KR20190052084A - 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 그것의 사용 - Google Patents

친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 그것의 사용 Download PDF

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프랑수아 비그뉴트
랭햄 아드리안 브릭스
스테픈 제이. 골드플레스
브라이언 제이. 벨몬트
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에이비비트로, 엘엘씨
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Abstract

친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 단일 세포 특성화를 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 단일 세포 특성화를 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다.

Description

친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 그것의 사용
교차-참조
본 출원은 2016년 9월 24일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/053598 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
내인성으로 발현되고 원형질막에 위치한 풍부한 특정 일련의 단백질에 의해 많은 세포 유형이 확인되고 분류될 수 있다. 이 현상은 면역 표현형 분석 (immunophenotyping)으로 알려진 공정을 사용한 세포의 연구를 가능하게 하는데, 이 연구에서 세포는 세포의 공지된 표면 단백질에 특이적인 형광-라벨링된 항체와 함께 인큐베이션되고 이것에 의해 결합된다. 유동 세포 분석법은 흔히 각각의 세포에 대한 표면-결합된 항체의 수준을 측정하는데 사용된다. 하지만, 유동 세포 분석법-기반 접근법은 동일한 실험에서 동시에 사용될 수 있는 형광단의 수에 의해 제한된다. 또한, 유동 세포 분석법-기반 접근법을 사용하여 동일한 실험에서 동시에 사용될 수 있는 형광단의 수는 스펙트럼 중첩에 의해 제한된다. 추가로, 유동 세포 분석법은 많은 생물학적으로 관련된 검정 및 후속적인 DNA 시퀀싱 (sequencing)에 적용될 수 없다.
따라서, 이러한 제한 없이 단일 세포를 특성화하는, 예를 들어, 면역 표현형 분석하는 방법이 필요하다. 유동 세포 분석법-기반 접근법과는 달리, 본원에서 기술된 방법은 서열 판독 부위를 사용하여 개개의 세포의 단백질을 분석하며, 동일한 실험에서 동시에 사용될 수 있는 형광단의 수 또는 그것들의 스펙트럼 중첩에 의해 제한되지 않는다. 또한, 본원에서 기술된 방법은 많은 생물학적으로 관련된 검정 및 후속적인 DNA 시퀀싱에 적용될 수 있다. 본원에서 기술된 방법은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 (예를 들어, 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트)를 이용한다. 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분이 특이적으로 결합하는 표면 항원에 대해 바코드화되는 Antigen ID (AID) 서열을 포함한다. 따라서, 본원에서 기술된 방법을 사용하여, 형광단에 대한 필요 없이 단일 세포의 항원 (예를 들어, 표면 단백질)이 분석될 수 있다. 예를 들어, 디스플레이되는 단일 세포의 표면 단백질은 Antigen ID 서열로부터 확인될 수 있다. 또 다른 예로서, 디스플레이되는 단일 세포의 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B 세포 수용체 (BCR)는 Antigen ID 서열로부터 확인될 수 있다. 일부 양태에서, 세포 표면 상에 디스플레이된 TCR 또는 BCR의 결합 친화성은 본원에서 기술된, 컨쥬게이션된 친화성-올리고뉴클레오타이드를 사용하여 결정될 수도 있다. 단일 세포의 표면 단백질 중 하나 이상이 단일 세포의 정체, 특징 또는 관련성을 정의하는데 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 방법의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 느린 세포 분류, 세포 분류와 관련된 표적 수율 감소, 제한된 수의 출력 스트림, 및 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 정량화된 성질, 예컨대 친화성에 상응하지 않는 선택된 빈 (bin)의 문제를 극복하는데 사용될 수 있다. 도시된 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 용기에서 테트라머 결합의 단일 세포 측정으로의 분류를 대체하거나 향상시킬 수 있다. 도시된 예시의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 TCR 쌍 서열, 클론 존재량, 및 상대적 테트라머 친화성을 동시에 획득하기 위해 본원에서 기술된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 테트라머의 펩타이드에 결합하는 TCR 쌍 서열을 동시에 획득하고, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 주요 조직 적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex; MHC)-펩타이드 복합체로의 TCR의 결합의 친화성을 결정하고, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 MHC-펩타이드 복합체에 대하여 높은 결합 친화성을 가진 TCR과 비교하여 낮은 결합 친화성을 가진 TCR을 구별하기 위해 본원에서 기술된 방법에 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 테트라머의 B-세포 수용체 항원에 결합하는 BCR 쌍 서열을 동시에 획득하고, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 B-세포 수용체 항원으로의 BCR의 결합의 친화성을 결정하고, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 B-세포 수용체 항원에 대하여 높은 결합 친화성을 가진 BCR과 비교하여 낮은 결합 친화성을 가진 BCR을 구별하기 위해 본원에서 기술된 방법에 사용될 수 있다.
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트로 용기 (예를 들어, 에멀젼)에서 세포를 특성화하는, 예를 들어, 면역 표현형 분석하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, 방법은 에멀젼-기반 단일 세포 분석과 호환 가능한 방식으로 세포의 서브세트를 확인하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 방법은 에멀젼-기반 단일 세포 분석과 호환 가능한 방식으로 항원에 특이적인 면역 세포를 확인하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 세포 분석 전에, 표면 단백질-특이적 항체가 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 컨쥬게이션된 항체의 표적-특이성에 고유한 서열 모티프 (motif)를 포함하도록 설계된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 컨쥬게이션된 테트라머의 표적-특이성에 고유한 서열 모티프를 포함하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분 (예를 들어, 항체 또는 테트라머)에 공유 결합으로 또는 비공유 결합으로 (예를 들어, 스트렙타비딘-항체에 대한 비오틴-올리고뉴클레오타이드) 컨쥬게이션될 수 있다.
방법은 혼합물 또는 용액에서 하나 이상의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 함께 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 미결합 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 제거하기 위해 세척될 수 있다. 이어서 세포는 용기, 예를 들어, 에멀젼에서 캡슐화된다. 세포는 용기 당 단일 세포의 밀도로 용기 내에 존재할 수 있다. 따라서, 용기 내의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 예를 들어, 액적 (droplet)은, 예를 들어, 특이적 항체-표면 단백질 상호작용을 통해 세포 표면에 결합된다. 방법은 친화성-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드에 용기-특이적 DNA 서열 (예를 들어, 고유한 용기 바코드)을 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 친화성-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드를 (예를 들어, DNA 바코드로) 바코드화하기 전에, 바코드화하는 동시에, 또는 바코드화한 후에 추가의 세포 DNA 또는 mRNA 분석, 표현형 측정, 기능성 테스트, 세포-분류 또는 다른 반응이 수행될 수 있다.
방법은 혼합물 또는 용액에서 하나 이상의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 함께 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 미결합 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 제거하기 위해 세척될 수 있다. 이어서 세포는 용기, 예를 들어, 에멀젼에서 캡슐화된다. 세포는 용기 당 단일 세포의 밀도로 용기 내에 존재할 수 있다. 따라서, 용기 내의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 예를 들어, 액적은, 예를 들어, 특이적 TCR-MHC-펩타이드 복합체 상호작용을 통해 또는 테트라머 상호작용의 특이적 BCR-B-세포 수용체 항원을 통해 세포 표면에 결합된다. 방법은 테트라머-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드에 용기-특이적 DNA 서열 (예를 들어, 고유한 용기 바코드)을 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 테트라머-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드를 (예를 들어, DNA 바코드로) 바코드화하기 전에, 바코드화하는 동시에, 또는 바코드화한 후에 추가의 세포 DNA 또는 mRNA 분석, 표현형 측정, 기능성 테스트, 세포-분류 또는 반응이 수행될 수 있다.
방법은, 예를 들어, 에멀젼 실험에 후속하여, 에멀젼으로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 추출된 핵산은 시퀀싱을 위해 제조되어 시퀀싱될 수도 있다 (예를 들어, 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여). 방법은 Antigen ID 서열 및 액적-특이적 바코드 서열 둘 다를 포함하는 용기로부터 폴리뉴클레오타이드 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다. Antigen ID 서열은 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 항체에 의해 결합된 특이적 세포 표면 단백질을 한정할 수 있다. Antigen ID 서열은 특정 세포 표면 단백질에 결합하는 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 항체의 특이적 항체를 한정할 수 있다. Antigen ID 서열은 특정 세포 TCR에 결합하는 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 테트라머의 특이적 MHC-펩타이드 복합체를 한정할 수 있다. Antigen ID 서열은 특정 세포 BCR에 결합하는 올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이션된 테트라머의 특이적 B-세포 수용체 항원을 한정할 수 있다. 따라서, Antigen ID 서열은 분석된 세포가 어느 표면 단백질을 발현하는지 나타낼 수 있다. 단일 세포를 숨기고 있는 용기에서, 공유된 액적-특이적 바코드 서열을 포함하는 모든 서열은 단일 세포와 관련이 있다. 그러므로, 단일 세포는 정체, 특징 또는 관련성을 정의하는데 사용될 수 있는 일련의 표면 단백질을 디스플레이하는 것으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 단일 세포는 MHC-펩타이드 복합체에 대한 특정 친화성을 가진 TCR을 디스플레이하는 것으로 분석될 수 있거나 (여기서 상기 TCR의 서열이 또한 확인될 수 있다) 또는 단일 세포테트러마의 B 세포 수용체 항원에 대한 특정 친화성을 가진 BCR을 디스플레이하는 것으로 분석될 수 있다 (여기서 상기 BCR의 서열이 또한 확인될 수 있다).
한 양태에서, 복수의 용기에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 반응은 복수의 용기 중 한 용기에서 분리된 단일 세포의 표적 항원에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 것을 포함한다. 한 양태에서, 복수의 용기에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 반응은 복수의 용기 중 한 용기에서 분리된 단일 세포의 TCR에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 것을 포함한다. 한 양태에서, 복수의 용기에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 반응은 복수의 용기 중 한 용기에서 분리된 단일 세포의 BCR에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 것을 포함한다.
한 양태에서, 복수의 용기 중 한 용기에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공되며, 반응은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분에 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 것을 포함하는데, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 용기 중 상기 용기에서 세포에 의해 발현된 표적 항원에 결합한다. 한 양태에서, 복수의 용기 중 한 용기에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공되며, 반응은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분에 용기 바코드 서열를 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 것을 포함하는데, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 용기 중 상기 용기에서 세포에 의해 발현된 TCR에 결합한다. 한 양태에서, 복수의 용기 중 한 용기에서 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공되며, 반응은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분에 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 것을 포함하는데, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 용기 중 상기 용기에서 세포에 의해 발현된 BCR에 결합한다.
일부 구체예에서, 세포는 용기 내에 포함된 단일 세포이다. 일부 구체예에서, 용기는 복수의 용기 중 둘 이상의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기는 복수의 용기의 각각의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 반응은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기에서 일어난다. 일부 구체예에서, 각각의 용기 내의 세포는 동일한 샘플로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 둘 이상의 복수의 용기의 제1 복수의 용기 중 한 용기 내의 세포는 둘 이상의 복수의 용기의 제2 복수의 용기 중 한 용기 내의 세포와 동일한 샘플로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 부분은 항원 식별 서열 (antigen identification sequence; AID)을 포함한다. 일부 구체예에서, AID는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 표적 항원 또는 친화성 부분에 대해 바코드화된다. 일부 구체예에서, AID는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 공지된 특이성을 가진 TCR 또는 MHC-펩타이드 복합체에 대해 바코드화된다. 일부 구체예에서, AID는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 공지된 특이성을 가진 BCR 또는 B-세포 수용체 항원에 대해 바코드화된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 표적 항원 또는 친화성 부분에 대해 바코드화된 항원 식별 서열 (AID)을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 공지된 특이성을 가진 TCR 또는 MHC-펩타이드 복합체에 대해 바코드화된 항원 식별 서열 (AID)을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 식별 서열 (AID)은 공지된 서열이다.
일부 구체예에서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 용기 내 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘 (amplicon)을 시퀀싱하여 서열 정보를 획득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 서열 정보에 기초하여 단일 세포의 특징을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 서열 정보는 항원 식별 (AID) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 서열 정보에 기초하여 단일 세포의 특징을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 특징은 표현형이다. 일부 구체예에서, 표현형은 면역 표현형이다. 일부 구체예에서, 특징은 친화성이다. 일부 구체예에서 친화성은 MHC-펩타이드 복합체의 것이다. 일부 구체예에서 친화성은 MHC-펩타이드 복합체의 상대적인 친화성 (예를 들어, 낮은 결합 친화성을 가진 TCR과 비교하여 높은 결합 친화성을 가진 TCR)이다. 일부 구체예에서 친화성은 BCR의 것이다. 일부 구체예에서 친화성은 BCR의 상대적인 친화성 (예를 들어, 낮은 결합 친화성을 가진 BCR과 비교하여 높은 결합 친화성을 가진 BCR)이다.
일부 구체예에서, 방법은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 단일 세포를 포함하는 복수의 세포에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 단일 세포를 포함하는 복수의 세포에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 접촉 단계는 단일 세포가 용기에서 분리되기 전이다. 일부 구체예에서, 방법은 접촉 단계 이후에 복수의 세포를 세척하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 용기는 표적 항원에 결합되지 않은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 용기는 TCR에 결합되지 않은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 용기는 BCR에 결합되지 않은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 방법은 용기에서 단일 세포를 분리하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 분리 단계 전에 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 결합된다.
일부 구체예에서, 방법은 단일 세포를 용해시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 용해 단계는 단일 세포가 용기에서 분리된 후이다.
일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 미분류 세포이다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 분류된 세포이다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 부화된 (enriched) 세포이다.
일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기 내의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘의 용기 바코드 서열은 복수의 용기 중 제2 용기 내의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘의 용기 바코드 서열과 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기 내의 각각의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘의 용기 바코드 서열은 동일한 용기 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기 내의 각각의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 및 그것의 앰플리콘의 용기 바코드 서열은 복수의 용기 중 임의의 다른 단일 용기 내의 각각의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 및 앰플리콘의 용기 바코드 서열에 대해 고유하다.
일부 구체예에서, 방법은 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 단일 세포의 세포 폴리뉴클레오타이드에 부착시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 부착하는 것과 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 단일 세포의 세포 폴리뉴클레오타이드에 부착하는 것은 동시에 수행된다.
일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 것과 세포 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 것은 동시에 수행된다.
일부 구체예에서, 세포 폴리뉴클레오타이드의 용기 바코드 서열 및 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드 서열은 동일하다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기로부터 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘을 모집하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기로부터 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘 및 세포 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘을 모집하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 모집 단계는 시퀀싱 전이다.
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 상이한 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 고유한 항원 식별 (AID) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 단일 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 대해 바코드화된 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 각각의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 고유한 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 기술된 방법 및 컨쥬게이트는 복수의 상이한 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 고유한 항원 식별 (AID) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 복수의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 단일 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 대해 바코드화된 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 각각의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 고유한 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열을 포함하고 부착 단계는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 융합 서열에 부착시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 결합 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 불변 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드, 그것의 보체, 그것의 증폭된 생성물, 또는 이것들의 조합을 시퀀싱하여, 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 하나 이상의 제1 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위와 하나 이상의 제2 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열을 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 항원 식별 (AID) 서열을 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열을 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 분석 단계는 하나 이상의 용기 바코드 서열, 하나 이상의 AID 서열, 하나 이상의 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열, 또는 이것들의 조합의 빈도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 분석 단계는 비교하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 항원 식별 (AID) 서열과 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 친화성 분자 바코드 (AMB) 서열을 비교하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 세포 폴리뉴클레오타이드, 그것의 보체, 그것의 증폭된 생성물, 또는 이것들의 조합을 시퀀싱하여, 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위와 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열과 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열을 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열을 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 분자 바코드 서열을 분석하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 분석 단계 또는 비교 단계에 기초하여 세포의 특징을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위에 기초하여 항체, BCR, 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 세포 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위에 기초하여 항체, BCR, 또는 TCR을 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 분석 단계 또는 비교 단계에 기초하여 TCR 또는 BCR에 대한 테트라머의 친화성 및/또는 테트라머에 대한 TCR 또는 BCR의 친화성을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 시퀀싱 판독 부위의 수는 TCR 또는 BCR에 대한 테트라머의 친화성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 단일 세포에 대하여 많은 수의 서열 판독 부위는 적은 수의 시퀀싱 판독 부위를 가진 단일 세포와 비교하여 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및/또는 TCR 또는 BCR의 더 높은 결합 친화성을 나타낸다. 테트라머의 결합 친화성은 테트라머의 MHC-펩타이드 복합체 또는 테트라머의 B-세포 수용체 항원의 결합을 나타낼 수 있다.
일부 구체예에서, 테트라머 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트데 대한 TCR 또는 BCR의 친화성을 결정하는 방법은 하나 또는 복수의 테트라머 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 존재 하에 하나 또는 복수의 T 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는데, 복수의 테트라머 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 각각 고유한 식별 바코드를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 방법은 본원에서 기술된 바와 같이 각각의 세포-테트라머 복합체를 분리하고 테트라머 복합체에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 상보성 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 각각의 고유한 바코드 서열에 대한 시퀀싱 중에 얻어진 시퀀싱 판독 부위를 계수하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 시퀀싱 정보를 분석하거나 또는 시퀀싱 정보와 표준 곡선을 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 시퀀싱, 또는 시퀀싱 정보의 분석 또는 비교에 기초하여, 테트라머에 대한 TCR 또는 BCR, 또는 TCR 또는 BCR에 대한 테트라머의 친화성을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드와 세포 폴리뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 용기 내의 동일한 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 증폭 생성물이다.
일부 구체예에서, 세포 폴리뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 증폭 생성물이다.
일부 구체예에서, 용기는 고체 지지체를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기는 고체 지지체를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 각각의 용기는 단일 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기는 웰, 에멀젼, 또는 액적이다. 일부 구체예에서, 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 결합되지 않는다. 일부 구체예에서, 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 결합된다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 분자 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 중 한 분자 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 분자 바코드 서열을 세포 폴리뉴클레오타이드에 부착시키는 단계를 더 포함하며, 분자 바코드 서열은 단일 세포 폴리뉴클레오타이드 분자 및 그것의 앰플리콘에 대해 바코드화된다.
일부 구체예에서, 부착 단계는 용기 폴리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 부착 단계는 용기 폴리뉴클레오타이드를 효소를 이용하여 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 부착 단계는 용기 폴리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 혼성화시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 부착 단계는 올리고뉴클레오타이드를 연장시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 부착 단계는 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA이다.
일부 구체예에서, 세포 폴리뉴클레오타이드는 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 가변 영역 서열을 포함하는 자생 (native) 사슬 서열을 짝짓는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 세포 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 구체예에서, 세포 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 mRNA이다.
일부 구체예에서, 단일 세포는 B-세포이다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 T-세포이다.
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 단일 세포의 세포외 항원에 결합한다. 일부 구체예에서, 단일 세포의 세포외 항원은 면역 세포에 특이적인 항원이다. 일부 구체예에서, 단일 세포의 세포외 항원은 T-세포에 특이적인 항원이다. 일부 구체예에서, 세포외 항원은 CD4이다. 일부 구체예에서, 세포외 항원은 CD8이다. 일부 구체예에서, 단일 세포의 세포외 항원은 B-세포에 특이적인 항원이다. 일부 구체예에서, 세포외 항원은 면역글로불린이다.
일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 항체 또는 그것의 단편이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 펩타이드이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 단백질이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 앱타머이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 소분자이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 약물이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 항원 제공 세포 (APC)이다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC-펩타이드 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)를 포함한다. 일부 구체예에서, MHC는 가용성 및/또는 멀티머 (예를 들어, 테트라머) 형태이다. 일부 구체예에서, MHC는 펩타이드에 결합된다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 합성 펩타이드이다. 일부 구체예에서, MHC는, 예를 들어, 단일 세포의 T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 TCR-유사 결합 분자, 예컨대 TCR-유사 항체 또는 면역글로불린 또는 키메라 항원 수용체에 결합한다.
일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC-펩타이드 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)를 가용성 및/또는 멀티머 (예를 들어, 테트라머) 형태로 포함한다. 일부 구체예에서, MHC는 스트렙타비딘 단백질에 결합되며, 이것은 중심 비오틴 단백질과 복합체를 형성하여, 최대 4개의 MHC-스트렙타비딘 복합체가 멀티머 복합체로 결합되게 한다 (예를 들어, 도 10A에서 도시됨). 일부 구체예에서, MHC는 펩타이드와 회합된다. 일부 구체예에서, MHC는 공유 또는 비-공유 결합을 통해 펩타이드와 회합된다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 합성 펩타이드이다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 합성 펩타이드이다. 일부 구체예에서, MHC는, 예를 들어, 단일 세포의 TCR 및/또는 TCR-유사 결합 분자, 예컨대 TCR-유사 항체 또는 면역글로불린 또는 키메라 항원 수용체에 결합한다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 B-세포 수용체 항원을 가용성 및/또는 멀티머 (예를 들어, 테트라머) 형태로 포함한다. 일부 구체예에서, B-세포 수용체 항원은 이전에 세포 또는 대상체에게 투여되었다. 일부 구체예에서, B-세포 수용체 항원은, 예를 들어, 단일 세포의 BCR 및/또는 BCR-유사 결합 분자, 예컨대 키메라 항원 수용체에 결합한다.
일부 구체예에서, 친화성 부분은 항원-인식 분자 및/또는 면역수용체, 예컨대 항체 또는 면역글로불린 또는 그것의 일부 또는 융합체, 조작된 면역수용체, 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 TCR에 특이적으로 결합한다. 이러한 일부 구체예에서, 친화성 부분은 항체 또는 수용체, 예컨대 CAR에 의해 인식되는 항원 또는 그것의 에피토프 또는 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 면역수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 수용체의 가변 및/또는 항원-결합 부분, 예컨대 이디오토프에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 친화성 분자는 항-이디오타입 항체 또는 그것의 단편이다.
일부 구체예에서, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 또는 그것의 기능적 또는 결합 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 MHC의 멀티머, 선택적으로 MHC의 테트라머를 포함한다. 일부 구체예에서, MHC는 가용성 형태이다. 일부 구체예에서, MHC는 펩타이드에 결합되고 및/또는 MHC의 그루브 (groove) 내에 펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 합성 펩타이드이다. 일부 구체예에서, MHC는 단일 세포의 T-세포 수용체 (TCR)에 결합한다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 항체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)에 결합하는 펩타이드를 포함하고 및/또는 표적은 항체 또는 CAR이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 항체 또는 키메라 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 항원 또는 에피토프이거나 또는 이것들을 포함하고 및/또는 그것에 특이적으로 결합하는 항체, 선택적으로 그것의 항원 결합 부분에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체를 포함한다.
한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 제공되며, 각각의 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 세포, 단일 세포의 표적 항원에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 및 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 부착된다.
한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 제공되며, 각각의 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 세포, 단일 세포의 TCR 또는 BCR에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 및 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 제공되며, 각각의 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 용해된 세포, 및 단일 용해된 세포의 표적 항원에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하며, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드는 용기 바코드 서열을 포함하고, 단일 용해된 세포의 세포 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기 바코드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 제공되며, 각각의 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 용해된 세포, 및 단일 용해된 세포의 TCR 또는 BCR에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하고; 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드는 용기 바코드 서열을 포함하고, 단일 용해된 세포의 세포 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기 바코드 서열을 포함한다. 한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되며, 복수의 용기 중 한 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 세포, 및 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 용기는 단일 세포의 표적 항원에 결합하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 또는 그것으로부터의 올리고뉴클레오타이드 부분을 더 포함한다.
한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되며, 복수의 용기 중 한 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 세포, 및 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 용기는 단일 세포의 TCR 또는 BCR에 결합하는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 또는 그것의 올리고뉴클레오타이드 부분을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 반응은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기에서 일어난다. 일부 구체예에서, 용기는 복수의 용기의 각각의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 둘 이상의 복수의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 각각의 용기 내의 세포는 동일한 샘플로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 둘 이상의 복수의 용기의 제1 복수의 용기 중 한 용기 내의 세포는 둘 이상의 복수의 용기의 제2 복수의 용기 중 한 용기 내의 세포와 동일한 샘플로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 일부 구체예에서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 용해된다.
한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되며, 복수의 용기 중 한 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 용해된 세포, 및 단일 용해된 세포의 표적 항원에 결합하는 친화성 부분을 포함하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 또는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분을 포함하고, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 용기 바코드 서열을 포함하고, 단일 용해된 세포의 세포 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기 바코드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 복수의 용기를 포함하는 조성물이 본원에서 제공되며, 복수의 용기 중 한 용기는 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 용해된 세포, 및 단일 용해된 세포의 TCR 또는 BCR에 결합하는 친화성 부분을 포함하는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분을 포함하고, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 용기 바코드 서열을 포함하고, 단일 용해된 세포의 세포 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기 바코드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 공지된 서열인 제1 항원 식별 (AID) 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 컨테이너 (container); 공지된 서열이며 제1 AID 서열과는 상이한 제2 항원 식별 (AID) 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제2 컨테이너; 제1 올리고뉴클레오타이드를 제1 친화성 분자에 컨쥬게이션시킬 수 있는 시약 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 제2 친화성 분자에 컨쥬게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 하나 이상의 제3 컨테이너; 제1 올리고뉴클레오타이드를 제1 친화성 분자에 컨쥬게이션시키고 제2 올리고뉴클레오타이드를 제2 친화성 분자에 컨쥬게이션시키는 방법을 기술하는 설명서 세트를 포함하는 키트가 제공된다.
