KR20220097404A - 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20220097404A
KR20220097404A KR1020227015246A KR20227015246A KR20220097404A KR 20220097404 A KR20220097404 A KR 20220097404A KR 1020227015246 A KR1020227015246 A KR 1020227015246A KR 20227015246 A KR20227015246 A KR 20227015246A KR 20220097404 A KR20220097404 A KR 20220097404A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
effector
encoded
microns
channel
Prior art date
Application number
KR1020227015246A
Other languages
English (en)
Inventor
데본 케이어
앤드루 맥코널
파벨 추부코프
래메시 램지
션 스트롬버그
Original Assignee
1859, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 1859, 인크. filed Critical 1859, 인크.
Publication of KR20220097404A publication Critical patent/KR20220097404A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/08—Methods of screening libraries by measuring catalytic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C40B50/16—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support involving encoding steps
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0424—Dielectrophoretic forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/30—Characterised by physical treatment
    • C12Q2523/319—Photocleavage, photolysis, photoactivation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/549—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the capture oligonucleotide being a reporter labelled capture oligonucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B20/00—Methods specially adapted for identifying library members
    • C40B20/04—Identifying library members by means of a tag, label, or other readable or detectable entity associated with the library members, e.g. decoding processes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

이펙터 분자의 큰 라이브러리를 스크리닝하는 데 유용한 방법 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법 및 시스템은 미세유체 시스템 및 장치에 특히 유용하다. 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 인코딩된 이펙터를 사용하여 이펙터의 큰 라이러리를 스크리닝한다.

Description

미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템
상호 참조
본원은 2019년 10월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/913,624호, 및 2019년 12월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/954,348호를 우선권으로 주장하고, 이들 출원 둘 다는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
약물 개발은 종종 특정 화학 물질이 세포 및 다른 생물학적 구성요소에 얼마나 영향을 미치는지를 확인하기 위해 상당한 양의 시험 및 분석을 필요로 한다. 따라서, 특정 화학 물질과 생물학적 구성요소 사이의 관계를 연관시키는 데 초점을 맞춘 장치 및 특정 방법은 제약 회사와 같은 약물 개발자에게 필수적인 구성요소이다.
본원은 미세유체 시스템 및 인코딩된 이펙터를 사용하여 고처리량 어세이를 수행하는 시스템 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 시스템 및 방법은 거의 임의의 어세이를 고처리량 방식으로 수행하고 생물학적 시스템에 대한 다양한 이펙터 분자들의 효과에 관한 상세한 정보를 제공하는 데 이용될 수 있다. 본원에서 제공된 시스템 및 방법은 인코딩된 이펙터를 사용함으로써, 사용자로 하여금 어느 이펙터가 생물학적 샘플에 대한 효과를 갖는지를 용이하게 확인할 수 있게 한다.
다른 시스템은 스크린 동안 상이한 유닛 작업에서 관심 있는 농도의 시약 첨가를 맞춤화할 수 없다는 점을 비롯한 다양한 결점을 가진다. 본원에 기재된 시스템 및 방법은 이 결점을 해결한다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 스크리닝 절차의 상이한 단계에서 특정된 농도로 시약을 도입할 수 있게 한다. 일부 경우, 정의된 농도로 시약을 첨가하는 것은 스크리닝되는 라이브러리 전체에 걸쳐 균일한 용량의 이펙터가 투여될 수 있게 한다. 이것은 낮은 효능을 갖되 고도로 로딩된 이펙터가 라이브러리 스크린 전체에 걸쳐 균일한 농도로 샘플에 투여될 수 있기 때문에 스크린에서 거짓 양성이 감소되게 할 수 있다. 일부 경우, 맞춤화될 수 있는 시약 첨가는 스크린에서 양성 또는 음성 반응을 이끌어내는 이펙터의 물리적 분류 단계 없이 스크리닝 히트(hit)의 용이한 데콘볼루션(deconvolution)을 가능하게 한다.
또 다른 측면에서, 샘플로부터 방출된 빛(예를 들면, 형광)을 사용하지 않으면서 미세유체 기반 스크린에서 생물학적 샘플을 모니터링하는 방법을 제공한다. 이 방법은 분석되는 샘플에 대한 정보가 다른 방법에 의해 입수될 수 있는 정보보다 더 상세한 정보일 수 있게 한다. 추가로, 본원은 샘플로부터의 유전 또는 세포 정보를 인코딩된 이펙터 내로 혼입하는 방법 및 시스템을 제공한다. 이 혼입 단계는 이펙터와 접촉된 세포 또는 다른 생물학적 샘플의 반응의 분석이 다른 방법에 의해 이용될 수 있는 분석보다 더 개선될 수 있게 한다. 또 다른 측면에서, 샘플에 인코딩된 정보, 예컨대, DNA 바코드는 샘플로부터 인코딩물(encoding) 내로 혼입되어, 다수의 이펙터들의 상승작용적 이점을 확인할 수 있게 한다. 이것은 소분자 단편 기반 스크린을 수행하여 화합물 리드(lead)를 생성하는 데 이용될 수 있다.
본원에서 제공된 방법은 약물 스크리닝에 사용되는 기존 DNA 인코딩된 라이브러리에 비해 이점을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 포함된 방법들은 "친화성 기반" 어세이가 아니라 기능적 "활성 기반" 어세이이다: 이들은 기능적 어세이의 스크리닝을 허용한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법은 후보 약물이 질환 표적에 결합하는지를 시험하는 것으로 제한되지 않는다. 대조적으로, 본원의 방법은 후보 약물이 그 질환 표적에 대해 작용하는지를 시험할 수 있다. 이러한 작용은 억제, 단백질-단백질 상호작용의 파괴, 또는 효소 또는 알로스테릭 포켓의 활성화를 포함할 수 있다.
일부 경우, 본원에서 제공된 방법은 단일 어세이에서 세포 용해물, 세포 또는 다른 다성분 혼합물과 같은 복잡한 환경에서 스크리닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능적 활성 시험은 혼합물의 모든 다른 성분들에 대해 오르토고날하고(orthogonal) 특히 관심 있는 표적의 기능적 활성에 대해 시험한다. 본원에서 제공된 스크리닝 방식은 다양하다. 이러한 방식은 효능, 선택성, 독성, 성향, 또는 약물 발견 캠페인에 매우 중요한 다른 핵심 메트릭(metric)에 대해 스크리닝할 수 있다. 본원에서 제공된 방법은 다른 방법보다 1000배 더 낮은 작업 비용으로 속도 및 다양성을 허용할 수 있다. 일부 경우, 속도, 낮은 시약 요구 및 탁월한 검증률은 잠재적으로 무한한 세트의 화학적으로 다양한 화합물들을 빠르게 반복적으로 스크리닝할 수 있게 한다. 유연성 및 속도는 단일 표적에 대해 많은 상이한 어세이 또는 포맷으로 화합물을 시험하거나 스크리닝할 수 있게 함으로써, 조건의 다중 샘플링, 용이한 "재시작", 빠른 "히트 투 리드(hit to lead)" 시작, 및 라이브러리 디자인의 "즉각적인" 검증을 가능하게 한다.
일부 경우, 본원에서 제공된 방법은 높은 서열분석 깊이를 요구하지 않으므로, 분석 비용을 감소시킨다. 추가로, 본원에 개시된 방법은 각각의 화학 단계의 수율을 정량할 수 있게 함으로써, 정규화된 용량-반응 곡선 및 가능하게는 정량적 분석을 가능하게 한다.
일부 경우, 본원에서 제공된 방법은 인코딩된 비드의 합성에서 유기 용매를 요구하는 DNA 손상 화학반응, 또는 다른 방식으로 DNA를 손상시킬 조건을 이용할 수 있게 한다. 예를 들면, 소분자를 구축하는 데 필요한 일부 화학반응은 DNA를 분해할 수 있거나 DNA가 증폭될 수 없게 하므로, DNA 바코드 정보는 더 이상 판독될 수 없다. 일부 경우, 높은 수준으로 스캐폴드에 결합된 DNA 인코딩물을 제공함으로써 이 문제를 극복한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 스캐폴드에 결합된 천만 개 이상의 인코딩물을 포함한다. 추가로, 일부 실시양태에서, 양성 히트를 검출하기 위해 10개만큼 적은 인코딩물이 존재할 것이 요구된다.
본원은 세포 표현형 스크리닝 방법을 제공한다. 액적 내의 세포를 직접 시험할 수 있고 다양한 상이한 표현형에 대해 프로빙할 수 있다. 예를 들면, 전체 라이브러리를 특정 세포 유형에 대한 독성에 대해 스크리닝할 수 있거나, 전체 라이브러리를 그의 천연 세포 환경에서 특정 질환 표적에 영향을 미치는 그의 능력에 대해 스크리닝할 수 있거나, 전체 라이브러리를 표적 패널(전사체, 단백질 패널 등)에 영향을 미치는 그의 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 이것은 소분자가 비드로부터 유리된 후 세포 내부로 침투할 수 있고(또는 세포외 표적에 영향을 미칠 수 있고) 특정 질환 표적에 영향을 미칠 수 있기 때문에 허용된다.
본원은 인코딩된 이펙터의 스크린 결과를 정규화하는 방법도 제공한다. 스크린으로부터 결과를 확인하는 다른 방법은 높은 비율의 거짓 음성 결과로 인해 어려움을 겪고, 이때 이펙터는 표적 샘플에 대한 효능을 표시하나, 스크린 동안 인코딩물에 대한 손상 또는 인코딩된 이펙터의 합성 동안 인코딩물의 낮은 존재도로 인해, 후속 분석에서 "히트"가 누락된다. 본원은 강력한 이펙터의 인코딩물의 낮은 존재도로 인한 거짓 음성 결과를 최소화하기 위해 스크린이 수행된 후 존재하는 인코딩물의 양을 정규화하는 방법을 제공한다.
본원은 본원에서 제공된 방법을 수행하는 장치도 제공한다. 일부 경우, 본원에서 제공된 방법은 미세유체 장치 또는 미세유체 채널에서 수행된다.
추가로, 본원은 인코딩된 라이브러리를 사용하여 고처리량 스크린을 수행하는 데 유용한 장치를 제공한다. 이 장치는 단일 인코딩된 이펙터를 가진 공간의 고정된 위치에서 표적 샘플, 일부 경우 단일 세포를 고정할 수 있게 한다. 이러한 장치는 세포에 대해 단일 화합물의 스크리닝이 각각의 개별 샘플/이펙터 조합을 분리하는 제자리 캡슐화물(encapsulation)을 생성할 필요 없이 원하는 효과를 확인할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 본원은 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 개시한다: a) 적어도 하나의 세포 및 스캐폴드를 캡슐화물 내에 제공하는 단계로서, 상기 스캐폴드는 광절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터, 및 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; b) 광절단 가능한 링커를 절단하여 인코딩된 이펙터를 상기 스캐폴드로부터 방출시키는 단계; 및 c) 인코딩된 이펙터와 적어도 하나의 세포 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 액적으로부터 검출하는 단계. 일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 액적 내로 방출한다. 일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커는 전자기 복사를 사용함으로써 절단된다. 일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 인코딩된 이펙터로부터 광절단 가능한 링커가 절단될 수 있도록 광절단 가능한 링커를 활성화시키기 위한 활성화 시약을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 시스템으로서, a) 하나 이상의 세포; b) 스캐폴드로서, 인코딩된 이펙터가 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있고, 이펙터를 인코딩하는 핵산이 스캐폴드에 결합되어 있는 것인 스캐폴드; 및 c) 미세유체 장치로서, i) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 수취하고; ii) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 캡슐화물 내로 캡슐화하며; iii) 인코딩된 이펙터로부터 절단 가능한 링커를 절단하여, 캡슐화물 내에서 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출시키고; iv) 인코딩된 이펙터를 하나 이상의 세포와 일정 시간 동안 인큐베이션하고; v) 인코딩된 이펙터와 하나 이상의 세포 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물로부터 검출하고; vi) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하도록 구성된 미세유체 장치를 포함하는 시스템을 개시한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 미세유체 장치는 캡슐화물을 분류하기 위해 제1 수집 튜브 및 제2 수집 튜브를 추가로 포함하고, 여기서 캡슐화물은 1) 신호가 소정의 역치 이상인 경우 제1 수집 튜브에, 또는 2) 신호가 소정의 역치 미만인 경우 제2 수집 튜브에 배치된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 전기장 구배를 통해, 소리를 통해, 다이어프램을 통해, 미세유체 채널의 기하구조의 변형을 통해, 또는 미세유체 장치의 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 제1 또는 제2 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 하나 이상의 세포의 형태학적 변화를 검출하는 것, 또는 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 기반으로 신호를 검출한다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 장치의 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어된다.
본원은 프라이머를 증폭하여 세포 핵산 포획을 최대화하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 개시한다: a) 하나 이상의 세포, 증폭 혼합물 및 닉킹 효소(nicking enzyme)와 함께 핵산 인코딩된 스캐폴드를 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계로서, 핵산 인코딩물이 핵산 인코딩된 스캐폴드에 결합되어 있는 것인 단계; 하나 이상의 세포를 용해시켜 하나 이상의 세포 핵산을 방출시키는 단계; c) 핵산 인코딩물을 닉킹 효소로 닉킹함으로써, 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 단계; d) 닉킹 부위 및 증폭 혼합물을 통해, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계; 및 e) 방출된 세포 핵산을 인코딩된 핵산 프라이머로 라벨링하는 단계. 일부 실시양태에서, 특정 부위는 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계는 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 닉킹하여 또 다른 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계는 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 대체하여 또 다른 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 것을 동시에 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 핵산 인코딩물의 카피가 증폭 효소에 의해 동시에 생성 및 대체될 수 있도록 증폭 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 효소는 중합효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 인코딩물은 방출된 세포 핵산을 라벨링하기 위해 표적 세포 코딩물(coding) 또는 표적 세포 핵산을 규정하는 포획 부위를 포함한다.
참고에 의한 인용
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 개시내용의 특징 및 장점은 본 개시내용의 원리가 이용된 예시적인 실시양태가 기재되어 있는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참고함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 핵산 인코딩물과 함께 비드에 결합된 핵산 인코딩된 이펙터의 묘사를 제공한다.
도 2a는 비드에 결합된 핵산 인코딩된 이펙터를 사용하는 스크린의 예시적인 작업흐름을 보여준다.
도 2b는 미세유체 장치를 사용하는 스크린의 예시적인 작업흐름을 보여준다.
도 2c는 캡슐화 어세이 스크린에 대한 예시적인 작업흐름을 보여준다.
도 2d는 피코주입을 이용하는 캡슐화 어세이 스크린에 대한 예시적인 작업흐름을 보여준다.
도 3은 세포 핵산 포획을 최대화하기 위해 프라이머를 증폭하는 예시적인 방법을 예시한다.
도 4는 본원에서 제공된 방법에 따라 스크린을 수행하는 예시적인 미세유체 장치를 보여준다.
도 5는 본원에서 제공된 방법에 따라 스크린을 수행하는 예시적인 미세유체 장치를 보여준다.
도 6은 본원에서 제공된 방법에 따라 스크린을 수행하는 예시적인 미세유체 장치를 보여준다.
도 7은 본원에서 제공된 방법에 따라 스크린을 수행하는 예시적인 미세유체 장치를 보여준다.
도 8은 특별히 디자인된 IC 칩 및 이의 관련 개발 작업흐름의 개요를 보여준다.
도 9a는 본원에 기재된 방법 및 시스템이 제공된 예시적인 미세유체 장치의 묘사를 제공한다.
도 9b는 본원에서 제공된 예시적인 미세유체 장치의 특정 구획의 묘사를 제공한다.
도 9c는 본원에서 제공된 예시적인 미세유체 장치의 사진을 보여준다.
도 10은 도 9a에 제공된 미세유체 장치의 또 다른 예시적인 묘사를 제공한다.
도 11은 본원에 기재된 방법 및 시스템과 함께 사용되는 또 다른 예시적인 미세유체 장치의 묘사를 제공한다.
도 12a는 형광단에 의해 변형된 인코딩된 이펙터가 부착된 비드 라이브러리의 묘사를 제공한다.
도 12b는 UV 광에 노출될 때 비드로부터 유리되는 형광단 염료에 의해 변형된 인코딩된 이펙터의 묘사를 제공한다.
도 12c는 도 12b의 방출된 인코딩된 이펙터-형광단의 묘사를 제공한다.
도 12d는 본원에 기재된 미세유체 장치의 절단 영역의 묘사를 제공한다.
도 12e는 UV 광과 보정 유체 사이의 상관관계의 묘사를 보여준다.
도 12f는 공초점 레이저 및 PMT 방출 포착을 위한 예시적인 장치의 묘사를 제공한다.
도 13a는 100 mV UV 광의 사용 시 형광단 염료의 측정된 강도 피크를 보여준다.
도 13b는 100 mV UV 광의 사용 시 형광단 염료의 강도 피크에 상응하는 액적 맵을 보여준다.
도 14a는 600 mV UV 광의 사용 시 형광단 염료의 측정된 강도 피크를 보여준다.
도 14b는 600 mV UV 광의 사용 시 형광단 염료의 강도 피크에 상응하는 액적 맵을 보여준다.
도 15a는 UV 출력과 형광단 염료의 PMT 카운트 사이의 알려진 상관관계를 제공한다.
도 15b는 UV 출력 노출과 비교된, 인코딩된 이펙터-형광단의 분포된 강도 값의 히스토그램을 제공한다.
도 16은 본원에 기재된 미세유체 장치에서 UV 밀폐부(confinement)의 예시적인 데이터를 제공한다.
도 17a 및 17b는 광절단을 위해 활성화되는 예시적인 분자를 보여준다.
도 18은 도 9a에 나타낸 미세유체 장치에서의 균일한 인큐베이션에 대한 예시적인 데이터를 보여준다. 도 19는 도 11에 나타낸 미세유체 장치에서의 균일한 인큐베이션에 대한 예시적인 데이터를 보여준다.
도 20은 어세이 유동 경로를 따라 다양한 검출기 점을 가진 도 9a의 미세유체 장치를 보여준다.
도 21은 본원에 기재된 미세유체 장치에서 어세이 유동 경로를 따라 특정 위치의 예시적인 검출을 보여준다.
도 22a 및 22b는 본원에 기재된 미세유체 장치와 함께 사용되는 예시적인 형광 검출 장치, 및 관련 구성요소의 설명을 보여준다.
도 23a는 인큐베이션 시간 0초에서 형광단 염료에 대한 미처리(raw) 강도 수준의 검출을 제공한다.
도 23b는 도 23a의 강도 수준의 실시간 평활화의 검출을 제공한다.
도 24a는 1333초의 인큐베이션 시간에서 형광단 염료에 대한 미처리 강도 수준의 검출을 제공한다.
도 24b는 도 24a의 강도 수준의 실시간 평활화의 검출을 제공한다.
도 25는 어세이의 인큐베이션 시간에 걸쳐 형광단 염료에 대한 측정된 강도 피크의 증가를 보여준다.
도 26a는 TR1-TAMRA 형광단이 부착된 예시적인 비드를 보여준다.
도 26b는 비드로부터 방출된 후 TR1-TAMRA에 대해 검출된 예시적인 강도 피크를 보여준다.
도 27a는 TR3 억제제가 부착된 예시적인 비드를 보여준다.
도 27b는 비드로부터 방출된 후 TR3 억제제에 의한 활성에 상응하는 억제된 예시적인 강도를 보여준다.
도 27c는 TR3 억제제의 증가하는 농도를 기반으로 카텝신 D 활성의 예시적인 변화를 보여준다.
도 28a는 억제 역치 미만의 강도를 나타내는 비드에 대한 분류 개략도의 예시적인 묘사를 제공한다.
도 28b는 양성 분류에 대한 역치를 초과하는 TR1-TAMRA에 대해 검출된 예시적인 강도 피크를 보여준다.
도 28c는 양성 분류에 대한 역치 미만인 TR3 억제제에 대해 억제된 예시적인 강도 피크를 보여준다.
도 28d는 캡슐화의 분류에 사용되는 예시적인 장치를 보여준다.
스크리닝 방법 및 시스템
본원은 처리량이 높고 재료가 적은 방식으로 샘플에 대해 다양한 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템 및 방법은 인코딩된 이펙터를 사용하여 샘플로부터 다양한 반응을 프로빙한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터는 상응하는 인코딩물의 성질을 측정함으로써 측정될 수 있는 구조를 가진 분자이다. 일반적으로, 샘플은 캡슐화물 내에서 이펙터와 함께 인큐베이션된다. 그 후, 이펙터와의 상호작용에 대한 반응으로, 일부 유형의 신호가 검출될 수 있다. 이 신호를 기반으로, 특정 반응을 유도하는 데 있어서 샘플에 대한 효능을 가진 이펙터를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 액적과 같은 작은 캡슐화물을 사용한다. 일부 경우, 각각의 개별 캡슐화물은 작은 부피로 이펙터 및 샘플의 어세이를 수행한다. 이러한 이펙터의 큰 라이브러리는 동일한 실험에서 동시에 샘플에 대해 스크리닝될 수 있으므로, 스크린을 수행하는 고처리량 방법을 제공할 수 있다. 그 다음, 샘플로부터 원하는 신호를 생성하는 이펙터를 분류할 수 있고, 이펙터의 인코딩물을 측정하여, 어세이에서 어느 이펙터가 효과적이었는지를 알아낼 수 있다.
코딩된 이펙터
본원에서 제공된 시스템 및 방법은 인코딩된 이펙터를 사용한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터는 인코딩물의 성질의 확인이 연구자로 하여금 이펙터의 구조를 용이하게 확인할 수 있게 하도록 인코딩물과 연결된 이펙터이다. 이펙터는 샘플에 대한 효과가 조사되고 있는 임의의 유형의 분자 또는 물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 화합물, 단백질, 펩타이드, 효소, 핵산, 또는 임의의 다른 물질이다. 일부 경우, 인코딩물은 사용자가 인코딩물의 성질을 확인함으로써 이펙터의 구조를 확인할 수 있게 한다. 따라서, 각각의 인코딩물 모이어티는 측정될 때 인코딩되는 이펙터의 구조를 확인하는 데 사용될 수 있는 측정 가능한 성질을 가진다. 핵산 및 펩타이드를 제한 없이 포함하는 많은 상이한 인코딩물 형태가 사용될 수 있다. 인코딩물 형태가 핵산인 경우, 핵산의 서열은 그의 상응하는 이펙터의 구조에 대한 정보를 제공할 수 있다. 일부 경우, 인코딩된 이펙터는 어떤 종류의 분자가 인코딩에 사용되는지에 의해 기재된다. 예를 들면, "핵산 인코딩된 이펙터"는 핵산에 의해 인코딩된 이펙터를 포함한다.
일부 경우, 이펙터와 그의 상응하는 인코딩물은 스캐폴드에 결합된다. 이것은 이펙터/인코딩물 쌍이 공간에서 연결된 상태로 유지될 수 있게 한다. 일부 경우, 인코딩된 이펙터가 용액 또는 다른 환경에 배치될 때, 페어링 사이의 연결은 상실되지 않는다. 이펙터와 인코딩물 둘 다에 결합할 수 있는 임의의 물질이 상기 쌍을 공간에서 연결된 상태로 유지한다는 원하는 목표를 달성할 수 있기 때문에, 많은 물질들을 스캐폴드로서 사용할 수 있다.
스캐폴드에 연결된 인코딩된 이펙터를 제조하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 병렬 합성 방식으로 이펙터와 이의 인코딩물을 생성하기 위해 오르토고날 호환 가능한 방법을 이용한다. 이것은 종종 "분할 및 풀 합성"으로서 지칭된다. 단지 예시하기 위해, 이펙터 및 인코딩물을 함유하는 스캐폴드의 제조를 위한 예시적인 비제한적 작업흐름이 다음과 같이 기재된다: 제1 이펙터 서브유닛을 스캐폴드의 부착점에서 부착시킨다. 그 후, 스캐폴드를 세척하여 스캐폴드로부터 미반응된 과량의 시약을 제거한다. 이어서, 제1 인코딩물 서브유닛을 스캐폴드의 또 다른 부착점에서 부착시키고 세척 단계를 수행한다. 그 후, 제2 이펙터 서브유닛을 제1 이펙터 서브유닛에 부착시킨 후, 또 다른 세척 단계를 수행한다. 그 다음, 제2 인코딩물 서브유닛을 제1 인코딩물 서브유닛에 부착시킨 후, 세척 단계를 수행한다. 원하는 이펙터 및 상응하는 인코딩물을 제조하기 위해 이 과정을 원하는 만큼 많은 횟수로 반복한다. 작은 부피로 대량 병렬 규모로 이 과정을 반복하여, 낮은 비용 및 적은 양의 시약으로 화합물의 거대한 라이브러리를 제조할 수 있다. 일부 경우, 미리 합성된 화합물을, 인코딩물을 함유하는 스캐폴드에 로딩한다. 인코딩물을 미리 합성하고 스캐폴드에 로딩할 수 있거나, 전술된 분할 및 풀 합성과 유사한 방법을 이용하여 스캐폴드 상에서 직접 합성한다. 일부 경우, 각각의 스캐폴드는 고유 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물의 많은 카피를 포함한다.
비드와 연결된 핵산 인코딩된 이펙터의 예는 도 1에 도시되어 있다. 비드에 연결된 인코딩된 이펙터(100)는 비드(101)를 포함한다. 이 예에서 스캐폴드에 공유부착된 핵산 인코딩물(102)은 한 위치에서 부착된다. 핵산 인코딩물은 인코딩물 서브유닛 A, B 및 C를 포함한다. 인코딩물 서브유닛은 이펙터(103)를 구성하는 이펙터 서브유닛 A, B 및 C에 상응한다. 이펙터(103)는 링커(104)를 통해 비드(101)에 연결된다. 링커(104)는 전자기 복사에 의해 절단될 수 있는(광절단 가능한) 링커 또는 절단 시약에 의해 선택적으로 절단될 수 있는(화학적으로 절단될 수 있는) 링커와 같은 절단 가능한 링커일 수 있다. 절단 가능한 링커는 이펙터가 샘플과 상호작용할 수 있도록 비드 또는 다른 스캐폴드로부터 이펙터를 유리시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 이펙터 및/또는 이의 인코딩물에서 불순물을 추가로 포함한다. 일부 경우, 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물의 불순물은 스크린 동안, 비드, 이펙터 또는 인코딩물 조합의 제조 동안 또는 저장 동안 손상으로 인해 발생한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물의 불순물은 인코딩된 이펙터를 합성하는 데 이용되는 방법의 결함으로 인해 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 스캐폴드는 단일 인코더(encoder), 인코딩물 및 이의 불순물, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 이펙터의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%는 동일한 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 인코딩물의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%는 동일한 구조를 포함한다.
스크리닝 시스템 구성요소 및 방법
본원은 캡슐화물을 이용하여 샘플에 대해 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 샘플에 대해 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템은 고처리량 방식으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 작은 부피, 최소량의 시약, 및 소량의 스크리닝되는 이펙터를 사용하여 인코딩된 이펙터의 큰 라이브러리를 스크리닝할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 샘플에 대한 라이브러리에서 이펙터의 균일한 투여를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 고처리량 방식으로 세포 특징을 측정할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 인코딩된 이펙터에 대해 스크리닝된 세포로부터 게놈, 대사체학 및/또는 단백질체학 데이터를 측정한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 특정 샘플에 대해 다수의 이펙터를 사용하였을 때의 상승작용적 효과가 확인될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 돌연변이체 단백질의 라이브러리가 원하는 활성 또는 활성의 개선에 대해 스크리닝될 수 있게 한다.
스캐폴드에 결합된 단일 인코딩된 이펙터를 사용하는 스크린의 비제한적 예시적인 작업흐름은 도 2a에 제시되어 있다. 스캐폴드에 결합된 핵산 인코딩된 이펙터는 관심 있는 표적(이 경우 세포)와 함께 캡슐화된다. 그 후, 단계 1에서, 이펙터(이 경우 약물)는 캡슐화물 내의 비드로부터 절단된다. 단계 2에서, 이펙터는 세포와 상호작용할 수 있다. 약물이 세포에 대한 원하는 효과를 가진 경우, 리포터 신호는 약물이 양성 히트임을 표시한다. 리포터 신호가 검출되지 않는 경우, 그 약물에 대한 결과는 음성이다. 단계 3에서, 신호의 검출을 기반으로 양성 결과와 음성 결과를 분류한다. 그 다음, 스크린의 말기인 단계 4에서, 함께 풀링된 양성 히트를 서열분석하여(핵산 인코딩물의 경우), 어느 이펙터가 원하는 효과를 갖는지를 확인한다. 그 후, 단계 5에서, 이 정보를 사용하여 추가 라이브러리의 합성을 안내할 수 있거나 더 개발할 리드 분자를 확인할 수 있다.
도 2b는 미세유체 장치 상에서의 이펙터 스크린의 추가 예시적인 비제한적 작업흐름을 보여준다. 제시된 예시적인 작업흐름에서, 비드에 결합된 핵산 인코딩된 이펙터를 입구에 배치하고, 일부 실시양태에서 시험될 샘플을 함유하는 추가 수성 스트림과 병합한다. 병합된 유체는 "압출 영역" 또는 "액적 형성 영역"을 통과하고, 이때 비드 및 샘플은 수성 유체와 혼화될 수 없는 담체 유체 내에 캡슐화된다. 그 다음, 이펙터를 이펙터 절단 영역에서 비드로부터 절단하는데, 일부 실시양태에서 이 절단은 광원을 이용하여 광절단 가능한 링커를 절단한다. 이어서, 절단된 이펙터를 함유하는 캡슐화물은 일부 실시양태에서 장치 상에서 유속 또는 체류 시간을 제어하기 위해 넓혀진 또는 확장된 챔버를 함유하는 인큐베이션 영역을 통해 장치의 유동 경로를 따라 계속 유동할 수 있다. 캡슐화물이 인큐베이션 영역을 통해 이동할 때, 방출된 이펙터가 원하는 활성을 가진 경우 검출 가능한 신호가 생성된다. 그 후, 이 신호를 장치의 검출 영역에서 검출한다. 일부 실시양태에서, 임의의 검출 가능한 신호가 사용될 수 있지만, 이 검출 가능한 신호는 형광 신호이다. 이어서, 일부 실시양태에서 분류 장치(예를 들면, 유전영동 전극 또는 임의의 다른 분류 기작)에 커플링된 광원(예를 들면, 레이저 또는 LED)과 검출기(예를 들면, 광전자증배관(PMT), 하전된 커플링된 장치(CCD) 또는 포토다이오드)를 갖춘 검출 영역에서 이 신호를 측정하거나 검출한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 센서 또는 센서 어레이에 커플링된 조사(interrogation) 영역을 포함한다. 신호를 기반으로, 캡슐화물을 폐기물 출구 또는 히트 출구 내로 분류한다. 스크린 완료 후, 히트의 인코딩물을 (예를 들면, PCR 또는 유화액 PCR로) 증폭하고, 인코딩물을 (예를 들면, 차세대 서열분석으로) 서열분석한다. 그 다음, 서열분석된 인코딩물을 해독하여, 원하는 활성을 가진 이펙터를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 비드는 비드 그 자체에 고유한 바코드를 추가로 포함한다(이펙터와 무관함). 따라서, 일부 실시양태에서, 동일한 이펙터를 보유하는 다수의 비드가 다수의 캡슐화물 내에서 히트로서 선택되었는지를 확인할 수 있다.
예시적인 비제한적 액적 어세이 스크린 작업흐름은 도 2c에 제시되어 있다. 프로브 기질 및 비드에 결합된 핵산 인코딩된 이펙터를 포함하는 비드 완충제는 질환 표적(예를 들면, 효소와 같은 단백질)을 포함하는 어세이 완충제와 병합된다. 이어서, 프로브 기질, 핵산 인코딩된 이펙터를 보유하는 비드 및 질환 표적을 포함하는 캡슐화물을 비혼화성 담체 유체에서 형성한다. 그 다음, 비드로부터 이펙터를 방출하여 질환 표적과 상호작용할 수 있게 한다. 그 후, 샘플을 지연 라인(또는 원하는 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하도록 구성된 임의의 적합한 채널 또는 저장소) 내에서 인큐베이션한다. 이 실시양태에서, 프로브 기질은 질환 표적에 의해 절단된다. 절단 시, 예를 들면, 프로브 기질의 FRET 상호작용으로 인해 기질의 형광성의 변화가 관찰된다. 질환 표적이 이펙터에 의해 억제되는 경우, 프로브 기질은 절단되지 않을 것이다. 원하는 인큐베이션 시간 후, (예를 들면, 레이저 또는 LED에 의한) 여기 후 (예를 들면, PMT, CCD 또는 포토다이오드로) 캡슐화의 형광을 측정하고 결과를 기반으로 (예를 들면, 전기영동 또는 유전영동으로) 캡슐화물을 분류한다. 도 2d는 유사한 작업흐름을 보여주나, 질환 표적과 반응하였거나 반응하지 않은 기질이 검출될 수 있도록 (예를 들면, 피코주입 또는 액적 병합으로) 기질 검출 시약을 첨가하는 추가 단계를 함유한다. 일부 실시양태에서, 피코주입된 유체가 캡슐화물 내로 용이하게 혼입되도록 캡슐화의 계면을 불안정화시키기 위해 피코주입 부위에서 전극을 사용한다.
본원은 캡슐화물을 이용하여 샘플에 대해 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공하고, 이때 샘플 및 인코딩된 이펙터는 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 및 샘플은 인코딩된 이펙터를 포함하는 제1 용액을, 샘플을 포함하는 제2 용액과 혼합함으로써 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 제1 용액과 제2 용액은 오일과 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, 제1 용액 및 제2 용액과 오일의 혼합은 유화액을 형성하고, 이때 제1 용액과 제2 용액은 조합되어 액적을 형성한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 장치에서 형성된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화 단계는 미세유체 채널의 T-연접부에서 제1 용액과 제2 용액을 병합하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화의 생성은 미세유체 장치에서 수성 스트림을 수렴하는 단계를 포함한다. 캡슐화의 생성은 다수의 방법들에 의해 일어날 수 있으며, 이 방법들 중 임의의 방법이 본원에 기재된 방법과 호환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 장치 상에서 형성된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 장치를 통해 유동한다.
일부 실시양태에서, 본원은 인코딩된 이펙터의 라이브러리를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법 또는 시스템의 경우, 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 적어도 약 1개, 1,000개, 10,000개, 100,000개, 250,000개, 1,000,000개 또는 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, (본원에 기재된 바와 같은) 복수의 스캐폴드는 미세유체 채널에서 샘플과 함께 (본원에 기재된 바와 같은) 복수의 캡슐화로 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드(예를 들면, 비드)는 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리에 결합된다. 일부 실시양태에서, 각각의 스캐폴드는 하나 이상의 고유 인코딩된 이펙터에 결합된다. 일부 실시양태에서, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 적어도 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 증분을 포함하는, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터, 또는 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터 내지 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터 또는 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 적어도 약 1개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 또는 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 최대 약 1,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 100,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 250,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 1,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터, 약 10,000,000개의 고유 인코딩된 이펙터 또는 약 200개의 고유 인코딩된 이펙터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 고유 인코딩된 이펙터는 상응하는 인코딩물로 인코딩된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 인코딩물은 핵산 인코딩물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 인코딩된 이펙터는 절단 가능한 링커를 통해 각각의 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커, 또는 화학적으로 절단 가능한 링커(예를 들면, 시약과의 접촉을 통해 절단되는 링커)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터와 상응하는 비드 사이의 하나 이상의 광절단 가능한 링커가 절단된다. 일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커의 절단은 비드로부터 상응하는 인코딩된 이펙터를 방출한다. 일부 실시양태에서, 방출된 인코딩된 이펙터는 각각의 캡슐화물 내에서 상응하는 샘플과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터와 샘플 사이의 상호작용은 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 신호는 검출되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 각각의 캡슐화물로부터 검출된 상응하는 신호를 기반으로 복수의 캡슐화물을 분류한다. 일부 실시양태에서, 각각의 캡슐화물로부터 검출되지 않는 상응하는 신호를 기반으로 복수의 캡슐화물을 분류한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 대안으로서, 검출된 신호(들)를 가진 캡슐화와 관련된 인코딩물(들)을 바코딩한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 대안으로서, 검출된 신호(들)를 갖지 않은 캡슐화와 관련된 인코딩물(들)을 바코딩한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 장치 상에서 형성된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 장치를 통해 유동한다.
본원은 캡슐화물을 이용하여 샘플에 대해 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공하고, 이때 신호는 캡슐화물로부터 검출된다. 일부 실시양태에서, 신호는 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 신호는 검출기에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 미세유체 채널을 통해 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 검출기를 갖춘 미세유체 채널을 통해 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출기는 신호를 검출하도록 구성된다.
본원에서 제공된 방법 및 시스템의 신호는 캡슐화물에서 검출될 수 있는 임의의 신호일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사, 열 복사, 샘플의 시각적 변화, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 형광 또는 발광이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 가시광선 스펙트럼에 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사의 흡광도이다.
본원은 캡슐화물을 사용하여 샘플에 대해 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공하고, 여기서 캡슐화물은 분류된다. 일부 실시양태에서, 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류한다. 일부 실시양태에서, 임의적으로 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류한다.
대안적 신호 검출
본원은 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법 및 시스템을 제공하고, 이때 다양한 대안적 신호 검출 방법들 및 시스템들을 이용하여 이펙터에 의한 또는 캡슐화물 내의 활성을 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 열 복사이다. 일부 실시양태에서, 열 복사는 적외선 카메라를 이용함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 열 복사는 샘플에 의해 방출된 열 복사의 변화이다. 일부 실시양태에서, 열 복사의 변화는 샘플의 대사 활성에 기인한다. 일부 실시양태에서, 열 복사의 변화는 샘플의 대사 활성의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 열 복사의 변화는 샘플에 대한 이펙터의 효과로 인한 샘플의 대사 활성 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플에 대한 효과는 대사 활성의 변화이다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 열 복사의 변화를 검출함으로써 샘플의 대사 활성의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포이고 신호는 열 복사이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 이펙터와 함께 캡슐화되지 않은 샘플에 비해 열 복사의 방출 변화를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 열 복사의 변화는 열 복사의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 방출이다. 일부 실시양태에서, 열 복사의 변화는 이펙터로 처리되지 않은 샘플에 비해 열 복사의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 방출이다. 일부 실시양태에서, 열 복사의 변화는 이펙터로 처리되지 않은 샘플에 비해 열 복사의 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 방출이다.
일부 실시양태에서, 신호는 발광이다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 일정 시간 동안 캡슐화물을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 일정 시간 동안 샘플로부터의 발광을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발광은 일정 시간에 걸쳐 통합된다. 일부 실시 형태에서, 발광은 적어도 1분, 적어도 5분, 적어도 30분, 적어도 4시간, 또는 적어도 12시간의 시간에 걸쳐 통합된다. 일부 실시양태에서, 발광은 최대 1분, 최대 5분, 최대 30분, 최대 4시간, 또는 최대 12시간의 시간에 걸쳐 통합된다. 일부 실시양태에서, 발광은 캡슐화물에 의해 이동된 거리에 걸쳐 통합된다. 일부 실시양태에서, 발광은 미세유체 채널을 통해 캡슐화물에 의해 이동된 거리에 걸쳐 통합된다. 일부 실시양태에서, 발광은 미세유체 채널을 통해 캡슐화물에 의해 이동된 적어도 1 ㎛, 적어도 10 ㎛, 적어도 50 ㎛, 적어도 100 ㎛, 적어도 250 ㎛, 적어도 500 ㎛, 적어도 1 mm, 적어도 10 mm 또는 적어도 100 mm의 거리에 걸쳐 통합된다. 일부 실시양태에서, 발광은 미세유체 채널을 통해 캡슐화물에 의해 이동된 최대 1 ㎛, 최대 10 ㎛, 최대 50 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 250 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 1 mm, 최대 10 mm 또는 최대 100 mm의 거리에 걸쳐 통합된다.
샘플로부터의 신호는 캡슐화물을 이미지화함으로써 측정될 수 있는 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 캡슐화물에서 샘플의 이미지를 기록하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 캡슐화물에서 샘플의 일련의 이미지를 기록하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 캡슐화물에서 샘플의 일련의 이미지를 기록하는 단계 및 샘플의 일련의 이미지를 중첩하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플, 예컨대, 하나 이상의 세포의 형태학적 변화는 고속 셔터로 트랜스조명된 광을 포착하는 이미지화 센서에 의해 검출될 수 있고, 이때 복합 비디오 프레임은 모양 확인에 도움이 될 수 있는 다수의 전체 세포 이미지를 제공한다. 일부 실시양태에서, 샘플, 예컨대, 하나 이상의 세포의 형태학적 변화는, 고주파주 펄스 광원으로부터 트랜스조명된 광을 포착하고 시간 해상도를 증가시키고 세포의 둘레를 날카롭게 하는 이미지화 센서에 의해 검출될 수 있다. 한 표시에서, 형태학적 변화는 레이저-광 시트 여기 영역을 가로지르는 세포로부터의 형광 방출에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방출은 픽셀의 1차원 어레이에서 어발란치 포토다이오드(Avalanche Photodiode; APD) 또는 하전된 커플링된 검출기(charged coupled detector; CCD)에 의해 포착되고 시간별로 비닝된 다음, 복합 형광 현미경관찰 이미지으로 재스티칭된다.
일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 샘플의 이미지를 기록하는 단계를 포함하고, 이때 샘플은 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포의 이미지를 기록하는 단계는 세포 형태, 유사분열 단계, 발현된 단백질의 수준, 세포 구성요소의 수준, 세포 건강 또는 이들의 조합에 대한 정보를 제공한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 검출제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출제는 인터칼레이션 염료이다. 일부 실시양태에서, 인터칼레이션 염료는 브롬화에티듐, 요오드화프로피듐, 크리스탈 바이올렛, dUTP-접합 프로브, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌), 7-AAD(7-아미노악티노마이신 D), Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, 이들의 조합, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 검출제는 세포의 상이한 영역을 강조한다. 일부 실시양태에서, 검출제는 특정 소기관을 강조한다. 일부 실시양태에서, 소기관은 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 핵, 리보좀, 세포막, 핵인, 리포좀, 지질 소포, 라이소좀 또는 액포이다. 일부 실시양태에서, 소기관은 미토콘드리아이다. 일부 실시양태에서, 소기관은 핵이다.
일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 분자 비콘을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 비콘은 샘플의 표적 핵산 서열의 일부에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 분자 비콘을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 분자 비콘에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 프로브 및 중합효소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 TaqMan 프로브 및 Taq 중합효소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 TaqMan 프로브 및 Taq 중합효소를 캡슐화물에 첨가하는 단계도 포함한다. 일부 실시양태에서, TaqMan 프로브는 표적 핵산 서열의 일부에 상보적이다. 일부 실시양태에서, TaqMan 프로브 및 Taq 중합효소는 캡슐화물에 동시에 첨가된다. 일부 실시양태에서, TaqMan 프로브 및 Taq 중합효소는 순차적으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 신호는 분자 비콘에 의해 방출된 형광이다. 일부 실시양태에서, 신호는 TaqMan 프로브에 의해 방출된 형광이다. 일부 실시양태에서, 신호는 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브에 의해 방출된 형광이다.
다양한 분자 비콘들이 본원에 기재된 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있다. 일반적으로, 분자 비콘은 관심 있는 상보적 핵산에 결합하는 핵산 결합 영역을 포함한다. 분자 비콘은 전형적으로 2차 구조를 가질 수 있고, 이때 형광단과 켄처는 핵산 결합 영역이 관심 있는 상보적 핵산에 결합되어 있지 않을 때 근접해 있다. 핵산 결합 영역과 관심 있는 상보적 핵산의 결합 시, 형광 신호가 검출될 수 있도록 형광단과 켄처가 공간에서 분리될 수 있다. 따라서, 검출된 형광의 양은 샘플에 존재하는 관심 있는 핵산의 양을 정량하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제가 사용되고, 이때 이펙터와 샘플 사이의 활성은 형광 신호의 강도를 억제하거나 제한한다.
일부 실시양태에서, 신호를 검출하기 위해 2종 이상의 신호 검출 방법을 병용한다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 샘플에서 형태학적 변화를 검출하는 것뿐만 아니라 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것도 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 캡슐화물(예를 들면, 액적) 내의 분자 비콘로부터의 형광 방출은 PMT 또는 아발란치 포토다이오드(APD)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스조명에 의한 동시적인 이미지 포착은 캡슐화(예를 들면, 액적) 내의 다른 특징, 예컨대, 인코딩된 이펙터 및 세포를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정보의 이 스트림들은 함께 분류 연접부에서 결과를 결정한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 등온 증폭 방법에 의해 증폭된다. 일부 실시양태에서, 등온 증폭 방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 가닥 대체 증폭(SDA), 헬리카제 의존적 증폭(HAD), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 롤링 서클 복제(RCA) 또는 닉킹 효소 증폭 반응(NEAR)이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 표적 핵산의 등온 증폭을 위한 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 등온 증폭을 위한 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 등온 증폭을 위한 시약은 표적 핵산 서열에 특이적이다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 세포 DNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 게놈 DNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 mRNA, 리보좀 RNA, tRNA, 비-단백질 코딩 RNA(npcRNA), 비-메신저 RNA, 기능성 RNA(fRNA), 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 전구 mRNA, 또는 1차 miRNA(pri-miRNA)이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 mRNA이다.
스캐폴드 및 비드
캡슐화물을 사용하여 샘플에 대해 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 예시적인 실시양태는 스캐폴드의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 고체 지지체로서 작용하고 인코딩된 이펙터 분자를 공간에서 그들의 인코딩물에 연결된 상태로 유지한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 하나 이상의 분자의 연결을 허용하는 복수의 부착점을 가진 구조이다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터는 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 고체 지지체이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머, 또는 다가 분자 어셈블리이다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드, 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 유리 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 금속 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 자기 비드이다.
본원에서 제공된 방법에 사용되는 비드는 임의의 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 폴리스티렌 코어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 폴리에틸렌 글리콜에 의해 유도체화된다. 일부 실시양태에서, 비드는 폴리에틸렌 글리콜에 의해 그래프팅된다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 이펙터 또는 인코딩물과 같은 다른 작용기의 부착을 위한 반응성 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 아미노 또는 카르복실레이트 기이다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 말단 단부에 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 TentaGel® 비드이다.
비드에 부착된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG는 최대 20 kDa이다. 일부 실시양태에서, PEG는 최대 5 kDa이다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 3 kDa이다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 2 내지 3 kDa이다.
일부 실시양태에서, PEG 기는 알킬 결합에 의해 비드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 기는 알킬 결합에 의해 폴리스티렌 비드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비드는 TentaGel® M 수지이다.
일부 실시양태에서, 비드는 알킬 결합을 통해 비드에 부착된 PEG를 포함하고 비드는 2개의 이작용성 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 비드의 내부 구획 내의 반응성 부위에 대해 오르토고날적으로 보호되는 비드의 외면 상에서 표면 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 절단 가능한 리간드 및 절단 불가능한 리간드 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 TentaGel® B 수지이다.
본원에 기재된 시스템 및 방법에서 사용하기 위한 비드는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 최대 10 nm, 최대 100 nm, 최대 1 ㎛, 최대 10 ㎛, 또는 최대 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 1 ㎛, 적어도 10 ㎛ 또는 적어도 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛이다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 스캐폴드에 공유결합된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 스캐폴드에 비-공유결합된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 이온 상호작용을 통해 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 소수성 상호작용을 통해 스캐폴드에 결합된다.
절단 가능한 링커 및 이펙터 방출
절단 가능한 링커를 사용하여 이펙터를 스캐폴드에 부착시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사, 효소, 화학 시약, 열, pH 조절, 소리, 또는 전기화학적 반응성에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 UV 광과 같은 전자기 복사에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커는 전자기 복사에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커는 광에의 노출을 통해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 광은 UV 광을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 시약에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단될 수 있기 위해 먼저 활성화되어야 한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 시약과의 상호작용을 통해 활성화된다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 디설파이드 결합이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 디설파이드 결합이고 절단 가능한 시약은 환원제이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디설파이드 환원제이다. 일부 실시양태에서, 디설파이드 환원제는 포스핀이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 2-머캡토에탄올, 2-머캡토에틸아민, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 디티오트레이톨, 이들의 조합, 또는 이들의 유도체이다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커 및 절단 시약은 바이오오르토고날(bioorthogonal) 시약이다. 바이오오르고날 시약은 서로 선택적으로 반응하지만 다른 생물학적 구성요소와의 유의미한 반응성을 갖지 않는 시약의 조합이다. 이러한 시약은 반응 혼합물의 다른 구성요소와의 교차 반응성을 최소화함으로써, 오프 표적 사건이 줄어들게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 치환된 트랜스-사이클로옥텐이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 치환된 트랜스-사이클로옥텐이고, 절단 시약은 테트라진이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조
Figure pct00001
를 갖고, 이때 X는 -C(=O)NR-, -C(=O)O-, -C(=O)- 또는 결합이고, R은 H 또는 알킬이다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 테트라진이다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 디메틸 테트라진(DMT)이다. 테트라진 절단 가능한 링커 및 사용 방법의 추가 예는 본원에 참고로 포함된 문헌[Tetrazine-triggered release of carboxylic-acid-containing molecules for activation of an anti-inflammatory drug, ChemBioChem 2019, 20, 1541-1546]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 에테르 결합과 동일한 탄소에 부착된 아지도 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
를 가진다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 아지도 기를 환원시키는 시약이다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 포스핀이다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 수소 및 팔라듐 촉매이다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전이 금속 촉매에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 전이 금속 촉매이다. 일부 실시양태에서, 전이 금속 촉매는 루테늄 금속 착물이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 O-알릴 알켄이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조
Figure pct00004
를 가진다. 이러한 촉매의 비제한적 예는 본원에 참고로 포함된 문헌[Bioorthogonal catalysis: a general method to evaluate metal-catalyzed reaction in real time in living systems using a cellular luciferase reporter system, Bioconjugate Chem. 2016, 27, 376-382]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 전이 금속 착물은 팔라듐 착물이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조
Figure pct00005
를 가진다. 이러한 절단 가능한 링커는 본원에 참고로 포함된 문헌[3'-O-modified nucleotides as reversible terminators for pyrosequencing, PNAS October 16, 2007, 104 (42) 16462-16467]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 절단되는 이펙터의 수는 제어된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 절단되는 이펙터의 수는 절단 가능한 링커를 절단하는 데 사용되는 자극의 양을 제어함으로써 제어된다. 이 문맥에서, "자극"은 절단 가능한 링커를 특이적으로 절단하는 데 사용되는 임의의 방법 또는 화학물질이다. 일부 실시양태에서, 자극은 절단 시약과의 화학 반응이다. 일부 실시양태에서, 자극은 전자기 복사이다. 일부 실시양태에서, 자극은 pH의 변화이다. 일부 실시양태에서, pH의 변화는 산성화이다. 일부 실시양태에서, pH의 변화는 염기성화이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 절단 시약으로 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 절단 가능한 링커를 통해 스캐폴드에 결합된 이펙터를 포함하는 캡슐화물에 절단 시약을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 절단 가능한 링커를 통해 스캐폴드에 결합된 인코딩물을 포함하는 캡슐화물에 절단 시약을 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 절단되는 이펙터의 수는 절단 시약의 농도를 제어함으로써 제어된다. 일부 실시양태에서, 절단 시약의 농도는 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터를 함유하는 캡슐화물에서 제어된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 절단하는 데 사용되는 화학 시약의 농도는 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 500 mM이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 절단하는 데 사용되는 절단 시약의 농도는 최대 100 pM, 최대 500 pM, 최대 1 nM, 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 μM, 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 mM, 최대 10 mM, 최대 100 mM 또는 최대 500 mM이다.
일부 실시양태에서, 절단 시약은 복수의 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에 첨가된 절단 시약의 농도는 복수의 캡슐화의 개별 캡슐화물 사이에 실질적으로 균일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에서 절단 가능한 링커를 절단하는 데 사용되는 절단 시약의 농도는 각각의 개별 캡슐화물에서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에서 절단 가능한 링커를 절단하는 데 사용되는 절단 시약의 농도는 복수의 캡슐화의 각각의 개별 캡슐화물 사이에 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 50배 또는 100배 이하만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, 절단 시약은 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 피코주입 부위를 포함하는 미세유체 채널을 통과한다. 일부 실시양태에서, 피코주입의 속도가, 캡슐화물이 피코주입 부위를 가로지르는 속도와 일치하도록 피코주입이 시간조정된다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 피코주입을 받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입은 부피가 통과 액적보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배 또는 적어도 1000배 더 작다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 액적 병합에 의해 캡슐화물에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 절단 시약은 스톡 용액으로부터 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 스톡 용액은 캡슐화물에서 원하는 최종 농도보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 더 농축된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 인코딩된 이펙터와 스캐폴드 사이의 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 광절단 가능한 링커를 통해 스캐폴드에 결합된 이펙터를 포함하는 캡슐화물을 전자기 복사에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 광절단 가능한 링커를 통해 스캐폴드에 결합된 이펙터를 포함하는 캡슐화물을 광(예를 들면, UV 광)에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 장치를 이용함으로써 광에 노출된다.
일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커는 광(예를 들면, UV 광)에의 노출에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 방출된 이펙터 분자의 수의 농도는 UV 광에의 노출의 강도 및/또는 지속시간을 제어함으로써 제어된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)의 광 강도는 적어도 약 0.1 J/cm2 내지 약 200 J/cm2이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)의 광 강도는 약 0.1 J/cm2 내지 약 200 J/cm2이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)의 광 강도는 증분을 포함하는, 약 0.1 J/cm2 내지 약 5 J/cm2, 약 0.1 J/cm2 내지 약 25 J/cm2, 약 0.1 J/cm2 내지 약 100 J/cm2, 약 0.1 J/cm2 내지 약 150 J/cm2, 약 0.1 J/cm2 내지 약 200 J/cm2, 약 5 J/cm2 내지 약 25 J/cm2, 약 5 J/cm2 내지 약 100 J/cm2, 약 5 J/cm2 내지 약 150 J/cm2, 약 5 J/cm2 내지 약 200 J/cm2, 약 25 J/cm2 내지 약 100 J/cm2, 약 25 J/cm2 내지 약 150 J/cm2, 약 25 J/cm2 내지 약 200 J/cm2, 약 100 J/cm2 내지 약 150 J/cm2, 약 100 J/cm2 내지 약 200 J/cm2, 또는 약 150 J/cm2 내지 약 200 J/cm2이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)의 광 강도는 약 0.1 J/cm2, 약 5 J/cm2, 약 25 J/cm2, 약 100 J/cm2, 약 150 J/cm2 또는 약 200 J/cm2이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)의 광 강도는 적어도 약 0.1 J/cm2, 약 5 J/cm2, 약 25 J/cm2, 약 100 J/cm2 또는 약 150 J/cm2이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)의 광 강도는 최대 약 5 J/cm2, 약 25 J/cm2, 약 100 J/cm2, 약 150 J/cm2 또는 약 200 J/cm2이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)은 적어도 약 5 mV이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)은 약 5 mV 내지 약 10,000 mV이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광(예를 들면, UV 광)은 약 100 mV, 200 mV, 400 mV, 600 mV, 800 mV, 1000 mv, 1250 mV, 1500 mV, 2000 mV, 4000 mV, 5000 mV이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화(예를 들면, 액적)가 노출되는 광은 보정된 양의 광이다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 방출된 이펙터 분자의 수의 농도는 전자기 복사의 강도 또는 지속시간을 제어함으로써 제어된다.
임의의 적합한 광반응성 또는 광절단 가능한 링커는 전자기 복사(예를 들면, UV 광에의 노출)에 의해 절단되는 절단 가능한 링커로서 사용될 수 있다. 전자기 복사에 의해 절단될 수 있는 링커의 비제한적 목록은 (i) o-니트로벤질옥시 링커, (ii) o-니트로벤질아미노 링커, (iii) α-치환된 o-니트로벤질 링커, (iv) o-니트로베라트릴 링커, (v) 페나실 링커, (vi) p-알콕시페나실 링커, (vii) 벤조인 링커, (viii) 피발로일 링커, 및 (ix) 다른 광불안정성 링커를 포함한다. 광절단 가능한 링커의 추가 예는 본원에 참고로 포함된 문헌[Photolabile linkers for solid-phase synthesis, ACS Comb Sci. 2018 Jul 9;20(7):377-99]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 o-니트로벤질옥시 링커, o-니트로벤질아미노 링커, α-치환된 o-니트로벤질 링커, o-니트로베라트릴 링커, 페나실 링커, p-알콕시페나실 링커, 벤조인 링커, 또는 피발로일 링커이다.
일부 실시양태에서, 광절단 가능한 링커는 전자기 복사(예를 들면, UV 광)에의 노출을 통해 절단될 수 있기 전에 시약에의 노출을 통해 먼저 활성화될 것을 요구한다. 일부 실시양태에서, 방출된 이펙터의 원하는 수는 시약을 캡슐화(예를 들면, 액적)에 선택적으로 노출시킴으로써 더 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, UV 광에의 노출을 통해 절단되기 전에 활성화될 필요가 있는 광절단 가능한 링커를 제공하는 것은 입사 UV 노출을 통해 인코딩된 이펙터 방출이 최소화되거나 제거되기 때문에 비드 취급, 합성, 저장 및 제조가 개선될 수 있게 한다. 도 17a는 UV 광절단을 위해 활성화되도록 시약과의 상호작용 시 변형되도록 구성된 예시적인 분자를 제공한다(참조: J. AM. CHEM. SOC. 2003, 125, 8118-8119; 10.1021/ja035616d). 도시된 바와 같이, 아지드 기는 링커가 더 안정하도록 광절단 가능한 링커 모이어티의 민감성을 기능적으로 감소시키므로, 주위 조명 하에서의 취급 및 저장에 유리하다. 도 17a에 도시된 바와 같이, 아지드는 시약 처리(HOF-CH3CN) 시 전환되어 감광성 니트로-벤질 모티프(중간에 도시된 분자)를 생성할 수 있고, 이때 생성물인 광절단 가능한 링커는 UV 노출 시 공지된 양의 이펙터를 방출하도록 보정될 수 있다. 도 17b는 UV 광절단을 위해 활성화되도록 시약과의 상호작용 시 변형되도록 구성된 또 다른 예시적인 분자를 제공한다(참조: J. Comb. Chem. 2000, 2, 3, 266-275). 도시된 바와 같이, 티오-페놀 에스테르는 안정한 공유 링커를 화합물(R)에 제공한다. 티오-페놀의 특이적 산화(중간 분자에 표시됨)는 "활성화된" 링커 모이어티를 생성할 수 있다. 산화 단계의 동역학적 제어는 화합물 방출을 규정하기 위한 정량적 "활성화"를 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 처리는 제거를 통해 링커 절단을 야기함으로써, 유리 산 화합물을 생성하거나, 후속 탈카르복실화로 화합물만을 생성한다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 효소에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 프로테아제, 뉴클레아제 또는 하이드롤라제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 탄수화물이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 절단된 이펙터 분자의 수는 효소의 농도를 제어함으로써 제어된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자가 스캐폴드로부터 절단되는 속도는 효소의 농도를 제어함으로써 제어된다.
일부 실시양태에서, 방법은 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 절단 시약으로 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 소정의 양의 이펙터를 방출하도록 구성된 농도로 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 원하는 양의 이펙터를 방출하도록 구성된 농도로 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 절단 가능한 링커가 절단될 수 있도록 절단 가능한 링커를 먼저 활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 활성화시킬 때, 절단 가능한 링커는 본원에 기재된 방법을 이용함으로써, 예컨대, 광절단, 효소와의 상호작용, 절단 시약의 사용 등을 통해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 활성화 시약과의 상호작용을 통해 활성화된다. 일부 실시양태에서, 방법은 스캐폴드에 결합된 이펙터를 포함하는 캡슐화물에 활성화 시약을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 스캐폴드에 결합된 인코딩물을 포함하는 캡슐화물에 활성화 시약을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 시약은 절단 시약으로서 본원에 기재된 임의의 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 시약은 디설파이드 환원 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 시약은 테트라진을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화 시약은 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 피코주입 부위를 포함하는 미세유체 채널을 통과한다. 일부 실시양태에서, 피코주입의 속도가, 캡슐화물이 피코주입 부위를 가로지르는 속도와 일치하도록 피코주입이 시간조정된다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입은 부피가 통과 액적보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배 또는 적어도 1000배 더 작다. 일부 실시양태에서, 활성화 시약은 액적 병합에 의해 캡슐화물에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 활성화시키는 데 사용되는 활성화 시약의 농도는 최대 100 피코몰(pM), 최대 500 pM, 최대 1 나노몰(nM), 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 마이크로몰(μM), 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 밀리몰(mM), 최대 10 mM, 최대 100 mM, 또는 최대 500 mM이다.
