JP2014507662A - ラインスキャン血球計算システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
胞の画像)と呼ばれる別の技法は、カメラまたは顕微鏡によって記憶することができる。
して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する。いくつかの実施形態では、画像は、スキャン領域内の実質的に同じそれぞれの場所に対応するそれぞれの画像からのピクセル値をデジタル的に結合することによって結合される。画像は、時間遅延積分によって結合される。システムは、蛍光によって細胞から発する光をリニア光センサセットに優先的に提供するように構成された波長選択性フィルタをさらに備える。
いくつかの実施形態では、システムは、対物レンズと、可動光学コンポーネントと対物レンズとの間の4f光学系とをさらに備える。可動光学コンポーネントは、スキャン中にシステムの唯一の可動コンポーネントとすることができる。システムは、少なくとも1つのリニア光センサを備える第2のセットをさらに備え、第2のセットは、第1のセットによって受信される光と異なる波長帯域の光を受信する。いくつかの実施形態では、システムは、両方のリニア光センサセットから画像データを受信し、下流画像処理を使用して画像を結合する処理ユニットをさらに備える。
いくつかの実施形態では、セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は、結合されて、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する。
を回転させることを含む。セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、方法は、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合することであって、それにより、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、結合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも1つのリニア光センサを備える第2のセット上にフォーカスさせることをさらに含み、第2のセットは、第1のセットと異なる波長帯域の光を受信する。
呼ばれることがある。センサピクセルによって検知されるスキャンラインの対応する部位もまた、「ピクセル」と呼ばれる。センサ205は、たとえば、ピクセルの1つまたは複数の列であって、各列が512、1024、2048、または別の適切な数のピクセルを含む、ピクセルの1つまたは複数の列を備えることができる。ピクセルの列上に入射する光の強度は、ピクセルアレイであって、所定の露出時間の間、ピクセル部位内に電荷が蓄積することを可能にし、蓄積された電荷量を、光強度を表す数値に変換する、ピクセルアレイをクリアすることによって読取ることができる。このプロセスは、細胞がスキャンエリアを通過するときに繰返し実施される。1つの例示的な実施形態では、システムは、20マイクロ秒ごとにまたは50kHzのスキャンレートで測定値を取得する(「ラインをスキャンする(scan a line)」)ことができる。10ミリメートル/秒の細胞搬送速度お
よび50kHzのスキャンレートを使用することは、200nmの結像ピクセルサイズをもたらす。他の搬送速度およびスキャンレートが可能であり、他の結像ピクセルサイズをもたらすことができる。結果として得られる測定アレイは、細胞の適切な画像に再構成されうる。
、細胞移動速度、サンプルレート、およびピクセルサイズの特定の組合せについて起こることになるだけである。実際には、連続するスキャンラインは、結像される細胞上でオーバラップする場合がある、または、連続するスキャンラインによって読取られる細胞のエリア間にギャップが存在する場合がある。)ピクセルa、b、c、d、およびeによって読取られる光量は、細胞101の構造によって影響を受ける。たとえば、細胞がスキャンライン301を全く横切らないとき、比較的高い光量が登録される。細胞101の比較的透明な部分がピクセルを横切るとき、そのピクセルによって登録される光量はある程度減少する。細胞101の核がピクセル内にあるとき、そのピクセルにおいて登録される光量は、大幅に減少する場合がある。図3Cは、時間の関数として、ピクセルa、b、およびcにおいて登録された光量(0〜1の範囲の任意のスケール上)のトレースを示す。図3Dは、いくつかの連続するラインスキャン中にスキャンされるデータを共に積重ね、それぞれの数値的な光の測定値を印刷されたグレースケールで表すことによって形成された再構成画像を示す。図3Dは、少数の時間でサンプリングされた少数のピクセルだけを使用して構築され、したがって、細胞101の比較的粗い図を示すが、実際には、本発明の実施形態によるシステムは、各細胞の通過中に、より多くのまたはより少ないラインをスキャンすることができ、各ラインは、図示するよりも多くのまたは少ないピクセルを含むことができる。一実施形態では、システムは、各細胞の通過中に約50ラインをスキャンすることができ、各ラインは、約50ピクセルを含むことができる。スキャンされるラインおよび各細胞について影響を受けるピクセルの正確な数は、細胞のサイズ、ラインスキャン周波数、スキャンラインを通過して細胞が流れる速度、ならびに使用される特定のセンサおよび光学コンポーネントに依存することになる。