한 양태에서, 공지된 서열인 제1 항원 식별 (AID) 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 용기; 공지된 서열이며 제1 AID 서열과는 상이한 제2 항원 식별 (AID) 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제2 컨테이너; 제1 올리고뉴클레오타이드를 제1 테트라머에 컨쥬게이션시킬 수 있는 시약 및 제2 올리고뉴클레오타이드를 제2 테트라머에 컨쥬게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 하나 이상의 제3 컨테이너; 제1 올리고뉴클레오타이드를 제1 테트라머에 컨쥬게이션시키고 제2 올리고뉴클레오타이드를 제2 테트라머 분자에 컨쥬게이션시키는 방법을 기술하는 설명서 세트를 포함하는 키트가 제공된다.
한 양태에서, 공지된 서열인 항원 식별 (AID) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 컨테이너; 올리고뉴클레오타이드를 친화성 분자에 컨쥬게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 제2 컨테이너; 복수의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제3 컨테이너; 및 친화성 분자에 컨쥬게이션될 때 복수의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 방법을 기술하는 설명서 세트를 포함하는 키트가 제공된다.
한 양태에서, 공지된 서열인 항원 식별 (AID) 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 컨테이너; 올리고뉴클레오타이드를 테트라머에 컨쥬게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 제2 컨테이너; 복수의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제3 컨테이너; 및 테트라머에 컨쥬게이션될 때 복수의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 방법을 기술하는 설명서 세트를 포함하는 키트가 제공된다.
본원에서 개시된 방법 및 조성물은 종양 프로파일링에 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 환자 샘플에서 세포 표현형을 면역 레퍼토리와 결부시켜 종양 반응성 TCR을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 개시된 방법 및 조성물은 차용 (adoptive) 세포 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 분류되지 않은 T 세포의 유전자 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 제품 제조 및 치료 중에 T 세포 클론 정보 (TCR을 사용함)를 유전자 발현 패턴과 조합하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 차용 세포 요법 전에, 차용 세포 요법 과정 중에, 또는 차용 세포 요법 후에 환자로부터 얻어진 차용 전달된 세포를 추적하고, 특성화하고, 모니터링하고 및/또는 평가하는데 사용될 수 있다. 본원에서 개시된 방법 및 조성물은 공지된 표적에 대해 TCR을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 항원에 대해 고도로 반응하지만 불량하게 증식할 수 있는 고 친화성 클론을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 개시된 방법 및 조성물은 세포 샘플 다중화 (multiplexing)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 접촉된 모집된 세포 샘플을 포함하는 에멀젼이 다수의 샘플을 동시에 가공하면서 원래 세포 샘플을 확인하는데 사용될 수 있다.
본원에서 개시된 방법 및 조성물은 시퀀싱에 의한 다중화된 TCR 또는 BCR 친화성 측정에 사용될 수 있다. 본원에서 개시된 방법 및 조성물은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 테트라머에 대한 단일 세포의 TCR 또는 BCR의 결합 친화성을 정량화하는데 사용될 수 있다. 또한, 이 정량화는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 농도에 민감할 수 있으며, 여기서 결합 친화성 신호는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 농도에 의존적일 수도 있다 (예를 들어, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 농도의 감소는 결합 친화성 신호의 상응하는 감소를 유도한다). 추가로, 본원에서 개시된 방법 및 조성물은 항원 특이적 세포와 비-특이적 세포를 구별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 테트라머에 결합하는 TCR 또는 BCR을 가진 세포와 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 테트라머에 결합하지 않는 TCR 또는 BCR을 가진 세포를 구별하는 것이다. 또한, 본원에서 개시된 방법 및 조성물의 한 가지 이점은 유동 세포 분석 게이팅 (flow cytometry gating)을 사용하지 않고 항원 특이적 세포의 집단 (즉, 테트라머+ 세포)을 비-특이적 세포 (즉, 테트라머- 세포)와 구별하여 이 2개의 집단을 분리할 수 있는 능력이다. 종종, 유동 세포 분석 게이팅은 부정확할 수도 있으며 그러므로 각각의 집단의 세포의 손실 또는 세포의 잘못된 특성화를 일으킬 수 있는 유동 세포 분석법 플롯 상에서의 테트라머+ 집단과 테트라머- 집단의 분리에 기초한 집단 분리의 "최선 추정 (best guess)"일 수도 있다. 그에 반해, 본원에서 기술된 방법 및 조성물은 세포의 집단을 구별하기 위한 게이팅 기술에 의존하지 않지만, 대신에 샘플 내 각각의 세포의 결합 친화성을 개별적으로 정량화하는 고 처리량 방법일 수 있다. 또한, 본원에서 개시된 방법 및 조성물은 MHC-펩타이드에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 TCR을 가진 세포 (즉, 높은 바인더)와 MHC-펩타이드에 대해 낮은 결합 친화성을 갖는 TCR을 가진 세포 (즉, 낮은 바인더)를 구별하는 것뿐만 아니라 본원에서 기술된 고 처리량 방법을 사용하여 샘플 내의 높은 결합 친화성 세포와 낮은 결합 친화성 세포를 구별하는데 사용될 수 있다.
참조에 의한 통합
이 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각각의 공보, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 바와 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 기술된 새로운 특징들은 첨부된 청구범위에서 상세하게 제시된다. 본원에서 기술된 특징들 및 특징들의 이점에 대한 더 나은 이해는 본원에서 기술된 특징들의 원리가 이용되는 예시적인 실시예들을 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 얻어질 것이다:
도 1은 본원에서 기술된 방법의 용기의 개략도를 도시한다.
도 2는 항체에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오타이드 태그의 예시적인 디자인을 도시한다. 각각의 유색 블록은 완전한 올리고뉴클레오타이드 서열의 일부를 나타낸다. 융합 서열은 에멀젼 반응물 내에서 액적-특이적 DNA 바코드의 효소 부착에 사용된다. 단 하나의 가능한 서열의 배열이 도시되지만, 다른 배열도 기술된 방법과 호환 가능하다.
도 3A는 추가의 mRNA 및 단백질 표적을 가진 면역 수용체 서열의 예시적인 공동-캡쳐 (co-capture)를 도시한다. 표면 단백질 표적은 에멀젼 시퀀싱 전에 DNA-라벨링된 염색 항체와 함께 세포를 예비-인큐베이션함으로써 정량화된다.
도 3B는 건강한 인간 T-세포로부터 생성된 3,682개의 액적 바코드 TCR VαV β 쌍에 대한 예시적인 CD4 및 CD8 mRNA 및 단백질 측정을 도시한다.
도 3C는 mRNA와 단백질 측정 간의 예시적인 일치 (concordance)를 도시한다 (각 지점은 TCR VαV β 쌍에 결합된 액적 바코드이다).
도 3D는 에멀젼 내 미분류 T 세포로부터 CD4 및 CD8의 동시 mRNA 및 단백질 검출의 예시적인 표를 도시한다. 30,000개의 투입된 T 세포로부터 3,682개의 TCR 쌍이 회수되었다. mRNA 대 단백질에 의해 CD4+ 또는 CD8+로 불리는 TCR 쌍의 빈도가 행렬로서 나타난다 (분자 계수에 기초함, 주요 규칙).
도 3E는 CD4를 표적화하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 CD8을 표적화하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 45,870개 단일 세포 TCR 쌍의 예시적인 결과를 도시한다.
도 4는 CD4를 표적화하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 CD8을 표적화하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 예시적인 방법의 개략도를 도시한다.
도 5는 에멀젼에서 단일 면역 세포 바코드화 방법의 결과를 예시한다.
도 5A는 오일로 전달되어 시간당 8백만 개 초과의 액적으로 단분산 에멀젼을 생성하는, 세포 및 용해물/반응물 (LR) 믹스를 포함하는 2개의 수성 스트림의 예시적인 묘사이다.
도 5B는 용기 내의 세포가 용해되어 단일 반응에서 분자- 및 액적-특이적 바코드화되는 것을 나타내는 예시적인 묘사이다.
도 5C는 표적 mRNA가 역전사되고 범용 어댑터 서열로 주형 스위치-태그되는 것을 나타내는 예시적인 묘사이다. 이어서 처음에 액적 당 ~1개 분자로 희석된 액적 바코드 주형에 대해 PCR 증폭이 일어난다. 증폭된 바코드는 상보성 중첩 확장에 의해 주형-스위치된 cDNA에 부속된다. 추가의 라이브러리 가공 단계 및 고 처리량 시퀀싱 전에 생성물이 에멀젼으로부터 회수되고 RT 프라이머 상에서 비오틴을 사용하여 정제된다.
도 5D는 이중 바코드화가 시퀀싱 판독 부위의 그것의 분자 및 액적 기원으로의 클러스터화를 허용하여, 시퀀싱 오차 및 증폭 편향을 최소화하면서 자생 수용체 사슬 페어링을 재구성하는 것을 나타내는 예시적인 묘사이다.
도 6은 분리된 건강한 B-세포로부터의 BCR 회수 방법의 결과를 예시한다.
도 6A는 3백만 개의 B-세포가 0.2 세포/액적으로 에멀젼으로 전달되어 단일 세포를 포함하는 점유된 세포의 ~90%를 발생시키는 액적의 예시적인 묘사이다.
도 6B는 VHVL 페어링 정확도의 예시적인 묘사이다. 에멀젼 바코드화 및 시퀀싱 후, 단일-세포 액적의 데이터에 대하여 데이터가 부화되고, 확장된 클론들에서 쌍 일치를 사용하여 VHVL 페어링 정확도가 추정되었다.
도 6C는 액적 바코드 퍼센트 대 Ig 아이소타입의 예시적인 그래프이다. 259,368개의 필터링된 VHVL 쌍에 대해 중쇄 아이소타입 (각 액적 내에 가장 풍부한 아이소타입) 및 경쇄 유전자좌 활용이 나타난다.
도 6D는 6개의 독립적인 에멀젼 분획 각각에서 100개 최대 빈도 중쇄 클론의 순위 존재량에 대한 예시적인 그래프이다. 0.05% 전체 빈도가 표시된다.
도 6E는 각각의 액적 바코드 내에서 캡쳐된 mRNA의 수에 의해 추정된 세포 내에서 VH 대 VL 발현의 예시적인 그래프이다. 5,000개 포인트가 각각의 아이소타입에 대해 나타난다.
도 6F는 각각의 아이소타입 내에서 BCR 쌍과 밀도 분포에 대한 VH 대 VL 돌연변이 상관성의 예시적인 그래프이다.
도 7은 HIV 광범위 중화 항체 (bNAb) 발견 방법의 결과를 예시한다.
도 7A는 에멀젼으로 들어간 HIV 엘리트 컨트롤의 B-세포로부터 회수된 38,620개의 VHVL 쌍의 중쇄 아이소타입 분포의 예시적인 그래프이다. IgG 사슬의 드문 비율은 이미 공지된 bNAb ("PGT-유사")에 대해 잘 정렬된다.
도 7B는 공지된 bNAb (검은색)와 새로 회수된 것 (빨간색, 액적 바코드로 라벨링됨)의 완전한 VDJ 아미노산 서열의 계통수의 예시적인 묘사이며, 중쇄 (좌) 및 경쇄 (우)는 별개로 플롯팅된다. 잠재적으로 미스매치된 항체 PGT122 및 PGT123은 파란색이다.
도 7C는 PGT121의 대조군 스톡과 비교하여, HIV의 10개 균주에 대한 8개의 새로 발견된 PGT-유사 변이체의 중화 활성 (IC50, μg/mL)의 예시적인 묘사이다.
도 8은 난소 종양으로부터의 TIL의 특성화 방법으로부터의 결과를 예시한다.
도 8A는 난소 종양의 400,000개의 미분류된 해리된 세포가 에멀젼에 들어가고 BCR 및 TCR 쌍이 에멀젼 바코드화에 의해 동시에 회수되는 액적의 예시적인 묘사이다.
도 8B는 필터링 후 액적 바코드 내에서 관찰된 모든 VH/VL 및 Vα/Vβ 조합의 수를 나타내는 액적 바코드 대 수용체 사슬 조합의 예시적인 그래프이다.
도 8C는 회수된 BCR 쌍의 액적 바코드 퍼센트 대 중쇄 아이소타입 분포의 예시적인 그래프이다.
도 8D는 각각의 아이소타입 내에서 BCR 쌍과 밀도 분포에 대한 VH 대 VL 돌연변이 상관성의 예시적인 그래프이다.
도 8E는 TCR 쌍 및 BCR 쌍 전체 (위) 및 상이한 아이소타입 (아래)에 대해 캡쳐된 mRNA의 수에 대한 예시적인 그래프를 나타낸다.
도 8F는 6개의 독립적인 에멀젼 분획 각각에서 30개 최대 빈도 BCR 중쇄 클론 (위) 및 30개 최대 빈도 TCR 베타 사슬 클론의 순위 존재량을 나타내는 클론 분석의 예시적인 그래프를 나타낸다. 1% 및 10% 전체 빈도 수준이 나타난다.
도 9는 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 면역표현형 분석 방법을 예시한다.
도 9A는 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 결합된 단일 세포를 각각 포함하는 2개의 용기가 도시된다는 것을 나타내는 예시적인 개략도를 도시한다 (DB1 - 액적 바코드 1; DB2 - 액적 바코드 2; MB1 - 분자 바코드 1; MB2 - 분자 바코드 2; AID - Antigen ID 바코드; AMB1 - 항체 분자 바코드 1; AMB2 - 항체 분자 바코드 2).
도 9B는 도 9A의 용기의 용해된 세포의 RNA 분자를 각각 포함하는 2개의 용기를 나타내는 예시적인 개략도를 도시한다. RNA 분자는 역전사되고, 비-주형 뉴클레오타이드가 역전사에 의해 생성된 cDNA 분자의 단부에 추가된다. 분자 바코드가 역전사에 의해 생성된 cDNA 분자의 단부에 추가된 비-주형 뉴클레오타이드에 혼성화된다.
도 9C는 혼성화를 통해서 증폭되고 도 9B의 용기의 cDNA에 부착된 주형 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 각각 포함하는 2개의 용기를 나타내는 예시적인 개략도를 도시하며, cDNA는 확장된다 (위). 다음에, 확장된 cDNA가 증폭된다 (아래).
도 9D는 동일한 동일 RNA 서열에 부착된 동일한 분자 바코드 (MB)를 가진 RNA-MB-DB 종이 아마도 PCR 듀플리케이션의 결과임을 나타내는 예시적인 개략도를 도시한다. 동일한 동일 RNA 서열에 부착된 2개의 상이한 MB를 가진 RNA-MB-DB 종 (RNA1-MB1-DB 및 RNA1-MB2-DB)은 2개의 독립적인 RNA 분자 기원이며, PCR 듀플리케이션은 아니다.
도 9E는 동일한 액적 바코드 (DB) 및 Antigen ID 바코드 (AID)를 가진 서열에 부착된 동일한 항체 분자 바코드 (AMB)를 가진 DB-AMB-AID 종이 아마도 PCR 듀플리케이션의 결과임을 나타내는 예시적인 개략도를 도시한다. 동일한 액적 바코드 (DB) 및 Antigen ID 바코드 (AID)를 가진 서열에 부착된 2개의 상이한 AMB를 가진 DB1-AMB1-AID1 및 DB1-AMB2-AID1 종은 용기 내의 동일한 단일 세포에 부착된 동일한 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 각각 가진 2개의 독립적인 항체 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 2개의 독립적인 올리고뉴클레오타이드 분자이며, PCR 듀플리케이션은 아니다. 동일한 액적 바코드 (DB) 및 동일하거나 상이한 항체 분자 바코드 (AMB)를 가진 서열에 부착된 2개의 상이한 AID를 가진 DB1-AMBn-AID1 및 DB1-AMBn-AID2 종은 용기 내의 동일한 단일 세포에 부착된 2개의 독립적인 항체 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 2개의 독립적인 올리고뉴클레오타이드 분자이며, 여기서 항체 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자 중 하나는 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 가지고, 다른 항체 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 갖는다.
도 10A는 본원에서 기술된 방법의 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 개략도를 도시한다. 도시된 바와 같이, 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 MHC-펩타이드 친화성 부분을 포함할 수도 있다. 일부 양태에서, 이러한 컨쥬게이트는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트라고 불릴 수도 있다.
도 10B는 본원에서 기술된 방법의 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 개략도를 도시한다. 일부 양태에서, 이러한 컨쥬게이트는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트라고 불릴 수도 있다.
도 11A는 TCR에 결합하는 친화성 부분을 포함하는 본원에서 기술된 방법의 2개의 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한 결합 신호의 예시적인 그래프를 도시한다.
도 12A는 본원에서 기술된 방법의 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 결합된 T-세포의 예시적인 개략도를 도시한다.
도 12B는 본원에서 기술된 방법의 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 결합된 액적 내의 T-세포의 예시적인 개략도를 도시한다. 액적 내의 핵산은 액적-식별 서열로 표시되고 차세대 시퀀싱 라이브러리에 통합된다.
도 13은 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 테트라머에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오타이드 태그의 예시적인 개략도를 도시한다. 테트라머 ID는 테트라머 배치에 상응하고 단일 실험에서 펩타이드-MHC 표적과 같은 상이한 표적의 다중화를 허용하는 짧은 불변 DNA 서열이다. 분자 바코드는 결합된 테트라머의 정량화를 위해 분자 계수를 허용하는 축퇴성(degenerate) 서열이다.
도 14는 DNA-라벨링된 MHC 테트라머 시약 (테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트)으로부터 생성된 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 개략도를 도시한다. 한 구체예에서, Cy5-결합된 DNA 올리고뉴클레오타이드는 합성되고 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서, 비-형광 DNA 올리고뉴클레오타이드는 APC-스트렙타비딘에 컨쥬게이션된다. 한 구체예에서, 비-형광 DNA 올리고뉴클레오타이드와 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘의 혼합물은 활성화된 APC에 컨쥬게이션된다.
도 15는 클릭 화학법(click-chemistry)을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 컨쥬게이션하는 예시적인 방법을 도시한다.
도 16은 예시적인 친화성-올리고뉴클레오타이드를 제조하고 특성화하기 위한 예시적인 작업순서도(workflow)의 개략도를 도시한다.
도 17은 CD3, CD19, CD4, CD8, HLA-DR, 및 CTLA-4를 표적화하는 6개의 상이한 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 본원에서 기술된 예시적인 방법의 결과를 도시한다. 각 지점은 액적 바코드/단일 세포이다. 회수된 수용체 쌍의 유형에 의해 세포 동일성이 밝혀졌다 (TCR = T-세포; Ig = B-세포).
도 18은 예시적인 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한 추가의 견해를 도시한다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드는 형광단 (Fluor)을 포함한다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드는 형광단을 포함하지 않는다.
도 19는 TCR에 결합하지 않는 MHC-펩타이드 친화성 부분을 포함하는 본원에서 기술된 방법의 2개의 예시적인 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한 예시적인 결합 곡선을 도시한다.
도 20은 표적-특이적 1차 CD8+ T 세포 또는 비-표적 특이적 1차 CD8+ T 세포가 표준 pMHC 테트라머 시약 또는 DNA 라벨링된 pMHC 테트라머 (테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트)와 함께 인큐베이션된 유동 세포 분석 플롯을 도시한다. DNA-라벨링된 pMHC 테트라머는 패널의 가장 우측의 3개의 컬럼 바로 위에 있는 삼격형으로 나타난 바와 같이 감소하는 농도로 사용되었다.
도 21은 비-결합 TCR (예를 들어, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 시약에 의해 특이적으로 인식되지 않은 TCR) 및 결합 TCR (예를 들어, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 시약에 의해 특이적으로 인식되는 TCR)을 디스플레이하는 세포 사이에서 세포 당 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 개수의 비교를 도시한다. 증가하는 농도의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 X 축을 따라 나타나있는 바와 같이 사용되었다.
예시를 위한 실례의 적용을 참조하여 여러 양태가 아래 기술된다. 본원에서 기술된 특징들의 충분한 이해를 제공하기 위해 많은 구체적인 상세한 내용, 관계, 및 방법이 제시된다는 것을 이해해야 한다. 하지만, 관련 분야의 당업자는 본원에서 기술된 특징들이 구체적인 상세한 내용 중 하나 이상 없이 또는 다른 방법으로 실시될 수 있다는 것을 쉽게 인정할 것이다. 본원에서 기술된 특징들은 작용들 또는 사건들의 예시된 순서로 제한되지 않는데, 일부 작용이 상이한 순서로 및/또는 다른 작용 또는 사건들과 동시에 일어날 수 있기 때문이다. 또한, 모든 예시된 작용 또는 사건이 본원에서 기술된 특징들에 따라서 방법을 실시하기 위해 요구되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어들은 단지 특정한 사례들을 기술하기 위한 목적일 뿐이며, 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 "한 (a)", "한 (an)" 및 "그 (the)"는 문맥상 분명히 달리 나타나지 않는 한 복수의 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함하는 (including)", "포함한다 (include)", "가진 (having)", "갖는다 (has)", "~와 함께 (with)" 또는 이들의 변형들이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는데, 이러한 용어는 용어 "포함하는 (comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정될 때 특정값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내임을 의미할 수 있으며, 이것은 부분적으로 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 본 분야에서 관례상 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내임을 의미할 수 있다. 대안으로서, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로서, 특히 생물학적 시스템이나 과정과 관련하여, 용어는 값의 5배 이내, 더 바람직하게 2배 이내의 크기 정도 이내를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에서 특정한 값이 기술된 경우, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 그 특정한 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내임을 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본 발명의 목적은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 (예를 들어, 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트)를 사용하여 단일 세포 (예를 들어, 면역 세포)의 표현형을 분석하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다 (예를 들어, 에멀젼 내에서).
정의
따라서 본원에서 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 항원 결합 (Fab) 단편, F (ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 단일 사슬 항체 단편, 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하는 그것의 기능적 (항원-결합) 항체 단편을 포함하여, 다클론성 및 단클론성 항체를 포함한다. 용어는 유전적으로 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 및 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트라이아바디, 및 테트라바디, 탠덤(tandem) di-scFv, 탠덤 tri-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 그것의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어는 또한 IgG 및 그것의 하위부류, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는 임의의 부류 또는 하위부류의 항체를 포함하여 온전한 또는 전장 항체를 포함한다.
"초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비-연속 서열을 말하는 것으로 본 분야에 공지되어 있으며, 이것은 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)과 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. "프레임워크 영역" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 말하는 것으로 본 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에 4개의 FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및 FR-H4)과 각각의 전장 경쇄 가변 영역에 4개의 FR (FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4)이 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 다수의 널리 공지된 계획 중 어느 것을 사용하여 쉽게 결정될 수 있으며, Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 계획), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 넘버링 계획), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" 넘버링 계획), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27 (1):55-77 ("IMGT" 넘버링 계획), 및 Honegger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309 (3):657-70, ("Aho" 넘버링 계획)에서 기술된 것들을 포함한다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 확인에 사용된 계획에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 계획은 구조적 정렬에 기초하는 한편, Chothia 계획은 구조적 정보에 기초한다. Kabat 및 Chothia 계획 모두에서 넘버링은 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이에 기초하며, 삽입은 삽입 문자, 예를 들어, "30a"로 표시되고, 결실이 일부 항체에서 나타난다. 이 2개의 계획은 상이한 위치에 특정한 삽입 및 결실 ("indels")을 배치하며, 그 결과 차등적 넘버링이 이루어진다. Contact 계획은 복잡한 결정 구조의 분석에 기초하고, Chothia 넘버링 계획과 많은 부분에서 유사하다.
아래 표 A는 Kabat, Chothia, 및 Contact 계획에 의해 각각 확인된 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 나열한다. CDR-H1에 대하여, 잔기 넘버링은 Kabat 및 Chothia 넘버링 계획을 둘 다 사용하여 나열된다. FR은 CDR 사이에 위치되며, 예를 들어, FR-L1은 CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치되는 등이다. 표시된 Kabat 넘버링 계획은 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문에 표시된 Kabat 넘버링 협약을 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32 내지 H34 사이에서 달라진다.
표 A
Figure pct00001
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그것의 영역, 예컨대 가변 영역의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역" 또는 개별적으로 명시된 CDR (예를 들어, "CDR-H1, CDR-H2)은 상기 언급된 계획 중 어느 것에 의해 정의된 상보성 결정 영역 (또는 특이적 상보성 결정 영역)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정한 CDR (예를 들어, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열에서 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 포함한다고 언급된 경우, 이러한 CDR은 상기 언급된 계획 중 어느 것에 의해 정의된 바와 같이, 가변 영역 내에 상응하는 CDR (예를 들어, CDR-H3)의 서열을 갖는다는 것이 이해된다. 일부 구체예에서, 명시된 CDR 서열이 명시된다.
