で、転送制御部１５２から蓄積部３６に転送信号が出力される。したがって、図１１Ｅに示すように、図１１Ａにおける第４段３７４の丸印を付した画素に蓄積されていた電荷は、水平転送レジスタ３８に他の電荷と重ねあわされることなく受け渡される。図１１Ａにおける第４段３７４の丸印を付した画素に蓄積されていた電荷を受け取った電荷蓄積素子よりも読み出し回路側の電荷蓄積素子では、図１１Ａの第４段３７４、第５段３７５、第６段３７６の画素に蓄積されていた電荷が重ね合わされて蓄積されている。

図１１Ｅの状態になった段階で、転送制御部１５２から水平転送レジスタ３８へ転送信号が出力され、水平転送レジスタ３８に蓄積された電荷が順次掃き出される。図１１Ｆに示すように、水平転送レジスタ３８に蓄積された電荷が順次掃き出されて、図１１Ａにおける第３段３７３の丸印を付した画素に対応する水平転送レジスタ３８の電荷蓄積素子の電荷が掃き出されて、その電荷蓄積素子が新たな電荷を受け入れ可能な状態になった時点で、転送制御部１５２から蓄積部３６に転送信号が出力される。したがって、図１１Ｇに示すように、図１１Ａにおける第３段３７３の丸印を付した画素に蓄積されていた電荷は、水平転送レジスタ３８に他の電荷と重ね合わされることなく受け渡される。

図１２Ａ〜図１２Ｇは、図１の蛍光相関分光解析装置１の他の変形例を説明するための図である。本変形例においては、検出器としてインターライン型のＣＣＤ撮像素子を用いる点で、フレームトランスファー型のＣＣＤカメラ１５を用いている図１の蛍光相関分光解析装置１と相違する。

本変形例によるＣＣＤ撮像素子においては、光検出面４２、及び水平転送レジスタ４８（第２電荷蓄積素子）が設けられている。光検出面４２は、垂直方向に沿って第１段４２１〜第６段４２６に分けられており、各段４２１〜４２６には、それぞれ水平方向に１０個のフォトダイオード（画素）４４ａが配列されている。各画素の図中右側に隣接して垂直転送ＣＣＤ（第１電荷蓄積素子）４４ｂが設けられている。本変形例における解析対象画素群は、第３段４２３及び第４段３２４における左から４〜７番目の画素からなっている。解析対象画素群に属する全ての画素に、蛍光が入射しているものとする。また、光検出面４２の第６段４２６に隣接して水平転送レジスタ４８が設けられている。

図１２Ａは、光検出面４２に被測定試料Ｓからの蛍光が入射した状態を模式的に示している。図１２Ａにおいて、解析対象画素群４３ａに属する画素で発生した電荷が蓄積されている画素に「Ａ」を付している。図１２Ａの状態において、転送制御部１５２から光検出面４２に転送パルス信号が出力されると、解析対象画素群内の各画素で光電変換により発生した電荷が垂直転送ＣＣＤ４４ｂに出力されて図１２Ｂに示す状態となる。各画素は、光電変換した電荷を出力すると露光可能な状態になるので、図１２Ｃに示すように図１２Ａと同様の部分において蛍光を検出できる。図１２Ａにおいて検出したものと区別するために、図１２Ｃにおいて新たに入射した蛍光が光電変換されて発生した電荷が蓄積されている画素には「Ｂ」を付している。

このように新たに蛍光を検出している間に、図１２Ｂで垂直転送ＣＣＤ４４ｂに出力された電荷（「Ａ」）は、水平転送レジスタ４８方向に転送される。「Ｂ」を付した領域に対応する垂直転送ＣＣＤ４４ｂから電荷が転送されて、新たに電荷を受け入れ可能な状態になった段階で、転送制御部１５２から光検出面４２に転送パルス信号が出力されて、図１２Ｄに示す状態となる。

各画素は、光電変換した電荷を出力すると露光可能な状態になるので、図１２Ｅに示すように図１２Ａおよび図１２Ｃと同様の部分において蛍光を検出できる。図１２Ａおよび図１２Ｃにおいて検出したものと区別するために、図１２Ｅにおいて新たに入射した蛍光が光電変換されて発生した電荷が蓄積されている画素には「Ｃ」を付している。このように新たに蛍光を検出している間に、垂直転送ＣＣＤ４４ｂに出力された電荷（「Ａ」、「Ｂ」）は、水平転送レジスタ４８方向に転送されて、図１２Ａの第４段４２４で光電変換された電荷（「Ａ」）が水平転送レジスタ４８に受け渡される。