特性の光が蛍光によって生成される。たとえば、1つの蛍光体は、532nmの励起光に強く反応し、約550nmの放出ピークを有する放出光を生成することができ、第2の蛍光体は、633nmの励起光に強く反応し、約650nmの放出ピークを有する放出光を生成することができる。これらの異なる放出は、励起光の2つの色が示されるのと同様な方法で、破線と実線を使用して図5におおよそ示されるが、放出後に特定のラインタイプで示す光は、一般に、同じラインタイプで示す励起光と同じスペクトル特性を持たないことが理解される。
0は、システム500と同様であり、追加のスリットアパーチャ601および602がカメラ601および602の前部に設置される。スリットアパーチャ601および602は、システムの焦点面以外の場所から採取される一部の光がそれぞれのカメラに達するのを阻止または排除する傾向がある効果を持つ。この効果は、細胞101の上の焦点外の場所から発する細かい破線の光線束603によって図6に示される。レンズ508から発する、結果として得られる光線束604は、システムの焦点面からの光よりもレンズ508に接近してフォーカスすることになる。束604内の光がスリットアパーチャ601に達するときまでに、束604は、既に分散し始めているため、束604の中心のほんのわずかな部分が、スリット601を通過し、カメラ509に達しうる。こうして、システムは、細胞101においてシステムの焦点面からの光を優先的に受信し、他の深さの場所から受信される少なくとも一部の光を排除する。
半共焦結像を利用しないシステムによって記録される画像と比較して、システムによって記録される画像のコントラストを改善する。
よび708などの1つまたは複数のさらなるフィルタを、光学経路内に設置することができる。チューブレンズ705は、リニア光センサ706上に光を再フォーカスし、リニア光センサ706は、ラインスキャンセンサの一部とすることができ、処理ユニット514によって読取られうる。
センサによって作られる特定の細胞の完全な画像は全く構築されない。
図5に示すシステム500のようなシステムはまた、各カメラ509、513が2つ以上のリニア光センサのセットを含むように適合されうることを当業者は認識するであろう。結像は、カメラ801に関して上述したように各カメラ509、513によって実施されるため、多色結像を、デジタル画像結合またはTDIによって達成することができる。
さらに、デジタル画像結合によるのであれ、時間遅延積分によるのであれ、少なくとも2つの平行リニア光センサから画像を結合することは、ビニングまたは他の分解能減少技法によって結合されうる。ビニングは、分解能が減少するが、信号対雑音特性がさらに改善された画像を生成することができる。
ラインスキャン血球計算技法は、全ての実施形態において長尺状照明場の使用を必要としない場合がある。従来の円形落射照明を利用することができ、照明パワーが十分に高いことを実現する。散乱した非蛍光光を使用した結像の場合、照明源の十分なパワーを達成することが難しくない場合がある。しかし、蛍光によって放出する光を実際に検知する場合、長尺状場内に励起光を集中させることが、ずっとエネルギー効率的であり、たとえば、必要とされる励起レーザパワーを、数十〜数百ワットで測定されるレベルから数十〜数百ミリワットで測定されるレベルまで低減しうる。
ンポーネントおよび配置構成を使用するが、図9Aに示す照明技法は、他の検知配置構成と共に使用することもできることを当業者は認識するであろう。システム900では、照明が、検知が実施されるのと同じ方向からレーザ901によって提供されるため、サンプルの上の空間が遮るものがないままである。したがって、この配置構成は、サンプルステージとコンデンサレンズとの間の距離より厚くないサンプルに制限する場合がある、以前に述べた配置構成に比べてずっと大きなサンプルを収容することができる。図9Aのシステムの別の利点は、対物レンズ405が、照明場の形成に関与することである。対物レンズ405は、通常、非常に高品質のレンズであるため、対物レンズ405が作る照明場を明確に画定することができる。
。リニアラインセンサ1004は、正方形またはほぼ正方形である感光性ピクセル部位を有することができる、または、感度の改善をもたらす場合がある細長いアスペクト比を有するピクセルを含むことができる。細長いピクセルを有するセンサの例は、米国、コネチカット州、ストラトフォートのOriel Instrumentsから入手可能なOriel LineSpec CCD検出器である。
トと考えることができる。他の実施形態では、リニア光センサのセットは、2つ以上のセンサを含むことができ、セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は、結合されて、セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成することができる。たとえば、画像が、時間遅延積分を使用して結合される場合がある、時間遅延および平均法を使用して結合される場合がある、ピクセルビニングを使用して結合される場合がある、デジタル的に結合される場合がある、または、他の方法によって結合される場合がある。
できる。他の実施形態の場合と同様に、リニア光センサ1204は、1つまたは複数のリニア光センサのセットを備えることができる。図12Aに示す実施形態などのいくつかの実施形態では、収集光学部品1203は、スキャン領域の場所のリニアなセットからリニア光センサ1204上の場所へ光を送るファイバのリニアアレイになるよう形成されるファイバ束を含む。好ましくは、ファイバのリニアアレイは、結像される細胞101とスキャン領域との間の相対的運動の方向に全体的に垂直に配設される。
