JP6851982B2 - マイクロ流体の液滴の検出およびソーティング - Google Patents
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- G—PHYSICS
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- G01N15/149—
Description
(i)第一の検出可能な標識の信号を測定する工程、
(ii)第二の検出可能な標識の信号を測定する工程、および
(iii)第一の検出可能な標識の信号を用いて、第二の検出可能な標識の信号を正規化する工程、
を含み、正規化された第二の検出可能な標識の信号は、粒子と潜在的な粒子の結合パートナーとの結合の量を示す。
(a)1以上の粒子を含むマイクロ流体の液滴を、検出点を含む検出チャンネル内に供給する工程、
(b)マイクロ流体の液滴中の粒子の少なくとも垂直方向の動きを、球形であるときの同じマイクロ流体の液滴と比較して、検出チャンネル内の少なくとも検出点において抑える工程、および
(c)マイクロ流体の液滴中に含まれる少なくとも一つの粒子を、検出点において検出する工程、
を含む。
第五、六、七および/または八の態様におけるマイクロ流体デバイス、および
検出チャンネル内のマイクロ流体の液滴中に含まれる少なくとも一つの粒子を、検出点において検出する検出手段、
を含む。
好ましくは、第二の検出可能な標識の量は、既知であるか、かつ/または全ての潜在的な粒子の結合パートナーと実質的に同一である。
(i)20ないし400μm、30ないし350μm、40ないし300μm、40ないし250μm、40ないし200μm、または40ないし100μmであり、かつ、液滴中の最大の粒子(例えば、第一の粒子またはさらなる粒子)の直径の2ないし20倍、
(ii)20ないし400μm、30ないし350μm、40ないし300μm、40ないし250μm、40ないし200μm、または40ないし100μmであり、かつ、液滴中の最大の粒子(例えば、第一の粒子またはさらなる粒子)の直径の4ないし16倍、または
(iii)20ないし400μm、30ないし350μm、40ないし300μm、40ないし250μm、40ないし200μm、または40ないし100μmであり、かつ、液滴中の最大の粒子(例えば、第一の粒子またはさらなる粒子)の直径の6ないし12倍、
である。
したがって、本明細書で記述するマイクロコンパートメントはまた、「マイクロ流体の液滴」(例えば、油中水型のエマルジョン)と呼ばれる(Schaerli and Hollfelder, The potential of microfluidic water-in-oil droplets in experimental biology. Mol Biosyst (2009) vol. 5 (12) pp. 1392-404)。
用語「ウイルス」は、宿主生物の生細胞中でのみ増殖する、小さな感染病原体を指す。好ましくは、ウイルスは、病原性のウイルスであり、より好ましくは哺乳類、特にヒトにおいて病原性のウイルスであり、例えば、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、アネロウイルス科、パルボウイルス科、レオウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、フラビウイルス科、ピコルナウイルス科、トガウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科由来である。好ましくは、粒子がウイルスである場合、潜在的な粒子の結合パートナーはウイルスでない。