水平転送レジスタ４８に受け渡された電荷（「Ａ」）は、読出し回路４９方向に転送されて図１２Ｆに示す状態となる。図１２Ｆに示すように、水平転送レジスタ４８に蓄積された電荷が順次掃き出されて、図１２Ａにおける第４段４２４の電荷（「Ａ」）が掃き出され、対応する電荷蓄積素子が新たな電荷を受け入れ可能な状態になった時点で、転送制御部１５２から光検出面４２に転送信号が出力される。したがって、図１２Ｇに示すように、図１２Ａにおける第３段４２３の「Ａ」を付した画素が光電変換した電荷は、水平転送レジスタ４８に他の電荷と重ね合わされることなく受け渡される。

図１３Ａ〜図１３Ｄを参照しつつ、図１０Ａ〜図１０Ｅ、図１１Ａ〜図１１Ｇ、図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した変形例の効果を説明する。図１３Ａは、比較例として全ての画素で発生した電荷を検出信号として出力する構成をとった場合のタイミングチャートを、図１３Ｂは図１０Ａ〜図１０Ｅで説明した変形例のタイミングチャートを、図１３Ｃは図１１Ａ〜図１１Ｇで説明した変形例のタイミングチャートを、図１３Ｄは図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した変形例のタイミングチャートをそれぞれ示している。図１３Ａ〜図１３Ｄに示す各タイミングチャートは、上段が垂直同期、下段が水平同期をそれぞれ示している。また、下段において丸印又は英文字を付してあるのは、解析対象画素群に属する画素で発生した電荷を、斜線を付してあるのは、解析対象画素群に属さない画素で発生した電荷を、それぞれ転送することを示している。

図１３Ａに示す比較例では、各段の画素が光電変換した電荷を１段づつ読み出しているので、水平方向の読み出しは６段分必要となる。一方、図１３Ｂに示す例（図１０Ａ〜図１０Ｅで説明した変形例）では、解析対象画素群に属さない画素が光電変換した電荷は重ね合わされているので、水平方向の転送速度が同一であっても１フレーム分の電荷の読み出し時間を短縮できる。このため、検出信号を高速度で読み出すことができる。

図１３Ｃに示す例（図１１Ａ〜図１１Ｇで説明した変形例）では、第３段３２３及び第４段３２４に属する画素が、解析対象画素群に属する画素及び解析対象画素群に属さない画素をともに含む場合であるが、一部の画素が解析対象画素群に属する画素であっても、その画素と同一段に属する解析対象画素群に属さない画素が光電変換した電荷は重ね合わせて読み出すので、更に１フレーム分の電荷の読み出し時間を短縮できる。このため、検出信号を更に高速度で読み出すことができる。

図１３Ｄに示す例（図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した変形例）では、インターライン型のＣＣＤ撮像素子を用いているので解析対象画素群に属さない画素の読み出しに影響されずに、解析対象画素群に属する画素の電荷を読み出すことができる。このため、検出信号を高速度で読み出すことができる。また、読み出しと露光とを同時に行えるため、出力されたデータを２次元画像として取り扱うことができる。

図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５Ａ、図１５Ｂを参照しつつ、図１０Ａ〜図１０Ｅ、図１１Ａ〜図１１Ｇ、図１２Ａ〜図１２Ｇで説明した動作時の各ＣＣＤの動作タイミングを説明する。図１４Ａはフレームトランスファー型のＣＣＤ撮像素子を用いて図１０Ａ〜図１０Ｅ又は図１１Ａ〜図１１Ｇを用いて説明した動作を行った場合のタイミングチャートを示している。図１４Ｂはインターライン型のＣＣＤ撮像素子を用いて図１０Ａ〜図１０Ｅ又は図１１Ａ〜図１１Ｇを用いて説明した動作を行った場合のタイミングチャートを示している。

