JP6608368B2 - 核酸バーコードを用いた単一細胞と関連づけられた核酸の分析方法 - Google Patents
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Description
本出願は、内容全体が全ての目的で参照により本明細書に取り込まれる、2013年12月30日に出願された表題「Analysis of Nucleic Acids Associated with Single Cells using Nucleic Acid Barcodes」の米国特許仮出願第61/922,012の利益を主張するものである。
2014年12月30日に作成されたファイル97519−920777.txt(18,227,200バイト、機器フォーマット:IBM−PC、MS−Windowsオペレーションシステム)に記載された配列表は、全ての目的で全体として参照により本明細書に取り込まれる。ファイルTable 18.[barcode_part1].txt(2,039,808バイト)に記載されたTable 18.[barcode_part1];ファイルTable 18.[barcode_part2].txt(90,112バイト)に記載されたTable 18.[barcode_part2];ファイルTable 22.[i5 index primers].txt(4,096バイト)に記載されたTable 22.[i5 index primers];ファイルTable 32.[well−barcode].txt(4,096バイト)に記載されたTable 32.[well−barcode];ファイルTable 32.[plate−barcode].txt(4,096バイト)に記載されたTable 32.[plate−barcode]は、全て2014年12月24日に作成され(機器フォーマット:IBM−PC、MS−Windowsオペレーションシステム)、全ての目的で全体として参照により本明細書に取り込まれる。
免疫グロブリン(Ig)及びT細胞受容体(TCR)遺伝子などの可変遺伝子は、ジャンクションの間にP/Nヌクレオチド付加を有するV(D)J遺伝子セグメントの再構成から形成される。完全に機能的なIgまたはTCRタンパク質が、2つの遺伝子、即ちIgの場合には重鎖及び軽鎖遺伝子、αβTCRの場合にはα及びβ遺伝子、そしてγδTCRの場合にはγ及びδ遺伝子の会合により形成される。このコンビナトリアルアプローチは、極めて多様性のある異なる可能な配列をもたらす。
[本発明1001]
1つまたは複数の対象から得られた1つまたは複数の試料と関連づけられた複数のRNAを得ることであって、試料と関連づけられた前記RNAが別個の反応ボリューム内に存在する、こと;
酵素反応を利用して生成されかつユニバーサルプライミング配列、バーコード配列及び結合部位を含むアダプター分子を、前記試料と関連づけられた前記RNAに付加すること;ならびに
前記バーコード配列を、前記試料と関連づけられた1つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込み、それにより関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させること
を含む、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドの生成方法。
[本発明1002]
前記酵素反応を用いて前記アダプター分子を生成させることをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記アダプター分子が、鋳型分子を1つまたは複数の酵素と接触させることにより生成される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記鋳型分子が、RNAポリメラーゼ(RNAP)プロモーターを含むDNA分子であり、前記1つまたは複数の酵素が、RNAポリメラーゼを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記RNAPプロモーターが、T7、T3、及びSP6からなる群から選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記鋳型分子が、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位を含むDNA分子であり、前記1つまたは複数の酵素が、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び鎖置換DNAポリメラーゼを含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
前記ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位が、Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI、及びNt.BsmAIからなる群から選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記鎖置換DNAポリメラーゼが、Klenow exo−、Bst Large Fragment、及びBst Large Fragmentの操作された変異体からなる群から選択される、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記鋳型分子が、固体担体に結合されており、
前記固体担体が、水溶液と接触しており、かつ
前記アダプター分子が、生成されると水溶液中に放出される、
本発明1003の方法。
[本発明1010]
前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加することが、前記水溶液を、前記RNAが存在している前記反応ボリュームと混和することを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記水溶液が、1つの試料と関連づけられた前記RNAと同じ反応ボリューム内に存在する、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記鋳型分子が、エンドヌクレアーゼ制限部位を含み、
前記1つまたは複数の酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、かつ
前記アダプター分子が、前記鋳型分子の一部を含み、前記鋳型分子が前記制限エンドヌクレアーゼと接触すると前記一部が生成されて前記水溶液中に放出される、本発明1009の方法。
[本発明1013]
前記固体担体が、ビーズまたは表面である、本発明1009の方法。
[本発明1014]
前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加する前は、前記アダプター分子が溶液中で遊離している、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加することが、前記コンパートメントを、前記RNAが存在している反応ボリュームと混和することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記RNAが存在している反応ボリューム内で生成される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記RNAが存在している反応ボリューム内で生成されない、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記酵素反応が、等温性反応である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記アダプター分子が、固有分子識別子(UMI)配列をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記アダプター分子が、RNA分子である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記アダプター分子が、RNAPを利用して生成される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記アダプター分子が、DNA分子である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記アダプター分子が、DNAPを利用して生成される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
関心対象の前記1つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させることが、前記試料と関連づけられたRNAを逆転写して、それにより複数の第一鎖cDNAを合成することを含み、
前記試料と関連づけられたRNAの少なくとも幾つかが、前記アダプター分子の結合部位に相補的である配列領域を含み、かつ
前記バーコード配列が、前記試料と関連づけられた第一鎖cDNAに組み込まれるように、前記アダプター分子が逆転写のためのプライマーとして使用される、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記結合部位が、ポリ−Tトラクトを含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記結合部位が、ランダムトラクトを含む、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記結合部位が、前記アダプター分子の3'末端に存在する、本発明1024の方法。
[本発明1028]
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記試料と関連づけられた前記RNAを逆転写することが、前記コンパートメントを、前記RNAが存在している前記反応ボリュームと混和すると起こる、本発明1024の方法。
[本発明1029]
前記試料と関連づけられた前記RNAを逆転写することが、前記RNAに付加された前記アダプター分子が生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こる、本発明1024の方法。
[本発明1030]
複数のcDNAを得るために、前記試料と関連づけられた前記RNAを逆転写することをさらに含み、RNAを逆転写することが、逆転写酵素及び第一鎖プライマーを用いてcDNAの第一鎖を合成することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記逆転写酵素が、MMLV H − 逆転写酵素である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加することが、前記コンパートメントを、前記RNAが存在している前記反応ボリュームと混和することを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
cDNAの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応ボリュームと混和する前に合成される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
cDNAの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応ボリュームと混和した後に合成される、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記試料と関連づけられた前記RNAを逆転写することが、前記RNAに付加された前記アダプター分子が生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こる、本発明1030の方法。
[本発明1036]
前記反応ボリューム内の緩衝液が、pH8.0〜pH8.8のpH範囲で、トリス、カリウムイオン、塩素イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、酢酸イオン、またはマグネシウムイオンのうちの少なくとも1種を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記逆転写酵素が、鋳型切替え活性を有し、
前記試料と関連づけられたcDNAの少なくとも幾つかの第一鎖が、3'オーバーハングを含み、
前記アダプター分子の結合部位が、3'オーバーハングに相補的である3'部分を含み、かつ
前記バーコード配列が、前記試料と関連づけられたcDNAの第一鎖に組み込まれるように、前記アダプター分子が前記逆転写酵素のための鋳型として働く、
本発明1030の方法。
[本発明1038]