일부 실시양태에서, 활성화 시약은 스톡 용액으로부터 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 스톡 용액은 캡슐화물에서 원하는 최종 농도보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 더 농축된다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 스캐폴드로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터의 이펙터의 방출은 이펙터가 용액에서 자유롭게 이동할 수 있게 한다. 이 자유로운 이동은 이펙터가 조사되는 샘플 또는 표적과 상호작용할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 이 이펙터는 제어된 방식으로 방출된다. 이 제어된 방식은 소정의 및/또는 알려진 용량의 이펙터가 스캐폴드로부터 방출될 수 있게 한다. 이러한 절차는 용량 반응이 측정될 수 있기 때문에 스크린으로부터의 히트의 정량 및 분석을 개선할 수 있게 한다. 또한, 스크리닝되는 이펙터의 라이브러리 전체에 걸쳐 공지된 양의 이펙터의 방출은 샘플 세트로부터 편향을 제거할 수 있다. 개별 스캐폴드가 라이브러리의 스캐폴드 사이에 양이 상이한 이펙터의 부착을 가질 때, 인코딩된 스캐폴드를 사용하는 라이브러리 스크린에서 편향이 일어날 수 있다. 예를 들면, 한 스캐폴드는 이펙터 분자의 10개 카피를 함유할 수 있고, 또 다른 스캐폴드는 이펙터 분자의 1000개 카피를 함유할 수 있다. 결과적으로, 샘플 또는 표적에 대해 스크리닝되는 상이한 농도의 이펙터가 방출되어, 개별 이펙터의 효능을 확인하기 어렵게 만들 수 있다. 스크린에서 각각의 스캐폴드로부터 균일한 양의 이펙터를 방출함으로써, 스크린 전체에 걸쳐 균일한 용량을 사용하여, 더 낮은 효능 및 더 높은 농도의 이펙터로부터 편향을 제거한다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 원하는 농도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 캡슐화물 내에서 원하는 농도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 원하는 농도는 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 250 mM이다. 일부 실시양태에서, 원하는 농도는 최대 100 pM, 최대 500 pM, 최대 1 nM, 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 μM, 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 mM, 최대 10 mM, 최대 50 mM, 최대 100 mM 또는 최대 250 mM이다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 소정의 농도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 캡슐화물 내에서 소정의 농도로 방출된다. 일부 실시양태에서, 소정의 농도는 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 250 mM이다. 일부 실시양태에서, 소정의 농도는 최대 100 pM, 최대 500 pM, 최대 1 nM, 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 μM, 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 mM, 최대 10 mM, 최대 50 mM, 최대 100 mM 또는 최대 250 mM이다.
일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 복수의 캡슐화물에서 스캐폴드로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에서 스캐폴드로부터 방출된 이펙터 분자의 농도는 캡슐화물 사이에 균일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에서 스캐폴드로부터 방출된 이펙터 분자의 농도는 캡슐화물 사이에 실질적으로 균일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에서 스캐폴드로부터 방출된 이펙터 분자의 농도는 각각의 개별 캡슐화물에서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물에서 스캐폴드로부터 방출된 이펙터 분자의 농도는 복수의 캡슐화의 각각의 개별 캡슐화물 사이에 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 50배 또는 100배 이하만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터와 샘플이 상호작용하도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 이펙터와 샘플이 반응하도록 일정 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 적어도 1밀리초, 1초, 1분, 적어도 10분, 적어도 1시간, 적어도 4시간, 또는 적어도 24시간이다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 최대 1분, 최대 10분, 최대 1시간, 최대 몇 시간, 또는 최대 24시간이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 스캐폴드로부터 이펙터를 방출한 후 측정된다.
일부 실시양태에서, 상기 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 체류 시간은 유동 밸브, 미세유체 채널의 기하구조, 미세유체 채널의 길이, 미세유체 채널로부터의 캡슐화의 제거, 또는 이들의 조합에 의해 제어된다.
본원에서 제공된 방법 및 시스템의 이펙터는 임의의 유형의 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 생화학적, 화학적 또는 생물학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 세포, 단백질, 펩타이드, 소분자, 소분자 단편 또는 핵산이다. 이펙터는 표적과 상호작용할 수 있는 임의의 분자이다. 용어 "이펙터"는 샘플에 대한 효과가 조사되는 임의의 모이어티를 포괄하기 위해 광범위하게 사용된다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 스캐폴드에 부착될 수 있게 하는 핸들을 가진다. 핸들은 이펙터를 스캐폴드 상의 부착 부위에 묶는 데 사용될 수 있는 반응성 작용기이다. 이 핸들은 결합을 형성할 수 있는 임의의 작용기일 수 있다. 핸들은 제한 없이 설프하이드릴 기, CLICK 화학 시약, 아미노 기, 카르복실레이트 기 또는 다수의 다른 기들을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 개별 서브유닛으로 구성된다. 다양한 화학 반응을 이용함으로써 이 개별 서브유닛을 연결하여 완전한 이펙터를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체상 펩타이드 합성에 사용되는 방법과 유사하게 반복적 화학 공정을 이용하여 이펙터를 생성한다. 유사한 방법을 이용하여 비-펩타이드 이펙터를 생성할 수 있고, 이때 제1 반응은 2개의 서브유닛을 연결하기 위해 수행되고, 그 후 2개의 연결된 서브유닛에 대해 제2 반응을 수행하여 연결된 서브유닛을 활성화시킨 다음, 제3 서브유닛을 부착시킨다. 임의의 유형의 이러한 반복적 화학 합성 방식을 이용하여 본원에서 제공된 방법 및 시스템에 사용되는 이펙터를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 조사되는 표적으로부터 반응을 이끌어낸다. 이끌어내진 반응은 임의의 형태를 취할 수 있고 조사되는 샘플에 의해 좌우된다. 비제한적 예로서, 샘플이 세포를 포함할 때, 반응은 발현 패턴의 변화, 아폽토시스, 특정 분자의 발현, 또는 세포의 형태학적 변화일 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 샘플이 단백질을 포함할 때, 이펙터는 단백질 활성을 억제할 수 있거나, 단백질 활성을 향상시킬 수 있거나, 단백질 폴딩을 변경시킬 수 있거나, 단백질 활성을 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 천연 생성 또는 돌연변이체 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 천연 생성 단백질의 단편이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 신호전달 단백질, 효소, 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편, 구조 단백질, 저장 단백질 또는 수송 단백질, 또는 이들의 임의의 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 비천연 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 중합체이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 길이가 5개 아미노산 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 길이가 5개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 15개 아미노산, 5개 아미노산 내지 20개 아미노산, 5개 아미노산 내지 30개 아미노산, 5개 아미노산 내지 50개 아미노산, 10개 아미노산 내지 15개 아미노산, 10개 아미노산 내지 20개 아미노산, 10개 아미노산 내지 30개 아미노산, 10개 아미노산 내지 50개 아미노산, 15개 아미노산 내지 20개 아미노산, 15개 아미노산 내지 30개 아미노산, 15개 아미노산 내지 50개 아미노산, 20개 아미노산 내지 30개 아미노산, 20개 아미노산 내지 50개 아미노산, 또는 30개 아미노산 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 길이가 5개 아미노산, 10개 아미노산, 15개 아미노산, 20개 아미노산, 30개 아미노산 또는 50개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산, 10개의 아미노산, 15개의 아미노산, 20개의 아미노산, 또는 30개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 최대 10개의 아미노산, 15개의 아미노산, 20개의 아미노산, 30개의 아미노산, 또는 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 비-펩타이드 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 고리형 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 단백질을 모방하는 2차 구조를 가진다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 유기 분자이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 무기 분자이다. 일부 실시양태에서, 이펙터로서 사용되는 화합물은 유기 원자 및 무기 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 약물 유사 소분자이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 하나 이상의 금속 원자와 같은 하나 이상의 무기 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 거대분자이다.
일부 실시양태에서, 화합물은 복수의 화학적 단량체를 서로 연결함으로써 합성되는 완성된 화학물질이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 합성 후 비드 상에 로딩된 미리 합성된 화합물이다.
일부 실시양태에서, 화합물은 소분자 단편이다. 소분자 단편은 크기가 작고 분자량이 낮은 작은 유기 분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자 단편은 분자량(MW)이 500 달톤(Da) 미만, 400 Da 미만, 300 Da 미만, 200 Da 미만 또는 100 Da 미만이다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 이펙터 핵산이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 길이가 5개 뉴클레오타이드 내지 50개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 길이가 5개 뉴클레오타이드 내지 10개 뉴클레오타이드, 5개 뉴클레오타이드 내지 15개 뉴클레오타이드, 5개 뉴클레오타이드 내지 20개 뉴클레오타이드, 5개 뉴클레오타이드 내지 30개 뉴클레오타이드, 5개 뉴클레오타이드 내지 50개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드 내지 15개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드 내지 20개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드 내지 30개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드 내지 50개 뉴클레오타이드, 15개 뉴클레오타이드 내지 20개 뉴클레오타이드, 15개 뉴클레오타이드 내지 30개 뉴클레오타이드, 15개 뉴클레오타이드 내지 50개 뉴클레오타이드, 20개 뉴클레오타이드 내지 30개 뉴클레오타이드, 또는 20개 뉴클레오타이드 내지 50개 뉴클레오타이드, 또는 30개 뉴클레오타이드 내지 50개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 또는 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 길이가 최대 10개 뉴클레오타이드, 15개 뉴클레오타이드, 20개 뉴클레오타이드, 30개 뉴클레오타이드, 또는 50개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 비천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 앱타머이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 핵산은 DNA, RNA, 또는 이들의 조합을 포함한다.
효소 진화 스크린
본원의 방법 및 시스템은 다양한 활성의 보유에 대해 이펙터 단백질을 스크리닝하는 데에도 유용하다. 이 실시양태에서, 이펙터는 단백질이다. 단백질의 다양한 돌연변이체 변이체는 단백질의 발현을 코딩하는 플라스미드 또는 다른 핵산을 스캐폴드에 연결함으로써 스크리닝될 수 있다. 이 측면에서 언급된 "코딩"은 유전 코드를 지칭하고, "인코딩"은 단백질의 구조를 설명하는 대안적 전략을 의미한다. 일부 경우, 각각의 핵산은 단백질을 코딩하는 전체 플라스미드 또는 다른 핵산에 대한 전체 서열 판독을 수행하지 않으면서 그 안의 돌연변이를 보여주도록 서열분석될 수 있는 특정 돌연변이체 단백질에 고유한 바코드를 가진다. 따라서, 바코드는 전체 코딩 서열에 의존하지 않으면서 단백질의 구조와 서열을 기술하기 위해 그 자신의 인코딩물로서 작용한다. 이 측면에서, 캡슐화 기반 어세이에서 본원에서 제공된 구성요소로 샘플에 대해 돌연변이체 단백질의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
비제한적 예에서, 관심 있는 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 스캐폴드는 캡슐화된다. 그 후, 단백질은 임의의 시험관내 전사/번역 시스템과 같은 발현 시스템을 사용함으로써 캡슐화물에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출 시약은 단백질이 특정 원하는 활성을 나타낼 수 있는 캡슐화물에 첨가될 수 있다. 일부 경우, 이 검출 시약은 단백질의 발현 동안 존재할 수 있거나 나중에 첨가될 수 있다. 이 검출 시약은 단백질 결합, 효소 활성을 비롯한 임의의 원하는 활성을 평가하는 데 사용될 수 있거나, 검출 시약은 단백질 구조를 프로빙할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 검출 시약은 발현된 단백질(예를 들면, 관심 있는 효소)이 함께 결합할 수 있는 하나 이상의 화합물 또는 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현된 단백질(예를 들면, 효소)이 각각의 검출 시약의 분자 프로브에 함께 결합할 수 있도록 분자 프로브를 각각 포함하는 적어도 2개의 검출 시약이 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현된 단백질(예를 들면, 효소)이 각각의 검출 시약의 하나 이상의 화합물에 함께 결합할 수 있도록 하나 이상의 화합물을 각각 포함하는 적어도 2개의 검출 시약이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단백질에 의한 분자 프로브 또는 화합물의 결합은 신호의 생성을 유발한다. 일부 실시양태에서, 단백질에 의한 분자 프로브 또는 화합물의 결합은 신호의 생성을 유발하는 특정 원하는 활성이다.
캡슐화물 내의 단백질이 특정 원하는 활성을 가진 경우, 상기 활성은 신호의 생성으로 이어질 수 있다. 신호는 본원에 기재된 신호들 중 임의의 신호일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 2개의 관심 있는 분자의 라이게이션으로 인해 생성된 형광 신호이다. 일부 실시양태에서, 관심 있는 분자는 그에 부착된 FRET 쌍, 또는 그에 부착된 형광단/켄처 쌍, 또는 서로 인접하게 되는 2개의 모이어티로 인한 신호의 변화를 유발하는 임의의 다른 유형의 모이어티를 가진다. 일부 실시양태에서, 2개의 모이어티는 관심 있는 분자 사이의 결합 형성으로 인해 서로 인접하게 된다. 그 후, 생성된 신호는 검출될 수 있고, 이것은 스크리닝되는 단백질이 원하는 활성을 가짐을 시사한다. 그 다음, 신호 존재, 부재 또는 수준과 같은 검출 가능한 신호를 기반으로 캡슐화물을 분류할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터는 단백질이고 인코딩물은 단백질의 발현을 추가로 코딩하는 바코딩된 핵산을 포함한다.
본원은 샘플에 대해 핵산 인코딩된 단백질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 스캐폴드에 부착된 핵산 인코딩물을 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 인코딩물은 인코딩 바코드, 및 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 인코딩된 단백질의 생성을 위한 발현 시스템을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 단백질은 캡슐화물 내에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 캡슐화물에 도입된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 단백질 발현 동안 캡슐화물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 인코딩된 단백질이 특정 활성을 가진 경우 인코딩된 단백질과 상호작용할 때 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 이 상호작용으로 인해 생성된 신호는 측정된다. 일부 실시양태에서, 신호의 측정을 기반으로 캡슐화물을 분류한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 이 핵산 인코딩물은 차세대 서열분석에 의해 서열분석된다.
코딩된 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 발현이 일어날 수 있게 하는 임의의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 선형 핵산이다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 이중 가닥이다.
일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 바코드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바코드는 인코딩된 이펙터 단백질에 대한 인코딩물로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 바코드는 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 바코드는 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함하는 핵산 인코딩물은 서열분석 프라이머를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 바코드의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 바코드의 다운스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터는 핵산 인코딩된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상응하는 핵산 인코딩물은 인코딩된 단백질의 발현을 위한 코딩 구획을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩된 단백질은 효소 또는 이의 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 효소 또는 이의 돌연변이체는 효소 활성에 대해 스크리닝된다.
일부 실시양태에서, 효소 활성은 산화, 환원, 라이게이션, 중합, 결합 절단, 결합 형성 또는 이성질체화이다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 공유결합 형성이다. 일부 실시양태에서, 효소는 아미노산 데하이드로게나제, 천연 아민 데하이드로게나제, 오핀 데하이드로게나제, 또는 이민 환원효소이다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 거울상특이적 활성이다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 입체특이적 활성이다.
본원에서 제공된 방법 및 시스템을 이용하여 다양한 단백질 특성을 프로빙할 수 있거나 스크리닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 특정 특성은 효소 활성, 결합 능력, 촉매 활성, 물리적 성질, 억제 활성, 또는 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 특정 특성은 결합 능력을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 특정 특성은 촉매 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 특정 특성은 물리적 성질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 특정 특성은 억제 활성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 특정 특성은 2차, 3차 또는 4차 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 효소 활성은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자 프로브들 사이에 결합을 형성하는 능력이다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자 프로브들 사이에 결합을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물들 사이에 결합을 형성하는 능력이다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물들 사이에 결합을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합은 공유결합이다. 일부 실시양태에서, 결합은 비가역적 공유결합이다. 일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자들이 함께 결합될 때 형광 신호를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자 프로브들이 함께 결합되지 않은 때에 비해 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자 프로브들이 함께 결합될 때 변화된 형광 신호를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물이 함께 결합될 때 형광 신호를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물이 함께 결합되지 않은 때에 비해 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물이 함께 결합될 때 변경된 형광 신호를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 형광 신호는 형광 공명 에너지 전달(FRET), 생체발광 공명 에너지 전달(BRET), 란타나이드 킬레이트 여기 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(LANCE TR-FRET), 또는 증폭된 발광 근접 균질 어세이로 인한 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 시약 및 제2 시약은 화합물이다.
일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자 프로브는 FRET 쌍 또는 형광단/켄처 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 분자 프로브는 4-(4-디메틸아미노페닐 아조), 5-((3-아미노에틸)아미노)-1-나프탈렌 설폰산, 5-((2-아미노에틸)아미노)-1-나프탈렌 설폰산(EDANS), 4-(디메틸아미노아조)벤젠-4-카르복실산(DABCYL), 및 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC), 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택된 형광단 또는 켄처를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍 또는 형광단/켄처 쌍은 상이한 형광단을 포함한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍은 동일한 형광단의 이중 카피이다.
일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물은 FRET 쌍 또는 형광단/켄처 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물은 4-(4-디메틸아미노페닐 아조), 5-((3-아미노에틸)아미노)-1-나프탈렌 설폰산, 5-((2-아미노에틸)아미노)-1-나프탈렌 설폰산(EDANS), 4-(디메틸아미노아조)벤젠-4-카르복실산(DABCYL), 및 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC), 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택된 형광단 또는 켄처를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍 또는 형광단/켄처 쌍은 상이한 형광단을 포함한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍은 동일한 형광단의 이중 카피이다.
일부 실시양태에서, 결합을 형성하는 능력은 이민 환원이다. 일부 실시양태에서, 이민 환원은 거울상특이적이다. 일부 실시양태에서, 이민 환원은 입체특이적이다. 일부 실시양태에서, 이민 환원은 환원된 이민 결합에 인접한 치환된 탄소에서 S-거울상이성질체를 선호한다. 일부 실시양태에서, 이민 환원은 환원된 이민 결합에 인접한 치환된 탄소에서 R-거울상이성질체를 선호한다. 일부 실시양태에서, 이민 환원은 분자내 반응이다. 일부 실시양태에서, 이민 환원은 부분입체특이적이다.
일부 실시양태에서, 샘플에 대해 핵산 인코딩된 단백질의 라이브러리를 스크리닝한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 핵산 인코딩된 단백질의 라이브러리에 대해 기재된 스크린 중 임의의 스크린을 수행하는 단계를 포함하고, 이때 핵산 인코딩된 단백질의 라이브러리는 핵산 인코딩된 단백질의 복수의 상이한 돌연변이체 버전을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩된 단백질의 각각의 돌연변이체 버전은 고유 바코드에 의해 인코딩된다.
본원에서 제공된 방법 및 시스템은 종종 검출 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 액적 병합에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 신호가 검출되기 전에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 신호가 검출된 후에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 신호의 검출을 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물은 리포터 효소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 효소는 또 다른 시약과 반응하여 기능적 판독값을 생성한다. 일부 실시양태에서, 제1 분자 프로브와 제2 분자 프로브 사이의 결합은 리포터 효소를 억제하는 새로운 분자를 생성한다.
추가 시약을 사용하여 바코드를 샘플의 핵산 또는 인코딩물에 첨가할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 핵산 바코드를 캡슐화의 하나 이상의 내용물에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 핵산 바코드는 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 바코드는 샘플로부터의 핵산에 첨가된다.
이펙터에 대한 인코딩물
본원에서 제공된 이펙터는 인코딩물과 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 인코딩물과 연결된다. 일부 경우, 인코딩물은 사용자가 인코딩물의 성질을 확인함으로써 이펙터의 구조를 확인할 수 있게 한다. 따라서, 각각의 인코딩물 모이어티는 측정될 때 인코딩된 이펙터의 구조를 확인하는 데 사용될 수 있는 측정 가능한 성질을 가진다.
일부 실시양태에서, 인코딩물은 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산의 서열은 이펙터의 구조에 대한 정보를 제공한다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 핵산 바코드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바코드는 특정 이펙터에 고유하다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 서열분석 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물의 서열분석은 사용자가 상응하는 이펙터의 구조를 확인할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 인코딩물은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 이중 가닥 DNA이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 단일 가닥 DNA이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 단일 가닥 RNA이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 이중 가닥 RNA이다.
일부 실시양태에서, 인코딩 핵산은 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩 핵산은 길이가 20개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩 핵산은 길이가 20개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 또는 80개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 인코딩 핵산은 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 60개의 뉴클레오타이드, 약 80개의 뉴클레오타이드 또는 약 100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩 핵산은 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 또는 80개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩 핵산은 길이가 최대 40개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 또는 100개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시양태에서, 인코딩물은 상응하는 이펙터 서브유닛을 인코딩하는 개별 서브유닛으로 구성된다. 결과적으로, 전체 인코딩물은 어느 개별 서브유닛이 연결되거나 조합되어 이펙터를 형성하는지를 특정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 서브유닛은 최대 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 이상의 개별 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 전체 인코딩 서열은 임의의 수의 이들 개별 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 인코딩 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 인코딩 서브유닛을 포함한다. 효소 라이게이션, 주형 부재 합성, 주형 중합효소 연장, 화학적 라이게이션, 재조합 또는 고체상 핵산 합성 기법을 비롯한 많은 알려진 방법을 이용하여 이들 인코딩 서브유닛들을 함께 라이게이션시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 인코딩물은 분자량 바코드이다. 일부 실시양태에서, 분자량 바코드는 분자량이 적어도 1,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000 또는 적어도 15,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, 분자량 바코드는 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 분자량 바코드 펩타이드는 5개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 10개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 10개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 10개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 10개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 15개의 아미노산 내지 20개의 아미노산, 15개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 15개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 20개의 아미노산 내지 30개의 아미노산, 20개의 아미노산 내지 50개의 아미노산, 또는 30개의 아미노산 내지 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자량 바코드 펩타이드는 5개의 아미노산, 10개의 아미노산, 15개의 아미노산, 20개의 아미노산, 30개의 아미노산, 또는 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자량 바코드 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산, 10개의 아미노산, 15개의 아미노산, 20개의 아미노산, 또는 30개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩타이드는 최대 10개의 아미노산, 15개의 아미노산, 20개의 아미노산, 30개의 아미노산, 또는 50개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자량 바코드 펩타이드는 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인코딩물은 스캐폴드 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 인코딩물의 높은 로딩을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 인코딩물의 약 1,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 인코딩물의 약 1,000,000개 카피 내지 약 2,000,000개 카피, 약 1,000,000개 카피 내지 약 5,000,000개 카피, 약 1,000,000개 카피 내지 약 10,000,000개 카피, 약 1,000,000개 카피 내지 약 15,000,000개 카피, 약 1,000,000개 카피 내지 약 20,000,000개 카피, 약 1,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피 내지 약 5,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피 내지 약 10,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피 내지 약 15,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피 내지 약 20,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피 내지 약 10,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피 내지 약 15,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피 내지 약 20,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피, 약 10,000,000개 카피 내지 약 15,000,000개 카피, 약 10,000,000개 카피 내지 약 20,000,000개 카피, 약 10,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피, 약 15,000,000개 카피 내지 약 20,000,000개 카피, 약 15,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피, 또는 약 20,000,000개 카피 내지 약 50,000,000개 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 인코딩물의 약 1,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피, 약 10,000,000개 카피, 약 15,000,000개 카피, 약 20,000,000개 카피 또는 약 50,000,000개 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 적어도 약 1,000,000개 카피, 약 2,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피, 약 10,000,000개 카피, 약 15,000,000개 카피, 또는 약 20,000,000개 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 인코딩물의 최대 약 2,000,000개 카피, 약 5,000,000개 카피, 약 10,000,000개 카피, 약 15,000,000개 카피, 약 20,000,000개 카피 또는 약 50,000,000개 카피를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인코딩물은 바코드 서열을 포함하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 DNA 바코드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드당 적어도 1개의 DNA 바코드, 비드당 적어도 10개 카피의 DNA 바코드, 비드당 적어도 100개 카피, 적어도 1,000개 카피, 적어도 100,000개 카피, 적어도 백만 개 카피 또는 적어도 천만 개 카피의 DNA 바코드가 존재한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드당 적어도 천만 개 카피의 DNA 바코드를 포함한다.
일부 실시양태에서, DNA 바코드는 스캐폴드를 식별하는 데 사용된다. 일부 경우, 스캐폴드는 비드이다. 일부 경우, 천만 개의 DNA 바코드 중 1개의 DNA 바코드만이 비드를 식별하는 데 요구된다. 일부 경우, 천만 개의 바코드 중 5개의 DNA 바코드, 10개의 DNA 바코드, 20개의 DNA 바코드, 50개의 DNA 바코드, 100개의 DNA 바코드, 1000개의 DNA 바코드, 10,000개의 DNA 바코드, 100,000개의 DNA 바코드 또는 백만 개의 DNA 바코드만이 비드를 식별하는 데 요구된다.
샘플
임의의 유형의 샘플이 본원에서 제공된 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 하나 이상의 세포, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 효소, 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 세포 용해물, 또는 하나 이상의 조직 추출물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 세균 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 SH-SY5Y, 인간 신경모세포종; Hep G2, 인간 백인 간세포 암종; 293(HEK293으로서도 알려짐), 인간 배아 신장; RAW 264.7, 마우스 단핵구 대식세포; HeLa, 인간 자궁경부 상피 암종; MRC-5(PD 19), 인간 태아 폐; A2780, 인간 난소 암종; CACO-2, 인간 백인 결장 선암종; THP 1, 인간 단핵구 백혈병; A549, 인간 백인 폐 암종; MRC-5(PD 30), 인간 태아 폐; MCF7, 인간 백인 유방 선암종; SNL 76/7, 마우스 SIM 균주 배아 섬유모세포; C2C12, 마우스 C3H 근육 근모세포; Jurkat E6.1, 인간 백혈병 T 세포 림프모구; U937, 인간 백인 조직구 림프종; L929, 마우스 C3H/An 결합 조직; 3T3 L1, 마우스 배아; HL60, 인간 백인 전골수구성 백혈병; PC-12, 래트 부신 크롬친화세포종; HT29, 인간 백인 결장 선암종; OE33, 인간 백인 식도 암종; OE19, 인간 백인 식도 암종; NIH 3T3, 마우스 스위스 NIH 배아; MDA-MB-231, 인간 백인 유방 선암종; K562, 인간 백인 만성 골수성 백혈병; U-87 MG, 인간 교모세포종 성상세포종; MRC-5(PD 25), 인간 태아 폐; A2780cis, 인간 난소 암종; B9, 마우스 B 세포 하이브리도마; CHO-K1, 햄스터 중국 난소; MDCK, 개 코커 스파니엘(Cocker Spaniel) 신장; 1321N1, 인간 뇌 성상세포종; A431, 인간 편평 암종; ATDC5, 마우스 129 기형암종 AT805 유래; RCC4 PLUS VECTOR ALONE, 신장 세포 암종 세포주 RCC4, 네오마이신 내성을 부여하는 빈 발현 벡터인 pcDNA3에 의해 안정적으로 형질감염됨; HUVEC(S200-05n), 인간 미리 스크리닝된 제대 정맥 내피 세포(HUVEC); 신생아; Vero, 원숭이 아프리카 녹색 신장; RCC4 PLUS VHL, 신장 세포 암종 세포주 RCC4, pcDNA3-VHL에 의해 안정적으로 형질감염됨; Fao, 래트 간암종; J774A.1, 마우스 BALB/c 단핵구 대식세포; MC3T3-E1, 마우스 C57BL/6 칼바리아(calvaria); J774.2, 마우스 BALB/c 단핵구 대식세포; PNT1A, 인간 사춘기 후 전립선 정상, SV4에 의해 불멸화됨; U-2 OS, 인간 골육종; HCT 116, 인간 결장 암종; MA104, 원숭이 아프리카 녹색 신장; BEAS-2B, 인간 기관지 상피, 정상; NB2-11, 래트 림프종; BHK 21(클론 13), 햄스터 시리안 신장; NS0, 마우스 골수종; Neuro 2a, 마우스 알비노 신경모세포종; SP2/0-Ag14, 마우스 x 마우스 골수종, 비생산; T47D, 인간 유방 종양; 1301, 인간 T 세포 백혈병; MDCK-II, 개 코커 스파니엘 신장; PNT2, 인간 전립선 정상, SV40에 의해 불멸화됨; PC-3, 인간 백인 전립선 선암종; TF1, 인간 적혈백혈병; COS-7, 원숭이 아프리카 녹색 신장, SV40에 의해 형질전환됨; MDCK, 개 코커 스파니엘 신장; HUVEC(200-05n), 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC); 신생아; NCI-H322, 인간 백인 기관지폐포 암종; SK.N.SH, 인간 백인 신경모세포종; LNCaP.FGC, 인간 백인 전립선 암종; OE21, 인간 백인 식도 편평 세포 암종; PSN1, 인간 췌장 선암종; ISHIKAWA, 인간 아시아인 자궁내막 선암종; MFE-280, 인간 백인 자궁내막 선암종; MG-63, 인간 골육종; RK 13, 토끼 신장, BVDV 음성; EoL-1 세포, 인간 호산구성 백혈병; VCaP, 인간 전립선암 전이; tsA201, 인간 배아 신장, SV40에 의해 형질전환됨; CHO, 햄스터 중국 난소; HT 1080, 인간 섬유육종; PANC-1, 인간 백인 췌장; Saos-2, 인간 원발성 골원성 육종; 섬유모세포 성장 배지(116K-500), 섬유모세포 성장 배지 키트; ND7/23, 마우스 신경모세포종 x 래트 뉴런 하이브리드; SK-OV-3, 인간 백인 난소 선암종; COV434, 인간 난소 과립막 종양; Hep 3B, 인간 간세포 암종; Vero(WHO), 원숭이 아프리카 녹색 신장; Nthy-ori 3-1, 인간 갑상선 여포 상피; U373 MG(Uppsala), 인간 교모세포종 성상세포종; A375, 인간 악성 흑색종; AGS, 인간 백인 위 선암종; CAKI 2, 인간 백인 신장 암종; COLO 205, 인간 백인 결장 선암종; COR-L23, 인간 백인 폐 대세포 암종; IMR 32, 인간 백인 신경모세포종; QT 35, 메추라기 일본인 섬유육종; WI 38, 인간 백인 태아 폐; HMVII, 인간 질 악성 흑색종; HT55, 인간 결장 암종; TK6, 인간 림프모구, 티미딘 키나제 이형접합체; SP2/0-AG14(AC-FREE), 마우스 x 마우스 하이브리도마 비분비, 무혈청, 동물 성분(AC) 무함유; AR42J, 또는 래트 외분비 췌장 종양; 또는 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 단백질이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 돌연변이체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 효소이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 돌연변이체 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 프로테아제, 하이드롤라제, 키나제, 재조합효소, 환원효소, 데하이드로게나제, 이소머라제, 합성효소, 산화환원효소, 트랜스퍼라제, 리아제, 리가제, 또는 이들의 임의의 돌연변이체이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 단일 세포이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 2개 이상의 세포이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 100개, 적어도 1000개 또는 적어도 10000개의 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 형질감염된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 안정적으로 통합된 핵산을 포함한다.
이온 채널 스크린
일부 실시양태에서, 세포는 이온 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 세포에 대한 내생성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 세포에 대해 비-내생성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 돌연변이체 이온 채널이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 이온 채널을 광학 자극에 민감하게 만든다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 전자기 복사를 이용한 자극이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 가시광선을 이용한 자극이다.
일부 실시양태에서, 방법은 이온 채널을 자극하는 단계를 포함한다. 이온 채널을 자극하는 단계는 이온 채널을 활성화시키거나 불활성화시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 전기자극, 광학 자극, 또는 화학적 자극에 의해 자극된다. 일부 실시양태에서, 자극은 전기자극이다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 전기장을 이온 채널에 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 미세유체 장치에서 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전극은 미세유체 장치의 유동 경로 내부에 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 캡슐화의 유동 경로 내부에 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 미세유체 장치의 유동 경로의 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 캡슐화의 유동 경로의 외부에 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 이온 채널 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 조절제는 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 조절제는 아고니스트이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 이온 채널 단백질을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 전압 센서 프로브 세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 인코딩된 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 이온 채널 단백질을 발현하는 세포, 전압 센서 프로브 세트, 및 인코딩된 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포의 이온 채널을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 전압 센서 프로브 세트의 적어도 하나의 구성원으로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 캡슐화물을 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 신호의 존재, 부재, 수준 또는 변화를 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터의 정체를 확인하기 위해 인코딩물의 성질을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 핵산이고 이펙터의 정체를 확인하기 위해 측정된 성질은 인코딩물의 핵산 서열이다.
이온 채널 단백질은 임의의 이러한 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 나트륨, 칼슘, 클로라이드, 양성자, 또는 칼륨 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 나트륨 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 칼륨 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 칼슘 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 클로라이드 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 양성자 이온 채널 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 이온 채널 단백질을 포함한다. 임의의 전압 게이팅 이온 채널 단백질을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 나트륨, 칼슘, 클로라이드, 양성자 또는 칼륨 전압 게이팅 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 칼슘 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 나트륨 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 칼륨 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 클로라이드 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 양성자 이온 채널 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 세포에 대한 내생성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 외생성 이온 채널 단백질이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 벡터를 통해 세포 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 벡터의 첨가를 통해 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질을 인코딩하는 유전자는 세포 내로 일시적으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 인코딩하는 유전자는 세포 내로 안정적으로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 과다발현된다.
일부 실시양태에서, 전압 게이팅 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 칼슘 채널 단백질(VGCC)을 포함한다. 임의의 VGCC 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, VGCC는 L형 칼슘 채널(예를 들면, Cav1.1, Cav1.2, Cav1.3, 또는 Cav1.4), P형 칼슘 채널(예를 들면, Cav2.1), N형 칼슘 채널(예를 들면, Cav2.2), R형 칼슘 채널(예를 들면, Cav2.3) 또는 T형 칼슘 채널(예를 들면, Cav3.1, Cav3.2 또는 Cav3.3), 또는 이들의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VGCC는 L형 칼슘 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGCC는 P형 칼슘 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGCC는 N형 칼슘 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGCC는 R형 칼슘 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGCC는 T형 칼슘 채널을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 나트륨 채널 단백질(Nav), 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다. 임의의 전압 게이팅 나트륨 채널 단백질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 나트륨 채널 단백질은 Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, Nav2.1, Nav2.2, Nav2.3 또는 Nav3.1, 또는 이들의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 칼륨 채널 단백질(VGKC), 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다. 임의의 VGKC 단백질이 사용될 수 있다. VGKC 단백질은 임의의 알파 서브유닛을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, VGKC는 지연된 정류기 칼륨 채널(예를 들면, Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv1.7, Kv1.8, Kv2.1, Kv2.1, Kv3.1, Kv3.2, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.3, Kv7.4, Kv7.5 또는 Kv10.1)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGKC는 A형 칼륨 채널(예를 들면, Kv1.4, Kv3.3, Kv3.4, Kv4.1, Kv4.1, Kv4.2 또는 Kv4.3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGKC는 외향 정류 칼륨 채널(예를 들면, Kv10.2)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGKC는 내향 정류 칼륨 채널(예를 들면, Kv11.1, Kv11.2 또는 Kv11.3과 같은 에테르-어-고-고(ether-a-go-go) 칼륨 채널)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGKC는 천천히 활성화되는 칼륨 채널(예를 들면, Kv12.1, Kv12.2 또는 Kv12.3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, VGKC는 변형제/침묵제(silencer) 칼륨 채널(예를 들면, Kv5.1, Kv6.1, Kv6.2, Kv6.3, Kv6.4, Kv8.1, Kv8.2, Kv9.1, Kv9.2, 또는 Kv9.3)을 포함한다. 상기 칼륨 채널들 중 임의의 칼륨 채널의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 클로라이드 채널 단백질을 포함한다. 임의의 전압 게이팅 클로라이드 채널 단백질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 클로라이드 채널 단백질은 CLCN 패밀리(예를 들면, CLCN1, CLCN2, CLCN3, CLCN4, CLCN5, CLCN6, CLCN7, CLCNKA, CLCNKB)로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 클로라이드 채널 단백질은 상피 클로라이드 채널 패밀리(예를 들면, CLCA1, CLCA2, CLCA3, 또는 CLCA4)로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 클로라이드 채널 단백질은 클로라이드 세포내 채널(CLIC) 패밀리(예를 들면, CLIC1, CLIC2, CLIC3, CLIC4, CLIC5, 또는 CLIC6)로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 양성자 채널을 포함한다. 임의의 전압 게이팅 양성자 채널 단백질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전압 게이팅 양성자 채널은 전압 게이팅 수소 채널 1 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 채널로돕신, 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널로돕신은 ChrimsonR, 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체이다. 일부 실시양태에서, 채널로돕신은 K176R 돌연변이, S267M 돌연변이, Y268F 돌연변이, Y261F 돌연변이 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 ChrimsonR 돌연변이체이다.
전압 센서 프로브 세트는 임의의 적합한 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 FRET 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 전압 민감성 옥소놀, 형광 쿠마린, 또는 이들 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 전압 민감성 옥소놀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 형광 쿠마린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 DiSBAC 화합물, 쿠마린 인지질, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 DiSBAC 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 쿠마린 인지질을 포함한다. 전압 센서 세트는 DiSBAC2, DiSBAC4, DiSBAC6, CC1-DMPE, CC2-DMPE, 또는 이들의 조합 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 세트는 DiSBAC2(3), DiSBAC2(5), DiSBAC4(3), DiSBAC4(5), DiSBAC6(3), DiSBAC6(5), CC1-DMPE, CC2-DMPE, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 세트는 DiSBAC6 및 CC2-DMPE를 포함한다.
캡슐화물은 전압 어세이 배경 억제 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전압 어세이 배경 억제 화합물은 VABSC-1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 자극은 광학 자극이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 전자기 복사이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 가시광선이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 UV, VIS 또는 근적외선이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 자외선이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 가시광선이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 근적외선이다.
일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 약 660 nm이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 약 100 nm 내지 약 1,000 nm이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 400 nm, 약 100 nm 내지 약 450 nm, 약 100 nm 내지 약 500 nm, 약 100 nm 내지 약 550 nm, 약 100 nm 내지 약 600 nm, 약 100 nm 내지 약 650 nm, 약 100 nm 내지 약 700 nm, 약 100 nm 내지 약 750 nm, 약 100 nm 내지 약 800 nm, 약 100 nm 내지 약 1,000 nm, 약 200 nm 내지 약 400 nm, 약 200 nm 내지 약 450 nm, 약 200 nm 내지 약 500 nm, 약 200 nm 내지 약 550 nm, 약 200 nm 내지 약 600 nm, 약 200 nm 내지 약 650 nm, 약 200 nm 내지 약 700 nm, 약 200 nm 내지 약 750 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 200 nm 내지 약 1,000 nm, 약 400 nm 내지 약 450 nm, 약 400 nm 내지 약 500 nm, 약 400 nm 내지 약 550 nm, 약 400 nm 내지 약 600 nm, 약 400 nm 내지 약 650 nm, 약 400 nm 내지 약 700 nm, 약 400 nm 내지 약 750 nm, 약 400 nm 내지 약 800 nm, 약 400 nm 내지 약 1,000 nm, 약 450 nm 내지 약 500 nm, 약 450 nm 내지 약 550 nm, 약 450 nm 내지 약 600 nm, 약 450 nm 내지 약 650 nm, 약 450 nm 내지 약 700 nm, 약 450 nm 내지 약 750 nm, 약 450 nm 내지 약 800 nm, 약 450 nm 내지 약 1,000 nm, 약 500 nm 내지 약 550 nm, 약 500 nm 내지 약 600 nm, 약 500 nm 내지 약 650 nm, 약 500 nm 내지 약 700 nm, 약 500 nm 내지 약 750 nm, 약 500 nm 내지 약 800 nm, 약 500 nm 내지 약 1,000 nm, 약 550 nm 내지 약 600 nm, 약 550 nm 내지 약 650 nm, 약 550 nm 내지 약 700 nm, 약 550 nm 내지 약 750 nm, 약 550 nm 내지 약 800 nm, 약 550 nm 내지 약 1,000 nm, 약 600 nm 내지 약 650 nm, 약 600 nm 내지 약 700 nm, 약 600 nm 내지 약 750 nm, 약 600 nm 내지 약 800 nm, 약 600 nm 내지 약 1,000 nm, 약 650 nm 내지 약 700 nm, 약 650 nm 내지 약 750 nm, 약 650 nm 내지 약 800 nm, 약 650 nm 내지 약 1,000 nm, 약 700 nm 내지 약 750 nm, 약 700 nm 내지 약 800 nm, 약 700 nm 내지 약 1,000 nm, 약 750 nm 내지 약 800 nm, 약 750 nm 내지 약 1,000 nm, 또는 약 800 nm 내지 약 1,000 nm이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 약 100 nm, 약 200 nm, 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm, 약 800 nm 또는 약 1,000 nm이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 적어도 약 100 nm, 약 200 nm, 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm 또는 약 800 nm이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 최대 약 200 nm, 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm, 약 800 nm 또는 약 1,000 nm이다.
일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 약 500 mJ/s/cm2이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 약 50 내지 약 1,000 mJ/S/cm2이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 250, 약 50 내지 약 500, 약 50 내지 약 750, 약 50 내지 약 1,000, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 500, 약 100 내지 약 750, 약 100 내지 약 1,000, 약 250 내지 약 500, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 1,000, 약 500 내지 약 750, 약 500 내지 약 1,000, 또는 약 750 내지 약 1,000 mJ/S/cm2이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 약 50, 약 100, 약 250, 약 500, 약 750 또는 약 1,000 mJ/S/cm2이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 적어도 약 50, 약 100, 약 250, 약 500 또는 약 750 mJ/S/cm2이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 최대 약 100, 약 250, 약 500, 약 750 또는 약 1,000 mJ/S/cm2이다.
일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 약 10 Hz이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 약 1 Hz 내지 약 100 Hz이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 약 1 Hz 내지 약 2 Hz, 약 1 Hz 내지 약 5 Hz, 약 1 Hz 내지 약 10 Hz, 약 1 Hz 내지 약 20 Hz, 약 1 Hz 내지 약 50 Hz, 약 1 Hz 내지 약 100 Hz, 약 2 Hz 내지 약 5 Hz, 약 2 Hz 내지 약 10 Hz, 약 2 Hz 내지 약 20 Hz, 약 2 Hz 내지 약 50 Hz, 약 2 Hz 내지 약 100 Hz, 약 5 Hz 내지 약 10 Hz, 약 5 Hz 내지 약 20 Hz, 약 5 Hz 내지 약 50 Hz, 약 5 Hz 내지 약 100 Hz, 약 10 Hz 내지 약 20 Hz, 약 10 Hz 내지 약 50 Hz, 약 10 Hz 내지 약 100 Hz, 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 또는 약 50 Hz 내지 약 100 Hz이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 약 1 Hz, 약 2 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 50 Hz, 또는 약 100 Hz이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 적어도 약 1 Hz, 약 2 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 또는 약 50 Hz이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 최대 약 2 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 50 Hz, 약 100 Hz, 약 150 Hz, 또는 약 200 Hz이다.
일부 실시양태에서, 자극은 화학적 자극이다. 일부 실시양태에서, 화학적 자극은 이온 채널을 독소와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 독소는 이온 채널 독소이다. 일부 실시양태에서, 독소는 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 독소는 조건부 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 화학적 자극은 이온 채널을 이온 채널 독소와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 베라트리딘, OD-1, 또는 또 다른 이온 채널 독소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 베라트리딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 OD-1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 피코주입에 의해, 액적 융합에 의해, 또는 캡슐화물을 함유하는 미세유체 장치의 미리 배열된 구성을 통해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 액적 융합에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 캡슐화물을 함유하는 미세유체 장치의 미리 배열된 구성을 통해 캡슐화물에 첨가된다.
이온 채널은 전기 자극에 의해 자극될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온 채널의 자극은 적어도 하나의 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 전극은 캡슐화의 유동 경로 내부에 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 전극은 캡슐화의 유동 경로의 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 전기장, 유전영동력, 또는 내장된 금속 접촉 전극을 생성하기 위해 비접촉 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 전기장을 생성하기 위해 비접촉 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 유전영동력에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 내장된 금속 접촉 전극에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, 전기자극은 캡슐화물을 함유하는 미세유체 장치의 기하구조에 의해 좌우된다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 약 10 Hz이다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 약 1 Hz 내지 약 100 Hz이다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 약 1 Hz 내지 약 2 Hz, 약 1 Hz 내지 약 5 Hz, 약 1 Hz 내지 약 10 Hz, 약 1 Hz 내지 약 20 Hz, 약 1 Hz 내지 약 50 Hz, 약 1 Hz 내지 약 100 Hz, 약 2 Hz 내지 약 5 Hz, 약 2 Hz 내지 약 10 Hz, 약 2 Hz 내지 약 20 Hz, 약 2 Hz 내지 약 50 Hz, 약 2 Hz 내지 약 100 Hz, 약 5 Hz 내지 약 10 Hz, 약 5 Hz 내지 약 20 Hz, 약 5 Hz 내지 약 50 Hz, 약 5 Hz 내지 약 100 Hz, 약 10 Hz 내지 약 20 Hz, 약 10 Hz 내지 약 50 Hz, 약 10 Hz 내지 약 100 Hz, 약 20 Hz 내지 약 50 Hz, 약 20 Hz 내지 약 100 Hz, 또는 약 50 Hz 내지 약 100 Hz이다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 약 1 Hz, 약 2 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 50 Hz 또는 약 100 Hz이다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 적어도 약 1 Hz, 약 2 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz 또는 약 50 Hz이다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 최대 약 2 Hz, 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 20 Hz, 약 50 Hz, 약 100 Hz, 약 150 Hz 또는 약 200 Hz이다.
이온 채널의 자극은 여러 번 수행될 수 있거나 한 번만 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 이온 채널은 약 1회 내지 약 20회 자극된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이온 채널은 약 1회 내지 약 2회, 약 1회 내지 약 3회, 약 1회 내지 약 5회, 약 1회 내지 약 7회, 약 1회 내지 약 10회, 약 1회 내지 약 20회, 약 2회 내지 약 3회, 약 2회 내지 약 5회, 약 2회 내지 약 7회, 약 2회 내지 약 10회, 약 2회 내지 약 20회, 약 3회 내지 약 5회, 약 3회 내지 약 7회, 약 3회 내지 약 10회, 약 3회 내지 약 20회, 약 5회 내지 약 7회, 약 5회 내지 약 10회, 약 5회 내지 약 20회, 약 7회 내지 약 10회, 약 7회 내지 약 20회, 또는 약 10회 내지 약 20회 자극된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이온 채널은 약 1회, 약 2회, 약 3회, 약 5회, 약 7회, 약 10회, 또는 약 20회 자극된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이온 채널은 적어도 약 1회, 약 2회, 약 3회, 약 5회, 약 7회 또는 약 10회 자극된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이온 채널은 최대 약 2회, 약 3회, 약 5회, 약 7회, 약 10회 또는 약 20회 자극된다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 1회 자극된다. 자극이 이온 채널 독소 또는 다른 이온 채널 억제제의 첨가에 의해 일어나는 실시양태에서, 이온 채널 독소는 단일 단계에서만 첨가될 필요가 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 이온 채널을 자극하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 캡슐화물에서 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 전기자극, 광학 자극, 또는 화학적 자극으로 세포의 이온 채널을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 캡슐화물 내의 세포의 이미지를 포착함으로써 세포로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 전압 센서 프로브 세트의 적어도 하나의 구성원으로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 발광 또는 형광이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 형광이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 FRET 상호작용으로 인해 방출된다. 일부 실시양태에서, 신호는 인코딩된 이펙터를 갖지 않은 동일한 캡슐화물에 비해 전자기 복사의 증가, 감소 또는 변화이다. 일부 실시양태에서, 신호는 이온 채널의 자극 전 캡슐화물에 비해 전자기 복사의 증가, 감소 또는 변화이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 신호의 존재, 부재, 수준 또는 변화를 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터의 정체를 확인하기 위해 인코딩물의 성질을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 단백질이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 돌연변이체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 효소이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 돌연변이체 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 프로테아제, 하이드롤라제, 키나제, 재조합효소, 환원효소, 데하이드로게나제, 이소머라제, 합성효소, 산화환원효소, 트랜스퍼라제, 리아제, 리가제, 또는 이들의 임의의 돌연변이체이다.
샘플은 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산 및 표적 단백질 그 자체를 추가로 포함할 수 있다. 이 샘플 핵산은 바코딩될 수 있다. 핵산에의 바코드의 존재는 바코드가 표적 단백질 및 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산과 함께 공-캡슐화되는 이펙터의 핵산 인코딩물에 전달될 수 있게 한다. 이어서, 이것은 어느 이펙터 조합이 함께 캡슐화되었고 표적 단백질에 대한 상승작용적 효과를 생성하였는지를 확인할 수 있게 한다. 이러한 방법은 추가 약물 발견에 있어서 관심 있는 리드 분자를 확인하기 위해 단편 기반 스크린을 수행하는 데 이용될 수 있다.
단편 기반 스크린 및 효소 진화 방법
일부 실시양태에서, 샘플은 표적 단백질, 및 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산은 바코드 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산은 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 코딩하는 핵산으로부터의 바코드는 이펙터의 핵산 인코딩물에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 표적 단백질 및 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산은 시험관내 전사/번역 시스템과 함께 공-캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사/번역 시스템을 사용하여 표적 단백질을 증폭한다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 핵산 인코딩된 이펙터는 그들의 상응하는 핵산 인코딩물과 함께, 표적 단백질 및 표적 단백질의 발현을 인코딩하는 핵산을 포함하는 캡슐화물 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 바코드는 이펙터를 인코딩하는 핵산에 전달된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 2개 이상의 이펙터가 표적 단백질과 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 신호는 2개 이상의 이펙터와 표적 단백질의 상호작용에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 신호의 측정에 기반하여 분류된다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 코딩하는 핵산으로부터의 바코드를 포함하는 핵산 인코딩물은 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 표적 단백질에 대한 효능을 부여한 이펙터의 조합을 확인할 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 핵산에 의해 코딩된 표적 단백질은 신호전달 단백질, 효소, 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편, 구조 단백질, 저장 단백질, 또는 수송 단백질이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 트립신, 대식세포 메탈로엘라스타제 12(MMP-12), 세포외 신호 관련 키나제 1(ERK1), 또는 세포외 신호 조절 키나제 2(EKR2)이다.
샘플이 표적 단백질 및 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산인 실시양태에서, 상기 핵산은 이펙터를 인코딩하는 핵산에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 이 상보성은 이펙터를 인코딩하는 핵산 상으로의 바코드의 증폭에 이용될 수 있다. 샘플이 표적 단백질 및 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산인 실시양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 바코드가 전달된 후 핵산 서열 및/또는 이펙터를 인코딩하는 핵산 서열이 증폭될 수 있게 한다.
시험관내 전사/번역 시스템은 임의의 살아있는 조직 또는 세포를 필요로 하지 않으면서 단백질을 코딩하는 핵산으로부터 단백질을 발현할 수 있는 시스템이다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사/번역 시스템은 캡슐화물 내에서 표적 단백질을 발현시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사/번역 시스템은 캡슐화물 내에서 표적 단백질을 목표 농도까지 발현시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사/번역 시스템은 캡슐화물 내에서 표적 단백질을 증폭하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사/번역 시스템은 캡슐화물 내에서 표적 단백질을 원하는 농도까지 증폭하는 데 사용된다.
캡슐화
캡슐화물은 더 큰 시스템 내에서의 구획의 형성을 지칭할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 캡슐화물은 미세유체 채널 내의 액적이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 마크로웰, 마이크로웰, 기포, 또는 미세유체 밀폐부이다. 일단 캡슐화물이 형성되면, 캡슐화물 내부의 임의의 구성요소는 캡슐화물이 파괴되거나 분해될 때까지 캡슐화물에 남아 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용된 캡슐화물은 적어도 4시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 또는 적어도 1주 동안 안정하게 유지된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 캡슐화물 사이에 시약의 혼합이 일어나지 않도록 스크린이 수행되는 지속시간 동안 안정하다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터, 또는 최대 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 적어도 1 피코리터, 적어도 10 피코리터, 적어도 100 피코리터, 적어도 1 나노리터, 적어도 10 나노리터, 적어도 100 나노리터 또는 적어도 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 액적은 약 200 피코리터 내지 약 10 나노리터이다.
일부 실시양태에서, 액적은 더 큰 오일 본체(body) 내의 수성 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적을 오일 유화액에 넣는다. 일부 실시양태에서, 오일은 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 탄화수소 오일, 광유, 파라핀 오일, 할로겐화 오일, 플루오로카본 오일, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 실리콘 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 플루오로실리콘 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 탄화수소 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 광유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 파라핀 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 할로겐화 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 플루오로카본 오일을 포함한다.
복수의 캡슐화물이 있는 실시양태에서, 각각의 개별 캡슐화물은 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 캡슐화물은 대략 동일한 크기이다. 일부 실시양태에서, 각각의 캡슐화물은 복수의 캡슐화물 내에서 평균 크기 캡슐화의 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 이내이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화의 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%는 복수의 캡슐화물 내에서 평균 크기 캡슐화의 약 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 이내이다.
캡슐화물은 임의의 방법에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 수성 스트림을 비혼화성 담체 유체 내로 유동시킴으로써 형성된다. 일부 실시양태에서, 수성 스트림은 미세유체 채널의 연접부에서 비혼화성 담체 유체 내로 유동한다. 일부 실시양태에서, 연접부는 T-연접부이다. 일부 실시양태에서, 연접부는 2개의 수직 미세유체 채널의 만남이다. 연접부는 임의의 수의 미세유체 채널의 만남일 수 있다. 연접부는 임의의 각도에 있을 수 있다. 수성 스트림은 2개 이상의 수성 스트림의 업스트림 연접부에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 용액 및 이펙터 용액은 비혼화성 담체 유체와 수성 스트림 연접부의 업스트림에서 합쳐진다.
액적의 크기는 다양한 파라미터를 조절함으로써 제어될 수 있다. 이 파라미터는 2개의 미세유체 채널의 연접부의 기하구조, 2개의 스트림의 유속, 사용된 오일의 유형, 계면활성제의 존재, 유동 스트림에 가해진 압력, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 인코딩된 이펙터가 캡슐화물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터 및 그의 인코딩물을 포함하는 단일 스캐폴드가 캡슐화물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 상이한 인코딩된 이펙터 및 그의 각각의 인코딩물을 각각 포함하는 복수의 스캐폴드가 캡슐화물에 존재한다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물은 생물학적 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 단일 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 하나 이상의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 포함한다.
분류
본원에서 제공된 방법 및 시스템은 분류 단계를 포함할 수 있다. 분류 단계는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 비-히트 이펙터로부터 "히트" 이펙터를 분류하는 하나의 방식은 공간에서 히트와 비-히트를 물리적으로 분리하는 것이다. 이것은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 미세유체 채널을 통해 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 채널은 검출기를 갖춘다. 일부 실시양태에서, "히트" 기준이 충족되는 경우, "히트" 이펙터는 하나의 수집 용기 내에 배치되고, "비-히트" 이펙터는 또 다른 수집 용기 내에 배치된다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 이러한 "히트" 이펙터는 이펙터(또는 또 다른 구성요소) 및 샘플, 시약 또는 이들의 조합과의 상호작용으로부터 비롯된 신호의 존재 또는 부재에 기반하여 분류된다. 일부 실시양태에서, 분류는 검출된 신호의 수준에 기반한다. 일부 실시양태에서, 분류는 검출된 신호의 존재에 기반한다. 일부 실시양태에서, 분류는 신호의 부재에 기반한다.
일부 실시양태에서, 액적 분류는 활성 기반 스크리닝에 의해 달성된다. 활성 기반 분류는 액적이 통과할 때 액적에 의해 방출된 반응을 미세유체 칩의 검출 영역으로 검출하는 것에 기반하여 분류하는 능력에 의해 달성된다. 일례로서, 특정 소분자는 특정 효소를 억제하고, 이것은 그 억제를 검출하는 활성 기반 어세이에 의해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 분류는 효소의 "활성"에 기반하므로, 단순히 효소에 결합하기보다는 오히려 효소를 기능적으로 억제하는 소분자에 대해 스크리닝한다. 이것은 더 적절한 스크린이고 활성에 대해 스크리닝하는 통상의 HTS 스크리닝과 훨씬 더 유사하다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 이상인 경우 캡슐화(예를 들면, 액적)를 제1 수집 튜브 내에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 미만인 경우 액적을 제2 수집 튜브에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 이상인 경우 액적을 제1 수집 튜브 내에 배치하거나 신호가 소정의 역치 미만인 경우 액적을 제2 수집 튜브에 배치하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 캡슐화물을 2개 이상의 수집 튜브 또는 빈 내에 넣는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, "히트" 이펙터 또는 양성 "히트"는 2개 이상의 수집 튜브 또는 빈에 저장된다. 일부 실시양태에서, "히트" 이펙터 또는 양성 "히트"는 측정된 신호 또는 활성에 기반하여 분류된다.
도 26a 내지 도 28c는 2가지 유형의 검출 신호를 기반으로 액적을 분류하는 것을 도시한다. 도 26a 및 26b는 비드로부터 방출될 때 검출 가능한 강도 수준을 제공하는 형광단 TR1-TAMRA가 부착된 비드의 사용을 도시한다(도 26b). 대조적으로, 도 27a 및 27b는 방출 시 검출된 형광의 강도를 억제하거나 최소화하는 억제제 TR3이 부착된 비드의 사용을 도시한다(도 27b). 도 27c는 TR3 억제제의 농도 증가에 따른 카텝신 D 활성의 감소를 도시한다. 도 28a는 충족되는 특정 억제 역치에 기반하여 분류되는 액적의 예시적인 묘사를 제공하고, 이때 특정 역치 미만의 형광 강도 수준을 나타내는 액적은 "양성" 히트일 것이고, 상기 역치 초과의 형광 강도 수준을 나타내는 액적은 "음성" 히트일 것이다. 도 28c는 이러한 억제 활성에 대한 예시적인 역치 수준을 제공한다. 일부 실시양태에서, 분류를 위한 역치는 측정되는(예를 들면, TAMRA 형광단의 사용을 통해 발생하는) 최소 형광 강도 수준에 기반할 것이다. 도 28b는 이러한 형광 검출 활성에 대한 예시적인 역치 수준을 제공한다. 도 28d는 본원에 기재된 방법 또는 시스템에 사용되는 장치의 예시를 제공한다.
일부 실시양태에서, 캡슐화의 분류는 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형, 또는 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 이용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 파형 펄스 발생기는 전기장 구배로 캡슐화물을 이동시킨다. 일부 실시양태에서, 파형 펄스 발생기는 소리로 캡슐화물을 이동시킨다. 일부 실시양태에서, 파형 펄스 발생기는 다이어프램으로 캡슐화물을 이동시킨다. 일부 실시양태에서, 파형 펄스 발생기는 미세유체 채널의 기하구조를 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 파형 펄스 발생기는 미세유체 채널의 압력을 변화시킨다.
어느 이펙터가 원하는 효과를 가졌는지를 확인하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 일부 경우, "히트" 이펙터의 물리적 분류를 이용하여 어느 이펙터가 원하는 효과를 가졌는지를 확인한다. 일부 경우, "히트" 이펙터를 포함하는 캡슐화물에의 검출 가능한 표지의 선택적 첨가가 이용된다. 일부 경우, 검출 가능한 표지는 검출 가능한 표지를 인코딩물과 연결함으로써 어느 이펙터가 원하는 효과를 가졌는지를 확인하는 데 사용된다. 예를 들면, 이펙터의 핵산 인코딩물에의 핵산 바코드의 첨가는 서열분석에 의해 확인될 수 있는 방식으로 "히트" 이펙터의 태그부착을 달성할 수 있다. "히트" 이펙터 인코딩물만이 핵산 바코드로 태그부착된 경우, 원하는 활성을 결여한 이펙터는 바코드를 결여할 것이기 때문에, 이 샘플은 후속 서열분석 단계 동안 선별될 수 있다. 바코드는 "히트" 이펙터 인코딩물만이 증폭될 수 있도록 고유 프라이머 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이 방식으로, 활성 또는 효능과 관계없이 모든 캡슐화물을 함께 풀링할 수 있고, 그 결과 히트를 여전히 확인할 수 있다.