用語「実質的に同一の量」は、等価な量を指し、正確に同じであることを必ずしも意味しない。それは、「実質的に同一の量」を与える場合に技術的にもっともらしいことを考慮して、当業者が実質的に同一、類似または同等であると考えられ得ることによって、むしろ決定される。この場合、偏差は正常であり、範囲内で許容できる。好ましい実施態様において、偏差は、±200%、±100%、±50%、±40%、±30%、±20%、またはわずか±10%もしくは±5%までであってよく、これは好ましくは、第一の粒子などの任意の基準の粒子、少なくとも3つの粒子の集団において中央値を有する粒子(ここで、集団内の粒子の数が偶数であり、2つの粒子が中央値を与え得るような場合、集団の平均値に近い値を有する粒子が中央値として選択される)、または少なくとも2つの粒子の集団の平均値、から計算される。したがって、用語「実質的に同一の量」の代わりに、用語「実質的に類似の量」を用いてもよい。標識方法が所望の均一性、すなわち粒子の集団(例えば、少なくとも2つまたは少なくとも3つの粒子)における実質的に同一の量、を達成しない場合、所望の均一性(すなわち、標識の所望の量)を有する粒子を、標識方法によって作り出された、初期の集団から選定してもよいことが想定される(例えば、後述のソーティングの工程(d)を含む、本発明の第三の態様の方法による)。
(i)第一の検出可能な標識を特定する信号を測定する工程、
(ii)第二の検出可能な標識の信号を測定する工程、および
(iii)第二の検出可能な標識の信号を、第一の検出可能な標識の信号を用いて正規化する工程、
を含み、ここで、正規化された第二の検出可能な標識の信号は、粒子と潜在的な粒子の結合パートナーとの結合の量を表す。
全ての用語は上記で定義された意味を持ち、これらの用語に関連して定義される実施態様はまた、第二の態様の方法に適用される。
(i)第一の検出可能な標識の信号を測定する工程、
(ii)第二の検出可能な標識の信号を測定する工程、
(iii)第二の検出可能な標識の信号を、第一の検出可能な標識の信号を用いて正規化する工程、
を含み、ここで正規化された第二の検出可能な標識の信号は、粒子と粒子の結合パートナーとの結合の量を表す。
(a)1以上の粒子を含むマイクロ流体の液滴を、検出点を含む検出チャンネル内に供給する工程、
(b)マイクロ流体の液滴中の粒子の少なくとも垂直方向の動きを、球形であるときの同じマイクロ流体の液滴と比較して、検出チャンネル内、少なくとも検出点において、抑える工程、および
(c)マイクロ流体の液滴中に含まれる少なくとも一つの粒子を、検出点において検出する工程、
を含む。
ある実施態様において、マイクロ流体の液滴を、工程(a)において、検出チャンネルの上流のフィードチャンネルを通して検出チャンネルに供給し、ここでフィードチャンネルは、フィードチャンネルの高さおよび幅が、マイクロ流体の液滴中の粒子の垂直方向および水平方向の動きを抑えない(すなわち、マイクロ流体の液滴は球形である)という特徴を有する。特に、マイクロ流体の液滴は、フィードチャンネル内で栓を形成しない。用語「フィードチャンネル」は、内部の流体およびマイクロ流体の液滴を、検出チャンネルに運搬するチャンネルを指す。
好ましい実施態様において、デバイスを、マイクロ流体の液滴中の粒子の水平方向の動きをも、球形であるときの同じマイクロ流体の液滴と比較して、検出チャンネル内、少なくとも検出点において抑えるように設計する。
(i)検出チャンネルの上流のフィードチャンネル、
(ii)検出チャンネルの上流のソーティングチャンネル、および/または
(iii)少なくとも2つの分岐チャンネル
のうち、1以上を含み、これら全ては上述されている。
(i)デバイスが、マイクロ流体の液滴中の粒子の少なくとも垂直方向の動きを、球形であるときの同じマイクロ流体の液滴と比較して、検出チャンネル内、少なくとも検出点において抑えるように設計されること、
(ii)デバイスのソーティングチャンネルおよび/または検出チャンネルが上述のようにねじれ、または曲がっていること、および/または
(iii)デバイスが、ソーティングジャンクションの上流かつ検出点の下流に、ソーティングチャンネルに流体を流入するための1以上の流入口をさらに含むこと。
第六の態様のデバイスは、本発明の第五の態様のデバイスにおいて記述されるように、さらに改変できる。
(i)デバイスが、マイクロ流体の液滴中の粒子の少なくとも垂直方向の動きを、球形であるときの同じマイクロ流体の液滴と比較して、検出チャンネル内、少なくとも検出点において抑えるように設計されること、