前記3'オーバーハングが、1つまたは複数のCヌクレオチドを含み、前記結合部位の3'部分が、1つまたは複数のGヌクレオチドを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記第一鎖プライマーが、ポリTトラクトを含む、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、本発明1037の方法。
[本発明1041]
関心対象のポリヌクレオチドを生成させることが、第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて前記試料のcDNAの前記第一鎖を増幅することを含み、前記第二のプライマーが、前記第一鎖プライマーの少なくとも一部と同じ配列を有し、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、本発明1030の方法。
[本発明1042]
前記第一のプライマーが、前記アダプター分子である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、本発明1041の方法。
[本発明1044]
前記第一鎖プライマーが、ポリTトラクトを含む、本発明1041の方法。
[本発明1045]
前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、本発明1041の方法。
[本発明1046]
前記試料が、細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1047]
前記細胞が、血液細胞、免疫細胞、組織細胞、または腫瘍細胞である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記細胞が、B細胞またはT細胞である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記試料と関連づけられた前記RNAが、mRNAを含む、本発明1046の方法。
[本発明1050]
前記試料と関連づけられた前記RNAが、少なくとも1、3、10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000種のmRNAを含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記試料と関連づけられた前記RNAが、細胞のトランスクリプトームの少なくとも一部を含む、本発明1049の方法。
[本発明1052]
前記試料と関連づけられた前記RNAが、細胞の総RNAを含む、本発明1046の方法。
[本発明1053]
試料あたり少なくとも10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000種の関心対象のポリヌクレオチドが、生成される、本発明1046の方法。
[本発明1054]
前記1つまたは複数の試料が、少なくとも10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000個の細胞を含む、本発明1046の方法。
[本発明1055]
前記1つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、本発明1046の方法。
[本発明1056]
前記試料を溶解緩衝液と接触させることをさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1057]
前記試料を核酸マーカーと接触させ、それにより前記核酸マーカーを前記試料のサブセットと結合させること;及び
前記試料を洗浄し、それにより前記核酸マーカーが結合していない試料から前記核酸マーカーを除去すること
をさらに含み、
前記サブセット内の試料については、前記試料と関連づけられたRNAに付加された前記アダプター分子もまた、前記核酸マーカーに付加され、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドが、前記核酸マーカーを用いて生成される、本発明1046の方法。
[本発明1058]
前記核酸マーカーが、分子標識に連結された核酸を含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記分子標識が、抗体、抗原、またはタンパク質である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記分子標識が、1つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記核酸が、RNAである、本発明1058の方法。
[本発明1062]
前記核酸が、DNAである、本発明1058の方法。
[本発明1063]
前記DNAが、RNAPプロモーターを含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記試料が、第一の核酸マーカー及び第二の核酸マーカーと接触しており、
前記第一の核酸マーカーが、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、
前記第二の核酸マーカーが、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含み、
前記第一の核酸及び第二の核酸が、異なる配列領域を含み、かつ
前記第一の分子標識と第二の分子標識が異なっている、
本発明1058〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記1つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1066]
前記1つまたは複数の試料が、少なくとも3、10、30、または100種の異なる対象から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1067]
RNAPプロモーター配列、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む、アダプター構築物。
[本発明1068]
前記RNAPプロモーターが、T7、T3、及びSP6からなる群から選択される、本発明1067のアダプター構築物。
[本発明1069]
ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む、アダプター構築物。
[本発明1070]
前記ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位が、Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI、及びNt.BsmAIからなる群から選択される、本発明1069のアダプター構築物。
[本発明1071]
固有分子識別子(UMI)配列をさらに含む、本発明1067または1069のアダプター構築物。
[本発明1072]
本発明1067、1069または1071のアダプター構築物を含む固体担体。
[本発明1073]
前記アダプター構築物が、共有結合を介して前記固体担体に結合されている、本発明1072の固体担体。
[本発明1074]
前記アダプター構築物の複数のコピーが、前記固体担体に結合されている、本発明1072の固体担体。
[本発明1075]
少なくとも10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000コピーの前記アダプター構築物が、前記固体担体に結合されている、本発明1074の固体担体。
[本発明1076]
前記アダプター構築物の各コピーが、同じバーコード配列を含む、本発明1074の固体担体。
[本発明1077]
本発明1072の複数の固体担体を含むアダプター鋳型ライブラリー。
[本発明1078]
前記複数が、少なくとも10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000個の固体担体を含む、本発明1077のアダプター鋳型ライブラリー。
[本発明1079]
抗体、抗原、またはタンパク質である分子標識に連結された核酸を含む核酸マーカー。
[本発明1080]
前記分子標識が、1つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する、本発明1079の核酸マーカー。
[本発明1081]
前記核酸が、RNAである、本発明1079の核酸マーカー。
[本発明1082]
前記核酸が、DNAである、本発明1079の核酸マーカー。
[本発明1083]
前記DNAが、RNAPプロモーターを含む、本発明1082の核酸マーカー。
[本発明1084]
少なくとも1つの核酸マーカーが、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、少なくとも1つの核酸マーカーが、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含み、
前記第一の核酸及び第二の核酸が、異なる配列領域を含み、前記第一の分子標識と第二の分子標識が異なっている、本発明1079〜1083のいずれかの複数の核酸マーカー。
[本発明1085]
本発明1067、1069もしくは1071のアダプター構築物、本発明1072の固体担体、本発明1077のアダプター鋳型ライブラリー、または本発明1079〜1083のいずれかの核酸マーカーを含む、キット。
[本発明1086]
本発明1067または1069のアダプター構築物から、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列及び結合部位を含むアダプター分子を生成させるための酵素をさらに含む、本発明1085のキット。
[本発明1087]
浸透圧保護剤を含む細胞懸濁緩衝液をさらに含む、本発明1085または1086のキット。
[本発明1088]
前記浸透圧保護剤が、ベタイン、または構造的に近いその類似体である、本発明1087のキット。
[本発明1089]
前記浸透圧保護剤が、グリシンベタインである、本発明1088のキット。
[本発明1090]
前記浸透圧保護剤が、糖またはポリオールである、本発明1087のキット。
[本発明1091]
前記浸透圧保護剤が、トレハロースである、本発明1090のキット。
[本発明1092]
前記浸透圧保護剤が、アミノ酸である、本発明1087のキット。
[本発明1093]
前記浸透圧保護剤が、プロリンである、本発明1092のキット。
[本発明1094]
前記緩衝液の浸透圧が、約250〜350mOsm/Lである、本発明1087のキット。
[本発明1095]
前記浸透圧保護剤が、前記緩衝液の浸透圧の最大10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%に寄与している、本発明1087のキット。
[本発明1096]
前記緩衝液が、約230〜330mMベタイン及び約10mM NaClを含む、本発明1087のキット。
[本発明1097]
a)逆エマルションの親水性コンパートメントを生成させるステップであって、前記親水性コンパートメントが
固体担体と、
バーコード配列を含むバーコードオリゴヌクレオチドと、
捕捉部分を介して前記固体担体の表面に結合されたオリゴヌクレオチドと
を含み、前記結合されたオリゴヌクレオチドが、前記バーコードオリゴヌクレオチドの3'配列に相補的である3'配列を含む、ステップと、
b)前記固体担体上の前記結合されたオリゴヌクレオチドに前記バーコード配列を組み込むためにポリメラーゼ伸長反応を実施するステップと
を含む、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に付着させる方法。
[本発明1098]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、PCRリバースプライマー配列と同一の、または前記PCRリバースプライマー配列に相補的である5'配列をさらに含む、本発明1097の方法。
[本発明1099]
フルオロフォア標識リバースプライマーを用いてPCR反応を実施することをさらに含む、本発明1098の方法。
[本発明1100]
前記固体担体が、ビーズまたは表面である、本発明1097の方法。
[本発明1101]
前記捕捉部分が、ストレプトアビジンである、本発明1097の方法。
[本発明1102]
前記捕捉部分が、カルボキシル基、エポキシ基、またはヒドロキシル基を含む、本発明1097の方法。
[本発明1103]
前記捕捉部分が、チオール化オリゴヌクレオチドを捕捉するための金を含む、本発明1097の方法。
[本発明1104]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む、本発明1097の方法。
[本発明1105]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、T7、T3、及びSP6からなる群から選択されるRNAPプロモーターをさらに含む、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI、及びNt.BsmAIからなる群から選択されるニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含む、本発明1104の方法。