바코드 비-분류 방법
본원에서 제공된 일부 실시양태에서, 방법은 물리적 분류 단계를 포함하지 않는다. 이 실시양태에서, 어느 이펙터가 샘플에 대한 원하는 효과를 갖는지의 해석은 상이한 방식으로 달성된다. 일부 실시양태에서, 방법은 바코드를 인코딩물에 첨가하는 추가 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 바코드를 핵산 인코딩물에 첨가하는 추가 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 바코드를 인코딩물에 어닐링하거나, 바코드를 인코딩물에 라이게이션시키거나, 바코드를 인코딩물 상에 증폭함으로써 바코드를 인코딩물에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 핵산 인코딩물 및 바코드에 대한 프라이머로서 작용하는 핵산 인코딩물의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 태그부착 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 바코드를 핵산 인코딩물에 첨가하는 효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 물리적 분류 단계 없이 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 샘플, 핵산 인코딩된 이펙터 및 핵산 인코딩물을 캡슐화물 내에 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물에서 신호가 검출된다. 일부 실시양태에서, 신호는 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된다. 일부 실시양태에서, 신호의 검출, 부재 또는 수준을 기반으로 제1 캡핑 혼합물을 액적에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 제1 캡핑 혼합물은 제1 핵산 캡을 핵산 인코딩물에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 제2 캡핑 혼합물은 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 제2 캡핑 혼합물은 제1 캡핑 혼합물이 캡슐화물에 첨가되지 않은 경우에만 첨가된다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 캡과 제2 핵산 캡은 상이한 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 캡만 또는 제2 핵산 캡만이 핵산 인코딩물에 첨가된다.
제1 핵산 캡 및 제2 핵산 캡은 핵산 인코딩물에 첨가될 때 상이한 의미를 가질 수 있고 상이한 것을 표시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 캡은 이펙터가 원하는 활성을 가졌음을 표시한다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성은 신호가 소정의 역치를 초과하게 만들었다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성은 신호가 소정의 역치 미만이게 만들었다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성은 신호의 존재를 야기하였다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성은 신호의 부재를 야기하였다.
일부 실시양태에서, 제2 핵산 캡은 이펙터가 원하는 활성을 결여하였음을 표시한다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성의 결여는 신호가 소정의 역치 미만이게 만들었다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성의 결여는 신호가 소정의 역치를 초과하게 만들었다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성의 결여는 신호의 부재를 야기하였다. 일부 실시양태에서, 원하는 활성의 결여는 신호의 존재를 야기하였다.
핵산 캡은 다양한 방법에 의해 핵산 인코딩물에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 라이게이션, 하이브리드화, 핵산 인코딩물의 연장 또는 이들의 조합에 의해 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 라이게이션에 의해 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 하이브리드화에 의해 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 핵산 인코딩물의 연장에 의해 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 핵산을 화학적으로 가교결합함으로써 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 소랄렌과 화학적으로 가교결합함으로써 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡의 상보적 서열은 핵산 캡이 첨가될 수 있도록 핵산 인코딩물의 말단 단부에 위치된다. 일부 실시양태에서, 핵산 캡은 바코드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 캡핑 혼합물은 핵산 캡을 인코딩물에 첨가하기 위한 추가 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 중합효소, 리가제, 제한 효소, 또는 재조합효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 중합효소이다.
핵산의 비드 포획
검출 가능한 신호로부터 활성을 측정하는 것 이외에, 핵산을 샘플로부터 인코딩물에 혼입함으로써 스크린으로부터 추가 정보를 모을 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 핵산을 샘플로부터 인코딩물에 전달하는 단계를 포함한다. 샘플로부터 인코딩물로의 핵산 전달은 특히 샘플이 세포일 때 샘플에 대한 실질적인 정보 및 이펙터가 샘플에 미치는 효과에 대한 정보를 확인할 수 있게 한다. 샘플로부터 핵산의 전달은 표적 mRNA의 양을 정량함으로써 발현된 단백질을 정량할 수 있게 할 뿐만 아니라, 세포에 대한 전반적인 단백질체학 및 게놈 데이터를 제공할 수 있다. 이 데이터는 수집될 수 있고 표시된 이펙터의 용량을 제공받지 않은 세포와 비교될 수 있다.
한 측면에서, 본원은 핵산 인코딩된 이펙터 스크린에서 샘플 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 세포, 핵산 인코딩된 이펙터 및 핵산 인코딩물을 캡슐화물 내에 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 이펙터와 세포가 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 이펙터와 세포 사이의 상호작용은 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 이펙터에 대한 반응으로 전사 및/또는 번역의 변화가 세포에서 일어나도록 하기에 충분하다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 핵산은 세포 핵산이 전달된 후 핵산 인코딩물을 서열분석함으로써 정량된다. 이 방식으로, 이펙터를 사용한 처리에 대한 반응으로 세포의 발현 핑거프린트가 생성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터와 하나 이상의 세포 사이의 상호작용을 통해 생성된 신호를 검출하는 단계, 및 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 추가로 포함한다.
세포 핵산을 방출하기 위해 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 용해시키는 단계는 용해 완충제를 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 세제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세제는 SDS, Triton, 또는 Tween이다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 세포 용해를 야기하는 화학물질을 포함한다.
임의의 유형의 세포 핵산이 핵산 인코딩물에 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 세포 핵산을 샘플로부터 핵산 인코딩물에 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 관심 있는 단백질을 발현하는 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 게놈 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 항체-DNA 구축물로서 첨가된다. 일부 실시양태에서, 첨가된 핵산은 인접 라이게이션 생성물이다. 일부 실시양태에서, 첨가된 핵산은 인접 연장 생성물이다. 일부 실시양태에서, 복수의 상이한 세포 핵산이 핵산 인코딩물에 부착된다.
일부 실시양태에서, 인코딩물에 전달된 핵산은 인코딩물의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이것은 샘플 핵산과 인코딩 핵산이 다양한 방법을 통해 라이게이션될 수 있게 한다. 이 방법은 제한 없이 어닐링, 라이게이션, 화학적 가교결합, 또는 이펙터를 인코딩하는 핵산 상으로의 세포 내용물의 증폭을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 인코딩물에 전달될 관심 있는 핵산에 상보적인 서열을 포함한다. 이 상보적 서열은 핵산이 인코딩물과 하이브리드화되게 한 후, 인코딩물이 세포 핵산에 의해 연장되게 하고 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
일부 실시양태에서, 핵산이 인코딩물에 용이하게 전달되게 하기 위해 추가 시약을 캡슐화물에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 핵산의 전달을 용이하게 하는 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산을 인코딩물에 전달하기 위한 시약은 캡슐화 단계 동안 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산을 인코딩물에 전달하기 위한 시약은 인큐베이션 단계 동안 첨가된다. 일부 실시양태에서, 핵산을 인코딩물에 전달하기 위한 시약은 인큐베이션 단계 후에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 핵산의 전달을 용이하게 하기 위한 추가 시약은 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 중합효소, 리가제, 제한 효소, 또는 재조합효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 화학적 가교결합 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 가교결합 시약은 소랄렌이다.
캡슐화물에의 시약의 첨가
본원에 기재된 방법 및 시스템은 하나 이상의 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 캡슐화물에 대한 스크린 동안 피코주입에 의해 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 각각의 캡슐화물은 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 80%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 85%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 90%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 95%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 97%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 98%는 피코주입을 제공받는다. 일부 실시양태에서, 피코주입 부위를 통과하는 캡슐화의 적어도 99%는 피코주입을 제공받는다.
일부 실시양태에서, 피코주입은 캡슐화물이 피코주입 부위를 통과하는 빈도와 동일한 빈도로 수행된다. 일부 실시양태에서, 피코주입은 캡슐화물이 피코주입 부위를 통과하는 빈도와 실질적으로 동일한 빈도로 수행된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물이 피코주입 부위를 통과하는 빈도는 캡슐화물을 모니터링함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물이 피코주입 부위를 통과하는 빈도는 유동에서 캡슐화물을 모니터링함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 실시간으로 이미지를 촬영함으로써 모니터링된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 검출기에 의해 모니터링된다.
일부 실시양태에서, 피코주입은 조건부 피코주입이다. 조건부 피코주입은 특정 조건이 충족된 후에만 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 조건부 피코주입은 신호가 검출될 때에만 일어난다. 일부 실시양태에서, 시약은 신호가 검출되면 피코주입에 의해 주입된다. 일부 실시양태에서, 시약은 신호가 검출되면 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 신호는 소정의 역치를 초과해야 한다.
일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법은 샘플 및 하나 이상의 스캐폴드를 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계로서, 상기 스캐폴드가 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터 및 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; 피코주입 또는 액적 병합을 통해 하나 이상의 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계; 절단 가능한 링커를 절단하여 소정의 양의 이펙터를 방출시키는 단계; 인코딩된 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된 하나 이상의 신호를 캡슐화물로부터 검출하는 단계; 및 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물에 첨가된 하나 이상의 시약은 하나 이상의 형광단, 하나 이상의 항체, 하나 이상의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
캡슐화의 분류 후
관심 있는 신호의 검출을 기반으로 하는 분류 단계 또는 바코딩 단계 후, 어느 이펙터가 표적 샘플에 대한 관심 있는 활성을 나타내었는지를 확인하기 위해 결과를 해독한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 신호의 검출을 기반으로 분류한 샘플에 어느 인코딩물이 존재하는지를 확인하는 단계를 포함한다. 인코딩물이 핵산인 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 인코딩물을 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 차세대 서열분석에 의해 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 어느 이펙터가 스크린에서 관심 있는 활성을 나타내었는지를 확인하기 위해 서열을 기준과 비교한다.
일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물의 서열분석은 인코딩물이 여전히 스캐폴드에 부착되어 있는 동안 인코딩물을 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물의 서열분석은 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물의 서열분석은 서열분석 전에 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계는 절단 시약으로 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계는 전자기 복사로 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 절단 가능한 링커 및 절단 시약은 이 목적을 위해 작용한다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소 또는 제한 효소를 사용하여 절단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소, 화학 시약, 광절단을 사용하여 인코딩물을 절단할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 서열분석 프라이머를 포함한다. 서열분석 프라이머는 핵산 인코딩물이 용이하게 증폭될 수 있게 한다. 인코딩된 이펙터의 라이브러리를 포함하는 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 각각의 인코딩물에 대해 동일하다. 인코딩된 이펙터의 라이브러리를 포함하는 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 인코딩물 사이에 상이하다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 인코딩물의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 인코딩물의 다운스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 미세유체 장치를 이용함으로써 수행된다. 미세유체 장치는 캡슐화 단계를 수행할 수 있다. 추가로, 미세유체 장치는 피코주입기, 및 본원에서 제공된 방법을 수행할 수 있게 하는 다른 구성요소를 갖출 수 있다. 일부 실시양태에서, 피코주입기는 미세유체 장치를 통과하는 유동 경로를 한정하는 미세유체 채널을 따라 제자리에 있다. 일부 실시양태에서, 피코주입기는 본원에서 제공된 방법을 수행하는 동안 시약이 원하는 시간에 첨가되도록 위치된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법 및 시스템은 인코딩된 이펙터의 라이브러리를 사용한다. 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 복수의 상이한 이펙터를 포함하고, 이들 각각은 알려진 인코딩 방식, 예컨대, 전술된 방식에 의해 고유하게 인코딩된다. 상기 라이브러리는 임의의 수의 인코딩된 이펙터를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개, 1015개 또는 1016개의 고유 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 약 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개, 1015개 또는 1016개의 고유 이펙터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 스캐폴드에 연결된다. 이 스캐폴드는 "스캐폴드 인코딩된 라이브러리"로서 지칭될 수 있다. 스캐폴드 인코딩된 라이브러리는 스캐폴드에 연결된 복수의 인코딩된 이펙터 분자를 포함한다. 스캐폴드는 고체 지지체로서 작용하고, 인코딩된 이펙터 분자를 공간에서 그의 인코딩물에 연결된 상태로 유지한다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개, 1015개 또는 1016개의 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 약 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개, 1015개 또는 1016개의 스캐폴드를 포함한다.
단일 인코딩된 이펙터에 대해 본원에 기재된 임의의 방법 또는 시스템은 인코딩된 이펙터의 라이브러리에 의해 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원은 인코딩된 이펙터의 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서, 인코딩된 이펙터의 라이브러리와 함께 본원에 전술된 방법들 중 임의의 방법을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 복수의 상이한 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 실질적으로 동일한 이펙터 또는 스캐폴드 인코딩된 이펙터의 다중 카피를 포함한다.
미세유체 장치
본원에서 제공된 방법 및 시스템은 미세유체 장치에서 수행될 수 있다. 장치 구성 및 방법은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 본 개시내용에 따른 분석기 또는 분류기 장치는 (예를 들면, 샘플의 액적을 주 채널 내로 도입하기 위해) 액적 압출 영역에서 주 채널과 연통하는 입구 영역, 주 채널 또는 액적 압출 영역의 전부 또는 일부 내에 있거나 이와 일치하는 검출 영역, 및 검출 영역과 연결된 검출기를 가진 적어도 하나의 분석 유닛을 포함한다. 특정 실시양태에서, 장치는 2개 이상의 액적 압출 영역을 가질 수 있다. 예를 들면, 분석 유닛이 제1 액적 압출 영역에서 주 채널과 연통하는 제1 입구 영역, 제2 액적 압출 영역(예를 들면, 제1 액적 압출 영역으로부터 다운스트림)에서 주 채널과 연통하는 제2 입구 영역 등을 가진 실시양태를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 미세유체 장치는 액적 생성 주파수가 약 5 Hz 내지 약 200 Hz이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 미세유체 장치는 처리량이 증분을 포함하는, 약 5 Hz 내지 약 15 Hz, 약 5 Hz 내지 약 25 Hz, 약 5 Hz 내지 약 50 Hz, 약 5 Hz 내지 약 80 Hz, 약 5 Hz 내지 약 100 Hz, 약 5 Hz 내지 약 150 Hz, 약 5 Hz 내지 약 200 Hz, 약 15 Hz 내지 약 25 Hz, 약 15 Hz 내지 약 50 Hz, 약 15 Hz 내지 약 80 Hz, 약 15 Hz 내지 약 100 Hz, 약 15 Hz 내지 약 150 Hz, 약 15 Hz 내지 약 200 Hz, 약 25 Hz 내지 약 50 Hz, 약 25 Hz 내지 약 80 Hz, 약 25 Hz 내지 약 100 Hz, 약 25 Hz 내지 약 150 Hz, 약 25 Hz 내지 약 200 Hz, 약 50 Hz 내지 약 80 Hz, 약 50 Hz 내지 약 100 Hz, 약 50 Hz 내지 약 150 Hz, 약 50 Hz 내지 약 200 Hz, 약 80 Hz 내지 약 100 Hz, 약 80 Hz 내지 약 150 Hz, 약 80 Hz 내지 약 200 Hz, 약 100 Hz 내지 약 150 Hz, 약 100 Hz 내지 약 200 Hz, 또는 약 150 Hz 내지 약 200 Hz이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 미세유체 장치는 액적 생성 주파수가 약 5 Hz, 약 15 Hz, 약 25 Hz, 약 50 Hz, 약 80 Hz, 약 100 Hz, 약 150 Hz 또는 약 200 Hz이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 미세유체 장치는 액적 생성 주파수가 적어도 약 5 Hz, 약 15 Hz, 약 25 Hz, 약 50 Hz, 약 80 Hz, 약 100 Hz 또는 약 150 Hz이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 미세유체 장치는 액적 생성 주파수가 최대 약 15 Hz, 약 25 Hz, 약 50 Hz, 약 80 Hz, 약 100 Hz, 약 150 Hz 또는 약 200 Hz이도록 구성된다.
장치의 분류기 실시양태는 주 채널 및 분지 채널과 연통하는 식별 영역 또는 분지점, 및 검출기에 반응하는 유동 제어도 가진다. 예를 들면, 샘플 또는 캡슐화의 하나 이상의 성질을 분석하기 위해 독립적으로 또는 함께 작동하는 복수의 검출 영역 및 검출기가 있을 수 있다. 분지 채널은 각각 출구 영역과 웰 또는 저장소로 이어질 수 있다. 복수의 입구 영역도 존재할 수 있고, 이들 각각은 상이한 샘플(예를 들면, 세포, 비리온, 또는 효소 또는 기질 분자와 같은 분자)의 액적을 주 채널 내로 도입한다. 하나 이상의 입구 영역 각각은 웰 또는 저장소와도 연통할 수 있다.
각각의 액적이 검출 영역 내로 통과할 때, 이 액적은 소정의 특성 또는 활성에 대해 조사되고(즉, 검출기를 이용함), 상응하는 신호가 생성되고, 예를 들면, "예" 는 특성 또는 활성이 존재함을 표시하거나, "아니오"는 특성 또는 활성이 존재하지 않음을 표시한다. 신호는 정성적 또는 정량적으로 특성에 상응할 수 있다. 즉, 신호의 양은 측정될 수 있고 특성 또는 활성이 존재하는 정도에 상응할 수 있다. 예를 들면, 신호의 강도는 분자의 크기, 또는 세포에 의해 발현된 효소의 효능 또는 양, 또는 양성 또는 음성 반응, 예컨대, 한 분자와 또 다른 분자의 결합 또는 하이브리드화, 효소에 의해 촉매작용된 기질의 화학 반응, 또는 효소의 활성화 또는 억제, 또는 임의의 다른 유형의 반응을 표시할 수 있다. 신호에 대한 반응으로 데이터를 수집할 수 있고/있거나, 유동 제어를 활성화시켜 액적을 한 분지 채널 또는 또 다른 분지 채널 내로 안내할 수 있다. 따라서, 식별 영역에서 액적 내의 샘플은 검출 영역에서 상응하는 조사에 의해 생성된 신호에 따라 적절한 분지 채널 내로 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자, 세포, 바이러스 또는 다른 샘플 특성의 광학 검출은 예를 들면, 직접적으로 사용되거나 분류를 위해 선택된 특성과 관련된 리포터의 사용에 의해 사용된다. 그러나, 다른 검출 기법도 이용될 수 있다.
샘플 유동 및 혼합을 위한 다양한 채널을 단일 칩에서 미세제작할 수 있으며, 예를 들면, 동역학 연구를 위해 검출 및 식별 또는 분류 점으로서 칩 상의 임의의 위치에 위치시킬 수 있다. 본 개시내용의 복수의 분석 유닛은 하나의 장치에서 조합될 수 있다. 본 개시내용에 따라 적용된 미세제작은 통상의 겔 전기영동 또는 유세포분석 동역학 연구에서 발생하는 데드 타임(dead time)을 제거하고, 더 우수한 시간 해상을 달성한다. 더욱이, 단일 칩 상의 선형 채널 어레이, 즉 다중체 시스템은 상이한 채널의 병렬 분석을 위해 광전자증배관(PMT)의 어레이를 사용함으로써 샘플을 동시에 검출하고 분류할 수 있다. 이 배열은 처리량을 개선하거나 연속적인 샘플 농후화를 위해 사용될 수 있고, 통상의 유동 분류기에 의해 허용된 용량을 초과하는 매우 높은 처리량을 미세유체 장치에 제공하도록 조정될 수 있다. 순환 시스템은 본 개시내용의 이들 특징 및 다른 특징과 함께 사용될 수 있다. 미세유체 펌프 및 밸브는 유체 및 샘플 유동을 제어하는 한 방식이다. 예를 들면, 미국 특허출원 제60/186,856호를 참조한다.
미세제작은 다른 기술, 예컨대, PCR, 광학 핀셋을 이용한 세포 이동/세포 포획, 전기천공에 의한 세포의 형질전환, μTAS 및 DNA 하이브리드화가 단일 칩 상에서 유세포분석과 통합되거나 조합될 수 있게 한다. 리포터의 바이러스(또는 세포) 특성을 검출하는 데 사용되는 검출기 및/또는 광 필터는 칩 상에서 직접 제작될 수도 있다.
본 개시내용의 장치는 전형적으로 입구 채널과 유체 연통하는 입구 영역에서 샘플 용액 저장소 또는 웰을 갖도록 미세제작될 수 있다. 저장소는 분자 또는 세포가 장치, 및 각각의 분석 유닛의 샘플 입구 채널 내로 쉽게 도입될 수 있게 한다. 입구 영역은 샘플이 장치 내로 들어갈 수 있도록, 예컨대, 미세제작된 칩의 바닥에서 개구를 가질 수 있다. 입구 영역은 샘플이 공급될 수 있는 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 튜빙과 같은 적절한 튜빙 조각을 수용하도록 개조된 연결기도 함유할 수 있다. 이러한 배열은 액적 압출 영역에서 원하는 압력을 달성하기 위해 양압 하에서 샘플 용액을 도입하는 것을 용이하게 한다.
본 개시내용의 장치는 액적 압출 영역의 업스트림에 있는 위치에서 주 채널과 직접 연통하는 추가 입구 영역을 가질 수 있으며, 이 영역을 통해 유체의 가압된 스트림 또는 "유동"이 주 채널 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 이 유체는 샘플의 용매 또는 유체와 혼화될 수 없는 유체이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 유체는 비극성 용매, 예컨대, 데칸(예를 들면, 테트라데칸 또는 헥사데칸)이고, (예를 들면, 세포, 비리온 또는 분자의) 샘플은 샘플의 수성 액적이 액적 압출 영역에서 비극성 용매의 가압된 스트림 내로 도입되도록 수용액에 용해되거나 현탁된다.
기판 및 유동 채널은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 본 개시내용의 전형적인 분석 유닛은 주 입구로부터 다운스트림에 위치된 액적 압출 영역에서 주 채널과 연통하는 하나 이상의 샘플 입구와 함께, 주 채널의 일부이고 주 채널에 직접 공급하거나 주 채널과 직접 연통하는 주 입구를 포함한다(각각의 상이한 샘플 입구는 상이한 액적 압출 영역에서 주 채널과 연통할 수 있다). 액적 압출 영역은 일반적으로 샘플의 가압된 용액(즉, 세포, 비리온 또는 분자와 같은 샘플을 함유하는 유체)이 액적으로 주 채널에 도입되도록 샘플 입구와 주 채널 사이에 연접부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 입구는 가압된 샘플 용액이 주 채널을 통과하는 유체의 스트림에 수직인 각도로 주 채널에 도입되도록 주 채널과 교차한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 샘플 입구와 주 채널은 T 모양 연접부에서 가로막는다. 즉, 샘플 입구는 주 채널에 수직(90도)으로 존재한다. 그러나, 샘플 입구는 임의의 각도에서 주 채널을 가로막을 수 있고, 그 유동에 수직인 각도에서 샘플 유체를 주 채널에 도입할 필요가 없다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 60도 내지 약 120도의 범위 내에 있다. 특정 예시적인 각도는 45도, 60도, 90도 및 120도이다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 5도 내지 약 60도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에, 교차 채널 사이의 각도는 약 5도 내지 약 60도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 5도 내지 약 10도, 약 5도 내지 약 15도, 약 5도 내지 약 20도, 약 5도 내지 약 25도, 약 5도 내지 약 30도, 약 5도 내지 약 40도, 약 5도 내지 약 50도, 약 5도 내지 약 60도, 약 10도 내지 약 15도, 약 10도 내지 약 20도, 약 10도 내지 약 25도, 약 10도 내지 약 30도, 약 10도 내지 약 40도, 약 10도 내지 약 50도, 약 10도 내지 약 60도, 약 15도 내지 약 20도, 약 15도 내지 약 25도, 약 15도 내지 약 30도, 약 15도 내지 약 40도, 약 15도 내지 약 50도, 약 15도 내지 약 60도, 약 20도 내지 약 25도, 약 20도 내지 약 30도, 약 20도 내지 약 40도, 약 20도 내지 약 50도, 약 20도 내지 약 60도, 약 25도 내지 약 30도, 약 25도 내지 약 40도, 약 25도 내지 약 50도, 약 25도 내지 약 60도, 약 30도 내지 약 40도, 약 30도 내지 약 50도, 약 30도 내지 약 60도, 약 40도 내지 약 50도, 약 40도 내지 약 60도, 또는 약 50도 내지 약 60도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 5도, 약 10도, 약 15도, 약 20도, 약 25도, 약 30도, 약 40도, 약 50도 또는 약 60도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 적어도 약 5도, 약 10도, 약 15도, 약 20도, 약 25도, 약 30도, 약 40도 또는 약 50도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 최대 약 10도, 약 15도, 약 20도, 약 25도, 약 30도, 약 40도, 약 50도 또는 약 60도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 120도 내지 약 175도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 120도 내지 약 130도, 약 120도 내지 약 140도, 약 120도 내지 약 150도, 약 120도 내지 약 160도, 약 120도 내지 약 170도, 약 120도 내지 약 175도, 약 130도 내지 약 140도, 약 130도 내지 약 150도, 약 130도 내지 약 160도, 약 130도 내지 약 170도, 약 130도 내지 약 175도, 약 140도 내지 약 150도, 약 140도 내지 약 160도, 약 140도 내지 약 170도, 약 140도 내지 약 175도, 약 150도 내지 약 160도, 약 150도 내지 약 170도, 약 150도 내지 약 175도, 약 160도 내지 약 170도, 약 160도 내지 약 175도, 또는 약 170도 내지 약 175도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 약 120도, 약 130도, 약 140도, 약 150도, 약 160도, 약 170도, 또는 약 175도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 적어도 약 120도, 약 130도, 약 140도, 약 150도, 약 160도 또는 약 170도의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 교차 채널 사이의 각도는 최대 약 130도, 약 140도, 약 150도, 약 160도, 약 170도 또는 약 175도의 범위 내에 있다.
액적 압출 또는 액적 형성 영역은 주 미세유체 채널의 반대쪽에서 도입되는 비혼화성 담체 유체를 운반하는 2개의 미세유체 채널도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 미세유체 채널은 실질적으로 동일선상에 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 연접부는 X 모양과 유사하다. 일부 실시양태에서, 주 미세유체 채널은 샘플 또는 어세이 유체를 함유한다.
그 다음, 주 채널은 또 다른 연접부 또는 "분지점"에서 2개 이상의 분지 채널과 연통하여, 예를 들면, T 모양 또는 Y 모양을 형성한다. 원하는 경우 다른 모양 및 채널 기하구조를 사용할 수 있다. 분류 실시양태에서, 연접부의 영역 또는 연접부를 둘러싸는 영역은 식별 영역 또는 분류 영역으로서도 지칭될 수 있다. 식별 영역에 대한 정확한 경계는 요구되지 않으나 선호된다.
검출 영역은 액적 압출 영역에서 또는 이의 다운스트림에서, 그리고 분류 실시양태에서 식별 영역 또는 분지점에서 또는 이의 업스트림에서 주 채널 내에 있을 수 있거나, 주 채널과 연통할 수 있거나 주 채널의 일부와 일치할 수 있다. 검출 영역에 대한 정확한 경계는 요구되지 않으나 선호된다. 식별 영역은 검출 영역의 바로 다운스트림에 위치할 수 있거나, 분자의 크기, 채널 치수 및 검출 시스템과 일치하는 적절한 거리에 의해 분리될 수 있다. 채널은 임의의 적합한 모양 또는 단면(예를 들면, 관형 또는 홈이 있음)을 가질 수 있고, 유동이 입구부터 출구까지 안내될 수 있고 한 채널부터 또 다른 채널까지 안내될 수 있는 한, 임의의 적합한 방식으로 배열될 수 있음을 인식할 것이다.
본 개시내용의 채널은 예를 들면, 통상의 포토리쏘그래피 기법을 이용하거나 "소프트 리쏘그래피"로서 지칭되는 미세가공 기술을 이용하여 실리콘 칩을 에칭함으로써 미세제작될 수 있다. 이 미세제작 방법들 및 다른 미세제작 방법은 저렴한 소형화된 장치를 제공하는 데 이용될 수 있고, 소프트 리쏘그래피의 경우 유리한 성질, 예컨대, 개선된 유연성, 안정성 및 기계적 강도를 가진 견고한 장치를 제공할 수 있다. 광학 검출이 이용될 때, 본원에서 제공된 장치는 분자 또는 세포(비리온을 포함함) 현탁액 및 챔버 물질로부터의 최소 광 산란을 제공할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 장치는 비교적 저렴하고 설정하기 용이하다. 또한, 이 장치는 일회용일 수 있고, 이것은 겔 전기영동(분자의 경우), 및 기존 FACS 기계의 유동 챔버 및 채널 내로의 입자의 멸균과 영구적인 흡착(세포, 비리온 및 다른 입자 현탁액의 경우)이라는 많은 문제점을 크게 경감시킨다.
본 개시내용의 미세제작된 장치는 실리콘 마이크로칩 또는 실리콘 탄성중합체로부터 제작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 칩의 치수는 전형적인 마이크로칩의 치수, 즉 측면당 약 0.5 cm 내지 약 5 cm 및 약 1 마이크론 내지 약 1 cm의 두께이다. 상기 장치는 액적 압출 영역 및 일치하는 검출 영역을 가진 주 채널을 가진 적어도 하나의 분석 유닛을 함유할 수 있다. 상기 장치는 적어도 하나의 입구 영역(입구 채널을 함유할 수 있음) 및 하나 이상의 출구 영역(각각의 영역에서 분지 채널과 유체 연통할 수 있음)도 함유할 수 있다. 분류 실시양태에서, 적어도 하나의 검출 영역은 검출기 유래의 신호를 통해 유동의 방향을 바꾸기 위해 적어도 하나의 식별 영역과 협력한다. "영역"과 "채널"은 서로 유체 연통하므로 중첩될 수 있음을 인식해야 한다; 즉, 영역 또는 채널이 시작되거나 종결되는 명확한 경계는 없을 수 있다. 미세제작된 장치는 투명할 수 있고, 예를 들면, 광학 현미경과 같은 광학 장치에 의한 리포터의 검출을 허용하기 위해 투명한 성질을 가진 물질, 예컨대, 유리 커버슬립으로 덮여질 수 있다.
검출 영역의 치수는 연구 중인 샘플의 성질, 특히 연구 중인 분자 또는 세포(비리온을 포함함)의 크기에 의해 영향을 받는다. 예를 들면, 일부 매우 큰 바이러스는 약 2000 nm의 길이에 도달할 수 있지만(즉, 일부 세균 세포만큼 크거나 더 큼), 바이러스는 약 20 nm 또는 500 nm의 직경을 가질 수 있다. 대조적으로, 생물학적 세포는 전형적으로 몇 배 더 크다. 예를 들면, 일부 포유동물 세포(예를 들면, 지방 세포)는 120 마이크론보다 더 클 수 있지만, 포유동물 세포는 약 1 내지 50 마이크론, 보다 전형적으로 10 내지 30 마이크론의 직경을 가질 수 있다. 식물 세포는 일반적으로 10 내지 100 마이크론이다.
분자 및 세포(비리온을 포함함)를 검출하는 데 사용되는 검출 영역은 원하는 분자가 이를 운반하는 유동에 비해 실질적으로 느려지지 않으면서 통과할 수 있게 하기에 충분히 큰 단면적을 가진다. "병목" 및/또는 난류를 피하고 단일 파일 유동을 촉진하기 위해, 특히 검출 영역에서 채널 치수는 일반적으로 이를 통과할 가장 큰 분자, 세포 또는 액적의 직경보다 측면당 또는 직경이 적어도 약 2배 또는 적어도 약 5배 커야한다.
주 채널의 유동 내에서 캡슐화물 내에 있는(즉, 액적 압출 영역에 의해 침착된) 입자(예를 들면, 비리온을 포함하는 세포) 또는 분자의 경우, 장치의 채널은 약 2 내지 100 마이크론의 직경을 가진 원형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치의 원형 채널은 직교류 영역 또는 액적 압출 영역에서 직경이 약 60 마이크론 또는 약 30 마이크론이다. 이 기하구조는 채널에서 액적의 질서정연한 유동을 용이하게 한다. 유사하게, 분석 장치에서 검출 영역의 부피는 약 10 펨토리터(fl) 내지 5000 fl, 약 40 또는 50 fl 내지 약 1000 또는 2000 fl, 또는 약 200 fl의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치의 채널, 특히 액적 압출 영역에 연결되는 입구의 채널은 약 2 내지 50 마이크론, 또는 약 30 마이크론이다.
한 실시양태에서, 이 치수에서 액적은 그들 각각의 부피를 유지하면서 채널의 크기와 모양에 순응하는 경향을 가진다. 따라서, 액적은 더 넓은 채널로부터 더 좁은 채널로 이동함에 따라 더 길고 더 가늘어지며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 실시양태에서, 액적은 폭보다 적어도 약 4배 더 길다. 마름모꼴 모양으로서 예상될 수 있는 이 액적 입체구조는 채널을 통해 매끄럽게 잘 유동한다. 더 좁은 채널에서 생성된 더 긴 액적은 더 높은 전단력을 제공하는데, 이것은 액적이 더 용이하게, 즉 더 적은 힘의 사용을 통해 유동으로부터 전단될 수 있거나 끊어질 수 있음을 의미한다. 액적은 또한 채널 표면에 부착하는 경향을 가질 수 있는데, 이것은 유동을 늦추거나 차단할 수 있거나, 난류를 생성할 수 있다. 액적 부착은 액적이 채널 크기와 관련하여 벗어날 만큼 충분히 거대할 때 극복된다. 따라서, 존재하는 경우 다양한 크기의 액적이 조합되어, 매끄러운 또는 층류 액적 유동을 야기하는 소위 임계 질량 또는 부피를 가진 균일한 액적을 형성할 수 있다. 폭보다 더 긴 액적, 예를 들면, 폭보다 약 4배 더 긴 액적은 일반적으로 채널 부착을 극복하고 미세유체 장치를 통해 자유롭게 이동하는 능력을 가진다. 따라서, 60 마이크론 채널을 가진 예시적인 실시양태에서, 전형적인 자유 유동 액적은 폭이 약 60 마이크론이고 길이가 240 마이크론이다. 액적 치수 및 유동 특성은 원하는 경우 부분적으로 채널 치수, 예를 들면, 채널 폭의 변경에 의해 영향을 받을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 장치는 원형의 단분산 액적을 생성한다. 일부 실시양태에서, 액적은 마이크로채널의 직경보다 더 작은, 즉 60 ㎛ 미만의 직경을 가진다. 단분산 액적은 예를 들면, 고처리량 장치, 및 고주파수에서 액적을 생성하는 것이 바람직한 다른 실시양태에서 특히 바람직할 수 있다.
샘플(예를 들면, 세포, 비리온 및 다른 입자 또는 분자) 또는 다른 물질이 채널 측면에 부착되는 것을 방지하기 위해, 채널(및 사용되는 경우 커버슬립)은 부착을 최소화하는 코팅을 가질 수 있다. 이러한 코팅은 장치의 제조에 사용된 물질에 내재할 수 있거나, 채널의 구조적 측면이 미세제작된 후 적용될 수 있다. "TEFLON"은 적합한 표면 성질을 가진 코팅의 일례이다. 대안적으로, 채널은 계면활성제로 코팅될 수 있다.
사용될 수 있는 계면활성제의 비제한적 예는 소르비탄 모노라우레이트(Span20), 소르비탄 모노팔미테이트(Span40), 소르비탄 모노스테아레이트(Span60) 및 소르비탄 모노올레에이트(Span80)를 포함하는 소르비탄 기제의 카르복실산 에스테르(예를 들면, "Span" 계면활성제, Fluka Chemika)와 같은 계면활성제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 비이온성 계면활성제의 다른 비제한적 예는 폴리옥시에틸렌화 알킬페놀(예를 들면, 노닐-, p-도데실-, 및 디노닐페놀), 폴리옥시에틸렌화 직쇄 알코올, 폴리옥시에틸렌화 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 머캡탄, 장쇄 카르복실산 에스테르(예를 들면, 천연 지방산의 글리세릴 및 폴리글리세릴 에스테르, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 폴리옥시에틸렌화 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리콜 에스테르 등) 및 알칸올아민(예를 들면, 디에탄올아민-지방산 축합물 및 이소프로판올아민-지방산 축합물)을 포함한다. 또한, 도데실황산나트륨(SDS)과 같은 이온성 계면활성제도 사용될 수 있다.
미세제작된 유동 채널 및 다른 구성요소를 함유하는 실리콘 기판은 투명한 커버, 예를 들면, 얇은 유리 또는 석영으로 덮여지고 밀봉될 수 있지만, 다른 투명한 또는 불투명한 커버 물질이 사용될 수 있다. 외부 복사원 또는 검출기가 이용될 때, 검출 영역은 세포에의 광학적 접근을 허용하기 위해 투명한 덮개 물질로 덮여질 수 있다. 예를 들면, "PYREX" 커버 슬립에의 애노드 결합은 두 구성요소들을 수성 H2SO4/H2O2 배쓰에서 세척하고 물로 헹군 다음, 예를 들면, 450V의 전압을 인가하면서 약 350℃까지 가열함으로써 달성될 수 있다.
스위칭 및 유동 제어는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 예를 들면, 밸브 및 펌프를 이용한 압력 구동 유동 제어를 이용하여 세포, 비리온, 입자, 분자, 효소 또는 시약의 유동을 하나 이상의 방향으로 및/또는 미세유체 장치의 하나 이상의 채널 내로 조작한다. 그러나, 전기삼투 유동 제어, 전기영동 및 유전영동과 같은 다른 방법도 단독으로 이용될 수 있거나 펌프 및 밸브와 함께 이용될 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 유동은 하나의 "정면" 방향으로, 예를 들면, 주 채널 및 분지 채널을 통해 주 입구 영역으로부터 출구 영역으로 이동한다. 다른 실시양태에서, 유동의 방향은 가역적이다. 본 개시내용에 따른 이 기법들의 적용은 예를 들면, 분류가 검출 영역에 배치될 수 있거나 검출 영역 바로 다음에 배치될 수 있는 식별 영역에서 또는 식별 영역 내에서 일어나기 때문에, 더 신속하고 정확한 분석 또는 분류 장치 및 방법을 제공한다. 이것은 분자 또는 세포가 이동하는 더 짧은 거리를 제공하고, 분자 또는 세포는 더 빨리 더 적은 난류로 이동할 수 있고, 단일 파일로, 즉 한 번에 하나씩 더 용이하게 이동하고 조사되고 분류될 수 있다. 가역적 실시양태에서, 잠재적 분류 오류는 예를 들면, 세포 또는 세포들을 특정 분지 채널에 회수 불가능하게 위탁하기 전에 분자, 세포 또는 비리온(또는 이들의 복수)을 다시 판독하거나 재분류하기 위해 유동을 역전시키고 늦춤으로써 피해질 수 있다.
임의의 이론에 의해 구속받지 않지만, 전기삼투는 2개 이상의 전극 사이에 전압차 또는 전하 구배를 적용함으로써, 이온을 함유하는 스트림, 예를 들면, 완충제와 같은 액체에서 움직임을 생성하는 것으로 여겨진다. 중성(비하전된) 분자 또는 세포(비리온을 포함함)는 스트림에 의해 운반될 수 있다. 전기삼투는 유동의 과정, 방향 또는 속도를 빠르게 변경하는 데 특히 적합하다. 전기영동은 유체 중의 하전된 물체가 유사한 전하를 가진 하나 이상의 전극으로부터 멀어지면서, 반대 전하를 가진 하나 이상의 전극을 향해 이동하게 하는 것으로 생각된다. 수성 층이 오일 층과 조합되는 본 개시내용의 실시양태에서, 수성 액적 캡슐화물은 오일에 의해 캡슐화되거나 서로 분리된다. 일부 실시양태에서, 오일 층은 전기 전도체가 아니고 전기삼투장으로부터 캡슐화물을 절연할 수 있다. 이 실시양태에서, 오일이 전기장을 전달하거나 전기장에 반응하도록 변형된 경우, 또는 오일이 물과 혼화될 수 없으나 전기장으로부터 물 층을 절연하지 않는 또 다른 층으로 대체된 경우, 전기삼투를 이용하여 캡슐화의 유동을 안내할 수 있다.
유전영동은 순 전하를 갖지 않으나 서로에 대해 양으로 또는 음으로 하전된 영역을 가진 유전 물체를 생성한다. 액적 및/또는 입자, 예컨대, 세포 또는 비리온을 포함하는 캡슐화의 존재 하에서 교류 불균질 전기장은 캡슐화물 및/또는 입자가 전기적으로 분극화됨으로써 유전영동력을 경험하게 한다. 입자 및 현탁 매질의 유전 분극성에 따라, 유전 입자는 높은 전계 강도 또는 낮은 전계 강도의 영역을 향해 이동할 것이다. 예를 들면, 살아있는 세포 및 비리온의 분극성은 그의 구성, 형태 및 표현형에 의해 좌우되고, 적용된 전기장의 주파수에 의해 크게 좌우된다. 따라서, 상이한 유형 및 상이한 생리학적 상태의 세포 및 비리온은 일반적으로 뚜렷하게 상이한 유전성을 가지며, 이것은 예를 들면, 차등 유전영동력에 의한 세포 분리를 위한 기반을 제공할 수 있다. 마찬가지로, 액적을 포함하는 캡슐화의 분극성은 그의 크기, 모양 및 구성에 의해서도 좌우된다. 예를 들면, 염을 함유하는 액적은 분극화될 수 있다. 단일 캡슐화의 개별 조작은 캡슐화물에 가까운 치수와 함께 전계 차이(불균질성)를 요구한다.
조작은 또한 현탁 매질을 가진 캡슐화물 및/또는 입자의 유전율(유전성)에 의해 좌우된다. 따라서, 중합체 입자, 살아있는 세포 및 비리온은 물에서 높은 전계 주파수에서 음성 유전영동을 보인다. 예를 들면, 물에서 0.5 MV/m 전계(20 마이크론 전극 갭의 경우 10V)에서 라텍스 구체가 경험하는 유전영동력은 3.4 마이크론 라텍스 구체의 경우 약 0.2 피코뉴턴(pN) 내지 15 마이크론 라텍스 구체의 경우 15 pN일 것으로 예측된다. 이 값은 스트림에서 구체가 경험하는 유체역학적 힘보다 대체로 더 크다(3.4 마이크론 구체의 경우 약 0.3 pN 및 15 마이크론 구체의 경우 1.5 pN). 따라서, 개별 세포 또는 입자의 조작은 유전영동을 이용함으로써 세포 분류기 장치와 같은 스트리밍 유체에서 달성될 수 있다. 통상의 반도체 기술을 이용하여, 전극을 기판 상에 미세제작하여 본 개시내용의 미세제작된 분류 장치에서 힘 장을 제어할 수 있다. 유전영동은 전기 전도체인 물체를 이동시키는 데 특히 적합하다. AC 전류는 이온의 영구적인 정렬을 방지하는 데 사용될 수 있다. 메가헤르츠 주파수는 상대적으로 긴 거리에 걸쳐 순 정렬, 인력 및 움직임을 제공하는 데 적합하다.
레이저와 같은 집속된 광선으로 내부에 함유된 물체, 예를 들면, 캡슐화, 액적 및 입자(분자, 세포, 비리온 등)를 편향시키고 이동시키기 위해 본 개시내용에서 복사 압력도 사용할 수 있다. 장치의 하나 이상의 채널 사이에 또는 본 개시내용의 방법에서 압력 차이 또는 구배를 제공함으로써 유동을 수득하고 제어할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 분자, 세포 또는 비리온(또는 분자, 세포 또는 비리온을 함유하는 액적)은 예를 들면, 온-오프 밸브를 사용한 직접적인 기계적 전환 또는 채널의 압착에 의해 이동될 수 있다. 압력 제어는 예를 들면, 출력 웰을 높이거나 낮추어 칩의 채널 내부의 압력을 변화시킴으로써 이용될 수도 있다. 상이한 전환 및 유동 제어 기작은 하나의 칩 또는 하나의 장치에서 조합될 수 있고 요구되는 경우 독립적으로 또는 함께 작동할 수 있다.
분류를 위한 검출 및 식별은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 검출기는 분자, 세포 또는 비리온이 검출 영역을 통과할 때 이를 조사하는 임의의 장치 또는 방법일 수 있다. 전형적으로, 분자, 세포 또는 비리온(또는 이러한 입자를 함유하는 액적)은 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있는 소정의 특성에 따라 분석되거나 분류되어야 하고, 검출기는 그 특성을 검출하도록 선택되거나 개조된다. 하나의 검출기는 공지되어 있는 기법을 이용함으로써 현미경에 의해 생성된 이미지 또는 정보를 처리하기 위해 컴퓨터 및/또는 다른 이미지 처리 또는 증강 장치와 커플링될 수 있는 현미경과 같은 광학 검출기이다. 예를 들면, 분자는 크기 또는 분자량별로 분석될 수 있고/있거나 분류될 수 있다. 효소는 기질의 화학 반응을 촉매작용하는 정도별로 분석될 수 있고/있거나 분류될 수 있다(반대로, 기질은 효소에 의해 촉매작용되는 화학 반응성의 수준별로 분석될 수 있고/있거나 분류될 수 있다). 세포 및 비리온은 광학 검출기를 이용하여 특정 단백질의 존재 또는 양의 광학적 표시에 대해 각각의 세포 또는 비리온을 조사함으로써 이들이 그 단백질을 함유하거나 생성하는지에 따라 분류될 수 있다. 단백질 그 자체는, 예를 들면, 특징적인 형광에 의해 검출될 수 있거나, 원하는 단백질이 존재하거나 적어도 역치 양으로 존재할 때 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터로 라벨링될 수 있거나 이러한 리포터와 회합될 수 있다. 분류될 관심 있는 특성 또는 특성들이 원하는 특성(들)을 가진 세포를 그렇지 않은 세포로부터 식별할 정도로 충분히 확인될 수 있고 검출될 수 있거나 측정될 수 있는 한, 세포 또는 비리온의 표면 특성 및 세포내 특성을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 본 개시내용의 기법을 이용함으로써 확인될 수 있거나 측정될 수 있는 특성의 종류 또는 수에는 제한이 없다. 예를 들면, 본원에 기재된 임의의 표지 또는 리포터는 분자 또는 세포(비리온을 포함함)를 분석하고/하거나 분류하기 위한, 즉 수집될 분자 또는 세포를 검출하기 위한 기반으로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플(또는 이를 함유하는 캡슐화)은 이들이 장치에서 검출 윈도우 또는 "검출 영역"을 통과할 때 이들과 결합되거나 회합된 광학적으로 검출 가능한 리포터로부터의 신호의 강도에 기반하여 분석되고/되거나 분리된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 검출 가능한 리포터로부터의 신호의 강도에 기반하여 분석되고/되거나 분리된다. 선택된 역치에 있거나 선택된 범위 내에 있는 리포터의 양 또는 수준을 가진 분자 또는 세포 또는 비리온은 장치의 소정의 출구 또는 분지 채널 내로 방향전환된다. 리포터 신호는 현미경에 의해 수집될 수 있고 광전자증배관(PMT)에 의해 측정될 수 있다. 컴퓨터는 PMT 신호를 디지털화하고 밸브 작동 또는 전기삼투 전위를 통해 유동을 제어한다. 대안적으로, 신호는 예를 들면, 반드시 분자 또는 세포 분류를 진행할 필요 없이 평가 목적으로 리포터 및/또는 이의 상응하는 특성 또는 마커의 척도로서 기록될 수 있거나 정량될 수 있다.
한 실시양태에서, 칩은 도립 광학 현미경 상에 장착된다. 리포터에 의해 생성된 형광은 검출 영역을 통과하는 분자(예를 들면, DNA, 단백질, 효소 또는 기질) 또는 세포에 초점을 맞춘 레이저 빔의 사용을 통해 여기된다. 형광 리포터는 나열하자면, 예를 들면, 로다민, 플루오레세인, 텍사스 레드, Cy3, Cy5, 파이코빌리프로테인(phycobiliprotein), 녹색 형광 단백질(GFP), YOYO-1 및 PicoGreen을 포함한다. 분자 핑거프린팅 적용에서, 리포터 표지는 임의적으로 형광 라벨링된 단일 뉴클레오타이드, 예컨대, 플루오레세인-dNTP, 로다민-dNTP, Cy3-dNTP 등이고; 이때 dNTP는 dATP, dTTP, dUTP 또는 dCTP를 나타낸다. 리포터는 화학적으로 변형된 단일 뉴클레오타이드, 예컨대, 바이오틴-dNTP일 수도 있다. 다른 실시양태에서, 리포터는 형광 또는 화학적으로 라벨링된 아미노산 또는 항체(세포 또는 바이러스에 의해 발현되거나 표시될 때 특정 항원 또는 이의 단편에 결합함)일 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면에서, 장치는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기계를 이용하는 현재 이용되는 방식과 유사한 방식으로, 검출 가능한 리포터가 결합되어 있는 선택된 세포 마커, 예컨대, 세포 표면 마커의 발현 수준을 기반으로 세포 또는 비리온을 분석할 수 있고/있거나 분류할 수 있다. 세포 내부에 있고 반드시 세포 표면에 나타날 필요가 없는 단백질 또는 다른 특성도 확인할 수 있고 분류를 위한 기반으로서 사용할 수 있다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 장치는 검출 영역을 통과하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(효소 및 다른 단백질을 포함함) 또는 이의 단편과 같은 분자의 크기 또는 분자량을 측정할 수 있다. 대안적으로, 장치는 리포터에 의해 표시된 일부 다른 특성의 존재 또는 정도를 확인할 수 있다. 원하는 경우, 이 분석을 기반으로 세포, 비리온 또는 분자를 분류할 수 있다. 분류된 세포, 비리온 또는 분자는 출구 채널로부터 수집될 수 있고 필요에 따라 사용될 수 있다.
리포터를 검출하거나 분자, 세포 또는 비리온이 원하는 특성을 갖는지를 확인하기 위해, 검출 영역은 측정 가능한 광 에너지를 방출하도록 그 특성에 대한 리포터를 자극하는 장비, 예를 들면, 레이저, 레이저 다이오드, 고강도 램프(예를 들면, 수은 램프) 등과 같은 광원을 포함할 수 있다. 램프가 사용되는 실시양태에서, 채널은 검출 영역을 제외한 모든 영역에서 광으로부터 차폐될 수 있다. 레이저가 사용되는 실시양태에서, 레이저는 상이한 분석 유닛으로부터의 검출 영역 세트 전체에 걸쳐 스캔하도록 설정될 수 있다. 또한, 레이저 다이오드는 분석 유닛을 함유하는 동일한 칩으로 미세제작될 수 있다. 대안적으로, 레이저 다이오드는 다이오드로부터의 레이저 광이 검출 영역(들)에 비추도록 미세제작된 분석 또는 분류기 칩에 인접하게 배치되는 제2 칩(즉, 레이저 다이오드 칩)에 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 통합된 반도체 레이저 및/또는 통합된 포토다이오드 검출기는 검출 영역의 근처에서 실리콘 웨이퍼 상에 포함된다. 이 디자인은 소형화, 및 여기 및/또는 방출된 복사를 위한 더 짧은 광학 경로라는 이점을 제공함으로써, 왜곡을 최소화한다.
분류 체계는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 본 개시내용에 따르면, 분자 또는 입자와 관련된 특성, 마커 또는 리포터의 검출 또는 측정을 기반으로 분자(예컨대, DNA, 단백질, 효소 또는 기질) 또는 입자(즉, 비리온을 비롯한 세포)를 미시적 차원의 유동 스트림에서 동역학적으로 분류한다. 보다 구체적으로, 분자, 세포 또는 비리온의 샘플을 함유하는 용액(예를 들면, 수용액 또는 완충제)의 캡슐화물을, 액적 압출 영역을 통해 주 채널 내의 유체(예를 들면, 비극성 유체, 예컨대, 데칸 또는 다른 오일)의 스트림 내로 도입한다. 그 다음, 개별 액적 캡슐화물을 유동 스트림에서 분석하고/하거나 분류함으로써, 액적 내에 함유된 분자, 세포 또는 비리온을 분류한다.
주 채널 내의 유동 스트림은 전형적으로 연속적이나 반드시 연속적일 필요는 없고 정지되고 시작될 수 있거나, 역전될 수 있거나 속도가 변경될 수 있다. 분류 전에, 장치를 수화시키고 사용할 준비를 하기 위해 샘플 분자, 세포 또는 비리온을 함유하지 않는 액체를 샘플 입구 영역(예컨대, 입구 웰 또는 채널) 내로 도입할 수 있고, 예를 들면, 모세관 작용으로 액적 압출 영역을 통과시킬 수 있다. 마찬가지로, 장치를 퍼지하고(예를 들면, 또는 "죽은" 공기) 사용할 준비를 하기 위해, 완충제 또는 오일을 주 채널과 직접 연통하는 주 입구 영역 내로 도입할 수 있다. 원하는 경우, 예를 들면, 완충제 또는 오일을 출구 영역에 첨가하여 압력을 조절할 수 있거나 균등화할 수 있다.
액적 압출 영역에서 압력은 예를 들면, 주 입구 및 샘플 입구 내로의 가압된 주입기 공급으로 주 입구 및 샘플 입구에 대한 압력을 조절함으로써 조절될 수도 있다. 액적 압출 영역에서 오일 공급원과 물 공급원 사이의 압력 차이를 제어함으로써, 생성된 액적의 크기 및 주기성을 조절할 수 있다. 대안적으로, 밸브는 액적 압출 영역 내로의 용액의 유동을 제어하기 위해 액적 압출 영역 또는 이에 연결된 샘플 입구에 배치되거나 이러한 영역 또는 입구와 일치하도록 배치됨으로써, 액적의 크기와 주기성을 제어할 수 있다. 주기성 및 액적 부피는 채널 직경, 유체의 점도 및 전단 압력에 의해서도 좌우될 수 있다.
액적 형성 액체는 전형적으로 수성 완충제 용액, 예컨대, 초순수 물(예를 들면, 컬럼 크로마토그래피에 의해 수득된 18 메가-옴 저항성), 10 mM Tris HCl 및 1 mM EDTA(TE) 완충제, 포스페이트 완충제 식염수(PBS) 또는 아세테이트 완충제이다. 분석되고/되거나 분류될 분자, 세포 또는 비리온의 집단과 생리학적으로 호환될 수 있는 임의의 액체 또는 완충제를 사용할 수 있다. 주 채널을 통과하고 액적이 형성되는 유체는 바람직하게는 액적 형성 유체와 혼화될 수 없는 유체이다. 일부 실시양태에서, 주 채널을 통과하는 유체는 비극성 용매, 예를 들면, 데칸(예를 들면, 테트라데칸 또는 헥사데칸) 또는 또 다른 오일이다.
본 개시내용에 사용된 유체는 표면 장력을 감소시키는 작용제(계면활성제)와 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 Tween, Span, 플루오르화 오일, 및 물에 비해 오일에 용해되는 다른 작용제를 포함한다. 계면활성제는 예를 들면, 액적을 교차 채널 내로 압출하거나 주입하는 데 필요한 전단력을 감소시킴으로써 액적 크기, 유동 및 균일성을 제어하거나 최적화하는 데 도움이 될 수 있다. 이것은 액적 부피와 주기성, 또는 액적이 교차 채널 내로 분리되는 속도 또는 빈도에 영향을 미칠 수 있다.
본 개시내용의 채널은 실리콘 탄성중합체(예를 들면, RTV), 우레탄 조성물, 실리콘-우레탄 합성물, 예컨대, 폴리머 테크놀로지 그룹(Polymer Technology Group)(캘리포니아주 버클리 소재)으로부터 입수 가능한 합성물, 예를 들면, PurSil™ 및 CarboSil™로부터 형성될 수 있다. 채널은 첨가제 또는 작용제, 예컨대, 계면활성제, TEFLON 또는 플루오르화 오일, 예컨대, 옥타데카플루오로옥탄(98%, Aldrich) 또는 플루오로노난으로 코팅될 수도 있다. TEFLON은 소수성을 띠고 유리하게는 물을 흡수하지 않으나 오일 층에 노출될 때 팽창하는 경향을 가질 수 있는 실리콘 탄성중합체(RTV) 채널에 특히 적합하다. 팽창은 채널 치수와 모양을 바꿀 수 있으며, 예를 들면, 탄성중합체와 커버슬립 사이의 밀봉에 응력을 가함으로써 채널을 닫을 수 있거나 칩의 무결성에 영향을 미칠 수 있다. 우레탄 기판은 오일에서 팽창하는 경향을 갖지 않으나 친수성을 띠고, 바람직하지 않게는 물을 흡수할 수 있으며, 더 높은 작동 압력을 사용하는 경향을 가진다. 소수성 코팅을 사용하여 물 흡수를 감소시킬 수 있거나 제거할 수 있다. 흡수 또는 팽창 문제는 압력 또는 액적 빈도를 바꾸거나 최적화함으로써(예를 들면, 주기성을 증가시켜 흡수를 감소시킴으로써) 해결될 수도 있다. RTV-우레탄 하이브리드는 실리콘의 소수성과 우레탄의 친수성을 조합하는 데 사용될 수 있다.
샘플의 액적을 주 채널 내로 도입하는 2개 이상의 액적 형성 영역이 있는 본 개시내용의 실시양태도 제공한다. 예를 들면, 제1 액적 압출 영역은 제1 샘플의 액적을 주 채널 내의 유체(예를 들면, 오일)의 유동 내로 도입할 수 있고, 제2 액적 압출 영역은 제2 샘플의 액적을 주 채널 내의 유체의 유동 내로 도입할 수 있다. 임의적으로, 제2 액적 압출 영역은 제1 액적 압출 영역으로부터 다운스트림(예를 들면, 약 30 ㎛)에 있다. 한 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 액적 압출 영역 내로 도입된 유체는 동일한 유체 또는 동일한 유형의 유체(예를 들면, 상이한 수용액)를 포함한다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 효소를 함유하는 수용액의 액적은 제1 액적 압출 영역에서 주 채널 내로 도입되고, 효소에 대한 기질을 함유하는 수용액의 액적은 제2 액적 압출 영역에서 주 채널 내로 도입된다. 상이한 압출 영역을 통한 액적의 도입은 예를 들면, 액적이 조합되도록(예를 들면, 효소가 기질의 화학 반응을 촉매작용할 수 있도록) 제어될 수 있다. 대안적으로, 상이한 액적 압출 영역에서 도입된 액적은 호환 가능하거나 호환 불가능한 상이한 유체의 액적일 수 있다. 예를 들면, 상이한 액적은 상이한 수용액일 수 있거나, 제1 액적 압출 영역에서 도입된 액적은 하나의 유체(예를 들면, 수용액)의 액적일 수 있는 반면, 제2 액적 압출 영역에서 도입된 액적은 또 다른 유체(예를 들면, 알코올 또는 오일)일 수 있다.
액적에 있는 스캐폴드, 분자, 세포 또는 비리온의 농도(즉, 수)는 분류에 효율적으로 영향을 미칠 수 있으므로 최적화될 수 있다. 특히, 샘플 농도는 액적의 대부분이 하나 이하의 단일 스캐폴드, 분자, 세포 또는 비리온을 함유할 정도로 충분히 희석되어야 하며, 이때 액적이 2개 이상의 분자, 세포 또는 비리온을 함유할 통계적 가능성은 작을 뿐이다. 일부 실시양태에서, 샘플 농도는 단일 세포가 단일 스캐폴드와 함께 캡슐화되도록 하는 농도이어야 한다. 이것은 대부분의 측정의 경우 액적이 검출 영역을 통과할 때 각각의 액적에서 측정된 리포터의 수준이 단일 분자, 세포 또는 비리온에 상응하고 2개 이상의 분자, 세포 또는 비리온에 상응하지 않게 하기 위한 것이다. 추가로, 단일 세포 또는 비리온이 오로지 단일 인코딩된 이펙터 스캐폴드와 함께 캡슐화되도록 보장하는 것은 양성 "히트"가 정확한 이펙터와 정확한 상관관계를 갖도록 보장한다.
이 관계를 좌우하는 파라미터는 액적의 부피, 및 샘플 용액 중의 분자, 세포 또는 비리온의 농도이다. 액적이 2개 이상의 스캐폴드, 분자, 세포 또는 비리온을 함유할 확률(
Figure pct00006
)은 하기 식으로서 표현될 수 있다:
Figure pct00007
상기 식에서, "[비리온]"은 입방 마이크론(㎛3)당 분자, 세포 또는 비리온 수 단위의 분자, 세포 또는 비리온의 농도이고, V는 ㎛3 단위의 액적 부피이다.