마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그것의 영역, 예컨대 가변 영역의 FR 또는 개별적으로 명시된 FR (들) (예를 들어, FR-H1, FR-H2)은 공지된 계획 중 어느 것에 의해 정의된 프레임워크 영역 (또는 특이적 프레임워크 영역)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 경우에는, Kabat, Chothia, 또는 Contact 방법에 의해 정의된 CDR과 같이, 특정한 CDR, FR, 또는 FR들 또는 CDR들의 확인을 위한 계획이 명시된다. 다른 경우에는, CDR 또는 FR의 특정한 아미노산 서열이 주어진다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체으로의 항원의 결합에 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 자생 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR)과 3개의 CDR을 포함한다 (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있으며, 이로써 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
제공된 항체는 항체 단편이다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부을 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 scFv와 같은 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR, 뿐만 아니라 그것의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편 (MHC-펩타이드 결합 단편이라고도 불림)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구체예에서, TCR은 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구체예에서, TCR은 전장 TCR보다 작지만 MHC 분자에 결합된 (즉, MHC 분자와 관련된) 특이적 항원성 펩타이드, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 항원-결합 부분이다. 어떤 경우에는, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조 도메인의 일부만을 포함하지만, 여전히 전체 TCR이 결합하는 에피토프 (예를 들어, MHC-펩타이드 복합체)에 결합할 수 있다. 어떤 경우에는, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은, 예컨대 일반적으로 각각의 사슬이 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경우, 특이적 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 도메인, 예컨대 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬을 포함한다. 항원-결합 도메인이거나 또는 항원-결합 도메인에 상동성인 결합 도메인을 가진 폴리펩타이드 또는 단백질이 포함된다. 상보성 결정 영역 (CDR) 이식된 항체 및 TCR 및 다른 인간화된 항체 및 TCR (CDR 변형 및 프레임워크 영역 변형을 포함하는)이 또한 이들 용어에 의해 고려된다. 단지 면역글로불린 사슬 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄)만을 참조할 수 있지만, 개시된 발명은 다수의 다른 상이한 유형의 쌍을 이룬 서열, 예를 들어, T-세포 수용체 사슬 쌍 (TCRα 및 TCRβ 사슬 및 TCRγ 및 TCRδ 사슬)에도 적용될 수 있으며 면역글로불린에 제한되지 않는다.
T-세포가 다양한 암 또는 감염성 유기체와 관련된 항원을 인식하는 능력은 그것의 TCR에 의해 부여되며, 이것은 알파 (α) 사슬과 베타 (β) 사슬 또는 감마 (γ)와 델타 (δ) 사슬로 이루어진다. 이들 사슬을 구성하는 단백질은 DNA에 의해 암호화되며, 이것은 TCR의 상당한 다양성을 생성하기 위해 고유한 메커니즘을 이용한다. 이 다중-서브유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합하고, 항원-제공 세포 (APC)의 표면 상의 MHC 부류 I 및 II 단백질에 의해 제공된 펩타이드에 결합한다. APC 상의 항원성 펩타이드로의 TCR의 결합은 T-세포 활성화에서 중심 사건이며, 이것은 T-세포와 APC의 접촉 지점에 있는 면역학적 시냅스에서 일어난다.
각 TCR은 가변 상보성 결정 영역 (CDR), 뿐만 아니라 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. α 및 β 사슬 가변 도메인의 제3 상보성-결정 영역 (CDR3) 루프의 아미노산 서열은 β 사슬 유전자좌에서 가변 (Vβ), 다양성 (Dβ) 및 연결 (Jβ) 유전자 세그먼트 간의 재조합, 및 α 사슬 유전자좌에서 유사한 Vα 및 Jα 유전자 세그먼트 간의 재조합으로부터 발생한 αβ T-세포의 서열 다양성을 대부분 결정한다. TCR α 및 β 사슬 유전자좌에 다수의 이러한 유전자 세그먼트의 존재는 상당수의 별개의 CDR3 서열이 암호화될 수 있도록 한다. TCR 유전자 재배열의 과정 동안 Vβ-Dβ, Dβ-Jβ, 및 Vα-Jα 접합부에서 뉴클레오타이드의 독립적인 추가 및 결실은 CDR3 서열 다양성을 더 증가시킨다. 이와 관련하여, 면역능력(immunocompetence)이 TCR의 다양성에 반영된다.
일부 양태에서, B-세포에 의해 발현된 면역글로불린 (Ig)은 4개의 폴리펩타이드 사슬, 2개의 중쇄 (IgH) 및 2개의 경쇄 (IgL)로 구성된 단백질이며, H2L2 구조를 형성한다. IgH 및 IgL 사슬의 각각의 쌍은 VL 및 VH 영역으로 구성된 초가변 도메인, 및 불변 도메인을 포함한다. Ig의 IgH 사슬은 몇 가지 유형, μ, δ, γ, α, 및 β으로 이루어진다. 개체 내에서 Ig의 다양성은 주로 초가변 도메인에 의해 결정된다. TCR과 유사하게, IgH 사슬의 V 도메인은 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 조합 방식 연결에 의해 생성된다. Ig 유전자 재배열의 과정 동안 VH-DH, DH-JH, 및 VH-JH 접합부에서 뉴클레오타이드의 독립적인 추가 및 결실은 초가변 도메인 서열 다양성을 더 증가시킨다. 여기서, 면역능력이 Ig의 다양성에 반영된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원으로의 항체의 결합에 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 자생 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR)과 3개의 CDR을 포함한다 (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있으며, 이로써 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
"친화성 부분"은 표적 항원과 상호작용하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 일부를 말한다. 예시적인 친화성 부분은 항체, 펩타이드, 단백질, 앱타머, 소분자, 약물, 세포, MHC 등을 포함한다.
"초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 TCR의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR의 아미노산 잔기를 포함한다. 프레임워크 또는 FR 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 초가변 영역 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
제공된 항체는 항체 단편이다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부을 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 scFv와 같이 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다.
항체 단편은, 제한되는 것은 아니지만, 온전한 항체의 단백질가수분해성 분해, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 생성을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 재조합 방식으로 생성된 단편, 예컨대 합성 링커, 예를 들어, 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 가진 것들과 같은 자연적으로 발생하지 않은, 및/또는 자연 발생 온전한 항체의 효소 분해에 의해 생성될 수 없는 배열을 포함하는 단편이다. 일부 양태에서, 항체 단편은 scFv이다.
또한, 항원-결합 단편을 포함하는 TCR 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, TCR은 경막 및/또는 세포질 영역(들)을 포함하지 않는 전장 TCR의 변이체와 같은, 항원-결합 부분이며, 이것은 완전 가용성 TCR이라고 불릴 수도 있다. 일부 구체예에서, TCR은 다이머 TCR (dTCR)이다. 일부 구체예에서, TCR은 단일 사슬 TCR (scTCR), 예컨대 PCT 특허 공개 번호 WO 03/020763, WO 04/033685, 또는 WO 2011/044186에 기술된 구조를 가진 scTCR이다. 특정 구체예에서, TCR은 scTv와 같이, 베타 사슬 가변 영역에 결합된 알파 사슬 가변 영역을 포함하는 단일 사슬 TCR 단편이다. 일부 구체예에서, scTv는 또한 scFv라고도 불린다.
일부 양태에서, 단일 사슬 Fv 또는 scFv는 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인 또는 TCR의 가변 알파 또는 감마 사슬 (Vα 또는 Vγ) 및 가변 베타 또는 델타 사슬 (Vβ 또는 Vδ) 도메인을 포함하는 항체 또는 TCR 단편을 말하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 또는 Vα와 Vβ 도메인 또는 Vγ와 Vδ 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 더 포함하며, 이것은 sFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 한다.
일부 양태에서, 디아바디는 2개의 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 및/또는 TCR 단편을 말하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 VL에 연결된 VH (VH-VL) 또는 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 Vβ에 연결된 Vα (Vα-Vβ) 또는 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 Vδ에 연결된 Vγ (Vγ-Vδ)를 포함한다. 동일한 사슬에서 2개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 짧은 링커를 사용함으로써 도메인들은 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 예시적인 디아바디는, 예를 들어, EP404097 및 WO93111161에 더 충분히 기술되어 있다.
일부 양태에서, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 TCR은 2개의 상이한 유형의 항원에 대해 특이성을 나타내는 항체 또는 TCR을 말한다. 본원에서 사용된 이 용어는 구체적으로, 제한되는 것은 아니지만, 표적 항원에 대한 결합 특이성과 특정한 조직으로의 전달을 용이하게 하는 다른 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 항체 및 TCR을 포함한다. 유사하게, 다중특이적 항체 및 TCR은 둘 이상의 결합 특이성을 가진다.
일부 양태에서, 선형 항체 또는 "선형 TC"는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트 (예를 들어, VH-CH1-VH-CH1 또는 Vα-Cα1-Vα-Cα1)를 말한다. 선형 항체 및 TCR은, 예를 들어, Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)에 의해 설명된 바와 같이 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
일부 양태에서, 항체-결합 도메인은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체 또는 TCR의 하나 이상의 단편을 말한다. 이러한 용어에 포함되는 항체 단편의 비-제한적 예들은, 제한되는 것은 아니지만, (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F (ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) scFv를 포함하는, 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편, (v) VH 도메인을 포함하는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546); 및 (vi) 분리된 CDR을 포함한다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄을 포함하는 항체 또는 단일 알파 사슬 또는 단일 베타 사슬을 가진 TCR이 이 정의에 추가로 포함된다.
"F (ab')2" 및 "Fab'" 모이어티는 펩신 및 파파인과 같은 프로테아제로 Ig를 처리함으로써 생성될 수 있고, 2개의 중쇄의 각각의 힌지 영역 사이에 존재하는 이황화 결합 근처에서 면역글로불린을 분해함으로써 생성된 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 파파인은 2개의 중쇄의 각각의 힌지 영역 사이에 존재하는 이황화 결합의 업스트림에서 IgG를 분열시키고, 이로써 VL 및 CL로 이루어진 경쇄, 및 VH 및 CHγ1 (중쇄의 불변 영역의 γ1)로 이루어진 중쇄 단편이 이들의 C 말단 영역에서 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 상동성 항체 단편을 생성한다. 이들 2개의 상동성 항체 단편의 각각은 'Fab'라고 불린다. 또한, 펩신은 2개의 중쇄의 각각의 힌지 영역 사이에 존재하는 이황화 결합의 다운스트림에서 IgG를 분열시키고, 이로써 상기-언급된 2개의 'Fab'가 힌지 영역에서 결합된 단편보다 약간 더 큰 항체 단편을 생성한다. 이 항체 단편은 F ('ab')2라고 불린다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. 'Fab' 단편은 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 몇 개의 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 차이가 있다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 가진 Fab'에 대한 명칭이다. F (ab')2 항체 단편은 원래 그 사이에 힌지 시스테인을 가진 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성된다.
일부 양태에서, Fv는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 항체 또는 TCR 단편을 말한다. 이 영역은 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인 또는 하나의 TCRα 사슬과 하나의 TCRβ 사슬 또는 하나의 TCRγ 사슬과 하나의 TCRδ 사슬의 단단한 비-공유 회합의 다이머로 구성된다. 이 구성형태에서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 다이머 또는 Vα-Vβ 다이머 또는 Vγ-Vδ 다이머의 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 종합하면, VH 및 VL 사슬 또는 Vα-Vβ 사슬 또는 Vγ-Vδ 사슬의 각각의 CDR 중 하나 이상의 조합이 항체 또는 TCR에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 예를 들어, CDRH3 및 CDRL3은 수령체 선택된 항체, TCR, 또는 그것의 항원-결합 단편의 VH 및 VL 사슬 또는 Vα 및 Vβ 사슬 또는 Vγ-Vδ 사슬에 전달되었을 때 항체 또는 TCR에 대한 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다는 것이 이해되어야 하며, CDR의 이 조합은 결합, 친화성 등에 대해 테스트될 수 있다. 친화성은 제2 가변 도메인과 조합되었을 때보다는 아마 낮을 테지만, 심지어 단일 가면 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 그것에 결합하는 능력을 갖는다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 (VL 및 VH 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ)은 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 그것들은 VL 및 VH 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 사슬 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬로 만들어지는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 이어질 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFV)라고 알려짐; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). 이러한 scFv는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되도록 의도된다. 특이적 scFv의 임의의 VH 및 VL 서열은 Fc 영역 cDNA 또는 게놈 서열에 연결될 수 있고, 이로써 완전한 Ig (예를 들어, IgG) 분자 또는 다른 아이소타입을 암호화하는 발현 벡터를 생성한다. VH 및 VL은 또한 단백질 화학 또는 재조합 DNA 기술을 사용하는 Ig들의 Fab, Fv 또는 다른 단편의 생성에 사용될 수 있다.
항원-결합 폴리펩타이드는 또한 중쇄 다이머, 예컨대 예를 들어, 카멜리드(camelid) 및 상어로부터의 항체를 포함한다. 카멜리드 및 상어 항체는 V-유사 및 C-유사 도메인의 2개의 사슬의 호모다이머 쌍을 포함한다 (어느 것도 경쇄를 갖지 않는다). 카멜리드에서 중쇄 다이머 IgG의 VH 영역은 경쇄와 소수성 상호작용을 하지 않아야 하므로, 일반적으로 경쇄와 접촉하는 중쇄 내의 영역은 카멜리드에서 친수성 아미노산 잔기로 변화된다. 중쇄 다이머 IgG의 VH 도메인은 VHH 도메인이라고 불린다. 상어 Ig-NAR는 하나의 가변 도메인 (V-NAR 도메인으로 명명)과 5개의 C-유사 불변 도메인 (C-NAR 도메인)의 호모다이머를 포함한다. 카멜리드에서 항체 레퍼토리의 다양성은 VH 또는 VHH 영역의 CDR 1, 2 및 3에 의해 결정된다. 낙타 VHH 영역의 CDR3은 평균 16개 아미노산인, 그것의 비교적 긴 길이를 특징으로 한다 (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7 (9): 1129).
"인간화된" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비-인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래되는 항체이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 전형적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화가 진행된 한편 모 (parental) 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 보유한 비-인간 항체의 변이체를 나타낸다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복원 또는 개선하기 위해 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유래되는 항체)의 상응하는 잔기로 치환된다.
제공된 항체들 중에는 인간 항체가 있다. "인간 항체"는 인간 또는 인간 세포, 또는 인간 항체 라이브러리를 포함한 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 활용하는 비-인간 공급원에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진 항체이다. 용어는 비-인간 항원-결합 영역을 포함하는 비-인간 항체의 인간화된 형태, 예컨대 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비-인간인 것들을 배제한다.
인간 항체는 항원성 도전에 대한 반응으로 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 온전한 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉(transgenic) 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물들은 전형적으로 모든 또는 일부의 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하며, 이것은 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된다. 이러한 트랜스제닉 동물에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 비활성화되었다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 및 세포-미포함 라이브러리를 포함하여, 인간 레퍼토리로부터 유래된 항체-암호화 서열을 포함하는, 인간 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있다.
제공된 항체 중에는 단클론성 항체 단편을 포함하여, 단클론성 항체가 있다. 용어 "단클론성 항체"는 본원에서 기술된 바와 같이 자연적으로 발생하는 돌연변이를 포함하거나 또는 단클론성 항체 제제의 생성 중에 발생하는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 또는 집단 내에서 얻어진 항체를 말하며, 즉 그 집단을 포함하는 개개의 항체는 동일하다. 전형적으로 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대한 것이다. 용어는 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성이 필요한 것으로 해석되어서는 안 된다. 단클론성 항체는, 제한되는 것은 아니지만, 하이브리도마로부터의 생성, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 및 다른 항체 디스플레이 방법을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"와 "단백질"은 아미노산 잔기들의 폴리머를 나타내기 위해 교체 가능하게 사용되며, 최소 길이에 제한되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 사슬 및 다른 펩타이드, 예를 들어, 링커 및 결합 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현-후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 자생 또는 천연 서열과 관련하여 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 변형들은 부위-특이적 돌연변이생성을 통한 것처럼 의도적이거나, 또는 PCR 증폭으로 인한 단백질 또는 오류를 생성하는 숙주들의 돌연변이를 통한 것 처럼 우연일 수도 있다.
"생식세포 계열 서열"은 생식세포 계열 (반수체 생식세포 및 그것이 형성되는 것으로부터의 이배체 세포)의 유전자 서열을 나타낸다. 생식세포 계열 DNA는 단일 Ig 중쇄 또는 경쇄, 또는 단일 TCRα 또는 TCRβ 사슬, 또는 사슬 TCRγ 또는 TCRδ 사슬을 암호화하는 다중 유전자 세그먼트를 포함한다. 이들 유전자 세그먼트는 생식 세포에서 운반되지만 그것들이 기능적 유전자로 배열될 때까지 전사 및 번역될 수 없다. 골수에서 B-세포 및 T-세포 분화가 일어나는 동안, 이들 유전자 세그먼트는 108개 초과의 특이성을 생성할 수 있는 역동적인 유전자 시스템에 의해 무작위로 셔플링될 수 있다. 이들 유전자 세그먼트의 대부분은 생식세포 계열 데이터베이스에 의해 공개되고 수집된다.
친화성은 2개의 작용제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 나타내고 KD로 표시된다. 리간드에 대한 결합 단백질의 친화성, 예컨대 에피토프에 대한 항체의 친화성 또는 MCH-펩타이드 복합체에 대한 TCR의 친화성은, 예를 들어, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM)일 수 있다. 용어 "결합력"은 희석 후 분해에 대한 둘 이상의 제제의 복합체의 저항을 나타낸다.
일부 양태에서, "에피토프"는 항체 또는 TCR의 가변 영역 결합 포켓과 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원 또는 다른 거대분자의 부분을 말한다. 이러한 결합 상호작용은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자 간 접촉으로서 나타날 수 있다. 항원 결합은, 예를 들어, CDR3, CDR3 쌍, 또는 어떤 경우에는, VH 및 VL 사슬의 최대 6개의 CDR 모두의 상호작용을 수반할 수 있다. 에피토프는 선형 펩타이드 서열 (즉 "연속적")이거나 비연속적인 아미노산 서열로 구성될 수 있다 (즉 "형태적" 또는 "비연속적"). 항체 또는 TCR은 하나 이상의 아미노산 서열을 인식할 수 있다; 그러므로 에피토프는 하나 이상의 별개의 아미노산 서열을 한정할 수 있다. 일부 양태에서, TCR은 MHC와 관련하여 하나 이상의 아미노산 서열 또는 에피토프를 인식할 수 있다. 항체 및 TCR에 의해 인식되는 에피토프는 당업자에게 널리 공지된 펩타이드 맵핑 및 서열 분석 기술에 의해 결정될 수 있다. 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자 간 접촉으로서 나타난다.
일부 구체예에서, 특이적 결합을 가진 항체 또는 TCR에 대한 언급은 항체 또는 TCR이 항체 또는 TCR에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 항원 이외의 분자에 대한 어떠한 유의한 결합을 나타내지 않을 상황을 말한다. 용어는 또한, 예를 들어, 항원 결합 도메인이 많은 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 적용될 수 있으며, 이 경우에 항원 결합 도메인을 운반하는 선택된 항체, TCR 또는 그것의 항원-결합 단편은 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있다. 용어 "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, TCR 또는 그것의 단편이 관련이 없는 아미노산 서열에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 에피토프에 결합하고, 에피토프를 포함하는 다른 폴리펩타이드에 대하여 교차-반응성인 경우, 인간 용도로 투여되기 위해 제제화되는 수준에서 독성이 아니라는 것을 의미한다. 한 양태에서, 이러한 친화성은 관련이 없는 아미노산 서열에 대한 항체, TCR 또는 그것의 단편의 친화성보다 적어도 1배 더 크거나, 적어도 2배 더 크거나, 적어도 3배 더 크거나, 적어도 4배 더 크거나, 적어도 5배 더 크거나, 적어도 6배 더 크거나, 적어도 7배 더 크거나, 적어도 8배 더 크거나, 적어도 9배 더 크거나, 10배 더 크거나, 적어도 20배 더 크거나, 적어도 30배 더 크거나, 적어도 40배 더 크거나, 적어도 50배 더 크거나, 적어도 60배 더 크거나, 적어도 70배 더 크거나, 적어도 80배 더 크거나, 적어도 90배 더 크거나, 적어도 100배 더 크거나, 또는 적어도 1000배 더 크다. 용어 "결합"은, 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 공유, 정전기, 소수성, 및 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한 2개의 분자 간의 직접적인 회합을 말하고, 염 브릿지 및 물 브릿지, 뿐만 아니라 임의의 다른 통상적인 결합 수단과 같은 상호작용을 포함한다.
용어 "결합"은, 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 공유, 정전기, 소수성, 및 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인한 2개의 분자 간의 직접적인 회합을 말하고, 염 브릿지 및 물 브릿지, 뿐만 아니라 임의의 다른 통상적인 결합 수단과 같은 상호작용을 포함한다.
일부 양태에서, 용어 "테트라머"는 스트렙타비딘의 단일 분자에 결합된 4개의 서브유닛을 포합하는 복합체를 말할 수도 있다. 서브유닛은 MHC-펩타이드 복합체일 수도 있으며, 이것은 세포의 집단에 결합하여 이것을 확인할 수 있다. 서브유닛은 회합된 펩타이드가 없는 MHC일 수도 있다. 서브유닛은 B-세포 수용체 항원일 수도 있다. 테트라머에 의해 학인된 세포의 집단은 테트라머의 서브유닛에 결합하는 수용체, 예컨대 TCR 또는 BCR을 발현하는 집단일 수도 있다. 세포의 집단은 항원 특이적 T 세포일 수도 있다. 세포의 집단은 항원 특이적 B 세포일 수도 있다. 테트라머는 형광 라벨링될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 MHC-펩타이드 테트라머는 pMHC와 교체 가능하게 사용될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"은 인간에게 투여될 때 생리적으로 용인되고 전형적으로 위경련, 현기증 등과 같은 알레르기성 또는 유사한 부반응(untoward reaction)을 일으키지 않는 분자 실체물 및 조성물을 말한다.
"방지"는 과도한 수준의 단백질과 관련된 또는 단백질 활성과 연관이 있는 질환 또는 장애의 예방, 이것들의 증상의 발병의 방지, 이것들의 진행의 방지를 말한다.
"억제", "치료" 및 "치료하는"은 교체 가능하게 사용되고, 예를 들어, 증상의 정체, 생존의 연장, 증상의 부분적 또는 완전한 개선, 및 과도한 수준의 단백질과 관련된 또는 단백질 활성과 연관이 있는 병태, 질환 또는 장애의 부분적 또는 완전한 근절을 말한다. 예를 들어, 암 치료는, 제한되는 것은 아니지만, 암 성장 또는 종양의 정체, 부분적인 또는 전체적인 제거를 포함한다. 치료 또는 부분적 제거는, 예를 들어, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 또는 그 사이의 임의의 배수 감소와 같이 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피의 배수 감소를 포함한다. 유사하게, 치료 또는 부분적 제거는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트 감소의 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피의 퍼센트 감소를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 중화 항체 또는 중화 TCR은 중화가 이루어지는 메커니즘에 관계없이, 바이러스 또는 박테리아와 같은 병원체의 복제를 억제하는 임의의 항체 또는 TCR을 말한다.
항체 레퍼토리 또는 TCR 레퍼토리는 항체, TCR 또는 그것의 단편의 집합체를 말한다. 항체 레퍼토리는, 예를 들어, 특정한 항체를 선택하거나 또는 특정한 성질, 예컨대 결합 능력, 결합 특이성, 위장 수송 능력, 안정성, 친화성 등에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수도 있다. 용어는 구체적으로, 제한되는 것이 아니라, 예를 들어, 나이브(naive), 합성 및 반-합성 라이브러리를 포함한, 임의의 공급원의 단일 사슬 Fv (scFv) 및 Fab 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여, 예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 모든 형태의 조합 라이브러리를 포함하는, 항체 및 TCR 라이브러리를 포함한다.
"표적 핵산 분자", "표적 폴리뉴클레오타이드," "표적 폴리뉴클레오타이드 분자"는 관심있는 임의의 핵산을 말한다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 상보적인 가닥의 동시 프라이머 연장에 의한 폴리뉴클레오타이드의 시험관 내 증폭 반응을 말한다. PCR 반응은 프라이머 결합 부위가 플랭킹된 주형 폴리뉴클레오타이드의 카피를 생성한다. 2개의 프라이머를 이용한 결과는, 각각의 주기로 2개의 가닥이 모두 복제되기 때문에, 각각의 사이클을 이용한 2개의 가닥의 주형 폴리뉴클레오타이드 카피 수의 지수적 증가이다. 폴리뉴클레오타이드 듀플렉스(duplex)는 사용된 프라이머의 단부에 상응하는 말단을 갖는다. PCR은 주형 폴리뉴클레오타이드 변성의 1회 이상의 반복, 프라이머 결합 부위로의 프라이머 어닐링(annealing), 및 뉴클레오타이드의 존재하에 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장을 포함할 수 있다. 특정 온도, 각각의 단계에서의 기간, 및 단계들 사이의 변화 속도는 당업자에게 널리 공지된 많은 요인들에 의존한다. (McPherson et al., IRL Press, Oxford (1991 및 1995)). 예를 들어, Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 통상적인 PCR에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드는 >90℃의 온도에서 변성될 수 있고, 프라이머는 50-75℃의 범위의 온도에서 어닐링될 수 있으며, 프라이머는 72-78℃의 범위의 온도에서 연장될 수 있다. 일부 구체예에서, PCR은 역전사 PCR (RT-PCR), 실시간 PCR, 네스티드 (nested) PCR, 정량적 PCR, 다중화된 PCR 등을 포함한다. 일부 구체예에서, PCR은 RT-PCR을 포함하지 않는다 (미국 특허 번호 5,168,038, 5,210,015, 6,174,670, 6,569,627, 및 5,925,517; Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30:1292-1305 (2002)). RT-PCR은 역전사 반응이 선행되는 PCR 반응을 포함하고 결과의 cDNA는 증폭되며, 네스티드 PCR은 제1 세트의 프라이머를 사용하는 제1 PCR 반응의 앰플리콘이 제2 프라이머 세트를 사용하는 제2 PCR 반응에 대한 샘플이 되고, 그중 적어도 하나는 제1 PCR 반응의 앰플리콘의 내부 위치에 결합하는, 2-단계 PCR을 포함한다. 다중화된 PCR은 동일한 반응 혼합물에서 복수의 폴리뉴클레오타이드 서열에 동시에 PCR 반응이 수행되는 PCR 반응을 포함한다. PCR 반응 부피는 어느 곳에서든지 0.2 pL-1000 μL일 수 있다. 정량적 PCR은 샘플에서 하나 이상의 서열의 절대량 또는 상대량, 풍부함, 또는 농도를 측정하기 위해 디자인된 PCR 반응을 포함한다. 정량적 측정은 관심의 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 참조 서열 또는 표준을 비교하는 것을 포함한다 (Freeman et al., Biotechniques, 26:112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21:268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122:3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9446 (1989)).