図１４Ａ及び図１４Ｂにおいて、ＰＩＶはフレームトランスファー型ＣＣＤ撮像素子のイメージエリア（光検出部）シフトパルス信号を、ＰＳＶはフレームトランスファー型ＣＣＤ撮像素子のメモリエリア（蓄積部）シフトパルス信号を、ＰＨは水平ＣＣＤシフトパルス信号を、ＳＧはフォトダイオードから垂直転送ＣＣＤへの転送パルス信号を、ＰＶは垂直シフトパルス信号を、ＶＶは垂直有効信号を、それぞれ示している。尚、フレームトランスファー型ＣＣＤ撮像素子は、イメージエリアが１０×６、メモリエリアが１０×６のものを想定している。図１４Ａ及び図１４Ｂそれぞれの垂直有効信号を比較すれば、図１０Ａ〜図１０Ｅ又は図１１Ａ〜図１１Ｇを用いて説明した動作を行う場合には、フレームトランスファー型ＣＣＤ撮像素子及びインターライン型ＣＣＤ撮像素子のいずれを用いてもほぼ同じ速度での読み出しが可能となることがわかる。

図１５Ａはインターライン型のＣＣＤ撮像素子を用いて図１２Ａ〜図１２Ｇを用いて説明した動作を行った場合のタイミングチャートを示している。図１５Ｂはフレームトランスファー型のＣＣＤ撮像素子を用いて図１２Ａ〜図１２Ｇを用いて説明した動作を行った場合のタイミングチャートを示している。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいて用いている記号は、図１４Ａ及び図１４Ｂで用いている記号と同じである。図１５Ａ及び図１５Ｂそれぞれの垂直有効信号を比較すれば、図１２Ａ〜図１２Ｇを用いて説明した動作を行う場合には、インターライン型ＣＣＤ撮像素子を用いた方が格段に速度の向上が図れることとなることがわかる。これは、インターライン型ＣＣＤ撮像素子は不要エリアにそのまま必要エリアを足しこめるためであるのに対して、フレームトランスファー型ＣＣＤ撮像素子はその動作ができないことに起因する。

本発明による蛍光相関分光解析装置は、上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施形態においては、解析対象画素群は、その領域が蛍光入射領域と一致するように選択される例を示した。しかし、解析対象画素群は、その領域の一部に蛍光入射領域を含むように選択されてもよい。あるいは、解析対象画素群は、その領域が蛍光入射領域に含まれるように選択されてもよい。あるいは、解析対象画素群は、その領域の一部に蛍光入射領域の一部を含むように選択されてもよい。

図１６Ａ〜図１６Ｌ、及び図１７Ａ〜図１７Ｋを参照しつつ、蛍光相関分光解析装置１においてＣＣＤカメラ１５から検出信号を読出す動作の他の例を説明する（図６Ａ〜図６Ｄ参照）。

撮像部としてフレームトランスファー型（フレーム転送型）のＣＣＤを用いた場合の、電荷の読み出し方法について、図１６Ａ〜図１６Ｆを用いて説明する。

撮像部９５は、光検出部（光検出面）９５ａと蓄積部９５ｂとを別々に有するフレームトランスファー型（フレーム転送型）のものである。撮像部９５は、垂直方向（図中上下方向）及び水平方向（図中左右方向）に沿って複数の画素Ｐが２次元的に配列されている。ここでは、全部で１２０個の画素Ｐが、垂直方向に１２段に分けられて配列されている場合を例にとって説明する。このとき、各段には、水平方向に沿って１０個の画素が配列されている。

これらの画素Ｐは、光検出部９５ａを構成する画素と蓄積部９５ｂを構成する画素とに分けられている。すなわち、全画素Ｐのうち上半分（上から１段目から６段目まで）に含まれる６０個の画素は光検出部を構成し、下半分（上から７段目から１２段目まで）に含まれる６０個の画素は蓄積部を構成している。光検出部９５ａを構成する各画素Ｐにおいては、入射した蛍光が光電変換され、光電変換により発生した電荷が一段ずつ垂直方向に転送される。光検出部９５ａの最下段（第６段９５６）の画素から垂直方向に転送された電荷は、蓄積部９５ｂの最上段（第１段９５７）の画素に受け渡される。蓄積部９５ｂを構成する各画素においては、光検出部９５ａから受け渡された電荷が垂直方向に一段ずつ転送される。