샘플 용액에서 스캐폴드, 분자, 세포 또는 비리온의 농도를 감소시킴으로써
Figure pct00008
를 최소화할 수 있음이 인식될 것이다. 그러나, 샘플 용액 중의 분자, 세포 또는 비리온의 농도를 감소시키는 것은 또한 장치를 통해 처리되는 용액의 부피를 증가시키고, 실행 시간을 늘릴 수 있다. 따라서, 액적 중의 많은 분자, 세포 또는 비리온의 존재를 최소화하고(이로써 분류의 정확도를 증가시킴) 샘플의 부피를 감소시킴으로써, 허용되는 농도의 분자, 세포 또는 비리온을 함유하는 적당한 부피로 적당한 시간 이내에 샘플이 분류될 수 있게 하는 것이 바람직하다.
최대 허용
Figure pct00009
는 분류된 샘플의 원하는 "순도"에 의해 좌우된다. 이 경우 "순도"는 원하는 특성(예를 들면, 특정 항원을 표시하거나, 특정된 크기 범위 내에 있거나, 특정 유형의 분자, 세포 또는 비리온임)을 가진 분류된 분자, 세포 또는 비리온의 비율을 지칭한다. 분류된 샘플의 순도는
Figure pct00010
에 반비례한다. 예를 들면, 고순도가 필요하지 않거나 요구되지 않는 적용에서 비교적 높은
Figure pct00011
(예를 들면,
Figure pct00012
=0.2)가 허용될 수 있다. 대부분의 적용에서,
Figure pct00013
를 약 0.1 이하 또는 약 0.01 이하로 유지하는 것은 만족스러운 결과를 제공한다.
적합한 담체 유체(예컨대, 전술된 액체 또는 완충제) 중의 분자, 세포 또는 비리온의 혼합물 또는 집단을 함유하는 샘플 용액은 샘플 입구 영역에 공급되고, 샘플 용액의 액적은 액적 압출 영역에서 주 채널을 통과하는 유동 내로 도입된다. 유동의 힘과 방향은 유동을 제어하는 임의의 원하는 방법, 예를 들면, 압력 차이, 밸브 작동 또는 전기삼투 유동(예를 들면, 입구 및 출구 채널에서 전극에 의해 생성됨)에 의해 제어될 수 있다. 이것은 세포가 하나 이상의 원하는 분지 채널 또는 출구 영역 내로 이동할 수 있게 한다.
본 개시내용에 따르면, "정방향" 분류 알고리즘은 액적 내의 분자, 세포 또는 비리온의 측정 가능한 리포터의 수준이 미리 설정된 역치를 초과할 때까지, 액적 압출 영역으로부터의 액적이 장치를 통해 소정의 분지 또는 출구 채널("폐기물 채널"로서 지칭될 수 있음)까지 유동하는 실시양태를 포함한다. 그 때, 유동은 액적(및 그 안에 함유된 스캐폴드, 분자, 세포 및/또는 비리온)을 또 다른 채널에 전달하도록 방향전환된다. 예를 들면, 전환이 사실상 즉각적이고 처리량이 최고 전압에 의해 제한되는 전기삼투 실시양태에서, 전압을 일시적으로 바꾸어, 선택된 액적을 또 다른 소정의 출구 채널("수집 채널"로서 지칭될 수 있음)로 방향전환시킨다. 리포터의 검출 및 유동의 방향전환을 동시에 일어나게 하는 것을 포함하는 분류는 컴퓨터 또는 마이크로프로세서 제어를 포함하는 다양한 방법에 의해 제어될 수 있다. 미세유체 장치에서 분류를 위한 상이한 알고리즘은 기존 FACS 장치에 사용되는 프로그램과 같은 상이한 컴퓨터 프로그램에 의해 실행될 수 있다. 예를 들면, 프로그래밍 가능한 카드, 예컨대, 내이셔날 인스트루먼츠(National Instruments)(텍사스주 오스틴 소재)로부터 입수될 수 있는 Lab PC 1200 카드는 전환을 제어하는 데 사용될 수 있다. 분류 절차와 같은 알고리즘은 C++, LAB VIEW 또는 임의의 적합한 소프트웨어를 사용함으로써 프로그래밍될 수 있다.
예를 들면, 전환 속도가 제한될 수 있는 실시양태에서, "정방향" 모드 대신에 "가역적" 분류 알고리즘이 사용될 수 있다. 예를 들면, 압력 전환 방식이 전기삼투 유동 대신에 이용될 수 있고 고전압을 요구하지 않으며 더 긴 작동을 위해 더 견고할 수 있다. 그러나, 기계적 제약은 유체 전환 속도가 속도 제한이 되게 할 수 있다. 압력 전환 방식에서, 관심 있는 분자, 세포 또는 비리온이 액적 내에서 검출될 때 유동이 정지된다. 유동이 정지될 때까지, 분자, 세포 또는 비리온을 함유하는 액적은 연접부 또는 분지점을 지날 수 있고 폐기물 채널 쪽으로 내려가는 길의 부분일 수 있다. 이 상황에서, 가역적 실시양태가 사용될 수 있다. 시스템은 더 느린(전환 가능한) 속도로(예를 들면, 폐기물부터 입구까지) 역방향으로 작동될 수 있고, 그 후 액적은 상이한 분지 또는 수집 채널 쪽으로 전환된다. 그 시점에서, 잠재적으로 잘못 분류된 액적(및 그 안의 분자, 세포 또는 비리온)은 "저장"되고, 장치는 정방향으로 다시 고속으로 작동될 수 있다. 이 "가역적" 분류 방법은 표준 FACS 기계에 의해서는 불가능하다. FACS 기계는 방향을 재안내하기 위해 주로 챔버로 되돌아 갈 수 없는 에어로졸 액적을 분류한다. 에어로졸 액적 분류기는 사실상 비가역적이다. 가역적 분류는 임의의 플루이딕 장치에 내재하는 오류의 한계로 인해 잘못 안내될 수 있는, 드물거나(예를 들면, 분자 진화 및 암 세포학적 확인에서) 수가 적은 분자, 세포 또는 비리온을 확인하는 데 특히 유용하다. 본 개시내용의 장치의 가역성은 이 가능한 오류의 감소를 허용한다.
추가로, "가역적" 분류 방법은 단일 액적 내에 함유된 분자, 세포 또는 비리온의 다회 시간 경과 측정을 가능하게 한다. 이것은 세포를 상이한 채널 내로 재안내하기 전에 유동이 세포를 다시 검출 윈도우 내로 되돌려 보내기 때문에 상이한 시간에서 동일한 분자, 세포 또는 비리온을 관찰할 수 있게 하거나 측정할 수 있게 한다. 따라서, 측정치를 비교하거나 확인할 수 있고, 시간에 따른 성질의 변화를 예를 들면, 동역학 연구에서 조사할 수 있다.
샘플에서 스캐폴드, 분자, 세포 또는 비리온을 스캐폴드, 분자, 세포 또는 비리온의 총수에 대한 매우 낮은 비로 분리하고자 할 때, 장치의 고유 전환 속도에 의해 제한되지 않는 분류 알고리즘이 실행될 수 있다. 결과적으로, 액적은 입구 채널부터 폐기물 채널까지 가능한 가장 높은 정적(비전환) 속도로 유동한다. 원치 않는 액적(즉, 원치 않는 분자, 세포 또는 비리온을 함유함)은 가능한 가장 높은 속도로 폐기물 채널 내로 안내될 수 있고, 원하는 분자, 세포 또는 비리온을 함유하는 액적이 검출될 때, 유동은 느려진 후 역전되어, 액적을 검출 영역 내로 다시 안내할 수 있고, 액적은 이 영역으로부터 재안내될 수 있다(즉, 효율적인 전환을 달성하기 위함). 따라서, 액적(및 그 안에 함유된 분자, 세포 또는 비리온)은 가능한 가장 높은 정적 속도로 유동할 수 있다.
본원은 온도, pH 및 농도와 같은 변수를 제어하는 방법을 제공한다. 이것은 2개의 수성 스트림을 수렴하여 액적을 형성함으로써 달성될 수 있고, 이때 예를 들면, 제1 수성 스트림은 액적에서 요구된 구성요소 "A"의 농도의 2배를 함유할 것이고 제2 수성 스트림은 액적에서 요구된 구성요소 "B"의 농도의 2배를 함유할 것이므로, 상기 스트림들이 병합할 때 이들은 "A" 및 "B" 둘 다의 1배 용액을 형성할 것이다. 상이한 농도의 시약과 수렴하는 수성 스트림의 상이한 비 또한 샘플, 스캐폴드 및/또는 시약의 원하는 최종 농도에 도달하는 데 이용될 수 있다. 액적에서의 농도는 각각의 수성 스트림 중의 구성요소의 농도가 얼마인지를 확인함으로써 제어된다. 이 개념은 pH, 염, 농도 등에 적용될 수 있다. 온도 제어를 위해, 투명한 단(stage)을 이용하여 칩을 원하는 온도까지 가열할 수 있다.
액적을 포함하는 유체 및 액적을 운반하는 유체(즉, 수성 유체 및 비극성 유체) 둘 다가 비교적 낮은 레이놀드 수(Reynolds Number), 예를 들면, 10 내지 2를 가질 수 있다. 레이놀드 수는 주어진 길이의 채널에서 유체의 밀도 및 속도와 그의 점도 사이의 역 관계를 표시한다. 점성이 더 높고 덜 조밀하고 더 느리게 이동하는 유체는 더 짧은 거리에 걸쳐 더 낮은 레이놀드 수를 가질 것이고, 난류 없이 방향전환되거나, 정지되거나, 시작되거나 역전되기 더 쉽다. 작은 크기와 느린 속도 때문에, 미세제작된 유체 시스템은 종종 낮은 레이놀드 수 레짐(regime)(Re<<1)에 있다. 이 레짐에서, 난류 및 2차 유동을 야기하는 관성 효과는 무시할 수 있고; 점성 효과는 동역학보다 우세하다. 이 조건은 분류에 유리하고, 본 개시내용의 미세제작된 장치에 의해 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 미세제작된 장치는 임의적으로 낮은 또는 매우 낮은 레이놀드 수에서 작동된다.
한 측면에서, 본원은 액적 기반 인코딩된 라이브러리 스크리닝을 위해 디자인된 미세유체 장치를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 장치는 수성 유체를 포함하는 제1 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 장치는 수성 스트림과 혼화될 수 없는 유체를 포함하는 제2 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 장치는 제1 미세유체 채널이 제2 미세유체 채널과 유체 연통하는 연접부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부는 장치 평면을 한정한다. 일부 실시양태에서, 상기 연접부는 제2 미세유체 채널로부터의 유체 내에서 수성 유체의 액적을 형성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 미세유체 채널은 연접부를 지나 계속됨으로써 어세이 유동 경로를 한정하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 내부에 액적을 가진 제2 미세유체 채널로부터의 유체는 어세이 유동 경로를 한정하는 제3 미세유체 채널에서 연접부를 지나 이동한다. 어세이 유동 경로는 인큐베이션 영역으로서도 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하기 위한 절단 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 검출 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 분류 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 자극 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 제3 미세유체 채널을 포함한다. 제3 미세유체 채널은 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부의 업스트림에서 제1 미세유체 채널과 유체 연통할 수 있다. 이 제3 미세유체 채널을 이용하여 액적 형성 전에 추가 수성 유체를 제1 수성 유체와 혼합함으로써, 액적이 형성되기 직전에 상이한 시약 세트가 혼합될 수 있게 한다.
제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부는 제2 미세유체 채널의 비혼화성 유체에 캡슐화된 수성 액적을 생성하도록 구성된다. 이 연접부는 임의의 구성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 연접부는 T-연접부이다. 일부 실시양태에서, 연접부는 비스듬한 각도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 연접부는 보충 미세유체 채널을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 보충 미세유체 채널은 수성 스트림과 혼화될 수 없는 제2 유체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 스트림과 혼화될 수 없는 제2 유체는 제2 미세유체 채널로부터의 수성 스트림과 혼화될 수 없는 유체와 동일하다. 일부 실시양태에서, 수성 스트림과 혼화될 수 없는 제2 유체는 제2 미세유체 채널로부터의 수성 스트림과 혼화될 수 없는 유체와 상이하다. 일부 실시양태에서, 제2 미세유체 채널 및 보충 미세유체 채널은 제1 미세유체 채널의 반대쪽에 위치한다. 일부 실시양태에서, 제2 미세유체 채널 및 보충 미세유체 채널은 수성 스트림과 혼화될 수 없는 그들 각각의 유체를 동시에 첨가하도록 구성된다.
연접 후, 제2 미세유체 채널의 유동 경로는 적어도 짧은 거리 동안 동일한 궤적을 따라 계속될 수 있다. 액적 형성 후, 연접부의 다운스트림에 있는 채널은 어세이 유동 경로를 형성한다. 어세이 유동 경로는 스크리닝 어세이가 액적에서 수행되는 미세유체 채널의 경로이다. 액적이 이 어세이 유동 경로를 따라 계속될 때, 검출 가능한 판독값을 가진 어세이가 액적 내에서 일어날 수 있게 하는 순서로 추가 유닛 작업을 액적에 대해 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 절단 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 검출 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 분류 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 자극 영역을 포함한다.
어세이 유동 경로는 임의의 모양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 인큐베이션 영역으로서 작용하여, 어세이가 원하는 시간에 걸쳐 수행될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 구불구불한 경로 영역을 포함한다. 구불구불한 경로 영역은 복수의 곡선 또는 회전을 함유할 수 있다. 이러한 경로는 연장된 유동 경로가 작은 크기의 장치에 내장될 수 있게 한다. 추가로, 유동 경로의 곡선은 경로를 따라 이동할 때 액적 내로의 다양한 유입물의 배경 신호, 크로스-토크(cross-talk) 또는 블리드 쓰루(bleed through)를 최소화하는 방식으로 다양한 검출기, 자극기, 분류기 또는 다른 구성요소를 배향시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 구불구불한 경로의 곡선 또는 회전을 따라 유닛 작업의 다양한 유입물을 배향시킴으로써 달성된다. 이것은 유동 경로를 따라 이동할 수 있는 유입물의 양을 최소화한다. 예를 들면, 유동 경로의 곡선 또는 회전을 따라 위치에서 광을 유입하도록 광원을 구성하는 것은 경로를 따라 이동하고 방출의 표적이 아닌 액적에 도달할 광을 최소화한다.
구불구불한 경로 영역은 임의의 길이의 미세유체 장치일 수 있고 임의의 수의 곡선 또는 회전을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 유동 경로 영역은 약 10개의 곡선 내지 약 100개의 곡선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 유동 경로 영역은 약 10개의 곡선 내지 약 20개의 곡선, 약 10개의 곡선 내지 약 30개의 곡선, 약 10개의 곡선 내지 약 40개의 곡선, 약 10개의 곡선 내지 약 50개의 곡선, 약 10개의 곡선 내지 약 100개의 곡선, 약 20개의 곡선 내지 약 30개의 곡선, 약 20개의 곡선 내지 약 40개의 곡선, 약 20개의 곡선 내지 약 50개의 곡선, 약 20개의 곡선 내지 약 100개의 곡선, 약 30개의 곡선 내지 약 40개의 곡선, 약 30개의 곡선 내지 약 50개의 곡선, 약 30개의 곡선 내지 약 100개의 곡선, 약 40개의 곡선 내지 약 50개의 곡선, 약 40개의 곡선 내지 약 100개의 곡선, 또는 약 50개의 곡선 내지 약 100개의 곡선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 유동 경로 영역은 약 10개의 곡선, 약 20개의 곡선, 약 30개의 곡선, 약 40개의 곡선, 약 50개의 곡선, 또는 약 100개의 곡선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 유동 경로 영역은 적어도 약 10개의 곡선, 약 20개의 곡선, 약 30개의 곡선, 약 40개의 곡선, 또는 약 50개의 곡선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 유동 경로 영역은 최대 약 20개의 곡선, 약 30개의 곡선, 약 40개의 곡선, 약 50개의 곡선, 또는 약 100개의 곡선을 포함한다.
일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 어세이 유동 경로 내에 배치된 하나 이상의 챔버를 포함한다. 일부 실시양태에서, 챔버 중 하나 이상의 챔버는 입구 및 출구 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 입구 미세유체 채널은 업스트림 위치에 있고 출구 미세유체 채널은 챔버의 다운스트림 위치에 있다. 일부 실시양태에서, 입구 미세유체 채널과 출구 미세유체 채널은 챔버 사이의 연결 채널로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로를 통해 이동하는 각각의 액적은 하나 이상의 챔버를 통해 이동한다. 일부 실시양태에서, 챔버는 액적이 어세이 유동 경로를 통해 유동할 때 액적의 유속을 조절하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 챔버는 액적이 어세이 유동 경로를 통해 유동할 때 액적의 체류 시간을 조절하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 챔버는 입구 및 출구 미세유체 채널을 포함하지 않는다(예를 들면, 챔버 사이에 연결 채널이 없음). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 챔버는 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 챔버는 구불구불한 어세이 유동 경로를 형성하도록 배열된다.
원하는 챔버 및 어세이 유동 경로 기하구조를 선택할 때 추가 디자인 고려 사항을 유념할 수 있다. 예를 들면, 비혼화성 담체 유체의 특성은 장치에서 수행되는 특정 어세이에 대한 챔버 또는 채널 기하구조의 적합성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 점도가 높은 비혼화성 담체 유체는 장치 상에서의 유동에 대한 더 큰 저항에 기여하므로, 상당한 길이의 좁은 채널 또는 챔버를 사용하는 장치 유동 경로 기하구조와 덜 호환될 수 있다. 그러나, 장치의 채널 또는 챔버의 확장은 챔버 또는 채널을 통해 이동하는 액적의 분산을 증가시킴으로써, 장치를 통해 이동하는 개별 액적에 대한 인큐베이션 시간의 높은 편차를 초래할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 장치가 저점도 비혼화성 담체 유체, 예컨대, 3-에톡시퍼플루오로(2-메틸헥산)에 의해 작동되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 장치는 특정 비혼화성 담체 유체로 체류 시간, 적당한 유동 압력 및 분산 비와 같은 특성을 최적화하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 장치는 점도가 낮은 저밀도(예를 들면, 1.00 g/㎖ 미만) 비혼화성 담체 유체를 사용함으로써 최적으로 작동하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 장치는 비혼화성 담체 유체로서 3-에톡시퍼플루오로(2-메틸헥산)을 사용함으로써 최적으로 작동하도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, 챔버는 액적이 유동 경로를 통해 이동할 때 액적의 포획을 방지하도록 구성된다. 수성 액적보다 더 조밀한 담체 유체(예를 들면, 3-에톡시퍼플루오로(2-메틸헥산))가 사용되는 실시양태에서, 수성 액적은 넓어지고 높아진 챔버의 상단까지 올라갈 수 있고, 액적 및 담체 유체가 장치를 통해 유동할 때 챔버 내에서 포획될 수 있다. 이에 대응하기 위해, 일부 실시양태에서, 챔버 및 입구 및/또는 출구 미세유체 채널은 챔버와 연결 채널 사이의 채널 높이에서 작은 차이만을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 챔버와 출구 채널 사이의 높이는 채널의 폭이 유동 경로를 따라 좁아진 후 변경되지 않는다. 채널의 폭을 좁힌 후에만 높이를 조절함으로써, 액적이 원하는 경로를 따라 유동하고 포획되지 않게 될 경향이 더 크다.
일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 단지 약간 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.1배 내지 약 3배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 3배 내지 약 2.5배, 약 3배 내지 약 2배, 약 3배 내지 약 1.9배, 약 3배 내지 약 1.8배, 약 3배 내지 약 1.7배, 약 3배 내지 약 1.6배, 약 3배 내지 약 1.5배, 약 3배 내지 약 1.4배, 약 3배 내지 약 1.3배, 약 3배 내지 약 1.2배, 약 3배 내지 약 1.1배, 약 2.5배 내지 약 2배, 약 2.5배 내지 약 1.9배, 약 2.5배 내지 약 1.8배, 약 2.5배 내지 약 1.7배, 약 2.5배 내지 약 1.6배, 약 2.5배 내지 약 1.5배, 약 2.5배 내지 약 1.4배, 약 2.5배 내지 약 1.3배, 약 2.5배 내지 약 1.2배, 약 2.5배 내지 약 1.1배, 약 2배 내지 약 1.9배, 약 2배 내지 약 1.8배, 약 2배 내지 약 1.7배, 약 2배 내지 약 1.6배, 약 2배 내지 약 1.5배, 약 2배 내지 약 1.4배, 약 2배 내지 약 1.3배, 약 2배 내지 약 1.2배, 약 2배 내지 약 1.1배, 약 1.9배 내지 약 1.8배, 약 1.9배 내지 약 1.7배, 약 1.9배 내지 약 1.6배, 약 1.9배 내지 약 1.5배, 약 1.9배 내지 약 1.4배, 약 1.9배 내지 약 1.3배, 약 1.9배 내지 약 1.2배, 약 1.9배 내지 약 1.1배, 약 1.8배 내지 약 1.7배, 약 1.8배 내지 약 1.6배, 약 1.8배 내지 약 1.5배, 약 1.8배 내지 약 1.4배, 약 1.8배 내지 약 1.3배, 약 1.8배 내지 약 1.2배, 약 1.8배 내지 약 1.1배, 약 1.7배 내지 약 1.6배, 약 1.7배 내지 약 1.5배, 약 1.7배 내지 약 1.4배, 약 1.7배 내지 약 1.3배, 약 1.7배 내지 약 1.2배, 약 1.7배 내지 약 1.1배, 약 1.6배 내지 약 1.5배, 약 1.6배 내지 약 1.4배, 약 1.6배 내지 약 1.3배, 약 1.6배 내지 약 1.2배, 약 1.6배 내지 약 1.1배, 약 1.5배 내지 약 1.4배, 약 1.5배 내지 약 1.3배, 약 1.5배 내지 약 1.2배, 약 1.5배 내지 약 1.1배, 약 1.4배 내지 약 1.3배, 약 1.4배 내지 약 1.2배, 약 1.4배 내지 약 1.1배, 약 1.3배 내지 약 1.2배, 약 1.3배 내지 약 1.1배, 또는 약 1.2배 내지 약 1.1배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 3배, 약 2.5배, 약 2배, 약 1.9배, 약 1.8배, 약 1.7배, 약 1.6배, 약 1.5배, 약 1.4배, 약 1.3배, 약 1.2배 또는 약 1.1배이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 적어도 약 3배, 약 2.5배, 약 2배, 약 1.9배, 약 1.8배, 약 1.7배, 약 1.6배, 약 1.5배, 약 1.4배, 약 1.3배 또는 약 1.2배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 챔버의 높이보다 최대 약 2.5배, 약 2배, 약 1.9배, 약 1.8배, 약 1.7배, 약 1.6배, 약 1.5배, 약 1.4배, 약 1.3배, 약 1.2배 또는 약 1.1배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.1배 내지 약 1.8배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.4배 내지 약 1.8배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.1배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.2배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.3배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.4배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.5배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.6배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.7배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.8배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 1.9배 더 크다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 연결 채널의 높이보다 약 2배 더 크다.
일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 50 마이크론 내지 약 120 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 120 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 90 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 80 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 90 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 80 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 80 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 80 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 80 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 80 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 70 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 70 마이크론 내지 약 50 마이크론, 또는 약 60 마이크론 내지 약 50 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 120 마이크론, 약 100 마이크론, 약 90 마이크론, 약 80 마이크론, 약 70 마이크론, 약 60 마이크론, 또는 약 50 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 적어도 약 120 마이크론, 약 100 마이크론, 약 90 마이크론, 약 80 마이크론, 약 70 마이크론, 또는 약 60 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 최대 약 100 마이크론, 약 90 마이크론, 약 80 마이크론, 약 70 마이크론, 약 60 마이크론, 또는 약 50 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 80 마이크론이다.
일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 300 마이크론 내지 약 1,000 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 1,000 마이크론 내지 약 750 마이크론, 약 1,000 마이크론 내지 약 600 마이크론, 약 1,000 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 1,000 마이크론 내지 약 450 마이크론, 약 1,000 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 1,000 마이크론 내지 약 350 마이크론, 약 1,000 마이크론 내지 약 300 마이크론, 약 750 마이크론 내지 약 600 마이크론, 약 750 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 750 마이크론 내지 약 450 마이크론, 약 750 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 750 마이크론 내지 약 350 마이크론, 약 750 마이크론 내지 약 300 마이크론, 약 600 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 600 마이크론 내지 약 450 마이크론, 약 600 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 600 마이크론 내지 약 350 마이크론, 약 600 마이크론 내지 약 300 마이크론, 약 500 마이크론 내지 약 450 마이크론, 약 500 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 500 마이크론 내지 약 350 마이크론, 약 500 마이크론 내지 약 300 마이크론, 약 450 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 450 마이크론 내지 약 350 마이크론, 약 450 마이크론 내지 약 300 마이크론, 약 400 마이크론 내지 약 350 마이크론, 약 400 마이크론 내지 약 300 마이크론, 또는 약 350 마이크론 내지 약 300 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 1,000 마이크론, 약 750 마이크론, 약 600 마이크론, 약 500 마이크론, 약 450 마이크론, 약 400 마이크론, 약 350 마이크론, 또는 약 300 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 적어도 약 1,000 마이크론, 약 750 마이크론, 약 600 마이크론, 약 500 마이크론, 약 450 마이크론, 약 400 마이크론, 또는 약 350 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 최대 약 750 마이크론, 약 600 마이크론, 약 500 마이크론, 약 450 마이크론, 약 400 마이크론, 약 350 마이크론, 또는 약 300 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 500 마이크론이다.
일부 실시양태에서, 연결 채널의 폭은 약 50 마이크론 내지 약 120 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 폭은 약 120 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 90 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 80 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 120 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 90 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 80 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 100 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 80 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 90 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 80 마이크론 내지 약 70 마이크론, 약 80 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 80 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 70 마이크론 내지 약 60 마이크론, 약 70 마이크론 내지 약 50 마이크론, 또는 약 60 마이크론 내지 약 50 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 폭은 약 120 마이크론, 약 100 마이크론, 약 90 마이크론, 약 80 마이크론, 약 70 마이크론, 약 60 마이크론, 또는 약 50 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 폭은 적어도 약 120 마이크론, 약 100 마이크론, 약 90 마이크론, 약 80 마이크론, 약 70 마이크론, 또는 약 60 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 폭은 최대 약 100 마이크론, 약 90 마이크론, 약 80 마이크론, 약 70 마이크론, 약 60 마이크론, 또는 약 50 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 폭은 약 80 마이크론이다.
일부 실시양태에서, 연결 채널의 높이는 약 35 마이크론 내지 약 75 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 높이는 약 75 마이크론 내지 약 65 마이크론, 약 75 마이크론 내지 약 55 마이크론, 약 75 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 75 마이크론 내지 약 45 마이크론, 약 75 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 75 마이크론 내지 약 35 마이크론, 약 65 마이크론 내지 약 55 마이크론, 약 65 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 65 마이크론 내지 약 45 마이크론, 약 65 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 65 마이크론 내지 약 35 마이크론, 약 55 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 55 마이크론 내지 약 45 마이크론, 약 55 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 55 마이크론 내지 약 35 마이크론, 약 50 마이크론 내지 약 45 마이크론, 약 50 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 50 마이크론 내지 약 35 마이크론, 약 45 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 45 마이크론 내지 약 35 마이크론, 또는 약 40 마이크론 내지 약 35 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 높이는 약 75 마이크론, 약 65 마이크론, 약 55 마이크론, 약 50 마이크론, 약 45 마이크론, 약 40 마이크론, 또는 약 35 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 높이는 적어도 약 75 마이크론, 약 65 마이크론, 약 55 마이크론, 약 50 마이크론, 약 45 마이크론, 또는 약 40 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 높이는 최대 약 65 마이크론, 약 55 마이크론, 약 50 마이크론, 약 45 마이크론, 약 40 마이크론, 또는 약 35 마이크론이다. 일부 실시양태에서, 연결 채널의 높이는 약 50 마이크론이다.
일부 실시양태에서, 챔버는 액적이 장치를 통해 이동할 때 액적의 유속을 감소시키도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 유속은 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널에 비해 챔버의 단면적의 증가로 인해 감소된다. 예를 들면, 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널에 비해 10배 단면적을 가진 챔버는 챔버를 통한 유속이 업스트림 미세유체 채널을 통한 유속에 비해 유속의 10%일 것이다. 일부 실시양태에서, 챔버를 통한 유속은 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널을 통한 유속의 약 1% 내지 약 25%이다. 일부 실시양태에서, 챔버를 통한 유속은 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널을 통한 유속의 약 25% 내지 약 20%, 약 25% 내지 약 15%, 약 25% 내지 약 12%, 약 25% 내지 약 10%, 약 25% 내지 약 8%, 약 25% 내지 약 5%, 약 25% 내지 약 3%, 약 25% 내지 약 1%, 약 20% 내지 약 15%, 약 20% 내지 약 12%, 약 20% 내지 약 10%, 약 20% 내지 약 8%, 약 20% 내지 약 5%, 약 20% 내지 약 3%, 약 20% 내지 약 1%, 약 15% 내지 약 12%, 약 15% 내지 약 10%, 약 15% 내지 약 8%, 약 15% 내지 약 5%, 약 15% 내지 약 3%, 약 15% 내지 약 1%, 약 12% 내지 약 10%, 약 12% 내지 약 8%, 약 12% 내지 약 5%, 약 12% 내지 약 3%, 약 12% 내지 약 1%, 약 10% 내지 약 8%, 약 10% 내지 약 5%, 약 10% 내지 약 3%, 약 10% 내지 약 1%, 약 8% 내지 약 5%, 약 8% 내지 약 3%, 약 8% 내지 약 1%, 약 5% 내지 약 3%, 약 5% 내지 약 1%, 또는 약 3% 내지 약 1%이다. 일부 실시양태에서, 챔버를 통한 유속은 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널을 통한 유속의 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 12%, 약 10%, 약 8%, 약 5%, 약 3% 또는 약 1%이다. 일부 실시양태에서, 챔버를 통한 유속은 적어도 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 12%, 약 10%, 약 8%, 약 5% 또는 약 3%이다. 일부 실시양태에서, 챔버를 통한 유속은 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널을 통한 유속의 최대 약 20%, 약 15%, 약 12%, 약 10%, 약 8%, 약 5%, 약 3% 또는 약 1%이다. 일부 실시양태에서, 챔버를 통한 유속은 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널을 통한 유속의 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 업스트림에 있는 미세유체 채널을 통한 유속은 장치의 상이한 지점에서 변한다. 이러한 실시양태에서, 챔버에 대한 유속 비교에 사용되는 유속은 액적 형성 연접부(예를 들면, 가장 작은 단면적을 가진 미세유체 채널 부분) 다음으로 가장 빠른 유속이다.
일부 실시양태에서, 챔버는 미세유체 장치에서 형성된 액적이 이 장치를 통해 이동하는 실질적으로 동일한 체류 시간을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 미세유체 장치는 장치에서 형성된 액적이 이 장치를 통해 이동하는 실질적으로 동일한 체류 시간을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 이것은 분산 비에 의해 측정된다. 분산 비는 식 6σ/Tavg에 따라 계산되고; 이때 Tavg는 장치를 통해 이동하는 액적의 평균 체류 시간이고 σ는 장치를 통해 이동하는 액적의 체류 시간의 표준 편차이다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 10%, 약 8%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 10%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 8%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 6%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 5%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 4%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 3%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 2%의 분산 비를 가진다. 일부 실시양태에서, 장치는 최대 약 1%의 분산 비를 가진다.
도 18은 도 9a 및 10에 도시된 미세유체 장치를 이용하였을 때 인큐베이션 시간에 대한 균일성 수준을 도시하는 예시적인 데이터 세트를 제공한다. 구체적으로, 2개의 수성 유입물을 입구(101, 102)에 제공하였고, 이때 하나의 수성 유입물은 완충제 용액 및 형광단을 함유하였고("형광단 용액") 다른 수성 유입물은 완충제 용액만을 함유하였다("완충제 용액"). 한 용액이 다른 용액보다 더 높은 농도로 어세이 유동 채널을 통해 유동하도록 약 3% 상쇄된 설정점 압력을 형광단 용액 및 완충제 용액에 제공하였다. 먼저, 더 높은 압력에서 완충제 용액을 제공한 후, 더 높은 압력에서 형광단 용액을 제공하도록 설정점 압력을 전환시켰다. 도 18에 도시된 바와 같이, 제1 시간 동안 PMT 카운트는 100 rfu 미만이고 그 후 갑작스런 증가가 있다. 데이터 세트 사이의 분산은 단지 1.7%인 것으로 계산되었고, 이때 시그마는 3.19이었다. 따라서, 이것은 형광단 용액이 2% 이내의 분산으로 검출 신호를 제공하였기 때문에 농도를 전환할 때 유의미한 지연 없이 균일한 인큐베이션 시간의 수준을 표시한다. 따라서, 이것은 상대적으로 균일한 속도로 어세이 유동 경로를 따라 이동하는 캡슐화와 상관관계를 가진다. 도 19는 도 11의 미세유체 장치를 사용하는 유사한 분석을 제공하고, 이때 형광단 용액은 더 낮은 압력으로 전환되기 전에 초기에 더 높은 압력으로 제공되었다. 데이터 점 사이의 분산은 4.52%에서 약간 더 높은 것으로 계산되었고, 이때 시그마는 7.25이었다. 따라서, 이것은 유사하게 형광단 용액이 5% 미만의 분산으로 검출 신호를 제공하였기 때문에 인큐베이션 시간에 대한 균일성 수준을 표시한다.
일부 실시양태에서, 장치는 하나 이상의 수집 챔버를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수집 챔버는 어세이 유동 경로를 통과하는 복수의 액적의 서브세트를 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 수집 챔버는 연장된 시간 동안 서브세트를 인큐베이션하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 수집 챔버는 복수의 액적의 서브세트에 대한 체류 시간을 연장하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 장치는 장치의 유동 경로를 따라 위치된 하나 이상의 션트(shunt)를 추가로 포함한다. 션트는 장치의 임의의 위치에 위치될 수 있다. 션트는 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 액적 간격에 영향을 미치기 위해 션트를 이용하여 추가 비혼화성 담체 유체를 미세유체 채널 내로 삽입한다. 일부 실시양태에서, 션트를 이용하여 미세유체 장치로부터 담체 유체의 액적을 방향전환시킨다. 일부 실시양태에서, 션트는 장치의 개시에 이용된다. 일부 실시양태에서, 션트는 장치의 평형화에 이용된다. 일부 실시양태에서, 장치는 평형화된다.
일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 제1 션트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 션트는 어세이 유동 경로의 업스트림 영역에 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 션트는 어세이 유동 경로의 구불구불한 영역의 업스트림에 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 션트는 하나 이상의 챔버의 업스트림에 위치된다. 일부 실시양태에서, 제1 션트는 장치를 사용하는 평형화 단계 동안 개방된다. 일부 실시양태에서, 담체 유체는 장치의 평형화 단계 동안 정상 작동과 반대 방향으로 장치를 통해 흐르고 제1 션트를 통해 장치를 빠져나갈 수 있다. 일부 실시양태에서, 수성 액적은 제1 션트의 업스트림에서 미세유체 장치 내로 동시에 도입되고 제1 션트를 통해 장치를 빠져나갈 수 있다. 일부 실시양태에서, 션트는 시스템을 원하는 대로(예를 들면, 유속, 압력, 액적 크기, 액적 간격 등) 작동하기 위해 장치에 대한 유입 유체의 압력이 원하는 수준까지 조절되면 폐쇄된다.
일부 실시양태에서, 제1 션트는 액적이 어세이 유동 경로의 적어도 일부를 우회하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 대안적 유동 경로는 제1 션트에 커플링된다. 대안적 유동 경로는 임의의 성질을 가질 수 있으며 임의의 방식으로 어세이 유동 경로에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 대안적 유동 경로는 미세유체 장치 상에서 액적의 인큐베이션 시간 또는 체류 시간을 변경하거나, 추가 시약 증기(예를 들면, 액적 병합 연접부 또는 피코주입 부위)를 첨가하거나, 장치에서 액적을 전체적으로 인큐베이션하는 데 이용될 수 있다.
절단 영역은 절단 가능한 링커에 의해 비드에 연결된 이펙터를 유리시키는 기작을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하기 위한 시약을 도입하기 위해 피코주입 부위 또는 액적 병합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하도록 구성된 광원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광원은 UV 광원이다. 일부 실시양태에서, 광원은 도파관이다. 일부 실시양태에서, 광원은 광섬유 케이블이다. 일부 실시양태에서, 광원은 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하도록 구성된 광원이다. 일부 실시양태에서, 광원은 장치 평면과 실질적으로 평행한 광축을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 광원은 어세이 유동 경로의 곡선에서 통과 액적을 조명한다. 일부 실시양태에서, 광원은 장치 평면에 실질적으로 수직인 광축을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 광원은 장치 상에 장착된 기둥에 의해 절단 영역의 미세유체 채널과 정렬된다. 일부 실시양태에서, 광원은 절단 영역을 통과하는 미세유체 채널의 다수의 부분을 덮는 영역에 걸쳐 광을 방출하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 구불구불한 유동 경로를 포함한다.
절단 영역은 장치 상에서 이용되는 어세이의 요건에 따라 미세유체 장치를 따라 임의의 지점에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 검출 영역, 분류 영역 및 자극 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 검출 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 분류 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 자극 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 검출 영역 및 분류 영역의 업스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 절단 영역의 업스트림 및 다운스트림에서 미세유체 채널에 위치된 추가 입구 및 출구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 입구 및 출구는 절단 영역 바로 앞 및 바로 뒤에 위치된다.
일부 실시양태에서, 이 입구 및 출구는 절단 영역의 보정을 허용하도록 구성된다. 보정은 절단 영역을 통과하는 샘플이 얼마나 많은 광에 노출되는지에 있어서 장치-대-장치 가변성을 제어할 수 있게 한다. 이러한 가변성은 광원과 장치의 커플링을 포함하는, 장치의 다양한 파라미터에 대한 작은 변화로부터 비롯될 수 있다. 노출 강도 시간 및 지속시간의 가변성은 비드로부터 방출된 화합물의 양의 가변성으로 이어질 수 있고, 이것은 궁극적인 스크리닝 어세이 판독값의 오류를 야기할 수 있다.
일부 실시양태에서, 입구 및 출구는 보정 절차를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 보정 절차는 형광 염료를 포함하는 용액이 절단 영역을 통해 유동하게 하는 단계를 포함한다. 도 12d는 본원에 기재된 미세유체 장치에 대한 절단 영역의 예시적인 묘사를 제공하고, 이때 캡슐화(예를 들면, 액적)를 광에 노출시키기 위한 보정 입구 및 UV 도파관이 도시되어 있다. 일부 실시양태에서, 보정 채널은 절단 영역에서 UV 강도를 측정하기 위해 UV 민감성 형광단으로 채워진다. 일부 실시양태에서, UV 도파관은 UV LED 커플링된 광섬유로부터의 광을 국한된 영역으로 향하게 한다. 그 후, 일부 실시양태에서, UV LED 전력은 측정되는 보정 염료에 기반하여 설정된다. 도 12e는 보정 염료를 주어진 광 노출(BD HorizonTM BV51)과 상호관련시키는 예시적인 데이터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 미세유체 장치를 이용하여 인코딩된 이펙터-형광단 비드를 캡슐화(예를 들면, 액적) 내로 도입한다. 도 12a는 형광단에 의해 변형된 인코딩된 이펙터를 가진 비드의 예시적인 용액을 제공하고, 이때 상기 용액은 비드의 라이브러리를 포함할 수 있다. 도 12b에 나타낸 바와 같이, 이펙터-형광단은 광절단 가능한 또는 전구 광절단 가능한 링커에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 형광단 비드는 대략 200 pL의 부피에서 액적 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 액적은 절단 영역 내로 도입되고 UV 광에 노출된다. 도 12b에 나타낸 바와 같이, UV 광에 노출될 때, 이펙터가 비드로부터 방출되도록(도 12c) 이펙터가 유리된다(즉, 광절단 가능한 링커의 절단). 그 다음, 액적은 미세유체 장치의 "조사 영역"에 도달할 때까지 본원에 기재된 바와 같이 미세유체 장치를 통해 계속 유동하고, 이때 액적에 대해 레이저 여기(예를 들면, 공초점 레이저 여기, 도 12f)를 수행함으로써, 방출된 이펙터-형광단을 여기한다. 그 후, 각각 100 mV 및 600 mV 광으로부터의 노출에 기반한 이펙터 방출을 나타내는 도 13a 및 14a(PMT 2 Smooth로 표시됨)에 나타낸 바와 같이, 인코딩된 이펙터-형광단으로부터의 방출을 PMT 검출기로 수집함으로써, 방출된 이펙터-형광단 농도를 측정한다. 신호의 안정성을 관찰하기 위해 시간에 따른 히트 맵으로서 작도된 도 13b 및 14b는 각각 100 mV 및 600 mV 광으로부터의 노출을 기반으로 각각의 액적에 대해 측정된 피크 방출을 제공한다. 도시된 바와 같이, UV LED 전력의 증가는 노출을 증가시킴으로써, 방출된 이펙터-형광단의 최종 농도를 제어할 수 있게 한다. 도 15b는 정규 분포된 강도 값을 묘사하기 위해 압축된 액적 맵(예를 들면, 도 13b 및 14b로부터)을 가진 히스토그램을 제공한다. UV 방출 후 이펙터-형광단의 최종 농도를 측정하기 위해 중앙값을 공지된 형광단 농도 보정(예를 들면, 도 15a)과 상호관련시킨다. 따라서, 보정 유체를 사용하여 측정하였을 때, 방출 강도를 최종 이펙터 방출 농도와 상호관련시킴으로써, 예측 정량적 방출을 제공할 수 있다.
검출 영역은 장치에서 수행되는 어세이의 임의의 원하는 판독값을 검출할 수 있는 검출기를 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 형광계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광계는 광전자증배관 검출기, 광원, 여기 필터 및 방출 필터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광계는 장치 평면에 실질적으로 평행한 광축을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 형광계는 장치 평면에 실질적으로 수직인 광축을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 형광계는 어세이 유동 경로의 곡선에서 통과 액적을 조명한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 공초점 검출 및 레이저 스캐닝을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 도 22a 및 22b에 나타낸 바와 같이 공초점 레이저 스캐닝 장치를 포함한다(장치의 평면도 제공). 도 12f는 공초점 레이저 스캐닝을 통한 캡슐화물 검출의 예시적인 개략도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 레이저 스캐닝을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 형광을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 본원에 기재된 검출 수단의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 검출 영역은 여기 광을 검출 영역 내로 방출하기 위한 대물렌즈 또는 섬유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 검출 영역으로부터 방출을 수집하도록 구성된 대물렌즈, 섬유, 또는 하전된 커플링된 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 대물렌즈는 여기를 유도하고 검출 영역으로부터 방출을 수집하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 검출 영역으로부터 방출을 수집하도록 구성된 대물렌즈(여기 대물렌즈와 동일할 수 있음)는 도립 대물렌즈이다. 일부 실시양태에서, 검출 영역으로부터 방출을 수집하도록 구성된 대물렌즈(여기 대물렌즈와 동일할 수 있음)는 광섬유를 통해 방출된 광을 수집하고 시준하고 안내하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 광섬유는 방출을 정량하도록 구성된 검출기에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 방출을 정량하도록 구성된 검출기는 광전자증배관, 하전된 커플링된 장치 또는 포토다이오드이다.
일부 실시양태에서, 검출 영역은 칩 상에서 이동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 장치에 커플링되지 않은 여기 광원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 장치에 커플링되지 않은 대물렌즈를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치에 커플링되지 않은 검출 영역을 위한 광원 또는 검출기를 가짐으로써, 어세이 요건을 기반으로 시스템을 조절할 수 있다. 예를 들면, 검출과 분류 사이의 시간을 증가시키거나 감소시키도록 시스템을 조절할 수 있다. 추가로, 장치에서 스크리닝 어세이를 수행하기 전에 장치의 보정 및 초기화를 위해 단일 광원이 사용될 수 있도록 시스템을 조절할 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 영역은 2개 이상의 형광 파장을 검출하도록 구성된다. 이것은 복수의 형광 프로브의 존재도를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 어세이되는 액적은 대조군 형광단 및 어세이 형광단을 포함할 수 있다. 어세이 형광단은 어세이의 판독값, 예를 들면, 어세이의 양성 또는 음성 결과를 제공한다. 대조군 형광단은 존재하는 경우 검출되고 정량될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군 형광단을 공지된 농도로 제1 미세유체 채널의 수성 유체에 넣는다. 제1 미세유체 채널의 수성 유체를 포함하는 액적이 검출 영역에 도달할 때, 검출된 대조군 형광단 형광의 양을 사용하여 액적의 크기를 정량할 수 있다. 이것은 어세이 형광단 판독값의 결과를 정규화하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 2개 이상의 어세이 형광단을 측정하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 장치는 단일 검출 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 절단 영역의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 자극 영역의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 분류 영역의 업스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 다수의 검출 영역을 포함한다. 장치가 다수의 검출 영역을 포함할 때, 이들은 장치의 아무 곳에나 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 또 다른 영역과 연통하도록 구성된다. 예를 들면, 검출 영역은 신호의 검출을 기반으로 분류가 일어나도록 분류 영역과 연통할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 피코주입기와 연통하도록 구성된다. 검출 영역이 피코주입기와 연통하는 경우, 특정 조건, 예컨대, 신호의 존재 또는 부재가 충족될 때에만 시약 또는 다른 어세이 구성요소를 선택적으로 첨가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 자극 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이온 채널을 자극하기 위한 하나 이상의 작동기를 포함한다. 이온 채널을 자극하는 임의의 방법은 장치가 이온 채널 조절 어세이를 수행하도록 구성될 때 작동기에 의해 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이온 채널을 자극하기 위한 하나 이상의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하기 위한 하나 이상의 작동기는 적어도 하나의 광원, 적어도 하나의 전극, 또는 이온 채널 독소를 갖춘 적어도 하나의 피코주입 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 적어도 하나의 광원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 적어도 하나의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 이온 채널 독소에 대한 주입 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 적어도 하나의 전극을 포함한다. 전자기 전류를 캡슐화물에 전달할 수 있는 임의의 유형의 전극이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 어세이 유동 경로의 벽을 따라 놓여 있고 전기장을 통과 스트림에 전달한다. 일부 실시양태에서, 전기장은 액적이 전극을 통과하는 주파수와 일치하도록 펄스된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 액적이 전극 쌍을 통과할 때 액적이 전극과 접촉함으로써 전류가 액적을 통해 흐를 수 있게 하도록 어세이 유동 경로의 반대쪽 벽에서 한 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 이렇게 구성된 다수의 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이렇게 구성된 약 1 내지 약 20 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이렇게 구성된 약 1 내지 약 2, 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 20, 약 2 내지 약 3, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 10, 약 2 내지 약 20, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 20, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 10, 약 5 내지 약 20, 약 7 내지 약 10, 약 7 내지 약 20, 또는 약 10 내지 약 20 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이렇게 구성된 약 1, 약 2, 약 3, 약 5, 약 7, 약 10 또는 약 20 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이렇게 구성된 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 5, 약 7 또는 약 10 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이렇게 구성된 최대 약 2, 약 3, 약 5, 약 7, 약 10 또는 약 20 쌍의 전극을 포함한다.
임의의 수의 작동기가 미세유체 장치에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 약 1개의 작동기 내지 약 20개의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 약 1개의 작동기 내지 약 2개의 작동기, 약 1개의 작동기 내지 약 3개의 작동기, 약 1개의 작동기 내지 약 5개의 작동기, 약 1개의 작동기 내지 약 7개의 작동기, 약 1개의 작동기 내지 약 10개의 작동기, 약 1개의 작동기 내지 약 20개의 작동기, 약 2개의 작동기 내지 약 3개의 작동기, 약 2개의 작동기 내지 약 5개의 작동기, 약 2개의 작동기 내지 약 7개의 작동기, 약 2개의 작동기 내지 약 10개의 작동기, 약 2개의 작동기 내지 약 20개의 작동기, 약 3개의 작동기 내지 약 5개의 작동기, 약 3개의 작동기 내지 약 7개의 작동기, 약 3개의 작동기 내지 약 10개의 작동기, 약 3개의 작동기 내지 약 20개의 작동기, 약 5개의 작동기 내지 약 7개의 작동기, 약 5개의 작동기 내지 약 10개의 작동기, 약 5개의 작동기 내지 약 20개의 작동기, 약 7개의 작동기 내지 약 10개의 작동기, 약 7개의 작동기 내지 약 20개의 작동기, 또는 10개의 작동기 내지 약 20개의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 약 1개의 작동기, 약 2개의 작동기, 약 3개의 작동기, 약 5개의 작동기, 약 7개의 작동기, 약 10개의 작동기 또는 약 20개의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 적어도 약 1개의 작동기, 약 2개의 작동기, 약 3개의 작동기, 약 5개의 작동기, 약 7개의 작동기 또는 약 10개의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 최대 약 2개의 작동기, 약 3개의 작동기, 약 5개의 작동기, 약 7개의 작동기, 약 10개의 작동기 또는 약 20개의 작동기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 다수의 자극 영역을 포함한다. 자극 영역은 미세유체 장치 전체에 걸쳐 임의의 배향으로 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 절단 영역의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 검출 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 분류 영역의 업스트림에 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 담체 유체를 미세유체 장치의 유동 경로 내로 삽입하도록 구성된 추가 입구를 포함한다. 액적의 최적 간격은 원하는 액적을 정확하게 분류하기 위해 중요한 고려사항이다. 액적의 정확한 분류에 영향을 미칠 수 있는 요인은 액적 크기, 액적의 평균 분리, 유동의 총 오일 비율, 액적의 이온 강도 및 액적의 내용물을 포함한다. 본원에서 제공된 장치에서 수행된 개별 어세이는 추가 입구의 존재에 의해 가능해지는 간격의 최적화를 요구할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 입구는 추가 담체 유체를 미세유체 장치의 유동 경로 내로 삽입하여 액적의 간격을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 추가 입구는 추가 담체 유체를 미세유체 장치의 유동 경로 내로 삽입하여 액적을 집속한다. 일부 실시양태에서, 추가 담체 유체는 제2 미세유체 채널로부터의 비혼화성 유체이다. 일부 실시양태에서, 추가 담체 유체는 제2 미세유체 채널로부터의 비혼화성 유체와 상이하다. 일부 실시양태에서, 추가 입구는 일정한 유동에서 작동한다. 일부 실시양태에서, 추가 입구는 가변적 유동에서 작동한다. 바람직한 실시양태에서, 추가 입구는 검출 영역의 바로 업스트림에 위치된다. 일부 실시양태에서, 추가 입구는 액적을 최적으로 이격시키도록 선택된 유속에서 작동한다. 일부 실시양태에서, 장치는 2개의 추가 입구를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 이격 오일을 전달하도록 구성된 제1 추가 입구 및 집속 오일을 전달하도록 구성된 제2 추가 입구를 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 분류 영역을 포함한다. 장치에서 액적을 분류하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 검출 영역과 연통한다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 검출 영역에 의해 검출된 신호의 존재, 부재 또는 수준의 검출을 기반으로 액적을 분류하는 분류 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 분류 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분류 전극은 전기영동 전극이다. 일부 실시양태에서, 분류 전극은 유전영동 전극이다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 분류를 위해 구성된 밸브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 분류를 위해 구성된 편향 가능한 막을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 분류를 위해 구성된 음파 생성기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 통과 액적을 분류된 경로 아래로 안내하도록 구성된 유체용 입구를 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 완전히 둘러싸인 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 장치 내로의 임의의 입구 및 출구를 제외한, 미세유체 채널의 모든 측면에서 포함된 미세유체 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 채널을 둘러싸도록 구성된 커버 슬립을 포함한다. 일부 실시양태에서, 커버 슬립은 소수성 물질(예를 들면, PDMS)로 코팅된다. 커버 슬립은 임의의 크기(예를 들면, 5 마이크론, 10 마이크론, 15 마이크론, 20 마이크론, 30 마이크론, 40 마이크론, 50 마이크론 이상)일 수 있다.
장치를 통한 유체 유동의 제어는 임의의 방식으로 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유체의 유동은 연장된 시간 동안 및/또는 연속 방식으로 장치를 통해 유체를 전달할 수 있는 장치(예를 들면, 공압 펌프 또는 연동 펌프)에 의해 제어된다. 이러한 펌프는 일정한 압력에서 연장된 시간 동안 시스템을 작동시킴으로써, 물질이 장치를 통해 연속적으로 공급될 수 있게 하고 장치를 통해 이동하는 액적의 체류 시간을 제어할 수 있게 하는 능력을 포함하는, 주입기 펌프와 같은 다른 펌프에 비해 몇 가지 장점을 가진다. 일부 실시양태에서, 유체의 유동은 연속 펌프에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 유체의 유동은 공압 펌프에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 유체는 장치 외부의 유체 저장소로부터 장치로 전달된다. 이것은 장치가 장치 상의 저장소로부터 가능한 양보다 훨씬 더 큰 양의 유체를 끌어들일 수 있게 한다. 임의의 샘플 유체, 비혼화성 유체, 이격 오일, 집속 오일, 또는 칩으로 전달되는 다른 유체를 이 방식으로 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펌프는 적어도 4시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 16시간, 또는 적어도 24시간의 연속 시간 동안 장치를 통해 유체를 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 펌프는 적어도 12시간의 연속 시간 동안 장치를 통해 유체를 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 펌프는 적어도 24시간의 연속 시간 동안 장치를 통해 유체를 전달하도록 구성된다.
비제한적 예시적인 미세유체 장치는 도 9a에 도시되어 있다. 예시적인 미세유체 장치는 제1 입구(101)를 함유한다. 제1 입구(101)는 수성 어세이 시약과 같은 수성 유체를 수용하도록 구성된다. 예시적인 미세유체 장치는 제2 입구(102)도 함유한다. 이 예에서, 제2 입구(102)는 또 다른 수성 유체를 수용하도록 구성된다. 이것은 제1 입구(101)에 첨가되는 수성 유체와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 제2 입구(102)는 본원에서 제공된 바와 같이 비드를 수용하도록 구성될 수 있거나, 제1 입구(101)는 이와 같이 구성될 수 있다. 미세유체 장치의 다른 예에서, 단일 입구 스트림만이 있을 수 있다. 도 9a에 나타낸 예시적인 미세유체 장치는 액적 형성 연접부 또는 압출 연접부(104)와 유체 연결되는, 담체 유체(예를 들면, 수성 유체와 혼화될 수 없는 오일)를 위한 입구(103)를 추가로 포함한다. 이 예에서 입구(103)는 2개의 채널에 의해 액적 형성 연접부(104)에 연결되고, 이들 각각은 수성 스트림 채널의 반대쪽에 있는 동일한 지점에서 수성 스트림 채널에 도달한다. 액적 형성 연접부(104)는 절단 영역(106)을 향해 유동 경로 아래로 연속되는 미세유체 채널을 포함한다. 절단 영역(106) 근처에는 광을 절단 영역(106)의 미세유체 채널 내로 전달하도록 구성된 광섬유 도파관(105a)이 있다. 광섬유 도파관(5a)은 방출된 광이 장치 평면으로부터 절단 영역(106)의 미세유체 채널로 들어가도록 장치의 평면에 내장된다. 또한, 절단 영역(106) 근처에는 광을 장치의 평면 위로부터 절단 영역(106)의 미세유체 채널 내로 방출하도록 구성될 수 있는 광섬유 매니폴드를 고정하도록 구성된 기둥(105b)이 있다. 105a 및 105b의 광원은 대안적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 장치는 또한 절단 영역(106)과 유체 연결되는 보정 유체용 입구(107a) 및 보정 유체용 출구(107b)를 포함한다. 보정 유체용 입구(107a)는 절단 영역 내에서의 광자 노출을 정규화하도록 구성된 유체를 제공받고 절단 영역(106)에 전달하도록 구성된다. 절단 영역(106)을 통과한 후, 보정 유체는 보정 유체용 출구(107b)를 통해 나간다. 절단 영역(106)은 미세유체 채널을 통해 인큐베이션 영역(109)과 유체 연통한다. 도 9a의 예에서, 인큐베이션 영역(109)은 일련의 확장된 챔버를 함유하고, 각각의 챔버는 미세유체 채널에 의해 일렬로 다음 챔버에 연결된다. 이 챔버들의 구성은 장치를 통해 액적 형성 영역(104)에서 형성된 액적의 유속 및 체류 시간에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 챔버는 액적이 인큐베이션 영역(109)을 통과할 때 액적의 포획을 방지하도록 구성된다. 챔버의 이러한 구성은 수성 액적(예를 들면, 3-에톡시퍼플루오로(2-메틸헥산))보다 더 조밀한 담체 유체를 사용할 때 특히 중요하다. 일부 실시양태에서, 이 원하는 구성은 챔버와 연결 채널 사이의 채널 높이의 작은 차이만을 갖도록 챔버 및 연결 채널을 구성함으로써 달성된다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 80 ㎛이고 연결 채널의 높이는 약 50 ㎛이다. 기포가 장치의 내부에 포획되는 것을 방지하는 데 도움이 되는 추가 디자인 특징으로서, 유동 경로의 높이는 액적이 연결 채널에 접근함에 따라 좁아지는 챔버의 폭 사이에 변하지 않음으로써, 포획 없이 챔버 사이의 원활한 액적 전이를 용이하게 한다. 인큐베이션 영역(109)의 양 단부에는 우회 션트(108a 및 108b)가 구성되어 있다. 우회 션트(108a 및 108b)는 션트에 커플링된 유체가 주 미세유체 채널의 안팎으로 유동할 수 있도록 구성된다. 유체가 우회 션트(108a)에서 주 미세유체 채널의 밖으로 방향전환되는 경우, 물질은 인큐베이션 영역(109)을 통과하지 않을 것이다. 인큐베이션 영역(109)의 다운스트림에는 담체 유체용 입구(110)가 위치된다. 담체 유체용 입구(110)는 장치의 주 미세유체 채널과 유체 연통하고 원하는 경우 액적을 이격하기 위해 추가 비혼화성 담체 유체를 주 미세유체 채널 내로 전달하도록 구성된다. 액적 집속 오일을 주 미세유체 채널 내로 전달하도록 구성된 담체 유체용 입구(111)도 주 미세유체 채널과 유체 연통한다. 담체 유체용 입구(110 및 111)의 다운스트림은 검출 위치(116)이다. 검출 위치(116)는 칩 상에서 실행되는 어세이로부터 원하는 신호가 검출되는, 장치 상의 지점을 표시한다. 검출 위치(116)는 검출 위치(116)를 통과하는 샘플에서 여기 광을 안내하는 대물렌즈 또는 섬유, 및 검출 위치(116)로부터의 방출을 검출하도록 구성된 검출기에 커플링된 추가 대물렌즈 또는 섬유의 정렬에 기반할 수 있다. 대안적으로, 여기 광에 대한 대물렌즈는 방출도 수집하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기원은 도립 대물렌즈를 통해 검출 위치(116)로부터 반사되고, 이때 방출은 광전자증배관 또는 다른 검출기에 의한 정량을 위해 광섬유를 통해 수집되고 시준되고 안내된다. 일부 실시양태에서, 검출 위치(116)에서 정렬된 대물렌즈 또는 섬유는 장치에 커플링되지 않는다. 장치에 커플링되지 않은 경우, 검출기 또는 방출 대물렌즈 또는 섬유는 검출과 분류 사이의 시간을 조절하기 위해 장치의 검출 위치(116)를 조절하도록 이동될 수 있다. 장치에 커플링되지 않은 경우, 검출기 또는 방출 대물렌즈는 장치의 보정 또는 장치의 시작에도 사용되도록 이동됨으로써, 단일 광원이 다수의 기능을 위해 사용될 수 있게 한다. 담체 유체용 입구(110 및 111) 및 검출 위치(116)의 다운스트림은 식별 연접 전극(112)이다. 식별 연접 전극(112)은 액적이 원하는 신호를 표시하는 것으로 확인된 경우 액적을 출구(114) 아래로 밀어내도록, 또는 액적이 원하는 신호를 결여하는 것으로 확인된 경우 액적을 출구(115) 아래로 밀어내도록 구성된 유전영동 전극일 수 있다. 식별 연접 전극(112)은 회로 연결점(113a 및 113b)에서 장치에 연결된 식별 연접 접지 회로에 연결된다. 예시적인 장치의 분류 및 검출 영역의 확대된 도면은 도 9b에 제시되어 있다. 도 9c는 실질적으로 이 예에 기재된 바와 같은 미세유체 장치의 사진을 보여준다. 도 10은 도 9a의 미세유체 장치의 또 다른 예시적인 묘사를 제공하고, 이때 광학 접착제는 광섬유 도파관 내에 표시되어 있다. 일부 실시양태에서, 광학 접착제는 광섬유 도파관으로부터의 광의 산란을 최소화하는 데 도움이 된다.