[本発明1107]
前記結合部位が、1つまたは複数のGヌクレオチドである、本発明1104の方法。
[本発明1108]
a)固体担体と、
W配列を含む第一のバーコードオリゴヌクレオチドと、
(i)S1 x 配列、及び(ii)前記第一のバーコードオリゴヌクレオチドの3'配列に相補的である配列を含む、捕捉部分を介して前記固体担体の表面に結合されたオリゴヌクレオチドと
を提供するステップと;
b)前記W配列を前記結合されたオリゴヌクレオチドに組み込むためにポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施するステップと;
c)(i)S2 y 配列、及び(ii)ステップb)から得られた結合されたオリゴヌクレオチドの3'末端に相補的である3'配列を含む第二のバーコードオリゴヌクレオチドを提供するステップと;
d)前記結合されたオリゴヌクレオチドに前記S2 y 配列を組み込むためにポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施するステップであって、それにより、ポリヌクレオチドを前記固体担体に付着させ、前記ポリヌクレオチドが、バーコード配列を含み、前記バーコード配列が、S1 x 、W、及びS2 y 配列を含む、ステップと
を含む、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に付着させる方法。
[本発明1109]
前記固体担体が、ビーズまたは表面である、本発明1108の方法。
[本発明1110]
前記捕捉部分が、ストレプトアビジンである、本発明1108の方法。
[本発明1111]
前記捕捉部分が、カルボキシル基、エポキシ基、またはヒドロキシル基を含む、本発明1108の方法。
[本発明1112]
前記捕捉部分が、チオール化オリゴヌクレオチドを捕捉するための金を含む、本発明1108の方法。
[本発明1113]
前記第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む、本発明1108の方法。
[本発明1114]
前記第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、T7、T3、及びSP6からなる群から選択されるRNAPプロモーターをさらに含む、本発明1113の方法。
[本発明1115]
前記第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI、及びNt.BsmAIからなる群から選択されるニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含む、本発明1113の方法。
[本発明1116]
前記結合部位が、1つまたは複数のGヌクレオチドである、本発明1113の方法。
[本発明1117]
バーコード配列を含むポリヌクレオチドに付着されている、本発明1097〜1116のいずれかの方法により調製された固体担体。
[本発明1118]
本発明1117の複数の固体担体を含むバーコードライブラリー。
[本発明1119]
(a)3つの独立して制御される圧力源と、(b)3つのマイクロ流体経路と、(c)3つのフローセンサーと、(d)2つの試料ループと、(e)マイクロ流体ドロップレットチップと、(f)試料回収容器と
を含み、
(a)〜(f)が流体連通するように、
各圧力源が前記マイクロ流体経路の1つに連結されて、該マイクロ流体経路を通るように流体を流し、
前記フローセンサーの1つが、前記各圧力源の下流の各マイクロ流体経路に沿って配置され、
第一のマイクロ流体経路が、第一の試料ループを通過し、
第二のマイクロ流体経路が、第二の試料ループを通過し、
前記第一及び前記第二の試料ループが、熱冷却ユニットと接触しており、
前記第一及び第二のマイクロ流体経路が第一のジャンクションで合流して、組み合わせられた経路を形成しており、
前記組み合わせられた経路及び第三のマイクロ流体経路が第二のジャンクションで合流して試料経路を形成しており、前記第二のジャンクションが、前記マイクロ流体ドロップレットチップ内かつ前記第一のジャンクションの下流に存在し、
前記試料経路が、前記第二のジャンクションの下流の前記試料回収容器内に入っている、
細胞と、バーコードアダプター鋳型と、関心対象のポリヌクレオチドを生成するための試薬とを封入するためのマイクロ流体ドロップレットデバイス。
[本発明1120]
前記各圧力源が、圧力ポンプを含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1121]
前記各圧力源が、シリンジポンプを含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1122]
前記第一の試料ループが、前記マイクロ流体ドロップレットチップに向かう水溶液の流れを計量するように構成されており、前記水溶液が、細胞及びバーコードアダプター鋳型を含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1123]
前記第二の試料ループが、前記マイクロ流体ドロップレットチップに向かう反応混合物の流れを計量するように構成されており、前記反応混合物が、細胞溶解のための試薬及び関心対象のポリヌクレオチドを生成させるための試薬を含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1124]
前記第三のマイクロ流体経路が、油/界面活性剤ミックスを前記マイクロ流体ドロップレットチップに送達するように構成されている、本発明1119のデバイス。
[本発明1125]
前記熱冷却ユニットが、ペルティエデバイスを含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1126]
前記熱冷却ユニットが、氷の箱を含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1127]
前記第一のジャンクションが、前記ドロップレットチップ内に存在する、本発明1119のデバイス。
[本発明1128]
前記第三のマイクロ流体経路が、前記マイクロ流体ドロップレットチップの上流で2つの準経路に分割されており、前記2つの準経路が、前記第二のジャンクションで前記組み合わせられた経路と合流し、前記第二のジャンクションが、フローフォーカシング配置を有する、本発明1119のデバイス。
[本発明1129]
前記第二のジャンクションが、T字形ジャンクション配置を有する、本発明1119のデバイス。
[本発明1130]
前記第一のマイクロ流体経路が、細胞を収容するように構成されており、前記第二のマイクロ流体経路が、固体担体に結合されたバーコードアダプター鋳型を収容するように構成されている、本発明1119のデバイス。
[本発明1131]
前記固体担体の少なくとも2つが、異なるバーコード配列またはUMI配列を有するアダプター構築物を含む、本発明1077のアダプター鋳型ライブラリー。
[本発明1132]
前記複数の固体担体の各固体担体が、異なるバーコード配列または異なるUMI配列を有するアダプター構築物を含む、本発明1131のアダプター鋳型ライブラリー。
本明細書で用いられる、ポリヌクレオチドへ配列を「組み込む」という用語は、一連のヌクレオチドを、ホスホジエステル結合により、例えばポリヌクレオチドの3'または5'末端にある、ポリヌクレオチドの残り部分と共有結合によりつなぎ、該ヌクレオチドを配列により定められた順序でつなぐことを指す。ポリヌクレオチドが配列またはその相補鎖を含んでいれば、配列がポリヌクレオチドに「組み込まれている」、または同等に、該ポリヌクレオチドが該配列を「組み込んでいる」。ポリヌクレオチドへの配列の組み込みは、酵素的に(例えば、ライゲーションまたは重合により)、または化学合成を利用して(例えば、ホスホルアミダイトの化学作用により)起こり得る。
本発明の実施形態は、固有核酸バーコード化アダプターが水相にあるが、それらが生成された鋳型が固体表面に付着され得る(ビーズに付着されるなど)か、または溶液中で遊離し得るように、各反応容器内で該核酸バーコード化アダプターを生成させる方法を提供する。核酸バーコード化アダプターは、固有バーコード配列を含む任意のポリヌクレオチド配列であり、修飾(例えば、ビオチン化されているか、またはC18スペーサーを含む)を有していても、もしくは有していなくてもよく、または修飾されたポリヌクレオチド(2'−O−メチルRNA塩基など)を含んでいてもよい。
1.バーコード化アダプター鋳型をビーズ(ビーズごとに固有のバーコード)に付着させて、同じ貯蔵容器で保存することができる
2.個別のピペット注入ステップを利用せずに、複数のコピーの固有バーコード化アダプターを反応容器に送達することができる
3.各ビーズに付着され得るポリヌクレオチドが限られた量であるが、それでもなおバーコード化アダプターが増幅される
4.増幅されたバーコードが水相にあり、固相の反応速度よりもかなり急速な液相を利用する。
1.逆転写酵素が典型的にはDNAよりもむしろRNAを鋳型として用いること、及び鋳型スイッチングがインビボで逆転写酵素により用いられてレトロウイルスの複製においてRNA鋳型に切り替わることから、RNAバーコード化アダプターは、対象ポリヌクレオチドに該バーコード配列を付着させる鋳型スイッチング反応においてより効率的になり得る。
2.RNA転写産物全体をアダプターとして用いることで、下流のPCR反応においてプルーフリーディングDNAポリメラーゼを用いた場合にバックグランドが低くなる。バーコードアダプターがミスプライミングして、逆転写を開始した場合にバックグランドが生じ、第一鎖cDNAの5'及び3'の両末端に付加されたバーコードアダプター配列が得られる。これらは、バーコードアダプターに相補的である1つのプライマーだけからPCRで増幅され得る。しかし、プルーフリーディングDNAポリメラーゼをPCRで用いる場合、それらはRNAプライマーを転写せず(図4)、バーコードアダプターのミスプライミングからバックグランドが排除される。
により与えられ、式中、k=1、及びp=1/Nである。
(Nは十分に大きく、組み合わせは本質的に反復を含まないと仮定される)、及びn個の試料をバーコード化するのに用いられるバーコード数nxを有するバーコードライブラリーと見なすことができ、
により与えられ、式中、k=1、及び
である。
A.対象ポリヌクレオチドの生成
幾つかの態様において、本発明は、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させる方法を提供する。そのようなポリヌクレオチドは、バーコード化された核酸、例えばバーコードを含むcDNAまたはDNAアンプリコンであってもよく、共通のバーコードまたはバーコードセットによって、ポリヌクレオチドの群が同じ試料に由来することが示される。該方法によれば、1つまたは複数の試料と関連づけられた複数のRNAは、以下に記載される通り得られる。各試料と関連づけられたRNAは、別個の反応ボリューム内に存在する。その後、アダプター分子が、各試料と関連づけられたRNAに付加され、バーコード配列を該RNAに由来する1つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込む。
本発明の別の態様は、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを、固体担体に付着させる方法を提供する。該ポリヌクレオチドは、バーコードアダプター鋳型、またはそのような鋳型の前駆体であり得る。したがってポリヌクレオチドを先に記載された通り使用して、バーコードアダプターを酵素的に生成させ、該バーコード配列をRNA由来のアンプリコンに組み込むことができる。
A.ポリヌクレオチド
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、cDNA領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、試料同定(バーコード)−アダプター領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、試料同定(バーコード)領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、アダプター領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、ユニバーサルプライマー領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、アンプリコン領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、プレート同定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第一のプレート同定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二のプレート同定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、制限部位領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第一の制限部位領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二の制限部位領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列決定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第一の配列決定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二の配列決定領域を含み得る。