(ii)ここでソーティングジャンクションと検出点との間の距離は、(先に明記したように)500μmまたはそれ未満、好ましくは球形のマイクロ流体の液滴の直径の10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍またはわずか3倍未満であること、および/または、
(iii)デバイスが、ソーティングジャンクションの上流かつ検出点の下流に、ソーティングチャンネルに流体を流入するための1以上の流入口をさらに含むこと。
第七の態様のデバイスは、本発明の第五の態様のデバイスにおいて記述されるように、さらに改変できる。
(i)デバイスが、マイクロ流体の液滴中の粒子の少なくとも垂直方向の動きを、球形であるときの同じマイクロ流体の液滴と比較して、検出チャンネル内、少なくとも検出点において抑えるように設計されること、
(ii)ソーティングジャンクションと検出点との間の距離が、(先に明記したように)500μmまたはそれ未満、好ましくは球形のマイクロ流体の液滴の直径の10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍またはわずか3倍未満であること、および/または、
(iii)デバイスのソーティングチャンネルおよび/または検出チャンネルが上述のようにねじれ、または曲がっていること。
第八の態様のデバイスは、本発明の第五の態様のデバイスにおいて記述されるように、さらに改変できる。
第五、六、七および/または八の態様におけるマイクロ流体デバイス、および
検出チャンネル内のマイクロ流体の液滴中に含まれる少なくとも一つの粒子を、検出点において検出する検出手段、
を含む。
実施例1
第一の実施例において、本発明を用いて、ヒトGPCRに結合する、B細胞が分泌した抗体を選定する。マウスを、GPCRの細胞外ドメインで免疫化し、次いでいくつかのブースター注射を行い、B細胞を脾臓から単離する。そして、これらのB細胞を個別に、Alexa−Fluor405(405nmの励起、450nmの蛍光)で標識された抗マウスの二次抗体ならびに、ビオチン化されたGPCRの細胞外ドメインおよび二次抗体と異なる波長の光を発する追加のビオチン化された色素(bio−Alexa488またはbio−Alexa568など)の両方で被覆された8μmのストレプトアビジンビーズと共に、液滴中に封入した。液滴を(液滴内部での一次抗体の十分な細胞分泌を可能にするために)外部で数時間インキュベートし、次いで上述した検出およびソーティングチップに再注入した。各液滴の蛍光信号を、(一次抗体とビーズの結合を定量化するための)二次抗体および(ビーズが焦点面および/またはレーザースポットの最大強度のどのくらい外側にあるかを決定するための)ビオチン化された色素の両方において、レーザー分光法によって測定した。ある封入されたB細胞がGPCRで被覆されたビーズに結合する抗体を分泌する場合、蛍光標識された二次抗体もビーズ表面上で固定化される。これは、液滴がレーザーを通過すると、強く、狭い蛍光の発光ピークをもたらす。対照的に、B細胞が分泌した抗体がビーズに結合しないと、広く、弱い強度の蛍光ピークが観測される。ビーズが焦点面および/または最大強度のレーザースポットの内部にある場合、ビオチン化された色素の信号は最大となる。対照的に、ビーズが焦点面および/または最大強度のレーザースポットの外部にある場合、観測される蛍光信号は弱くなる。したがって、測定された二次抗体蛍光ピークの強度をビーズのピーク強度の最大値で割ることは、液滴内部のビーズの位置に関係なく、一次抗体とGPCRとの結合を定量的に決定することを可能にする。それゆえ、この正規化された値を、GPCRに結合する抗体を分泌するB細胞のホストである液滴を、特異的に単離するためのソーティングの基準として利用できる。ソーティングの工程後、ポジティブにソーティングされた個々のB細胞における抗体をコードする遺伝子をRT−PCRで増幅し、配列決定し、所望の抗体を同定する。