"뉴클레오타이드", "뉴클레오사이드", "뉴클레오타이드 잔기", 및 "뉴클레오사이드 잔기"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 잔기, 또는 증폭 반응 (예를 들어, PCR 반응)에서의 사용에 적합한 프라이머의 구성요소의 역할을 할 수 있는 다른 유사한 뉴클레오사이드 유사체를 의미할 수 있다. 이러한 뉴클레오사이드 및 그것의 유도체는, 달리 지시된 경우를 제외하고, 본원에서 기술된 프라이머의 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 본 출원에서 어떤 것도 증폭 반응에서 안정성 또는 유용성을 증대시키기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 유도체 또는 염기의 활용을 배제하는 것을 의미하는 것이 아니며, 단 화학적 변형은 적절하게 폴리머라제에 의한 데옥시구아닌, 데옥시시토신, 데옥시티미딘 또는 데옥시아데닌으로서의 인식을 방해하지 않는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 하이브리드(hybrid) 형성을 안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 하이브리드 형성을 탈안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 혼성화 특이성을 증대시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 혼성화 특이성을 감소시킬 수 있다.
"핵산", 또는 문법적 동등물은 단일 뉴클레오타이드 또는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 나타낸다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 문법적 동등물은 함께 공유 결합된 적어도 2개의 개의 뉴클레오타이드를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 둘 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 비-천연 염기, 뉴클레오타이드 염기의 유도체를 포함하는 어떤 길이의 폴리머 형태의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 펩타이드 핵산 (PNA) 중 하나를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 백본은 당 및 포스페이트 기, 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자, 예컨대 또 다른 혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 또는 둘 다의 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 실례는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 유전자간(intergenic) DNA (제한 없이, 이종이량체 DNA 포함), 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, 작은 간섭 RNA (siRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형(branched) 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 서열의 분리된 DNA, 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 천연 공급원, 재조합체로부터 분리되거나 또는 인공적으로 합성될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 비표준 뉴클레오타이드, 예컨대 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 비표준 뉴클레오타이드는 하이브리드 형성을 안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 비표준 뉴클레오타이드는 하이브리드 형성을 탈안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 비표준 뉴클레오타이드는 혼성화 특이성을 증대시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 비표준 뉴클레오타이드는 혼성화 특이성을 감소시킬 수 있다. 비표준 뉴클레오타이드 변형의 실례는 2' O-Me, 2' O-알릴, 2' O-프로파르길, 2' O-알킬, 2' 플루오로, 2' 아라비노, 2' 자일로, 2' 플루오로 아라비노, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로아미데이트, 2' 아미노, 5-알킬-치환된 피리미딘, 3' 데옥시구아노신, 5-할로-치환된 피리미딘, 알킬-치환된 퓨린, 할로-치환된 퓨린, 이환형 뉴클레오타이드, 2'MOE, PNA 분자, LNA-분자, LNA-유사 분자, 다이아미노퓨린, S2T, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 5-클로로유라실, 5-아이오도유라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)유라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오유리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸유라실, 다이하이드로유라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸 구아닌, 5-메틸아미노메틸유라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오유라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸유라실, 5-메톡시유라실, 2-메틸티오-D46-아이소펜테닐아데닌, 유라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신, 슈도유라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5- 메틸-2-티오유라실, 2-티오유라실, 4-티오유라실, 5-메틸유라실, 유라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 유라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오유라실, 3- (3-아미노-3-N-2- 카르복시프로필) 유라실, (acp3)w, 2,6-다이아미노퓨린, 및 그것의 유도체를 포함한다.
"대상체", "개체", "숙주" 또는 "환자"는 포유류와 같이 살아있는 유기체를 말한다. 대상체 및 숙주의 실례로는, 제한되는 것은 아니지만, 말, 소, 낙타, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 래트, 마우스 (예를 들어, 인간화된 마우스), 져빌, 비-인간 영장류 (예를 들어, 마카크 원숭이), 인간 등, 예를 들어, 비-포유류 척추동물, 예컨대 조류 (예를 들어, 닭 또는 오리), 어류 (예를 들어, 상어) 또는 개구리류 (예를 들어, 제노푸스(Xenopus)), 및 비-포유류 무척추동물, 뿐만 아니라 그것들의 트랜스제닉 종들을 포함하는, 비-포유류를 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 단일 유기체 (예를 들어, 인간)를 나타낸다. 특정 양태에서, 또는 연구 및/또는 질환에 대한 공통 면역 인자를 가지는 작은 코호트(cohort), 및/또는 질환이 없는 개체 코호트 (예를 들어, 음성/정상 대조군)을 구성하는 개체의 군이 제공된다. 샘플이 얻어지는 대상체는 질환 및/또는 장애 (예를 들어, 하나 이상의 알레르기, 감염, 암 또는 자가면역 장애 등)로 피해를 입을 수 있고 질환에 의해 영향을 받지 않는 음성 대조군 대상체와 비교될 수 있다.
"키트"는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 물질 또는 시약을 전달하기 위한 전달 시스템을 말한다. 일부 구체예에서, 키트는 반응 시약 (예를 들어, 적절한 컨테이너 내의 프로브, 효소, 등) 및/또는 지원 물질 (예를 들어, 버퍼, 검정을 수행하기 위한 설명서, 등)의 저장, 수송 또는 한 장소에서 다른 장소로의 전달을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련된 반응 시약 및/또는 지원 물질을 포함하는 하나 이상의 엔클로져 (예를 들어, 박스)를 포함한다. 이러한 내용물은 함께 또는 별도로 의도된 수령체에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 컨테이너는 검정에 사용을 위한 효소를 포함할 수 있는 한편, 제2 컨테이너는 복수의 프라이머를 포함한다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드는 적어도 2개의 개의 아미노산을 포함하는 분자를 말한다. 일부 구체예에서, 폴리 펩타이드는 단일 펩타이드로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리펩타이드는 둘 이상의 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 펩타이드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 아미노산 사슬, 단백질, 펩타이드, 호르몬, 폴리펩타이드 당류, 지질, 당지질, 인지질, 항체, 효소, 키나아제, 수용체, 전사인자 및 리간드를 포함한다.
일부 양태에서, 샘플은 생물학적, 환경적, 의학적 대상체 또는 환자 샘플 또는 표적 폴리 뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플을 말한다.
친화성- 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 친화성 분자 부분 (예를 들어, 항체 또는 MHC-펩타이드 복합체)과 올리고뉴클레오타이드 부분을 포함한다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 항원 식별 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 특이적으로 상호작용하는 하나 이상의 항원을 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 컨쥬게이트의 친화성 부분에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 컨쥬게이트의 친화성 부분에 비-공유 결합으로 부착된다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트일 수 있다. 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 테트라머 (예를 들어, B-세포 수용체 항원 테트라머 또는 MHC-펩타이드 복합체 테트라머) 및 올리고뉴클레오타이드 부분을 포함할 수 있다. 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 항원 식별 서열은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 특이적으로 상호작용하는 하나 이상의 항원을 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 컨쥬게이트의 친화성 부분 또는 테트라머에 공유 결합으로 부착된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 컨쥬게이트의 친화성 부분 또는 테트라머에 비-공유 결합으로 부착된다.
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 단일 친화성 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 다원자가 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트이다. 예를 들어, 다원자가 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드(들)에 컨쥬게이션된 적어도 2개의 친화성 분자의 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다원자가 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션된 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1,000개의 친화성 분자의 항원-결합 도메인을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 단일 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 친화성 분자 (예를 들어, 항체 또는 MHC-펩타이드 복합체)에 컨쥬게이션된 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1,000개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 동일한 Antigen ID (AID) 서열을 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 동일한 AID 서열을 포함하는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1,000개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
친화성- 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분 (또는 도메인)은 표적 항원에 결합하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 영역, 분자, 도메인, 부분, 단편, 또는 모이어티를 포함한다. 따라서, 친화성 부분은 주어진 표적 항원, 예컨대 세포-표면 단백질의 세포외 도메인에 결합하거나 특이적으로 결합하는 능력을 부여한다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 상이한 Antigen ID 서열을 포함하는 또 다른 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 항원과는 실질적으로 상호작용하지 않는다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 표적 항원으로의 친화성 부분의 결합을 실질적으로 훼손하지 않으면서, 핵산을 포함할 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착될 수 있는 분자이다.
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 핵산 분자일 수 있거나, 또는 단백질성 물질일 수 있다. 친화성 부분은, 제한되는 것은 아니지만, RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드, 소분자 (예를 들어, 약물), 앱타머, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 및 그것의 단편, TCR 및 그것의 단편, 바이러스, 바이러스 입자, 세포, 그것의 단편, 및 이것들의 조합을 포함한다 (예를 들어, Fredriksson et al., (2002) Nat Biotech 20:473-77; Gullberg et al., (2004) PNAS, 101:8420-24 참조). 예를 들어, 친화성 부분은 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 하나 이상의 이중 가닥 영역 및 하나 이상의 단일 가닥 영역을 포함하는 DNA 또는 RNA, RNA-DNA 하이브리드, 소분자, 앱타머, 폴리펩타이드, 단백질, 항체, 항체 단편, TCR, TCR 단편, MHC, MHC-펩타이드 복합체, 바이러스 입자, 세포, 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포를 표적화한다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 T-세포 또는 B-세포를 표적화할 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 특정한 세포 유형 또는 세포 서브세트를 표적화한다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 특정한 항원을 특이적으로 인식하는 TCR을 포함하는 T-세포를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 특정한 MHC-펩타이드 복합체를 특이적으로 인식하는 TCR을 포함하는 T-세포를 표적화할 수 있다.
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포의 표적의 세포외 도메인을 표적화한다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포의 수용체, 예를 들어, T-세포 수용체의 세포외 도메인을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포의 수용체의 세포외 도메인의 글리코실화된 영역을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포의 수용체의 세포외 도메인의 리간드 결합 영역을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 리간드와 결합하지 않은 세포의 수용체의 세포외 도메인의 영역을 표적화할 수 있다.
일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC-펩타이드 복합체를 포함한다. 일부 구체예에서, MHC-펩타이드 복합체는 TCR을 표적화한다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 B-세포 수용체 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, B-세포 수용체 항원은 BCR을 표적화한다.
단백질
일부 구체예에서, 친화성 부분은 폴리펩타이드, 단백질, 또는 이것들의 임의의 단편이다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 단백질이다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 펩타이드이다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 항체, 예컨대 항체의 결합 도메인일 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC-펩타이드 복합체일 수 있다. 예를 들어, 친화성 부분은 정제된 폴리펩타이드, 분리된 폴리펩타이드, 융합체 태그화된 폴리펩타이드, 세포 또는 바이러스나 비리온의 막에 부착된 또는 그 막에 걸쳐 있는 폴리펩타이드, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 세포외 단백질, 키나아제, 포스파타아제, 아로마타아제, 헬리카아제, 프로테아제, 옥시도리덕타아제, 리덕타아제, 트랜스페라아제, 하이드롤라아제, 리아제, 이소머라아제, 글리코실라아제, 세포외 바탕질 단백질, 리가아제, 이온 수송체, 채널, 포어, 세포자멸성 단백질, 세포 유착 단백질, 병원성 단백질, 비정상적으로 발현된 단백질, 전사 인자, 전사 조절자, 번역 단백질, 샤페론, 분비된 단백질, 리간드, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 핵 단백질, 수용체, 경막 수용체, 신호 변환기, 항체, 막 단백질, 통합 막 단백질, 주변 막 단백질, 세포벽 단백질, 구상 단백질, 섬유상 단백질, 당단백질, 지질단백질, 염색체 단백질, 이것들의 임의의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 이종성 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 트랜스펙션과 같은 분자 기술을 사용하여 세포에서 과발현된 단백질이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 재조합 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 친화성 부분은 박테리아 (예를 들어, 대장균(E. coli)), 효모, 포유류, 또는 곤충 세포에서 생성된 샘플을 포함할 수 있다 (예를 들어, 유기체에 의해 과발현된 단백질). 일부 구체예에서, 친화성 부분은 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 다형성을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 항원, 예컨대 항체 생성과 같이, 유기체를 면역화하거나 또는 유기체에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용된 폴리펩타이드이다.
일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 테트라머이다. 일부 구체예에서, 테트라머의 서브유닛은 단백질이다. 일부 구체예에서, 테트라머의 서브유닛은 펩타이드이다. 일부 구체예에서, 테트라머의 서브유닛은 단백질 및/또는 펩타이드의 복합체이다. 일부 구체예에서, 단백질 및/또는 펩타이드의 복합체는 공유 결합으로 또는 비-공유 결합으로 결합 및/또는 회합될 수도 있다. 예를 들어, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC-펩타이드 복합체일 수 있다. MHC-펩타이드 복합체에서 펩타이드의 일부 비-제한적 예는 정제된 폴리펩타이드, 분리된 폴리펩타이드, 융합체 태그화된 폴리펩타이드, 세포 또는 바이러스나 비리온의 막에 부착된 또는 그 막에 걸쳐 있는 폴리펩타이드, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 세포외 단백질, 키나아제, 포스파타아제, 아로마타아제, 헬리카아제, 프로테아제, 옥시도리덕타아제, 리덕타아제, 트랜스페라아제, 하이드롤라아제, 리아제, 이소머라아제, 글리코실라아제, 세포외 바탕질 단백질, 리가아제, 이온 수송체, 채널, 포어, 세포자멸성 단백질, 세포 유착 단백질, 병원성 단백질, 비정상적으로 발현된 단백질, 전사 인자, 전사 조절자, 번역 단백질, 샤페론, 분비된 단백질, 리간드, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 핵 단백질, 수용체, 경막 수용체, 신호 변환기, 항체, 막 단백질, 통합 막 단백질, 주변 막 단백질, 세포벽 단백질, 구상 단백질, 섬유상 단백질, 당단백질, 지질단백질, 염색체 단백질, 이것들의 임의의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합의 펩타이드일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩타이드는 질환 관련 항원으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 펩타이드는 종양-관련 항원, 예컨대 범용 종양 항원, 바이러스-관련 항원, 자가면역-관련 항원, 염증-관련 항원, 박테리아-관련 항원, 또는 이것들의 임의의 조합으로부터 유래되거나 또는 유래될 수도 있다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 트랜스펙션과 같은 분자 기술을 사용하여 세포에서 과발현된 단백질이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 재조합 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 친화성 부분은 박테리아 (예를 들어, 대장균), 효모, 포유류, 또는 곤충 세포에서 생성된 샘플을 포함할 수 있다 (예를 들어, 유기체에 의해 과발현된 단백질). 일부 구체예에서, 친화성 부분은 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 다형성을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 항원, 예컨대 항체 생성과 같이, 유기체를 면역화하거나 또는 유기체에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용된 폴리펩타이드이다. 또 다른 예로서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 B-세포 수용체 항원일 수 있다. B-세포 수용체 항원은 테트라머의 서브유닛일 수 있다.
항체
일부 구체예에서, 친화성 부분은 항체, 예를 들어, 항체의 결합 단편이다. 항체는 또 다른 분자의 특정한 공간적인 극성 조직에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 정제된 항체, 분리된 항체, 항체의 단편, 또는 융합체 태그화된 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 트랜스펙션과 같은 분자 기술을 사용하여 세포에서 과발현된다. 일부 구체예에서, 항체는 재조합 항체이다. 항체는 세포 표면 분자와 같은 또 다른 분자의 특정한 공간적인 극성 조직에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 단클론성, 다클론성, 또는 재조합 항체일 수 있고, 숙주의 면역화 및 혈청의 수집 (다클론성)과 같이 본 분야에 공지된 기술에 의해서 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질을 수집함으로써 (단클론성), 또는 뉴클레오타이드 서열, 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합에 필요한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 돌연변이된 버젼을 클로닝 및 발현함으로써 제조될 수 있다. 이에 더하여, 특정한 분자에 대한 결합 친화성이 유지되는 한 적절한 경우 면역글로불린 또는 그것의 단편의 응집체, 중합체, 및 컨쥬게이트가 사용될 수 있다. 항체 단편의 예들은 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; F (ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-46); 및 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 분리된 CDR 및 단일 사슬 단편 (scFv) (단일 사슬 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242: 423-26; 및 Huston et al., (1988) PNAS 85: 5879-83 참조)을 포함한다. 따라서, 항체 단편은 Fab, F (ab)2, scFv, Fv, dAb 등을 포함한다. 2개의 도메인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만 그것들은, 재조합 방법을 사용하여, 이들이 단일 단백질 사슬이 될 수 있게 하는 인공 펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어질 수 있고, 단편은 온전한 항체에 대한 것과 동일한 방식으로 활용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 항체는 인간, 인간화된, 키메라, 분리된, 개, 고양이, 당나귀, 양, 임의의 식물, 동물, 또는 포유류의 것일 수 있다.
MHC
어떤 경우에는, 세포 면역 시스템에 의한 항원성 구조의 인식은 표면-발현된 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 매개된다. 일부 양태에서, 항원-제공 세포 (APC)와 같은 세포는 항원과 같은 단백질을 짧은 펩타이드로 가공하고, 이것은 MHC 분자의 특이적 펩타이드 결합 배수로 제시될 수 있으며, 일부 양태에서는 따라서 T-세포에 의해 인식될 수 있다. T-세포 수용체 (TCR)에 의한 에피토프 (펩타이드 단편)의 특이적 인식은 일반적으로 MHC 분자와의 동시 상호작용을 필요로 한다. 안정한 멀티머 복합체는 결합된 펩타이드를 포함하는 MHC 단백질 서브유닛으로 제조될 수 있다. MHC-항원 복합체는 항원 수용체를 통해 복합체를 인식하는 T-세포와 안정한 구조를 형성할 수 있고, 이로써 항원을 특이적으로 인식하는 T-세포에 대한 결합을 허용한다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 T-세포를 표적화할 수 있다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 T-세포를 특이적으로 표적화할 수 있다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 T-세포 수용체 또는 TCR-유사 분자, 예컨대 TCR-유사 CAR을 표적화할 수 있다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 T-세포 수용체를 특이적으로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 MHC-펩타이드 복합체 (MHC-p)를 포함할 수 있다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 식 (A-B-P)n을 가질 수 있으며, 여기서 A는 MHC 부류 I 또는 MHC 부류 II 단백질의 α 사슬이고, B는 MHC 부류 II 단백질의 β 사슬 또는 MHC 부류 I 단백질의 β2 마이크로글로불린이고, P는 펩타이드이다. 일부 구체예에서, n은 1이다. 일부 구체예에서, n은 2 이상이다. MHC 단백질 서브유닛은 가용성 형태일 수 있다. 예를 들어, 가용성 MHC 단백질 서브유닛은 경막 도메인 또는 그것의 일부의 결실에 의해 자생 MHC 단백질 서브유닛으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, MHC 단백질 서브유닛은 세포질 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, MHC 단백질 서브유닛은 경막 도메인을 포함하지 않는다.
펩타이드 (P)는 부류 I MHC 단백질과의 복합체에 대해 약 6 내지 12개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 8 내지 10개 아미노산 길이일 수 있다. 펩타이드는 MHC 부류 II 단백질과의 복합체에 대해 약 6 내지 20개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 10 내지 18개 아미노산 길이일 수 있다. 펩타이드는 광범위한 다양한 단백질로부터 유래된 서열을 가질 수 있다. 펩타이드는 T-세포 에피토프일 수 있다. 많은 항원의 에피토프 서열이 본 분야에 공지되어 있다. 대안으로서, 에피토프 서열은 자생 MHC 단백질에 결합된 펩타이드를 분리하고 시퀀싱함으로써, 표적 서열로부터 일련의 펩타이드를 합성한 다음 상이한 펩타이드에 대한 T-세포 반응성을 분석함으로써, 또는 상이한 펩타이드와의 일련의 결합 복합체를 생성하고 T-세포 결합을 정량함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 단편의 제조, 서열의 확인, 및 최소 서열의 확인은 미국 특허 번호 5,019,384 및 거기 인용된 참고문헌에 기술된다. 펩타이드는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 편리하게, 그것들은 자동 합성장치를 이용하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있거나, 또는 수동으로 합성될 수 있다. 대안으로서, 특정한 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 제조될 수 있고, 클로닝되고 발현되어 원하는 펩타이드를 제공할 수 있다. 이 경우에, 메티오닌이 최초의 아미노산일 수 있다. 이에 더하여, 펩타이드는 특이적 결합 쌍 중 하나인 단백질에 대한 융합체로서 재조합 방법에 의해 생성될 수 있는데, 이것은 친화성 시약에 의한 융합 단백질의 정제를 허용하며, 이어서 일반적으로 조작된 부위에서 단백질가수분해성 분열이 이루어져 원하는 펩타이드가 수득된다 (예를 들어, Driscoll et al., (1993) J. Mol. Bio. 232:342-350 참조). 또한, 펩타이드는 천연 공급원으로부터 분리될 수 있고, 예를 들어, 이온 교환 물질 상에서의 크로마토그래피, 크기에 의한 분리, 면역친화성 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
일부 구체예에서, α- 및 β-서브유닛이 별도로 생성되고 시험관내에서 회합되어 안정한 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 복합체가 형성될 수 있다 (예를 들어, Altman et al. (1993) 또는 Garboczi et al. (1992) 참조). 일부 구체예에서, α- 및 β-서브유닛은 단일 세포에서 함께 발현된다. 일부 구체예에서, α- 및 β-서브유닛을 가진 단일 분자가 사용된다. 예를 들어, 짧은 펩타이드 링커, 예를 들어, 15 내지 25개 아미노산 펩타이드 또는 링커를 사용하여 2개의 서브유닛을 함께 융합함으로써 단일 사슬 헤테로다이머가 생성될 수 있다 (예를 들어, Bedzyk et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:18615 참조). 또한, 가용성 생성물을 생성하기 위해 자생 헤테로다이머의 분리 및 프로테아제, 예를 들어, 파파인에 의한 분열에 의해 가용성 헤테로다이머가 생성될 수 있다.
가용성 서브유닛은 절단된 단백질을 암호화하는 DNA 구조체로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 발현을 위해 DNA 서열이 적절한 발현 벡터에 삽입될 수 있으며, 이 경우 자생 전사 개시 영역이 이용될 수 있거나, 또는 외인성 전사 개시 영역, 예를 들어, 일반적으로 발생한 염색체 내의 유전자와 관련된 프로모터 이외의 다른 프로모터가 이용될 수 있다. 프로모터는 시험관내 재조합 방법에 의해, 또는 서열의 염색체로의 상동성 통합의 결과로서 도입될 수 있다. 전사 개시 영역은 광범위한 다양한 발현 숙주에 대해 공지되어 있다. 발현 숙주는 원핵생물 또는 진핵생물, 특히 대장균 (대장균), 바실루스 섭틸리스 (B. subtilis), 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포, COS 세포, 원숭이 신장 세포, 림프양 세포, 인간 세포주 등을 포함할 수 있다.
서브유닛은 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 필요하다면 용해될 수 있다. 2개의 서브유닛이 펩타이드와 조합되어 시험관내에서 폴딩되어 사슬내 이황화 결합된 도메인과 안정한 헤테로다이머 복합체를 형성할 수 있다. 펩타이드는 초기 폴딩 반응에 포함될 수 있거나, 또는 후기 단계에서 빈 헤테로다이머에 추가될 수 있다. MHC 결합 부위는 펩타이드의 추가 전에는 펩타이드를 갖지 않을 수 있다. 예외는 천연 펩타이드-MHC 복합체, 예컨대 자가면역 공격 등에 대한 표적인 세포의 표면 상에 존재할 수도 있는 것들로 T 세포를 라벨링하는 것이 바람직한 경우들일 것이다. MHC 헤테로다이머는 부류 I에 대해 α2 및 α1, 또는 부류 II에 대해 α1 및 β1인 2개의 막 원위 도메인에 의해 형성된 그루브 내의 펩타이드에 결합할 것이다. 서브유닛과 펩타이드의 폴딩 및 회합을 허용하는 조건은 본 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, Altman et al. (1993) 및 Garboczi et al. (1992) 참조). 허용 조건의 한 예로서, 대략 등몰량의 용해된 α 및 β 서브유닛이 요소 용액에서 혼합된다. 요소가 없는 완충된 용액으로의 희석 또는 투석에 의해 리폴딩이 개시된다. 펩타이드는 약 1 내지 3일 동안 약 pH 5 내지 5.5에서 빈 부류 II 헤테로다이머에 로딩된 후, 중화, 농축 및 버퍼 교환이 수행된다. 그러나, 본 발명의 실시를 위해서 특정 폴딩 조건은 중요하지 않다는 것이 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.