異なる波長帯域で取得されるが、たとえば2つの蛍光体の放出スペクトルのオーバラップのせいで、2つの画像間にかなりのクロストークが存在する。図14の例では、タグ付けされたアクチンを示す第1のサブセクション1404の特徴は、第2のサブセクション1405内で特に見ることができる。スペクトル分離は、画像間のクロストークの量を低減するために適用され、画像1406および1407をもたらす。所望される場合、処理済み画像1406および1407で見ることができる特徴を、誤った色および融合画像を対比させて割当てることができる。分離技法は、同様に他の光学的配置構成によって、たとえば図5に示すシステム500によって得られる画像について実施することができることが認識されるであろう。他の種類の下流画像処理またはデータ解析も使用することができる。
または複数(one or more)」を意味することを意図される。用語「備える(comprise)」な
らびに「備える(comprises)」および「備える(comprising)」などのその変形は、ステッ
プまたは要素の列挙に先行するとき、さらなるステップまたは要素の追加がオプションであり、排除されないことを意味することを意図される。本発明は、ここで、明確さおよび理解のために詳細に述べられた。しかし、特定の変更および修正を、添付特許請求の範囲内で実施することができることを当業者は理解するであろう。
Claims (26)
- 血球計算を実施するためのシステムにおいて、
光源と、
スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を前記光源からの光に照明させるための光整形要素と、
少なくとも1つのリニア光センサを備えるセットと、
前記スキャン領域の照明された部分の画像を前記リニア光センサセット上にフォーカスさせるための光学系と、
可動光学コンポーネントであって、結像の対象となる細胞を横断する方式にて、前記長尺状またはスリット状の照明場と、前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の部分との両方を掃引するための、可動光学コンポーネントとを備え、
前記長尺状またはスリット状の照明場および前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の前記部分が、結像の対象となる細胞を横断して掃引される間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する、システム。 - 前記可動光学コンポーネントは回転自在のミラーを備える請求項1に記載のシステム。
- 前記可動光学コンポーネントを移動させるガルバノメータをさらに備える請求項1に記載のシステム。
- 前記光源はレーザを備える請求項1に記載のシステム。
- 前記光整形要素は円柱レンズを備える請求項1に記載のシステム。
- 前記セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は結合された結果、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、請求項1に記載のシステム。
- 前記画像は、前記スキャン領域内の実質的に同じそれぞれの場所に対応するそれぞれの画像からのピクセル値をデジタル的に結合することによって結合される請求項6に記載のシステム。
- 前記画像は、時間遅延積分によって結合される請求項6に記載のシステム。
- 蛍光によって前記細胞から発する光を前記リニア光センサセットに優先的に提供するように構成された波長選択性フィルタをさらに備える請求項1に記載のシステム。
- 対物レンズと、
前記可動光学コンポーネントと前記対物レンズとの間の4f光学系とをさらに備える請求項1に記載のシステム。 - 前記可動光学コンポーネントは、スキャン中にシステムの唯一の可動コンポーネントである請求項1に記載のシステム。
- 少なくとも1つのリニア光センサを備える第2のセットをさらに備え、前記第2のセットは、前記第1のセットによって受信される光と異なる波長帯域の光を受信する請求項1に記載のシステム。
- 両方のリニア光センサセットから画像データを受信し、下流画像処理を使用して前記画像を結合する処理ユニットをさらに備える請求項12に記載のシステム。
- 血球計算を実施するためのシステムにおいて、
光源と、
スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を前記光源からの光に照明させるための光整形要素と、
少なくとも1つのリニア光センサを備えるセットと、
前記スキャン領域から発する光を収集し、前記収集された光の少なくとも一部を前記リニア光センサセットに送る光ファイバ束と、
結像の対象となる細胞と前記光ファイバ束の一端との間の相対的運動を生成するためのメカニズムとを備え、
細胞が前記スキャン領域を通過する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する、システム。 - 前記長尺状またはスリット状の照明場および前記光ファイバ束の端部は、結像される前記細胞と前記スキャン領域との間の相対的運動を生成するよう移動する請求項14に記載のシステム。