도 11은 본원에 기재된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 미세유체 장치를 제공한다. 예시적인 미세유체 장치는 제1 입구(201)를 함유한다. 제1 입구(201)는 수성 어세이 시약과 같은 수성 유체를 수용하도록 구성된다. 예시적인 미세유체 장치는 제2 입구(202)도 함유한다. 이 예에서, 제2 입구(202)는 또 다른 수성 유체를 수용하도록 구성된다. 이것은 제1 입구(201)에 첨가된 수성 유체와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 제2 입구(202)는 본원에서 제공된 바와 같이 비드를 수용하도록 구성될 수 있거나, 제1 입구(201)는 이와 같이 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 미세유체 장치는 제3 입구(218)도 함유한다. 이 예에서, 제3 입구(218)는 또 다른 수성 유체를 수용하도록 구성된다. 이것은 제1 입구(201) 및/또는 제2 입구(202)에 첨가된 수성 유체와 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 제3 입구(218)는 본원에서 제공된 바와 같이 비드를 수용하도록 구성될 수 있다. 미세유체 장치의 다른 예에서, 단일 입구 스트림만이 있을 수 있다. 미세유체 장치의 일부 실시양태에서, 4개 이상의 입구가 있다. 일부 실시양태에서, 4개 이상의 입구는 수성 입구일 수 있다. 도 11에 도시된 예시적인 미세유체 장치는 액적 형성 연접부 또는 압출 연접부(204)와 유체 연결되는, 담체 유체(예를 들면, 수성 유체와 혼화될 수 없는 오일)용 입구(203)를 추가로 포함한다. 이 예에서 입구(203)는 2개의 채널에 의해 액적 형성 연접부(204)에 연결되고, 이들 각각은 수성 스트림 채널의 반대쪽에 있는 동일한 지점에서 수성 스트림 채널에 도달한다. 액적 형성 연접부(204)는 절단 영역(206)을 향해 유동 경로 아래로 연속되는 미세유체 채널을 포함한다. 절단 영역(206) 근처에는 광을 절단 영역(206)의 미세유체 채널 내로 전달하도록 구성된 UV 도파관(205)이 있다. 일부 실시양태에서, UV 도파관은 광섬유 도파관이다. UV 도파관(205)은 방출된 광이 장치 평면으로부터 절단 영역(206)의 미세유체 채널로 들어가도록 장치의 평면에 내장된다. 일부 실시양태에서, UV 도파관은 절단 영역에 가장 가까운 단부에서 포물선형 렌즈를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포물선형 렌즈는 광을 절단 영역의 내부로 시준하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 포물선형 렌즈 또는 곡면 렌즈는 UV 도파관으로부터의 광이 산란되는 경향을 최소화한다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 회로 평면에 수직으로 투영된 UV 광에 노출되어, 한정된 영역을 화합물이 절단되는 UV에 노출시킨다. 일부 실시양태에서, 광학 접착제(217)를 UV 도파관에 제공한다. 일부 실시양태에서, 광학 접착제(217)는 UV 도파관에 의해 산란되는 광을 최소화하는 데 도움이 된다. 또한 절단 영역(206) 근처에는 광을 장치의 평면 위로부터 절단 영역(206)의 미세유체 채널 내로 방출하도록 구성될 수 있는 광섬유 매니폴드를 고정하도록 구성된 기둥(도시되지 않음)이 있을 수 있다. 장치는 절단 영역(206)과 유체 연결되는 보정 유체용 입구(207a) 및 보정 유체용 출구(207b)도 포함한다. 보정 유체용 입구(207a)는 절단 영역 내에서의 광자 노출을 정규화하도록 구성된 유체를 수용하고 절단 영역(206)에 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 절단 영역(206)은 구불구불한 유동 경로를 포함한다. 절단 영역(206)을 통과한 후, 보정 유체는 보정 유체용 출구(207b)를 통해 나간다. 절단 영역(206)은 미세유체 채널을 통해 인큐베이션 영역(209)과 유체 연통한다. 도 11의 예에서, 인큐베이션 영역(209)은 일련의 확장된 챔버를 함유하고, 각각의 챔버는 미세유체 채널에 의해 일렬로 다음 챔버에 연결된다. 이 챔버들의 구성은 장치를 통해 액적 형성 영역(204)에서 형성된 액적의 유속 및 체류 시간에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 챔버는 액적이 인큐베이션 영역(209)을 통과할 때 액적의 포획을 방지하도록 구성된다. 챔버의 이러한 구성은 수성 액적(예를 들면, 3-에톡시퍼플루오로(2-메틸헥산))보다 더 조밀한 담체 유체를 사용할 때 특히 중요하다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 30 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 이 예시적인 미세유체 장치(도 11)의 챔버의 깊이는 도 9a의 장치 내의 챔버의 깊이보다 더 크다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이 예시적인 장치(도 11)는 더 긴 인큐베이션 영역을 제공하는데, 그 이유는 더 큰 깊이가 액적으로 하여금 더 빨리 이동하게 함으로써, 동일한 길이의 인큐베이션 영역이 사용되었을 때 도 9a의 장치에 비해 체류 시간을 감소시키기 때문이다. 일부 실시양태에서, 이 예시적인 미세유체 장치에는 수집 챔버(219)가 임의적으로 제공된다. 인큐베이션 영역(209)의 어느 한 단부에는 우회 션트(208a 및 208b)가 구성되어 있다. 우회 션트(208a 및 208b)는 션트에 커플링된 유체가 주 미세유체 채널의 안팎으로 유동할 수 있도록 구성된다. 유체가 우회 션트(208a)에서 주 미세유체 채널의 밖으로 방향전환되는 경우, 물질은 인큐베이션 영역(209)을 통과하지 않을 것이다. 인큐베이션 영역(209)의 다운스트림에는 담체 유체용 입구(210)가 위치된다. 담체 유체용 입구(210)는 장치의 주 미세유체 채널과 유체 연통하고 원하는 경우 액적을 이격하기 위해 추가 비혼화성 담체 유체를 주 미세유체 채널 내로 전달하도록 구성된다. 또한, 주 미세유체 채널과 유체 연통하는 담체 유체용 입구(211)는 액적 집속 오일을 주 미세유체 채널 내로 전달하도록 구성된다. 담체 유체용 입구(210 및 211)의 다운스트림은 검출 위치(216)이다. 검출 위치(216)는 칩 상에서 실행되는 어세이로부터 원하는 신호가 검출되는, 장치 상의 지점을 표시한다. 검출 위치(216)는 검출 위치(216)를 통과하는 샘플에서 여기 광을 안내하는 대물렌즈 또는 섬유, 및 검출 위치(216)로부터의 방출을 검출하도록 구성된 검출기에 커플링된 추가 대물렌즈 또는 섬유의 정렬에 기반할 수 있다. 대안적으로, 여기 광에 대한 대물렌즈는 방출도 수집하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기원은 도립 대물렌즈를 통해 검출 위치(216)로부터 반사되고, 이때 방출은 광전자증배관 또는 다른 검출기에 의한 정량을 위해 광섬유를 통해 수집되고 시준되고 안내된다. 일부 실시양태에서, 검출 위치(216)에서 정렬된 대물렌즈 또는 섬유는 장치에 커플링되지 않는다. 장치에 커플링되지 않은 경우, 검출기 또는 방출 대물렌즈 또는 섬유는 검출과 분류 사이의 시간을 조절하기 위해 장치의 검출 위치(216)를 조절하도록 이동될 수 있다. 장치에 커플링되지 않은 경우, 검출기 또는 방출 대물렌즈는 장치의 보정 또는 장치의 시작에도 사용되도록 이동됨으로써, 단일 광원이 다수의 기능을 위해 사용될 수 있게 한다. 담체 유체용 입구(210 및 211) 및 검출 위치(216)의 다운스트림은 식별 연접 전극(212)이다. 식별 연접 전극(212)은 액적이 원하는 신호를 표시하는 것으로 확인된 경우 액적을 출구(214) 아래로 밀어내도록, 또는 액적이 원하는 신호를 결여하는 것으로 확인된 경우 액적을 출구(215) 아래로 밀어내도록 구성된 유전영동 전극일 수 있다. 식별 연접 전극(212)은 회로 연결점(213a 및 213b)에서 장치에 연결된 식별 연접 접지 회로에 연결된다.
도 16은 본원에 기재된 미세유체 장치의 절단 영역으로 방출된 UV 광의 국한을 표시하는 데이터 세트를 제공한다. 따라서, UV 광은 추가 인코딩된 이펙터가 어세이 유동 경로를 따라 방출되게 하는 미세유체 장치 전체에 걸쳐 산란되지 않는다. 일부 실시양태에서, UV 광을 어세이 유동 경로의 특정 영역으로 표적화하고 국한시키는 것은 소정의 양의 인코딩된 이펙터가 방출되도록 보장하는 데 도움이 된다. 이러한 국한된 UV 방출을 확인하는 예시적인 방법으로서, 어세이 유동 경로는 형광단 염료를 가진 캡슐화물을 포함하는 어세이로 미리 채워질 수 있다. 따라서, 다수의 캡슐화물이 UV 노출 영역(예를 들면, 절단 영역)의 다운스트림에 위치되고, 미세유체 장치의 검출 지점에서 임의의 검출 가능한 신호를 제공할 것으로 예상되지 않는다. 도 16에 도시된 바와 같이, 1218초의 인큐베이션 지연 시간이 표시되고, 이때 검출 가능한 신호를 나타내는 최소 캡슐화 후, 검출 가능한 신호를 가진 상이한 수의 캡슐화물이 있다. 따라서, 방출된 UV 광은 일반적으로 절단 영역을 통과하는 캡슐화물이 어세이 유동 경로를 따라 캡슐화물에 더 노출되는 최소 산란된 광 내에서 UV 광에 노출되도록 미세유체의 절단 영역으로 국한되었다.
도 20은 제공된 도 9a 및 10의 미세유체 장치를 이용하여 형광 어세이 동역학을 수행하는 예를 도시한다. 일부 실시양태에서, 형광은 인큐베이션될 때 인코딩된 이펙터와 샘플 사이의 상호작용의 진행을 측정하기 위해 어세이 유동 경로 내의 다양한 위치에서 측정된다. 도 21은 PMT 방출을 측정하기 위해 주어진 채널 위치에 레이저 스폿을 위치시키는 것에 대한 묘사를 제공한다. 도 23a 내지 24b는 상이한 인큐베이션 시간(PMT 1)에서 어세이에 의해 측정된 강도의 그래픽 출력을 제공한다. 예를 들면, 도 23a 및 23b는 인큐베이션 시간(T=0초)의 초기에 측정된 미처리 신호 및 실시간 평활화 강도를 도시하고, 이때 매우 낮은 카운트가 측정된다(예를 들면, 피크에서 25 카운트). 대조적으로, 도 24a 및 24b는 인큐베이션 시간(T= 1333초)의 분류 전 연접부에서 측정된 미처리 신호 및 실시간 평활화 강도(PMT 1)를 도시하고, 이때 유의미하게 더 높은 카운트가 측정된다(피크에서 대략 380 카운트). 도 25는 표준 마이크로플레이트 어세이와 본원에 기재된 미세유체 장치 사이의 데이터 품질 비교를 제공한다. 도면 기록선은 미세유체 장치의 마이크로플레이트(왼쪽)와 액적 구획(오른쪽) 내에서 프로테아제의 동역학적 활성을 보여준다. 균일한 인큐베이션 시간은 각각의 시점에서 높은 재현성 및 균일성을 제공하여, 분산을 감소시키고 마이크로플레이트보다 더 우수한 음성 대조군에 비해 강한 통계적 유의성을 입증한다.
스크린 정규화 방법
본원은 인코딩된 이펙터를 사용하여 스크린의 출력 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 다른 방법은 이펙터 또는 인코딩물이 스캐폴드에 가변적으로 로딩됨으로 인해 높은 비율의 거짓 음성 또는 양성이라는 문제점을 가진다. 스캐폴드에 로딩된 이펙터 또는 인코딩물의 양의 변화는 스캐폴드에서의 인코딩물/이펙터의 낮은 농도로 인한 것일 수 있거나, 합성, 스크리닝 과정 또는 저장 동안 인코딩물/이펙터의 분해로 인한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 스캐폴드의 인코딩물 수준을 균일한 수준까지 증폭함으로써 이 한계를 극복한다. 따라서, 모든 인코딩물은 실질적으로 동일한 수준으로 존재하고 더 풍부한 인코딩물로부터의 더 높은 신호에 의해 묻혀 버리는 인코딩물은 없다.
추가로, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 스캐폴드에 결합된 이펙터의 농도를 측정하는 수단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전체 라이브러리에서 이펙터 로딩을 측정할 수 있다. 스캐폴드의 이펙터 로드를 알면, 스크린에서 양성 결과를 표시하는 이펙터가 관심 있는 이펙터의 높은 효능 때문인지, 또는 특정 이펙터가 스크리닝된 캡슐화물 내에서 고농도로 존재하였는지를 확인할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 방법은 특정 이펙터가 얼마나 강력하고 이펙터 스크리닝 세트로부터 거짓 양성을 제거하는 데 도움이 될 수 있는지를 용이하게 확인하는 방식을 사용자에게 제공한다.
추가로, 본원은 핵산의 최적 검출을 위해 샘플로부터의 핵산을 인코딩물에 연결하기 위한 프라이머를 증폭하는 방법을 제공한다. 이 증폭 단계가 없는 방법에서, 스캐폴드에 존재하는 낮은 수준의 인코딩물로 인해 샘플에 의해 방출된 핵산의 불완전한 포획이 일어날 수 있다. 낮은 수준의 핵산 포획은 효능 부족으로서 해석될 수 있다. 스크린이 완료되는 동안 또는 완료된 후에 캡슐화물 내의 프라이머를 증폭함으로써 모든 샘플 핵산을 포획할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 스크린에서 핵산 수준의 판독값을 개선한다. 일부 경우, 이것은 다양한 샘플 성분의 발현 수준의 수율 및 지식, 또는 샘플 핵산 포획으로부터 확인될 수 있는 다른 지식을 개선한다.
바코드 정규화 방법
본원은 스크린을 수행한 후 라이브러리 전체에 걸쳐 핵산 인코딩물 수준을 정규화하는 방법을 제공한다. 핵산 인코딩된 이펙터의 라이브러리 스크린 동안, 비드에 결합된 핵산 인코딩물의 수준은 비드마다 실질적으로 상이할 수 있다. 이것은 비드의 합성 동안 낮은 합성 수율에 기인할 수 있거나, 스크린 또는 저장 동안 인코딩물 그 자체의 손상에 기인할 수 있다. 일부 비드는 다른 비드보다 훨씬 과량으로 비드에 결합된 인코딩물의 농도를 가질 수 있다. 결과적으로, 어느 이펙터가 효과적인지를 확인하기 위해 스크린을 수행한 후 생성된 "히트" 비드를 서열분석할 때, 인코딩물의 농도가 낮은 이펙터는 검출하기 어렵다. 이것은 농도가 더 높게 시작되는 인코딩물의 훨씬 더 높은 존재를 야기하는, 서열분석 동안 일어나는 증폭 반응으로 인한 것이다. 예를 들면, 인코딩된 이펙터의 풀링된 수집물로부터 인코딩물을 증폭하는 것은 서열분석 동안 주형 전환 또는 하이브리드화 오류로부터 비롯된 노이즈(예를 들면, 배경 신호)를 생성할 수 있고, 이것은 진정한 이펙터 집단을 잘못 대표하는 키메라 서열을 생성한다. 따라서, 다른 것보다 실질적으로 더 낮은 농도로 존재하는 인코딩물을 검출하기 위해 엄청나게 많은 수의 판독이 요구될 것이다. 이러한 이유로, 스크린 후 핵산 인코딩물의 수준을 정규화하는 방법은 스크린에서 양성 결과를 가진 실질적으로 모든 이펙터의 검출을 가능하게 하기 때문에 매우 바람직하고 유리하다. 예시적인 방법에서, 인코딩된 이펙터의 수집물로부터 각각의 인코딩물의 단리된 증폭은 상이한 인코딩물로부터의 주형이 키메라 서열을 유발하는 기작으로부터 형성되지 못하게 하는 데 도움이 된다.
일부 실시양태에서, 복수의 스크리닝된 인코딩된 이펙터 및 상응하는 스캐폴드는 복수의 상응하는 캡슐화물 내에 제공되고, 이때 각각의 스캐폴드는 상응하는 스크리닝된 인코딩된 이펙터를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 인코딩물에 결합된다. 일부 실시양태에서, 복수의 캡슐화물이 용해된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 결합되지 않은 복수의 캡슐화물 내의 내용물은 제거된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드는 액체 매질에 현탁된다. 그 후, 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드는 복수의 새로운 캡슐화물 내로 캡슐화되고, 이때 각각의 새로운 캡슐화물은 하나 이상의 스캐폴드를 캡슐화한다. 일부 실시양태에서, 비드의 핵산 인코딩물. 일부 실시양태에서, 각각의 비드의 핵산은 증폭되어 상응하는 증폭된 핵산 인코딩물을 형성한다. 일부 실시양태에서, 복수의 새로운 캡슐화물 내의 증폭된 핵산 인코딩물은 각각의 새로운 캡슐화물 내의 핵산 인코딩물 및 시약으로 제한됨으로써, 각각의 인코딩물을 대표하는 앰플리콘의 수의 균일성을 개선한다. 일부 실시양태에서, 각각의 스캐폴드에 대한 증폭된 핵산 인코딩물의 농도가 서로에 대해 최소 수준의 균일성 내에 있도록, 증폭된 핵산 인코딩물을 증폭한다.
핵산 인코딩된 라이브러리는 스크리닝될 수 있다. 임의의 유형의 스크린은 본원에서 제공된 방법 및 시스템과 함께 작동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이전에 수행된 스크린은 본원에서 제공된 스크리닝 방법 중 하나이다. 일부 실시양태에서, 스크리닝된 인코딩된 이펙터는 이전 스크린에서 분류되었다. 일부 실시양태에서, 라이브러리 스크린으로부터의 "히트" 이펙터 비드만이 본 방법에 포함된다. 일부 실시양태에서, 스크리닝된 인코딩된 이펙터 및 상응하는 스캐폴드를 제공하는 단계는 핵산 인코딩된 라이브러리의 스크린을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크린은 스크린에서 양성 결과를 표시한 핵산 인코딩된 이펙터를 분리하는 분류 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 스크리닝된 인코딩된 이펙터 및 상응하는 스캐폴드는 복수의 캡슐화물 내에서 유화액으로 제공된다. 스크리닝된 인코딩된 이펙터 및 스캐폴드를 함유하는 제공된 캡슐화물은 다양한 방법에 의해 용해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 용해시키는 단계는 탈유화 시약, 여과 또는 초음파처리를 유화액에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 용해시키는 단계는 탈유화 시약을 유화액에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 용해시키는 단계는 유화액을 여과하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물을 용해시키는 단계는 탈유화 시약을 유화액에 도입하는 단계를 포함한다.
임의의 탈유화 시약을 본원에서 제공된 방법 및 시스템과 함께 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈유화 시약은 산 또는 염이다. 일부 실시양태에서, 탈유화 시약은 산이다. 일부 실시양태에서, 탈유화 시약은 황산 또는 염산이다. 일부 실시양태에서, 탈유화 시약은 유기산이다. 일부 실시양태에서, 탈유화 시약은 염이다. 일부 실시양태에서, 염은 염화나트륨, 피로인산칼륨, 또는 황산나트륨이다. 일부 실시양태에서, 염은 염화나트륨이다. 일부 실시양태에서, 염은 피로인산칼륨이다. 일부 실시양태에서, 염은 황산나트륨이다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물을 가진 스캐폴드는 결합되지 않은 내용물을 제거하기 위해 세척된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드를 세척하는 것은 세척 완충제로 스캐폴드를 헹구는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 수성 완충제, 유기 용액, 또는 이들의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 수성 완충제이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 pH 4 내지 pH 10이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 pH 5 내지 9이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 pH 6 내지 pH 8이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 pH 7이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 포스페이트 완충제이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 등장성 완충제이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 유기 용액이다. 일부 실시양태에서, 유기 용액은 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 아세토니트릴, 벤젠, 톨루엔, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 헥산, 임의의 다른 유기 용매, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 변성제를 포함한다.
스캐폴드의 세척은 스캐폴드로부터 결합되지 않은 내용물을 제거할 수 있고/있거나, 상응하는 캡슐화물 내에 위치된 결합되지 않은 내용물을 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합되지 않은 내용물의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 하나 이상의 세척 단계 동안 스캐폴드로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 결합되지 않은 내용물의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 하나 이상의 세척 단계 동안 스캐폴드로부터 제거된다.
다회 세척을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 대해 다회 세척 및 수집 단계를 수행한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 각각의 세척 단계 후 원심분리 또는 여과에 의해 수집된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 각각의 세척 단계 후 원심분리에 의해 수집된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 각각의 세척 단계 후 여과에 의해 수집된다. 일부 실시양태에서, 1회 세척 단계가 있다. 일부 실시양태에서, 2회 세척 단계가 있다. 일부 실시양태에서, 세척 단계는 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 이상 반복된다.
세척 단계 후, 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 액체 매질에 현탁된다. 일부 실시양태에서, 액체 매질은 수용액이다. 일부 실시양태에서, 액체 매질은 유기 용매를 포함한다. 일부 실시양태에서, 액체 매질은 핵산 증폭에 적합하다. 일부 실시양태에서, 액체 매질은 증폭 혼합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 복수의 캡슐화("새로운 캡슐화") 내로 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 복수의 액적 내로 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 유화액 내로 재도입된다. 일부 실시양태에서, 각각의 새로운 캡슐화물은 하나 이상의 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 새로운 캡슐화의 대부분이 하나 이상의 단일 스캐폴드를 포함하도록 캡슐화된다. 실시양태에서, 각각의 액적은 증폭 혼합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드를 캡슐화하거나 스캐폴드를 유화액 내로 재도입하는 것은 미세유체 장치를 통해 스캐폴드를 배치하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세유체 장치는 미세유체 칩이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드를 원-포트(one-pot) 유화제에 넣음으로써 스캐폴드를 유화액 내로 재도입한다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 고체 지지체이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머, 또는 다가 분자 어셈블리이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드, 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 유리 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 금속 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 자기 비드이다. 본원에 기재된 시스템 및 방법에서 사용하기 위한 비드는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 최대 10 nm, 최대 100 nm, 최대 1 ㎛, 최대 10 ㎛, 또는 최대 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 1 ㎛, 적어도 10 ㎛ 또는 적어도 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛이다.
일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 별도의 단계에서 새로운 캡슐화물에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 복수의 캡슐화물이 형성된 후에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 스캐폴드가 캡슐화됨과 동시에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 스캐폴드를 유화액 내로 재도입한 후에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 액적 병합에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 캡슐화 단계에서 첨가된다.
증폭 혼합물은 새로운 캡슐화물에서 핵산을 증폭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 PCR 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 실온 증폭을 위한 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 스캐폴드에 대한 증폭된 핵산 인코딩물의 농도가 서로에 대한 균일성의 최소 수준 이내에 있도록, 각각의 스캐폴드의 핵산 인코딩물을 증폭하여 증폭된 핵산 인코딩물을 형성한다. 일부 실시양태에서, 균일성의 최소 수준은 각각의 새로운 캡슐화물에서 핵산 인코딩물의 농도를 포함하고, 이때 새로운 캡슐화의 약 90%는 복수의 새로운 캡슐화물에서 증폭된 핵산 인코딩물의 평균 농도의 약 10% 이내의 증폭된 핵산 인코딩물 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 균일성의 최소 수준은 각각의 새로운 캡슐화물에서 핵산 인코딩물의 농도를 포함하고, 이때 새로운 캡슐화의 약 80%는 복수의 새로운 캡슐화물에서 증폭된 핵산 인코딩물의 평균 농도의 약 20% 이내의 증폭된 핵산 인코딩물 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 균일성의 최소 수준은 각각의 새로운 캡슐화물에서 핵산 인코딩물의 농도를 포함하고, 이때 새로운 캡슐화의 약 75%는 복수의 새로운 캡슐화물에서 증폭된 핵산 인코딩물의 평균 농도의 25% 이내의 증폭된 핵산 인코딩물 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 균일성의 최소 수준은 각각의 새로운 캡슐화물에서 핵산 인코딩물의 농도를 포함하고, 이때 새로운 캡슐화의 약 70% 내지 약 90%는 복수의 새로운 캡슐화물에서 증폭된 핵산 인코딩물의 평균 농도의 약 10% 내지 약 30% 이내의 증폭된 핵산 인코딩물 농도를 가진다. 일부 실시양태에서, 균일성의 최소 수준은 각각의 새로운 캡슐화물에서 핵산 인코딩물의 농도를 포함하고, 이때 새로운 캡슐화의 약 70% 내지 약 90%는 서로의 10배, 15배, 20배, 50배 또는 100배 이내의 증폭된 핵산 인코딩물 농도를 가진다.
일부 실시양태에서, 증폭된 핵산 인코딩물의 서열분석은 방법이 수행되지 않은 핵산 인코딩된 라이브러리보다 더 낮은 배경 신호를 야기한다. 일부 실시양태에서, 배경 신호는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% 감소된다. 일부 실시양태에서, 배경 신호는 적어도 75% 감소된다. 일부 실시양태에서, 배경 신호는 적어도 90% 감소된다. 일부 실시양태에서, 배경 신호는 적어도 95% 감소된다.
일부 실시양태에서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 라이브러리의 평균 인코딩물 농도보다 100배, 1000배, 10000배, 100000배 또는 1000000배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 라이브러리의 평균 인코딩물 농도보다 100배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 라이브러리의 평균 인코딩물 농도보다 1000배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 라이브러리의 평균 인코딩물 농도보다 10000배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 라이브러리의 평균 인코딩물 농도보다 100000배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 라이브러리의 평균 인코딩물 농도보다 1000000배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 한다.
프라이머 증폭 방법
본원은 세포 핵산 포획을 최대화하기 위해 프라이머를 증폭하는 방법을 제공한다. 본원에서 제공된 일부 스크리닝 방법에서, 세포의 핵산 함량은 다양한 이펙터의 핵산 인코딩물에 전달된다. 핵산 인코딩물은 때때로 비드와 같은 스캐폴드에 연결된다. 그러나, 비드의 라이브러리는 비드 상에서 현저히 상이한 수준의 핵산 인코딩물을 가질 수 있는 개별 비드를 포함할 수 있다. 결과적으로, 이러한 비드는 유의미한 수준의 세포 핵산을 부착시킬 수 없거나, 다른 비드는 실질적으로 더 많은 수준의 세포 핵산을 부착시킬 수 있다. 이러한 불일치는 세포 핵산 수준 차이가 다양한 이펙터의 차등 효과로 인한 것인지 아니면 단순히 세포 핵산을 모으는 데 이용될 수 있는 포획 부위가 더 적었는지를 확인하는 것을 어렵게 만든다. 따라서, 세포 핵산을 핵산 인코딩물로 라벨링하기 위해 추가 프라이머를 제공하는 방법은 상당한 이점을 가질 것이다.
한 측면에서, 본원은 세포 핵산 포획을 최대화하기 위해 프라이머를 증폭하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 핵산 인코딩물의 카피(인코딩된 핵산 프라이머)이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 세포, 증폭 혼합물 및 닉킹 효소와 함께 핵산 인코딩된 스캐폴드를 캡슐화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소는 특정 뉴클레오타이드 서열을 표적화한다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산 인코딩된 스캐폴드는 하나 이상의 핵산 인코딩물에 결합된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 인코딩물은 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 용해되어 하나 이상의 세포 핵산을 방출한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 닉킹 효소로 닉킹됨으로써, 인코딩된 핵산 프라이머를 생성한다. 일부 실시양태에서, 닉킹은 대체되는 인코딩물의 단일 가닥을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소는 핵산 인코딩물에서 특정 부위를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 특정 부위는 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물의 닉킹은 인코딩된 핵산 프라이머를 생성한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머는 증폭된다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머는 닉킹 부위와 증폭 혼합물 사이의 상호작용을 통해 증폭된다. 일부 실시양태에서, 방출된 세포 핵산은 인코딩된 핵산 프라이머에 의해 라벨링된다.
일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머의 증폭은 먼저 닉킹 부위로부터 연장된 핵산 인코딩물의 카피를 생성한 후, 핵산 인코딩물 카피를 닉킹하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머의 증폭은 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 대체하는 단계를 동시에 포함한다.
일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 증폭 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 효소는 핵산 인코딩물 카피가 생성되게 한 후, 닉킹이 일어나게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소는 핵산 인코딩물 카피의 카피의 닉킹을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 증폭 효소는 핵산 인코딩물 카피가 동시에 생성 및 대체될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 증폭 효소는 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물 카피의 생성 및 닉킹, 또는 핵산 인코딩물 카피의 동시적 생성 및 대체는 세포 핵산을 라벨링하기 위한 프라이머(코딩된 핵산 프라이머)로서 사용되는 단일 가닥 핵산 인코딩물의 집단을 생성하도록 반복된다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머는 등온 생성된다.
일부 실시양태에서, 각각의 인코딩된 핵산 프라이머는 특정 방출된 세포 핵산을 라벨링하기 위해 표적 세포 핵산을 규정하는 포획 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 표적 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 mRNA는 관심 있는 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소는 핵산 인코딩물을 사용한 표적 mRNA 포획 및 라벨링이 증가될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 표적 mRNA 포획은 적어도 10%, 25%, 50%, 100% 또는 200% 증가된다.
일부 실시양태에서, 복수의 세포 핵산은 각각의 인코딩된 핵산 프라이머에 의해 라벨링된다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩된 스캐폴드는 비드를 포함하고, 인코딩된 핵산 프라이머는 고유 비드 바코드 및 이펙터 인코딩물을 포함한다.
도 3은 본원에 기재된 바와 같이, 세포 핵산 포획을 최대화하기 위해 프라이머를 증폭하는 예시적인 방법을 예시한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 단계 1에서, 핵산 인코딩물이 결합되어 있는 핵산 인코딩된 스캐폴드가 제시되어 있고, 이때 복수의 세포 인코딩물(예를 들면, 핵산)도 용해된 세포로부터 방출된 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩된 스캐폴드 및 세포 인코딩물은 캡슐화물 내에 제공된다. 닉킹 부위는 포획 부위와 함께 핵산 인코딩물에서 확인된다. 일부 실시양태에서, 닉킹 부위는 핵산 인코딩물의 특정 뉴클레오타이드 서열에 상응한다. 단계 2에 나타낸 바와 같이, 핵산 인코딩물은 닉킹 부위에서 닉킹된다. 도시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에서 닉킹은 핵산 인코딩된 스캐폴드로부터 대체되는 인코딩물의 단일 가닥을 지칭한다. 도 3의 단계 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 증폭 효소는 닉킹 부위와 상호작용함으로써, 핵산 인코딩물의 새로운 카피를 생성할 수 있는 반면(단계 4), 이전에 닉킹된 핵산 인코딩물 카피(코딩된 핵산 프라이머)는 결합되지 않고 캡슐화물 내에서 이동하므로, 인코딩된 핵산 프라이머는 단계 5에 나타낸 바와 같이, 방출된 세포 인코딩물(예를 들면, 세포 핵산)과 상호작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머는 세포 인코딩물을 라벨링시킨다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머의 포획 부위는 표적화된 세포 핵산을 규정한다. 일부 실시양태에서, 효소는 이러한 라벨링을 가능하게 한다. 단계 6에 나타낸 바와 같이, 인코딩된 세포 인코딩물은 인코딩된 핵산 프라이머에 의해 라벨링되는 반면, 핵산 인코딩물의 생성된 카피는 스캐폴드로부터 대체되고, 이때 과정은 단계 3으로 되돌아간다.
원하는 핵산을 방출하고 원하는 핵산이 증폭에 사용될 수 있도록 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 세포 용해 완충제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 세제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세제는 SDS, Triton 또는 Tween이다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 세포 용해를 야기하는 화학물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 용해 완충제는 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 세포 용해 완충제는 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 마크로웰, 마이크로웰, 기포, 또는 미세유체 밀폐부이다. 캡슐화물이 형성되면, 캡슐화물 내부의 임의의 구성요소는 캡슐화물이 파괴되거나 분해될 때까지 캡슐화물 내에 남아 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 캡슐화물은 적어도 4시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일 또는 적어도 1주 동안 안정하게 유지된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 캡슐화물 사이에 시약의 혼합이 일어나지 않도록 수행되는 스크린의 지속시간 동안 안정하다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터, 또는 최대 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 적어도 1 피코리터, 적어도 10 피코리터, 적어도 100 피코리터, 적어도 1 나노리터, 적어도 10 나노리터, 적어도 100 나노리터, 또는 적어도 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 액적은 약 200 피코리터 내지 약 10 나노리터이다.
일부 실시양태에서, 액적은 더 큰 오일 바디 내의 수성 액적이다. 일부 실시양태에서, 오일은 비혼화성 담체 유체로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 액적을 오일 유화액에 넣는다. 일부 실시양태에서, 오일은 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 탄화수소 오일, 광유, 파라핀 오일, 할로겐화 오일, 플루오로카본 오일 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 실리콘 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 플루오로실리콘 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 탄화수소 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 광유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 파라핀 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 할로겐화 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 플루오로카본 오일이다.
일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 핵산 인코딩물을 증폭하여 스크린에서 관심 있는 세포 핵산을 라벨링하기 위한 추가 프라이머를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 등온 증폭 혼합물이다. 일부 실시양태에서, 등온 증폭 혼합물은 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 가닥 대체 증폭(SDA), 헬리카제 의존성 증폭(HAD), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 롤링 서클 복제(RCA) 또는 닉킹 효소 증폭 반응(NEAR)을 위한 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 표적 핵산의 등온 증폭을 위한 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 등온 증폭을 위한 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 등온 증폭을 위한 시약은 특정 핵산 서열로 표적화된다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 닉킹 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 닉킹 효소 증폭 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소는 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 닉킹 효소는 제한 효소이다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 역전사효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 혼합물은 증폭 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 효소는 중합효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 관심 있는 특정 뉴클레오타이드 서열은 캡슐화물 내에서 증폭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포 핵산을 증폭하여 증폭된 세포 핵산을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 핵산의 증폭은 PCR에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 세포 핵산의 증폭은 등온 증폭에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포 핵산은 증폭된다. 일부 실시양태에서, 증폭된 세포 핵산은 스캐폴드를 인코딩하는 핵산에 의해 바코딩된다.
이 방법에서 임의의 유형의 스캐폴드를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 고체 지지체로서 작용하고 스캐폴드를 인코딩하는 핵산을 공간에서 스캐폴드에 연결된 상태로 유지한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 하나 이상의 분자가 연결될 수 있게 하는 복수의 부착점을 가진 구조이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드를 인코딩하는 핵산은 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 고체 지지체이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리이다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드, 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 유리 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 금속 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 자기 비드이다.
본원에 기재된 시스템 및 방법에서 사용하기 위한 비드는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 최대 10 nm, 최대 100 nm, 최대 1 ㎛, 최대 10 ㎛, 또는 최대 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 1 ㎛, 적어도 10 ㎛ 또는 적어도 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛이다.
스캐폴드는 스캐폴드에 부착된 이펙터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 본원에 기재된 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사, 효소, 화학 시약, 열, pH 조절, 소리 또는 전기화학적 반응성에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사를 사용함으로써 스캐폴드로부터 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단된 이펙터의 양은 전자기 복사에의 노출의 강도 또는 지속시간에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 시약을 사용함으로써 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단된 이펙터의 양은 캡슐화물 내의 절단 시약의 농도에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 효소를 사용함으로써 스캐폴드로부터 절단된다. 일부 실시양태에서, 효소는 프로테아제, 뉴클레아제 또는 하이드롤라제이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 절단의 속도는 캡슐화물 내의 효소의 양에 의해 제어된다.
일부 실시양태에서, 본 방법에서 증폭된 인코딩된 핵산 프라이머는 핵산 인코딩된 스캐폴드를 이용하는 이펙터를 사용함으로써 스크리닝되는 하나 이상의 세포에서 표적 핵산의 양을 검출하고 정량하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 인코딩된 핵산 프라이머는 표적 핵산과 하이브리드화한다.
일부 실시양태에서, 특정 뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산과 함께 증폭 프라이머로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 특정 뉴클레오타이드 서열을 사용함으로써 스캐폴드를 인코딩하는 핵산에 의해 바코딩된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 스캐폴드를 인코딩하는 핵산에 의해 연장된 특정 뉴클레오타이드 서열을 사용함으로써 스캐폴드를 인코딩하는 핵산에 의해 바코딩된다.
표적 핵산은 세포로부터의 임의의 유형의 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 표적 mRNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 mRNA는 관심 있는 단백질을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 복수의 표적 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 표적 mRNA의 바코딩은 이펙터로 처리된 세포의 발현 핑거프린트를 생성한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 게놈 DNA이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 미토콘드리아 DNA이다.
본원에서 제공된 방법은 스캐폴드를 인코딩하는 핵산을 사용한 표적 핵산 포획 및 라벨링을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 포획은 특정 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 닉킹 효소를 사용하지 않는 방법에 비해 적어도 10%, 25%, 50%, 100% 또는 200% 증가된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 라벨링은 특정 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 닉킹 효소를 사용하지 않는 방법에 비해 적어도 10%, 25%, 50%, 100% 또는 200% 증가된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 포획은 특정 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 닉킹 효소를 사용하지 않는 방법에 비해 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 증가된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 바코딩은 특정 뉴클레오타이드 서열을 표적화하는 닉킹 효소를 사용하지 않는 방법에 비해 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 증가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 인코딩된 핵산 프라이머를 사용한 세포 핵산의 라벨링은 세포 핵산을 바코딩하는 단계를 포함한다. 캡슐화물은 바코딩 시약을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 바코딩 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 인코딩된 핵산 프라이머로 세포 핵산의 바코딩을 수행하기 위해 바코딩 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 증폭된 핵산으로 스캐폴드를 인코딩하는 핵산의 바코딩을 수행하기 위해 바코딩 시약을 추가로 포함한다.
바코딩 시약은 상이한 핵산이 연결될 수 있게 하는 임의의 시약 세트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바코딩 시약은 효소 또는 화학적 가교결합 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 중합효소, 리가제, 제한 효소 또는 재조합효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 추가 시약은 화학적 가교결합 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 가교결합 시약은 소랄렌이다.
본원에 기재된 프라이머의 증폭은 언제든지 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터 스크린과 동시에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 이펙터에 대해 스크리닝된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 스크린은 프라이머 증폭 방법과 동시에 일어난다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프라이머 증폭 방법은 이펙터 스크린 전에 일어난다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 스크린을 위해 핵산 인코딩된 스캐폴드를 제조하는 데 이용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 스크린을 위해 핵산 인코딩된 스캐폴드를 제조하는 데 사용된다.
이펙터 로드 정규화 방법
본원은 스캐폴드 및 스캐폴드 라이브러리 상의 이펙터 로딩을 측정하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터의 라이브러리가 제조될 때, 스캐폴드에 결합된 이펙터의 최종 농도는 개별 스캐폴드 사이에 상당히 상이하다. 이것은 스캐폴드에 구축된 이펙터의 각각의 합성 단계의 수율 차이 때문이다. 결과적으로, 궁극적으로 스크린에서 사용될 때, 상이한 샘플은 상이한 용량의 이펙터를 제공받을 수 있다. 이것은 효능이 낮고 존재도가 높은 이펙터가, 효능이 높고 존재도가 낮은 이펙터의 신호를 압도할 수 있기 때문에 스크린의 결과를 왜곡할 수 있다. 따라서, 라이브러리에서 스캐폴드 상의 이펙터 로딩을 측정하는 방법은 이 결과 왜곡을 피하는 데 도움이 될 수 있다.
본원은 스캐폴드 상의 이펙터 로딩을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 이펙터 서브유닛을 복수의 스캐폴드 상의 이펙터 부착 부위에 부착시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (b) 이펙터 서브유닛을 부착시키는 단계 후에 검출 가능한 표지를 복수의 스캐폴드 상의 임의의 남아 있는 빈 이펙터 부착 부위에 부착시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 복수의 스캐폴드로부터 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 스캐폴드의 서브세트에 부착된 검출 가능한 표지의 양을 측정하여, 이펙터 부착 부위에 성공적으로 부착된 이펙터 서브유닛의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (e) 부착된 이펙터 서브유닛을 임의적으로 활성화시켜 새로운 이펙터 부착 부위를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나열된 단계는 원하는 이펙터가 어셈블링될 때까지 반복된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 이펙터를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터 서브유닛이 스캐폴드에 첨가될 때 서브유닛을 인코딩하는 핵산을 이펙터 서브유닛에 상응하는 스캐폴드에 부착시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 마지막 이펙터 서브유닛이 부착된 후에 활성화 단계는 없다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 독립적으로 아미노산, 소분자 단편, 뉴클레오타이드 또는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 화합물이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 소분자 단편이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 뉴클레오타이드이다.
이펙터 부착 부위는 화학 반응을 수행할 수 있는 임의의 기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 반응성 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 아미노 기, 카르복실레이트 기, 알코올 기, 페놀 기, 알킨 기, 알데하이드 기 또는 케톤 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 아미노 또는 카르복실레이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 바이오오르토고날 또는 CLICK 화학 반응성 기를 포함한다.
인코딩 서브유닛은 이펙터 부착 부위의 반응성 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인코딩 서브유닛은 반응성 작용기와 공유결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 서브유닛은 이펙터 부착 부위에 상보적인 반응성 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 이펙터 부착 부위의 반응성 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 반응성 작용기와 공유결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 이펙터 부착 부위에 상보적인 반응성 기를 포함한다.
검출 가능한 표지는 검출되고 정량될 수 있는 신호를 생성할 수 있는 임의의 표지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광단이다.
일부 실시양태에서, 각각의 이펙터 부착 단계와 관련된 수율이 있다. 일부 실시양태에서, 수율은 이펙터 서브유닛을 부착시키는 단계 후에 빈 이펙터 부착 부위의 측정된 퍼센트이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40% 또는 최대 50%는 이펙터 서브유닛을 부착시키는 단계 후에 빈 상태이다.
원하는 이펙터 합성의 각각의 단계에서 로딩을 정량하기 위해 비드의 서브세트를 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 것은 남아 있는 스캐폴드의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 5% 이하 또는 10% 이하를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 것은 남아 있는 스캐폴드의 1% 이하를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 것은 남아 있는 스캐폴드의 2% 이하를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 것은 남아 있는 스캐폴드의 3% 이하를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 것은 남아 있는 스캐폴드의 5% 이하를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 것은 남아 있는 스캐폴드의 10% 이하를 제거하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위에 성공적으로 부착된 이펙터 서브유닛의 양을 측정하기 위해 스캐폴드의 서브세트에 부착된 검출 가능한 표지의 양을 측정하는 것은 검출 가능한 표지의 측정치를, 부착된 임의의 이펙터 서브유닛을 갖지 않은 스캐폴드 상의 검출 가능한 표지의 측정치와 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드의 서브세트에 성공적으로 부착된 이펙터 서브유닛의 양은 이펙터 서브유닛에 의해 점유된 총 부착 부위의 퍼센트로서 표현된다.
이펙터 서브유닛을 부착시키는 새로운 단계를 시작하기 위해, 이전에 부착된 이펙터 서브유닛을 활성화시킬 필요가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화는 새로운 이펙터 부착 부위의 존재를 드러낸다. 일부 실시양태에서, 부착된 이펙터 서브유닛을 임의적으로 활성화시켜 새로운 이펙터 부착 부위를 생성하는 것은 부착된 이펙터 서브유닛으로부터 보호기를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보호기는 아미노 보호기, 카르복실레이트 보호기, 알코올 보호기, 페놀 보호기, 알킨 보호기, 알데하이드 보호기 또는 케톤 보호기이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 아미노 보호기이다. 일부 실시양태에서, 아미노 보호기는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), tert-부틸옥시카르보닐(BOC), 카르보벤질옥시(Cbz), 벤질(Bz), 토실(Ts) 또는 트리클로로에틸 클로로포르메이트(Troc)이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 카르복실레이트 보호기이다. 일부 실시양태에서, 카르복실레이트 보호기는 메틸 에스테르, 벤질 에스테르, tert-부틸 에스테르, 2,6-이치환된 페놀 에스테르, 실릴 에스테르 또는 오르토에스테르이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 알코올 보호기이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 페놀 보호기이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 알킨 보호기이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 알데하이드 보호기이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 케톤 보호기이다.
새로운 이펙터 부착 부위는 임의의 적합한 반응성 작용기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 새로운 이펙터 부착 부위는 이전의 이펙터 부착 부위와 동일한 작용기이다. 일부 실시양태에서, 새로운 이펙터 부착 부위는 이전의 이펙터 부착 부위와 상이한 작용기이다.
원하는 이펙터는 임의의 수의 단계를 이용함으로써 합성될 수 있고 임의의 수의 이펙터 서브유닛을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (e)는 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 10회 또는 20회 반복된다. 일부 실시양태에서, 원하는 이펙터는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 10개 또는 적어도 20개의 서브유닛으로 구성된다.
임의의 유형의 스캐폴드가 본원에서 제공된 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 유리 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 금속 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 자기 비드이다.
본원에서 제공된 방법에서 사용되는 비드는 임의의 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 중합체 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 폴리스티렌 코어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜로 비드를 유도체화한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜로 비드를 그래프팅한다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 이펙터 또는 인코딩물과 같은 다른 작용기의 부착을 위한 반응성 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 아미노 또는 카르복실레이트 기이다. 일부 실시양태에서, 반응성 기는 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 말단 단부에 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 TentaGel® 비드이다
비드에 부착된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG는 최대 20 kDa이다. 일부 실시양태에서, PEG는 최대 5 kDa이다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 3 kDa이다. 일부 실시양태에서, PEG는 약 2 내지 3 kDa이다.
일부 실시양태에서, PEG 기는 알킬 결합에 의해 비드에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 기는 알킬 결합에 의해 폴리스티렌 비드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비드는 TentaGel® M 수지이다.
일부 실시양태에서, 비드는 알킬 연결을 통해 비드에 부착된 PEG를 포함하고 비드는 2개의 이작용 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 비드의 내부 구획에서 반응성 부위에 대해 오르토고날적으로 보호된 비드의 외면에서 표면 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 절단 가능한 리간드 및 절단 불가능한 리간드 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 TentaGel® B 수지이다.
본원에 기재된 시스템 및 방법에서 사용하기 위한 비드는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 최대 10 nm, 최대 100 nm, 최대 1 ㎛, 최대 10 ㎛ 또는 최대 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 1 ㎛, 적어도 10 ㎛ 또는 적어도 100 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 비드는 직경이 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛이다.
이펙터를 인코딩하는 핵산은 기재된 방법에서 사용된다. 이펙터를 인코딩하는 핵산은 미리 합성된 핵산으로서 스캐폴드에 결합될 수 있거나, 이펙터와 동시에 합성될 수 있거나, 이펙터의 합성 전에 스캐폴드 상에서 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터를 인코딩하는 핵산은 스캐폴드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터 서브유닛이 스캐폴드에 첨가될 때 서브유닛을 인코딩하는 핵산을 이펙터 서브유닛에 상응하는 스캐폴드에 부착시키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방법은 스캐폴드 상의 이펙터 라이브러리에 적용될 때 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 이펙터의 라이브러리는 병렬로 합성된다. 일부 실시양태에서, 이펙터의 라이브러리는 개별 웰에서 합성된다. 일부 실시양태에서, 이펙터의 라이브러리는 고처리량 합성 기법을 이용함으로써 합성된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 로딩된 스캐폴드의 라이브러리는 동시에 합성된다. 이펙터 로딩된 스캐폴드의 라이브러리는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 적어도 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개, 1015개 또는 1016개의 이펙터 로딩된 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 이펙터 로딩된 스캐폴드는 고유 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일부 이펙터 로딩된 스캐폴드는 라이브러리에서 반복된다.
일부 실시양태에서, 라이브러리로부터의 이펙터 부착 단계로부터 비드 서브세트를 검출 가능한 표지의 검출 전에 풀링한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리의 모든 스캐폴드로부터 비드 서브세트를 함께 풀링한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리의 스캐폴드로부터 비드 서브세트의 일부를 함께 풀링한다.
추가 분석을 위해 비드의 풀링된 서브세트를 캡슐화물 내에 넣는다. 캡슐화물은 더 큰 시스템 내에서의 구획의 형성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 마크로웰, 마이크로웰, 기포 또는 미세유체 밀폐부이다. 일부 실시양태에서, 대부분의 캡슐화물은 단일 스캐폴드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 적어도 1 피코리터, 적어도 10 피코리터, 적어도 100 피코리터, 적어도 1 나노리터, 적어도 10 나노리터, 적어도 100 나노리터 또는 적어도 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 액적은 약 200 피코리터 내지 약 10 나노리터이다.
일부 실시양태에서, 액적은 더 큰 오일 바디 내의 수성 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적을 오일 유화액에 넣는다. 일부 실시양태에서, 오일은 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 탄화수소 오일, 광유, 파라핀 오일, 할로겐화 오일, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 실리콘 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 플루오로실리콘 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 탄화수소 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 광유를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 파라핀 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 할로겐화 오일을 포함한다.
스캐폴드를 캡슐화물에 넣은 후, 스캐폴드에 결합된 형광단의 수준을 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드의 서브세트로부터의 스캐폴드는 검출된 검출 가능한 표지의 양에 따라 비닝된다. 일부 실시양태에서, 각각의 빈은 검출된 검출 가능한 표지의 고유 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 빈은 이펙터 서브유닛이 로딩되어 있지 않은 스캐폴드에 비해 검출된 검출 가능한 표지의 0% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75% 및 75% 내지 100% 로딩에 상응한다. 일부 실시양태에서, 빈은 이펙터 서브유닛이 로딩되어 있지 않은 스캐폴드에 비해 검출된 검출가능한 표지의 0% 내지 20%, 20% 내지 40%, 40% 내지 60%, 60% 내지 80% 및 80% 내지 100% 로딩에 상응한다. 일부 실시양태에서, 빈은 이펙터 서브유닛이 로딩되어 있지 않은 스캐폴드에 비해 검출된 검출 가능한 표지의 0% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 및 90% 내지 100% 로딩에 상응한다. 빈의 임의의 조합은 본원에서 제공된 방법 및 시스템과 함께 사용되도록 허용될 수 있다. 그 다음, 빈을 서열분석하여, 부착 단계에서 어느 이펙터가 특정 수율을 갖는지를 보여줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 풀의 인코딩 핵산 또는 인코딩 핵산 서브유닛을 서열분석하여, 이펙터 서브유닛을 이펙터 부착 부위에 부착시키는 단계에서 어느 이펙터 서브유닛이 특정 수율에 상응하는지를 보여주는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석 단계는 단계 (a) 내지 (e)가 반복될 때마다 수행된다. 일부 실시양태에서, 각각의 고유 스캐폴드에 대한 각각의 단계 (a) 내지 (e)의 수율을 수집하여, 각각의 스캐폴드 상에서의 완전한 원하는 이펙터의 로딩을 보여주는 데이터세트를 생성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 고유 스캐폴드에 대한 각각의 인코더 서브유닛의 부착 수율을 수집하여, 각각의 스캐폴드 상에서의 완전한 원하는 이펙터의 로딩을 보여주는 데이터세트를 생성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 고유 스캐폴드 상에서의 원하는 이펙터의 로딩을 계산한다.
스크리닝 장치 및 이용 방법
본원은 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 데 이용되는 장치 및 이용 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 장치는 인코딩된 이펙터를 위치에 고정시킨다. 일부 실시양태에서, 스크리닝되는 샘플을 위치에 유사하게 고정시킨다. 이들 둘을 제자리에 고정시킴으로써, 캡슐화물이 분해되거나 다른 캡슐화와 병합될 위험을 최소화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물에 대한 필요성이 완전히 제거된다. 또한, 장치의 특정 위치에서 이펙터의 구조를 아는 것은 사용자로 하여금 어느 이펙터가 샘플에 대한 원하는 효과를 갖는지를 용이하게 확인할 수 있게 한다. 이하에 기재된 장치는 본원의 다른 곳에 기재된 방법들 중 임의의 방법과 호환될 수 있다.
핵산 패치 어레이
본원은 인코딩된 비드를 스크리닝하는 어레이를 제공한다. 어레이는 소수성 표면에 산재된 핵산 패치를 포함할 수 있다. 소수성 패치 상에서의 핵산 패치의 위치선정은 액체 매질이 장치에 첨가될 때 액적이 핵산 패치의 캡슐화물을 형성하나, 소수성 표면이 매질 부재 상태로 남아 있게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 그 자신의 액적에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 매질이 첨가된 후 상이한 핵산 패치 사이에 액체 또는 유체 연결이 존재하지 않는다. 핵산 패치는 비드, 세포 또는 이들 둘 다에 결합할 수 있다. 추가로, 어레이는 표면 아래에서 채널을 추가로 포함할 수 있다. 채널은 유체가 채널을 통해 핵산 패치로 유동할 수 있게 하는 말단 단부를 가질 수 있다. 이러한 채널은 시약을 핵산 패치에 첨가할 수 있게 한다.
한 측면에서, 본원은 인코딩된 비드를 스크리닝하는 어레이 장치를 제공한다. 일부 실시양태에서, 장치는 소수성 표면을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 핵산 패치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 소수성 표면에 산재되어 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 표면 및 핵산 패치는 규정된 양의 매질이 표면을 가로질러 전개될 때 각각의 핵산 패치가 매질로 덮이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치 사이의 소수성 표면은 매질을 함유하지 않는다.
어레이 장치는 채널을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 소수성 표면 아래에서 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 실시양태에서, 네트워크로부터의 채널. 일부 실시양태에서, 채널은 미세유체 채널이다. 일부 실시양태에서 채널은 분지된다. 일부 실시양태에서, 채널은 핵산 패치 내에 말단 단부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 어레이의 각각의 핵산 패치 내에 말단 단부를 포함한다.
채널은 액체 용액을 핵산 패치에 전달하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 시약을 핵산 패치에 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 시약은 액체 용액으로서 전달된다. 일부 실시양태에서, 액체 용액은 수용액이다.
채널은 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 채널은 약 0.1 ㎛, 약 0.5 ㎛, 약 1 ㎛, 약 5 ㎛, 약 10 ㎛ 또는 약 20 ㎛의 직경을 가진다. 일부 실시양태에서, 채널은 최대 약 0.1 ㎛, 최대 약 0.5 ㎛, 최대 약 1 ㎛, 최대 약 5 ㎛, 최대 약 10 ㎛ 또는 최대 약 20 ㎛의 직경을 가진다. 일부 실시양태에서, 채널은 적어도 약 0.1 ㎛, 적어도 약 0.5 ㎛, 적어도 약 1 ㎛, 적어도 약 5 ㎛, 적어도 약 10 ㎛ 또는 적어도 약 20 ㎛의 직경을 가진다.
소수성 표면은 임의의 적합한 소수성 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 표면은 소수성 중합체로 구성된다. 일부 실시양태에서, 소수성 표면은 소수성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 폴리아크릴, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리디엔, 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리플루오로카본, 폴리올레핀, 폴리스티렌, 폴리비닐 아세탈, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 피리딘, 폴리비닐피롤리돈, 폴리실란, 폴리플루오로실란, 폴리퍼플루오로실란 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 폴리플루오로카본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 폴리퍼플루오로카본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 플루오르화된다.
소수성 표면은 소수성을 가진 기로 작용화된 표면일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 표면은 소수성 기로 작용화된 표면이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 지방산, 알킬 기, 알콕시 기, 방향족 기, 알킬 실란, 플루오로실란, 퍼플루오로실란 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 퍼플루오로실란이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 지방산이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 플루오르화 지방산이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 퍼플루오르화 지방산이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 플루오르화된다.
소수성 표면은 원하는 결합 성질을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 소수성 표면에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 소수성 표면에서 생장하지 않는다.
핵산 패치는 원하는 결합 성질을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 비특이적 상호작용을 통해 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 특이적 상호작용을 통해 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 매질을 끌어들이도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 단일 핵산 패치는 매질의 단일 액적 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 비드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 핵산 인코딩된 비드이다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 비드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 핵산 인코딩된 비드에 결합할 수 있는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 비드 상의 상보적 핵산에 결합하거나, 비드 상의 또 다른 기에 결합함으로써, 비드에 비특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 비드 상의 상보적 핵산에 결합하거나, 비드 상의 또 다른 기에 결합함으로써, 핵산 인코딩된 비드에 비특이적으로 결합한다.
핵산 패치는 임의의 유형의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 DNA, RNA, 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 단일 가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 이중 가닥 RNA를 포함한다.
핵산 패치는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 크기가 최대 약 1 ㎛2, 최대 약 10 ㎛2, 최대 약 100 ㎛2, 최대 약 1000 ㎛2 또는 최대 약 10000 ㎛2이다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 크기가 적어도 약 1 ㎛2, 적어도 약 10 ㎛2, 적어도 약 100 ㎛2, 적어도 약 1000 ㎛2 또는 적어도 약 10000 ㎛2이다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 크기가 약 1 ㎛2, 약 10 ㎛2, 약 100 ㎛2, 약 1000 ㎛2 또는 약 10000 ㎛2이다.
핵산 패치는 정의된 거리에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 최대 약 1 ㎛, 최대 약 10 ㎛, 최대 약 100 ㎛, 최대 약 1000 ㎛ 또는 최대 약 10000 ㎛에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 적어도 약 1 ㎛, 적어도 약 10 ㎛, 적어도 약 100 ㎛, 적어도 약 1000 ㎛ 또는 적어도 약 10000 ㎛에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 약 1 ㎛, 약 10 ㎛, 약 100 ㎛, 약 1000 ㎛ 또는 약 10000 ㎛에 의해 분리된다.
핵산 패치는 임의의 구성으로 표면에 배열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 격자 패턴으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 무작위로 분포된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 원형 구성으로 배열된다.
핵산 패치는 표면에서 임의의 밀도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치의 밀도는 적어도 100개 패치/cm2, 적어도 1000개 패치/cm2, 적어도 10000개 패치/cm2, 적어도 100000개 패치/cm2, 적어도 1000000개 패치/cm2 또는 적어도 10000000개 패치/cm2이다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치의 밀도는 약 100개 패치/cm2, 약 1000개 패치/cm2, 약 10000개 패치/cm2, 약 100000개 패치/cm2, 약 1000000개 패치/cm2 또는 약 10000000개 패치/cm2이다.
어레이 장치는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치의 표면적은 적어도 1 cm2, 적어도 5 cm2, 적어도 10 cm2, 적어도 25 cm2, 적어도 50 cm2, 적어도 100 cm2, 적어도 500 cm2 또는 적어도 1000 cm2이다. 일부 실시양태에서, 장치의 표면적은 약 1 cm2, 약 5 cm2, 약 10 cm2, 약 25 cm2, 약 50 cm2, 약 100 cm2, 약 500 cm2 또는 약 1000 cm2이다. 일부 실시양태에서, 장치의 표면적은 최대 1 cm2, 최대 5 cm2, 최대 10 cm2, 최대 25 cm2, 최대 50 cm2, 최대 100 cm2, 최대 500 cm2 또는 최대 1000 cm2이다.
한 측면에서, 본원은 본원에 기재된 어레이를 사용하여 스크린을 수행하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 핵산 인코딩된 비드를 어레이의 핵산 패치에 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 핵산 인코딩된 비드를 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 핵산 패치에 결합된다. 일부 실시양태에서, 어세이는 어레이에서 수행된다.
비드는 이펙터를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드는 핵산 인코딩된 이펙터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 비드로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 절단 가능한 링커를 절단함으로써 방출된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 시약에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 절단 시약을 핵산 패치에 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시약은 표면 아래의 채널을 통해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 채널을 통해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 채널을 통해 첨가된다.
비드의 서열분석은 공간에서 인코딩된 비드의 위치가 확인될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 비드의 서열분석은 특정 핵산 인코딩된 비드의 물리적 위치가 확인될 수 있게 한다.