일부 구체예에서, 모노머 복합체 (α-β-P)는 멀티머화될 수 있다. 예를 들어, α 또는 β 서브유닛 상의 특이적 부착 부위를 통해서 모노머들을 다원자가 실체물에 결합시킴으로써 멀티머가 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 멀티머는 모노머들의 화학적 교차-결합에 의해 형성된다. 단백질을 교차-결합시킬 수 있는 다수의 시약이 본 분야에 공지되어 있으며, 제한되는 것은 아니지만, 아지도벤조일 하이드라지드, N-[4-(p-아지도살리실아미노)부틸]-3'-[2'-피리딜다이티오]프로피온아미드), 비스-설포석신이미딜 수베레이트, 다이메틸아디프이미데이트, 다이석신이미딜타르트레이트, N-γ-말레이미도부티릴옥시석신이미드 에스터, N-하이드록시 설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트, N-석신이미딜[4-아지도페닐]-1,3'-다이티오프로피오네이트, N-석신이미딜[4-아이오도아세틸]아미노벤조에이트, 글루타르알데하이드, 포름알데하이드 및 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥세인-1-카복실레이트를 포함한다. 다원자가 실체물로의 결합을 위한 부착 부위는 자연 발생할 수 있거나, 또는 유전자 조작을 통해서 도입될 수 있다. 부위는 특이적 결합 쌍 구성원이거나 또는 특이적 결합 쌍 구성원을 제공하도록 변형된 것일 수 있으며, 이 경우 상보성 쌍은 특이적 결합 부위의 다중성을 가진다. 상보성 결합 구성원으로의 결합은 화학적 반응, 에피토프-수용체 결합 또는 헵텐-수용체 결합일 수 있으며, 여기서 헵텐은 서브유닛 사슬에 결합된다. 바람직한 구체예에서, 서브유닛 중 하나는 변형 효소에 대한 인식 부위를 제공하는 아미노산 서열에 융합된다. 인식 서열은 일반적으로 서브유닛 중 하나의 카르복시 말단에 가까이에서 융합되어 항원성 펩타이드 결합 부위에서의 잠재적 장해를 피할 수 있다. 편리하게, 발현 카세트는 인식 부위를 암호화하는 서열을 포함할 것이다.
관심의 변형 효소는 BirA, 다양한 글리코실라아제, 파네실 단백질 트랜스페라아제, 단백질 키나아제 등을 포함한다. 서브유닛은 임의의 편리한 시기에, 일반적으로는 모노머의 형성 후에 변형 효소와 반응될 수 있다. 변형 효소에 의해 도입된 기, 예를 들어, 비오틴, 당, 포스페이트, 파네실 등은 상보성 결합 쌍 구성원, 또는 상보성 결합 쌍 구성원을 제공하는 화학적 교차-결합, 비오틴화 등과 같은 추가의 변형을 위한 고유한 부위를 제공한다. 대안의 전략은 서브유닛에 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 도입하는 것이며, 이로써 결합을 위한 고유하고 화학적으로 반응성인 부위가 도입된다. 부착 부위는 또한 자연 발생 또는 도입된 에피토프일 수 있으며, 이 경우 다원자가 결합 파트너는 항체, 예를 들어, IgG, IgM 등일 것이다. 임의의 변형이 결합을 방해하지 않는 부위, 예를 들어, C-말단 근처에서 이루어질 것이다. 멀티머 형성의 예는 단백질 기질의 비오틴화를 촉매하는 효소 BirA에 대한 인식 서열의 도입이다. 그 다음에, 비오틴화된 서브유닛을 가진 모노머는 비오틴이 매우 높은 친화성으로 결합하는 다원자가 결합 파트너, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 결합된다. 스트렙타비딘은 4의 원자가를 가지며, (α-β-P)4의 멀티머를 제공한다. 다원자가 결합 파트너는 용액에서 자유로울 수 있거나, 또는 불용성 지지체에 부착될 수 있다. 적합한 불용성 지지체의 예들은 비드, 예를 들어, 자기 비드, 막 및 미세역가 플레이트를 포함한다. 이것들은 전형적으로 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌), 다당류, 나일론 또는 나이트로셀룰로오스로 이루어진다. 불용성 지지체로의 부착은 결합 복합체가 T 세포의 분리에 사용되어야 할 때 유용하다.
B-세포 수용체 항원
B 세포, 예컨대 B 세포의 작은 집단 또는 B 세포 서브세트는 B-세포 수용체 (BCR)를 통해 항원을 인식할 수 있다. B-세포 수용체 항원의 서브유닛을 가진 테트라머는 이들 B 세포 또는 B 세포 서브세트를 확인 및 연구하는데 사용될 수 있다. B-세포 수용체 항원은 BCR을 통해 면역 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 가진 임의의 항원을 포함한다. 예를 들어, B-세포 수용체 항원은 대상체를 면역화하는데 사용된 항원일 수 있다. B-세포 수용체 항원은 B-세포 수용체 항원의 작은 선형-펩타이드 부분을 사용함으로써 테트라머로 만들어질 수 있으며, 여기서 펩타이드 부분은 BCR 에피토프를 포함한다. 그 다음에, 발현 벡터 내에 비오티닐화 부위를 가진 작은 선형화된 펩타이드 부분이 발현되고 테트라머에 사용되는 모노머로서 정제될 수 있다. 그 다음에, 비오티닐화된 서브유닛을 가진 모노머는 비오틴이 매우 높은 친화성으로 결합하는 다원자가 결합 파트너, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 결합될 수 있다. 스트렙타비딘은 4의 원자가를 갖지며, B-세포 수용체 항원의 테트라머를 제공한다. 결과의 테트라머는 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다.
세포
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 세포이다. 예를 들어, 친화성 부분은 온전한 세포, 화합물 (예를 들어, 약물)로 처리된 세포, 고정된 세포, 용해된 세포, 또는 이것들의 임의의 조합물일 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 단일 세포이다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 T-세포 또는 B-세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 복수의 세포이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 T-세포이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 B-세포이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 항원 제공 세포 (APC)이다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 특정한 세포 유형 또는 세포 서브세트이다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포일 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 특정한 항원을 특이적으로 인식하는 TCR을 포함하는 T-세포일 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 특정한 MHC-펩타이드 복합체를 특이적으로 인식하는 TCR을 포함하는 T-세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 세포이다.
소분자
일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분은 약물과 같은 소분자이다. 예를 들어, 소분자는 거대환형 분자, 억제제, 약물, 또는 화학적 화합물일 수 있다. 일부 구체예에서, 소분자는 5개 이하의 수소 결합 공여체를 포함한다. 일부 구체예에서, 소분자는 10개 이하의 수소 결합 억셉터를 포함한다. 일부 구체예에서, 소분자는 500 달톤 이하의 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 소분자는 약 180 내지 500 달톤의 분자량을 가진다. 일부 구체예에서, 소분자는 5 이하의 옥탄올-물 분배 계수 log P를 포함한다. 일부 구체예에서, 소분자는 -0.4 내지 5.6의 분배 계수 log P를 포함한다. 일부 구체예에서, 소분자는 40 내지 130의 몰 굴절률을 가진다. 일부 구체예에서, 소분자는 약 20 내지 70개의 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, 소분자는 140 옹스트롬2 이하의 극성 표면적을 가진다.
핵산
일부 구체예에서, 친화성 부분은 DNA 또는 RNA (예를 들어, mRNA)와 같은, 폴리머 형태의 리보뉴클레오타이드 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드 (아데닌, 구아닌, 티민, 또는 시토신)이다. DNA는 선형 DNA 분자 (예를 들어, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드, 및 염색체에서 발견되는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 친화성 부분은 단일-가닥, 이중-가닥, 작은 간섭 RNA (si RNA), 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 염색체, 유전자, 비-암호화 게놈 서열, 게놈 DNA (예를 들어, 단편화된 게놈 DNA), 정제된 폴리뉴클레오타이드, 분리된 폴리뉴클레오타이드, 혼성화된 폴리뉴클레오타이드, 전사 인자 결합 부위, 미토콘드리아 DNA, 리보솜 RNA, 진핵세포 폴리뉴클레오타이드, 원핵세포 폴리뉴클레오타이드, 합성된 폴리뉴클레오타이드, 결찰된 폴리뉴클레오타이드, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 핵산 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 메틸화된 폴리뉴클레오타이드, 탈메틸화된 폴리뉴클레오타이드, 이것들의 임의의 단편, 또는 이것들의 임의의 조합물이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 이중 가닥 영역과 이중 가닥이 아닌 단부 (예를 들어, 5' 또는 3' 오버행(overhang) 영역)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 재조합 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 이종성 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 친화성 부분은 박테리아 (예를 들어, 대장균), 효모, 포유류, 또는 곤충 세포에서 생성된 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 유기체에 이종성인 폴리뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구체예에서, 친화성 부분은 앱타머이다. 앱타머는 단백질과 같은 표적 피분석물에 높은 특이성 및 친화성으로 결합하는 분리된 핵산 분자이다. 앱타머는 그것의 주어진 표적과 특이적으로 결합하기 위한 화학적 접촉을 제공하는 특정한 입체형태(들)로 고정된 3차원 구조이다. 앱타머는 핵산 기반 분자이지만 앱타머와 유전자 및 mRNA와 같은 다른 핵산 분자 사이에는 근본적인 차이가 있다. 후자에서, 핵산 구조는 그것의 선형 염기 서열을 통해서 정보를 암호화하고, 따라서 이 서열은 정보 저장 기능에 중요하다. 완전히 반대로, 표적 분자의 특이적 결합에 기초한 앱타머 기능은 보존된 선형 염기 서열 (비-암호화 서열)에 전적으로 의존하지 않고, 오히려 특정한 2차/3차/4차 구조에 의존한다. 앱타머가 지닐 수 있는 임의의 암호화 가능성은 전적으로 우연적이며 앱타머와 그것의 동족 표적의 결합에서 어떠한 역할도 하지 않는다. 또한, 앱타머는 특정한 단백질에 결합하는 자연 발생 핵산 서열과 구별되어야 한다. 이들 후자의 서열은 자연 발생 핵산의 전사, 번역 및 수송에 연루되는 전문화된 하위-그룹의 단백질 (예를 들어, 핵산-결합 단백질)에 결합하는 유기체의 게놈 내에 매립된 자연 발생 서열이다. 한편, 앱타머는 짧은, 분리된, 비-자연 발생 핵산 분자이다. 핵산-결합 단백질에 결합하는 앱타머가 확인될 수 있지만, 대부분의 경우 이러한 앱타머는 사실상 핵산-결합 단백질에 인식된 서열과 서열 동일성을 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 더 중요한 점은 앱타머가 사실상 모든 단백질 (핵산-결합 단백질만은 아님), 뿐만 아니라 소분자, 탄수화물, 펩타이드 등을 포함하는 거의 모든 관심의 표적에 결합할 수 있다는 것이다. 대부분의 표적에는, 심지어 단백질의 경우에도, 그것이 결합하는 자연 발생 핵산 서열은 존재하지 않는다. 이러한 서열을 가진 표적, 예를 들어, 핵산-결합 단백질에 있어서, 이러한 서열은 단단하게 결합한 앱타머와 비교하여 사실상 비교적 낮은 결합 친화성이 사용된 결과로서 앱타머와 다를 것이다. 앱타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, 결합을 통해서 표적 활성 또는 결합 상호작용을 조정할 수 있으며, 앱타머는 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다. 표적으로의 특이적 결합의 기능적 성질은 앱타머의 고유한 특성이다. 전형적인 앱타머는 6-35 kDa 크기 (20-100개 뉴클레오타이드)이고, 마이크로몰 내지 나노몰 미만의 친화성으로 표적에 결합하고, 밀접히 관련된 표적에 대해 구별될 수 있다 (예를 들어, 앱타머는 동일한 유전자 패밀리의 관련된 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다). 앱타머는 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 및 특이적 표적과 결합하기 위한 입체 배제와 같이 흔히 볼 수 있는 분자간 상호작용을 사용할 수 있다. 앱타머는 높은 특이성 및 친화성, 낮은 면역원성, 생물학적 효능, 및 뛰어난 약동학적 성질을 포함하는 치료제 및 진단제로서 사용을 위한 다수의 바람직한 특징을 가진다. 앱타머는 공유 결합된 상보성 폴리뉴클레오타이드의 혼성화로부터 형성된 분자 줄기 및 루프 구조 (예를 들어, 헤어핀 루프 구조)를 포함할 수 있다. 줄기는 혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 루프는 2개의 상보성 폴리뉴클레오타이드를 공유 결합시키는 영역이다.
일부 구체예에서, 친화성 부분은 복수의 친화성 부분, 예컨대 친화성 부분의 혼합물 또는 라이브러리이다. 일부 구체예에서, 친화성 부분은 복수의 상이한 친화성 부분이다. 예를 들어, 친화성 부분은 복수의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 또는 30,000개의 친화성 부분을 포함할 수 있다.
친화성- 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 핵산이다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 핵산이다. 일부 구체예에서, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 테트라머 복합체의 하나 이상의 코어 요소에 결합된 핵산이다. 예를 들어, 핵산은 모노머 또는 테트라머 스트렙타비딘 코어에 컨쥬게이션될 수도 있다. 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 예시의 개략도는 도 10A, 10B, 13, 14, 및 18에서 도시된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 친화성 부분에 직접 결합된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 친화성 부분에 간접적으로 결합된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 친화성 부분에 비공유 결합에 의해 결합된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 친화성 부분에 공유 결합으로 결합된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 합성된 올리고뉴클레오타이드이다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 친화성 부분의 표적 분석물과 실질적으로 직접 상호작용하지 않는다.
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 바코드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 Antigen ID (AID) 서열 및 항원 분자 바코드 (AMB) 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 Antigen ID (AID) 서열, 융합 서열, 프라이머 부위, 분자 바코드 서열, 불변 서열, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 (예를 들어, 아민, 티올 또는 비오틴) 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분과의 컨쥬게이션을 가능하게 하기 위한 화학적 변형을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 복수의 올리고뉴클레오타이드는 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 복수의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 의해 포함될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 복수의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 또는 30,000개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 또는 30,000개 올리고뉴클레오타이드는 복수의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 또는 30,000개 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 의해 포함될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열, 올리고뉴클레오타이드 융합 서열, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 Antigen ID ( AID) 서열
올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열 또는 그것의 보체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드는 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드를 포함하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체 또는 테트라머 올리고뉴클레오타이드 복합체의 확인을 허용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드는 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드가 부착된 친화성 부분의 확인을 허용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드는 상이한 표적 피분석물에 결합한 복수의 상이한 친화성 부분으로부터 친화성 부분을 확인하는데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체에 대해서만 배타적으로 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 복합체에 대해서만 배타적으로 바코드화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드는 친화성 부분에 대해서만 배타적으로 바코드화될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 특정 친화성 부분에 대해서만 바코드화될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 항원 바코드는 고유한 바코드 서열일 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 중 임의의 하나의 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드가 고유한 바코드 서열일 수 있다. 이론상 가능한 상이한 항원 바코드 서열의 수는 바코드 서열의 길이에 직접 의존할 수 있다. 예를 들어, 무작위로 조립된 아데닌, 티미딘, 구아노신 및 시티딘 뉴클레오타이드를 가진 DNA 바코드가 사용될 수 있다면, 가능한 바코드 서열의 이론상 최대 숫자는 10개 뉴클레오타이드의 길이에 대해 1,048,576일 수 있고, 15개 뉴클레오타이드의 길이에 대해서는 1,073,741,824일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 둘 이상의 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열 또는 그것의 보체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 뉴클레오타이드의 무작위로 조립된 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 축퇴성 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 공지된 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 미리 한정된 서열일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 서열은 그것이 연결된 친화성 부분에 대해 바코드화된 공지된 고유한 서열이며, 이로써 올리고뉴클레오타이드 항원 바코드 (예를 들어, 서열 판독 부위) 또는 그것의 보체를 포함하는 신호를 사용하여 상이한 표적 피분석물과 상호작용하는 복수의 상이한 친화성 부분의 친화성 부분을 확인할 수 있다.
예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 Antigen ID (AID) 서열인 바코드를 포함할 수 있다. AID 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 대해 바코드화될 수 있다. AID 서열은 친화성 부분이 표적으로 하는 항원에 대해 바코드화될 수 있다. AID 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분 및/또는 친화성 부분이 표적으로 하는 항원을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, AID 서열은 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 항체에 대해 바코드화될 수 있다. 예를 들어, AID 서열은 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 항체가 표적으로 하는 항원에 대해 바코드화될 수 있다. 예를 들어, AID 서열은 세포의 면역표현형 세포에 사용될 수 있다. 예를 들어, AID 서열은 MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드에 대해 바코드화될 수 있다.
AID 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 의해 표적화된 각각의 항원에 대해 고유할 수 있다. AID 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 대해 고유할 수 있다. 예를 들어, AID 서열은 세포의 상이한 표적 항원에 특이적으로 결합한 각각의 항체에 대해 고유할 수 있다. 일부 구체예에서, AID 서열은 한정된 서열이다. 일부 구체예에서, AID 서열은 공지된 서열이다. 각각의 올리고뉴클레오타이드에 대한 AID 서열은 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 증폭 생성물을 시퀀싱함으로써, 예를 들어, 차세대 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열
올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열 또는 그것의 보체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 바코드는 올리고뉴클레오타이드 바코드를 포함하는 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체의 분자의 확인을 허용할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체의 분자에 대해서만 배타적으로 바코드화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드는 친화성 부분의 분자에 대해서만 배타적으로 바코드화될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 친화성 부분의 특정 분자에 대해서만 바코드화될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 분자 바코드는 고유한 바코드 서열일 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 중 임의의 하나의 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드는 고유한 바코드 서열일 수 있다. 이론적으로 가능한 상이한 분자 바코드 서열의 수는 바코드 서열의 길이에 직접 의존할 수 있다. 예를 들어, 무작위로 조립된 아데닌, 티미딘, 구아노신 및 시티딘 뉴클레오타이드를 가진 DNA 바코드가 사용될 수 있다면, 가능한 바코드 서열의 이론상 최대 숫자는 10개 뉴클레오타이드의 길이에 대하여 1,048,576일 수 있고, 15개 뉴클레오타이드의 길이에 대하여 1,073,741,824일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 45, 또는 50개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 둘 이상의 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열 또는 그것의 보체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 뉴클레오타이드의 무작위로 조립된 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 축퇴성 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 공지된 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 미리 한정된 서열일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 분자 바코드 서열은 표적 피분석물과 상호작용하는 복수의 친화성 부분 분자의 친화성 부분 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 항원 분자 바코드 (AMB) 서열인 바코드를 포함할 수 있다. 항원 분자 바코드 (AMB) 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 올리고뉴클레오타이드 분자에 대해 고유할 수 있다. AMB 서열은 용기, 예를 들어, 에멀젼 액적에서 개개의 세포의 항원과 같은 항원에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 분자의 수를 계수하는 것을 가능하게 할 수 있다. 각각의 올리고뉴클레오타이드에 대한 AMB 서열은 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 증폭 생성물을 시퀀싱함으로써, 예를 들어, 차세대 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 융합 서열
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열을 포함할 수 있다. 융합 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 예를 들어, 세포 표면-결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 예를 들어, TCR 또는 BCR-결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 위로액적-특이적 바코드 서열의 PCR 확장을 허용할 수 있다. 복수의 올리고뉴클레오타이드의 각각의 올리고뉴클레오타이드의 융합 서열은 동일할 수 있다. 융합 서열은 액적 바코드의 서열에 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 서열은 올리고뉴클레오타이드의 단부에 위치된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드의 단부에서 융합 서열은 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 직접 컨쥬게이션되지 않는다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드의 단부에서 융합 서열은 자유 단부를 포함한다.
융합 서열은 용기 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 같은 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드의 영역에 상보성인 영역을 포함할 수 있다. 융합 서열은 용기 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 같은, 폴리뉴클레오타이드의 영역의 보체에 상보성인 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 서열은 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드 또는 바코드, 예컨대 용기 바코드를 포함하는 그것의 보체에 상보성인 3' 영역, 예컨대 3' 말단 영역을 포함할 수 있다.
3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드와 같은, 표적 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에 핵산을 추가하기 위해 사용된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드와 같은, 표적 뉴클레오타이드의 3' 단부에 핵산을 추가하기 위한 주형으로서 사용된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드와 같은, 표적 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드와 같은, 표적 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역, 예컨대 3' 말단 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구체예에서, 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드이다. 용기 바코드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 추가될 수 있다. 예를 들어, 용기 바코드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있다. 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역, 예컨대 3' 말단 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 단일 분자로부터 기원한 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, 3' 태그화 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드로부터 기원한 증폭된 생성물이다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 5'의 영역은 프라이머 또는 그것에 보체에 상보성인 영역을 포함할 수 있다. 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 5'의 영역은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는데 사용될 수 있는 프라이머에 상보성인 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 5'의 영역에 상보적인 제1 프라이머 또는 그것의 보체 및 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 부위에 상보성인 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트가 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는데 사용될 수 있다.
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 5'의 영역은 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위해 사용된 프라이머 또는 그것의 보체에 상보성인 영역을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 융합 서열은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개, 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 융합 서열은 공지된 길이의 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 융합 서열은 공지된 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 융합 서열은 미리 한정된 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 융합 서열은 공지된 길이를 가진 미지의 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 융합 서열은 공지된 길이를 가진 공지된 서열일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 불변 서열
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 불변 서열을 포함할 수 있다. 불변 서열은 선택적이다. 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 올리고뉴클레오타이드의 불변 서열은 동일할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드의 길이를 증가시키거나 또는 올리고뉴클레오타이드 바코드, 올리고뉴클레오타이드 융합부, 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 부위 중 하나 이상을 서로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 불변 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 단부에서 친화성 부분에 결합될 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 복합체의 친화성 부분에 부착된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열의 업스트림에 위치된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열에 대하여 5'에 위치될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열의 다운스트림에 위치된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열에 대하여 3'에 위치될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 바코드의 업스트림에 위치된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 바코드에 대하여 5'에 위치될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 바코드의 다운스트림에 위치된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 바코드에 대하여 3'에 위치될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 융합 서열의 업스트림에 위치된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 융합 서열에 대하여 5'에 위치될 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열과 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 복합체의 친화성 부분 사이에 삽입된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열에 대하여 5'에 위치되고 올리고뉴클레오타이드의 친화성 부분에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열과 올리고뉴클레오타이드 바코드 사이에 삽입된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열에 대하여 3'에 그리고 올리고뉴클레오타이드 바코드에 대하여 5'에 위치될 수 있다. 일부 구체예서, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 융합 서열과 올리고뉴클레오타이드 바코드 사이에 삽입된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 올리고뉴클레오타이드 바코드에 대하여 3'에 그리고 올리고뉴클레오타이드 융합 서열에 대하여 5'에 위치될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 250, 300, 400, 500개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 뉴클레오타이드의 비무작위 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 공지된 길이의 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 공지된 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 미리 한정된 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 공지된 길이를 가진 미지의 서열일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 불변 서열은 공지된 길이를 가진 공지된 서열일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 부위
친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 프라이머 부위는 프라이머, 예컨대 증폭 프라이머에 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열은 증폭 또는 시퀀싱과 같은 반응에 프라이머 결합 부위로서 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열은 증폭 또는 시퀀싱과 같은 반응에 사용되는 한 쌍의 프라이머에 대한 제1 프라이머 결합 서열일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열은 정방향 프라이머 결합 부위일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 부위는 역방향 프라이머 결합 부위일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 부위는 정방향 프라이머 결합 부위일 수 있고, 이 올리고뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 프라이머 결합 서열은 역방향 프라이머 결합 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열은 범용 프라이머 결합 서열이다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 이 올리고뉴클레오타이드에 부착된 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드)의 프라이머 결합 서열은 섭씨 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1도 이하만큼 차이가 있는 용융 온도를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 이 올리고뉴클레오타이드에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 프라이머 결합 서열의 뉴클레오타이드 서열은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 프라이머 결합 서열과는 혼성화하지 않도록 상이할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 이 올리고뉴클레오타이드에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 프라이머 결합 서열의 뉴클레오타이드 서열은 올리고뉴클레오타이드에 부착된 폴리뉴클레오타이드의 프라이머 결합 서열이 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열과는 혼성화하지 않도록 상이할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 요소의 배열
올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 융합 서열이 올리고뉴클레오타이드의 한 단부에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 융합 서열의 업스트림에 올리고뉴클레오타이드 바코드를 포함하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 바코드의 업스트림에 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 불변 서열이 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 불변 서열이 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열의 업스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 불변 서열이 올리고뉴클레오타이드의 하나의 단부, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 융합 서열을 포함하지 않는 올리고뉴클레오타이드의 말단에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 융합 서열, 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 올리고뉴클레오타이드 불변 서열의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 융합 서열, 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 올리고뉴클레오타이드 불변 서열의 순서로 배열될 수 있으며, 친화성 부분으로부터 멀어지는 방향으로 전파된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 5' 단부에서 3' 단부로 또는 3' 단부에서 5' 단부로 올리고뉴클레오타이드 융합 서열, 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 올리고뉴클레오타이드 불변 서열의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 5' 단부 올리고뉴클레오타이드 융합 서열, 고유한 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열, 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 서열 및 (예를 들어, 3' 단부에 부착된 1차 아민 기를 통해) 친화성 부분에 부착된 3' 올리고 뉴클레오타이드 불변 서열을 상기 순서대로 포함할 수 있다. 예를 들어, 친화성 부분에 부착된 올리고뉴클레오타이드는, 친화성 부분으로부터 멀어지는 방향으로 전파되어, 올리고뉴클레오타이드 융합 서열, 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열, 올리고뉴클레오타이드 불변 서열 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 결합 부위 서열의 순서로 배열될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 융합 서열이 올리고뉴클레오타이드의 한 단부에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열이 AID 서열의 다운스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열이 AMB 서열의 다운스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열이 불변 서열의 다운스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열이 프라이머 부위의 다운스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위가 올리고뉴클레오타이드의 한 단부에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위가 AID 서열의 업스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위가 AMB 서열의 업스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고 뉴클레오타이드는 프라이머 부위가 불변 서열의 업스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위가 융합 서열의 업스트림에 위치하는 순서로 배열될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 융합 서열의 업스트림에 AID 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위의 다운스트림에 AID 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. AID 서열은 AMB 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. AID 서열은 불변 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열과 프라이머 부위 사이에 AID 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 융합 서열의 업스트림에 AMB 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위의 다운스트림에 AMB 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. AMB 서열은 AID 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. AMB 서열은 불변 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열과 프라이머 부위 사이에 AMB 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 융합 서열의 업스트림에 불변 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 부위의 다운스트림에 불변 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다. 불변 서열은 AID 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. 불변 서열은 AMB 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열과 프라이머 부위 사이에 불변 서열을 포함하는 순서로 배열될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 AMB 서열 및/또는 AID 서열이 올리고뉴클레오타이드의 한 단부, 예를 들어, 융합 서열 또는 프라이머 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 단부에 위치되지 않도록 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AID 서열, AMB 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AMB 서열, AID 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다.