幾つかの態様において、組成物は、ベクターを含み得る。用語「ベクター」は、複製され得る細胞の中に核酸配列を導入するために挿入され得る担体核酸分子を指すために用いられる。ベクターは、核酸配列での宿主細胞の形質転換において用いることができる。幾つかの態様において、ベクターは、本明細書に記載された1つまたは複数のポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、標的ポリヌクレオチドをコードする核酸配列のライブラリーが、細胞集団に導入され、それによりライブラリーをスクリーニングすることができる。核酸配列は、「外在性」または「異種性」であってもよく、つまりそれがベクターを導入している細胞にとって外来性であること、または配列が細胞内の配列と相同性があるが該配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にある。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス(例えば、バクテリオファージ)が挙げられる。当業者は、Maniatis et al., 1988及びAusubel et al., 1994(両者とも参照により本明細書に取り込まれる)に記載された標準的な組換え技術を通してベクターを構築し得る。幾つかの態様において、ベクターは、予め操作された抗体の定常領域を有するベクターであり得る。この方法において、当業者は、関心対象の抗体のVDJ領域そのものをクローニングすることができ、予め操作されたベクター内にそれらの領域をクローニングすることができる。
一部の態様において、組成物は、宿主細胞を含有してもよい。一部の態様において、宿主細胞は、本明細書に記述されるポリヌクレオチドまたはベクターを含有してもよい。一部の態様において、宿主細胞は、真核細胞(たとえば昆虫、酵母、または哺乳類)または原核細胞(たとえば細菌)を含有してもよい。異種核酸配列の発現に関連して、「宿主細胞」とは、原核細胞を指し、ならびにベクターを複製することができ、及び/またはベクターによりコードされた異種遺伝子を発現することができる、形質転換可能な任意の生物体を含有する。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして用いることができ、及びベクターのレシピエントとして用いられている。宿主細胞は、「トランスフェクト」されていてもよく、または「形質転換」されていてもよく、それらは、外来性核酸が当該宿主細胞に移送または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞は、初代の対象細胞及びその子孫細胞を含有する。
一部の態様において、組成物は、ポリペプチドを含有してもよい。一部の態様において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、たとえば宿主細胞から発現されてもよい。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然型タンパク質、すなわち、天然型であり、組み換えがされていない細胞により産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を含有し;または遺伝的に改変された、もしくは組み換えされた細胞により産生され、天然型タンパク質のアミノ酸配列を有する分子を含有し、または天然型配列のアミノ酸の1つ以上の欠失、付加、及び/または置換を有する分子を含有する。当該用語はまた、1以上のアミノ酸が、対応する天然型アミノ酸及びポリマーの化学的アナログであるアミノ酸ポリマーを含有する。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質のアミノ酸の1つ以上の欠失、付加、及び/または置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、天然型の全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシ末端の欠失、及び/または内部分の欠失を有するポリペプチドを指す。また、そのような断片は天然型タンパク質と比較し、改変されたアミノ酸を含有してもよい。ある実施形態において、断片は、約5〜500アミノ酸の長さである。たとえば、断片は、少なくとも5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400、または450アミノ酸の長さであってもよい。有用なポリペプチド断片としては、結合ドメインを含有する、抗体の免疫学的に機能的な断片が挙げられる。結合抗体の場合、有用な断片としては、限定されないが、CDR領域、重鎖及び/もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、または2つのCDRを含有するその可変領域等が挙げられる。
試料は、免疫細胞を含有してもよい。当該免疫細胞は、T細胞及びB細胞を含有してもよい。T細胞(Tリンパ球)としては、たとえば、T細胞受容体を発現している細胞が挙げられる。B細胞としては、たとえば、活性化B細胞、ブラストB細胞、形質細胞、形質芽細胞、記憶B細胞、B1細胞、B2細胞、辺縁体B細胞、及び濾胞性B細胞が挙げられる。T細胞としては、T細胞、ブラストT細胞、ヘルパーT細胞(エフェクターT細胞またはTh細胞)、細胞傷害性T細胞(CTL)、記憶T細胞、中心記憶T細胞、エフェクター記憶T細胞、及び制御性T細胞が挙げられる。試料は、1つの細胞(たとえば1つのT細胞または1つのB細胞)を含有してもよく、または少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも100,000、少なくとも250,000、少なくとも500,000、少なくとも750,000、または少なくとも1,000,000個の細胞を含有してもよい。
本明細書において、「B細胞」とは、少なくとも1つの再構成イムノグロブリン遺伝子座を有する任意の細胞を指す。B細胞は、少なくとも1つの再構成イムノグロブリン重鎖遺伝子座または少なくとも1つの再構成イムノグロブリン軽鎖遺伝子座を含有してもよい。B細胞は、少なくとも1つの再構成イムノグロブリン重鎖遺伝子座及び少なくとも1つの再構成イムノグロブリン軽鎖遺伝子座を含有してもよい。B細胞は、適応免疫系の一部のリンパ球である。B細胞は、B細胞受容体(BCR)として細胞表面上に膜結合型で、または分泌型抗体としてのいずれかで抗体を発現する任意の細胞を含んでもよい。B細胞は、イムノグロブリンを発現することができる(抗体、B細胞受容体)。抗体は、重鎖イムノグロブリンと軽鎖イムノグロブリンから形成されるヘテロ二量体を含有してもよい。重鎖は、可変領域を形成するための、可変で、多様性に富み、結合性(VDJ)の遺伝子の遺伝子再構成から形成され、定常領域に結合される。軽鎖は、可変領域を形成するための、可変で、結合性(VJ)の遺伝子の遺伝子再構成から形成され、次いで定常領域に結合される。結合の組み合わせが非常に膨大な数になるため、抗体遺伝子の可変領域(BCRでもある)は高い多様性に富んでおり、それにより、B細胞は、任意の外来性抗原を認識し、それに対する反応を開始することができる。
B細胞は、炎症性免疫応答に関連し、抗原を認識した際に、活性化され、分化する。通常、活性化されるための2つのシグナルがB細胞に含有され、シグナルの1つはBCR(再構成イムノグロブリンの膜結合型)を介して伝達され、他は、CD40を介して、または他の共刺激性分子を介して伝達される。この第二のシグナルは、その表面上にCD40に対するリガンド(CD40L)を発現しているヘルパーT細胞との相互作用を介してもたらされてもよい。次いで、B細胞は増殖し、体細胞超変異を経て、抗体遺伝子のヌクレオチド配列にランダム変化が発生し、高い親和性を有する抗体を有するB細胞が選択される。また、B細胞は「クラススイッチ」を経てもよく、IgMアイソタイプをコードする重鎖の定常領域が、IgG、IgA、またはIgEアイソタイプをコードする定常領域へと変化(スイッチ)する。B細胞の分化は、記憶B細胞で終了し、それらは通常、親和性が高く、クラススイッチが行われているが、一部の記憶B細胞はIgMアイソタイプのままである。また、記憶B細胞は、活性化され、形質芽細胞に分化し、最終的に形質細胞へと分化してもよい。また、B細胞の分化は、最初に形質芽細胞になり、次いで、形質細胞になるよう分化してもよい。
クローンファミリーは一般的に、2以上の試料による、関連イムノグロブリン重鎖及び/または軽鎖V(D)J配列の使用により定義される。関連イムノグロブリン重鎖のV(D)J配列は、ゲノム中にコードされたV(D)J遺伝子セグメントの共通利用により特定されてもよい。クローンファミリー内には、一般的に、そのV(D)Jセグメント内の共通変異に基づき変化するサブファミリーがあり、それはB細胞の遺伝子組み換え及び体細胞超変異の間に発生しうる。
記憶B細胞は、通常、親和性成熟されたB細胞であり、クラススイッチがなされていてもよい。これらは、次の抗原刺激に対しより素早く応答することができ、ネイティブな生物体における約14日から、約7日まで、抗原に対する親和性成熟抗体の分泌に要する時間を大幅に短縮させることができる。
形質細胞は、長命型、または短命型のいずれであってもよい。長命型の形質細胞は、当該生物体の生涯にわたり生存し、一方で短命型の細胞は、3〜4日間、持続しうる。長命型の形質細胞は、炎症領域、粘膜領域(IgA分泌形質細胞の場合)、第二のリンパ組織(たとえば脾臓またはリンパ節)、または骨髄のいずれかに存在する。これら相違する領域に送達するために、長命型形質細胞になることを運命づけられた形質芽細胞は最初に血流を通って移動し、その後、様々なケモカイン勾配を利用して適切な領域へと移動する。形質芽細胞は、親和性成熟された細胞であり、典型的にはクラススイッチがなされており、通常、抗体を分泌するが、形質細胞により産生される抗体量よりも低量である。形質細胞は、抗体分泌専用の細胞である。
個々の適応免疫細胞のそれぞれのDNA中、ならびにそれらの関連RNA転写物中に組み換えが存在していることを特定するために、RNAまたはDNAのいずれかを配列解析してもよい。T細胞またはB細胞由来の組み換え配列はまた、クローン型とも呼称されうる。DNAまたはRNAは、抗体をコードするイムノグロブリン(Ig)遺伝子、またはT細胞受容体(TCR)遺伝子由来の配列に対応しうる。たとえば、DNA及びRNAは、TCRのα、β、γ、またはδ鎖をコードする配列に相当する。T細胞の多くは、TCRがα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体である。TCRα鎖は、VJ再構成により生成され、β鎖受容体はV(D)J再構成により生成される。TCRβ鎖に関しては、ヒトにおいて、48種のVセグメント、2種のDセグメント、及び13種のJセグメントが存在する。当該2種の結合部位の各々で、いくつかの塩基が欠失しており、他の塩基が付加されている(N及びPヌクレオチドと呼ばれる)。T細胞の一部では、TCRはγ鎖とδ鎖からなる。TCRγ鎖は、VJ再構成により生成され、TCRδ鎖はV(D)J再構成により生成される(Kenneth Murphy, Paul Travers, and Mark Walport, Janeway's Immunology 7th edition, Garland Science, 2007、その全体において、参照により本明細書に援用される)。
一部の態様において、本明細書に開示される1以上の方法がコンピューターに実装されてもよい。1つの実施形態において、コンピューターは、チップセットに連結されたプロセッサーを少なくとも1つ含有する。一部の実施形態において、チップセットは、メモリー、記憶装置、キーボード、グラフィックスアダプタ、ポインティングデバイス、及び/またはネットワークアダプタに連結されている。ディスプレイは通常、グラフィックスアダプタに連結されている。1つの実施形態において、チップセットの機能性は、メモリーコントローラーハブ、及びI/Oコントローラーハブによりもたらされる。他の実施形態において、メモリーは、チップセットの代わりにプロセッサーに直接連結される。