어레이에서 임의의 어세이를 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 어세이는 검출 가능한 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 전자기 복사이다. 일부 실시양태에서, 신호는 형광 또는 발광이다.
핵산 패치는 임의의 양의 세포 또는 비드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 단일 비드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 단일 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 단일 비드 및 단일 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 복수의 비드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 복수의 세포에 결합한다.
넘버링된 실시양태
하기 실시양태는 본원에 개시된 특징의 조합의 비제한적 순열을 언급한다. 특징의 조합의 다른 순열도 고려된다. 특히, 이 넘버링된 실시양태들 각각은 그들의 나열된 순서와 무관하게 모든 선행 또는 후속 넘버링된 실시양태에 의존하거나 이러한 실시양태와 관련된 것으로서 간주된다.
실시양태 1: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 샘플, 인코딩된 이펙터 및 인코딩물을 캡슐화물 내에 제공하는 단계로서, 상기 인코딩된 이펙터가 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합된 것인 단계; b) 활성화 시약을 사용하여 절단 가능한 링커를 활성화시키는 단계; c) 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출하도록 절단 가능한 링커를 절단하는 단계; d) 인코딩된 이펙터와 샘플의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물로부터 검출하는 단계; 및 e) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계. 실시양태 2: 실시양태 1에 있어서, 활성화 시약을 단계 (a)에서 캡슐화물 내에 제공하는 것인 방법. 실시양태 3: 실시양태 1에 있어서, 활성화 시약을 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 4: 실시양태 3에 있어서, 활성화 시약을 피코주입으로 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 5: 실시양태 1에 있어서, 활성화 시약을 액적 병합으로 캡슐화물에 첨가하고, 여기서 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 6: 실시양태 1에 있어서, 활성화 시약은 디설파이드 환원 시약인 방법. 실시양태 7: 실시양태 1에 있어서, 활성화 시약은 테트라진인 방법. 실시양태 8: 실시양태 1에 있어서, 절단 가능한 링커를 활성화시키는 데 사용되는 활성화 시약의 농도는 최대 100 피코몰(pM), 최대 500 pM, 최대 1 나노몰(nM), 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 마이크로몰(μM), 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 밀리몰(mM), 최대 10 mM, 최대 100 mM 또는 최대 500 mM인 방법. 실시양태 9: 실시양태 1에 있어서, 활성화 시약을 캡슐화물에서 원하는 최종 농도보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 더 농축된 스톡 용액으로부터 첨가하는 것인 방법. 실시양태 10: 실시양태 1에 있어서, 스캐폴드로부터 방출되는 이펙터의 소정의 양은 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 250 mM의 농도인 방법. 실시양태 11: 실시양태 1에 있어서, 절단 가능한 링커는 디설파이드 또는 치환된 트랜스사이클로옥텐인 방법. 실시양태 12: 실시양태 1에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 세포, 단백질, 효소, 핵산, 세포 용해물, 조직 추출물 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 13: 실시양태 12에 있어서, 샘플은 하나 이상의 세포, 단백질 또는 효소인 방법. 실시양태 14: 실시양태 1에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 15: 실시양태 14에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 16: 실시양태 15에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법. 실시양태 17: 실시양태 15에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 방법. 실시양태 18: 실시양태 1에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 방법. 실시양태 19: 실시양태 18에 있어서, 인코딩된 이펙터는 비천연 펩타이드인 방법. 실시양태 20: 실시양태 18에 있어서, 인코딩된 이펙터는 중합체인 방법. 실시양태 21: 실시양태 18에 있어서, 화합물은 약물 유사 소분자인 방법. 실시양태 22: 실시양태 1에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 23: 실시양태 22에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 24: 실시양태 1에 있어서, 신호는 전자기 복사, 열 복사, 샘플의 시각적 변화 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 25: 실시양태 24에 있어서, 전자기 복사는 가시광선 스펙트럼 내에 있는 것인 방법. 실시양태 26: 실시양태 24에 있어서, 전자기 복사는 형광 또는 발광인 방법. 실시양태 27: 실시양태 26에 있어서, 신호는 TaqMan 프로브 또는 분자 비콘에 의해 방출된 형광인 방법. 실시양태 28: 실시양태 24에 있어서, 신호는 적외선 카메라에 의해 검출되는 열 복사를 포함하는 것인 방법. 실시양태 29: 실시양태 24에 있어서, 신호는 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화를 포함하는 것인 방법. 실시양태 30: 실시양태 1에 있어서, 이펙터와 샘플이 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 31: 실시양태 30에 있어서, 상기 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되고, 이때 각각의 캡슐화의 체류 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 캡슐화의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 방법. 실시양태 32: 실시양태 31에 있어서, 최대 분산은 최대 약 3% 내지 약 10%인 방법. 실시양태 33: 실시양태 1에 있어서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 이상인 경우 액적을 제1 수집 튜브 내에 넣거나, 신호가 소정의 역치 미만인 경우 액적을 제2 수집 튜브에 넣는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 34: 실시양태 1에 있어서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형 또는 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 이용하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 35: 실시양태 1에 있어서, 캡슐화물은 오일 중의 유화액인 방법. 실시양태 36: 실시양태 1에 있어서, 인코딩물은 핵산이고, 인코딩 핵산을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 37: 실시양태 36에 있어서, 인코딩물을 서열분석 전에 스캐폴드로부터 절단하는 것인 방법. 실시양태 38: 실시양태 37에 있어서, 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계는 절단 시약을 사용하거나 전자기 복사를 통해 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 39: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 샘플, 인코딩된 이펙터 및 인코딩물을 캡슐화물 내에 제공하는 단계로서, 인코딩된 이펙터가 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되는 것인 단계; b) 절단 가능한 링커를 절단 시약으로 절단하는 단계로서, 절단 시약이 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출하도록 구성된 농도로 첨가되는 것인 단계; c) 인코딩된 이펙터와 샘플의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물로부터 검출하는 단계; 및 d) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계. 실시양태 40: 실시양태 39에 있어서, 절단제를 피코주입으로 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 41: 실시양태 39에 있어서, 캡슐화물을 형성하는 단계로부터 분리된 단계에서 절단 시약을 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 42: 실시양태 39에 있어서, 캡슐화의 형성 전에 절단 시약 및 샘플을 포함하는 용액을 사용하여 절단 시약을 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 43: 실시양태 39에 있어서, 절단 가능한 링커를 절단하는 데 사용되는 절단 시약의 농도는 최대 100 피코몰(pM), 최대 500 pM, 최대 1 나노몰(nM), 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 마이크로몰(μM), 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 밀리몰(mM), 최대 10 mM, 최대 100 mM 또는 최대 500 mM인 방법. 실시양태 44: 실시양태 39에 있어서, 절단 시약을 캡슐화물에서 원하는 최종 농도보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 더 농축된 스톡 용액으로부터 첨가하는 것인 방법. 실시양태 45: 실시양태 39에 있어서, 스캐폴드로부터 방출된 이펙터의 소정의 양은 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 250 mM의 농도인 방법. 실시양태 46: 실시양태 39에 있어서, 절단 가능한 링커는 디설파이드 또는 치환된 트랜스사이클로옥텐인 방법. 실시양태 47: 실시양태 39에 있어서, 절단제는 디설파이드 환원 시약인 방법. 실시양태 48: 실시양태 39에 있어서, 절단제는 테트라진인 방법. 실시양태 49: 실시양태 39에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 세포, 단백질, 효소, 핵산, 세포 용해물, 조직 추출물 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 50: 실시양태 49에 있어서, 샘플은 하나 이상의 세포, 단백질 또는 효소인 방법. 실시양태 51: 실시양태 49에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 52: 실시양태 51에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 53: 실시양태 52에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법. 실시양태 54: 실시양태 52에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 방법. 실시양태 55: 실시양태 39에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 방법. 실시양태 56: 실시양태 55에 있어서, 인코딩된 이펙터는 비천연 펩타이드인 방법. 실시양태 57: 실시양태 55에 있어서, 인코딩된 이펙터는 중합체인 방법. 실시양태 58: 실시양태 55에 있어서, 화합물은 약물 유사 소분자인 방법. 실시양태 59: 실시양태 39에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 60: 실시양태 59에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 61: 실시양태 39에 있어서, 신호는 전자기 복사, 열 복사, 샘플의 시각적 변화 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 62: 실시양태 61에 있어서, 전자기 복사는 가시광선 스펙트럼 내에 있는 것인 방법. 실시양태 63: 실시양태 61에 있어서, 전자기 복사는 형광 또는 발광인 방법. 실시양태 64: 실시양태 63에 있어서, 신호는 TaqMan 프로브 또는 분자 비콘에 의해 방출된 형광인 방법. 실시양태 65: 실시양태 61에 있어서, 신호는 적외선 카메라에 의해 검출되는 열 복사를 포함하는 것인 방법. 실시양태 66: 실시양태 61에 있어서, 신호는 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화를 포함하는 것인 방법. 실시양태 67: 실시양태 39에 있어서, 이펙터와 샘플이 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 68: 실시양태 67에 있어서, 상기 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되고, 이때 각각의 캡슐화의 체류 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 캡슐화의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 방법. 실시양태 69: 실시양태 68에 있어서, 최대 분산은 최대 약 3% 내지 약 10%인 방법. 실시양태 70: 실시양태 39에 있어서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 이상인 경우 액적을 제1 수집 튜브 내에 넣거나, 신호가 소정의 역치 미만인 경우 액적을 제2 수집 튜브에 넣는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 71: 실시양태 39에 있어서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형 또는 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 이용하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 72: 실시양태 39에 있어서, 캡슐화물은 오일 중의 유화액인 방법. 실시양태 73: 실시양태 39에 있어서, 인코딩물은 핵산이고, 인코딩 핵산을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 74: 실시양태 73에 있어서, 인코딩물을 서열분석 전에 스캐폴드로부터 절단하는 것인 방법. 실시양태 75: 실시양태 74에 있어서, 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계는 절단 시약을 사용하거나 전자기 복사를 통해 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 76: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 적어도 하나의 세포 및 스캐폴드를 캡슐화물 내에 제공하는 단계로서, 상기 스캐폴드가 광절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터 및 상기 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; b) 광절단 가능한 링커를 절단하여, 스캐폴드로부터 인코딩된 이펙터를 방출시키는 단계; 및 c) 인코딩된 이펙터와 적어도 하나의 세포 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 액적으로부터 검출하는 단계. 실시양태 77: 실시양태 76에 있어서, 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 78: 실시양태 77에 있어서, 액적을 분류하는 단계는 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형 또는 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 액적을 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 이용하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 79: 실시양태 77에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산을 서열분석함으로써 인코딩된 이펙터를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 80: 실시양태 76에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산을 바코딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 81: 실시양태 80에 있어서, 바코딩은 시약을 액적에 첨가함으로써 달성되는 것인 방법. 실시양태 82: 실시양태 76에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 액적 내로 방출하는 것인 방법. 실시양태 83: 실시양태 76에 있어서, 전자기 복사를 이용하여 광절단 가능한 링커를 절단하는 것인 방법. 실시양태 84: 실시양태 76에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 85: 실시양태 84에 있어서, 광은 보정된 양의 광인 방법. 실시양태 86: 실시양태 84에 있어서, 광은 UV 광인 방법. 실시양태 87: 실시양태 84에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 방법. 실시양태 88: 실시양태 76에 있어서, 신호를 검출하는 단계는 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 변화를 검출하거나, 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 89: 실시양태 76에 있어서, 인코딩된 이펙터와 세포의 상호작용은 하나 이상의 세포 구성요소의 억제를 포함하는 것인 방법. 실시양태 90: 실시양태 76에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산을 서열분석함으로써 인코딩된 이펙터를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 91: 실시양태 76에 있어서, 2개 이상의 세포를 스캐폴드에 제공하는 것인 방법. 실시양태 92: 실시양태 76에 있어서, 인코딩된 이펙터로부터 광절단 가능한 링커가 절단될 수 있도록 활성화 시약을 제공하여 광절단 가능한 링커를 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 93: 실시양태 92에 있어서, 활성화 시약을 캡슐화물에 제공하는 것인 방법. 실시양태 94: 실시양태 92에 있어서, 피코주입 또는 액적 병합을 통해 활성화 시약을 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 95: 실시양태 76에 있어서, 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 96: 실시양태 95에 있어서, 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계는 용해 완충제를 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 97: 실시양태 96에 있어서, 용해 완충제를 피코주입으로 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 98: 실시양태 76에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 99: 실시양태 98에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 100: 실시양태 98에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법. 실시양태 101: 실시양태 98에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 방법. 실시양태 102: 실시양태 76에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 방법. 실시양태 103: 실시양태 102에 있어서, 인코딩된 이펙터는 비천연 펩타이드인 방법. 실시양태 104: 실시양태 102에 있어서, 인코딩된 이펙터는 중합체인 방법. 실시양태 105: 실시양태 102에 있어서, 화합물은 약물 유사 소분자인 방법. 실시양태 106: 실시양태 76에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 107: 실시양태 106에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 108: 실시양태 76에 있어서, 이펙터와 적어도 하나의 세포가 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 액적을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 109: 실시양태 108에 있어서, 상기 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되고, 이때 각각의 캡슐화의 체류 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 캡슐화의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 방법. 실시양태 110: 실시양태 109에 있어서, 최대 분산은 최대 약 3% 내지 약 10%인 방법. 실시양태 33에 있어서, 액적을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 이상인 경우 액적을 제1 수집 튜브 내에 넣거나, 신호가 소정의 역치 미만인 경우 액적을 제2 수집 튜브에 넣는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 111: 실시양태 76에 있어서, 신호는 전자기 복사, 열 복사, 샘플의 시각적 변화 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 112: 실시양태 111에 있어서, 전자기 복사는 가시광선 스펙트럼 내에 있는 것인 방법. 실시양태 113: 실시양태 111에 있어서, 전자기 복사는 형광 또는 발광인 방법. 실시양태 114: 실시양태 113에 있어서, 신호는 TaqMan 프로브 또는 분자 비콘에 의해 방출된 형광인 방법. 실시양태 115: 실시양태 111에 있어서, 신호는 적외선 카메라에 의해 검출되는 열 복사를 포함하는 것인 방법. 실시양태 116: 실시양태 111에 있어서, 신호는 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화를 포함하는 것인 방법.
실시양태 117: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 샘플, 인코딩된 이펙터 및 인코딩물을 캡슐화물 내에 제공하는 단계; b) 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 검출하는 단계로서, 신호의 검출이 1) 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 변화를 검출하는 것, 2) 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것, 또는 3) 이들의 조합을 포함하는 것인 단계; 및 c) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계. 실시양태 118: 실시양태 117에 있어서, 신호는 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 119: 실시양태 118에 있어서, 캡슐화물은 검출 시약을 추가로 포함하는 것인 방법. 실시양태 120: 실시양태 119에 있어서, 검출 시약은 인터칼레이션 염료를 포함하는 것인 방법. 실시양태 121: 실시양태 120에 있어서, 인터칼레이션 염료는 브롬화에티듐, 요오드화프로피듐, 크리스탈 바이올렛, dUTP-접합 프로브, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌), 7-AAD(7-아미노액티노마이신 D), Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, 이들의 조합 또는 이들의 유도체를 포함하는 것인 방법. 실시양태 122: 실시양태 118에 있어서, 캡슐화물 내의 샘플의 일련의 이미지를 중첩시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 123: 실시양태 117에 있어서, 신호는 분자 비콘 또는 TaqMan 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 124: 실시양태 123에 있어서, 신호는 샘플의 표적 핵산 서열의 일부에 상보적인 분자 비콘에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 125: 실시양태 123에 있어서, 신호는 표적 핵산 서열의 일부에 상보적인 TaqMan 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 126: 실시양태 123에 있어서, 캡슐화물은 Taq 중합효소를 추가로 포함하는 것인 방법. 실시양태 127: 실시양태 123에 있어서, TaqMan 프로브 또는 분자 비콘을 피코주입으로 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 128: 실시양태 117에 있어서, 인코딩된 이펙터는 스캐폴드에 부착된 것인 방법. 실시양태 129: 실시양태 128에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 130: 실시양태 129에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 131: 실시양태 128에 있어서, 인코딩된 이펙터는 스캐폴드에 공유결합된 것인 방법. 실시양태 132: 실시양태 128에 있어서, 인코딩된 이펙터는 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합된 것인 방법. 실시양태 133: 실시양태 132에 있어서, 절단 가능한 링커는 디설파이드 또는 치환된 트랜스사이클로옥텐인 방법. 실시양태 134: 실시양태 132에 있어서, 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 135: 실시양태 134에 있어서, 스캐폴드로부터 절단된 인코딩된 이펙터의 수는 전자기 복사에의 노출 강도 또는 지속시간에 의해 제어되는 것인 방법. 실시양태 136: 실시양태 134에 있어서, 스캐폴드로부터 절단된 인코딩된 이펙터의 수는 캡슐화물 내의 절단 시약의 농도를 제어함으로써 제어되는 것인 방법. 실시양태 137: 실시양태 136에 있어서, 절단 시약을 피코주입으로 첨가하는 것인 방법. 실시양태 138: 실시양태 134에 있어서, 절단 가능한 링커는 활성화 시약과 상호작용함으로써, 절단 가능한 링커가 절단될 수 있게 함으로써 활성화되는 것인 방법. 실시양태 139: 실시양태 134에 있어서, 인코딩된 이펙터는 캡슐화물 내에 원하는 농도로 방출되는 것인 방법. 실시양태 140: 실시양태 117에 있어서, 인코딩된 이펙터와 샘플이 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 141: 실시양태 140에 있어서, 상기 일정 시간은 적어도 1분, 적어도 10분, 적어도 1시간, 적어도 4시간 또는 적어도 1일인 방법. 실시양태 142: 실시양태 140에 있어서, 상기 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되고, 이때 각각의 캡슐화의 체류 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 캡슐화의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 방법. 실시양태 143: 실시양태 142에 있어서, 최대 분산은 최대 약 3% 내지 약 10%인 방법. 실시양태 144: 실시양태 142에 있어서, 체류 시간은 미세유체 채널을 통과하는 유속, 미세유체 채널의 기하구조 또는 미세유체 채널의 밸브를 통해 제어되거나, 미세유체 채널로부터 하나 이상의 액적을 제거하고 하나 이상의 액적을 별도의 용기에 전달함으로써 제어되는 것인 방법. 실시양태 145: 실시양태 117에 있어서, 인코딩된 이펙터는 화합물, 펩타이드, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산을 포함하는 것인 방법. 실시양태 146: 실시양태 145에 있어서, 인코딩된 이펙터는 비천연 펩타이드인 방법. 실시양태 147: 실시양태 145에 있어서, 인코딩된 이펙터는 중합체인 방법. 실시양태 148: 실시양태 145에 있어서, 화합물은 약물 유사 소분자인 방법. 실시양태 149: 실시양태 117에 있어서, 샘플은 하나 이상의 세포를 포함하는 것인 방법. 실시양태 150: 실시양태 149에 있어서, 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 151: 실시양태 117에 있어서, 신호를 검출하는 단계는 검출기를 포함하는 미세유체 채널을 통해 하나 이상의 액적을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 152: 실시양태 117에 있어서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 신호가 소정의 역치 이상인 경우 캡슐화물을 제1 수집 튜브 내에 넣거나, 신호가 소정의 역치 미만인 경우 캡슐화물을 제2 수집 튜브에 넣는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 153: 실시양태 117에 있어서, 캡슐화물을 분류하는 단계는 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형 또는 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 이용하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 154: 실시양태 117에 있어서, 인코딩물은 핵산을 포함하는 것인 방법. 실시양태 155: 실시양태 154에 있어서, 인코딩 핵산을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 156: 실시양태 155에 있어서, 서열분석 전에 스캐폴드로부터 인코딩물을 절단하는 것인 방법. 실시양태 157: 실시양태 156에 있어서, 스캐폴드로부터 핵산 인코딩물을 절단하는 단계는 절단 시약을 사용하거나 전자기 복사를 통해 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 158: 실시양태 117에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 159: 실시양태 158에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 160: 실시양태 117에 있어서, 캡슐화물은 오일 중의 유화액인 방법. 실시양태 161: 실시양태 160에 있어서, 오일은 실리콘 오일, 플루오로실리콘 오일, 탄화수소 오일, 광유, 파라핀 오일, 할로겐화 오일 또는 이들의 임의의 조합인 방법. 실시양태 162: 실시양태 117에 있어서, 하나 이상의 시약을 하나 이상의 캡슐화물 내에 주입하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 163: 실시양태 162에 있어서, 하나 이상의 시약을 피코주입 또는 액적 병합으로 주입하는 것인 방법. 실시양태 164: 실시양태 162에 있어서, 하나 이상의 시약을 주입하는 단계는 유동에서 하나 이상의 캡슐화물을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 하나 이상의 시약은 하나 이상의 캡슐화물이 주입 부위를 통과하는 빈도와 동일한 빈도로 주입되는 것인 방법. 실시양태 165: 실시양태 140에 있어서, 하나 이상의 시약의 주입 속도는 하나 이상의 캡슐화의 유속에 의해 결정되는 것인 방법.
실시양태 166: 핵산 인코딩된 이펙터 스크린을 이용하여 하나 이상의 세포 핵산을 검출하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 인코딩된 이펙터, 인코딩된 이펙터를 인코딩하는 핵산, 및 하나 이상의 세포 핵산을 포함하는 하나 이상의 세포를 제공하는 단계로서, 상기 인코딩된 이펙터, 핵산 인코딩물 및 하나 이상의 세포를 캡슐화물 내에 제공하는 것인 단계; b) 인코딩된 이펙터와 하나 이상의 세포가 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션함으로써, 신호를 생성하는 단계; c) 하나 이상의 세포 핵산 중 적어도 하나의 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 전달하는 단계; d) 신호를 검출하는 단계; 및 e) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계.
실시양태 167: 실시양태 166에 있어서, 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 168: 실시양태 167에 있어서, 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계는 용해 완충제를 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 169: 실시양태 168에 있어서, 용해 완충제를 피코주입으로 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 170: 실시양태 166에 있어서, 하나 이상의 세포 핵산은 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 171: 실시양태 166에 있어서, 하나 이상의 세포 핵산은 mRNA를 포함하는 것인 방법. 실시양태 172: 실시양태 664에 있어서, 하나 이상의 세포 핵산을 항체-DNA 구축물, 인접 라이게이션 생성물 또는 인접 연장 생성물로서 핵산 인코딩물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 173: 실시양태 166에 있어서, 적어도 하나의 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 전달하는 단계는 적어도 하나의 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 어닐링하거나, 라이게이션시키거나, 증폭하거나 화학적으로 가교결합시키는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 174: 실시양태 166에 있어서, 적어도 하나의 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 전달하는 단계는 핵산 인코딩된 이펙터로 캡슐화된 하나 이상의 세포 핵산의 양을 정량할 수 있게 하는 것인 방법. 실시양태 175: 실시양태 166에 있어서, 복수의 상이한 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 전달하는 것인 방법. 실시양태 176: 실시양태 166에 있어서, 적어도 하나의 세포 핵산을 핵산 인코딩물에 전달하기 위해 하나 이상의 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 177: 실시양태 176에 있어서, 하나 이상의 시약을 단계 (a)에서 캡슐화물 내에 제공하는 것인 방법. 실시양태 178: 실시양태 176에 있어서, 하나 이상의 시약을 인큐베이션 단계 동안 또는 인큐베이션 단계 후에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 179: 실시양태 176에 있어서, 액적 병합, 피코주입, 또는 하나 이상의 시약을 포함하는 고체상 입자와의 상호작용으로 하나 이상의 시약을 첨가하는 것인 방법. 실시양태 180: 실시양태 176에 있어서, 하나 이상의 시약은 효소를 포함하는 것인 방법. 실시양태 181: 실시양태 180에 있어서, 효소는 라가제, 중합효소, 제한 효소 또는 재조합효소인 방법. 실시양태 182: 실시양태 176에 있어서, 하나 이상의 시약은 어세이 검출 시약, 라벨링 시약, 항체, 표적 이펙터, 세포 용해 시약, 핵산 라이게이션 시약, 증폭 시약 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 183: 실시양태 176에 있어서, 신호가 검출된 경우에만 하나 이상의 시약을 첨가하는 것인 방법. 실시양태 184: 실시양태 166에 있어서, 신호는 전자기 복사, 열 복사 또는 샘플의 시각적 변화인 방법. 실시양태 185: 실시양태 166에 있어서, 신호를 검출하는 단계는 검출기를 갖춘 미세유체 채널을 통해 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 186: 실시양태 166에 있어서, 캡슐화의 분류는 신호의 수준, 존재 또는 부재에 기반한 것인 방법. 실시양태 187: 실시양태 166에 있어서, 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되고, 이때 각각의 캡슐화의 체류 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 캡슐화의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 방법. 실시양태 188: 실시양태 187에 있어서, 최대 분산은 최대 약 3% 내지 약 10%인 방법. 실시양태 189: 실시양태 166에 있어서, 일정 시간은 적어도 1분, 적어도 10분, 적어도 1시간, 적어도 4시간 또는 적어도 1일인 방법. 실시양태 190: 실시양태 166에 있어서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 피코웰, 마이크로웰, 기포 또는 미세유체 밀폐부인 방법. 실시양태 191: 실시양태 166에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 192: 실시양태 191에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 193: 실시양태 191에 있어서, 액적은 유화액에 현탁된 것인 방법. 실시양태 194: 실시양태 166에 있어서, 이펙터는 화합물, 펩타이드, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산을 포함하는 것인 방법. 실시양태 195: 실시양태 166에 있어서, 1) 전달된 적어도 하나의 세포 핵산으로 인코딩된 이펙터를 인코딩하는 핵산을 증폭하는 단계, 2) 전달된 적어도 하나의 세포 핵산으로 핵산 인코딩물을 서열분석하는 단계, 3) 적어도 하나의 세포 핵산을 정량하는 단계, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법. 실시양태 196: 실시양태 166에 있어서, 인코딩된 이펙터는 스캐폴드에 부착된 것인 방법. 실시양태 197: 실시양태 196에 있어서, 스캐폴드는 비드인 방법. 실시양태 198: 실시양태 196에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드, 분자 케이지 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 199: 실시양태 196에 있어서, 인코딩된 이펙터는 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 부착된 것인 방법. 실시양태 200: 실시양태 199에 있어서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커인 방법. 실시양태 201: 실시양태 199에 있어서, 인코딩된 이펙터는 절단 가능한 링커에 공유부착된 것인 방법. 실시양태 201: 실시양태 199에 있어서, 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 202: 실시양태 199에 있어서, 핵산 인코딩물은 제2 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 부착된 것인 방법. 실시양태 203: 실시양태 203에 있어서, 제2 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 205: 핵산 인코딩된 단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) i) 인코딩된 이펙터 단백질을 발현시키기 위해 인코딩 바코드 및 코딩 구획을 포함하는, 스캐폴드에 부착된 핵산 인코딩물, 및 ii) 인코딩된 이펙터 단백질의 생성을 위한 발현 시스템을 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계; b) 캡슐화물 내에서 인코딩된 이펙터 단백질을 발현시키는 단계; c) 캡슐화물 내에 배치된 인코딩된 이펙터 단백질 및 하나 이상의 검출 시약과의 상호작용으로부터 생성된 신호를 검출하는 단계; 및 d) 신호를 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계. 실시양태 206: 실시양태 205에 있어서, 분류된 캡슐화물을 기반으로 핵산 인코딩물을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 207: 실시양태 205에 있어서, 인코딩된 이펙터 단백질은 신호전달 단백질, 효소, 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편, 구조 단백질, 저장 단백질 또는 수송 단백질, 또는 이들의 임의의 돌연변이체인 방법. 실시양태 208: 실시양태 205에 있어서, 인코딩된 이펙터 단백질은 효소 활성에 대해 스크리닝되는 효소 또는 효소 돌연변이체인 방법. 실시양태 209: 실시양태 208에 있어서, 효소 활성은 산화, 환원, 라이게이션, 중합, 결합 절단, 결합 형성 또는 이성질체화를 포함하는 것인 방법. 실시양태 210: 실시양태 205에 있어서, 인코딩된 이펙터 단백질은 아미노산 데하이드로게나제, 천연 아민 데하이드로게나제, 오핀 데하이드로게나제, 또는 이민 환원효소인 방법. 실시양태 211: 실시양태 205에 있어서, 인코딩된 이펙터 단백질과 하나 이상의 검출 시약 사이의 상호작용은 1) 하나 이상의 시약들 중 제1 검출 시약으로부터의 제1 분자 프로브와 제2 검출 시약으로부터의 제2 분자 프로브 사이에, 또는 2) 제1 검출 시약에 대한 하나 이상의 화합물과 제2 검출 시약으로부터의 하나 이상의 화합물 사이에 결합을 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 212: 실시양태 211에 있어서, 결합은 공유결합인 방법. 실시양태 213: 실시양태 211에 있어서, 결합은 비가역적 공유결합인 방법. 실시양태 214: 실시양태 211에 있어서, 제1 시약 및 제2 시약은 제1 분자 프로브와 제2 분자 프로브가 함께 결합될 때 형광 신호를 나타내는 것인 방법. 실시양태 215: 실시양태 214에 있어서, 형광 신호는 형광 공명 에너지 전달(FRET), 생체발광 공명 에너지 전달(BRET), 란타나이드 킬레이트 여기 시간 해상 형광 공명 에너지 전달(LANCE TR-FRET), 또는 증폭된 발광 근접 균질 어세이로 인한 것인 방법. 실시양태 216: 실시양태 211에 있어서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 화합물을 포함하는 것인 방법. 실시양태 217: 실시양태 211에 있어서, 제1 시약 및 제2 시약은 FRET 쌍 또는 형광단/켄처 쌍을 포함하는 것인 방법. 실시양태 218: 실시양태 217에 있어서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 4-(4-디메틸아미노페닐 아조), 5-((3-아미노에틸)아미노)-1-나프탈렌 설폰산, 5-((2-아미노에틸)아미노)-1-나프탈렌 설폰산(EDANS), 4-(디메틸아미노아조)벤젠-4-카르복실산(DABCYL) 및 플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC), 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택된 형광단 또는 켄처를 포함하는 것인 방법. 실시양태 219: 실시양태 217에 있어서, FRET 쌍 또는 형광단/켄처 쌍은 상이한 형광단을 포함하는 것인 방법. 실시양태 220: 실시양태 217에 있어서, FRET 쌍은 동일한 형광단의 중복 카피인 방법. 실시양태 221: 실시양태 211에 있어서, 결합의 형성은 이민 환원을 포함하는 것인 방법. 실시양태 222: 실시양태 221에 있어서, 이민 환원은 거울상특이적인 것인 방법. 실시양태 223: 실시양태 211에 있어서, 캡슐화물은 리포터 효소를 추가로 포함하는 것인 방법. 실시양태 224: 실시양태 223에 있어서, 리포터 효소는 또 다른 시약과 반응하여 기능적 판독값을 생성하는 것인 방법. 실시양태 225: 실시양태 223에 있어서, 제1 분자 프로브와 제2 분자 프로브 사이의 결합은 리포터 효소를 억제하는 새로운 분자를 생성하는 것인 방법. 실시양태 226: 실시양태 205에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 227: 실시양태 226에 있어서, 스캐폴드는 비드인 방법. 실시양태 228: 실시양태 226에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 229: 실시양태 205에 있어서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 피코웰, 마크로웰, 마이크로웰, 기포 또는 미세유체 밀폐부인 방법. 실시양태 230: 실시양태 229에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 231: 실시양태 230에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 232: 실시양태 205에 있어서, 발현 시스템은 시험관내 전사/번역 시스템을 포함하는 것인 방법. 실시양태 233: 실시양태 205에 있어서, 피코주입 또는 액적 병합을 통해 하나 이상의 검출 시약을 첨가하는 것인 방법. 실시양태 234: 실시양태 205에 있어서, 하나 이상의 검출 시약이 첨가된 후 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 235: 실시양태 205에 있어서, 신호를 검출하는 단계는 검출기를 갖춘 미세유체 채널을 통해 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 236: 핵산 인코딩된 단백질의 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서, 핵산 인코딩된 단백질의 복수의 상이한 돌연변이체 버전을 포함하는 핵산 인코딩된 단백질의 라이브러리에 대해 실시양태 205 내지 235 중 어느 한 실시양태의 스크린을 수행하는 단계를 포함하는 방법. 실시양태 237: 실시양태 236에 있어서, 핵산 인코딩된 단백질의 각각의 돌연변이체 버전은 고유 바코드에 의해 인코딩된 것인 방법.
실시양태 238: 핵산 인코딩된 라이브러리 스크린의 결과를 정규화하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 복수의 스크리닝된 인코딩된 이펙터 및 상응하는 스캐폴드를 복수의 캡슐화물 내에 제공하는 단계로서, 각각의 스캐폴드가 상응하는 스크리닝된 인코딩된 이펙터를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 인코딩물에 결합된 것인 단계; b) 복수의 캡슐화물을 용해시키는 단계; c) 복수의 스캐폴드에 결합되지 않은 내용물을 제거하는 단계; d) 복수의 스캐폴드를 액체 매질에 현탁하는 단계; e) 복수의 스캐폴드를 복수의 새로운 캡슐화물 내로 캡슐화하는 단계로서, 상기 각각의 새로운 캡슐화물이 복수의 스캐폴드 중 하나 이상의 스캐폴드를 캡슐화하는 것인 단계; 및 f) 복수의 새로운 캡슐화물 내의 증폭된 핵산 인코딩물이 복수의 새로운 캡슐화물 내에 함유된 인코딩 스캐폴드(들) 및 시약(들)로 제한되도록, 각각의 스캐폴드의 하나 이상의 핵산 인코딩물을 증폭하여 상응하는 증폭된 핵산 인코딩물을 형성하는 단계. 실시양태 239: 실시양태 238에 있어서, 복수의 새로운 캡슐화의 90%는 복수의 새로운 캡슐화물에서 증폭된 핵산 인코딩물의 평균 농도의 10% 이내의 증폭된 핵산 인코딩물 농도를 가진 것인 방법. 실시양태 240: 실시양태 238에 있어서, 복수의 스크리닝된 인코딩된 이펙터를 제공하는 단계는 미리 스크리닝된 핵산 인코딩된 라이브러리의 스크린을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 241: 실시양태 240에 있어서, 스크린을 수행하는 단계는 스크린에서 양성 결과를 표시한 미리 스크리닝된 핵산 인코딩된 라이브러리로부터 핵산 인코딩된 이펙터를 분리하는 분류 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 242: 실시양태 240에 있어서, 복수의 스크리닝된 인코딩된 이펙터는 미리 스크리닝된 핵산 인코딩된 라이브러리의 스크린에서 양성 결과를 표시한 핵산 인코딩된 이펙터를 포함하는 것인 방법. 실시양태 243: 실시양태 238에 있어서, 복수의 캡슐화물을 용해시키는 단계는 탈유화 시약, 여과, 원심분리 또는 초음파처리를, 복수의 캡슐화물을 함유하는 유화액에 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 244: 실시양태 243에 있어서, 탈유화 시약은 산 또는 염인 방법. 실시양태 245: 실시양태 243에 있어서, 탈유화 시약은 황산 또는 염산인 방법. 실시양태 246: 실시양태 243에 있어서, 탈유화 시약은 염화나트륨, 피로인산칼륨 또는 황산나트륨인 방법. 실시양태 247: 실시양태 238에 있어서, 복수의 스캐폴드로부터 결합되지 않은 내용물을 제거하는 단계는 복수의 스캐폴드를 세척하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 248: 실시양태 247에 있어서, 복수의 스캐폴드를 세척하는 단계는 복수의 스캐폴드를 세척 완충제로 헹구는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 249: 실시양태 248에 있어서, 세척 완충제는 수성 완충제, 유기 용액 또는 이들의 혼합물인 방법. 실시양태 250: 실시양태 247에 있어서, 복수의 스캐폴드에 대해 다회 세척 및 수집 단계를 수행하고, 각각의 세척 단계는 복수의 스캐폴드를 세척 완충제로 헹구는 단계를 포함하고, 각각의 수집 단계는 복수의 스캐폴드의 원심분리 또는 여과를 포함하는 것인 방법. 실시양태 251: 실시양태 238에 있어서, 액체 매질은 수용액인 방법. 실시양태 252: 실시양태 238에 있어서, 액체 매질은 유기 용매를 포함하는 것인 방법. 실시양태 253: 실시양태 238에 있어서, 복수의 스캐폴드의 각각의 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 254: 실시양태 238에 있어서, 복수의 스캐폴드의 각각의 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 255: 실시양태 238에 있어서, 액체 매질은 증폭 혼합물을 포함하는 것인 방법. 실시양태 256: 실시양태 238에 있어서, 각각의 새로운 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 257: 실시양태 238에 있어서, 복수의 스캐폴드를 새로운 캡슐화물 내로 캡슐화하는 단계는 복수의 스캐폴드를 유화액 내로 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 258: 실시양태 257에 있어서, 복수의 스캐폴드를 유화액 내로 도입하는 단계는 미세유체 장치를 통해 복수의 스캐폴드를 넣는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 259: 실시양태 258에 있어서, 미세유체 장치는 미세유체 칩인 방법. 실시양태 260: 실시양태 257에 있어서, 복수의 스캐폴드를 유화액 내로 도입하는 단계는 복수의 스캐폴드를 원-포트 유화제에 넣는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 261: 실시양태 238에 있어서, 증폭 혼합물을 복수의 새로운 캡슐화물 내로 복수의 스캐폴드와 함께 캡슐화하는 것인 방법. 실시양태 262: 실시양태 238에 있어서, 증폭 혼합물을 복수의 새로운 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 263: 실시양태 262에 있어서, 증폭 혼합물을 피코주입으로 첨가하는 것인 방법. 실시양태 264: 실시양태 262에 있어서, 증폭 혼합물을 액적 병합으로 첨가하고, 이때 각각의 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 265: 실시양태 261 또는 262에 있어서, 증폭 혼합물은 PCR 시약을 포함하는 것인 방법. 실시양태 266: 실시양태 238에 있어서, 각각의 스캐폴드의 증폭된 핵산 인코딩물을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 267: 실시양태 238에 있어서, 상기 방법이 수행되지 않은 핵산 인코딩된 라이브러리보다 더 낮은 배경 신호를 야기하는 방법. 실시양태 268: 실시양태 267에 있어서, 배경 신호는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% 감소되는 것인 방법. 실시양태 269: 실시양태 267에 있어서, 더 낮은 배경 신호는 스크린 전 인코딩물 농도가 제공된 스크리닝된 인코딩된 이펙터 및 상응하는 스캐폴드의 평균 인코딩물 농도보다 100배, 1000배, 10000배, 100000배 또는 1000000배 더 낮은 핵산 인코딩된 이펙터를 검출할 수 있게 하는 것인 방법.
실시양태 270: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 시스템으로서, a) 샘플; b) 인코딩된 이펙터가 절단 가능한 링커에 의해 결합되어 있고 이펙터를 인코딩하는 핵산이 결합되어 있는 스캐폴드; 및 c) i) 샘플 및 스캐폴드를 수취하고; ii) 샘플 및 스캐폴드를 캡슐화물 내로 캡슐화하고; iii) 인코딩된 이펙터로부터 절단 가능한 링커를 절단하여 캡슐화물 내에서 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출하고; iv) 인코딩된 이펙터를 일정 인큐베이션 시간 동안 샘플과 인큐베이션하고; v) 인코딩된 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물로부터 검출하고; vi) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하도록 구성된 미세유체 장치를 포함하는 시스템. 실시양태 271: 실시양태 270에 있어서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커인 시스템. 실시양태 272: 실시양태 271에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 액적을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함하는 것인 시스템. 실시양태 273: 실시양태 272에 있어서, 광은 UV 광인 시스템. 실시양태 274: 실시양태 272에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 시스템. 실시양태 275: 실시양태 271에 있어서, 캡슐화물은 인코딩된 이펙터로부터 광절단 가능한 링커가 절단될 수 있게 하기 위해 광절단 가능한 링커를 활성화시키도록 구성된 시약을 추가로 캡슐화하는 것인 시스템. 실시양태 276: 실시양태 275에 있어서, 미세유체 장치는 시약을 캡슐화물 내에 도입하도록 구성된 것인 시스템. 실시양태 277: 실시양태 270에 있어서, 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 변화를 검출하거나, 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 기반으로 신호를 검출하는 것인 시스템. 실시양태 278: 실시양태 270에 있어서, 인코딩된 이펙터와 세포 사이의 상호작용은 하나 이상의 세포 구성요소의 억제를 포함하는 것인 시스템. 실시양태 279: 실시양태 270에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산을 서열분석함으로써 인코딩된 이펙터를 확인하도록 구성된 서열분석 장치를 추가로 포함하는 시스템. 실시양태 280: 실시양태 270에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 시스템. 실시양태 281: 실시양태 280에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 시스템. 실시양태 282: 실시양태 280에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 시스템. 실시양태 283: 실시양태 280에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 시스템. 실시양태 284: 실시양태 270에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 시스템. 실시양태 285: 실시양태 284에 있어서, 인코딩된 이펙터는 비천연 펩타이드 또는 중합체인 시스템. 실시양태 286: 실시양태 284에 있어서, 인코딩된 이펙터는 소분자 또는 거대분자인 시스템. 실시양태 287: 실시양태 284에 있어서, 화합물은 약물 유사 소분자인 시스템. 실시양태 288: 실시양태 270에 있어서, 캡슐화물은 액적인 시스템. 실시양태 289: 실시양태 288에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 시스템. 실시양태 290: 실시양태 270에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 세포, 단백질 또는 효소를 포함하는 것인 시스템. 실시양태 291: 실시양태 270에 있어서, 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 장치의 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되는 것인 시스템. 실시양태 292: 실시양태 270에 있어서, 미세유체 장치는 캡슐화물을 분류하기 위해 제1 수집 튜브 및 제2 수집 튜브를 추가로 포함하고, 여기서 캡슐화물은 1) 신호가 소정의 역치 이상인 경우 제1 수집 튜브에, 또는 2) 신호가 소정의 역치 미만인 경우 제2 수집 튜브에 놓이는 것인 시스템. 실시양태 293: 실시양태 292에 있어서, 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형 또는 미세유체 장치의 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 제1 또는 제2 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 추가로 포함하는 시스템. 실시양태 294: 실시양태 270에 있어서, 미세유체 장치는 a) 샘플 및 스캐폴드를 포함하는 수성 유체를 포함하는 제1 미세유체 채널; b) 수성 유체와 혼화될 수 없는 유체를 포함하는 제2 미세유체 채널; c) 제1 미세유체 채널이 제2 미세유체 채널과 유체 연통하는 연접부; d) 어세이 유동 경로 내에 배치된 캡슐화물 내에서 절단 가능한 링커를 절단하기 위한 절단 영역; e) 신호를 검출하기 위한 검출 영역; 및 f) 캡슐화물을 분류하기 위한 분류 영역을 추가로 포함하고, 이때 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부는 장치 평면을 한정하고, 상기 연접부는 제2 미세유체 채널로부터의 유체 내에서 수성 유체의 캡슐화물을 형성하도록 구성되고, 내부에 캡슐화물을 가진 제2 미세유체 채널로부터의 유체는 어세이 유동 경로를 한정하는 제3 미세유체 채널에서 연접부를 지나 이동하는 것인 시스템. 실시양태 295: 실시양태 294에 있어서, 제3 미세유체 채널은 제2 미세유체 채널의 연속인 시스템. 실시양태 296: 실시양태 294에 있어서, 복수의 캡슐화물은 어세이 유동 경로 내에 배치된 것인 시스템. 실시양태 297: 실시양태 294에 있어서, 절단 영역은 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 인코딩된 이펙터를 절단하기 위해 각각의 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키도록 구성된 것인 시스템. 실시양태 298: 실시양태 297에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 시스템. 실시양태 299: 실시양태 297에 있어서, 복수의 캡슐화물은 균일한 강도 또는 지속시간의 광에 노출되는 것인 시스템. 실시양태 300: 실시양태 297에 있어서, 각각의 캡슐화물이 노출되는 광의 강도 또는 지속시간은 서로의 약 0.1% 내지 약 10% 이내에 있는 것인 시스템. 실시양태 301: 실시양태 270에 있어서, 각각의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 캡슐화의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 시스템. 실시양태 302: 실시양태 301에 있어서, 미세유체 장치의 영역은 어세이 유동 경로인 시스템. 실시양태 303: 실시양태 301에 있어서, 최대 분산 비는 최대 약 10%인 시스템. 실시양태 304: 실시양태 301에 있어서, 최대 분산 비는 최대 약 5%인 시스템. 실시양태 305: 실시양태 270에 있어서, 각각의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간은 서로의 약 0.1% 내지 약 10% 이내에 있는 것인 시스템. 실시양태 306: 실시양태 294에 있어서, 검출 영역은 형광측정기를 포함하는 것인 시스템. 실시양태 307: 실시양태 294에 있어서, 검출 영역은 공초점 검출, 레이저 스캐닝 또는 형광, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 시스템. 실시양태 308: 실시양태 294에 있어서, 분류 영역은 검출 영역에서 검출된 신호를 기반으로 캡슐화물을 분류하도록 구성된 분류기를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 309: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 시스템으로서, a) 하나 이상의 세포; b) 인코딩된 이펙터가 절단 가능한 링커에 의해 결합되어 있고 이펙터를 인코딩하는 핵산이 결합되어 있는 스캐폴드; 및 c) i) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 수취하고; ii) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 캡슐화물 내로 캡슐화하고; iii) 인코딩된 이펙터로부터 절단 가능한 링커를 절단하여 캡슐화물 내에서 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출하고; iv) 인코딩된 이펙터를 일정 인큐베이션 시간 동안 하나 이상의 세포와 인큐베이션하고; v) 인코딩된 이펙터와 하나 이상의 세포 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물로부터 검출하고; vi) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하도록 구성된 미세유체 장치를 포함하는 시스템. 실시양태 310: 실시양태 309에 있어서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커인 시스템. 실시양태 311: 실시양태 310에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 액적을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함하는 것인 시스템. 실시양태 312: 실시양태 311에 있어서, 광은 UV 광인 시스템. 실시양태 313: 실시양태 311에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 시스템. 실시양태 314: 실시양태 310에 있어서, 캡슐화물은 인코딩된 이펙터로부터 광절단 가능한 링커가 절단될 수 있게 하기 위해 광절단 가능한 링커를 활성화시키도록 구성된 시약을 추가로 캡슐화하는 것인 시스템. 실시양태 315: 실시양태 314에 있어서, 미세유체 장치는 시약을 캡슐화물 내에 도입하도록 구성된 것인 시스템. 실시양태 316: 실시양태 309에 있어서, 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 하나 이상의 세포의 형태학적 변화를 검출하거나, 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 기반으로 신호를 검출하는 것인 시스템. 실시양태 317: 실시양태 309에 있어서, 인코딩된 이펙터와 하나 이상의 세포 사이의 상호작용은 하나 이상의 세포 구성요소의 억제를 포함하는 것인 시스템. 실시양태 318: 실시양태 309에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산을 서열분석함으로써 인코딩된 이펙터를 확인하도록 구성된 서열분석 장치를 추가로 포함하는 시스템. 실시양태 319: 실시양태 309에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 시스템. 실시양태 320: 실시양태 319에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 시스템. 실시양태 321: 실시양태 320에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 시스템. 실시양태 322: 실시양태 320에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 시스템. 실시양태 323: 실시양태 309에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 시스템. 실시양태 324: 실시양태 323에 있어서, 인코딩된 이펙터는 비천연 펩타이드 또는 중합체인 시스템. 실시양태 325: 실시양태 323에 있어서, 인코딩된 이펙터는 소분자 또는 거대분자인 시스템. 실시양태 326: 실시양태 323에 있어서, 화합물은 약물 유사 소분자인 시스템. 실시양태 327: 실시양태 309에 있어서, 캡슐화물은 액적인 시스템. 실시양태 328: 실시양태 327에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 시스템. 실시양태 329: 실시양태 309에 있어서, 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 장치의 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되는 것인 시스템. 실시양태 330: 실시양태 309에 있어서, 미세유체 장치는 캡슐화물을 분류하기 위해 제1 수집 튜브 및 제2 수집 튜브를 추가로 포함하고, 여기서 캡슐화물은 1) 신호가 소정의 역치 이상인 경우 제1 수집 튜브에, 또는 2) 신호가 소정의 역치 미만인 경우 제2 수집 튜브에 놓이는 것인 시스템. 실시양태 331: 실시양태 330에 있어서, 전기장 구배, 소리, 다이어프램, 미세유체 채널의 기하구조의 변형 또는 미세유체 장치의 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 제1 또는 제2 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 추가로 포함하는 시스템. 실시양태 332: 실시양태 309에 있어서, 미세유체 장치는 a) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 포함하는 수성 유체를 포함하는 제1 미세유체 채널; b) 수성 유체와 혼화될 수 없는 유체를 포함하는 제2 미세유체 채널; c) 제1 미세유체 채널이 제2 미세유체 채널과 유체 연통하는 연접부; d) 어세이 유동 경로 내에 배치된 캡슐화물 내에서 절단 가능한 링커를 절단하기 위한 절단 영역; e) 신호를 검출하기 위한 검출 영역; 및 f) 캡슐화물을 분류하기 위한 분류 영역을 추가로 포함하고, 이때 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부는 장치 평면을 한정하고, 상기 연접부는 제2 미세유체 채널로부터의 유체 내에서 수성 유체의 캡슐화물을 형성하도록 구성되고, 내부에 캡슐화물을 가진 제2 미세유체 채널로부터의 유체는 어세이 유동 경로를 한정하는 제3 미세유체 채널에서 연접부를 지나 이동하는 것인 시스템. 실시양태 333: 실시양태 332에 있어서, 제3 미세유체 채널은 제2 미세유체 채널의 연속인 시스템. 실시양태 334: 실시양태 332에 있어서, 복수의 캡슐화물은 어세이 유동 경로 내에 배치된 것인 시스템. 실시양태 335: 실시양태 332에 있어서, 절단 영역은 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 인코딩된 이펙터를 절단하기 위해 각각의 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키도록 구성된 것인 시스템. 실시양태 336: 실시양태 335에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 시스템. 실시양태 337: 실시양태 335에 있어서, 복수의 캡슐화물은 균일한 강도 또는 지속시간의 광에 노출되는 것인 시스템. 실시양태 338: 실시양태 335에 있어서, 각각의 캡슐화물이 노출되는 광의 강도 또는 지속시간은 서로의 약 0.1% 내지 약 10% 이내에 있는 것인 시스템. 실시양태 339: 실시양태 332에 있어서, 각각의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 액적의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 시스템. 실시양태 340: 실시양태 339에 있어서, 미세유체 장치의 영역은 어세이 유동 경로인 시스템. 실시양태 341: 실시양태 339에 있어서, 최대 분산 비는 최대 약 10%인 시스템. 실시양태 342: 실시양태 339에 있어서, 최대 분산 비는 최대 약 5%인 시스템. 실시양태 343: 실시양태 309에 있어서, 각각의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간은 서로의 약 0.1% 내지 약 10% 이내에 있는 것인 시스템. 실시양태 344: 실시양태 332에 있어서, 검출 영역은 형광측정기를 포함하는 것인 시스템. 실시양태 345: 실시양태 332에 있어서, 검출 영역은 공초점 검출, 레이저 스캐닝 또는 형광, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 시스템. 실시양태 346: 실시양태 332에 있어서, 분류 영역은 검출 영역에서 검출된 신호를 기반으로 캡슐화물을 분류하도록 구성된 분류기를 포함하는 것인 시스템.
실시양태 347: a) 수성 유체를 포함하는 제1 미세유체 채널; b) 수성 유체와 혼화될 수 없는 유체를 포함하는 제2 미세유체 채널; c) 제1 미세유체 채널이 제2 미세유체 채널과 유체 연통하는 연접부; d) 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드에 결합된 이펙터를 절단하기 위한 절단 영역; e) 검출 영역; 및 f) 분류 영역을 포함하고; g) 액적 생성 주파수가 적어도 약 80 Hz이 되도록 구성된, 액적 기반 인코딩된 라이브러리 스크리닝을 위한 미세유체 장치로서, 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부가 장치 평면을 한정하고, 상기 연접부가 제2 미세유체 채널로부터의 유체 내에서 수성 유체의 캡슐화물을 형성하도록 구성되고, 내부에 캡슐화물을 가진 제2 미세유체 채널로부터의 유체가 어세이 유동 경로를 한정하는 제3 미세유체 채널에서 상기 연접부를 지나 이동하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 348: 실시양태 347에 있어서, 제3 미세유체 채널은 제2 미세유체 채널의 연속인 미세유체 장치. 실시양태 349: 실시양태 347에 있어서, 절단 영역은 검출 영역 및 분류 영역의 업스트림에 있는 것인 미세유체 장치. 실시양태 350: 실시양태 347에 있어서, 절단 영역은 연접부의 다운스트림에 있는 것인 미세유체 장치. 실시양태 351: 실시양태 347에 있어서, 어세이 유동 경로는 구불구불한 유동 경로 영역을 포함하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 352: 실시양태 351에 있어서, 구불구불한 유동 경로 영역은 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 곡선을 포함하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 353: 실시양태 347에 있어서, 검출 영역은 형광측정기를 포함하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 354: 실시양태 353에 있어서, 형광측정기는 장치 평면에 실질적으로 평행한 광축을 갖도록 구성된 것인 미세유체 장치. 실시양태 355: 실시양태 353에 있어서, 형광측정기는 어세이 유동 경로의 곡선에서 통과 액적을 조명하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 356: 실시양태 353에 있어서, 형광측정기는 형광의 2개 이상의 파장을 검출하도록 구성된 것인 미세유체 장치. 실시양태 357: 실시양태 347에 있어서, 검출 영역은 공초점 검출, 레이저 스캐닝 또는 형광, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 358: 실시양태 347에 있어서, 수성 유체를 포함하는 2개 이상의 채널을 포함하는 미세유체 장치. 실시양태 359: 실시양태 347에 있어서, 검출 영역은 분류 영역의 업스트림에 있는 것인 미세유체 장치. 실시양태 360: 실시양태 347에 있어서, 분류 영역은 검출 영역에서 검출된 신호를 기반으로 액적을 분류하도록 구성된 분류기를 포함하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 361: 실시양태 347에 있어서, 어세이 유동 경로는 어세이 유동 경로 내에 배치된 하나 이상의 챔버를 포함하는 것인 미세유체 장치. 실시양태 362: 실시양태 347에 있어서, 어세이 유동 경로는 어세이 유동 경로 내에 배치된 복수의 챔버를 포함하고, 이때 상기 챔버는 채널을 연결함으로써 연결되는 것인 미세유체 장치. 실시양태 363: 실시양태 362에 있어서, 복수의 챔버들의 챔버의 높이는 복수의 연결 챔버들의 연결 챔버의 높이보다 최대 약 2배 더 큰 것인 미세유체 장치. 실시양태 364: 실시양태 362에 있어서, 챔버의 높이는 챔버의 폭이 연결 챔버의 폭과 실질적으로 일치하도록 좁아질 때까지 감소하지 않는 것인 미세유체 장치. 실시양태 365: 실시양태 361에 있어서, 챔버를 통한 유속은 챔버의 업스트림에서 어세이 유동 경로를 통한 유속의 약 10%인 미세유체 장치. 실시양태 366: 실시양태 347에 있어서, 최대 약 10%의 분산 비를 가진 미세유체 장치. 실시양태 367: 실시양태 347에 있어서, 일정 인큐베이션 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하도록 구성된 미세유체 장치로서, 각각의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간은 복수의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간의 최대 분산 비 이내에 있고, 이때 분산 비는 미세유체 장치의 영역을 통과하는 복수의 액적의 평균 체류 시간에 대한 편차에 기반한 것인 미세유체 장치. 실시양태 368: 실시양태 367에 있어서, 미세유체 장치의 영역은 어세이 유동 경로인 시스템. 실시양태 369: 실시양태 368에 있어서, 최대 분산 비는 최대 약 10%인 시스템. 실시양태 370: 실시양태 368에 있어서, 최대 분산 비는 최대 약 5%인 시스템. 실시양태 371: 실시양태 367에 있어서, 각각의 캡슐화물에 대한 인큐베이션 시간은 서로의 약 0.1% 내지 약 10% 이내에 있는 것인 시스템.
실시양태 372: 프라이머를 증폭하여 세포 핵산 포획을 최대화하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 하나 이상의 세포, 증폭 혼합물 및 닉킹 효소와 함께 핵산 인코딩된 스캐폴드를 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계로서, 핵산 인코딩물이 핵산 인코딩된 스캐폴드에 결합된 것인 단계; b) 하나 이상의 세포를 용해시켜 하나 이상의 세포 핵산을 방출시키는 단계; c) 핵산 인코딩물을 닉킹 효소로 닉킹함으로써, 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 단계; d) 닉킹 부위 및 증폭 혼합물을 통해 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계; 및 e) 방출된 세포 핵산을 인코딩된 핵산 프라이머로 라벨링하는 단계. 실시양태 373: 실시양태 372에 있어서, 닉킹 효소는 핵산 인코딩물에서 특정 부위를 표적화하는 것인 방법. 실시양태 374: 실시양태 373에 있어서, 특정 부위는 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법. 실시양태 375: 실시양태 372에 있어서, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계는 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 닉킹하여 또 다른 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 376: 실시양태 372에 있어서, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계는 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 대체하여 또 다른 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 것을 동시에 포함하는 것인 방법. 실시양태 377: 실시양태 376에 있어서, 증폭 혼합물은 핵산 인코딩물의 카피가 증폭 효소에 의해 동시에 생성 및 대체될 수 있도록 증폭 효소를 포함하는 것인 방법. 실시양태 378: 실시양태 377에 있어서, 증폭 효소는 중합효소를 포함하는 것인 방법. 실시양태 379: 실시양태 372에 있어서, 각각의 핵산 인코딩물은 방출된 세포 핵산을 라벨링하기 위해 표적 세포 코딩물 또는 표적 세포 핵산을 규정하는 포획 부위를 포함하는 것인 방법. 실시양태 380: 실시양태 379에 있어서, 표적 핵산은 표적 mRNA인 방법. 실시양태 381: 실시양태 380에 있어서, 표적 mRNA는 관심 있는 단백질을 인코딩하는 것인 방법. 실시양태 382: 실시양태 380에 있어서, 닉킹 효소는 핵산 인코딩물을 사용한 표적 mRNA 포획 및 라벨링의 증가를 가능하게 하는 것인 방법. 실시양태 383: 실시양태 380에 있어서, 표적 mRNA 포획은 적어도 10%, 25%, 50%, 100% 또는 200% 증가되는 것인 방법. 실시양태 384: 실시양태 372에 있어서, 복수의 세포 핵산을 각각의 인코딩된 핵산 프라이머로 라벨링하는 것인 방법. 실시양태 385: 실시양태 372에 있어서, 핵산 인코딩된 스캐폴드는 비드를 포함하고, 인코딩된 핵산 프라이머는 고유 비드 바코드 및 이펙터 인코딩물을 포함하는 것인 방법. 실시양태 386: 실시양태 372에 있어서, 캡슐화물은 세포 용해 완충제를 추가로 포함하는 것인 방법. 실시양태 387: 실시양태 372에 있어서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 피코웰, 마크로웰, 마이크로웰, 기포 또는 미세유체 밀폐부인 방법. 실시양태 388: 실시양태 372에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 389: 실시양태 388에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 390: 실시양태 372에 있어서, 증폭 혼합물은 등온 증폭 혼합물인 방법. 실시양태 391: 실시양태 372에 있어서, 증폭 혼합물은 닉킹 효소 증폭 혼합물을 포함하는 것인 방법. 실시양태 392: 실시양태 372에 있어서, 증폭 혼합물은 역전사효소를 포함하는 것인 방법. 실시양태 393: 실시양태 372에 있어서, 핵산 인코딩된 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 394: 실시양태 393에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 395: 실시양태 372에 있어서, 핵산 인코딩된 스캐폴드는 그에 부착된 이펙터를 포함하는 것인 방법. 실시양태 396: 실시양태 395에 있어서, 이펙터는 화합물, 펩타이드, 단백질, 효소 또는 핵산을 포함하는 것인 방법. 실시양태 397: 실시양태 395에 있어서, 이펙터는 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 부착된 것인 방법. 실시양태 398: 실시양태 397에 있어서, 전자기 복사, 효소, 화학 시약, 열, pH 조절, 소리 또는 전기화학적 반응성으로 절단 가능한 링커를 절단하는 것인 방법. 실시양태 399: 실시양태 398에 있어서, 전자기 복사를 이용하여 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하는 것인 방법. 실시양태 400: 실시양태 398에 있어서, 절단되는 이펙터의 양은 전자기 복사에의 노출 강도 또는 지속시간에 의해 제어되는 것인 방법. 실시양태 401: 실시양태 398에 있어서, 절단 시약을 사용하여 절단 가능한 링커를 절단하는 것인 방법. 실시양태 402: 실시양태 401에 있어서, 절단되는 이펙터의 양은 캡슐화물에서 절단 시약의 농도에 의해 제어되는 것인 방법. 실시양태 403: 실시양태 398에 있어서, 이펙터 절단의 속도는 캡슐화물에서 절단 시약의 농도에 의해 제어되는 것인 방법. 실시양태 404: 실시양태 398에 있어서, 효소를 사용하여 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하는 것인 방법. 실시양태 405: 실시양태 404에 있어서, 효소는 프로테아제, 뉴클레아제 또는 하이드롤라제인 방법. 실시양태 406: 실시양태 404에 있어서, 이펙터 절단의 속도는 캡슐화물에서 효소의 양에 의해 제어되는 것인 방법. 실시양태 407: 실시양태 372에 있어서, 인코딩된 핵산 프라이머를 사용하여 방출된 세포 핵산을 라벨링하는 단계는 방출된 세포 핵산을 바코딩하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 408: 실시양태 407에 있어서, 캡슐화물은 바코딩 시약을 추가로 포함하는 것인 방법. 실시양태 409: 실시양태 407에 있어서, 인코딩된 핵산 프라이머를 바코딩하는 단계는 바코딩 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 410: 실시양태 408 또는 409에 있어서, 바코딩 시약은 효소 또는 화학적 가교결합 시약을 포함하는 것인 방법. 실시양태 411: 실시양태 410에 있어서, 바코딩 시약은 효소를 포함하는 것인 방법. 실시양태 412: 실시양태 411에 있어서, 효소는 중합효소, 리가제, 제한 효소 또는 재조합효소인 방법. 실시양태 413: 실시양태 410에 있어서, 바코딩 시약은 화학적 가교결합 시약인 방법. 실시양태 414: 실시양태 413에 있어서, 화학적 가교결합 시약은 소랄렌인 방법. 실시양태 415: 실시양태 372에 있어서, 이펙터 스크린을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 이때 인코딩된 이펙터에 대해 하나 이상의 세포를 스크리닝하는 것인 방법. 실시양태 416: 실시양태 372에 있어서, 하나 이상의 세포를 사용하여 스크린용 핵산 인코딩된 스캐폴드를 제조하는 것인 방법.