GPCRに対する抗体のアゴニスト作用についてスクリーニングを行う。マウスを、GPCRの細胞外ドメインで免疫化し、次いでいくつかのブースター注射を行い、B細胞を脾臓から単離する。平行して、GPCR活性化に際して(例えば、短寿命GFPの発現による)細胞内緑色蛍光信号を発生するレポーター細胞を、カルセインブルーで染色する。次の工程において、B細胞とレポーター細胞を液滴中に共封入し、数時間インキュベートし、液滴中の抗体の十分な分泌を可能にする。その後、液滴を、例えば本明細書に記述されるような、ソーティングのためのマイクロ流体デバイスに再注入する。ソーティングにおいて、(GPCRの活性化を示す)緑色の信号を(レポーター細胞の、焦点面および最大強度のレーザースポットへの近接性を示す)青色の信号で割り、この正規化したパラメータが最も高い値である液滴を回収する。ソーティングの工程後、ポジティブにソーティングされた個々のB細胞における抗体をコードする遺伝子をRT−PCRで増幅し、配列決定し、所望の抗体を同定する。
GPCRに対する抗体のアゴニスト作用についてスクリーニングを行う。マウスを、GPCRの細胞外ドメインで免疫化し、次いでいくつかのブースター注射を行い、B細胞を脾臓から単離する。次にこれらのB細胞を、カルセイン−オレンジなどの非特異的な色素で染色する。平行して、GPCR活性化に際して細胞内緑色蛍光信号を発生するレポーター細胞を、カルセイン−ブルーで染色する。次の工程において、B細胞、レポーター細胞および対象のGPCRを活性化する薬剤を液滴中に共封入し、数時間インキュベートし、液滴中の抗体の十分な分泌を可能にする。アンタゴニスト抗体を分泌する任意のB細胞を含まない全ての液滴において、レポーター細胞は、(薬剤の存在により)強い緑色の信号を示す。対照的に、アンタゴニスト抗体を分泌するB細胞のホストである液滴は、このレポーター信号を消し、対象の表現型を示す。しかしながら、ある液滴が単にレポーター細胞のホストでない場合、同様の表現型が(緑色のチャンネルにおいて)検出される。追加の測定なしでは、これは多くの偽陽性のB細胞の選定を必然的に導く。この問題を克服するため、液滴を、感度向上のためのいくつかの特別な特徴を持つソーティングデバイスに再注入後、多色の様式で分析する:液滴を少なくともz方向において圧迫する検出チャンネルを備えるチップを用い、45°の角度におけるソーティングチャンネルを用い、液滴を、正確に1つのB細胞(1つのオレンジ色のピーク)および1つのレポーター細胞(1つの青色のピーク)の存在について、最初に分析する。この基準を達成し、さらに緑色のチャンネルにおいてアッセイの信号を示さない、または少なくとも強く減少したアッセイの信号を示す、液滴のみをソーティングする。ソーティングの工程後、ポジティブにソーティングされた個々のB細胞における抗体をコードする遺伝子をRT−PCRで増幅し、配列決定し、所望の抗体を同定する。
マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)などの抗原に対する抗体の特異的な結合について、スクリーニングを行う。このスクリーニングは、MMP−2にも結合する抗体に対する直接的なカウンタースクリーニングを含む。マウスをMMP−1のペプチドで免疫化し、次いでいくつかのブースター注射を行い、B細胞を脾臓から単離する。そして、これらのB細胞を個別に、Alexa−Fluor405(405nmの励起、450nmの蛍光)で標識された抗マウスの二次抗体ならびに、ビオチン化されたMMP−1のペプチドおよびbio−488の両方で被覆された8μmのストレプトアビジンビーズと共に、液滴中に封入した。そして、MMP−2およびbio−Alexa568で被覆された8μmのストレプトアビジンビーズをさらに液滴中に共封入する。ソーティングでは、488nmでの信号強度で割った405nmでの蛍光信号(標的抗原MMP−1に対する効率的な結合を示す正規化された値)において強い値を示し、同時に、568nmでの信号強度で割った405nmでの蛍光信号(MMP−2に対する望ましくない結合を示す正規化された値)において値を示さない、またはわずかな弱い値を示す、液滴のみを回収した。この方法では、MMP−2に結合しない、特異性の高いMMP−1のバインダーを同定できる。ソーティングの工程後、ポジティブにソーティングされた個々のB細胞における抗体をコードする遺伝子をRT−PCRで増幅し、配列決定し、所望の抗体を同定する。