また、蓄積部９５ｂの最下段（第６段９６２）に隣接して水平転送レジスタ９６が設けられている。蓄積部９５ｂの最下段（第６段９６２）の画素から垂直方向に転送された電荷は、水平転送レジスタ９６に受け渡される。水平転送レジスタ９６においては、蓄積部９５ｂから受け渡された電荷を水平方向に転送し、検出信号として出力される。

図１６Ａは、光検出部９５ａに蛍光が入射されて、光検出部９５ａの各画素が受光した状態を模式的に示した図である。図１６Ａにおいて、「Ａ」を付した領域に蛍光が入射されているものとする。図１６Ｂは、検出部９５ａに属する各画素で発生した電荷が蓄積部９５ｂまで転送された直後の状態を示している。すなわち、図１６Ａにおいて蛍光の入射に応じて発生した電荷は、図１６Ｂに示すように、蓄積部９５ｂの第１段９５７及び第２段９５８の各画素に蓄積されている。このように蛍光の入射に応じて発生した電荷が全て蓄積部９５ｂまで転送されると、その直後に光検出部９５ａに電子シャッタ信号が送られ、光検出部９５ａにおいて蛍光が入射されない画素で発生した電荷が全て掃き捨てられる（図１６Ｃ参照）。

さらに、光検出部９５ａにおいては、電荷が掃き捨てられた直後に、次の露光が行われる。図１６Ｄにおいて、「Ｂ」を付した領域に蛍光が入射されているものとする。この露光により光検出部９５ａで発生した電荷は蓄積部９５ｂへと転送される。図１６Ｅは、この露光により蛍光の入射に応じて発生した電荷が蓄積部９５ｂまで転送された直後の状態を示している。このとき、前回の露光により光検出部９５ａで発生した電荷は、第３段９５９及び第４段９６０まで転送されている。

上述の動作が繰り返され、蓄積部９５ｂの第１段９５７〜第６段９６２全てに蛍光の入射に応じて発生した電荷が順次蓄積された後、これらの電荷は一段ずつ水平転送レジスタ９６に転送され、水平転送レジスタ９６により順次電荷が読出し回路へ向けて転送される。この動作の間にも、光検出部９５ａにおける露光は行われる。ただし、この露光時間は、水平転送レジスタ９６が１段分の電荷全てを転送するのに要する時間以下に設定する必要がある。図１６Ｆにおいては、１回目の露光により発生した電荷が第５段９６１及び第６段９６２に、２回目の露光により発生した電荷が第３段９５９及び第４段９６０に蓄積されており、第１段９５７及び第２段９５８には、３回目の露光により発生した電荷が蓄積されている（図中「Ｃ」を付す）。水平転送レジスタ９６は、最初の段（最下段）の電荷を全て読出し回路へ向けて転送すると、続いて次の段の電荷の転送を行う。このように、本例による読出し動作では、蛍光の入射に応じて発生した電荷のみが実質的な検出信号として出力される。

本例においては、制御部（電子シャッタ信号出力手段）が電子シャッタ信号を出力することにより、蛍光が入射されない各画素で発生した電荷を掃き捨てさせている。これにより、蛍光の入射に応じて発生した電荷のみを繰返し蓄積部へ転送することができる。また、水平転送レジスタ９６による転送は光検出部９５ａにおける露光中も行われているので、蛍光の入射に応じて発生した電荷を水平転送レジスタ９６が水平転送する時間を最小として、高繰り返しにデータを取得することができる。本例では特に、光検出部９５ａにおいて蓄積部９５ｂに隣接する第６段９５６の画素を含むように蛍光を入射する領域を設定しているため、蛍光を入射する領域を構成する垂直方向の数ライン（本例では２ライン）分の電荷を転送する時間間隔で、解析対象画素群（所定領域）の情報を隙間なく次々と読み出すことができる。それゆえ、検出信号を特に高速度で読み出すことが可能となる。

図１６Ｆの後に、引き続いて説明するような露光及び読み出しを行う。この露光及び読み出しについて図１６Ｇ〜図１６Ｌを参照しながら説明する。図１６Ｆの状態から更に露光を行うと図１６Ｇの状態となる。ここで、蓄積部９５ｂの全ての画素は受け渡された電荷で満たされている。図１６Ｇの状態から１ライン分垂直転送を行うと図１６Ｈに示す状態となる。引き続いて１ライン分垂直転送を行うと図１６Ｉに示す状態となる。図１６Ｉに示す状態では最初の露光で蓄積された電荷（図中「Ａ」を付した部分）が重ねあわされた状態で水平転送レジスタ９６に格納される（図中「ＡＡ」で示す）。ここで電子シャッタ信号を出力すると再び光検出部９５ａに属する画素の電荷は掃き捨てられる（図１６Ｊ参照）。