さらに、本明細書において、本明細書に記述されるアダプター構築物を含有するキットが開示される。キットは、本明細書に記述されるアダプター構築物に連結された複数の固体担体を含有してもよい。一部の実施形態において、当該キットは、複数のアダプター鋳型を含有するアダプター鋳型ライブラリーを含有する。一部の実施形態において、当該キットは、複数の固体担体に連結された複数のアダプター鋳型を含有するアダプター鋳型ライブラリーを含有する。当該キットはさらに、アダプター鋳型構築物から本明細書に記述されるアダプター分子(たとえばバーコードアダプター分子)を酵素反応により作製するための酵素を含有する。一部の実施形態において、当該キットは、本明細書に記述される細胞懸濁緩衝液を含有する。
本発明の実施形態は、反応量を作製し、輸送するためのデバイスを含有する。これらの量は、マイクロ流体スケールで存在してもよく、及び分散媒から相分離されてもよい。当該デバイスにより操作されうる反応量の例としては、逆エマルション(すなわち、水/油エマルション)中の水性ドロップレットを含有する。当該デバイスにより、バーコードアダプター鋳型、バーコードアダプター分子、試料(たとえば細胞)、及び/またはこれら試料から得られたRNAが、別々に、または一緒にドロップレット中に内包されることができる。また、当該デバイスにより、試薬がドロップレット中に導入され、それにより、バーコードアダプター分子が酵素的に生成され、個々の試料由来のRNAがバーコード化されうる。
A.実施例1:1回の反応で、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する
以下に記述される方法を用いて、各ビーズに固有バーコードアダプター鋳型を付加するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うエマルションPCRを用いて、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製した(図15を参照)。
1.ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
2.1mLのM270ビーズ(およそ6.7x108個のビーズ)を3つの1.5mLマイクロチューブの各々に入れ、トータルで3mLとした。
3.磁石上に3分間置いた。
4.上清を各チューブから取り除き、1mL(1x量)のBind/Wash Buffer(BWB;1M NaCl、5mM トリス、0.5mM EDTA)に再懸濁した。
5.工程4を2回以上繰り返し、次いで、540μL量のBWBに最終的に再懸濁した。
6.100μMのemB_T7bridge2を60μL、ビーズに添加し、15分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
7.インキュベーションの後、ビーズを1mLのBWB緩衝液を用いて3回洗浄し、1つの試験管に混合した。
8.0.01%アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを4℃で保存した。
9.10mMのトリスを用いて、使用する前に3回ビーズを洗浄した。
1.以下のPCRミックス(総量で3mL)を、3つの1.5mL微小遠心管(VWR Cat. No. 20170−650)で調製した。
2.油−界面活性剤混合物を調製した(総量1mL)。
a.ミネラルオイル(Sigma) 900μL
b.EM90(Evonik) 100μL
3.800μLの油−界面活性剤混合物、及び200μLのPCRミックスを、15個のAxygen 2.0mL Maxymum Recovery円錐底微小遠心管(MCT−200−L−C)の各々で混合した。遠心管を密封し、3秒間振とうした。
4.遠心管をQiagen TissueLyzer IIに置き、14Hzで5分間振とうした。
5.エマルションをVWR 96−well PCRプレート(83007−374)のウェルに分注した(ウェル当たり、160μLのエマルションを添加した)。
6.遠心管を、以下のプログラムを用いてサーモサイクルを行った:
1.PCRプレートの内容物を1.5mLの微小遠心管(VWR 20170−650)に移した(遠心管当たり、0.5mL以下のエマルション量)。
2.100μLの1μM emB_T7bridgefreeプライマーを各遠心管に添加した。
3.遠心管にイソブタノールを満たし、密封して、混合するためにしっかりと振とうした。
4.遠心管を14,000rpmで1分間遠心した。
5.遠心管を磁気ストライプ上に置き、ビーズを遠心管の側面に引き寄せて、次いで、できるだけ多量の上清を吸引し、沈殿ビーズは遠心管に残した。
6.1mLのイソブタノールを添加し、残留した油/エマルションがイソブタノールに分散されるまで、ピペッティングにより上下させて良く混合した。
7.磁気ストライプ上に遠心管を置き、遠心管の側面にビーズを引き寄せ、次いで、イソブタノールを吸引した。磁石上でビーズを集める時間を考慮し、最初に上清を吸引した遠心管に、他の遠心管の全量を移して混合させ、次いで上清を吸引し、それを繰り返すことにより、すべての遠心管のビーズを1本の遠心管へと混合した。
8.1mLの新鮮なイソブタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
9.イソブタノールを吸引した。
10.1mLの100%エタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
11.エタノールを吸引した。
12.工程10と工程11を繰り返した。
13.1mLの70%エタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
14.エタノールを吸引した。
15.工程13と工程14を繰り返した。
16.1mLのPBSを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
17.PBSを吸引した。
18.工程16と工程17を繰り返した。
を、他のRNAPプロモーター配列と置き換えることにより、他のRNAPを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばNt.BbvCIの「CCT CAG C」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ(たとえば、Nt.BbvCI)及び鎖置換(strand−displacing)DNAP(たとえばKlenow exo−)を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
により、約3億8700万個の固有バーコードが得られる。たとえば1000万個の細胞をバーコード化するために本バーコードライブラリーを用いたとしても、用いられる固有バーコードは2.5%のみである。大部分のバーコードは互いに十分に隔たりがあるため、PCRエラー及び配列解析のエラーに関わらず、次世代シークエンスのバーコード配列リードのほとんどが互いに(破棄されるリードの一部とともに)容易に識別化される。
以下に記述される方法を用いて、各ビーズに固有バーコードアダプター鋳型を付加するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行うエマルションPCRを用いてバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する(図15を参照)。
1.ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
2.1mLのM270ビーズ(およそ6.7x108個のビーズ)を3つの1.5mLマイクロチューブの各々に入れ、トータルで3mLとした。
3.磁石上に3分間置いた。
4.上清を各チューブから取り除き、1mL(1x量)のBind/Wash Buffer(BWB;1M NaCl、5mM トリス、0.5mM EDTA)に再懸濁した。
5.工程4を2回以上繰り返し、次いで、540μL量のBWBに最終的に再懸濁した。
6.100μMのemB_T7bridgeIsceIを60μL、ビーズに添加し、15分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
7.インキュベーションの後、ビーズを1mLのBWB緩衝液を用いて3回洗浄し、1つの試験管に混合した。
8.0.01%アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを4℃で保存した。
9.10mMのトリスを用いて、使用する前に3回ビーズを洗浄した。
1.以下のPCRミックス(総量で3mL)を、3つの1.5mL微小遠心管(VWR Cat. No. 20170−650)で調製した。
2.油−界面活性剤混合物を調製した(総量1mL)。
a.ミネラルオイル(Sigma) 900μL
b.EM90(Evonik) 100μL
3.800μLの油−界面活性剤混合物、及び200μLのPCRミックスを、15個のAxygen 2.0 mL Maxymum Recovery円錐底微小遠心管(MCT−200−L−C)の各々で混合した。遠心管を密封し、3秒間振とうした。
4.遠心管をQiagen TissueLyzer IIに置き、14Hzで5分間振とうした。
5.エマルションをVWR 96−well PCRプレート(83007−374)のウェルに分注した(ウェル当たり、160μLのエマルションを添加した)。
6.遠心管を、以下のプログラムを用いてサーモサイクルを行った:
1.PCRプレートの内容物を1.5mLの微小遠心管(VWR 20170−650)に移した(遠心管当たり、0.5mL以下のエマルション量)。
2.100μLの1μM emB_T7bridgefreeIsceI_2プライマーを各遠心管に添加した。
3.遠心管にイソブタノールを満たし、密封して、混合するためにしっかりと振とうした。
4.遠心管を14,000rpmで1分間遠心した。
5.遠心管を磁気ストライプ上に置き、ビーズを遠心管の側面に引き寄せて、次いで、できるだけ多量の上清を吸引し、沈殿ビーズは遠心管に残した。
6.1mLのイソブタノールを添加し、残留した油/エマルションがイソブタノールに分散されるまで、ピペッティングにより上下させて良く混合した。
7.磁気ストライプ上に遠心管を置き、遠心管の側面にビーズを引き寄せ、次いで、イソブタノールを吸引した。磁石上でビーズを集める時間を考慮し、最初に上清を吸引した遠心管に、他の遠心管の全量を移して混合させ、次いで上清を吸引し、それを繰り返すことにより、すべての遠心管のビーズを1本の遠心管へと混合した。
8.1mLの新鮮なイソブタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
9.イソブタノールを吸引した。
10.1mLの100%エタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
11.エタノールを吸引した。
12.工程10と工程11を繰り返した。
13.1mLの70%エタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
14.エタノールを吸引した。
15.工程13と工程14を繰り返した。
16.1mLのPBSを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
17.PBSを吸引した。
18.工程16と工程17を繰り返した。
を、他のRNAPプロモーター配列と置き換えることにより、他のRNAPを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばNt.BbvCIの「CCT CAG C」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ(たとえば、Nt.BbvCI)及び鎖置換(strand−displacing)DNAP(たとえばKlenowexo−)を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
により、約3億8700万個の固有バーコードが得られる。たとえば1000万個の細胞をバーコード化するために本バーコードライブラリーを用いたとしても、用いられる固有バーコードは2.5%のみである。大部分のバーコードは互いに十分に隔たりがあるため、PCRエラー及び配列解析エラーに関わらず、次世代シークエンスのバーコード配列のリードのほとんどが互いに(破棄されるリードの一部とともに)容易に識別化される。
本実施例において、図16に記載されるように反応が行われた(1つのS1、1つのW、及び1つのS2のバーコード配列のみを用いた点を除く)。したがって、異なるS1配列に連結されたビーズのプールは行われず、同様に、S1オリゴにW配列を付加するためのポリメラーゼ伸長反応後に、ビーズはプールされなかった。
1.ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