細胞は焦点面および/またはレーザースポットの中心の内または外で浮遊し得、ばらつきの大きな発光強度をもたらすため、マイクロ流体の液滴内部の染色された細胞の信頼性のある検出は困難である。これを克服するため、発明者は特殊な配置を備える新規なソーティングチップを設計した(図3および4):まず第一に、検出を行う(レーザー光線が集光する)チャンネルの一部を、チップの残部と比較して狭く、浅くする(例えば、残りのチャンネルと比較して<50%)。これは、液滴が栓(チャンネルを完全に満たす液滴)となることを意味し、封入された細胞は、y方向(細胞は、レーザースポットの中心により近づき、またはさらに離れ得る)およびz方向(細胞は、焦点面により近づき、またはさらに離れ得る)の両方において、空間的な自由度が減る。注目すべきことは、チップ全体を狭く、浅いチャンネルとして設計することは、目詰まりが非常に頻繁に起こるため適切ではない。対照的に、本発明のソーティングチップは、分析およびソーティングの工程において、異なる深さおよび幅である。
6μmのFluoresbriteビーズ(異なる波長で同時に発光するビーズ;Polysciences Inc.から市販されている)を液滴中に封入し、得られる蛍光信号を分析した。全てのビーズはほぼ同数の蛍光色素分子を持ち、したがって蛍光強度についてほとんどばらつきを示さないはずである。しかしながら、単一の蛍光チャンネル(例えば、緑色または青色の範囲)のみを分析すると、蛍光強度の非常に広い分布が観測される(図7A、B参照)。これは、ビーズが液滴内部を自由に浮遊するという事実のためであり、ビーズが焦点面および/またはレーザースポットの中心の内または外にあり得ることを意味する。しかしながら、緑色の信号を青色の信号で(例えば、対応する値を割ることによって)正規化すると、この効果は最小化できる(図7C参照)。全てのイベントはおおむね同じ対角線上にあり、これは、単一の蛍光チャンネルのみを調べるとこれらの信号は大きくばらつくが、正規化したデュアルカラーの読み出しによるこれらのイベントのソーティングは、同等の蛍光強度を持つビーズの収集をもたらすことを意味する。
Claims (5)
- マイクロ流体の液滴中の、粒子と潜在的な粒子の結合パートナーとの間の結合を定量化する方法であって、
ここで、マイクロ流体の液滴が第一の検出可能な標識と会合している単一の第一の粒子、および第二の検出可能な標識と会合している潜在的な粒子の結合パートナーを含み、ここで第一の検出可能な標識の量が、既知であるか、かつ/または、さらなるマイクロ流体の液滴中に含まれる単一のさらなる粒子と会合している第一の検出可能な標識の量と実質的に同一であり、第一の検出可能な標識が第二の検出可能な標識と異なっており、さらなるマイクロ流体の液滴が、前記単一の第一の粒子を含む前記マイクロ流体の液滴をも含む多数のマイクロ流体の液滴に含まれ、
前記方法が、
(i)第一の検出可能な標識の信号を測定する工程、
(ii)第二の検出可能な標識の信号を測定する工程、および
(iii)第一の検出可能な標識の信号を用いて、第二の検出可能な標識の信号を正規化する工程、
を含み、ここで正規化された第二の検出可能な標識の信号が、粒子と潜在的な粒子の結合パートナーとの間の結合の量を表す、方法。 - 第一の粒子が、潜在的な粒子の結合パートナーとの結合を介して、第二の標識と会合している、請求項1記載の方法。
- 第一の粒子およびさらなる粒子が、細胞、ウイルス、ビーズ、タンパク質およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 潜在的な粒子の結合パートナーが、抗体、抗体誘導体、抗体模倣物、バクテリオファージ、mRNA−ポリペプチド複合体、mRNA−リボソーム−ポリペプチド複合体、細胞、ウイルス、ペプチド、タンパク質、核酸、アプタマーおよび小分子からなる群から選択される、請求項3記載の方法。
- マイクロ流体の液滴が、第三の検出可能な標識と会合している、(i)粒子に結合しない物質または(ii)潜在的な粒子の結合パートナーに結合しない第二の粒子、をさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
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