실시양태 417: 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: a) 샘플 및 하나 이상의 스캐폴드를 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계로서, 스캐폴드가 i) 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터, 및 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; b) 피코주입 또는 액적 병합을 통해 하나 이상의 시약을 캡슐화물에 첨가하는 단계; c) 절단 가능한 링커를 절단하여 소정의 양의 이펙터를 방출시키는 단계; d) 인코딩된 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된 하나 이상의 신호를 캡슐화물로부터 검출하는 단계; 및 e) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계. 실시양태 418: 실시양태 417에 있어서, 소정의 양의 이펙터가 방출된 후에 시약을 첨가하는 것인 방법. 실시양태 419: 실시양태 417에 있어서, 하나 이상의 시약을 피코주입으로 캡슐화물에 첨가하는 것인 방법. 실시양태 420: 실시양태 417에 있어서, 하나 이상의 시약의 시약 농도는 최대 100 피코몰(pM), 최대 500 pM, 최대 1 나노몰(nM), 최대 10 nM, 최대 100 nM, 최대 1 마이크로몰(μM), 최대 10 μM, 최대 100 μM, 최대 1 밀리몰(mM), 최대 10 mM, 최대 100 mM 또는 최대 500 mM인 방법. 실시양태 421: 실시양태 417에 있어서, 적어도 하나의 시약은 항체를 포함하는 것인 방법. 실시양태 422: 실시양태 417에 있어서, 스캐폴드로부터 방출된 이펙터의 소정의 양은 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 250 mM의 농도인 방법. 실시양태 423: 실시양태 417에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 세포, 단백질, 효소, 핵산, 세포 용해물, 조직 추출물 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 424: 실시양태 417에 있어서, 적어도 하나의 시약은 하나 이상의 형광단을 포함하는 것인 방법. 실시양태 425: 실시양태 417에 있어서, 이펙터를 인코딩하는 핵산을 바코딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 426: 실시양태 425에 있어서, 바코딩은 캡슐화물에 첨가된 하나 이상의 시약을 통해 달성되는 것인 방법. 실시양태 427: 실시양태 417에 있어서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커인 방법. 실시양태 428: 실시양태 427에 있어서, 전자기 복사를 이용하여 광절단 가능한 링커를 절단하는 것인 방법. 실시양태 429: 실시양태 427에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 430: 실시양태 429에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 방법. 실시양태 431: 실시양태 427에 있어서, 하나 이상의 시약은 인코딩된 이펙터로부터 광절단 가능한 링커가 절단될 수 있게 하기 위해 광절단 가능한 링커를 활성화시키도록 구성된 것인 방법. 실시양태 432: 실시양태 431에 있어서, 적어도 하나의 시약은 디설파이드 환원 시약인 방법. 실시양태 433: 실시양태 431에 있어서, 적어도 하나의 시약은 테트라진인 방법. 실시양태 434: 실시양태 417에 있어서, 신호를 검출하는 단계는 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 변화를 검출하거나 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 435: 실시양태 417에 있어서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리인 방법. 실시양태 436: 실시양태 417에 있어서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 437: 실시양태 435에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법. 실시양태 438: 실시양태 435에 있어서, 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 방법. 실시양태 439: 실시양태 417에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 방법. 실시양태 440: 실시양태 417에 있어서, 캡슐화물은 액적인 방법. 실시양태 441: 실시양태 440에 있어서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 442: 실시양태 440에 있어서, 이펙터와 적어도 하나의 세포가 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 액적을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 443: 실시양태 417에 있어서, 신호는 전자기 복사, 열 복사, 샘플의 시각적 변화 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 444: 인코딩된 이펙터의 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법: (a) 샘플을 가진 미세유체 채널에서 복수의 비드를 복수의 액적 내로 캡슐화하는 단계로서, 복수의 비드가 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리에 결합되고, 복수의 비드의 각각의 비드가 하나 이상의 인코딩된 이펙터에 결합되고, 고유 인코딩된 이펙터의 라이브러리가 적어도 약 250,000개의 고유 이펙터를 포함하고, 각각의 고유 인코딩된 이펙터가 고유 핵산 인코딩물에 의해 인코딩되고, 각각의 액적이 하나 이상의 비드를 포함하는 것인 단계; (b) 적어도 하나의 인코딩된 이펙터와 상응하는 비드 사이의 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계; (c) 복수의 액적 중 하나 이상의 액적으로부터 신호를 검출하는 단계로서, 각각의 신호가 상응하는 액적 내에서 각각의 인코딩된 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된 것인 단계; 및 (d) 상응하는 신호의 검출을 기반으로 복수의 액적을 분류하는 단계. 실시양태 445: 실시양태 444에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출하는 것인 방법. 실시양태 446: 실시양태 445에 있어서, 비드로부터 방출된 인코딩된 이펙터의 소정의 양은 적어도 100 pM, 적어도 500 pM, 적어도 1 nM, 적어도 10 nM, 적어도 100 nM, 적어도 1 μM, 적어도 10 μM, 적어도 100 μM, 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM 또는 적어도 250 mM의 농도인 방법. 실시양태 447: 실시양태 444에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 세포, 단백질, 효소, 핵산, 세포 용해물, 조직 추출물 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법. 실시양태 448: 실시양태 447에 있어서, 샘플은 하나 이상의 세포, 단백질 또는 효소인 방법. 실시양태 449: 실시양태 447에 있어서, 각각의 이펙터를 인코딩하는 핵산을 바코딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 450: 실시양태 447에 있어서, 바코딩은 하나 이상의 시약을 액적에 첨가함으로써 달성되는 것인 방법. 실시양태 451: 실시양태 447에 있어서, 전자기 복사를 이용하여 광절단 가능한 링커를 절단하는 것인 방법. 실시양태 452: 실시양태 451에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법. 실시양태 453: 실시양태 452에 있어서, 광의 광 강도는 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 방법. 실시양태 454: 실시양태 447에 있어서, 하나 이상의 시약은 액적에 첨가되고, 하나 이상의 시약은 광절단 가능한 링커가 상기 인코딩된 이펙터로부터 절단될 수 있게 하기 위해 각각의 인코딩된 이펙터의 광절단 가능한 링커를 활성화시키도록 구성된 것인 방법. 실시양태 455: 실시양태 454에 있어서, 활성화 시약은 디설파이드 환원 시약인 방법. 실시양태 456: 실시양태 454에 있어서, 활성화 시약은 테트라진인 방법. 실시양태 457: 실시양태 447에 있어서, 신호를 검출하는 단계는 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 변화를 검출하거나 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법. 실시양태 458: 실시양태 447에 있어서, 하나 이상의 비드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드인 방법. 실시양태 459: 실시양태 458에 있어서, 하나 이상의 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 방법. 실시양태 460: 실시양태 458에 있어서, 하나 이상의 비드는 직경이 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 방법. 실시양태 461: 실시양태 447에 있어서, 인코딩된 이펙터는 펩타이드, 화합물, 단백질, 효소, 거대고리 화합물 또는 핵산인 방법. 실시양태 462: 실시양태 447에 있어서, 하나 이상의 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터인 방법. 실시양태 463: 실시양태 447에 있어서, 각각의 이펙터와 상응하는 샘플이 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 액적을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법. 실시양태 464: 실시양태 447에 있어서, 신호는 전자기 복사, 열 복사, 샘플의 시각적 변화 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
일부 실시양태에서, 본원은 샘플에 대한 인코딩된 이펙터의 조합을 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 개시한다: (a) 캡슐화물 내에서 표적 단백질을 증폭하는 단계로서, 상기 캡슐화물이 (i) 바코드 영역을 포함하는, 표적 단백질의 발현을 코딩하는 핵산, 및 (ii) 시험관내 전사/번역 시스템을 포함하는 것인 단계; (b) 2개 이상의 핵산 인코딩된 이펙터를 캡슐화물 내로 도입하는 단계로서, 2개 이상의 핵산 인코딩된 이펙터가 핵산 인코딩물을 포함하는 것인 단계; (c) 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 상의 바코드를 사용하여 2개 이상의 인코딩된 이펙터의 핵산 인코딩물을 바코딩하는 단계; (d) 2개 이상의 이펙터가 표적 단백질과 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계; 및 (e) 2개 이상의 이펙터와 표적 단백질 사이의 상호작용에 의해 생성된 신호를 측정하는 단계. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (f) 소정의 역치에 비해 신호의 측정치를 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (g) 표적 단백질을 코딩하는 핵산으로부터 바코드를 포함하는 이펙터를 인코딩하는 핵산을 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (h) 표적 단백질에 대한 효능을 부여한 이펙터의 조합을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 증폭하는 단계는 표적 단백질의 발현을 활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 증폭하는 단계는 원하는 농도까지 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 신호전달 단백질, 효소, 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편, 구조 단백질, 저장 단백질 또는 수송 단백질이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 인코딩하는 바코딩된 핵산은 하나 이상의 이펙터를 인코딩하는 하나 이상의 핵산의 서열에 상보적인 프라이머 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질의 발현을 코딩하는 바코딩된 핵산은 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 핵산 인코딩된 이펙터를 액적 내에 도입하는 단계는 피코주입 또는 액적 병합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 핵산 인코딩된 이펙터는 캡슐화물 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 핵산 인코딩된 이펙터는 액적 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 이펙터를 인코딩하는 핵산은 길이가 적어도 10개, 15개, 20개, 25개, 50개, 75개 또는 100개 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이펙터를 인코딩하는 각각의 핵산은 표적 단백질의 발현을 코딩하는 바코딩된 핵산에 인코딩된 서열에 상보적인 프라이머 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 이펙터는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 각각의 이펙터는 화학적 단편이다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩된 이펙터 중 적어도 하나는 스캐폴드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터를 인코딩하는 핵산은 스캐폴드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에의 부착은 절단 가능한 링커를 통한 부착이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사, 효소, 화학 시약, 열, pH 조절, 소리 또는 전기화학적 반응성에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 전자기 복사에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방출된 이펙터, 핵산 또는 분자량 바코드의 양은 전자기 복사에의 노출 강도 또는 지속시간에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 시약에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 디설파이드 결합 또는 치환된 트랜스사이클로옥텐이고, 절단 시약은 포스핀 또는 테트라진이다. 일부 실시양태에서, 방출된 이펙터, 핵산 또는 분자량 바코드의 양은 캡슐화물 내의 화학 시약의 농도에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 방출된 이펙터, 핵산 또는 분자량 바코드의 속도는 액적 내의 화학 시약의 농도에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 효소에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 프로테아제, 뉴클레아제 또는 하이드롤라제이다. 일부 실시양태에서, 방출된 이펙터, 핵산 또는 분자량 바코드의 속도는 액적 내의 효소의 양에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질을 코딩하는 핵산의 바코드를 사용하여 2개 이상의 이펙터를 인코딩하는 핵산을 바코딩하는 단계는 이펙터를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을, 표적 단백질을 코딩하는 핵산으로부터 전사된 mRNA와 하이브리드화하는 단계, 및 전사된 mRNA 또는 이펙터를 인코딩하는 핵산을 중합효소로 연장하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 적어도 1분, 적어도 10분, 적어도 1시간, 적어도 4시간 또는 적어도 1일이다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 액적이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 체류 시간은 미세유체 채널을 통한 유속, 미세유체 채널의 기하구조 또는 미세유체 채널의 밸브에 의해 제어되거나, 미세유체 채널로부터 액적을 제거하거나 액적을 별도의 용기로 옮김으로써 제어된다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사, 열 복사 또는 샘플의 시각적 변화이다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 가시광선 스펙트럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 형광 또는 발광이다. 일부 실시양태에서, 신호는 TaqMan 프로브 또는 분자 비콘에 의해 방출된 형광이다. 일부 실시양태에서, 신호는 적외선 카메라에 의해 검출된 열 복사이다. 일부 실시양태에서, 신호는 캡슐화의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 샘플의 형태학적 또는 시각적 변화이다.
일부 실시양태에서, 본원은 물리적 분류 단계 없이 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서, (a) 샘플, 핵산 인코딩된 이펙터 및 핵산 인코딩물을 캡슐화물 내에 제공하는 단계; (b) 이펙터와 샘플 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물에서 검출하는 단계; 및 (c) 신호의 검출, 부재 또는 수준을 기반으로 제1 캡핑 혼합물을 액적에 첨가하는 단계로서, 제1 캡핑 혼합물이 제1 핵산 캡을 핵산 인코딩물에 첨가하는 것인 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 캡은 제1 핵산 바코드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 바코드는 이펙터가 원하는 활성을 가짐을 표시한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 캡은 핵산 인코딩물의 라이게이션, 하이브리드화 또는 연장에 의해 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 제1 캡핑 혼합물은 제1 핵산 캡의 첨가를 달성하기 위한 추가 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산 캡은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 제1 캡핑 혼합물이 캡슐화물에 첨가되지 않은 경우 제2 캡핑 혼합물을 캡슐화물에 첨가하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 제2 캡핑 혼합물은 제2 핵산 캡을 핵산 인코딩물에 첨가하고, 이때 제1 핵산 캡과 제2 핵산 캡은 상이한 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 캡은 제2 핵산 바코드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 바코드는 이펙터가 원하는 활성을 갖지 않음을 표시한다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 캡은 핵산 인코딩물의 라이게이션, 하이브리드화 또는 연장에 의해 핵산 인코딩물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 제2 캡핑 혼합물은 제2 핵산 캡의 첨가를 달성하기 위한 추가 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 핵산 캡은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA이다. 일부 실시양태에서, 제2 캡핑 혼합물은 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 제1 캡핑 혼합물만이 캡슐화물에 첨가되거나 제2 캡핑 혼합물만이 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 제1 캡핑 혼합물은 피코주입에 의해 첨가된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 캡슐화의 추가 물리적 분류를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 하나 이상의 세포, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 효소, 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 세포 용해물 또는 하나 이상의 조직 추출물이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 단일 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 화합물, 단백질, 펩타이드, 효소 또는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 약물 유사 소분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 말단 캡핑 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단 캡핑 부위는 제1 핵산 캡의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA 또는 이중 가닥 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 오일 중의 유화액이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 스캐폴드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 제1 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 제1 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 스캐폴드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 핵산 인코딩물은 제2 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 공유부착된다. 일부 실시양태에서, 제1 절단 가능한 링커와 제2 절단 가능한 링커는 상이하다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 제2 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 제1 또는 제2 캡핑 혼합물을 첨가하기 전에 절단된다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사, 열 복사 또는 샘플의 시각적 변화이다. 일부 실시양태에서, 신호를 검출하는 단계는 검출기를 갖춘 미세유체 채널을 통해 캡슐화물을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터와 샘플이 상호작용할 수 있도록 일정 시간 동안 캡슐화물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 일정 시간은 캡슐화물이 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 핵산 인코딩물을 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 차세대 서열분석이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 인코딩된 이펙터의 라이브러리에 대해 본원에 기재된 임의의 실시양태의 스크린을 수행하는 단계를 포함하고, 이때 인코딩된 이펙터의 라이브러리는 복수의 상이한 이펙터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 스캐폴드 상의 이펙터 로딩을 측정하는 방법으로서, (a) 이펙터 서브유닛을 복수의 스캐폴드 상의 이펙터 부착 부위에 부착시키는 단계; (b) 이펙터 서브유닛을 부착시키는 단계 후에 검출 가능한 표지를 복수의 스캐폴드 상의 임의의 남아 있는 빈 이펙터 부착 부위에 부착시키는 단계; (c) 복수의 스캐폴드로부터 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 단계; (d) 스캐폴드의 서브세트에 부착된 검출 가능한 표지의 양을 측정하여, 이펙터 부착 부위에 성공적으로 부착된 이펙터 서브유닛의 양을 측정하는 단계; (e) 부착된 이펙터 서브유닛을 임의적으로 활성화시켜 새로운 이펙터 부착 부위를 생성하는 단계; 및 (f) 원하는 이펙터가 어셈블링될 때까지 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계를 포함하는 방법을 개시하는 것으로서, 이때 상기 스캐폴드는 이펙터를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하거나, 상기 방법은 이펙터 서브유닛이 스캐폴드에 첨가될 때 서브유닛을 인코딩하는 핵산을 이펙터 서브유닛에 상응하는 스캐폴드에 부착시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (e)는 마지막 이펙터 서브유닛이 부착된 후 생략된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 독립적으로 아미노산, 소분자 단편, 뉴클레오타이드 또는 화합물이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드에 부착된 각각의 이펙터 서브유닛은 화합물이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 반응성 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 아미노 또는 카르복실레이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위는 바이오오르토고날 또는 CLICK 화학 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 서브유닛은 이펙터 부착 부위에 상보적인 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 이펙터 부착 부위에 상보적인 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 검출 가능한 표지에 의해 측정되는 부착을 가진 이펙터 서브유닛 상의 반응성 기와 동일한 반응성 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 형광단이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 부착 부위의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40% 또는 최대 50%는 이펙터 서브유닛을 부착시키는 단계 후에 비어 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 스캐폴드의 서브세트를 제거하는 단계는 남아 있는 스캐폴드의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 5% 이하 또는 10% 이하를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드의 서브세트에 부착된 검출 가능한 표지의 양을 측정하여 이펙터 부착 부위에 성공적으로 부착된 이펙터 서브유닛의 양을 측정하는 단계는 검출 가능한 표지의 측정치를, 임의의 이펙터 서브유닛이 부착되지 않은 스캐폴드 상의 검출 가능한 표지의 측정치와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드의 서브세트에 성공적으로 부착된 이펙터 서브유닛의 양은 이펙터 서브유닛에 의해 점유된 총 부착 부위의 퍼센트로서 표현된다. 일부 실시양태에서, 부착된 이펙터 서브유닛을 임의적으로 활성화시켜 새로운 이펙터 부착 부위를 생성하는 단계는 부착된 이펙터 서브유닛으로부터 보호기를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보호기는 아미노 보호기, 카르복실레이트 보호기, 알코올 보호기, 페놀 보호기, 알킨 보호기, 알데하이드 보호기 또는 케톤 보호기이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 아미노 보호기이다. 일부 실시양태에서, 아미노 보호기는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), tert-부틸옥시카르보닐(BOC), 카르보벤질옥시(Cbz), 벤질(Bz), 토실(Ts) 또는 트리클로로에틸 클로로포르메이트(Troc)이다. 일부 실시양태에서, 보호기는 카르복실레이트 보호기이다. 일부 실시양태에서, 카르복실레이트 보호기는 메틸 에스테르, 벤질 에스테르, tert-부틸 에스테르, 2,6-이치환된 페놀 에스테르, 실릴 에스테르 또는 오르토에스테르이다. 일부 실시양태에서, 새로운 이펙터 부착 부위는 이전의 이펙터 부착 부위와 동일한 작용기이다. 일부 실시양태에서, 새로운 이펙터 부착 부위는 이전의 이펙터 부착 부위와 상이한 작용기이다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (e)는 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 10회 또는 적어도 20회 반복된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터 서브유닛이 스캐폴드에 첨가될 때 서브유닛을 인코딩하는 핵산을 이펙터 서브유닛에 상응하는 스캐폴드에 부착시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 로딩된 스캐폴드의 라이브러리는 동시에 합성된다. 일부 실시양태에서, 라이브러리로부터의 이펙터 부착 단계로부터 스캐폴드의 서브세트는 검출 가능한 표지의 검출 전에 풀링된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드의 서브세트는 캡슐화물 내로 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 대부분의 캡슐화물은 단일 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드의 서브세트로부터의 스캐폴드는 검출된 검출 가능한 표지의 양에 따라 비닝된다. 일부 실시양태에서, 각각의 빈은 검출된 검출 가능한 표지의 고유 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법은 풀의 인코딩 핵산 또는 인코딩 핵산 서브유닛을 서열분석하여, 어느 이펙터 서브유닛이 이펙터 서브유닛을 이펙터 부착 부위에 부착시키는 단계에서 특정 수율에 상응하는지를 보여주는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석 단계는 단계 (a) 내지 (e)가 반복될 때마다 수행된다. 일부 실시양태에서, 각각의 고유 스캐폴드에 대한 각각의 단계 (a) 내지 (e)의 수율을 수집하여, 각각의 스캐폴드 상에서 완전한 원하는 이펙터의 로딩을 보여주는 데이터세트를 생성한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (a) 소수성 표면; 및 (b) 상기 소수성 표면에 산재된 핵산 패치를 포함하는 인코딩된 비드를 스크리닝하는 어레이 장치를 개시하는 것으로서, 이때 소수성 표면 및 핵산 패치는 규정된 양의 매질이 표면을 가로질러 전개될 때 각각의 핵산 패치가 매질로 덮이고 핵산 패치 사이의 소수성 표면이 매질을 함유하지 않도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 어레이 장치는 소수성 표면 아래에서 하나 이상의 채널을 추가로 포함하고, 이때 상기 채널은 핵산 패치 내에 말단 단부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널은 시약을 핵산 패치에 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 시약은 액체 용액으로서 전달된다. 일부 실시양태에서, 소수성 표면은 소수성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 폴리아크릴, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리디엔, 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리플루오로카본, 폴리올레핀, 폴리스티렌, 폴리비닐 아세탈, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐, 에테르, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 피리딘, 폴리비닐피롤리돈, 폴리실란, 폴리플루오로실란, 폴리퍼플루오로실란 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 폴리플루오로카본을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 중합체는 플루오르화된다. 일부 실시양태에서, 소수성 표면은 소수성 기로 작용화된 표면이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 지방산, 알킬 기, 알콕시 기, 방향족 기, 알킬 실란, 플루오로실란, 퍼플루오로실란, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 소수성 기는 플루오르화된다. 일부 실시양태에서, 세포는 소수성 표면에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일 핵산 패치는 매질의 단일 액적 내로 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 DNA, RNA, 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 핵산 인코딩된 비드에 결합할 수 있는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 비드 상의 상보적 핵산에 결합하거나 비드 상의 또 다른 기에 결합함으로써, 핵산 인코딩된 비드에 비특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 크기가 최대 약 1 ㎛2, 최대 약 10 ㎛2, 최대 약 100 ㎛2, 최대 약 1000 ㎛2 또는 최대 약 10000 ㎛2이다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 최대 약 1 ㎛, 최대 약 10 ㎛, 최대 약 100 ㎛, 최대 약 1000 ㎛ 또는 최대 약 10000 ㎛에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치는 격자 패턴으로 배열된다. 일부 실시양태에서, 매질은 수성 매질이다. 일부 실시양태에서, 핵산 패치의 밀도는 적어도 100개 패치/cm2, 적어도 1000개 패치/cm2, 적어도 10000개 패치/cm2, 적어도 100000개 패치/cm2, 적어도 1000000개 패치/cm2 또는 적어도 10000000개 패치/cm2이다. 일부 실시양태에서, 장치의 표면적은 적어도 1 cm2, 적어도 5 cm2, 적어도 10 cm2, 적어도 25 cm2, 적어도 50 cm2, 적어도 100 cm2, 적어도 500 cm2 또는 적어도 1000 cm2이다.
일부 실시양태에서, 본원은 스크린을 수행하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 개시한다: (a) 핵산 인코딩된 비드를 본원에 기재된 실시양태 중 어느 한 실시양태의 어레이의 핵산 패치에 결합시키는 단계; (b) 핵산 인코딩된 비드를 서열분석하는 단계; (c) 세포를 핵산 패치에 결합시키는 단계; 및 (d) 어레이에 대한 어세이를 수행하는 단계. 일부 실시양태에서, 비드는 인코딩된 이펙터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비드로부터 이펙터를 방출시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드로부터 이펙터를 방출시키는 단계는 절단 시약을 핵산 패치에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비드를 서열분석하는 단계는 특정 핵산 인코딩된 비드의 물리적 위치를 확인할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 어세이는 검출 가능한 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 핵산 패치는 단일 비드 및 단일 세포에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원은 이온 채널을 자극하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 개시한다: (a) 세포를 캡슐화물 내에 제공하는 단계; (b) 전기자극, 광학 자극 또는 화학적 자극으로 세포의 이온 채널을 자극하는 단계; 및 (c) 캡슐화물 내의 세포의 이미지를 포착함으로써 세포로부터 신호를 검출하는 단계. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 전기자극에 의해 자극된다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전극은 캡슐화의 유동 경로 내부에 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 캡슐화의 유동 경로 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 광학 자극에 의해 자극된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이온 채널은 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 이온 채널을 광학 자극에 민감하게 만든다. 일부 실시양태에서, 이온 채널은 화학적 자극에 의해 자극된다. 일부 실시양태에서, 화학적 자극은 이온 채널을 독소와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 독소는 피코주입에 의해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 피코주입은 조건부 피코주입이다. 일부 실시양태에서, 독소는 이온 채널 독소이다. 일부 실시양태에서, 신호는 세포의 형태학적 또는 시각적 변화이다. 일부 실시양태에서, 세포의 이미지를 포착하는 것은 캡슐화의 일련의 이미지를 기록하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 캡슐화물 내의 샘플의 일련의 이미지를 중첩하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 검출 시약을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본원은 이온 채널을 자극하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: (a) 세포를 캡슐화물 내에 제공하는 단계; (b) 전기자극, 광학 자극 또는 화학적 자극으로 세포의 이온 채널을 자극하는 단계; 및 (c) 캡슐화물 내의 세포의 이미지를 포착함으로써 세포로부터의 신호를 검출하는 단계.
한 측면에서, 본원은 이온 채널 조절제를 스크리닝하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다: (a) (i) 이온 채널 단백질을 발현하는 세포, (ii) 전압 센서 프로브 세트, 및 (iii) 인코딩된 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물을 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계; (b) 세포의 이온 채널을 자극하는 단계; 및 (c) 상기 전압 센서 프로브 세트의 적어도 하나의 구성원으로부터 신호를 검출하는 단계. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적, 유화액, 피코웰, 마크로웰, 마이크로웰, 기포 또는 미세유체 밀폐부이다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 액적이다. 일부 실시양태에서, 액적은 부피가 최대 1 피코리터, 최대 10 피코리터, 최대 100 피코리터, 최대 1 나노리터, 최대 10 나노리터, 최대 100 나노리터 또는 최대 1 마이크로리터이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 나트륨, 칼슘, 클로라이드, 양성자 또는 칼륨 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 내생성 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 외생성 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 나트륨, 칼슘, 클로라이드, 양성자 또는 칼륨 전압 게이팅 이온 채널 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 전압 게이팅 칼슘 채널 단백질(VGCC)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 L형 칼슘 채널, P형 칼슘 채널, N형 칼슘 채널, R형 칼슘 채널 또는 T형 칼슘 채널, 또는 이들의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 채널로돕신, 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 채널로돕신은 ChrimsonR, 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 접합체이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 단백질은 과다발현된다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 FRET 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 전압 민감성 옥소놀, 형광 쿠마린, 또는 이들 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 프로브 세트는 DiSBAC 화합물, 쿠마린 인지질, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 세트는 DiSBAC2, DiSBAC4, DiSBAC6, CC1-DMPE, CC2-DMPE, 또는 이들의 임의의 조합 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 센서 세트는 DiSBAC6 및 CC2-DMPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡슐화물은 전압 어세이 배경 억제 화합물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전압 어세이 배경 억제 화합물은 VABSC-1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 및 이의 상응하는 인코딩물은 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 비드, 섬유, 나노섬유 스캐폴드, 분자 케이지, 덴드리머 또는 다가 분자 어셈블리이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 중합체 비드, 유리 비드, 금속 비드 또는 자기 비드이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 직경이 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛인 비드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 절단 가능한 링커를 통해 스캐폴드에 결합된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 절단 가능한 링커를 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 화합물 또는 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 이펙터는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 인코딩물은 핵산이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하는 것은 전기자극, 광학 자극, 화학적 자극, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하는 것은 전기자극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하는 것은 적어도 하나의 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 전극은 캡슐화의 유동 경로 내에 있다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 전기장, 유전영동력, 또는 내장된 금속-접촉 전극을 생성하기 위해 비접촉 전극에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 전기자극은 캡슐화물을 함유하는 미세유체 장치의 기하구조에 의해 좌우된다. 일부 실시양태에서, 전기자극의 주파수는 약 10 Hz이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하는 것은 광학 자극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 UV, VIS 또는 근적외선 복사이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극은 캡슐화물을 함유하는 미세유체 장치에 내장된 광섬유 도파관을 이용함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 광학 자극의 주파수는 약 10 Hz이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 파장은 약 660 nm이다. 일부 실시양태에서, 광학 자극을 위한 광의 강도는 약 500 mJ/s/cm2이다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하는 것은 화학적 자극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 자극은 이온 채널을 이온 채널 독소와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 베라트리딘, OD-1 또는 또 다른 이온 채널 독소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널 독소는 피코주입에 의해, 액적 융합에 의해, 또는 캡슐화물을 함유하는 미세유체 장치의 미리 배열된 구성을 통해 캡슐화물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 신호는 전자기 복사이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 발광 또는 형광이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 형광이다. 일부 실시양태에서, 전자기 복사는 FRET 상호작용으로 인해 방출된다. 일부 실시양태에서, 신호는 인코딩된 이펙터를 갖지 않는 동일한 캡슐화물에 비해 전자기 복사의 증가, 감소 또는 변화이다. 일부 실시양태에서, 신호는 이온 채널의 자극 전 캡슐화물에 비해 전자기 복사의 증가, 감소 또는 변화이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 신호의 존재, 부재, 수준 또는 변화를 기반으로 캡슐화물을 분류하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 인코딩물의 성질을 측정하여 이펙터의 정체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본원은 (a) 수성 유체를 포함하는 제1 미세유체 채널; (b) 수성 유체와 혼화될 수 없는 유체를 포함하는 제2 미세유체 채널; (c) 제1 미세유체 채널이 제2 미세유체 채널과 유체 연통하는 연접부; (d) 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하기 위한 절단 영역; (e) 검출 영역; 및 (f) 분류 영역을 포함하는, 액적 기반 인코딩된 라이브러리 스크리닝을 위한 미세유체 장치를 제공하는 것으로서, 이때 상기 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널의 연접부는 장치 평면을 한정하고, 상기 연접부는 제2 미세유체 채널로부터의 유체 내에서 수성 유체의 액적을 형성하도록 구성되고, 이때 제2 미세유체 채널은 상기 연접부를 지나 연속됨으로써 어세이 유동 경로를 한정하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 장치는 자극 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 이온 채널을 자극하기 위한 하나 이상의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하기 위한 하나 이상의 작동기는 적어도 하나의 광원, 적어도 하나의 전극, 또는 이온 채널 독소를 갖춘 적어도 하나의 피코주입 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 적어도 하나의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 작동기는 액적이 전극 쌍을 통과할 때 액적이 전극과 접촉함으로써, 전류가 액적을 통해 흐를 수 있도록 어세이 유동 경로의 반대쪽 벽에서 한 쌍의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 5개, 적어도 7개, 적어도 10개 또는 적어도 20개의 작동기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하기 위한 작동기 중 적어도 하나는 장치 평면과 실질적으로 평행하다. 일부 실시양태에서, 이온 채널을 자극하기 위한 작동기 중 적어도 하나는 어세이 유동 경로의 곡선에 놓여 있다. 일부 실시양태에서, 자극 영역은 검출 영역의 업스트림 및 절단 영역의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 어세이 유동 경로 내에 배치된 스캐폴드로부터 이펙터를 절단하도록 구성된 광원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광원은 UV 광원이다. 일부 실시양태에서, 광원은 장치 평면과 실질적으로 평행한 광축을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 광원은 어세이 유동 경로의 곡선에서 통과 액적을 조명한다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 검출 영역 및 분류 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 절단 영역은 연접부의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 어세이 유동 경로는 구불구불한 유동 경로 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구불구불한 유동 경로 영역은 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 곡선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 형광측정기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광측정기는 장치 평면에 실질적으로 평행한 광축을 갖도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 형광측정기는 어세이 유동 경로의 곡선에서 통과 액적을 조명한다. 일부 실시양태에서, 형광측정기는 2개 이상의 형광 파장을 검출하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 절단 영역의 다운스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 검출 영역은 분류 영역의 업스트림에 있다. 일부 실시양태에서, 분류 영역은 검출 영역에서 검출된 신호를 기반으로 액적을 분류하도록 구성된 분류기를 포함한다.
정의
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문용어는 청구된 보호대상이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 일부 경우, 일반적으로 이해되는 의미를 가진 용어는 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되고, 이러한 정의를 본원에 포함하는 것은 반드시 당분야에서 일반적으로 이해되는 의미에 비해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원 전체에 걸쳐 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이고 본 개시내용의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치 값도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 및 6도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수형 용어는 복수형 용어도 포함한다. 예를 들면, 용어 "샘플"은 이들의 혼합물을 비롯한 복수의 샘플을 포함한다.
용어 "결정하는", "측정하는", "검출하는", "평가하는", "추정하는", "어세이하는" 및 "분석하는"은 측정 형태를 지칭하기 위해 본원에서 종종 교환 가능하게 사용된다. 이 용어들은 요소가 존재하는지 아니면 존재하지 않는지를 확인(예를 들면, 검출)하는 것을 포함한다. 이 용어들은 정량적, 정성적 또는 정량적 및 정성적 측정을 포함할 수 있다. 평가는 상대적 또는 절대적일 수 있다. "의 존재를 검출하는"은 문맥에 따라 어떤 것이 존재하는지 아니면 부재하는지를 확인하는 것 이외에 존재하는 어떤 것의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 설명하는 데 사용된다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체 외부에서 일어나는 사건을 설명하는 데 사용된다. 생체외 어세이는 대상체에 대해 수행되지 않는다. 오히려, 이 어세이는 대상체로부터 분리된 샘플에 대해 수행된다. 샘플에 대해 수행되는 생체외 어세이의 예는 "시험관내" 어세이이다.
용어 "시험관내"는 물질이 수득되는 생물학적 공급원으로부터 분리되도록 실험실 시약을 보관하기 위한 용기에 함유된 상태로 일어나는 사건을 설명하는 데 사용된다. 시험관내 어세이는 살아있거나 죽은 세포가 사용되는 세포 기반 어세이를 포괄할 수 있다. 시험관내 어세이는 온전한 세포가 사용되지 않는 무세포 어세이도 포괄할 수 있다.
용어 "히트"는 샘플에 대해 스크리닝되고 양성 결과를 돌려보내는 이펙터를 지칭한다. 양성 결과는 이용되는 스크린의 성질에 의해 좌우될 수 있으나, 조사되는 표적에 대한 효능의 표시를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "스크린"은 다양한 이펙터가 특정 샘플에 미치는 효과를 확인하기 위해 복수의 이펙터를 사용하여 어세이를 수행하는 것을 의미한다.
용어 "서열분석"은 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 것을 의미한다. 임의의 적합한 서열분석 방법을 본원에서 제공된 방법 및 시스템과 함께 사용할 수 있다. 서열분석은 차세대 서열분석에 의해 달성될 수 있다. 차세대 서열분석은 피로서열분석, 합성에 의한 서열분석, 단일 분자 서열분석, 2세대 서열분석, 나노공극 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석 또는 하이브리드화에 의한 서열분석과 같은 많은 종류의 서열분석을 포함한다. 차세대 서열분석 플랫폼은 일루미나(Illumina)(RNA-Seq) 및 헬리코스(Helicos)(디지털 유전자 발현 또는 "DGE")로부터 상업적으로 입수될 수 있는 플랫폼이다. 차세대 서열분석 방법은 하기 회사들에 의해 상업화된 방법들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다: 1) 문헌[Margulies et al., Nature (2005) 437:376-380 (2005)]; 및 미국 특허 제7,244,559호, 제7,335,762호, 제7,211,390호, 제7,244,567호, 제7,264,929호 및 제7,323,305호에 기재된 방법 및 장치를 포함하나 이들로 제한되지 않는 454/로슈 라이프사이언시스(Roche Lifesciences); 2) 미국 출원 제11/167046호, 및 미국 특허 제7501245호, 제7491498호 및 제7,276,720호; 및 미국 특허출원 공개 제US20090061439호, 제US20080087826호, 제US20060286566호, 제US20060024711호, 제US20060024678호, 제US20080213770호 및 제US20080103058호에 기재된 헬리코스 바이오사이언시스 코포레이션(Helicos Biosciences Corporation)(매사추세츠주 캠브리지 소재); 3) 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(예를 들면, SOLiD 서열분석); 4) 도버(Dover) 시스템(예를 들면, Polonator G.007 서열분석); 5) 미국 특허 제5,750,341호, 제6,306,597호 및 제5,969,119호에 기재된 일루미나 인코포레이티드(lllumina, Inc.); 및 6) 미국 특허 번호 제7,462,452호, 제7,476,504호, 제7,405,281호, 제7,170,050호, 제7,462,468호, 제7,476,503호, 제7,315,019호, 제7,302,146호, 제7,313,308호; 및 미국 출원 공개 제US20090029385호, 제US20090068655호, 제US20090024331호 및 US20080206764호에 기재된 파시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences). 이러한 방법 및 장치는 예로써 여기에 제공되고 제한하기 위한 것이 아니다.
용어 "바코드"는 특정 시스템에 고유한 핵산 서열을 지칭한다. 바코드는 특정 방법 또는 특정 이펙터에 고유할 수 있다. 본원에서 제공된 방법 및 시스템의 핵산 인코딩물은 소정의 이펙터의 구조를 확인하는 데 사용될 수 있는 고유 핵산 서열이라는 점에서 바코드와 유사하다. 바코드 또는 핵산 인코딩물의 길이는 주어진 라이브러리에서 모든 이펙터를 구별하기에 충분해야 한다.
용어 "유동"은 본 개시내용의 장치 또는 방법을 통한 액체 또는 고체의 임의의 이동을 의미하고, 물질이 스트림에 의해 운반되는지 여부와 관계없이 스트림과 함께, 스트림 내에서 또는 스트림에 거슬러 이동하는 임의의 유체 스트림 및 임의의 물질을 제한 없이 포괄한다. 예를 들면, 본 개시내용의 장치 또는 방법을 통한, 예를 들면, 본 개시내용의 미세유체 칩의 채널을 통한 분자, 세포 또는 비리온의 이동은 유동을 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 이것은 분자, 세포 또는 비리온이 유동을 포함하는 유체의 스트림에 의해 운반되는지 여부, 또는 분자, 세포 또는 비리온이 일부 다른 직접적인 또는 간접적인 힘 또는 동력에 의해 이동하도록 야기되는지 여부, 및 임의의 동력의 성질이 알려져 있거나 이해되어 있는지 여부와 관계없다. 분자, 세포 또는 비리온이 본 개시내용에 따라 검출되거나, 측정되거나 분류되는 한, 압력, 모세관 작용, 전기삼투, 전기영동, 유전영동, 광학 핀셋 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 힘의 적용을 임의의 특정 이론 또는 작용 기작과 관계없이 이용하여 유동을 제공할 수 있다.
"입구 영역"은 검출 측정 또는 분류를 위해 분자, 세포 또는 비리온을 제공받는 미세가공된 칩의 영역이다. 입구 영역은 입구 채널, 웰 또는 저장소, 개구, 및 분자, 세포 또는 비리온이 용이하게 장치 내로 진입하게 하는 다른 특징을 함유할 수 있다. 칩은 원하는 경우 하나 초과의 입구 영역을 함유할 수 있다. 입구 영역은 주 채널과 유체 연통하고 그로부터 업스트림에 있다.
"출구 영역"은 검출, 측정 또는 분류 후 분자, 세포 또는 비리온을 수집하거나 분배하는 미세가공된 칩의 영역이다. 출구 영역은 식별 영역으로부터 다운스트림에 있고, 분지 채널 또는 출구 채널을 함유할 수 있다. 칩은 원하는 경우 하나 초과의 출구 영역을 함유할 수 있다.
"분석 유닛"은 적어도 하나의 입구 영역, 적어도 하나의 주 채널, 적어도 하나의 검출 영역 및 적어도 하나의 출구 영역을 가진 미세가공된 기판, 예를 들면, 미세가공된 칩이다. 분석 유닛의 분류 실시양태는 예를 들면, 검출 영역의 다운스트림에서 적어도 2개의 분지 채널과 2개의 출구 영역을 형성하는 식별 영역 및/또는 분지점을 포함한다. 본 개시내용에 따른 장치는 복수의 분석 유닛을 포함할 수 있다.
"주 채널"은 검출(식별), 측정 또는 분류를 위해 검출 영역을 지나는 분자, 세포 또는 비리온의 유동을 허용하는 본 개시내용의 칩의 채널이다. 분류용으로 디자인된 칩에서, 주 채널은 식별 영역도 포함한다. 검출 영역 및 식별 영역은 주 채널에 배치될 수 있거나 제작될 수 있다. 주 채널은 전형적으로 분자, 세포 또는 비리온이 주 채널 내로 유동할 수 있게 하는 입구 채널 또는 입구 영역과 유체 연통한다. 주 채널은 또한 전형적으로 출구 영역 및 임의적으로 분지 채널과 유체 연통하며, 이들 각각은 출구 채널 또는 폐기물 채널을 가질 수 있다. 이 채널들은 세포가 주 채널로부터 외부로 유동할 수 있게 한다.
"검출 영역"은 칩 내부, 전형적으로 주 채널 내부의 위치이고, 여기서 소정의 특성을 기반으로 분자, 세포 또는 비리온을 확인할 수 있거나, 측정할 수 있거나 분류할 수 있다. 한 실시양태에서, 분자, 세포 또는 비리온은 한 번에 하나씩 조사되고, 특성은 예를 들면, 리포터의 존재 또는 양에 대한 시험에 의해 광학적으로 검출되거나 측정된다. 예를 들면, 검출 영역은 하나 이상의 현미경, 다이오드, 광 자극 장치(예를 들면, 레이저), 광전자증배관 및 프로세서(예를 들면, 컴퓨터 및 소프트웨어), 및 이들의 조합과 연통하고, 이들은 협력하여 특성, 마커 또는 리포터를 표시하는 신호를 검출하고 식별 영역에서 측정 또는 분류 작업을 결정하고 지시한다. 분류 실시양태에서, 검출 영역은 식별 영역과 유체 연통하고 식별 영역에 있거나, 식별 영역에 인접하거나, 식별 영역의 업스트림에 있다.
본원에서 사용된 "담체 유체", "비혼화성 유체" 또는 "비혼화성 담체 유체" 또는 유사한 용어는 샘플 또는 어세이 액체가 혼합될 수 없고 담체 유체 내에서 샘플 또는 어세이 액체의 액적이 형성될 수 있게 하는 액체를 지칭한다. 이 용어들은 본원에서 교환 가능하게 사용되며 동일한 물질을 포괄하기 위한 것이다. 이러한 담체 유체의 비제한적 예는 실리콘 기제 오일, 실리콘 오일, 소수성 오일(예를 들면, 스쿠알렌, 플루오르화 오일, 퍼플루오르화 오일), 또는 분석될 샘플을 함유하는 또 다른 원하는 액체를 캡슐화할 수 있는 임의의 유체를 포함한다.
"압출 영역", "액적 압출 영역" 또는 "액적 형성 영역"은 본 개시내용의 칩의 입구 영역과 주 채널 사이의 연접부이고, 이 연접부는 주 채널 내의 유체 유동에 수직인 각도에서 가압된 유체를 주 채널에 도입할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 압출 영역을 통해 주 채널에 도입된 유체는 압출 영역을 통해 도입된 유체의 액적이 주 채널에서 유체의 스트림으로 전단되도록 주 채널에서 유체와 "호환될 수 없다"(즉, 혼화될 수 없다).
"식별 영역" 또는 "분지점"은 분자, 세포 또는 비리온의 유동이 검출 영역에서의 조사와 관련하여 수신된 신호에 따라 방향을 변경하여 하나 이상의 다른 채널, 예를 들면, 분지 채널로 들어갈 수 있는 채널의 연접부이다. 전형적으로, 식별 영역은 모니터링되고/되거나 검출 영역의 제어 하에 있으므로, 식별 영역은 이러한 검출 영역에 "상응"할 수 있다. 식별 영역은 하나 이상의 분류 기법 또는 유동 제어 시스템, 예를 들면, 전기, 전기삼투, (마이크로) 밸브 등과 연통하고 이의 영향을 받는다. 유동 제어 시스템은 다양한 분류 기법을 이용하여 분자, 세포 또는 비리온의 유동을 소정의 분지 채널 내로 바꾸거나 안내할 수 있다.
"분지 채널"은 식별 영역 및 주 채널과 연통하는 채널이다. 전형적으로, 분지 채널은 검출 영역에 의해 검출되고 식별 영역에서 분류되는 관심 있는 분자, 세포 또는 비리온 특성에 따라 분자, 세포 또는 비리온을 제공받는다. 분지 채널은 추가 분류를 허용하기 위해 다른 채널과 연통할 수 있다. 대안적으로, 분지 채널은 출구 영역도 가질 수 있고/있거나, 분자, 세포 또는 비리온의 수집 또는 폐기를 가능하게 하는 웰 또는 저장소로 종결될 수 있다.
용어 "정방향 분류" 또는 유동은 분자, 세포 또는 비리온이 일부 경우, 방향의 변화, 예를 들면, 반대 "정방향" 유동 없이 전형적으로 입구 영역(업스트림)부터 출구 영역(다운스트림)까지 한 방향으로 유동하는 것을 기술한다. 일부 실시양태에서, 분자, 세포 또는 비리온은 선형 방식으로, 즉 단일 파일로 정방향으로 이동한다. "정방향" 분류 알고리즘은 분자, 세포 또는 비리온이 미리 설정된 역치를 초과하는 광학적으로 검출 가능한 신호(예를 들면, 형광)를 갖는 것으로 확인될 때까지 유입물 채널부터 폐기물 채널까지 분자, 세포 또는 비리온을 흘려보내는 것으로 구성되고, 이 시점에서 전압이 일시적으로 바뀌어, 전기삼투를 통해 분자를 수집 채널 쪽으로 방향전환시킨다.
용어 "가역적 분류" 또는 유동은 즉, 역방향, 예를 들면, 정방향에서 반대 방향으로 바뀔 수 있는 이동 또는 유동을 기술한다. 달리 말하면, 가역적 분류는 유동의 방향을 다운스트림에서 업스트림 방향으로 바꿀 수 있게 한다. 이것은 예를 들면, 분류 결정을 확인할 수 있게 하거나, 특정 분지 채널을 선택할 수 있게 하거나, 부적절하게 선택된 채널을 보정할 수 있게 함으로써 더 정확한 분류에 유용할 수 있다.
미세유체 장치에서 분류를 위한 상이한 "분류 알고리즘"은 예를 들면, 개인용 컴퓨터의 제어 하에서 상이한 프로그램에 의해 실행될 수 있다. 한 예로서, 전기삼투 유동 대신에 압력 전환 방식을 고려한다. 전기삼투 전환은 사실상 즉각적이며, 처리량은 분류기에 인가될 수 있는 가장 높은 전압에 의해 제한된다(이것은 이온 고갈 효과를 통해 작동 시간에도 영향을 미친다). 압력 전환 방식은 고전압을 필요로 하지 않고 더 긴 작동을 위해 더 견고하다. 그러나, 시스템의 기계적 규정준수는 유체 전환 속도가 "정방향" 분류 프로그램의 이용 시 속도 제한이 될 수 있게 할 가능성이 높다. 유체는 낮은 레이놀드 수에서 존재하고 완전히 가역적이기 때문에, 희귀 분자, 세포 또는 비리온을 분리하려고 할 때, 장치의 고유 전환 속도에 의해 제한되지 않는 분류 알고리즘을 실행할 수 있다. 분자, 세포 또는 비리온은 유입물부터 폐기물까지 가능한 가장 높은 정적(비전환) 속도로 유동한다. 관심 있는 분자, 세포 또는 비리온이 검출될 때, 유동이 정지된다. 분자, 세포 또는 비리온은 유동이 정지될 때까지 연접부를 지나 폐기물 채널을 부분적으로 따라 내려갈 수 있다. 그 후, 시스템은 폐기물부터 유입물까지 느린(전환 가능한) 속도로 반대 방향으로 작동되고, 분자, 세포 또는 비리온은 검출 영역을 통과할 때 수집 채널로 전환된다. 그 시점에서, 분자, 세포 또는 비리온은 "저장"되고, 장치는 다시 정방향으로 고속으로 작동될 수 있다. 유사하게, 분류 없이 분석에 사용되는 본 개시내용의 장치는 검출 영역에서 하나 이상의 분자, 세포 또는 비리온에 대해 수행된 검출 또는 분석을 재판독하거나 검증하기 위해 역으로 작동될 수 있다. 이 "가역적" 분석 또는 분류 방법은 표준 겔 전기영동 기술(분자용)에 의해 가능하지 않고 기존 FACS 기계(세포용)에 의해서도 가능하지 않다. 가역적 알고리즘은 희귀 분자, 세포 또는 비리온을 수집하거나 분자 또는 단일 세포의 다회 시간 경과 측정을 수행하는 데 특히 유용하다.
용어 "유화액"은 제2 액체의 본체에서 작은 소구체(본원에서 점적 또는 액적으로서도 지칭됨)에 분포된 한 액체의 제제를 지칭한다. 소구체에 분산된 제1 액체는 불연속상으로서 지칭되는 반면, 제2 액체는 연속상 또는 분산 매질로서 지칭된다. 한 실시양태에서, 연속상은 수용액이고 불연속상은 소수성 유체, 예컨대, 오일(예를 들면, 데칸, 테트라데칸 또는 헥사데칸)이다. 이러한 유화액은 본원에서 수중유 유화액으로서 지칭된다. 또 다른 실시양태에서, 유화액은 유중수 유화액일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 불연속상은 수용액이고 연속상은 오일과 같은 소수성 유체이다. 수중유 유화액 중의 오일의 액적 또는 소구체는 본원에서 "미셀"로서도 지칭되는 반면, 유중수 유화액 중의 물의 소구체는 "역 미셀"로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 그 숫자에서 그 숫자의 10%를 더하거나 빼는 것을 의미한다. 용어 "약" 범위는 그 범위에서 그의 가장 낮은 값의 10%를 빼고 그의 최대 값의 10%를 더하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 단락 제목은 조직화 목적만을 위한 것이며 기재된 보호대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
하기 실시예는 예시 목적으로만 포함되고 본 개시내용의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: 프로테아제 억제를 프로빙하기 위한 인코딩된 이펙터의 화학양론적 절단
소분자가 치환된 트랜스사이클로옥텐에 의해 비드에 연결되어 있는, 핵산 인코딩된 소분자를 함유하는 비드의 라이브러리를 제조한다. 이 실시예에서, 트립신의 소분자 억제제를 검출하기 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 비드의 라이브러리를 포함하는 용액을 미세유체 장치(400)의 제1 시약 웰(401)에 넣는다. 트립신을 포함하는 용액을 시약 웰(402)에 첨가하고, 오일 매질을 시약 웰(403)에 첨가한다. 시약 웰(401, 402 및 403)의 내용물은 트립신 용액과 비드 용액이 오일 유화액에서 액적을 형성하는 연접부(404)에서 만날 때까지 유동한다. 그 다음, 액적은 피코주입 부위(406)에 도달할 때까지 유동 경로(405)를 따라 유동한다. 피코주입 부위(406)에서, 피코주입기(407)는 디메틸 테트라진 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 카제인을 함유하는 용액을 첨가한다. 피코주입은 통과하는 각각의 액적이 균일한 용량의 용액을 제공받도록 구성된다. 용액 중의 디메틸 테트라진의 농도는 비드를 포함하는 각각의 액적이 피코주입을 제공받을 때 실질적으로 동일한 양의 이펙터를 방출하도록 구성된다. 그 후, 액적은 검출기(408)에 도달할 때까지 유동 경로(405)를 따라 계속된다. 검출기(408)는 FITC FRET 방출(여기 485 nm/방출 538 nm)을 측정하도록 구성된 형광측정기이다. 그 결과 검출기(408)에 의해 검출된 형광을 기반으로, 샘플은 FRET 방출이 특정 역치 초과 수준으로 검출되는 경우 연접부(409)에서 빈(410)을 향한 경로로 분류되고 FRET 방출이 상기 역치 초과 수준으로 검출되지 않는 경우 빈(411)을 향한 경로로 분류된다. 스크린이 완료된 후, 빈(410) 내의 핵산 인코딩물을 차세대 서열분석으로 서열분석하여, 어느 소분자가 트립신에 대한 억제 효과를 갖는지를 확인한다.
실시예 2: 분자 비콘을 사용한 핵산 검출
소분자가 디설파이드 결합에 의해 비드에 연결되어 있는, 핵산 인코딩된 소분자를 함유하는 비드의 라이브러리를 제조한다. 이 실시예에서, 분자 비콘을 사용하여 세포 mRNA를 측정함으로써 관심 있는 단백질의 세포 발현의 증가를 검출하기 위해 상기 라이브러리를 스크리닝한다. 이 실시예에서 사용된 분자 비콘은 관심 있는 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적인 서열을 함유한다. 분자 비콘은 한 루프 말단에서 시아닌 5 염료를 추가로 포함하고 다른 말단에서 DABCYL 켄처를 추가로 포함한다. 이 실시예에서, 관심 있는 단백질은 샘플 세포에 의해 발현되고, 원하는 스크린 결과는 관심 있는 단백질의 발현의 증가이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 비드의 라이브러리를 포함하는 용액을 미세유체 장치(500)의 제1 시약 웰(501)에 넣는다. 관심 있는 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 용액을 시약 웰(502)에 첨가하고, 오일 매질을 시약 웰(503)에 첨가한다. 시약 웰(501, 502 및 503)의 내용물은 세포를 함유하는 용액과 비드 용액이 오일 유화액에서 액적을 형성하는 접합부(504)에서 만날 때까지 유동한다. 장치는 대부분의 캡슐화물이 단일 세포 및 단일 비드를 제공받도록 구성된다. 그 후, 액적은 피코주입 부위(506)에 도달할 때까지 유동 경로(505)를 따라 유동한다. 피코주입 부위(506)에서, 피코주입기(507)는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 함유하는 용액을 첨가한다. 피코주입은 통과하는 각각의 액적이 균일한 용량의 용액을 제공받도록 구성된다. 용액에서 TCEP의 농도는 비드를 포함하는 각각의 액적이 피코주입을 제공받을 때 실질적으로 동일한 양의 이펙터를 방출하도록 구성된다. 그 다음, 액적은 분자 비콘이 세포를 용해시키는 용해 완충제와 함께 피코주입기(509)에 의해 캡슐화물에 첨가되는 지점은 제2 피코주입 부위(508)에 도달할 때까지 유동 경로(505)를 따라 계속된다. 그 후, 분자 비콘은 관심 있는 단백질을 인코딩하는 임의의 mRNA와 하이브리드화함으로써, 시아닌 5 모이어티로부터 형광 방출을 허용한다. 액적은 검출기(510)에 도달할 때까지 유동 경로(505)를 따라 계속된다. 검출기(510)는 시아닌 5 형광 신호(여기 646 nm/방출 669 nm)를 측정하도록 구성된 형광측정기이다. 그 결과 검출기(510)에 의해 검출된 형광을 기반으로, 샘플은 연접부(511)에서 형광 방출이 특정 역치 초과 수준으로 검출되는 경우 빈(512)을 향한 경로로 분류되고, 형광 방출이 상기 역치 초과 수준으로 검출되지 않은 경우 빈(513)을 향한 경로로 분류된다. 스크린이 완료된 후, 빈(512) 내의 핵산 인코딩물을 차세대 서열분석으로 서열분석하여, 어느 소분자가 원하는 효과인 관심 있는 단백질의 생성 증가를 갖는지를 확인한다.
실시예 3: 돌연변이체 이민 환원효소의 스크리닝
이민 환원효소의 다양한 돌연변이체를 코딩하는 핵산 및 상응하는 바코드를 함유하는 비드의 라이브러리를 제공한다. 이 실시예에서, 시약 1과 시약 2 사이의 이민 환원을 수행할 수 있는 효소를 검출하기 위해 상기 라이브러리를 스크리닝한다.
Figure pct00014
Figure pct00015
스크리닝된 효소가 이민 환원을 수행할 수 있는 경우, 시아닌 3 및 시아닌 5 염료는 FRET 상호작용을 겪을 것이고 680 nm에서의 방출은 540 nm에서의 여기 후에 관찰될 것이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 비드의 라이브러리를 포함하는 용액을 미세유체 장치(600)의 제1 시약 웰(601)에 넣는다. 그 다음, 시험관내 전사/번역 시스템(IVTT)을 포함하는 용액을 시약 웰(602)에 첨가하고, 오일 매질을 시약 웰(603)에 첨가한다. 시약 웰(601, 602 및 603)의 내용물은 IVTT를 함유하는 용액과 비드 용액이 오일 유화액에서 액적을 형성하는 연접부(604)에서 만날 때까지 유동한다. 장치는 대부분의 캡슐화물이 단일 비드를 제공받도록 구성된다. 그 다음, IVTT는 액적 내에서 돌연변이체 이민 환원효소가 발현될 수 있게 한다. 그 후, 액적은 피코주입 부위(606)에 도달할 때까지 유동 경로(605)를 따라 유동한다. 피코주입 부위(606)에서, 피코주입기(607)는 시약 1 및 시약 2를 함유하는 용액을 첨가한다. 피코주입은 통과하는 각각의 액적이 균일한 용량의 용액을 제공받도록 구성된다. 액적은 검출기(508)에 도달할 때까지 유동 경로(605)를 따라 계속된다. 검출기(510)는 시아닌 5/시아닌 3 FRET 방출(여기 540 nm/방출 680 nm)을 측정하도록 구성된 형광측정기이다. 그 결과 검출기(608)에 의해 검출된 형광을 기반으로, 샘플은 연접부(609)에서 형광 방출이 특정 역치 초과 수준으로 검출되는 경우 빈(610)을 향한 경로로 분류되고, 형광 방출이 상기 역치 초과 수준으로 검출되지 않는 경우 빈(611)을 향한 경로로 분류된다. 스크린이 완료된 후, 빈(610) 내의 비드 상의 핵산을 차세대 서열분석으로 서열분석하여, 어느 이민 환원효소 돌연변이체가 스크리닝 동안 시약 1과 시약 2 사이의 아민 결합의 형성이라는 원하는 효과를 갖는지를 확인한다.