2.M270ビーズ(Life Technologies)を磁石上に3分間置いた。
3.上清を各チューブから取り除き、0.5xのBind/Wash Buffer(BWB;1M NaCl、5mM トリス、0.5mM EDTA)(1x量)に再懸濁した。
4.工程4を2回以上繰り返し、次いで、BWBに最終的に再懸濁した。
5.10μMのS1−オリゴをビーズに添加し、15分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
6.インキュベーションの後、BWB緩衝液を用いてビーズを3回洗浄した。
7.0.01%アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを4℃で保存した。
8.10mMのトリスを用いて、使用する前に3回ビーズを洗浄した。
S2−オリゴ−aは、S1+w−aビーズとともに用いて、S2−オリゴ−bは、S1+w−bビーズとともに用いた。10分間、60℃でインキュベートした後、37℃までゆっくりと冷却した。2時間、37℃、800rpmで振とうさせながらインキュベートした。次いで、反応物を室温まで冷却させた。
次いで、以下を添加した:
反応物を3時間、25℃、800rpmで振とうしながらインキュベートした。毎時間ごとに、1μLのdNTPを用いて反応物をリフレッシュさせた。
を、他のRNAPプロモーター配列と置き換えることにより、他のRNAPを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばNt.BbvCIの「CCT CAG C」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ(たとえば、Nt.BbvCI)及び鎖置換(strand−displacing)DNAP(たとえばKlenowexo−)を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
本実施例において、ビーズに連結されない水性バーコードアダプター鋳型を合成し、本発明方法の広範な応用性を示す。
リアクションミックスは以下のように調整した:
1.次いで、反応物をプールし、メーカーの説明書に従い、Zymo Research RNA Clean and Concentratorキットを用いて洗浄した。
2.Picogreen quantitationキット(Life Technologies)を用いてDNAを定量し、バーコードアダプター鋳型濃度を55ng/μLに調節した。
を、他のRNAPプロモーター配列と置き換えることにより、他のRNAPを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばNt.BbvCIの「CCT CAG C」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ(たとえば、Nt.BbvCI)及び鎖置換(strand−displacing)DNAP(たとえばKlenowexo−)を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
本実施例は、本発明方法が様々な異なる緩衝液中で使用可能であることを示すものである。バーコードアダプター鋳型は実施例4に記述されるように作製された。
1.200μLのTE0.1(10mM トリス pH 8.0、0.1mM EDTA)を各リアクションミックスに添加した。
2.200μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(Sigma)を各リアクションミックスに添加し、遠心前のGel Phase Lock tubes(5Prime)中でしっかりと振とうさせた。
3.Gel Phase Lock tubesを、3分間、14,000gで遠心し、上の水性分画をピペッティングでAmicon 100kDaカラム(Millipore)へと移し、3分間、14,000gで遠心した。
4.次いで、450μL TE(10mM トリス、pH 8.0、1mM EDTA)をAmiconカラムにピペッティングで入れ、3分間、14,000gで遠心した。
5.次いで、450μLの10mMトリス(pH8.0)をAmiconカラムにピペッティングで入れ、5分間、14,000gで遠心した。
6.Amiconカラムを新しい採集管へと転倒させ、2分間、1000gで遠心し、精製mRNA/ファーストストランドcDNA二本鎖を含有した溶出物を回収した。
本実施例は、本発明方法が、異なる塩濃度の様々な異なる緩衝液中で使用可能であることを示すものである。また、バーコードアダプター鋳型から生成された増幅RNAバーコードアダプターを使用すると、DNAバーコードアダプターを当該反応にただ添加するよりも良く機能する(すなわち、所望される増幅反応産物が得られる)ことから、RNAバーコードアダプターを用いた反応は、バックグラウンドが低いことが推測される(図4を参照)。バーコードアダプター鋳型は、上述の実施例4の通りに作製された。
上述のものを3分間、55℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
1.200μLのTE0.1(10mM トリス pH 8.0、0.1mM EDTA)を各リアクションミックスに添加した。
2.200μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(Sigma)を各リアクションミックスに添加し、遠心前のGel Phase Lock tubes(5Prime)中でしっかりと振とうさせた。
3.Gel Phase Lock tubesを、3分間、14,000gで遠心し、上の水性分画をピペッティングでAmicon 100kDaカラム(Millipore)へと移し、3分間、14,000gで遠心した。
4.次いで、450μL TE(10mM トリス、pH 8.0、1mM EDTA)をAmiconカラムにピペッティングで入れ、3分間、14,000gで遠心した。
5.次いで、450μLの10mMトリス(pH8.0)をAmiconカラムにピペッティングで入れ、5分間、14,000gで遠心した。
6.Amiconカラムを新しい採集管へと転倒させ、2分間、1000gで遠心し、精製mRNA/ファーストストランドcDNA二本鎖を含有した溶出物を回収した。
単分散エマルションを作製するためのデバイスを用いて、1つの細胞にバーコード化ビーズ及びバーコード化アッセイに必要な他の試薬を封入した。3つのDolomite P−Pumpに、フローセンサーを設置した(Dolomite 3200016、3200095、及び3200098)。第一のP−Pumpは、当該ラインを2つのインプットに分けるためのT−ジャンクションを組み込んだマイクロ流体管を介して、2−Reagent Droplet Chip(Dolomite 3200287)に直接、連結された。これは油のインプットラインとなった。他の2つのP−Pumpは、デバイスが操作されている間、試料冷却を維持するために用いられる氷の箱の周囲に巻き付くPEEK試料ループに、流体管を介して連結され、これらループの各々は、2−Reagent Droplet Chipに連結された。各試料ループはフロントエンドで4方向バルブを組み込み、試料がシリンジにより当該ループ内へとロードされるようにした。第一の試料ループは細胞が充てんされ、一方で、第二のループはRT/バーコード化/溶解ミックスが充てんされた。デバイス構成の例を図17〜19に示す。氷の箱は、使用前に氷を充てんした。
RT/水性バーコードミックスは以下のように調製した。
1.200μLのTE、400μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、800μLのクロロホルムを、遠心前のGel Phase Lock管にピペッティングで入れた。
2.各試料を、対応するGel Phase Lock管にピペッティングで入れた。
3.管を、3分間、14,000gで遠心した。
4.水層を、100kDaのAmiconチューブ(Millipore)にピペッティングで入れた。
5.管を、3分間、14,000gで遠心した。
6.450μLのTEを、当該Amiconチューブにピペッティングで入れた。
7.管を、3分間、14,000gで遠心した。
8.450μLの10mMトリスを、当該Amiconチューブにピペッティングで入れた。
9.管を、5分間、14,000gで遠心した。
10.Amiconチューブを、新しい採取管に転倒して置いた。
11.管を、2分間、1,000gで遠心した。
5μLのPCR産物をゲルで泳動した(図23)。κ及びλ軽鎖に相当するバンド、及びμ重鎖に相当するバンドは明確に確認された。B220+B細胞のほとんどがナイーブB細胞(IgM+である)であることが予測されたため、μ重鎖のみが増幅された。
本実施例では、実施例に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態について記述する。実施例7に記述されるドロップレットを作製するためのマイクロ流体デバイスを用いる(第一の試料ループが、細胞、及び実施例1、2、または3で作製されたバーコードアダプター鋳型ビーズの両方を含有した点が唯一の差異である)。
本実施例では、実施例に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態について記述する。実施例7に記述されるドロップレットを作製するマイクロ流体デバイスを用いる(第一の試料ループが、細胞、及び実施例1、2、または3で作製されたバーコードアダプター鋳型ビーズの両方を含有した点が唯一の差異である)。本実施例において、バーコードアダプター鋳型ビーズは、T7 RNAPプロモーター配列ではなく、5'Nt.BbvCIニッキングエンドヌクレアーゼ配列を含有し、それにより、DNAポリメラーゼによるバーコードアダプターの増幅が可能となる。
本実施例は、実施例に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態について記述する。図1の組成を有するバーコードアダプター鋳型を、ベンダー(たとえば、IDT)から、二本鎖オリゴとして合成する。各固有バーコードアダプター鋳型を、異なる保管容器中に保管し、バーコード配列の混合、または相互汚染を防ぐ。活性化B細胞(形質芽細胞)は、FACS Aria II(Becton Dickenson)を用いて、96ウェルプレートのすべてのウェルへ、10μLの溶解緩衝液中にソートされた単一細胞である。各ウェルの緩衝液の組成は以下である。
1.400μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(Sigma)を添加し、遠心前のGel Phase Lock tubes(5Prime)中でしっかりと振とうさせる。
2.Gel Phase Lock tubesを、3分間、14,000gで遠心し、上の水性分画をピペッティングでAmicon 100kDaカラム(Millipore)へと移し、3分間、14,000gで遠心する。
3.Amiconカラムを通過する全水量を採取するために必要に応じて、工程2を繰り返す。
4.次いで、450μL TE(10mM トリス、pH 8.0、1mM EDTA)をAmiconカラムにピペッティングで入れ、3分間、14,000gで遠心する。
5.次いで、450μLの10mMトリス(pH8.0)をAmiconカラムにピペッティングで入れ、5分間、14,000gで遠心する。
6.Amiconカラムを新しい採集管へと転倒させ、2分間、1000gで遠心し、精製mRNA/ファーストストランドcDNA二本鎖を含有した溶出物を回収する。
以下に記述される方法を用いて、各ビーズに固有バーコードアダプター鋳型を付加するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が行われるエマルションPCRを用いて、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製した(図15を参照)。
1.ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
2.1mLのM270ビーズ(およそ2x109個のビーズ)を3つの1.5mLマイクロチューブの各々に入れ、トータルで3mLとした。
3.磁石上に3分間置いた。
4.上清を各チューブから取り除き、1mL(1x量)のBind/Wash Buffer(BWB;1M NaCl、5mM トリス、0.5mM EDTA)に再懸濁した。
5.工程4を2回以上繰り返し、次いで、540μL量のBWBに最終的に再懸濁した。
6.100μMのemB_T7bridge2を60μL、ビーズに添加し、15分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
7.インキュベーションの後、ビーズを1mLのBWB緩衝液を用いて3回洗浄し、1つの試験管に混合した。