예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AID 서열, AMB 서열, 불변 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AMB 서열, AID 서열, 불변 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, 불변 서열, AID 서열, AMB 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, 불변 서열, AMB 서열, AID 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AID 서열, 불변 서열, AMB 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AMB 서열, 불변 서열, AID 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다.
예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열, AID 서열, AMB 서열, 불변 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열되며, 친화성 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분으로부터 멀어지는 방향으로 전파된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 5' 단부에서 3' 단부로 융합 서열, AID 서열, AMB 서열, 불변 서열 및 프라이머 부위의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 5' 단부 융합 서열, AID 서열, AMB 서열, 불변 서열 및 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부에 부착된 항체의 1차 아민 기를 통해) 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성 부분에 부착된 3' 프라이머 부위를 상기 순서대로 포함할 수 있다.
친화성- 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 제조
본원에서 기술된 방법 및 조성물에서 이용된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 임의의 편리한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 친화성 부분은 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커를 통해) 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 친화성 부분은 공유 결합으로 (예를 들어, 화학적 가교를 통해) 또는 비-공유 결합으로 (예를 들어, 스트렙타비딘-비오틴을 통해) 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 사용될 수 있는 다양한 상이한 친화성 부분, 근접 결찰 검정을 위한 올리고뉴클레오타이드의 디자인, 및 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 친화성 부분으로의 이러한 올리고뉴클레오타이드의 연결을 포함하여, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 디자인 및 제조가 본 분야에 널리 설명되어 있다. 본 분야에 설명된 상세한 내용 및 원리는 본 발명의 방법에서의 사용을 위한 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 설계에 적용될 수 있다 (예를 들어, WO 2007107743, 및 미국 특허 번호 7,306,904 및 6,878,515 참조).
올리고뉴클레오타이드와 친화성 부분 사이의 직접적인 커플링 반응이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 각각은 나머지 하나에서 작용기와 반응할 수 있는 작용기 (예를 들어, 치환체 또는 화학적 핸들)를 지닌다. 작용기는 올리고뉴클레오타이드 또는 친화성 부분 상에 존재할 수 있거나, 또는 이들 구성요소에 도입될 수 있다 (예를 들어, 산화 반응, 환원 반응, 분열 반응 등을 통해). 핵산/폴리펩타이드 컨쥬게이트를 생성하기 위한 방법이 기술되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,733,523 참조).
올리고뉴클레오타이드에 대한 커플링에 사용될 수 있는 항체 또는 폴리펩타이드의 작용기는, 제한되는 것은 아니지만, 탄수화물, 아미노산의 티올 기 (HS-), 아미노산의 아민 기 (H2N-), 및 아미노산의 카르복시 기를 포함한다. 예를 들어, 탄수화물 구조는 알데하이드로 산화될 수 있고, H2NNH 기 포함 화합물과 반응되어 작용기 -C-NH-NH-를 형성할 수 있다. 예를 들어, 티올 기는 티올-반응성 기와 반응되어 티오에테르 또는 이황화물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 자유 티올 기는 자생 시스테인 잔기에서 이황화물의 티올화 또는 분할에 의해 단백질에 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노 기 (예를 들어, 아미노-말단의 것 또는 리신 잔기의 오메가 아미노 기)는 친전자성 기 (예를 들어, 활성화된 카르복시 기)와 반응되어 아미드 기를 형성할 수 있다. 예를 들어, 카르복시 기 (예를 들어, 2산성 알파 아미노산의 카르복시-말단 또는 카르복시 기)는 활성화되고 아미노 기와 접촉되어 아미드 기를 형성할 수 있다. 다른 예시적인 작용기는, 예를 들어, SPDP, 카보다이이미드, 글루타르알데하이드 등을 포함한다.
예시적인 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 상업용 키트를 사용하여 친화성 부분에 공유 결합된다 ("All-in-One Antibody-Oligonucleotide Conjugation Kit"; Solulink, Inc.). 예를 들어, 먼저 3'-아미노-올리고뉴클레오타이드가 설포-S-4FB로 유도체화될 수 있다. 두 번째로, 친화성 부분이 S-HyNic 기로 변형될 수 있다. 세 번째로, HyNic-변형된 친화성 부분이 4FB-변형된 올리고뉴클레오타이드와 반응되어 비스-아릴하이드라존 매개된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. 과잉의 4FB-변형된 올리고뉴클레오타이드는 자성의 친화성 매트릭스를 통해 더 제거될 수 있다. 전체적인 친화성 부분 회수율은 HyNic-변형된 친화성 부분 및 4FB-변형된 올리고뉴클레오타이드에서 자유롭게 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 비스-아릴하이드라존 결합은 열 (예를 들어, 94℃)과 pH (예를 들어, 3-10)에 모두 안정할 수 있다.
결합 기가 이용되는 경우, 이러한 링커는 결합 기를 통해서 친화성 부분과 올리고뉴클레오타이드의 공유 부착 또는 비-공유 부착을 제공하도록 선택될 수 있다. 다양한 적합한 링커가 본 분야에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 링커는 적어도 약 50 또는 100 달톤이다. 일부 구체예에서, 링커는 최대 약 300; 500; 1,000; 10,000 또는 100,000 달톤이다. 링커는 어느 한 단부에 올리고뉴클레오타이드와 결합할 수 있는 반응성 기능성을 가진 작용기를 포함할 수 있다. 링커는 어느 한 단부에 친화성 부분과 결합할 수 있는 반응성 기능성을 가진 작용기를 포함할 수 있다. 작용기는 올리고뉴클레오타이드, 친화성 부분 및/또는 링커 상에 존재할 수 있거나, 또는 이들 구성요소에 도입될 수 있다 (예를 들어, 산화 반응, 환원 반응, 분열 반응 등을 통해).
예시적인 링커는 폴리머, 지방족 탄화수소 사슬, 불포화 탄화수소 사슬, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 환형 링커, 비환형 링커, 탄수화물, 에테르, 폴리아민, 및 본 분야에 공지된 다른 것들을 포함한다. 링커의 예시적인 작용기는 친핵성 작용기 (예를 들어, 아민, 아미노 기, 하이드록시 기, 설프하이드릴 기, 아미노 기, 알코올, 티올, 및 하이드라지드), 친전자성 작용기 (예를 들어, 알데하이드, 에스터, 바이닐 케톤, 에폭사이드, 아이소시아네이트, 및 말레이미드), 및 고리추가 반응, 이황화물 결합 형성, 또는 금속에 대한 결합이 가능한 작용기를 포함한다. 예를 들어, 링커의 작용기는 1차 아민, 2차 아민, 하이드록삼산, N-하이드록시석신이미딜 에스터, N-하이드록시석신이미딜 카보네이트, 옥시카보닐이미다졸, 나이트로페닐에스터, 트라이플루오로에틸 에스터, 글리시딜 에테르, 바이닐 설폰, 말레이미드, 아지도벤조일 하이드라지드, N-[4-(p-아지도살리실아미노)부틸]-3'-[2'-피리딜다이티오]프로피온아미드), 비스-설포석신이미딜 수베레이트, 다이메틸아디프이미데이트, 다이석신이미딜타르트레이트, N-말레이미도부티릴옥시석신이미드 에스터, N-하이드록시 설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트, N-석신이미딜[4-아지도페닐]-1,3'-디티오프로피오네이트, N-석신이미딜[4-아이오도아세틸]아미노벤조에이트, 글루타르알데하이드, 및 석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥세인-1-카복실레이트, 3-(2-피리딜다이티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터 (SPDP), 4- (N-말레이미도메틸)-사이클로헥세인-1-카복실산 N-하이드록시석신이미드 에스터 (SMCC) 등일 수 있다.
다른 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 시험관내에서 친화성 부분을 암호화하는 벡터로부터 친화성 부분을 생성하는 것과 같은, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 수득하는 시험관내 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 관심의 이러한 시험관내 프로토콜의 예들은 RepA 기반 프로토콜 (예를 들어, Fitzgerald et al., Drug Discov Today (2000) 5:253-58 및 WO9837186 참조), 리보솜 디스플레이 기반 프로토콜 (예를 들어, Hanes et al., PNAS (1997) 94:4937-42; Roberts et al., Curr Opin Chem Biol (1999) Jun; 3: 268-73; Schaffitzel et al., J Immunol Methods (1999) Dec 10; 231:119-35; 및 WO9854312 참조) 등을 포함한다.
항체에 핵산 분자를 컨쥬게이션하기 위한 기술은 본 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antibody　Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled　Antibody　In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); 및 Thorpe et al, 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58 참조. 또한, 예를 들어, PCT 공보 WO 89/12624 참조). 예를 들어, 핵산 분자는, 예컨대 각기 N-하이드록시석신이미드 에스터 또는 말레이미드 기능성을 통해, 항체 상의 리신 또는 시스테인에 공유 결합으로 부착될 수 있다.
표적 항원
친화성 부분의 표적 항원은 핵산 분지일 수 있거나, 또는 표적 단백질 또는 펩타이드와 같은 단백질성 물질일 수 있다. 표적 항원은 샘플에서 세포 상에 존재하는 화합물 또는 조성물일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 항원은, 특히 인간과 같은 포유류에서 세포-매개 면역 반응 (즉, 후천적 면역 반응)을 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 항원은 MHC 분자에 관하여 T 세포에 의해 인식될 수 있다. 표적 항원은, 제한되는 것은 아니지만, 세포, 조직 추출물, 조직 또는 세포 용해물, 단백질, 개별적으로 또는 혼합물로서, 복수의 단백질, 펩타이드, 펩타이드의 혼합물, 지질, 탄수화물, 당 등을 포함한다. 표적 항원은 감염성 질환, 자가면역 질환, 또는 암과 같은 질환의 특징일 수 있다. 표적 항원은, 예를 들어, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 암 항원 등일 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원은, 예를 들어, 바이러스 코팅 단백질, 인플루엔자 바이러스 항원, HIV 항원, B형 간염 항원, 또는 C형 간염 항원을 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 항원은 종양 세포 또는 암 세포에 의해 단독으로 또는 지배적으로 발현되거나 또는 과발현되는 암 항원 (예를 들어, 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물 등)이며, 이로써 항원은 종양 또는 암과 관련된다. 암 항원은 오직 한 가지 유형의 암 또는 종양의 암 항원일 수 있고, 이로써 암 항원은 오직 한 가지 유형의 암 또는 종양과 관련되거나 그것이 특징이 된다. 대안으로서, 암 항원은 둘 이상의 유형의 암 또는 종양의 암 항원일 수 있다 (예를 들어, 그것의 특징일 수 있다). 예를 들어, 암 항원은 유방암과 전립선암 세포에 의해 모두 발현될 수 있고 정상, 비-종양, 또는 비-암 세포에 의해서는 전혀 발현되지 않거나 단지 최소한으로만 발현될 수 있다. 암 항원은 흑색종 암 항원 또는 유방암 항원일 수 있다. 예시적인 암 항원은 gp100. MART-1, NY-ESO-1, 단백질의 MAGE 패밀리의 구성원, 예를 들어, MAGE-A1, 메소텔린, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, PMSA, Her-2, 및 p53로 구성된 군의 것들을 포함한다.
표적 항원은 천연, 인공, 합성, 또는 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 따라서, 표적 항원은 합성, 재조합, 분리된, 및/또는 정제된 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드일 수 있다. 이러한 항원을 제조하거나 획득하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 및 단백질 (예를 들어, 항원성 폴리펩타이드 및 단백질)을 데 노보(de novo) 합성하는 적합한 방법은 Chan et al., Fmoc Solid Phase　Peptide Synthesis, Oxford University Press. Oxford, United Kingdom, 2005;　Peptide　and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press. Oxford. United Kingdom, 2000; 및 미국 특허 번호 5,449,752에 기술되어 있다. 또한, 폴리펩타이드 및 단백질 (예를 들어, 항원성 폴리펩타이드 및 단백질)은 표준 재조합 방법을 사용해서 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 사용하여 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994 참조. 많은 항원의 뉴클레오타이드 서열이 본 분야에 공지되어 있으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 웹사이트의 GenBank 데이터베이스로부터 이용할 수 있다. 또한, 항원은 식물, 박테리아, 곤충, 포유류, 예를 들어, 래트, 인간 등과 같은 공급원으로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다. 분리 및 정제 방법은 본 분야에 공지되어 있다.
항원은 자유 항원, 예를 들어, 미결합된 항원성 펩타이드 (예를 들어, 자유 펩타이드)일 수 있거나, 또는 결합된 항원, 예를 들어, MHC-펩타이드 테트라머 또는 펩타이드로 펄스된 운반 세포에 의해 제공된 항원성 펩타이드일 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 피분석물은 막 결합된 단백질이다. 한 구체예에서, 막 결합된 단백질은 단일 경막 (TM) 도메인을 가진 고전적 I형 막 단백질인 CD4이다 (Carr et al., (1989) J. Biol . Chem . 264:21286-95). 또 다른 구체예에서, 막 결합된 단백질은 멀티-스패닝, G-단백질 결합된 수용체 (GPCR) 막 단백질인 GPR77이다 (Cain & Monk, (2002) J. Biol . Chem . 277:7165-69).
추가의 예시적인 막 결합된 단백질은, 제한되는 것은 아니지만, GPCR (예를 들어, 아드레날린성 수용체, 안지오텐신 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 무스카린성 아세틸콜린 수용체, 뉴로텐신 수용체, 갈라닌 수용체, 도파민 수용체, 오피오이드 수용체, 에로토닌 수용체, 소마토스타틴 수용체 등), 이온 채널 (예를 들어, 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 나트륨 채널, 칼륨 채널 등), 수용체 티로신 키나아제, 수용체 세린/트레오닌 키나아제, 수용체 구아닐레이트 사이클라아제, 성장 인자 및 호르몬 수용체 (예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF) 수용체) 등을 포함한다. 막-결합된 단백질의 돌연변이체 또는 변형된 변이체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, GPCR의 일부 단일 또는 다중 점 돌연변이는 기능을 보유하며 질환에 연루된다 (예를 들어, Stadel et al., (1997) Trends in Pharmacological Review 18:430-37 참조).
단일 세포 특성화, 세포 폴리뉴클레오타이드 바코드화, 및 사슬 쌍 형성
본원에서 기술된 방법은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 이용하여 세포를 특성화하는 단계를 포함할 수 있다. 복수의 세포가 하나 이상의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 하나 이상의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉될 수 있다. 세포는 미결합된 컨쥬게이트를 제거하기 위해 세척될 수 있다. 세포는 단일 세포로서 용기에서 분리될 수 있다. 분리된 세포에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는, 예컨대 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시킴으로써 용기 바코드 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 분리된 세포에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는, 예컨대 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 부착시킴으로써 용기 바코드 서열을 포함하도록 변형될 수 있다.
용기 바코드를 숨기고 있는 폴리뉴클레오타이드는 또한 용기의 형성 동안 도입될 수 있다. 이들 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 축퇴성 바코드를 지닐 수 있으며, 이로써 용기 바코드를 포함하는 각각의 올리고뉴클레오타이드는 그들이 들어 있는 용기에 상응하는 고유한 식별자 코드를 포함한다.
올리고뉴클레오타이드는 증폭될 수 있고, 반응의 증폭된 생성물은 용기로부터 회수될 수 있다. 증폭된 생성물은 차세대 시퀀싱 (NGS) 태그를 추가하기 위해 PCR 부화될 수 있다. 라이브러리는 고 처리량 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱될 수 있고, 이후 용기 바코드 서열 및/또는 AID 서열 및/또는 AMB 서열이 분석된다. 각각의 단일 세포는 그것의 각각의 용기에서 분리되기 때문에, 2회 관찰된 각각의 용기 바코드에 대해, 시퀀싱된 증폭된 올리고뉴클레오타이드 생성물은 동일한 용기로부터 기원하고, 따라서 고유한 단일 세포로부터 기원한다. 올리고뉴클레오타이드의 각각의 AID는 그것이 부착되는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 친화성-부분에 대해 바코드화되고 각각의 단일 세포는 그것의 각각의 용기에서 분리되기 때문에, 동일한 용기 바코드를 포함하는 서열에 대해 관찰된 각각의 AID에 대해, 시퀀싱된 증폭된 올리고뉴클레오타이드 생성물은 동일한 용기에서 단일 세포에 결합된 특정한 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트로부터 기원한다. 동일한 용기 바코드를 포함하는 일련의 서열에서 개별적으로 관찰된 각각의 상이한 AMB에 대해, 시퀀싱된 세트에서 AMB를 가진 증폭된 올리고뉴클레오타이드 생성물은 동일한 용기 내의 세포에 결합된, 예를 들어, 단일-세포 용기가 사용된 경우, 용기 내의 단일 세포에 결합된, 단일 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 상이한 (나머지 개개의 AMB와 비교하여) 단일 올리고뉴클레오타이드 부분으로부터 기원한다. 관찰된 각각의 단일 AMB에 대해, 동일한 용기 바코드를 포함하는 서열을 가진 모든 증폭된 올리고뉴클레오타이드 생성물은 단일 (동일한) 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자 (예를 들어, PCR 듀플리케이트 또는 앰플리콘을 표시하는)의 올리고뉴클레오타이드 부분으로부터 기원한다. 따라서, 특이적 AMB와 특이적 용기 바코드의 주어진 조합에서 관찰된 각각의 올리고뉴클레오타이드는 단일 세포에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 단일 세포에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 단일 분자를 나타내며, 따라서 이러한 AMB/용기 바코드 조합을 가지고 시퀀싱된 주어진 수의 (예를 들어, 2, 3, 4개 또는 그 이상) 다수의 올리고뉴클레오타이드의 검출은, 예를 들어, 분석된 세포 집단 또는 샘플 내에서 단일 세포에 결합된 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 단일 세포에 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 수 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상)를 나타낸다. 따라서, 이러한 수는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 주어진 친화성 부분이 결합하도록 설계된 세포 상의 분자의 수, 예를 들어, 단일 세포 상에서 또는 내에서 발현된 카피의 수를 나타낼 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 구별되고 그것의 일부 또는 카피와 구별되는, 세포로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 용기 내의 폴리뉴클레오타이드를 바코드화하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 결합되거나 결합되었던 용기 내의 캡슐화된 단일 세포는 용해될 수 있고, 추가의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 단일 세포로부터의 또는 단일 세포 내의 폴리뉴클레오타이드가 바코드화될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기 내의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분, 예를 들어, 용기에서 단일 세포에 결합되거나 결합되었던 것 및/또는 그것의 카피 또는 증폭된 생성물이 용기 바코드 서열로 바코드화될 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 세포의 하나 이상의 세포 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기 바코드화된 서열로 바코드화될 수 있으며, 일부 구체예에서 이러한 추가의 하나 이상의 세포 폴리뉴클레오타이드는 분자 바코드로 더 바코드화된다.
T-세포 수용체 사슬 쌍과 항체 면역글로불린 사슬 쌍은 둘 다 면역 수용체의 유형이다. 일부 구체예에서, 세포 폴리뉴클레오타이드는 항체 면역글로불린 사슬 (또는 일부)-암호화 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 그것은 TCR (또는 일부)-암호화 폴리뉴클레오타이드이거나 그것을 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 의해 결합된 항원은 TCR 또는 항체 또는 그것의 사슬 또는 일부이다. 한 양태에서, 본원에서 기술된 방법은 고-처리량 시퀀싱 및 진단을 위한 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 생성하는 단계를 더 포함한다. 한 양태에서, 본원에서 기술된 방법은 특이적 공통 속성을 가진 환자 또는 코호트로부터 항체 및/또는 TCR 발견을 위해 인간 유래된 라이브러리 패널을 개발하는 단계를 더 포함한다. 개시된 발명은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용한 단일 세포 특성화와 함께, 다수의 상이한 유형의 쌍을 이룬 가변 서열, 예를 들어, T-세포 수용체 사슬 쌍 및 항체 면역글로불린 사슬 쌍에 적용될 수 있다. 예를 들어, 세포 폴리뉴클레오타이드에 상보성인 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 중쇄 및/또는 경쇄, 예를 들어, VH 및/또는 VL, 항체 사슬 및/또는 알파 및/또는 베타 및/또는 감마 및/또는 델타 사슬, 예를 들어, Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ T-세포 수용체 (TCR) 사슬 (이들의 프레임워크 부분으로부터 유래된 것들과 같은)이 용기의 형성 동안 도입될 수 있다 (또는 용기 내에 포함될 수 있다). 용기 바코드를 숨기고 있는 폴리뉴클레오타이드가 또한 용기의 형성 동안 도입될 수 있다 (또는 용기 내에 포함될 수 있다). 이들 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 축퇴성 바코드를 지닐 수 있으며, 이로써 용기 바코드를 포함하는 각각의 세포 폴리뉴클레오타이드는 반응(들) 동안 들어 있는 용기에 상응하는 고유한 식별자 코드를 포함한다. 따라서, 일부 이러한 구체예에서, 동일한 고유한 식별자 코드를 가진 복수의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기로부터, 일부 양태에서는 단일 세포로부터 기원한다고 생각된다. 또한, 분자 바코드를 숨기고 있는 복수의 폴리뉴클레오타이드는 용기의 형성 동안 도입될 수 있거나 또는 용기 내에 포함될 수 있다. 이들 분자 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 축퇴성 바코드를 지닐 수 있으며, 이로써 분자 바코드를 포함하는 각각의 세포 폴리뉴클레오타이드는 그들이 유래한 단일 세포 폴리뉴클레오타이드 분자에 상응하는 고유한 식별자 코드를 포함한다. 수백만 개의 단일 면역 세포가 에멀젼 내에서 용해될 수 있고, 세포 전사물, 예컨대 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬 전사물이 프라이머를 사용하여 역전사되거나 카피될 수 있고, 이후 용기 바코드 및 분자 바코드로 태그화되며, 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 PCR 증폭이 수행된다. 단일 면역 세포 (예를 들어, B-세포 또는 T-세포)로부터 나온 각각의 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬은 동일한 용기 바코드 식별자와 함께 서로 실질적으로 결합될 수 있다.
다음에, VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬은 용기로부터 회수되고 PCR 부화되어 차세대 시퀀싱 (NGS) 태그가 추가될 수 있다. 라이브러리는 고 처리량 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 시퀀싱될 수 있고, 이후 레퍼토리 다양성 분석, 항체 빈도 분석, CDR3 특성화, 체세포 초돌연변이 계통발생 분석 등이 수행된다. 용기 및 분자 바코드 서열을 디컨볼루팅함으로써(deconvolute) 정확하게 매치된 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 쌍의 데이터베이스가 생성될 수 있다. 각각의 단일 면역 세포는 그것의 각각의 용기로부터 분리되기 때문에, 2회 관찰된 각각의 용기 바코드에 대해, 시퀀싱된 전사물은 동일한 에멀젼 액적으로부터, 그리고 따라서 고유한 단일 세포로부터 기원한다. 관찰된 각각의 상이한 분자 바코드에 대해, 동일한 용기 바코드를 포함하는 서열의 경우, 시퀀싱된 전사물은 단일 세포의 상이한 전사물 분자로부터 기원한다. 관찰된 각각의 동일한 분자 바코드에 대해, 동일한 용기 바코드를 포함하는 서열의 경우, 시퀀싱된 전사물은 단일 세포로부터의 동일한 전사물 분자로부터 기원한다 (예를 들어, PCR 듀플리케이트).
시퀀싱과 병행하여, 용기로부터 회수된 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬의 라이브러리가 항체 발현 벡터로 클로닝되고 효모 디스플레이 스크리닝을 위해 동시-트랜스펙션될 수 있다. 이 동일한 라이브러리 풀을 클로닝하는 것은, 일부 희귀한 면역 세포가 단지 하나의, 또는 나머지 하나의 검정에서만 캡쳐되기 때문에 시작할 때 생물학적 샘플을 분할하는 것과 비교하여 바람직한 방법이다. 인간 유래된 VH 및 VL 및/또는 Vα 및 Vβ 및/또는 Vγ 및 Vδ 사슬의 라이브러리는 고전적인 디스플레이 검정과 마찬가지로 정확한 또는 부정확한 쌍 매칭과 무관하게 발현될 수 있다. 다음에, 효모 디스플레이가 하나 이상의 항원 표적에 대해 수행되어 잠재적 항체 후보를 부화시킬 수 있다.