ここで水平転送レジスタ９６を順次読み出すことで、水平方向の解像度を保ったまま（電荷が重ね合わされたのは垂直方向であるため）画像を取得することができる。また、この水平転送レジスタ９６の読み出し期間中には、更に次の露光が行われる（図１６Ｋ参照、図中「ｅ」は露光途中の状態を示す）。水平転送レジスタ９６の読み出しが完了すると新たな露光も完了する（図１６Ｌ参照。図中「Ｅ」は露光が完了した状態を示す）。図１６Ｌに示す状態は図１６Ｇに示す状態と等価であるから、図１６Ｈ〜図１６Ｌを参照しながら説明した露光及び読み出しを繰り返すと、画像出力の繰り返しレートを不必要に落とすことなく画像を連続的に出力することが可能となる。

更に別の露光及び読み出しの例について図１７Ａ〜図１７Ｋを参照しながら説明する。図１６Ａ〜図１６Ｌでは水平読み出し段において、解析対象画素群ごとに垂直方向への重ねあわせを行った例を説明した。図１７Ａ〜図１７Ｋでは、垂直方向への重ねあわせを行わない場合について説明する。図１７Ａ〜図１７Ｃでは図１６Ａ〜図１６Ｃを参照しながら説明したのと同様の露光及び転送を行っている。フレームトランスファー型ＣＣＤの場合、光検出部９５ａと蓄積部９５ｂのそれぞれの垂直方向への駆動を独立して行うことができる。そこで、図１７Ｃに示す状態から、光検出部９５ａでは露光を行いながら（図中「ｂ」で示す）、蓄積部９５ｂでは垂直方向に転送を行う。蓄積部９５ｂでの垂直転送を２ライン分行うと、光検出部９５ａでの露光が完了する（図１７Ｅ参照）。図１７Ｅで示すように２ライン分の隙間が生じるように駆動したのは、２ラインを解析対象画素群としているためである。従って、この隙間は蓄積部のライン数と画素群の垂直単位とから導き出される適切な値に基づいて設定される。

図１７Ｅの状態から光検出部９５ａ及び蓄積部９５ｂ共に垂直転送を行い、図１７Ｆに示す状態となる。図１７Ｆに示す状態から電子シャッタ信号を出力し、光検出部９５ａに蓄積された電荷を掃き捨てる（図１７Ｇ参照）。図１７Ｇの状態から、更に１ライン分垂直に転送すると、図１７Ｈに示すように「Ａ」で示す電荷の最初のラインが水平転送レジスタ９６に転送される。ここで図１７Ｉに示すように、水平転送レジスタ９６を読み出しながら、光検出部９５ａで露光を行う（図中「ｃ」は露光中であることを示す）。最初のラインにおける「Ａ」の電荷の読み出しが完了すると、更に蓄積部９５ｂのみに垂直転送を行い、次のラインの「Ａ」の電荷を水平転送レジスタ９６に転送する（図１７Ｊ参照）。ここで水平転送レジスタ９６の読み出しが完了すると、光検出部９５ａにおける露光も完了して図１７Ｋに示すような状態となる。図１７Ｋに示す状態は図１７Ｅに示した状態と等価であるから、図１７Ｆ〜図１７Ｋを参照しながら説明した露光及び読み出しを繰り返すと、画像出力の繰り返しレートを不必要に落とすことなく画像を連続的に出力することが可能となる。

本発明による蛍光相関分光解析装置は、タンパク質の結合過程の解析、及びドラッグスクリーニング等に用いられる蛍光相関分光解析装置として利用可能である。特に、本発明によれば、被測定試料の多点に対して同時且つ高速に蛍光相関分光解析を行うことが可能な蛍光相関分光解析装置が実現される。

Claims (7)