8.0.01%アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを4℃で保存した。
9.10mMのトリスを用いて、使用する前に3回ビーズを洗浄した。
1.以下のPCRミックス(総量で3mL)を、3つの1.5mL微小遠心管(VWR Cat. No. 20170−650)中で調製した。
2.油−界面活性剤混合物を調製した(総量20mL)。
a.ミネラルオイル(Sigma) 18.4mL
b.EM90(Evonik) 1.6mL
3.800μLの油−界面活性剤混合物、及び200μLのPCRミックスを、12個のAxygen 2.0mL Maxymum Recovery円錐底微小遠心管(MCT−200−L−C)の各々で混合した。管を密封し、3秒間振とうした。
4.管をQiagen TissueLyzer IIに置き、14Hzで5分間振とうした。
5.エマルションをVWR 96−well PCRプレート(83007−374)のウェルに分注した(ウェル当たり、160μLのエマルションを添加した)。
6.管を、以下のプログラムを用いてサーモサイクルを行った。
1.PCRプレートの内容物を1.5mLの微小遠心管(VWR 20170−650)に移した(遠心管当たり、0.5mL以下のエマルション量)。
2.100μLの1μM emB_T7bridgefreeIsceI_2プライマーを各遠心管に添加した。
3.管にイソブタノールを満たし、密封して、混合するためにしっかりと振とうした。
4.管を14,000rpmで1分間遠心した。
5.管を磁気ストライプ上に置き、ビーズを遠心管の側面に引き寄せて、次いで、できるだけ多量の上清を吸引し、沈殿ビーズは管に残した。
6.1mLのイソブタノールを添加し、残留した油/エマルションがイソブタノールに分散されるまで、ピペッティングにより上下させて良く混合した。
7.磁気ストライプ上に管を置き、管の側面にビーズを引き寄せ、次いで、イソブタノールを吸引した。磁石上でビーズを集める時間を考慮し、最初に上清を吸引した管に、他の管の全量を移して混合させ、次いで上清を吸引し、それを繰り返すことにより、すべての管のビーズを1本の遠心管へと混合した。
8.1mLの新鮮なイソブタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
9.イソブタノールを吸引した。
10.1mLの100%エタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
11.エタノールを吸引した。
12.工程10と工程11を繰り返した。
13.1mLの70%エタノールを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
14.エタノールを吸引した。
15.工程13と工程14を繰り返した。
16.1mLのPBSを添加し、よく混合し、60秒間置いた。
17.PBSを吸引した。
18.工程16と工程17を繰り返した。
1.Phase lock管(5Prime)を遠心し、ゲルを底に押し下げた。
2.試料、及び200μL TE緩衝液、400μLフェノールクロロホルム混合液、800μLクロロホルムを、各phase lock管に添加した。
3.管を14,000gで3分間、遠心した。
4.水層を第二の遠心前のphase lock管へと移し、等量のフェノールクロロホルムを加えた。
5.管を14,000gで3分間、遠心した。
6.450μLのTEをAmiconフィルターに加えた。
7.工程5及び6を繰り返した。
8.450μLの10mMトリスをAmiconフィルターに加えた。
9.工程5を繰り返した。
10.次いで、各フィルターユニットを新たな採集管に転倒させて置いた。
11.管を2分間、1000gで遠心し、清浄化された試料を採集管内へと集めた。
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーは、実施例11にあるように調製される(emB_BCbridgeISceI_2が、emB_BCbridgeISceI_Nで置き換えられ、emB_IsceI_RVが、emB_ISceI_RV_nで置き換えられている点を除く)。emB_ISceI_RV_nは、固有の分子識別子(UMI)を含有し、それにより、調製される際、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーは、固有試料バーコード、及びランダムH(A、C、Tヌクレオチド)オクトマー(octomer)UMIを各々有するビーズを含有し、異なるUMIで個々のmRNA分子をバーコード化する。
の配列を有するオリゴdT_nである点は異なる)。次いで、エマルションは、実施例11に記述されるように破壊される。
バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを、本実施例で合成した。
94℃で2分間、53℃で2時間、94℃で15秒間、53℃で30秒間、68℃で20秒間を7サイクル、次いで、68℃で1分間ののち、10℃で維持。
反応物は、Zymo DNAクリーンアップ及び濃縮キットを用いて清浄化され、Qubit(Life Technologies)を用いて濃度定量された。
凍結保存されたPBMCを溶解し、AIM V培地(Life Technologies)中で、一晩、300万個の細胞/mLの密度でインキュベートした。次いで、T細胞を、メーカーの説明書に従い、CD3マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いた磁気活性化細胞ソーティング(magnetic−activated cell sorting)(MACS)により単離した。簡潔に述べると、T細胞を10分間、300gで遠心した後、20% CD3マイクロビーズを含有するMACS緩衝液(2%ウシ胎児血清及び2mM EDTAの1X PBS溶液)中で、15分間、4℃で懸濁した。次いで、磁気標識されたT細胞を、磁気分離カラムを用いて分離し、次いで、1Xイオノマイシン、及び1Xホルボール12ミリスチン酸13酢酸(PMA)とともに、3時間、共刺激を行った。両刺激物質を含有する培地を取り除いた後、細胞を、抗凝集剤として1XのDNAse(Sigma)とともに15分間、インキュベートした。
バーコード化T細胞cDNAを、実施例14に記述されるように作製した。簡潔に述べると、PBMCを、1Xのイオノマイシン、及びPMA(AIM V培地溶液)を用いて、3時間、共刺激した。CD3、CD4、またはCD8を発現するT細胞を磁気標識し、MACSキット(Miltenyi Biotec)を用いて別々に単離し、ドロップレットデバイスを通して、バーコードアダプター鋳型ビーズとともに細胞を封入した(実施例13の通りに作製された)。細胞とバーコードの両方を含有するエマルションを、50℃で3分、及び42℃で3時間、逆転写した。次いで、フェノール/クロロホルム混合液を用いてエマルションを破壊し、Amicon100kDaカラム(Millipore)を用いて濃縮した。
ライブラリーPCRのサーモサイクル条件
バーコード化T細胞cDNAは、実施例15に記述されるように作製した。簡潔に述べると、PBMCを、1Xのイオノマイシン、及びPMA(AIM V培地溶液)を用いて、3時間、共刺激した。CD3、CD4、またはCD8を発現するT細胞を磁気標識し、MACSキット(Miltenyi Biotec)を用いて別々に単離し、ドロップレットデバイスを通した。細胞とバーコードの両方を含有するエマルションを、50℃で3分、及び42℃で3時間、実施例14の通りに逆転写した。次いで、フェノール/クロロホルム混合液を用いてエマルションを破壊し、Amicon100kDaカラム(Millipore)を用いて濃縮した。次いで、表25に列記される、たとえばCD4、CD8、及びインターフェロンγ(IFNγ)等のT細胞標的化サブセット遺伝子に対する特異的プライマーとともに、表21のサーモサイクル条件を用いて、異なるサイクル数のPCR1及びPCR2を行った。リアクションミックスは、以下のように調製した。
バーコード化T細胞cDNAは、実施例15に記述されるように作製した。簡潔に述べると、PBMCを、1Xのイオノマイシン、及びPMA(AIM V培地溶液)を用いて、3時間、共刺激した。CD3、CD4、またはCD8を発現するT細胞を磁気標識し、MACSキット(Miltenyi Biotec)を用いて別々に単離し、ドロップレットデバイスを通した。細胞とバーコードの両方を含有するエマルションを、50℃で3分、及び42℃で3時間、実施例14の通りに逆転写した。次いで、フェノール/クロロホルム混合液を用いてエマルションを破壊し、Amicon100kDaカラム(Millipore)を用いて濃縮した。1ラウンドのPCRを行い、全トランスクリプトームを増幅した。条件は以下である:
全トランスクリプトームPCR条件
サーモサイクル条件
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた、本発明の実施形態を記述するものである。細胞及びバーコードアダプター鋳型を共に反応容器に入れ、反応容器の大多数は、1つの細胞と1つの鋳型分子のみを有するか、またはたとえばドロップレット生成装置により、1つの細胞と1つのバーコードアダプター鋳型ビーズを有し、及び反応容器は、たとえば実施例14のような油中水ドロップレットである。バーコードアダプター配列は、固定配列、バーコード配列、任意選択的にUMI、及びオリゴ(dT)またはランダム配列もしくはセミランダム配列(それぞれ、表28において、バーコード_アダプター_5c_オリゴdT及びバーコード_アダプター_5c_ランダマー)もしくはその組み合わせのいずれかを含有する。鋳型スイッチオリゴ(TSO)は、固定配列、任意選択的にUMI、及びファーストストランドcDNA相補鎖(表28の5'アダプター)を含有する。
サーモサイクル条件
PCR1とPCR2のサーモサイクル条件
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測される結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。細胞及びバーコードアダプター鋳型を、反応容器に共に入れ、それにより、反応容器の大多数は、1つの細胞と1つの鋳型分子のみを有するか、または、たとえばドロップレット作製デバイスにより、1つの細胞と1つのバーコードアダプター鋳型ビーズを有し、当該反応容器は、たとえば実施例14のような油中水ドロップレットである。鋳型スイッチオリゴ(TSO)は、固定配列、任意選択的にUMI、及びファーストストランドcDNA相補鎖(表29の5'アダプター)を含有する。3'アダプター配列は、固定配列、任意選択的にUMI、及びオリゴ(dT)またはランダムもしくはセミランダム配列(それぞれ表29における、3'_アダプター_オリゴdT及び3'_アダプター_ランダマー)またはそれらの組み合わせのいずれかを含有する。
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測される結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。本実施例は、バーコードアダプター鋳型から作製されたバーコードアダプターが、PCRのリバースプライマーとして用いられている点を除き、実施例19と類似している。実施例19に記述されるように逆転写を行い、PCRにおいては、5'_PCR_プライマーがフォワードプライマーであり、3'_PCR_バーコード_アダプター_プライマーがバーコード_アダプター_鋳型から作製され、リバースプライマーとして用いられている(図12)。細胞及びバーコードアダプター鋳型ビーズを用いた逆転写反応を、50℃で3分間、次いで42℃で3時間行い、その後、以下の反応条件で標準的なPCRサイクル条件を行った。
本発明の実施形態において、反応に用いられるプライマーが特定のRNAに結合し、逆転写を開始することができるのであれば、反応容器中のすべてのRNAがバーコード化される。それゆえ、外来性に導入されたRNAもバーコード化されることができる。本実施例においては、in vitro転写を用いて作製されたRNAがバーコード化された。
PCR1、1ウェル当たり:
PCR1の産物を50倍希釈し、PCR2に用いた。
PCR2のウェル当たりの反応液:
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。実施例21に示されるように、外来性に導入されたRNAをバーコード化することができる。本実施例においては、バーコード化RNAを用いて、特定の細胞群を同定する。Spike−InDNAは、実施例21のとおりに作製される(SPIKEIN−FWが5'NH2修飾を有している点を除く)。それを、All−in−One Antibody−Oligonucleotide Conjugation Kit(Solulink)を用いて、抗CD4抗体に結合する。in vitro転写を用いてSpike−InDNAから作製されたRNAを、代わりに抗CD4抗体に結合してもよい。