효모 디스플레이와 같은 디스플레이 기술로부터 나타난 양성 후보 항체는 시퀀싱되고 매치된 쌍의 바코드 데이터베이스에 대해 질문될 수 있다. VH 및/또는 Vα 및/또는 Vγ 사슬을 디스플레이한 각각의 효모는 그것의 각각의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬과 다시 매치될 수 있고, VL 및/또는 Vβ 및/또는 Vδ 사슬을 디스플레이한 각각의 효모는 그것의 각각의 VH 또는 Vα 또는 Vγ 사슬과 다시 매치될 수 있다. 이러한 정확하게 쌍을 이룬 후보들은 유전자 합성되고 포유류 세포주에서 발현될 수 있으며, 관심의 표적에 대해 기능적으로 검증될 수 있다. 이들 후보는 완전한 인간 항체 및/또는 TCR일 수 있다.
샘플
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 샘플이 본원에서 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 세포를 포함하는 임의의 샘플이 일반적으로 본원에서 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 RNA 또는 DNA를 포함하는 대상체 또는 그로부터 유래된 샘플로부터의 생물학적 샘플일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있거나, 또는 샘플은 폴리뉴클레오타이드의 추출 또는 정제 없이 방법이 직접 수행될 수 있다. 샘플은 추출된 또는 분리된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 샘플은 또한 생물학적 견본, cDNA 라이브러리, 바이러스 DNA, 또는 게놈 DNA로부터 추출된 전체 RNA 또는 DNA일 수 있다. 한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 단백질, 지질 및 비-주형 핵산과 같은 다양한 다른 성분들을 포함하는 생물학적 샘플로부터 분리된다. 핵산 주형 분자는 동물, 식물, 박테리아, 균류, 또는 임의의 다른 세포성 유기체로부터 얻어진, 임의의 세포성 물질로부터 얻어질 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 단일 세포로부터 얻어진다. 폴리뉴클레오타이드는 유기체로부터 또는 유기체로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 직접 얻어질 수 있다. 임의의 조직 또는 체액 견본이 본 발명에서 사용하기 위한 핵산의 공급원으로서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 일차 세포 배양물 또는 세포주과 같은 배양된 세포로부터 분리될 수 있다. 주형 핵산이 얻어지는 세포 또는 조직은 바이러스 또는 다른 세포내 병원체로 감염될 수 있다.
특정 구체예에서, 항체 또는 TCR-생성 면역 세포는 잠재적인 임상적으로 중요한 병원체-, 종양-, 및/또는 질환 특이적 항체 또는 TCR을 확인하기 위하여 대상체 또는 숙주, 예컨대 인간 또는 다른 동물, 예컨대 면역화되어 있는 또는 감염, 암, 자가면역 병태, 또는 임의의 다른 질환에 걸려 있는 인간 또는 다른 동물의 혈액 또는 다른 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 인간은 질환으로 진단되거나, 질환의 증상을 나타내거나, 질환으로 진단되지 않거나, 또는 질환의 증상을 나타내지 않을 수 있다. 예를 들어, 인간은 감염제 (예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온 등), 항원, 또는 질환에 대해 노출되었거나 및/또는 그것들에 대해 유용한 항체 또는 TCR을 만들 수 있는 인간일 수 있다. 예를 들어, 동물은 감염제 (예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온 등), 항원, 또는 질환에 대해 노출되었거나 및/또는 그것들에 대해 유용한 항체 또는 TCR을 만들 수 있는 동물 수 있다. 면역화된 숙주로부터의 특정 면역 세포는 의문의 하나 이상의 표적 항원 및/또는 하나 이상의 미지의 항원에 대한 항체 또는 TCR을 만든다. 본 발명에서 림프구 풀은 항체 사슬이 시퀀싱되거나, 항체가 만들어지거나, 또는 발현 라이브러리(들)이 만들어지기 전에, 적합한 임의의 방법, 예컨대 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 자기 활성화된 세포 분류 (MACS), 패닝 또는 샘플, 예컨대 면역 세포 라이브러리로부터 복수의 면역 세포를 생성하기 위한 다른 스크리닝 방법을 사용하는 세포의 스크리닝 및 분류에 의해 원하는 면역 세포에 대해 풍부해질 수 있다. 상이한 항체를 발현하는 단지 소수의 하위세트, 및 따라서 가변 도메인의 단지 소수의 자연적으로 발생하는 조합을 제공하는 선행 기술 풍부화 방법과 대조적으로, 본 발명의 면역 세포 라이브러리는 상이한 항체 또는 TCR을 발현하는 면역 세포의 적어도 2개의 하위세트 또는 개별적인 면역 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 면역 세포 라이브러리는 상이한 항체 또는 TCR을 발현하는 면역 세포의 적어도 5, 10, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 10000, 25000, 50000, 75000, 10000, 250000, 500000, 750000, 1000000, 2500000, 5000000, 7500000, 또는 10000000개의 하위세트 또는 개별적인 면역 세포를 포함한다. 본 발명의 방법은 면역 세포 회수를 최대화하고, 매우 높은 다양성을 제공한다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 림프절 조직, 장 관련 림프양 조직, 점막 관련 림프양 조직, 비장 조직 또는 임의의 다른 림프양 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. T 세포는 T 세포주 및 자가조직 또는 동종 공급원으로부터 얻어질 수 있다. T 세포는 단일 개체 또는 개체 집단, 예를 들어, 모두가 암 또는 감염성 질환과 같은 동일한 질환으로 고통받고 있는 개체의 집단으로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, 개체의 순환하는 혈액으로부터의 세포는 분리반출 또는 백혈구분리반출에 의해 얻어질 수 있다. 분리반출 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함하는 림프구, 단구, 과립구, B 세포, 다른 핵화된 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한다. 하나의 구체예에서, 분리반출 또는 백혈구분리반출에 의해 수집된 세포는 후속 가공 단계를 위해 혈장 부분을 제거하고 세포를 적절한 버퍼 또는 매체에 배치하기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 대안적인 구체예에서, 세척 용액은 칼슘을 결여하며, 마그네슘을 결여할 수 있거나, 또는 전부는 아니지만 많은 2가 양이온을 결여할 수 있다. 당업자는 반-자동화된 "관통형 (flow-through)" 원심분리기를 사용하는 것과 같이, 본 분야에 공지된 방법에 의해 세척 단계를 수행할 수 있음을 쉽게 인정할 것이다. 세척 후, 세포는, 예를 들어, 다양한 생체적합성 버퍼에 재현탁될 수 있다. Ca++/Mg++ 무포함 PBS. 대안으로서, 분리반출 샘플의 바람직하지 않은 성분이 제거될 수 있고, 세포가 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다. 다른 구체예에서, T 세포는 적혈구를 용해하고 PERCOLL™ 구배를 통해 원심분리함으로써 말초혈 림프구로부터 분리된다. CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특정 아집단이 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 더 분리될 수 있다. 예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이트된 자기 비드 (예를 들어, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell　Expander)를 사용하여 양성으로 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 부화는 음성적으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지정된 항체들의 조합을 가지고 달성될 수 있다. 한 이러한 방법은 세포 정렬 및/또는 음성 자기 면역유착을 통한 선택 또는 음성적으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 지정된 단클론성 항체들의 칵테일을 사용하는 유세포분석이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 부화시키기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 자극을 위해 T 세포를 제조하는 다른 방법은 세척 단계 후 세포를 동결시키는 것인데, 이것은 단구-제거 단계를 요하지 않는다. 이론에 결부되기를 원하지는 않지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구와 어느 정도는 단구도 제거함으로써 더욱 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 변수가 본 분야에 공지되어 있고 이와 관련하여 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반한다. 다음에, 이것은 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지로 1:1 희석된다. 다음에, 세포는 분당 1℃의 속도로 -80℃까지 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 보관된다.
일부 구체예에서, 비-면역된 인간 또는 비-인간 공여체로부터의 면역 세포가 활용된다. 동물의 나이브 레퍼토리 (항원 도전 전의 레퍼토리)는 중간 정도의 친화성 (약 1x10-6 내지 1x10-7 M의 KA)으로 본질적으로 임의의 비-자체 분자와 결합할 수 있는 항체 또는 TCR을 가진 동물을 제공한다. 항체 또는 TCR 결합 부위의 서열 다양성은 직접적으로 생식계열에 의해 암호화되지는 않지만 V 유전자 절편으로부터 조합적인 방식으로 조립된다. 면역화는 임의의 면역 세포가 면역원에 결합하여 증식시키고 (클론성 팽창) 상응하는 항체를 상기 주지된 바와 같이 분비하는 VH-VL 또는 Vα-Vβ 또는 Vγ-Vδ 조합을 만들도록 촉발시킨다. 그러나, 면역화되지 않은 대상체로부터의 비장 세포 및/또는 면역 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)는 가능한 항체 또는 TCR 레퍼토리의 더 좋은 표현을 제공할 수 있고, 또한 임의의 동물 종을 사용하여 후속적인 B-세포 또는 T-세포 항체 또는 TCR 라이브러리의 제조를 허용한다.
어떤 경우에, 테스트에 충분한 핵산을 얻기 위해 적어도 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mL의 혈액 부피가 채혈된다.
어떤 경우에, 출발 물질은 말초혈이다. 말초혈 세포는 특정 세포 유형에 대해 풍부해질 수 있다 (예컨대 단핵 세포; 적혈구; CD4+ 세포; CD8+ 세포; 면역 세포; T 세포; NK 세포 등). 말초혈 세포는 또한 선택적으로 특정 세포 유형이 고갈될 수 있다 (예컨대 단핵 세포; 적혈구; CD4+ 세포; CD8+ 세포; 면역 세포; T 세포; NK 세포 등).
어떤 경우에, 출발 물질은, 예를 들어, 비-제한적으로 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절 (편도선을 포함함), 갑상선, 췌장, 심장, 백본근, 장, 후두, 식도 및 위를 포함한 고체 조직을 포함하여 조직 샘플일 수 있다. 다른 경우에, 출발 물질은 핵산, 면역 세포, 및 특히 B-세포 또는 T-세포를 포함하는 세포일 수 있다. 어떤 경우에, 출발 물질은 임의의 유기체로부터의, 핵산을 포함하는 샘플일 수 있고, 그것으로부터 유전 물질이 얻어질 수 있다. 어떤 경우에, 샘플은 유체, 예컨대 혈액, 타액, 림프액 또는 뇨일 수 있다.
샘플은 병태를 가진 대상체로부터 채취될 수 있다. 어떤 경우에, 샘플이 취해지는 대상체는 환자, 예를 들어, 암환자 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 환자일 수 있다. 대상체는 포유류, 예컨대 인간일 수 있고, 남성 또는 여성일 수 있다. 어떤 경우에, 여성은 임신중이다. 샘플은 종양 생검일 수 있다. 생검은, 예를 들어, 건강 관리 제공자, 의사, 진료 보조 인력, 간호사, 수의사, 치과의사, 척추 지압사, 긴급 의료원, 피부과 전문의, 종양학자, 위장병학자 또는 외과의사에 의해 수행될 수 있다.
어떤 경우에, 비-핵산 물질은 출발 물질로부터 효소적 처리 (예컨대 프로테아제 소화)를 사용하여 제거될 수 있다.
어떤 경우에, 혈액은, 제한되는 것은 아니지만, EDTA를 포함하여 마그네슘 킬레이터를 포함하는 장치로 수집될 수 있고, 4℃에서 보관된다. 선택적으로, 칼슘 킬레이터, 이를테면 제한되는 것은 아니지만 EGTA가 추가될 수 있다. 다른 경우에, 세포 용해 억제제, 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 포름알데하이드, 포름알데하이드 유도체, 포르말린, 글루타르알데하이드, 글루타르알데하이드 유도체, 단백질 교차-링커, 핵산 교차-링커, 단백질 및 핵산 교차-링커, 일차 아민 반응성 교차링커, 설프하이드릴 반응성 교차링커, 설프하이드릴 추가 또는 이황화물 환원, 탄수화물 반응성 교차링커, 카르복실 반응성 교차링커, 광반응성 교차링커 또는 분열 가능한 교차링커가 혈액에 추가된다.
추출된 물질이 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드를 포함하는 어떤 경우에는, 이들 분자는 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 이중-가닥 DNA로 전환될 수 있다. 예를 들어, 역전사 효소가 RNA 분자로부터 DNA를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 경우에, RNA의 DNA로의 전환은 링커 단편을 RNA에 결찰시키고, 그로써 역전사를 개시하기 위해 보편적인 프라이머의 사용을 허용하기 위해 사전 결찰 단계를 필요로 할 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, mRNA 분자의 폴리-A 꼬리표가 역전사를 개시하는데 사용될 수 있다. DNA로의 전환에 이어서, 본원에 기술된 방법이, 일부 경우에 원하는 서열을 추가로 포획하고, 선택하고, 꼬리표를 붙이고, 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다.
핵산 분자는 데옥시리보핵산 (DNA) 및/또는 리보핵산 (RNA)을 포함한다. 핵산 분자는 합성이거나 또는 자연적으로 발생하는 공급원으로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 다양한 다른 성분들, 예컨대 단백질, 지질 및 비-주형 핵산을 포함하고 있는 생물학적 샘플로부터 분리된다. 핵산 주형 분자는 동물, 식물, 박테리아, 진균, 또는 임의의 다른 세포 유기체로부터 얻어진, 임의의 세포 물질로부터 얻어질 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 단일 세포로부터 얻어진다. 본 발명에 사용하기 위한 생물학적 샘플은 바이러스 입자 또는 제제를 포함한다. 핵산 분자는 직접 유기체로부터 또는 유기체로부터 얻어진 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 뇨, 뇌척수액, 정액, 타액, 가래, 대변 및 조직으로부터 얻어질 수 있다. 임의의 조직 또는 체액 시편이 발명에 사용하기 위한 핵산에 대한 공급원으로서 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 배양된 세포, 예컨대 일차 세포 배양 또는 세포주로부터 분리될 수 있다. 주형 핵산이 얻어지는 세포 또는 조직은 바이러스 또는 다른 세포내 병원체로 감염될 수 있다
샘플은 또한 생물학적 시편으로부터 추출된 총 RNA, cDNA 라이브러리, 바이러스 또는 게놈 DNA일 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 단백질, 효소, 기질, 항체, 결합제, 비드, 작은 분자, 펩타이드 또는 다른 임의의 분자와 같은 다른 표적 분자에 결합된다. 일반적으로, 핵산은 생물학적 샘플로부터 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)에 기술된 것들과 같은 다양한 기술에 의해 추출될 수 있다. 핵산 분자는 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 단일-가닥 영역 (예를 들어, 줄기- 및 루프-구조)을 가진 이중-가닥일 수 있다.
DNA 추출 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 고전적인 DNA 분리 프로토콜은 페놀과 클로로포름의 혼합물과 같은 유기 용매를 사용한 추출과, 이어서 에탄올을 사용한 침전을 기반으로 한다 (J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, N.Y.). 다른 방법을 다름을 포함한다: 탈염 DNA 추출 (P. Sunnucks et al., Genetics, 1996, 144:747-756; S. M. Aljanabi et al., Nucl. Acids Res. 1997, 25:4692-4693), 트라이메틸암모늄 브로마이드 염 DNA 추출 (S. Gustincich et al., BioTechniques, 1991, 11:298-302) 및 구아니디늄 티오시아네이트 DNA 추출 (J. B. W. Hammond et al., Biochemistry, 1996, 240:298-300). 다양한 키트가 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는데 상업적으로 활용된다 (예컨대 BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA): Epicentre Technologies (Madison, WI); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN); MicroProbe Corp. (Bothell, WA); Organon Teknika (Durham, NC); 및 Qiagen Inc. (Valencia, CA)).
RNA 추출 방법 또한 기술분야에 잘 알려져 있고 (예컨대 J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 1989, 211d Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York) 신체 유체로부터의 RNA 추출을 위한 키트는 상업적으로 활용 가능하다 (예컨대 Ambion, Inc. (Austin, TX); Amersham Biosciences (Piscataway, NJ); BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA); BioRad Laboratories (Hercules, CA); Dynal Biotech Inc. (Lake Success, NY); Epicentre Technologies (Madison, WI); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN); GIBCO BRL (Gaithersburg, MD); Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA); MicroProbe Corp. (Bothell, WA); Organon Teknika (Durham, NC); Promega, Inc. (Madison, WI); 및 Qiagen Inc. (Valencia, CA)).
하나 이상의 샘플은 하나 이상의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 샘플은 둘 이상의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 대상체로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 샘플은 둘 이상의 대상체로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 대상체는 동일한 종으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 대상체는 상이한 종으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 대상체는 건강할 수 있다. 하나 이상의 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 영향을 받을 수 있다.
일부 구체예에서, 샘플은 유체, 예컨대 혈액, 타액, 림프액, 뇨, 뇌척수액, 정액, 가래, 대변 또는 조직 균등물이다.
샘플은 병태를 가진 대상체로부터 채취될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플이 취해지는 대상체는 환자, 예를 들어, 암환자 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 환자일 수 있다. 대상체는 포유류, 예컨대 인간일 수 있고, 남성 또는 여성일 수 있다. 일부 구체예에서, 여성은 임신중이다. 샘플은 종양 생검일 수 있다. 생검은, 예를 들어, 건강 관리 제공자, 의사, 진료 보조 인력, 간호사, 수의사, 치과의사, 척추 지압사, 긴급 의료원, 피부과 전문의, 종양학자, 위장병학자 또는 외과의사에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 단백질, 효소, 기질, 항체, 결합제, 비드, 작은 분자, 펩타이드 또는 임의의 다른 분자와 같은 다른 표적 분자에 결합된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 결합되지 않는다. 핵산은 생물학적 샘플로부터 다양한 기술 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))에 의해 추출될 수 있다.
일부 구체예에서, 샘플은 타액이다. 일부 구체예에서, 샘플은 전혈이다. 일부 구체예에서, 충분한 양의 테스트용 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위하여, 적어도 적어도 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mL의 혈액 부피가 채혈된다. 일부 구체예에서, 혈액은, 제한되는 것은 아니지만, EDTA를 포함하는 마그네슘 킬레이터를 포함하는 장치로 수집될 수 있고, 4℃에서 보관된다. 선택적으로, 제한되는 것은 아니지만 EGTA를 포함하는, 칼슘 킬레이터가 추가될 수 있다.
일부 구체예에서, 제한되는 것은 아니지만 포름알데하이드, 포름알데하이드 유도체, 포르말린, 글루타르알데하이드, 글루타르알데하이드 유도체, 단백질 교차-링커, 핵산 교차-링커, 단백질 및 핵산 교차-링커, 일차 아민 반응성 교차링커, 설프하이드릴 반응성 교차링커, 설프하이드릴 추가 또는 이황화물 환원, 탄수화물 반응성 교차링커, 카르복실 반응성 교차링커, 광반응성 교차링커 또는 분열 가능한 교차링커를 포함하는, 세포 용해 억제제가 혈액에 추가된다. 일부 구체예에서, 비-핵산 물질이 출발 물질로부터 효소적 처리 (예컨대 프로테아제 소화)를 사용하여 제거될 수 있다.
복수의 샘플은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 또는 그 이상의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 또는 그 이상의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000개 샘플, 9000, 또는 10,000개 샘플, 또는 100,000개 샘플 또는 1,000,000개 또는 그 이상의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 10,000개 샘플을 포함할 수 있다.
제1 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 제2 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드와 상이할 수 있다. 제1 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 복수의 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드와 상이할 수 있다. 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 뉴클레오타이드 또는 염기쌍이 상이할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 복수의 폴리뉴클레오타이드는 둘 이상의 동일한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 총 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 복수의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 2개의 상이한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 총 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 5%, 10 %, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 적어도 2개의 상이한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 서로의 변이체이다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 단일 뉴클레오타이드 다형태 또는 다른 유형의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 스플라이스 변이체이다.
제1 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있고 제2 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제1 샘플의 하나 이상의 세포는 제2 샘플의 하나 이상의 세포와 동일한 유형의 세포일 수 있다. 제1 샘플의 하나 이상의 세포는 복수의 샘플의 하나 이상의 상이한 세포와 상이한 유형의 세포일 수 있다.
복수의 샘플은 함께 얻어질 수 있다. 복수의 샘플은 동시에 얻어질 수 있다. 복수의 샘플은 순차적으로 얻어질 수 있다. 복수의 샘플은 수년의 과정으로, 예컨대 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 100년, 10년, 5년, 4년, 3년, 2년 또는 1년의 과정으로 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 약 1년 이내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 12개월, 11개월, 10개월, 9개월, 8개월, 7개월, 6개월, 4개월, 3개월, 2개월 또는 1개월 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 30일, 28일, 26일, 24일, 21일, 20일, 18일, 17일, 16일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 약 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 2시간 또는 1시간 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 약 60초, 45초, 30초, 20초, 10초, 5초, 2초 또는 1초 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 1초 미만 내에 얻어질 수 있다.
샘플의 상이한 폴리뉴클레오타이드는 상이한 농도 또는 양 (예컨대 상이한 수의 분자)으로 샘플에 존재할 수 있다. 예를 들어, 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 샘플 중의 다른 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 클 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 그 샘플 중의 적어도 하나의 다른 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배, 또는 그 이상으로 더 크다. 다른 실례에서, 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 그 샘플 중의 다른 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 적다. 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 그 샘플 중의 적어도 하나의 다른 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배, 또는 그 이상 적다.
일부 구체예에서, 둘 이상의 샘플은 상이한 양 또는 농도의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 한 샘플 중의 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 상이한 샘플 중의 동일한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 클 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 뇨 샘플보다 더 높은 양의 특정 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 다르게는, 단일 샘플은 둘 이상의 하위샘플로 나누어질 수 있다. 하위샘플은 상이한 양 또는 농도의 동일 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 한 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 다른 샘플 중의 동일 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배 또는 그 이상 더 클 수 있다. 다르게는, 한 샘플 중의 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 상이한 샘플 중의 동일 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 적을 수 있다. 예를 들어, 한 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 다른 샘플 중의 동일 폴리뉴클레오타이드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배 또는 그 이상 더 적을 수 있다.
표적 폴리뉴클레오타이드
어떤 경우에는, 본원에서 제공된 방법은 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드 분자, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 앰플리콘과 같은, 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 증폭 및 시퀀싱에 관한 것이다. 어떤 경우에는, 본원에서 제공된 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 적어도 하나의 영역의 증폭 및 시퀀싱에 관한 것이다. 어떤 경우에는, 본원에서 제공된 방법은 적어도 하나의 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 증폭 및 시퀀싱에 관한 것이다. 한 양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드이다. 한 양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 일부 구체예에서, 표적 RNA 폴리뉴클레오타이드는 mRNA이다. 일부 구체예에서, 표적 RNA 폴리뉴클레오타이드는 폴리아데닐화된다. 일부 구체예에서, RNA 폴리뉴클레오타이드는 폴리아데닐화되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 DNA 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 cDNA를 포함한다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 게놈 DNA일 수 있다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 엑손, 인트론, 미번역 영역, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 게놈 핵산이다. 특정한 유기체의 염색체에 존재하는 유전 물질로부터 유래된 DNA가 게놈 DNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해 생성된 항체 또는 TCR의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해 생성된 항체의 중쇄의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해 생성된 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해 생성된 TCR의 알파 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해서 생성된 TCR의 베타 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해서 생성된 TCR의 감마 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포에 의해서 생성된 TCR의 델타 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 역전사 반응 또는 프라이머 확장 반응의 생성물을 생성하기 위해 사용된 폴리뉴클레오타이드 주형을 포함하고, 또한 역전사 반응 또는 프라이머 확장 반응 생성물 자체를 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 역전사 반응 또는 프라이머 확장 반응이 수행될 수 있는 관심의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 AID를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 AMD를 포함하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA를 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 합성된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어,표적 폴리뉴클레오타이드는 AID 및/또는 AMB를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
표적 폴리뉴클레오타이드는 실질적으로 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있으며 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는, 제한되는 것은 아니지만, 유기체 또는 세포 (예를 들어, 면역 세포)로부터의 게놈 DNA 또는 mRNA의 단편을 추출하여 표적 폴리뉴클레오타이드를 얻는 것을 포함하는, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 증폭 없이 직접 분리될 수 있다. 또한, 표적 폴리뉴클레오타이드는 역전사-PCR을 통해서 RNA (mRNA와 같은)로부터 생성된 cDNA를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 RNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 mRNA 분자, 또는 mRNA 분자로부터 생성된 cDNA이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의, mRNA 분자, 또는 mRNA 분자로부터 생성된 cDNA이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의, mRNA 분자, 또는 mRNA 분자로부터 생성된 cDNA이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의 중쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의 중쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의 경쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의 경쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의 항체 가변 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의 가변 항체 서열을 암호화하는 mRNA 서열이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의 가변 경쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의 가변 경쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의 가변 중쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 면역 세포로부터의 가변 중쇄 항체 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 세포-미포함 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포로부터의 가변 알파, 베타, 감마, 및/또는 델타 사슬 TCR 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 면역 세포의 VH 및/또는 VL BCR 서열을 암호화하는 mRNA 분자이다.
본원에서 기술된 방법은 시퀀싱을 위해 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 표적 폴리뉴클레오타이드의 둘 이상의 영역으로부터 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 둘 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 염색체로부터 유래된 게놈 핵산 또는 DNA이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 다형성 또는 돌연변이와 같은 변이체를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 DNA를 포함하고 RNA가 아니다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 RNA를 포함하고 DNA가 아니다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 DNA와 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥이다.