1. 被測定試料の所定領域に励起光を照射する励起光照射光学系と、
   前記励起光照射光学系により励起光が照射された前記被測定試料の前記所定領域内の蛍光分子から発生した蛍光を結像する蛍光結像光学系と、
   前記蛍光結像光学系により結像された蛍光の像面位置に設けられ相互に交わる第１の方向及び第２の方向に沿って複数の画素が２次元的に配列された光検出面を有するとともに、前記光検出面に入射した蛍光を前記各画素毎に光電変換し、光電変換により発生した電荷を前記第１の方向及び前記第２の方向に転送して出力端から検出信号として出力する検出器と、
   前記光検出面に配列された全ての前記画素の中から、前記光検出面における前記蛍光結像光学系により結像された蛍光の入射領域に応じて選択された一部の画素からなる画素群に属する画素からの前記検出信号を入力し、該検出信号のそれぞれについて自己相関関数を求める解析部と、
   前記励起光照射光学系により前記被測定試料の前記所定領域に照射される励起光を該被測定試料に対して走査させる走査手段と、
   を備え、
   前記走査手段はガルバノミラーであるとともに、前記ガルバノミラーは、前記励起光照射光学系と前記蛍光結像光学系とで共通に設けられ、前記被測定試料で発生した蛍光は、前記ガルバノミラーにより反射され、前記検出器の前記光検出面における前記蛍光の入射領域に結像されることを特徴とする蛍光相関分光解析装置。
2. 前記光検出面において、前記画素群は、その領域が前記蛍光の入射領域と一致するように選択されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光相関分光解析装置。
3. 前記検出器は、前記第１の方向に転送される電荷を前記画素から受け取って蓄積し、蓄積した電荷を前記第２の方向に転送する水平転送レジスタと、前記各画素及び前記水平転送レジスタに対して電荷を転送するための転送信号を出力する転送制御手段とを有し、
   前記転送制御手段は、前記画素群に属さない画素で発生した電荷が前記第１の方向に重ね合わされて前記水平転送レジスタに蓄積された後に前記第２の方向に転送され、且つ前記画素群に属する画素で発生した電荷が前記第１の方向に一段毎に蓄積されて前記第２の方向に転送されるように、前記転送信号を出力することを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光相関分光解析装置。
4. 前記転送制御手段は、
   前記画素群に属する画素に前記転送信号を出力して、前記画素群に属する画素で発生した電荷を前記第１の方向に転送させるとともに、
   前記第２の方向に沿う一の段の画素が前記画素群に属する画素を含むものである場合には、前記一の段の画素で発生した電荷が前記水平転送レジスタに転送される前の段において前記水平転送レジスタに対して前記転送信号を出力することを特徴とする請求項３に記載の蛍光相関分光解析装置。
5. 前記第２の方向に沿う一の段の画素が前記画素群に属する画素と前記画素群に属さない画素とを含むものである場合に、
   前記転送制御手段は、前記一の段の前記画素群に属する画素に対応する前記水平転送レジスタから電荷が掃き出されて新たな電荷を受け入れ可能となっている場合には、前記一の段の画素に対して前記転送信号を出力することにより電荷を前記水平転送レジスタへ転送させることを特徴とする請求項３または４に記載の蛍光相関分光解析装置。
6. 前記検出器は、前記各画素で発生した電荷を蓄積し、蓄積した電荷を前記第１の方向に転送する第１電荷蓄積素子と、前記第１の方向に転送された電荷を前記第１電荷蓄積素子から受け取って蓄積し、蓄積した電荷を前記第２の方向に転送する第２電荷蓄積素子とを有し、
   前記転送制御手段は、前記第１電荷蓄積素子及び前記第２電荷蓄積素子に対して電荷を転送するための転送信号を出力し、
   前記第２の方向に沿う一の段の画素が前記画素群に属する画素と前記画素群に属さない画素とを含むものである場合に、
   前記転送制御手段は、前記一の段の前記画素群に属する画素に対応する前記第２電荷蓄積素子から電荷が掃き出されて新たな電荷を受け入れ可能となっている場合には、前記一の段の画素に対応する前記第１電荷蓄積素子に対して前記転送信号を出力することにより電荷を前記第２電荷蓄積素子へ転送させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光相関分光解析装置。
7. 前記光検出面に対して前記画素群に属さない画素で発生した電荷を掃き捨てさせるための電子シャッタ信号を出力する電子シャッタ信号出力手段を備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光相関分光解析装置。

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