- 前記セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は結合された結果、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、請求項14に記載のシステム。
- 血球計算を実施するためのシステムにおいて、
スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を照明する光源と、少なくとも1つのリニア光センサを備えるセットと、前記スキャン領域の照明された部分の画像を前記リニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系とを備える、光学モジュールと、
結像の対象となる細胞用のホルダと、
前記スキャン領域が前記細胞を横断する方式で前記細胞に対して前記光学モジュールを相対移動させるためのメカニズムとを備え、
前記スキャン領域が前記細胞を横断する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得するシステム。 - 前記セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像は結合された結果、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、請求項17に記載のシステム。
- 血球計算を実施するための方法において、
長尺状またはスリット状の照明場によってスキャン領域を照明する工程と、
前記スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも1つのリニア光センサを備えるセット上にフォーカスする工程と、
可動光学コンポーネントであって、前記スキャン領域内にて結像の対象となる細胞を横切る方式で、前記長尺状またはスリット状の照明場と、前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の部分との両方を掃引するための、可動光学コンポーネントを移動する工程と、
前記長尺状またはスリット状の照明場と、前記リニア光センサによって結像される前記スキャン領域の前記部分とが、結像の対象となる細胞を横断して掃引される間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する工程とを備える、血球計算
を実施するための方法。 - 可動光学コンポーネントを移動させる工程は、回転自在のミラーを回転させることを含んでなる、請求項19に記載の血球計算を実施するための方法。
- 可動光学コンポーネントを移動する工程は、ガルバノメータを回転させることを含んでなる、請求項19に記載の血球計算を実施するための方法。
- 前記セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、方法は、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合する工程であって、それにより、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、画像を結合する工程をさらに備える、請求項19に記載の血球計算を実施するための方法。
- 前記スキャン領域の照明された部分の画像を、少なくとも1つのリニア光センサを備える第2のセット上にフォーカスさせる工程をさらに備え、前記第2のセットは、前記第1のセットと異なる波長帯域の光を受信する、請求項19に記載の血球計算を実施するための方法。
- 血球計算を実施するための方法において、
長尺状またはスリット状の照明場によってスキャン領域を照明する工程と、
光ファイバ束を使用して前記スキャン領域から発する光を収集する工程であって、前記光ファイバ束は、前記収集された光の少なくとも一部を少なくとも1つのリニア光センサを備えるセットに送る、前記スキャン領域から発する光を収集する工程と、
結像の対象となる細胞と前記光ファイバ束の一端との間の相対的運動を生成する工程と、
細胞が前記スキャン領域を通過する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する工程とを備える、方法。 - 前記セットは、少なくとも2つのリニア光センサを備え、方法は、前記セット内の個々のリニア光センサによって採取される画像を結合する工程であって、それにより、前記セット内の単一のリニア光センサによって採取される画像と比較して、改善された信号対雑音特性を有する画像を形成する、画像を結合する工程をさらに備える、請求項24に記載の血球計算を実施するための方法。
- 血球計算を実施するための方法において、
結像の対象となる細胞をスキャン領域内に保持する工程と、
前記細胞に対して光学モジュールを相対移動させる工程であって、光学モジュールは、スキャン領域において長尺状またはスリット状の照明場を照明する光源と、少なくとも1つのリニア光センサを備えるセットと、前記スキャン領域の照明された部分の画像を前記リニア光センサセット上にフォーカスさせる光学系とを備える、光学モジュールを相対移動させる工程と、
前記スキャン領域が前記細胞を横断する間に、前記リニア光センサセット上に入射する光の測定値を繰返し取得する工程とを備える、方法。
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