실시예 4: 칩 기반 시공간적으로 제어된 전기 자극 어세이를 이용한 이온 채널 스크리닝
억제제 분자가 니트로벤질 광절단 가능한 링커에 의해 비드에 연결되어 있는, 후보 이온 채널 억제제 분자를 함유하는 핵산 인코딩된 비드의 라이브러리를 제조한다. 사용된 세포주는 관심 있는 나트륨 이온 채널을 발현하는 인간 배아 신장(HEK) 세포주이다. 이온 채널의 자극 시 형광의 급격한 변화를 보고하는, 염료 DiSBAC6 및 CC2-DMPE를 함유하는 FRET 프로브 시스템으로 세포를 처리한다. 자극은 화학적, 광학적, 전기적 수단에 의해 발생할 수 있다.
이 실시예에서, 전기 자극이 사용된다. 도 7에 도시된 바와 같이, 비드 인코딩된 라이브러리를 미세유체 장치(700)의 시약 웰(702)에 넣는다. FRET 프로브 시스템을 함유하는 세포 용액을 시약 웰(703)에 첨가하고 오일 매질을 시약 웰(701)에 첨가한다. 오일은 유동 경로(705)를 따라 시약 웰(701)로부터 이동한다. 시약 웰(702 및 703)의 내용물은 연접부(704)에서 만날 때까지 별도의 유동 경로를 따라 유동한다. 수성 샘플 용액은 세포를 함유하는 용액과 비드 용액이 오일에 의해 분리된 수성 액적의 유화액 스트림을 형성하는 연접부(706)에서 오일을 만날 때까지 유동 경로 채널을 따라 아래로 유동한다. 장치는 형성된 액적의 대부분이 단일 세포 및 단일 비드를 함유하도록 구성될 수 있으나, 이것이 필수적이지는 않다. 그 다음, 액적은 광섬유에 의해 UV 공급원(707)에 커플링된 UV 광 노출 부위(708)에 도달할 때까지 유동 경로(705)를 따라 유동하고, 상기 노출 부위에서 억제제 분자는 핵산 인코딩된 비드로부터 액적 내로 방출된다. 액적이 유동 경로(705)를 따라 아래로 유동할 때, 후보 억제제는 세포와 접촉한다. 액적은 다수의 전극(709)이 유동 경로를 따라 배치되어 있는 유동 경로(705)를 따라 계속된다. 액적은 각각의 전극 세트(709)에서 전기 자극에 개별적으로 노출된다. 전극 간격 및 유속은 이 경우 10 Hz인 원하는 자극 주파수를 정의한다. 자극 후, 액적은 광섬유에 의해 광원 및 검출기(710)에 커플링된 형광 검출 영역(711)을 통과한다. 효과적인 억제제를 함유하는 액적은 전기 자극 후 비효과적인 억제제를 함유하는 액적에 비해 뚜렷하게 상이한 형광 강도를 나타낼 것이다. 그 후, 액적은 그의 특징적인 형광 신호에 따라 분류 부위(712)에서 분류되고, 히트로서 지정된 경우 수집 빈(713)으로 안내된다. 누락은 수집 빈(714)으로 안내된다.
실시예 5: 이온 채널 조절제를 스크리닝하는 칩 장치의 개발
1 상
목적:
1 상: 세포 기반 나트륨 이온 채널 활성 어세이를 수용하기 위해 초고처리량 미세유체 시스템인 이온 채널 칩(IC 칩)을 활용할 가능성을 확인하는 것. 시공간적으로 제어된 전기 자극(ES); 제어된 광학 자극(OS); 또는 화합물 유리 및 짧은 인큐베이션 후 독소 유도된 자극(TS)으로 미세유체 칩에서 세포 표면 이온 채널 활성을 유발하는 세 가지 상이한 액적 미세유체 접근법을 제안한다. 액적에서 나트륨 이온 채널 어세이 호환성 및 스크리닝 가능성을 입증하기 위해 이 방법들을 시험할 것이다. 살아있는 세포 나트륨 이온 채널을 유발하는 상기 언급된 세 가지 방법들을 실시할 수 있다. 도 8은 상기 언급된 방법들을 수행하기 위한 장치의 디자인 및 평가를 위한 개발 작업흐름의 개요를 보여준다.
1 상의 목적은 액적 내의 담체 비드로부터 광분해에 의해 방출된 알려진 억제제 대조군 화합물을 사용하여 개념 증명 시스템을 입증하는 것이다. 방출된 화합물은 모델 세포주로부터의 억제되지 않은 세포와 비교될 때 충분한 재량으로 세포에서 Na+ 이온 채널 활성을 억제할 것이다.
목적:
단계 1: 이온 채널 억제에 대한 액적 세포 어세이의 검출
요약: DiSBAC6 + CC2-DMPE FRET 프로브 방출을 통해 미세액적에서 세포주 호환성 및 세포 어세이 모니터링을 입증한다. 이 초기 개념 증명은 액적 형성 직전 세포 현탁액과 자극 독소(베라트리딘 등)의 병합에 이은 방출 검출에 의존할 것이다. 이 단계의 목적은 광학적 조사 기법을 최적화하고 유동하는 액적 내에서 억제된 이온 채널 세포 집단을 대조군 집단으로부터 식별하는 신뢰도를 정량하는 것이다. 시스템에서 형광생성 프로브 방출을 측정하는 것은 단계 2 내에서 액적내 자극 방법을 더 개발하기 위한 기본 요건이다. 추가로, 검출 능력과 양립할 수 있는 광유전학적 자극을 할 수 있는 세포주를 제공할 수 없는 경우, 전기생리학 웰 플레이트 및 대조군 어세이에서 광학 자극 방법을 평가하기 위해 채널 로돕신 발현 세포주의 클로닝 및 선택을 시작할 것이다.
이정표: 피크에서의 독소 자극 후 또는 꼬리 전류 동안(어느 쪽이든 더 민감한 시점) ≥10% 비 진폭(+/- 억제제)의 벤치마크를 충족시킨다. 비 진폭이 독소 자극과 관련 없는 경우 Z'-점수 계산을 적용하여, 대조군 집단으로부터 억제된 집단을 분리하는 데 있어서 통계적 신뢰도를 측정할 수도 있다.
단계 2: 원하는 이온 채널에 대한 10K 구성원 "표적화된 라이브러리"의 시공간적 제어와 디자인 및 구축을 이용한 액적 세포 어세이의 자극
요약: 적절하게 디자인된 IC 칩(도 1 참조)을 사용하여 세 가지 방법들(ES, OS 또는 TS) 중 하나 이상의 방법으로 유동하는 액적 내의 세포를 자극하는 능력을 입증한다. 자극 후, 억제된 세포 집단을 양성 대조군으로부터 분리하기 위해 최적 시점에서 DiSBAC6 + CC2-DMPE FRET 방출의 검출을 입증한다. 추가로, 단계 3에서 사용된 대조군 분자에 존재하는 화학형에 대한 10K 구성원 "표적화된 라이브러리"의 디자인은 10K 구성원 표적화된 라이브러리의 구조적 및 화학적 다양성을 최대화하기 위해 화학정보학 도구를 이용함으로써 입증될 것이다. 라이브러리를 구축하는 데 사용된 초기 합성 방법을 시험할 것이고 이 방법의 화학적 생성물을 LC/MS 분석으로 검증할 것이다. 마지막으로, BEL로부터의 라이브러리 구성원의 방출을 입증하기 위해 "표적화된 라이브러리"에 대해 UV 절단을 수행할 것이고, 절단 정도를 LC/MS 분석으로 정량할 것이다.
이정표: 자극 방법 및 타이밍은 적격 Z' ≥ 0.4 beten +/- 억제제 세포 집단을 충족해야 한다. 이것은 단계 3 내에서 화합물 전달, 투여 및 억제된 세포의 분류를 포함하는 추가 미세유체 개발을 위한 기본 요건이다. 원하는 합성 방법을 이용하여 각각의 개별 라이브러리 구성원에 대해 >30%의 수율로 "표적화된 라이브러리"를 구축할 것이고, 상기 라이브러리는 UV 절단 방법을 이용하여 비드로부터 절단되는 능력을 입증해야 한다.
단계 3: 대조군을 이용한 POC 스크린 및 10K 구성원 표적화된 라이브러리의 후속 스크린을 위한 완전한 통합 칩 디자인
요약: 대조군 억제제의 제자리 방출, 자극 전 혼합과 인큐베이션, 및 자극 후 분류를 포함하는, 액적내 세포 자극 구성을 완전한 통합 장치 내로 통합한다. 완전 통합 칩의 검증 및 자극 억제에 대한 대조군 분자의 검증 시, 원하는 이온 채널에 대해 "표적화된 라이브러리"를 스크리닝하여, "표적화된 라이브러리"의 유도에 사용된 대조군에 대한 SAR을 설명할 것이다. 5가지 농도에 걸쳐 "표적화된 라이브러리"를 스크리닝할 것이다. NGS 분석을 자동화하고, "활성" 구조를 해독하고, 효능별로 활성 구성원의 순위를 정하고, SAR에 대한 통찰력을 제공하기 위해 분석 도구를 생성할 것이다. EC50을 검증하기 위해 's 표준 어세이를 이용하여 분석 및 프로파일링을 위한 가장 강력한 후보 분자를 재합성하기 위해 검증 작업흐름을 확립할 것이다.
이정표: 양성 대조군 억제제 비드를 샘플링할 것이고, 6가지 농도에 걸쳐 용량-반응을 측정할 것이다. 데이터는 공지된 EC50의 3배 이내에 있어야 하는 상대적 EC50을 시스템 내에서 측정하는 데 사용될 것이다. <10% 거짓 분류 사건으로 음성 대조군으로부터 양성 대조군 비드를 단리할 수 있는 분류도 입증될 것이다. "표적화된 라이브러리" 스크린으로부터의 출력은 상기 스크린으로부터의 미처리 데이터 출력의 최대 10 시각화일 것이다.
방법 및 프로젝트 디자인:
정의:
프로브 = 달리 언급되어 있지 않은 한, CC2-DMPE와 함께 DiSBAC6 또는 유사체.
독소 = 베라트리딘, OD-1 또는 다른 자극 분자.
모델 세포주 = 달리 언급되어 있지 않은 한, HEK293(인간 배아 신장 세포).
억제제 = 시스템 시험을 위해 제공된 대조군 화합물.
ChR = 채널로돕신, 또는 조정된 광학 성질을 가진 변이체.
형광 핵 염료 = DAPI, DRAQ5, PicoGreen 등.
IC 칩 = 액적에서 나트륨 이온 채널의 자극을 시작하는 이온 채널 칩.
ICES = 액적내 세포의 전기 자극을 위해 디자인된 이온 채널 칩.
ICTS = 액적내 세포의 독소 자극을 위해 디자인된 이온 채널 칩.
ICOS = 액적내 세포의 광유전학적 자극을 위해 디자인된 이온 채널 칩.
단계 1: 이온 채널 억제에 대한 액적 세포 어세이의 검출
1A) 관련 이온 채널을 발현하는 모델 세포주를 사용할 것이고, 모든 시약을 검증하고 프로브 방출에 의한 독소 자극의 동역학적 활성을 이해하기 위해 간단한 기본 대조군 세트를 확립할 것이다.
1) 프로브와 함께 모델 세포주를 사용하는 웰 플레이트 대조군 어세이, 독소 자극을 사용한 +/- 억제제 대조군.
2) 형광 현미경관찰은 세포주 균일성, 및 프로브 방출에 대한 정상 상태 거동을 확인할 것이다, +/- 억제제.
3) 독소 동역학, 정상 상태 및 EC50을 이해하기 위해 수집된, 플레이트 내의 대량 집단의 FRET 방출 프로파일, +/- 억제제.
1B) 간단한 미세유체 액적 생성기는 플루오르 표지(핵 염료, 플루오르-항-이온 채널) 또는 프로브와 함께 모델 세포를 도입하여 유동하는 액적 내에서 세포 검출을 시험하는 데 사용될 것이다.
1) 플루오르-항-이온 채널 또는 유사한 표지는 프로브 침출 또는 광표백이라는 변수 없이, 광안정성 형광단을 사용하여 유동에서 세포 발현 균일성을 확인하고 광학 검출을 조정하여 시스템에 대한 광학 민감성을 측정하는 데 이상적일 것이다.
2) 그 후, 액적에서의 막 결합된 프로브 방출(CC2-DMPE) 검출은 유동 채널 내의 액적에서 프로브 방출을 관찰하는 데 필요한 민감성을 완성할 것이다.
3) 살아있거나 죽은 형광생성 염료를 사용하여, 액적 내부에서 모델 세포주 생체적합성 및 독성 측정.
1C) 액적 형성 직전에 세포+프로브(+/- 억제제)를 자극 독소와 병합한 후, 설정된 시점에서 세포로부터 프로브 방출을 포착하기 위해 ICTS Chip(v1.0)을 개발한다.
1) 여기 및 검출의 공간적 위치 이외에 유속은 어세이 관찰을 위한 자극 후 시간 지연을 좌우한다.
2) 독소 자극은 탈분극 펄스에 이어 지속적인 꼬리 전류를 생성한다. 검출 위치는 이 곡선 상에서 특정 점을 단리할 수 있고 +/- 억제제 세포 집단을 식별하기 위한 최상의 위치를 결정할 수 있다.
3) 세포 +/- 억제제에 대한 프로브 방출 프로파일을 비교할 것이고, 독소 자극 후 다양한 시점에서 통계적 신뢰도(Z'-점수)를 측정할 것이다.
1D) 광유전학적 자극을 입증하기 위한 채널로돕신 발현 세포주 생성.
1) 전기 자극(또는 sced from)을 위한 HEK 세포주에서의 이온 채널 발현.
2) 광학 자극을 위한 모델 세포주에서의 이온 채널 + ChR(ChrimsonR 또는 다른 변이체, DOI: 10.1038/nmeth.2836) 발현.
1E) 전기생리학 마이크로플레이트 내의 세포 자극 대조군, +/- 억제제.
1) 세포주 품질에 대한 대조군으로서 형광생성 프로브(DiSBAC6 + CC2-DMPE)로부터의 방출을 관찰하는, 이온 채널 발현 세포주를 사용하는 웰 플레이트에서의 전극 자극.
2) 전류를 검출하기 위해 이온 채널 + ChR을 사용하는 전극 웰 플레이트에서의 광학 자극.
A) 500 mJ/s/cm2에서 660 nm 광을 사용하여 10 Hz에서 ChrimsonR 자극으로부터 >99% 스파이크 발생을 요구한다.
3) 프로브 방출 반응을 검출하기 위해 이온 채널 + ChR + 프로브를 사용하는 웰 플레이트에서의 광학 자극.
단계 2: 이온 채널에 대한 10K 구성원 "표적화된 라이브러리"의 시공간적 제어와 디자인 및 구축을 이용한 액적 세포 어세이의 자극
2A) 비드(양성 대조군 비드)에의 대조군 억제제의 광절단 가능한 공유부착.
1) 광절단 가능한 링커에 부착시키기 위한 반응성 핸들을 함유하기 위해 협력하고 대조군 억제제를 제공한다.
a) 유리 1차 또는 2차 아민, 카르복실산, 말단 아미드 또는 페놀이 이상적으로 적합하다.
2) 광불안정성 화합물 결합을 검증하기 위한 전체 생성물 절단 및 LC-MS.
3) UV 방출 후 활성을 검증하기 위한 웰 플레이트에서의 억제제 광절단.
2B) PMT 또는 이미지화로 프로브 방출을 모니터링하는, 액적내 세포 자극을 위한 IC 칩의 디자인 및 제작. 이 단계는 단계 3을 위한 가장 실행 가능한 후보를 입증하기 위해 다수의 전략을 이용하는 상당한 조작 노력이다.
1) ICES - 기하구조에 의해 좌우되는 자극의 주파수(10 Hz)와 함께, 두 가지 접근법을 이용하여 액적에서의 전기 자극을 조사할 것이다.
A) 전기장 또는 유전영동력을 생성하기 위한 비접촉 전극.
2) ICTS - 피코주입, 액적 융합 또는 미리 주입된 구성을 이용하여 액적에서의 독소 자극을 조사할 것이고, 이것은 자극 독소가 단계 3에서 화합물 투여 후 액적 내로 주입될 수 있게 한다.
3) ICOS - 기하구조에 의해 정의된 주파수(10 Hz)에서 UV, VIS 또는 NIR 파장으로 세포를 조명하는 내장된 광섬유 도파관을 이용하여 액적에서의 광학 자극을 조사할 것이다.
2C) 세포 집단 +/- 억제제 사이의 명확한 구별을 보여주는 IC 칩 입증. 전략 개요에 대해서는 도 8을 참조한다.
1) 10 Hz 자극 펄스를 위해 ICES 및 ICOS 칩을 디자인할 것이고, 자극 후 공간적으로 제어된 시간 지연에서 프로브 방출을 모니터링하여, 상이한 시점에서 +/- 억제제 세포 집단 사이에 어세이 Z'-점수를 평가할 것이다.
A) 억제제 적정(5점) 및 검출은 대략적인 효능을 's 표준 어세이와 비교하기 위해 종점 용량-반응 프로파일을 생성할 것이다.
2) 단계 1C-2에서 확인된 자극 독소 주입 후 시간 간격을 이용하여 ICTS 칩 디자인을 시험하여, 용량 반응에서 +/- 억제제 세포 집단 사이에 어세이 Z'-점수를 평가함으로써, 효능을 's 표준 어세이와 비교할 것이다.
A) 억제제 적정(5점) 및 검출은 대략적인 효능을 's 표준 어세이와 비교하기 위해 종점 용량-반응 프로파일을 생성할 것이다.
2D) 10K 구성원 "표적화된 라이브러리"의 디자인, 및 상기 라이브러리의 구축에 이용된 합성 방법의 검증.
1) 라이브러리의 디자인은 공지된 활성의 대조군 화합물의 화학 구조를 변경하기 위해 원하는 대로 화학반응을 이용할 것이다. 상기 라이브러리는 개별 라이브러리 구성원의 구조-활성 관계(SAR)의 보간을 최대화하도록 디자인될 것이다.
2) 라이브러리를 구축하는 데 이용되는 합성 방법은 라이브러리를 구축하는 데 사용되는 "구축 블록" 부류를 대표하는 "구축 블록"을 사용함으로써 검증될 것이다. 개별 구축 블록을 사용한 반응의 수율을 LC/MS로 정량하여 개별 구축 블록의 반응성을 검증할 것이다.
3) "표적화된 라이브러리"로부터의 개별 비드에 대한 광절단을 수행하여 라이브러리 구성원이 라이브러리의 비드로부터 절단되는지를 입증할 것이다.
단계 3: 대조군을 사용하는 POC 스크린 및 10K 구성원 "표적화된 라이브러리"의 후속 스크린을 위한 완전한 통합 칩 디자인
3A) 적격 Z' 점수를 가진 후보 IC 칩 디자인을 완전한 통합 시스템에 혼입할 것이다.
1) 억제제 비드 전달, 화합물 투여, 인큐베이션, 액적내 세포 자극, 어세이 검출 및 액적 분류를 위해 디자인되고 제작되고 조정된 ICxx 칩 2.0.
2) 통합 시스템 내에서 Z'-점수를 최적화하기 위해 고농도의 억제제를 방출하는, 양성 대조군 비드를 사용하는 IC 칩 2.0 장치의 POC.
3) <10% 거짓 분류 사건(억제제 비드 및 세포를 함유하지 않는 액적)으로 액적 분류에 의해 음성 비드 대조군으로부터 억제제 비드 단리의 입증.
3B) 예측 화합물 투여를 가능하게 하기 위한 화합물 방출 트리오-보정 곡선.
1) 액적에서 형광단 농도 대 PMT 검출 보정.
2) UV 노출 대 액적에서의 PMT 검출 보정에 의한 비드로부터의 형광단 방출.
3) UV 노출 대 보정 염료 방출 보정.
3C) 대조군 억제제에 대한 EC50의 용량-반응 및 근사치를 보여주기 위해 세포 집단 분석을 이용하는 대조군 비드 적정
1) 4Ln(즉, 10 μM, 3 μM, 1 μM, 300 nM, <100 nM)에 걸쳐 비드 방출된 억제제 적정 및 어세이 검출.
2) IC 칩에서 비드 방출된 화합물의 추정된 IC50은 동일한 모델 세포주와 함께 표준 플레이트 방법을 이용함으로써 확인된 IC50으로부터 3배 미만일 필요가 있다.
3D) 단계 2의 디자인된 라이브러리를 사용하는, 이온 채널에 대한 "표적화된 라이브러리" 스크린.
1) 7개의 라이브러리 등가물을 사용하여, 3C에 사용된 비드 상의 "스파이크-인(spiked-in)" 양성 대조군 화합물을 가진 이온 채널에 대해 "표적화된" 라이브러리를 스크리닝할 것이다.
2) 데이터는 화학정보학 도구에 의해 분석될 것이고 스크린이 수행된 후 1개월 이내에 스크린의 종결 시에 제시될 것이다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되어 있지만, 이러한 실시양태가 단지 예로써 제공된다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 당분야에서 숙련된 자는 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 많은 변이, 변화 및 치환을 비로소 인식할 것이다. 본원에 기재된 본 개시내용의 실시양태의 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는 데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이 청구범위 및 이의 등가물의 범위 내의 방법과 구조는 이에 의해 커버된다.

Claims (20)

  1. 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 적어도 하나의 세포 및 스캐폴드를 캡슐화물(encapsulation) 내에 제공하는 단계로서, 스캐폴드는 광절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있는 인코딩된 이펙터, 및 이펙터를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계;
    (b) 광절단 가능한 링커를 절단하여, 인코딩된 이펙터를 스캐폴드로부터 방출시키는 단계; 및
    (c) 인코딩된 이펙터와 적어도 하나의 세포 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 액적으로부터 검출하는 단계
    를 포함하는, 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 액적 내로 방출시키는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 광절단 가능한 링커는 전자기 복사를 이용하여 절단되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 광절단 가능한 링커를 절단하는 단계는 캡슐화물을 광원으로부터의 광에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 광의 광 강도가 약 0.01 J/cm2 내지 약 200 J/cm2인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 세포를 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 인코딩된 이펙터로부터 광절단 가능한 링커가 절단될 수 있도록, 활성화 시약을 제공하여 광절단 가능한 링커를 활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 시스템으로서,
    (a) 하나 이상의 세포;
    (b) 스캐폴드로서, 인코딩된 이펙터가 절단 가능한 링커에 의해 스캐폴드에 결합되어 있고, 이펙터를 인코딩하는 핵산이 스캐폴드에 결합되어 있는 것인 스캐폴드; 및
    (c) 미세유체 장치로서,
    (i) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 수취하고;
    (ii) 하나 이상의 세포 및 스캐폴드를 캡슐화물 내에 캡슐화하며;
    (iii) 인코딩된 이펙터로부터 절단 가능한 링커를 절단하여, 캡슐화물 내에서 소정의 양의 인코딩된 이펙터를 방출시키고;
    (iv) 인코딩된 이펙터를 하나 이상의 세포와 일정 시간 동안 인큐베이션하며;
    (v) 인코딩된 이펙터와 하나 이상의 세포 사이의 상호작용으로부터 비롯된 신호를 캡슐화물로부터 검출하고;
    (vi) 신호의 검출을 기반으로 캡슐화물을 분류하도록
    구성된 미세유체 장치
    를 포함하는, 인코딩된 이펙터를 스크리닝하는 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 절단 가능한 링커는 광절단 가능한 링커인 시스템.
  10. 제8항에 있어서, 미세유체 장치는 캡슐화물을 분류하기 위한 제1 수집 튜브 및 제2 수집 튜브를 추가로 포함하고, 여기서 캡슐화물은 1) 신호가 소정의 역치 이상인 경우 제1 수집 튜브에, 또는 2) 신호가 소정의 역치 미만인 경우 제2 수집 튜브에 놓이는 것인 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 전기장 구배, 소리, 다이어프램(diaphragm), 미세유체 채널의 기하구조 변형, 또는 미세유체 장치의 미세유체 채널의 압력 변화를 통해 캡슐화물을 제1 또는 제2 수집 튜브로 이동시키기 위해 파형 펄스 발생기를 추가로 포함하는 시스템.
  12. 제10항에 있어서, 액적의 일련의 이미지를 기록함으로써 측정된 하나 이상의 세포의 형태학적 변화를 검출하는 것, 또는 분자 비콘 또는 프로브에 의해 방출된 형광을 검출하는 것을 기반으로 신호가 검출되는 것인 시스템.
  13. 제8항에 있어서, 일정 시간은, 캡슐화물이 미세유체 장치의 미세유체 채널을 통해 이동할 때 체류 시간에 의해 제어되는 것인 시스템.
  14. 프라이머를 증폭하여 세포 핵산 포획을 최대화하는 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 세포, 증폭 혼합물 및 닉킹 효소(nicking enzyme)와 함께 핵산 인코딩된 스캐폴드를 포함하는 캡슐화물을 제공하는 단계로서, 핵산 인코딩물(nucleic acid encoding)이 핵산 인코딩된 스캐폴드에 결합되어 있는 것인 단계;
    (b) 하나 이상의 세포를 용해시켜 하나 이상의 세포 핵산을 방출시키는 단계;
    (c) 핵산 인코딩물을 닉킹 효소로 닉킹함으로써, 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 단계;
    (d) 닉킹 부위 및 증폭 혼합물을 통해, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계; 및
    (e) 방출된 세포 핵산을 인코딩된 핵산 프라이머로 라벨링하는 단계
    를 포함하는, 프라이머를 증폭하여 세포 핵산 포획을 최대화하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 특정 부위가 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계는 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 닉킹하여 또 다른 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 인코딩된 핵산 프라이머를 증폭하는 단계는 1) 닉킹 부위로부터 연장되는 핵산 인코딩물의 카피를 생성하는 것, 및 2) 핵산 인코딩물 카피를 대체하여 또 다른 인코딩된 핵산 프라이머를 생성하는 것을 동시에 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 증폭 혼합물은, 핵산 인코딩물의 카피가 증폭 효소에 의해 동시에 생성 및 대체될 수 있도록, 증폭 효소를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 증폭 효소는 중합효소를 포함하는 것인 방법.
  20. 제14항에 있어서, 각각의 핵산 인코딩물은, 방출된 세포 핵산을 라벨링하기 위해, 표적 세포 코딩물(coding) 또는 표적 세포 핵산을 규정하는 포획 부위를 포함하는 것인 방법.
KR1020227015246A 2019-10-10 2020-10-09 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템 KR20220097404A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962913624P 2019-10-10 2019-10-10
US62/913,624 2019-10-10
US201962954348P 2019-12-27 2019-12-27
US62/954,348 2019-12-27
PCT/US2020/055127 WO2021072306A1 (en) 2019-10-10 2020-10-09 Methods and systems for microfluidic screening

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220097404A true KR20220097404A (ko) 2022-07-07

Family

ID=75382436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227015246A KR20220097404A (ko) 2019-10-10 2020-10-09 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템

Country Status (10)

Country Link
US (14) US11919000B2 (ko)
EP (1) EP4041310A4 (ko)
JP (1) JP2022552194A (ko)
KR (1) KR20220097404A (ko)
CN (1) CN114829626A (ko)
AU (1) AU2020361681A1 (ko)
CA (1) CA3157359A1 (ko)
GB (1) GB2604481A (ko)
IL (1) IL292055A (ko)
WO (1) WO2021072306A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3082440B1 (fr) * 2018-06-14 2020-12-11 Paris Sciences Lettres Quartier Latin Methode de transfert de matiere dans un dispositif microfluidique ou millifluidique
KR20220097404A (ko) 2019-10-10 2022-07-07 1859, 인크. 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템
KR20230062808A (ko) * 2020-07-08 2023-05-09 루마사이트 엘엘씨 샘플링 디바이스 및 시스템
US11521947B1 (en) * 2021-07-14 2022-12-06 Nxp Usa, Inc. Space efficient flip chip joint design
WO2023086794A1 (en) * 2021-11-10 2023-05-19 University Of Washington Systems and methods for digital affinity-based detection assays
WO2024091930A1 (en) * 2022-10-24 2024-05-02 1859, Inc. Miniaturized methods and systems for sample screening
WO2024091949A1 (en) * 2022-10-24 2024-05-02 1859, Inc. Methods and systems for encoded effector screening
WO2024097863A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 1859, Inc. Methods and systems for in-silico and empirical screening

Family Cites Families (290)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
GB9511556D0 (en) 1995-06-07 1995-08-02 Triplex Safety Glass Co Apparatus for and method of bending glass sheets
DE69828287T2 (de) 1997-06-13 2005-12-15 Gryphon Therapeutics, Inc., South San Francisco Festphasige native chemische ligation von ungeschützten oder n-cystein-geschützten peptiden in wässrigen lösungen
US7497994B2 (en) 1998-02-24 2009-03-03 Khushroo Gandhi Microfluidic devices and systems incorporating cover layers
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
EP1190229B1 (en) 1998-05-22 2011-10-26 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
US6540896B1 (en) 1998-08-05 2003-04-01 Caliper Technologies Corp. Open-Field serial to parallel converter
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
WO2000050642A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Caliper Technologies Corp. Sequencing by incorporation
US6148508A (en) 1999-03-12 2000-11-21 Caliper Technologies Corp. Method of making a capillary for electrokinetic transport of materials
US6592821B1 (en) 1999-05-17 2003-07-15 Caliper Technologies Corp. Focusing of microparticles in microfluidic systems
US6506609B1 (en) 1999-05-17 2003-01-14 Caliper Technologies Corp. Focusing of microparticles in microfluidic systems
DK1065378T3 (da) 1999-06-28 2002-07-29 California Inst Of Techn Elastomere mikropumpe- og mikroventilsystemer
US7144616B1 (en) 1999-06-28 2006-12-05 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US7052545B2 (en) 2001-04-06 2006-05-30 California Institute Of Technology High throughput screening of crystallization of materials
US6929030B2 (en) 1999-06-28 2005-08-16 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
WO2001017797A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Caliper Technologies Corp. Microfabrication methods and devices
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6468763B1 (en) 1999-09-29 2002-10-22 Caliper Technologies Corp. Optical detection of transmembrane potential changes
WO2001027253A1 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Caliper Technologies Corp. Use of nernstein voltage sensitive dyes in measuring transmembrane voltage
US6468761B2 (en) 2000-01-07 2002-10-22 Caliper Technologies, Corp. Microfluidic in-line labeling method for continuous-flow protease inhibition analysis
US6589729B2 (en) 2000-02-04 2003-07-08 Caliper Technologies Corp. Methods, devices, and systems for monitoring time dependent reactions
AU2001249071B2 (en) 2000-02-23 2005-09-08 Caliper Life Sciences, Inc. Multi-reservoir pressure control system
US6777184B2 (en) 2000-05-12 2004-08-17 Caliper Life Sciences, Inc. Detection of nucleic acid hybridization by fluorescence polarization
US6635487B1 (en) 2000-05-17 2003-10-21 Caliper Technologies Corp. Fluorescence standard for use in microfluidic instruments
WO2001097974A1 (en) 2000-06-19 2001-12-27 Caliper Technologies Corp. Methods and devices for enhancing bonded substrate yields and regulating temperature
US6603546B1 (en) 2000-07-21 2003-08-05 I.S.S. (Usa) Inc. Rapid high throughput spectrometer and method
WO2002011887A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Caliper Technologies Corp. Methods and devices for high throughput fluid delivery
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
EP1334347A1 (en) 2000-09-15 2003-08-13 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
US6681788B2 (en) 2001-01-29 2004-01-27 Caliper Technologies Corp. Non-mechanical valves for fluidic systems
US7670559B2 (en) 2001-02-15 2010-03-02 Caliper Life Sciences, Inc. Microfluidic systems with enhanced detection systems
US6720148B1 (en) 2001-02-22 2004-04-13 Caliper Life Sciences, Inc. Methods and systems for identifying nucleotides by primer extension
US20030027225A1 (en) 2001-07-13 2003-02-06 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and systems for separating components of a mixture
US7023007B2 (en) 2001-07-17 2006-04-04 Caliper Life Sciences, Inc. Methods and systems for alignment of detection optics
US7247274B1 (en) 2001-11-13 2007-07-24 Caliper Technologies Corp. Prevention of precipitate blockage in microfluidic channels
US7069952B1 (en) 2001-11-14 2006-07-04 Caliper Life Sciences, Inc. Microfluidic devices and methods of their manufacture
US7910549B2 (en) 2001-12-13 2011-03-22 Institute Of Virology Of The Slovak Academy Of Sciences MN gene and protein
US7303727B1 (en) 2002-03-06 2007-12-04 Caliper Life Sciences, Inc Microfluidic sample delivery devices, systems, and methods
US7195986B1 (en) 2002-03-08 2007-03-27 Caliper Life Sciences, Inc. Microfluidic device with controlled substrate conductivity
US7252928B1 (en) 2002-03-12 2007-08-07 Caliper Life Sciences, Inc. Methods for prevention of surface adsorption of biological materials to capillary walls in microchannels
US20040026684A1 (en) 2002-04-02 2004-02-12 Nanosys, Inc. Nanowire heterostructures for encoding information
EP2278338B1 (en) 2002-05-09 2020-08-26 The University of Chicago Device and method for pressure-driven plug transport and reaction
US7901939B2 (en) 2002-05-09 2011-03-08 University Of Chicago Method for performing crystallization and reactions in pressure-driven fluid plugs
US7161356B1 (en) 2002-06-05 2007-01-09 Caliper Life Sciences, Inc. Voltage/current testing equipment for microfluidic devices
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
EP1546412B1 (en) 2002-10-02 2014-05-21 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
ES2640279T3 (es) 2002-10-30 2017-11-02 Nuevolution A/S Procedimiento para la síntesis de un complejo bifuncional
ATE459725T1 (de) 2002-11-18 2010-03-15 Panomics Inc Caged-sensoren, -regulatoren und-verbindungen sowie verwendungen davon
US20060073484A1 (en) 2002-12-30 2006-04-06 Mathies Richard A Methods and apparatus for pathogen detection and analysis
EP1590477B1 (en) 2003-01-29 2009-07-29 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
DK2236606T3 (da) 2003-03-20 2014-02-10 Nuevolution As Kodning af små molekyler ved ligering
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US7745116B2 (en) 2003-04-08 2010-06-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
EP3616781A1 (en) 2003-04-10 2020-03-04 President and Fellows of Harvard College Formation and control of fluidic species
US7055695B2 (en) 2003-06-02 2006-06-06 Caliper Life Sciencee, Inc. Container providing a controlled hydrated environment
US8048627B2 (en) 2003-07-05 2011-11-01 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
CN1842368B (zh) 2003-08-27 2014-05-28 哈佛大学 流体物种的电子控制
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
AU2005246404A1 (en) 2004-05-21 2005-12-01 Caliper Life Sciences, Inc. Automated system for handling microfluidic devices
US9477233B2 (en) 2004-07-02 2016-10-25 The University Of Chicago Microfluidic system with a plurality of sequential T-junctions for performing reactions in microdroplets
US7655470B2 (en) 2004-10-29 2010-02-02 University Of Chicago Method for manipulating a plurality of plugs and performing reactions therein in microfluidic systems
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
US7276720B2 (en) 2004-07-19 2007-10-02 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
US20060024678A1 (en) 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
CN101914620B (zh) 2004-09-17 2014-02-12 加利福尼亚太平洋生命科学公司 核酸测序的方法
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
CA2588122A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Helicos Biosciences Corporation Tirf single molecule analysis and method of sequencing nucleic acids
JP4601423B2 (ja) 2004-12-28 2010-12-22 独立行政法人科学技術振興機構 細胞計測および分離チップ
US7462468B1 (en) 2005-01-28 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. DNA intercalating agents and methods of use
AU2006211150A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Use of reversible extension terminator in nucleic acid sequencing
US20060286566A1 (en) 2005-02-03 2006-12-21 Helicos Biosciences Corporation Detecting apparent mutations in nucleic acid sequences
EP2453223B1 (en) 2005-04-12 2019-07-03 Caliper Life Sciences Inc. Optical detection system for a microfluidic device and method for aligning and focusing an optical detection system
CN1881457A (zh) 2005-06-14 2006-12-20 松下电器产业株式会社 致动器控制方法和使用该方法的盘装置
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US7727371B2 (en) 2005-10-07 2010-06-01 Caliper Life Sciences, Inc. Electrode apparatus for use with a microfluidic device
SI2341140T1 (sl) 2005-12-01 2017-12-29 Nuevolution A/S Postopki encimskega kodiranja za učinkovito sintezo velikih knjižnic
CA2636855C (en) 2006-01-11 2016-09-27 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
US7544473B2 (en) 2006-01-23 2009-06-09 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US20080269476A1 (en) 2006-04-26 2008-10-30 Helicos Biosciences Corporation Molecules and methods for nucleic acid sequencing
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP3031918B1 (en) 2006-05-11 2018-03-14 Raindance Technologies Inc. Microfluidic devices
US8685344B2 (en) 2007-01-22 2014-04-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Surface assisted fluid loading and droplet dispensing
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US8208146B2 (en) 2007-03-13 2012-06-26 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices, configurations, and methods for improving absorbance detection
US7767805B2 (en) 2007-05-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for sequencing a nucleic acid
CA2689626C (en) 2007-06-06 2016-10-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods
WO2009048673A2 (en) 2007-07-26 2009-04-16 University Of Chicago Stochastic confinement to detect, manipulate, and utilize molecules and organisms
CA2693979A1 (en) 2007-07-26 2009-02-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Molecular redundant sequencing
US7507539B2 (en) 2007-07-30 2009-03-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Substractive single label comparative hybridization
WO2009021233A2 (en) 2007-08-09 2009-02-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Pcb droplet actuator fabrication
WO2009032863A2 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator with improved top substrate
US9267918B2 (en) 2007-10-16 2016-02-23 Cambridge Enterprise Limited Microfluidic systems
EP2232535A4 (en) 2007-12-10 2016-04-13 Advanced Liquid Logic Inc DROPLET ACTUATOR CONFIGURATIONS AND METHODS
CN101946010B (zh) 2007-12-21 2014-08-20 哈佛大学 用于核酸测序的系统和方法
WO2009117167A1 (en) 2008-01-02 2009-09-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
JP5737707B2 (ja) 2008-03-04 2015-06-17 クリスタル バイオサイエンス インク．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． ゲル状マイクロドロップ組成物およびその使用方法
US8802027B2 (en) 2008-03-28 2014-08-12 President And Fellows Of Harvard College Surfaces, including microfluidic channels, with controlled wetting properties
AU2009231585B2 (en) 2008-04-04 2014-08-14 Novozymes A/S Method of enhancing enzyme activity
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
CN105344389B (zh) 2008-05-16 2018-01-02 哈佛大学 微流体系统、方法和装置
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
US20100018584A1 (en) 2008-07-28 2010-01-28 Technion Research & Development Foundation Ltd. Microfluidic system and method for manufacturing the same
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
WO2010042744A1 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Universite De Strasbourg Microfluidic devices for reliable on-chip incubation of droplets in delay lines
US9134221B2 (en) 2009-03-10 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Fluidic flow cytometry devices and particle sensing based on signal-encoding
WO2010104597A2 (en) 2009-03-13 2010-09-16 President And Fellows Of Harvard College Scale-up of microfluidic devices
EP2409133A1 (en) 2009-03-20 2012-01-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Serial-line-scan-encoded multi-color fluorescence microscopy and imaging flow cytometry
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
US8034629B2 (en) 2009-06-26 2011-10-11 Massachusetts Institute Of Technology High precision scanning of encoded hydrogel microparticles
US9757698B2 (en) 2009-06-26 2017-09-12 President And Fellows Of Harvard College Fluid injection
US8926065B2 (en) 2009-08-14 2015-01-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods
US8610085B2 (en) 2009-08-20 2013-12-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. High-speed cellular cross sectional imaging
CN102574078B (zh) 2009-09-02 2016-05-18 哈佛学院院长等 使用喷射和其它技术产生的多重乳液
EP3461558B1 (en) 2009-10-27 2021-03-17 President and Fellows of Harvard College Droplet creation techniques
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US9068916B2 (en) 2010-03-15 2015-06-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microassembled imaging flow cytometer
EP2550528B1 (en) 2010-03-25 2019-09-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
US20110312744A1 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Geneasys Pty Ltd Microfluidic device for amplifying mitochondrial dna in a biological sample
WO2012012090A2 (en) 2010-06-30 2012-01-26 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator assemblies and methods of making same
US8907312B2 (en) 2010-08-20 2014-12-09 Bio-Rad Laboratories, Inc. Cytometry system with solid numerical-aperture-increasing lens
GB2482911A (en) 2010-08-20 2012-02-22 Sphere Fluidics Ltd Microdroplet emulsion system
JP5922139B2 (ja) 2010-11-01 2016-05-24 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド エマルジョンを形成するためのシステム
US10457935B2 (en) 2010-11-12 2019-10-29 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
EP2673614B1 (en) 2011-02-11 2018-08-01 Raindance Technologies, Inc. Method for forming mixed droplets
US9150852B2 (en) 2011-02-18 2015-10-06 Raindance Technologies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US8761486B2 (en) 2011-02-22 2014-06-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Line scan cytometry systems and methods
US20140212503A1 (en) 2011-03-17 2014-07-31 Hyukjin Lee Delivery system
CN103765068B (zh) 2011-03-30 2016-09-07 努拜欧有限公司 将多个体积注入或注出液滴
JP5986623B2 (ja) 2011-03-31 2016-09-06 ヌビオ，インコーポレイテッド スケーラブルなスペクトル検出および計測
US9816931B2 (en) 2011-03-31 2017-11-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Managing variation in spectroscopic intensity measurements through the use of a reference component
US8692998B2 (en) 2011-04-11 2014-04-08 The Regents Of The University Of California Apparatus and method for light emission detection for in-depth imaging of turbid media
EP2702175B1 (en) 2011-04-25 2018-08-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
EP2714970B1 (en) 2011-06-02 2017-04-19 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
EP2737089B1 (en) 2011-07-29 2017-09-06 Bio-rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
US9149906B2 (en) * 2011-09-07 2015-10-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Apparatus for CMP pad conditioning
GB201115895D0 (en) 2011-09-14 2011-10-26 Embl Microfluidic device
CN106423314B (zh) 2011-09-28 2021-03-02 哈佛学院院长等 用于液滴产生和/或流体操纵的系统和方法
US9829451B2 (en) 2011-10-09 2017-11-28 Simon Fraser University Microfluidic reconfiguration device for multi-plexed sample analysis
WO2013101783A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for performing nucleic acid amplification reactions
US9701959B2 (en) 2012-02-02 2017-07-11 Invenra Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
US9475013B2 (en) 2012-02-08 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Droplet formation using fluid breakup
WO2013126741A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
GB2504240B (en) 2012-02-27 2015-05-27 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting of nucleic acids
WO2013134261A1 (en) 2012-03-05 2013-09-12 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for epigenetic sequencing
NO2694769T3 (ko) 2012-03-06 2018-03-03
US8859969B2 (en) 2012-03-27 2014-10-14 Innovative Science Tools, Inc. Optical analyzer for identification of materials using reflectance spectroscopy
JP6196661B2 (ja) 2012-04-20 2017-09-13 スリップチップ， エルエルシー サンプル調製または自律分析のための流体デバイスおよびシステム
EP2859324B1 (en) 2012-06-07 2019-08-07 Bio-rad Laboratories, Inc. Automated and accurate drop delay for flow cytometry
US9223317B2 (en) 2012-06-14 2015-12-29 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuators that include molecular barrier coatings
WO2013188770A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow rate balanced, dynamically adjustable sheath delivery system for flow cytometry
WO2014004278A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 The Curators Of The University Of Missouri Photocleavable drug conjugates
IN2015DN00359A (ko) 2012-06-27 2015-06-12 Advanced Liquid Logic Inc
GB2519906B (en) 2012-08-13 2017-02-08 Univ California Methods for detecting target nucleic acids in sample lysate droplets
US20140155295A1 (en) 2012-08-14 2014-06-05 10X Technologies, Inc. Capsule array devices and methods of use
US20150005199A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
FR2998899B1 (fr) 2012-11-30 2015-07-17 Commissariat Energie Atomique Methode de criblage a haut-debit pour l'identification de biomarqueurs, cibles therapeutiques ou d'agents therapeutiques
CN104781386B (zh) 2012-09-12 2018-04-06 基纽拜奥股份有限公司 用于进行试验的集成微流体系统、方法和试剂盒
JP6396911B2 (ja) 2012-10-15 2018-09-26 ナノセレクト バイオメディカル， インコーポレイテッド 粒子を選別するためのシステム、装置、および、方法
US8921055B2 (en) 2012-10-30 2014-12-30 Berkeley Lights, Inc. Detecting cells secreting a protein of interest
US9403172B2 (en) 2012-11-08 2016-08-02 Berkeley Lights, Inc. Circuit based optoelectronic tweezers
US20140151229A1 (en) 2012-12-05 2014-06-05 Caliper Life Sciences, Inc. Manipulation of objects in microfluidic devices using external electrodes
WO2014093714A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for using oils for analysis and detection of molecules
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3567116A1 (en) 2012-12-14 2019-11-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN105051522B (zh) 2013-02-01 2017-10-10 伯乐生命医学产品有限公司 具有单件式光学元件的检测系统
WO2014124338A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Technologies, Inc. Polynucleotide barcode generation
EP2964390B1 (en) 2013-03-06 2018-12-26 President and Fellows of Harvard College Use of devices for forming relatively monodisperse droplets
US10105702B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Lariat Biosciences, Inc. Microfluidic methods for manipulating DNA
EP2970367B8 (en) 2013-03-15 2018-06-13 Bio-rad Laboratories, Inc. Digital assays with a generic reporter
EP2981349A4 (en) 2013-04-02 2016-11-16 Raindance Technologies Inc SYSTEMS AND METHODS FOR HANDLING MICROFLUIDIC DROPLETS
US9403294B2 (en) 2013-04-17 2016-08-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method of making a droplet-generating device
US10151429B2 (en) 2013-05-14 2018-12-11 President And Fellows Of Harvard College Rapid production of droplets
US9809851B2 (en) 2013-05-29 2017-11-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Systems and methods for sequencing in emulsion based microfluidics
CN105393094B (zh) 2013-05-29 2019-07-23 生物辐射实验室股份有限公司 低成本光学高速离散测量系统
WO2014210353A2 (en) 2013-06-27 2014-12-31 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9659508B2 (en) 2013-08-01 2017-05-23 Technion Research & Development Foundation Limited Microfluidic platform and methods for using the same
EP3033599A4 (en) 2013-08-13 2017-03-22 Advanced Liquid Logic, Inc. Methods of improving accuracy and precision of droplet metering using an on-actuator reservoir as the fluid input
JP6545682B2 (ja) 2013-08-28 2019-07-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 大規模並列単一細胞分析
EP3038834B1 (en) 2013-08-30 2018-12-12 Illumina, Inc. Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces
US9784664B2 (en) 2013-09-05 2017-10-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multidimensional hydrodynamic focusing chamber
CA2959978A1 (en) * 2013-09-24 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them
WO2015048798A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Gnubio, Inc. Microfluidic cartridge device and methods of use and assembly
WO2015065909A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 The General Hospital Corporation System and method for inertial focusing cytometer with integrated optics for particle characterization
EP3792921A1 (en) 2013-12-11 2021-03-17 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis and computation
JP6608368B2 (ja) 2013-12-30 2019-11-20 アトレカ インコーポレイテッド 核酸バーコードを用いた単一細胞と関連づけられた核酸の分析方法
EP3111215B1 (en) 2014-02-27 2019-01-09 Bio-Rad Laboratories, Inc. Lateral flow blotting assay
JP6909370B2 (ja) 2014-03-31 2021-07-28 ブリガム・アンド・ウイミンズ・ホスピタル・インコーポレイテッド バイオミメティック流体処理のためのシステム及び方法
WO2015157567A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
WO2015161223A1 (en) 2014-04-17 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and systems for droplet tagging and amplification
AU2015247416A1 (en) 2014-04-17 2016-11-03 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for droplet tagging
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
LT3456846T (lt) 2014-04-21 2022-09-12 President And Fellows Of Harvard College Nukleorūgšties unikalios sekos įvedimo sistemos ir būdai
CN106574925B (zh) 2014-05-23 2019-07-26 萤火虫生物股份有限公司 用于生物测定的底物介导的反应器
US11155809B2 (en) 2014-06-24 2021-10-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital PCR barcoding
MX2016016902A (es) 2014-06-26 2017-03-27 10X Genomics Inc Metodos para analizar acidos nucleicos de celulas individuales o poblaciones de celulas.
GB201414464D0 (en) 2014-08-14 2014-10-01 Technion Res & Dev Foundation Compositions and methods for therapeutics prescreening
EP3186191B1 (en) 2014-08-29 2020-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Epoxy mold making and micromilling for microfluidics
WO2016036536A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microscale fluidic devices and components having a fluid retention groove
EP3191605B1 (en) 2014-09-09 2022-07-27 The Broad Institute, Inc. A droplet-based method and apparatus for composite single-cell nucleic acid analysis
EP3198243B1 (en) 2014-09-30 2020-07-22 The Regents of the University of California Imaging flow cytometer using spatial-temporal transformation
CN114807307A (zh) 2014-10-29 2022-07-29 10X 基因组学有限公司 用于靶核酸测序的方法和组合物
US10215771B2 (en) 2014-11-06 2019-02-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet velocity detection
EP3831482B1 (en) 2014-12-08 2024-01-24 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic device comprising lateral/vertical transistor structures
CN110918142B (zh) 2014-12-08 2022-10-25 伯克利之光生命科技公司 微流体装置中定向流动的致动微流体结构及使用它的方法
EP3230717B1 (en) 2014-12-09 2021-08-18 Berkeley Lights, Inc. Automated detection and identification of micro-objects in microfluidic devices
CN107206377B (zh) 2014-12-09 2020-02-11 伯克利之光生命科技公司 微流体装置中测定阳性的区域的自动检测
CN107427808B (zh) 2015-01-12 2020-10-23 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
CN115011670A (zh) 2015-02-04 2022-09-06 加利福尼亚大学董事会 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序
AU2016215298A1 (en) 2015-02-04 2017-08-10 The Regents Of The University Of California Multiple-emulsion nucleic acid amplification
PL3650458T3 (pl) 2015-02-24 2023-11-06 City Of Hope Platformy do analiz przesiewowych bibliotek kodowanych chemicznie i adresowanych przestrzennie
US20180284125A1 (en) 2015-03-11 2018-10-04 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
EP3268462B1 (en) 2015-03-11 2021-08-11 The Broad Institute, Inc. Genotype and phenotype coupling
EP3268125A4 (en) 2015-03-13 2018-08-15 President and Fellows of Harvard College Determination of cells using amplification
EP3271713B1 (en) 2015-03-18 2021-05-05 The Broad Institute, Inc. Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions
US11746367B2 (en) 2015-04-17 2023-09-05 President And Fellows Of Harvard College Barcoding systems and methods for gene sequencing and other applications
WO2016172454A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic cell structure
JP6851982B2 (ja) 2015-04-30 2021-03-31 ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリーＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ マイクロ流体の液滴の検出およびソーティング
GB201509640D0 (en) 2015-06-03 2015-07-15 Sphere Fluidics Ltd Systems and methods
EP3314123B1 (en) 2015-06-23 2024-04-03 NanoCellect Biomedical, Inc. Systems, apparatuses, and methods for cell sorting and flow cytometry
US9933565B2 (en) 2015-07-17 2018-04-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Contact imaging devices for fluorescence applications
WO2017027549A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Duke University Magnetic single cell arrays for probing cell-drug and cell-cell communication
US10180385B2 (en) 2015-08-12 2019-01-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multi-spectral filter profiling and quality control for flow cytometry
CN108350488A (zh) 2015-08-17 2018-07-31 加利福尼亚大学董事会 基于微滴的多重置换扩增(mda)方法及相关组合物
WO2017034925A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital immunoassay
WO2017040966A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 SeLux Diagnostics, Inc. Systems and methods for multiplexed detection of biomarkers
GB201516447D0 (en) 2015-09-16 2015-10-28 Sphere Fluidics Ltd Microfluidic structure
US10746734B2 (en) 2015-10-07 2020-08-18 Selma Diagnostics Aps Flow system and methods for digital counting
WO2017075297A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. High-throughput dynamic reagent delivery system
US10866184B2 (en) 2015-11-06 2020-12-15 California Institute Of Technology Devices and methods for direct visual detection and readout of single nucleic acid molecules
US10874991B2 (en) 2015-11-27 2020-12-29 Queen's University At Kingston Functional filters for hydrophobic liquid/hydrophilic liquid separations
WO2017100350A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Raindance Technologies, Inc. Multiplexing in partitions using microparticles
CN112782139A (zh) 2015-12-29 2021-05-11 生物辐射实验室股份有限公司 具有光采样的光学检测系统
WO2017117462A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection and signal processing system for particle assays
US20170191127A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet partitioned pcr-based library preparation
WO2017117461A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Optical detection system for particles
US20170189908A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet assay system with automatic calibration
WO2017120531A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
WO2017123730A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Label-free characterization of particles suspended in a fluid
US10612089B2 (en) 2016-01-12 2020-04-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Synthesizing barcoding sequences utilizing phase-shift blocks and uses thereof
JP7179329B2 (ja) 2016-01-14 2022-11-29 ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー リガンド誘発型の細胞発現のマイクロ流体分析
US9757728B2 (en) 2016-01-26 2017-09-12 Lidong Qin Microfluidic aliquoting for single-cell isolation
US20190101537A1 (en) 2016-03-25 2019-04-04 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic determination of immune and other cells
KR102451535B1 (ko) 2016-03-31 2022-10-05 버클리 라잇츠, 인크. 핵산 안정화 시약, 키트들, 및 그 이용 방법들
JP2019514002A (ja) 2016-04-15 2019-05-30 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 液滴および／または他の実体の収集のためのシステムおよび方法
US10675625B2 (en) 2016-04-15 2020-06-09 Berkeley Lights, Inc Light sequencing and patterns for dielectrophoretic transport
CN115639134A (zh) 2016-06-10 2023-01-24 加利福尼亚大学董事会 基于图像的细胞分选系统和方法
WO2017218486A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Mission Bio, Inc. Methods and compositions for emulsification of solid supports in deformable beads
US20190185800A1 (en) 2016-07-21 2019-06-20 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic sequencing techniques
WO2018054975A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 The European Molecular Biology Laboratory Microfluidic sorting devices and methods
KR102650753B1 (ko) 2016-10-01 2024-03-26 버클리 라잇츠, 인크. 미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법
IL266318B2 (en) 2016-11-08 2023-10-01 Nanna Therapeutics Ltd A chemical library without coded labeling
WO2018089641A2 (en) 2016-11-10 2018-05-17 The Scripps Research Institute Encode solid phase compound library with polynucleotide based barcoding
IL267008B2 (en) 2016-12-01 2024-06-01 Berkeley Lights Inc Imaging mechanisms and systems and methods for micro objects
EP3549099A4 (en) 2016-12-01 2020-07-29 Berkeley Lights, Inc. AUTOMATED DETECTION AND REPOSITIONING OF MICROBODIES IN MICROFLUIDIC DEVICES
CN110139932B (zh) 2016-12-19 2024-05-17 生物辐射实验室股份有限公司 液滴加标的相邻性保留的标签化dna
CN110099968A (zh) 2016-12-28 2019-08-06 生物辐射实验室股份有限公司 微流体装置的表面性质修饰
US11982611B2 (en) 2017-03-20 2024-05-14 Nanocellect Biomedical, Inc. Systems, apparatuses, and methods for cell sorting and flow cytometry
US11072816B2 (en) 2017-05-03 2021-07-27 The Broad Institute, Inc. Single-cell proteomic assay using aptamers
WO2018217625A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Molecular barcoding
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2019036505A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Mission Bio, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVALUATING THE UNIFORMITY OF AN EMULSION
WO2019060900A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 California Institute Of Technology DEVICE FOR ADDITIVE REAGENT DISTRIBUTION AND ASSOCIATED METHODS AND SYSTEMS
CN111971124B (zh) 2017-09-25 2022-08-23 普莱克斯姆公司 寡核苷酸编码的化学文库
AU2018401700B2 (en) 2017-09-29 2024-05-02 The Regents Of The University Of California Method of generating monodisperse emulsions
WO2019075264A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 California Institute Of Technology ANTIBIOSENSITIVITY OF MICROORGANISMS AND COMPOSITIONS, METHODS AND ASSOCIATED SYSTEMS
WO2019084207A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Mission Bio, Inc. METHOD, SYSTEMS AND APPARATUS FOR ANALYZING AN ISOLATED CELL
WO2019099751A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
WO2019112567A1 (en) 2017-12-05 2019-06-13 The Scripps Research Institute Methods and compositions related to selecting variant proteases
EP3749452B1 (en) 2018-02-05 2022-08-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic probe head with barrier projections
WO2019169060A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 President And Fellows Of Harvard College Layered microfluidic devices and techniques
US11414699B2 (en) 2018-05-15 2022-08-16 Mantra Bio, Inc. Barcode-free single vesicle multiplexed protein and RNA analysis
WO2019232473A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Berkeley Lights, Inc. Automated detection and characterization of micro-objects in microfluidic devices
WO2019241710A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 The Scripps Research Institute Droplet ecosystem
US20220213471A1 (en) 2019-04-16 2022-07-07 Hoffmann-La Roche Inc. Small molecule screening cellular assay using modified beads
WO2020223675A1 (en) 2019-05-02 2020-11-05 The Regents Of The University Of California Laser-induced confocal microscope and microfluidic device for dielectrophoretic fluorescence-activated droplet sorting
US20220364081A1 (en) 2019-08-30 2022-11-17 Pavel CHUBUKOV Molecular library encoding system and methods
KR20220097404A (ko) 2019-10-10 2022-07-07 1859, 인크. 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템

Also Published As

Publication number Publication date
US20210106999A1 (en) 2021-04-15
US20210107002A1 (en) 2021-04-15
GB2604481A (en) 2022-09-07
US20210107003A1 (en) 2021-04-15
US20220226825A1 (en) 2022-07-21
EP4041310A1 (en) 2022-08-17
CA3157359A1 (en) 2021-04-15
WO2021072306A1 (en) 2021-04-15
US11351543B2 (en) 2022-06-07
US20210107001A1 (en) 2021-04-15
US20220297125A1 (en) 2022-09-22
EP4041310A4 (en) 2024-05-15
US20210106996A1 (en) 2021-04-15
IL292055A (en) 2022-06-01
CN114829626A (zh) 2022-07-29
US20220266250A1 (en) 2022-08-25
AU2020361681A1 (en) 2022-05-05
US20210107000A1 (en) 2021-04-15
US20220305492A1 (en) 2022-09-29
JP2022552194A (ja) 2022-12-15
US11123735B2 (en) 2021-09-21
US20210107004A1 (en) 2021-04-15
GB202206471D0 (en) 2022-06-15
US11351544B2 (en) 2022-06-07
US20220176375A1 (en) 2022-06-09
US11247209B2 (en) 2022-02-15
US11919000B2 (en) 2024-03-05
US20220176374A1 (en) 2022-06-09
US20210106998A1 (en) 2021-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220097404A (ko) 미세유체 스크리닝을 위한 방법 및 시스템
JP5241678B2 (ja) 微小流体粒子分析システム
EP3913375A1 (en) Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
CN108290158A (zh) 测定板及其用途
EP2480890B1 (en) Methods for measuring translation of target proteins in cells
CN113164952A (zh) 用于细胞的微滴检测的装置和方法
US20220106631A1 (en) Barcoding in droplets for cell-cell interaction and secreted protein detection and analysis
US20230390772A1 (en) Microfluidic determination of heterogeneous objects
WO2021117667A1 (ja) 検出方法
US20220390436A1 (en) T-cell receptor neoantigen interaction analysis via microfluidics
WO2024091930A1 (en) Miniaturized methods and systems for sample screening
WO2024091949A1 (en) Methods and systems for encoded effector screening
WO2024097863A1 (en) Methods and systems for in-silico and empirical screening
Windman et al. Microfluidics for ultrasmall-volume biological analysis
KR20230157450A (ko) 세포 선택 방법
Windman et al. University, Tempe, Arizona, USA
JP2007105007A (ja) ＳＮＰｓ判別法