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。本実施例においては、外来性に導入されたRNAがバーコード化され、抗原特異的B細胞を特定するために用いられる。Spike−InDNAは、実施例21のように作製される(SPIKEIN−FWが、5'NH2修飾を有する点は除く)。それを、All−in−One Antibody−Oligonucleotide Conjugation Kit(Solulink)を用いて、インフルエンザヘマグルチニン抗原に結合させる。in vitro転写を用いてSpike−InDNAから作製されたRNAが、代わりにヘマグルチニンに結合されてもよい。
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。本実施例においては、外来性に導入されたRNAがバーコード化され、抗原特異的B細胞を特定するために用いられる。Spike−InDNAは、実施例21のように作製される(SPIKEIN−FWが、5'NH2修飾を有する点は除く)。それを、All−in−One Antibody−Oligonucleotide Conjugation Kit(Solulink)を用いて、特定のペプチド−MHC抗原に結合させる。in vitro転写を用いてSpike−InDNAから作製されたRNAが、代わりにペプチド−MHC複合体に結合されてもよい。
Claims (51)
- 1つまたは複数の対象から得られた1つまたは複数の試料と関連づけられた複数のRNAを得ることであって、試料と関連づけられた前記RNAが別個の反応コンパートメント内に存在すること;
酵素反応を利用して生成されかつユニバーサルプライミング配列、バーコード配列及び結合部位を含むアダプター分子を、前記試料と関連づけられた前記RNAに付加すること;ならびに
前記バーコード配列を、前記試料と関連づけられた1つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込み、それにより関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させること
を含む、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドの生成方法であって、
前記アダプター分子が、鋳型分子を1つまたは複数の酵素と接触させることにより生成され、前記鋳型分子が、RNAポリメラーゼ(RNAP)プロモーターを含むDNA分子であり、前記1つまたは複数の酵素が、RNAポリメラーゼを含む、前記方法。 - 前記RNAPプロモーターが、T7、T3、及びSP6からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記鋳型分子が、固体担体に結合されており、
前記固体担体が、水溶液と接触しており、かつ
前記アダプター分子が、生成されると水溶液中に放出される、
請求項1に記載の方法。 - 前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加することが、前記水溶液を、前記RNAが存在している前記反応コンパートメントと混和することを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記水溶液が、1つの試料と関連づけられた前記RNAと同じ反応コンパートメント内に存在する、請求項3に記載の方法。
- 前記鋳型分子が、エンドヌクレアーゼ制限部位を含み、
前記1つまたは複数の酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、かつ
前記アダプター分子が、前記鋳型分子の一部を含み、前記鋳型分子が前記制限エンドヌクレアーゼと接触すると前記一部が生成されて前記水溶液中に放出される、請求項3に記載の方法。 - 前記固体担体が、ビーズ、クロマトグラフィー樹脂、マルチウェルプレートまたはマイクロ遠沈管である、請求項3に記載の方法。
- 前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加する前は、前記アダプター分子が溶液中で遊離している、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加することが、前記コンパートメントを、前記RNAが存在している反応コンパートメントと混和することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記RNAが存在している反応コンパートメント内で生成される、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記RNAが存在している反応コンパートメント内で生成されない、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素反応が、等温性反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプター分子が、固有分子識別子(UMI)配列をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプター分子が、RNA分子である、請求項1に記載の方法。
- 複数のcDNAを得るために、前記試料と関連づけられた前記RNAを逆転写することをさらに含み、RNAを逆転写することが、逆転写酵素及び第一鎖プライマーを用いてcDNAの第一鎖を合成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、MMLV H−逆転写酵素である、請求項15に記載の方法。
- 前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記RNAに付加することが、前記コンパートメントを、前記RNAが存在している前記反応コンパートメントと混和することを含む、請求項15に記載の方法。
- cDNAの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応コンパートメントと混和する前に合成される、請求項17に記載の方法。
- cDNAの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応コンパートメントと混和した後に合成される、請求項17に記載の方法。
- 前記試料と関連づけられた前記RNAを逆転写することが、前記RNAに付加された前記アダプター分子が生成されたのと同じ反応コンパートメント内で起こる、請求項15に記載の方法。
- 前記反応コンパートメント内の緩衝液が、pH8.0〜pH8.8のpH範囲で、トリス、カリウムイオン、塩素イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、酢酸イオン、またはマグネシウムイオンのうちの少なくとも1種を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、鋳型切替え活性を有し、
前記試料と関連づけられたcDNAの少なくとも幾つかの第一鎖が、3'オーバーハングを含み、
前記アダプター分子の結合部位が、3'オーバーハングに相補的である3'部分を含み、かつ
前記バーコード配列が、前記試料と関連づけられたcDNAの第一鎖に組み込まれるように、前記アダプター分子が前記逆転写酵素のための鋳型として働く、
請求項15に記載の方法。 - 前記3'オーバーハングが、1つまたは複数のCヌクレオチドを含み、前記結合部位の3'部分が、1つまたは複数のGヌクレオチドを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記第一鎖プライマーが、ポリTトラクトを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、請求項22に記載の方法。
- 関心対象のポリヌクレオチドを生成させることが、第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて前記試料のcDNAの前記第一鎖を増幅することを含み、前記第二のプライマーが、前記第一鎖プライマーの少なくとも一部と同じ配列を有し、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、請求項15に記載の方法。
- 前記第一のプライマーが、前記アダプター分子である、請求項26に記載の方法。
- 前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、請求項26に記載の方法。
- 前記第一鎖プライマーが、ポリTトラクトを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記試料が、細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、血液細胞、免疫細胞、組織細胞、または腫瘍細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞が、B細胞またはT細胞である、請求項32に記載の方法。
- 前記試料と関連づけられた前記RNAが、mRNAを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記試料と関連づけられた前記RNAが、少なくとも1、3、10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000種のmRNAを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記試料と関連づけられた前記RNAが、細胞のトランスクリプトームの少なくとも一部を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記試料と関連づけられた前記RNAが、細胞の総RNAを含む、請求項31に記載の方法。
- 試料あたり少なくとも10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000種の関心対象のポリヌクレオチドが、生成される、請求項31に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の試料が、少なくとも10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000、または1,000,000個の細胞を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、請求項31に記載の方法。
- 前記試料を溶解緩衝液と接触させることをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 前記試料を核酸マーカーと接触させ、それにより前記核酸マーカーを前記試料のサブセットと結合させること;及び
前記試料を洗浄し、それにより前記核酸マーカーが結合していない試料から前記核酸マーカーを除去すること
をさらに含み、
前記サブセット内の試料については、前記試料と関連づけられたRNAに付加された前記アダプター分子もまた、前記核酸マーカーに付加され、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドが、前記核酸マーカーを用いて生成される、請求項31に記載の方法。 - 前記核酸マーカーが、分子標識に連結された核酸を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記分子標識が、抗体、抗原、またはタンパク質である、請求項43に記載の方法。
- 前記分子標識が、1つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する、請求項43に記載の方法。
- 前記核酸が、RNAである、請求項43に記載の方法。
- 前記核酸が、DNAである、請求項43に記載の方法。
- 前記DNAが、RNAPプロモーターを含む、請求項47に記載の方法。
- 前記試料が、第一の核酸マーカー及び第二の核酸マーカーと接触しており、
前記第一の核酸マーカーが、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、
前記第二の核酸マーカーが、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含み、
前記第一の核酸及び第二の核酸が、異なる配列領域を含み、かつ
前記第一の分子標識と第二の分子標識が異なっている、
請求項43〜48のいずれか1項に記載の方法。 - 前記1つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の試料が、少なくとも3、10、30、または100種の異なる対象から得られる、請求項1に記載の方法。
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