표적 폴리뉴클레오타이드는 임의의 생물학적 샘플로부터 합성되거나 획득될 수 있고 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 증폭 없이 직접 분리된다. 직접 분리를 위한 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 비-제한적 예들은 생물학적 샘플, 유기체 또는 세포로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 추출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드가 생물학적 샘플로부터 정제된다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 그것이 포함된 생물학적 샘플로부터 정제되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 생물학적 샘플로부터 분리된다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 그것이 포함된 생물학적 샘플로부터 분리되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 세포-미포함 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단편화된 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 전사된 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 변형된 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 비-변형된 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트로 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 복수의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개 또는 그 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개 또는 그 이상의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트로부터 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개 또는 그 이상의 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트로 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개 또는 그 이상의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 AID 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 1000개 또는 그 이상의 AID 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 AMB 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012개 또는 그 이상의 AMB 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 개개의 세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 바이오마커 서열을 암호화한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 둘 이상의 바이오마커 서열을 암호화한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 바이오마커 서열을 암호화한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 둘 이상의 바이오마커 서열을 암호화한다. 일부 구체에에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 또는 그 이상의 바이오마커 서열을 암호화한다.
일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 서열들의 패널을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 면역글로불린 서열들의 패널을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 서열들의 패널은 VH 및/또는 VL 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 TCR 서열들의 패널을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 또는 TCR 서열들의 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 면역글로불린 또는 TCR 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 BCR 서열들의 패널을 포함한다. 예를 들어, BCR 서열들의 패널은 VH 및/또는 VL 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 서열들의 패널은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012개 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 서열들의 패널은 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012개 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 서열들의 패널은 약 10-20, 10-30, 10-40, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 50-60, 50-70, 50-80, 50-90, 50-100, 100-200, 100-300, 100-400, 100-300, 100-400, 100-500, 100-600, 100-700, 100-800, 100-900, 100-1000, 500-600, 500-700, 500-800, 500-900, 500-1000, 1000-2000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 5000-6000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 5000-10000, 1-1x105, 1-2x105, 1-3x105, 1-4x105, 1-5x105, 1-6x105, 1-7x105, 1-8x105, 9x105, 1-1x106, 1-2x106, 1-3x106, 1-4x106, 1-5x106, 1-6x106, 1-7x106, 1-8x106, 9x106, 1x107, 1-2x107, 1-3x107, 1-4x107, 1-5x107, 1-6x107, 1-7x107, 1-8x107, 1-9x107, 1-1x108, 1-2x108, 1-3x108, 1-4x108, 1-5x108, 1-6x108, 1-7x108, 1-8x108, 1-9x108, 1-1x109, 1-2x109, 1-3x109, 1-4x109, 1-5x109, 1-6x109, 1-7x109, 1-8x109, 1-9x109, 1-1x1010, 1-2x1010, 1-3x1010, 1-4x1010, 1-5x1010, 1-6x1010, 1-7x1010, 1-8x1010, 1-9x1010, 1-1x1011, 1-2x1011, 1-3x1011, 1-4x1011, 1-5x1011, 1-6x1011, 1-7x1011, 1-8x1011, 1-9x1011, 1-1x1012, 1-2x1012, 1-3x1012, 1-4x1012, 1-5x1012, 1-6x1012, 1-7x1012, 1-8x1012, 또는 1-9x1012개 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000개 염기 또는 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000개 염기 또는 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000개 염기 또는 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 약 10-20, 10-30, 10-40, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100, 50-60, 50-70, 50-80, 50-90, 50-100, 100-200, 100-300, 100-400, 100-300, 100-400, 100-500, 100-600, 100-700, 100-800, 100-900, 100-1000, 500-600, 500-700, 500-800, 500-900, 500-1000, 1000-2000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-3000, 1000-4000, 1000-5000, 1000-6000, 1000-7000, 1000-8000, 1000-9000, 1000-10000, 5000-6000, 5000-7000, 5000-8000, 5000-9000, 또는 5000-10000개 염기 또는 염기쌍 길이이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 단편의 평균 길이는 약 100, 200, 300, 400, 500, 또는 800개 염기쌍 미만, 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200개 뉴클레오타이드 미만, 또는 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 킬로베이스 미만일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플과 같은, 비교적 짧은 주형으로부터의 표적 서열은 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개 염기이다. 특정 구체예에서, 시퀀싱 데이터는 질환 또는 병태와 관련된 서열 또는 면역글로불린 또는 TCR 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하여 공지된 또는 예상된 서열에 대해 정렬된다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오타이드, 제2 세포 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다의 생식세포 계열 서열을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 제1 세포 폴리뉴클레오타이드는 IgH 또는 VH 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오타이드는 IgL 또는 VL 서열을 포함하며, 또는 이것들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식세포 계열의 것들의 서열로부터 IgL IgH, VH, VL, 또는 이것들의 임의의 조합물의 서열의 편차를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 고유한 IgH 서열의 총 수; 고유한 IgL 서열의 총 수; 고유한 IgH 및 IgL 서열의 총 수; 고유한 쌍을 이룬 IgL 및 IgH 서열의 총 수; IgH 서열, 또는 IgL 서열의 빈도; 또는 하나 이상의 다른 것에 대한 IgH 서열과 IgL 서열의 조합의 빈도 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오타이드, 제2 세포 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다의 생식세포 계열 서열을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 제1 세포 폴리뉴클레오타이드는 TCRα 또는 Vα 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오타이드는 TCRβ 또는 Vβ 서열을 포함하며, 또는 이것들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식세포 계열의 것들의 서열로부터 TCRα, TCRβ, Vα, Vβ, 또는 이것들의 임의의 조합물의 서열의 편차를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 고유한 TCRα 서열의 총 수; 고유한 TCRβ 서열의 총 수; 고유한 TCRα, 및 TCRβ 서열의 총 수; 고유한 쌍을 이룬 TCRβ 및 TCRα 서열의 총 수; TCRα 서열, 또는 TCRβ 서열의 빈도; 또는 하나 이상의 다른 것에 대한 TCRα 서열과 TCRβ 서열의 조합의 빈도 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오타이드, 제2 세포 폴리뉴클레오타이드, 또는 둘 다의 생식세포 계열 서열을 결정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 제1 세포 폴리뉴클레오타이드는 TCRγ 또는 Vγ 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오타이드는 TCRδ 또는 Vδ 서열을 포함하며, 또는 이것들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식세포 계열의 것들의 서열로부터 TCRγ, TCRδ, Vγ, Vδ, 또는 이것들의 임의의 조합물의 서열의 편차를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 고유한 TCRγ 서열의 총 수; 고유한 TCRδ 서열의 총 수; 고유한 TCRγ, 및 TCRδ 서열의 총 수; 고유한 쌍을 이룬 TCRδ 및 TCRγ 서열의 총 수; TCRγ 서열, 또는 TCRδ 서열의 빈도; 또는 하나 이상의 다른 것에 대한 TCRγ 서열과 TCRδ 서열의 조합의 빈도 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 유전자로부터의 서열의 총 수; 제2 유전자로부터의 서열의 총 수; 제1 유전자로부터의 고유한 서열의 총 수; 제2 유전자로부터의 고유한 서열의 총 수; 또는 제1 유전자로부터의 서열, 또는 제2 유전자로부터의 서열의 빈도 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 개별적으로 쌍을 이룬 IgL 및 IgH 서열, 또는 TCRα 및 TCRβ 서열, 또는 TCRγ 및 TCRδ 서열의 하나 이상의 쌍의 총량, 및 생식세포 계열으로부터의 편차에 기초하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 하나 이상의 IgL 및 IgH 서열, 또는 TCRα 및 TCRβ 서열, 또는 TCRγ 및 TCRδ 서열, 및 생식세포 계열으로부터의 편차에 기초하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 서열 패턴, 편차 분석, 역학, 또는 빈도 중 하나 이상에 기초하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 빈도에 기초하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다.
항체, BCR , 및 TCR의 클로닝 및 발현
여기 사용된 "항체 발현 라이브러리" 또는 "BCR 발현 라이브러리" 또는 "TCR 발현 라이브러리" 또는 "발현 라이브러리"는 핵산 또는 단백질 수준에서 분자의 수집물 (즉, 둘 이상의 분자)을 말할 수 있다. 따라서, 이 용어는 복수의 항체, BCR, 또는 TCR 분자를 암호화하는 발현 벡터의 수집물 (즉, 핵산 수준에서)을 말할 수 있거나, 또는 적절한 발현 시스템에서 발현된 후의 항체, BCR, 또는 TCR 분자의 수집물 (즉, 단백질 수준에서)을 말할 수 있다. 대안으로서, 발현 벡터/발현 라이브러리는 그것이 발현될 수 있는 적합한 숙주 세포에 포함될 수 있다. 본 발명의 발현 라이브러리에서 암호화되거나 발현되는 항체 분자는 임의의 적절한 형식을 가질 수 있으며, 예를 들어, 전체 항체, BCR, 또는 TCR 분자일 수 있거나, 또는 항체, BCR 단편, 또는 TCR 단편, 예를 들어, 단일 사슬 항체 (예를 들어, scFv 항체), Fv 항체, Fab' 항체, (Fab')2 단편, 디아바디 등일 수 있다. "암호화하는"/"암호화하는" 핵산 서열 또는.의 DNA 암호화 서열 또는 특정한 효소를 "암호화하는"/"암호화하는" 뉴클레오타이드 서열과 같은 용어 "암호화하는" 및 "암호화하는", 및 다른 동의어들은 적절한 조절 서열의 제어하에 있을 때 효소로 전사되고 번역되는 DNA 서열을 말한다. "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제에 결합하고 다운스트림 (3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 DNA 서열의 일부이다. 이 서열 영역은 그것의 3' 말단에 시작 코돈을 가진다. 프로모터 서열은 바탕값 이상의 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 요소와 함께 최소 수량의 염기를 포함한다. 그러나, RNA 폴리머라제가 서열에 결합하고 시작 코돈 (프로모터를 가진 3' 말단)에서 전사가 개시된 후, 전사는 3' 방향으로 다운스트림로 진행된다. 프로모터 서열 내에 전사 개시 부위 (뉴클레아제 S1으로 맵핑함으로써 편리하게 정의된다)뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)이 있을 것이다.
본 발명의 항체, BCR, 또는 TCR 발현 라이브러리에 의해 확인된, 그로부터 유래된, 그로부터 선택된, 또는 그로부터 얻을 수 있는 항체, BCR, 또는 TCR 분자는 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 다시, 이들 항체, BCR, 또는 TCR 분자는 항체, BCR, 또는 TCR 분자를 암호화하는 단백질 또는 핵산일 수 있으며, 이 핵산은 차례로 적절한 발현 벡터에 포함되거나 및/또는 적합한 숙주 세포에 포함될 수 있다.
cDNA 풀은 항체 또는 BCR 유전자의 중쇄의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체, BCR, 또는 TCR 유전자의 VH 또는 Vα 또는 Vγ 사슬 영역의 5' 단부에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 가지고 PCR 반응이 수행될 수 있다. cDNA 풀은 항체 유전자의 중쇄 또는 항체, BCR, 또는 TCR 유전자의 알파 또는 감마 사슬의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체, BCR, 또는 TCR 서열을 포함하는 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 VH 또는 Vα 또는 Vγ 사슬 영역의 5' 단부까지 영역 5'에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 가지고 PCR 반응이 수행될 수 있다. PCR 반응은 또한 예를 들어, 카파 및 람다 부류의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 풀의 증폭을 위해 설정될 수 있다. cDNA 풀은 항체 유전자의 경쇄의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체, BCR, 또는 TCR 유전자의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 영역의 5' 단부에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 가지고 PCR 반응이 수행될 수 있다. cDNA 풀은 항체 유전자의 경쇄의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체, BCR, 또는 TCR 서열을 포함하는 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 영역의 5' 단부까지 영역 5'에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 가지고 PCR 반응이 수행될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 또는 프라이머는 공지된 공공이 이용가능한 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 유전자 서열 데이터베이스 정보에 기초하여 설계될 수 있다.
일부 구체예에서, VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열은 중쇄 또는 경쇄 유전자 및 특히 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 폴리뉴클레오타이드의 말단 영역 중 하나 또는 둘 다에 특이적이지 않은 하나 이상의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 편리하게 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 편리하게 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 C-유전자 패밀리-특이적 프라이머 또는 C-유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 편리하게 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 영역에 특이적인 제1 프라이머와 C-유전자 패밀리-특이적 프라이머 또는 C-유전자-특이적 프라이머인 제2 프라이머 또는 복수의 제2 프라이머를 가진 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 편리하게 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열은 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 영역에 특이적인 제1 프라이머 및 범용 서열에 특이적인 제2 프라이머를 가진 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 편리하게 얻어질 수 있다.
일부 구체예에서, 역전사시 결과의 cDNA 서열은 면역글로불린 유전자 또는 BCR 유전자 및 특히 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 폴리뉴클레오타이드의 말단 영역 중 하나 또는 둘 다에 특이적인 하나 이상의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 V-유전자 패밀리-특이적 프라이머 또는 V-유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ의 라이브러리로부터 얻어질 수 있거나 (Nicholls et al., J. Immunol. Meth., 1993, 165:81; W093/12227), 또는 이용가능한 서열 정보에 기초하여 본 분야에 공지된 표준 방법에 따라서 설계된다 (VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열은 일반적으로 개재 스페이서 서열 (예를 들어, 인-프레임 가요성 펩타이드 스페이서를 암호화하는)과 결찰되어 단일 사슬 항체를 암호화하는 카세트를 형성할 수 있다). V 영역 서열은 면역글로불린-발현 단일 세포에 대해 cDNA 또는 PCR 증폭 생성물로서 편리하게 클로닝될 수 있다. VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 영역은 본원에서 기술된 방법에서 특히 주지된 대로 특정한 단계 후에 선택적으로 시퀀싱된다 (예를 들어, 단일 세포 PCR 후; 포유류 또는 다른 세포 표면 디스플레이 후, FACS 스크리닝 후 등). 시퀀싱은 여러 이유 중에서 다양성의 수준이 허용 가능한 수준임을 검증하기 위해 사용될 수 있다. 시퀀싱은 고-처리량 시퀀싱, 심도 있는 시퀀싱 (동일한 유전자가 복수의 개개의 샘플로부터 시퀀싱되어 서열에서의 차이를 확인한다), 또는 이 둘의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 기술된 방법을 사용하여 천연 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 조합을 물리적으로 결합시키는 것은 불필요하다. 일부 구체예에서, cDNA, 바코드화된 폴리뉴클레오타이드, 또는 PCR 증폭된 바코드화된 cDNA는 물리적으로 결합되지 않는다. 일부 구체예에서, cDNAs, barcoded poly뉴클레오타이드, 또는 PCR amplified barcoded cDNAs are not physically linked in the same 반응 또는 vessel. cDNA, 바코드화된 폴리뉴클레오타이드, 또는 PCR 증폭된 바코드화된 cDNA는 동일한 반응 또는 용기에서 물리적으로 결합되지 않는다.
일부 구체예에서, 천연 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 조합은 cDNA 프라이머에 더하여, VH 또는 Vα 또는 Vγ 유전자의 5' 단부에 대한 하나의 프라이머 또는 복수의 프라이머 및 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 유전자의 5' 단부에 대한 다른 프라이머 또는 복수의 프라이머를 사용해서 물리적으로 결합된다. 이들 프라이머는 또한 가외 서열의 상보성 테일을 포함하며, 이로써 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 유전자의 자기-조립을 허용한다. PCR 증폭 및 결합 후, 혼합된 생성물, 다시 말해서 혼합된 가변 영역을 얻을 기회는 증폭 및 결합 반응이 각각의 세포 내에서 수행되었기 때문에 최소화된다. 혼합의 위험은 디곡시게닌 라벨링된 뉴클레오타이드와 같은 대용량 시약을 이용함으로써 더 감소될 수 있으며, 이것은 V 영역 cDNA 쌍이 세포 구획 및 혼합물을 떠나지 않고 PCR 증폭 및 결합을 위한 세포 내에 유지되는 것을 더 보장한다. 증폭된 서열은 상보성 말단 서열의 혼성화에 의해 결합된다. 결합 후, 서열은 본원에서 기술된 추가의 방법 단계에서 사용하기 위해 세포로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 회수된 DNA는 말단 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 수 있고, 필요하다면 아래 상세히 설명된 대로 플라스미드, 파지, 코스미드, 파지미드, 바이러스 벡터 또는 이들의 조합물일 수 있는 벡터에 클로닝될 수 있다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 편리한 제한 효소 부위가 혼성화된 서열에 편입될 수 있다. 이들 벡터는 또한 나중에 사용하기 위해 결합된 가변 영역의 라이브러리로서 보관될 수 있다.
추가의 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 조합을 제공하기 위해 발현 시스템이 선택될 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지 발현 시스템은 중쇄 및 경쇄 서열의 무작위 재조합을 허용한다. 다른 적합한 발현 시스템들도 당업자에게 공지되어 있다.
비-인간으로부터 유래된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 경우 이들 서열을 완전 인간 Fc와 키메라화하는 것이 바람직할 수 있음이 주지되어야 한다. 여기 사용된 "키메라화된"은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 영역은 인간 기원이 아니고 중쇄 및 경쇄 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 사슬의 불변 영역은 인간 기원인 면역글로불린, BCR, 또는 TCR을 말한다. 이것은 가변 도메인을 증폭하고 인간 Fc에 클로닝함으로써 실행된다. 인간 Fc는 벡터의 일부일 수 있거나, 또는 별개의 분자 내에 있을 수 있고, Fc의 라이브러리가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 키메라화된 분자는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 성장되고 FACS로 2회 스크리닝됨으로써 관심의 항체를 발현하는 세포에 대해 세포 집단을 부화시킬 수 있다. 키메라화된 항체, BCR, 또는 TCR은 시퀀싱 후 기능적 특성화, 또는 직접 기능적 특성화 또는 동력학에 의해 특성화된다. 성장, 스크리닝 및 특성화는 아래 상세히 설명된다.
상기 기술된 PCR 반응이 IgG 형태의 항체를 클로닝하기 위해 기술되는 것을 주지하는 것이 중요하다. 그것들은 일반적으로 보다 성숙한 면역 반응과 관련되고 일반적으로 IgM 항체보다 높은 친화성을 나타냄으로써, 특정 치료 및 진단 용도에 더 바람직하게 만들기 때문에 바람직하다. 그러나, 분명하게, 필요하거나 적절하다면 다른 형태의 면역글로불린 분자, 예컨대 IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 하나 이상의 클로닝을 허용할 폴리뉴클레오타이드가 디자인될 수 있다.
항체, BCR, 또는 TCR이 확인되고 세포의 적절한 집단이 적절한 때에 분리되고 선택적으로 상기 기술된 것과 같이 부화된 후, 항체 또는 TCR 발현 라이브러리는 즉시 생성될 필요가 없고, 단 세포에 포함된 유전 물질은 온전한으로 유지되어 나중에 라이브러리가 만들어지는 것을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 세포, 세포 용해물 또는 그것으로부터 유도된 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA는 적절한 방법에 의해, 예컨대 냉동에 의해 나중까지 보관될 수 있고, 발현 라이브러리가 필요한 때에 나중에 생성된다.
일단 발현 벡터의 라이브러리가 생성되면, 암호화된 항체 분자가 적절한 발현 시스템에서 발현될 수 있고 기술분야에 잘 알려져 있고 문서화되어 있는 적절한 기술을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 그러므로 상기 정의된 발명의 방법은 적절한 발현 시스템에서 발현 벡터의 라이브러리를 발현시키는 단계 및 발현된 라이브러리를 원하는 특성을 가진 항체에 대해 스크리닝하는 추가의 단계들을 포함할 수 있다.
본원에서 나타낸 것과 같이, 항체, BCR, 또는 TCR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발명의 방법에 의해 제조된 폴리뉴클레오타이드는, 제한되는 것은 아니지만 항체, BCR, 또는 TCR 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들 자체, 전체 항체, BCR, 또는 TCR 또는 그것의 일부에 대한 비암호화 서열, 추가의 비-암호화 서열, 이를테면, 제한되는 것은 아니지만 비-암호화 5' 및 3' 서열, 예컨대 전사, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, mRNA의 리보솜 결합 및 안정성)를 포함한 mRNA 프로세싱에서 역할을 담당하는 전사된, 비번역 서열과 함께, 상기 언급된 추가의 암호화 서열, 예컨대 적어도 하나의 인트론이 있거나 없는 항체, BCR, 또는 TCR, 단편 또는 부분, 뿐만 아니라 추가의 서열에 대한 암호화 서열, 예컨대 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩타이드의 암호화 서열; 추가의 아미노산을 암호화하는 추가의 암호화 서열, 예컨대 추가의 기능성을 제공하는 것들을 포함할 수 있다.
일차 PCR 생성물은 그런 다음 항체, BCR, 또는 TCR 가변 도메인 VH, VL 카파 및 VL 람다 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ의 5' 및 3' 단부에 혼성화하는 새로운 폴리뉴클레오타이드 세트로 선택적으로 제2 PCR 반응이 수행될 수 있다 (새로운 폴리뉴클레오타이드 세트와 함께 사용된 일차 PCR 반응이 중쇄 또는 경쇄 항체 유전자 또는 Vα 또는 Vβ TCR 유전자 또는 Vγ 또는 Vδ TCR 유전자의 부분들을 증폭시키기 위해 디자인된 것인지에 따라 필요한 대로 수행됨). 이들 폴리뉴클레오타이드는 유리하게도 후속 클로닝에 대한 제한 효소들의 규정된 세트 (즉 제한 효소 부위)에 특이적인 DNA 서열을 포함한다. 선택된 제한 효소는 인간 항체, BCR, 또는 TCR V-유전자 절편 내에서 절단되지 않도록 선택되어야 한다. 그런 폴리뉴클레오타이드는 공지된 및 대중적으로 입수 가능한 면역글로불린 또는 TCR 유전자 서열 및 제한 효소 데이터베이스 정보를 기반으로 디자인될 수 있다. 그러나, 포함되어야 할 바람직한 제한 효소 부위는 NcoI, Hind III, MluI 및 NotI이다. 그런 이차 PCR 반응의 생성물은 다양한 V-중쇄, V-경쇄 카파 및 V-경쇄 람다 항체 단편/도메인의 레퍼토리이다. 이런 유형의 이차 PCR 반응은 따라서 일반적으로 관심의 발현 라이브러리 포맷이 scFv 또는 Fv 포맷일 때 수행되고, 이때 항체 또는 TCR의 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 도메인만이 존재한다.
PCR 생성물은 또한 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 5' 및 3' 단부에 혼성화하는 새로운 프라이머 세트로 PCR 반응이 수행될 수 있다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 유리하게도 후속 클로닝을 위한 제한 효소의 규정된 세트 (즉 제한 효소 부위)에 특이적인 DNA 서열을 포함할 수 있다. 선택된 제한 효소는 인간 항체 또는 TCR V-유전자 절편 내에서 절단되지 않도록 선택되어야 한다. 그런 폴리뉴클레오타이드는 공지된 및 대중적으로 입수 가능한 면역글로불린, BCR, 또는 TCR 유전자 서열 및 제한 효소 데이터베이스 정보를 기반으로 디자인될 수 있다. 그러나, 포함되어야 할 바람직한 제한 효소 부위는 NcoI, Hind III, MluI 및 NotI이다. 그런 이차 PCR 반응의 생성물은 다양한 VH, VL 카파 및 VL 람다 항체 단편/도메인 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ TCR 단편/도메인의 레퍼토리이다.
중쇄 또는 경쇄 또는 Vα 또는 Vβ 사슬 또는 Vγ 또는 Vδ 사슬 Fv 또는 Fab 단편, 또는 단일-사슬 항체, BCR, 또는 TCR이 또한 이 시스템과 함께 사용될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 또는 Vα 또는 Vβ 사슬 또는 Vγ 또는 Vδ 사슬은 돌연변이될 수 있고 이어서 상보하는 사슬이 용액에 추가될 수 있다. 그런 다음 2개의 개의 사슬은 조합되어 기능적 항체 단편을 형성하도록 허용된다. 무작위 비-특이적 경쇄 또는 중쇄 또는 Vα 또는 Vβ 사슬 또는 Vγ 또는 Vδ 사슬 서열의 추가는 다양한 구성원의 라이브러리를 생성하기 위한 조합 시스템의 제조를 허용한다.
본원에 정의된 면역-도전된 숙주의 B 또는 T 림프구로부터 유도된 항체, BCR, 또는 TCR 유전자의, 가변 중쇄 또는 Vα 사슬 또는 Vγ 사슬 영역, 또는 그것의 단편, 및/또는 가변 경쇄 또는 Vβ 사슬 또는 Vδ 사슬 영역, 또는 그것의 단편을 포함하는 클론된 단편들의 그런 레퍼토리의 라이브러리는 발명의 추가 측면을 형성한다. 클론된 가변 영역을 포함하는 이들 라이브러리는 선택적으로 발현 벡터에 삽입되어 발현 라이브러리를 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, PCR 반응은 분리된 면역 세포 집단에 포함된 다양한 항체, BCR, 또는 TCR 사슬의 불변 영역의 전부 또는 일부를 보유하기 위해 설정될 수 있다. 이것은 발현 라이브러리 포맷이 Fab 포맷이고, 이때 중쇄 또는 알파 또는 감마 사슬 성분이 VH 또는 Vα 또는 Vγ 및 CH 또는 Cα 또는 Cγ 도메인을 포함하고 경쇄 또는 Vβ 사슬 또는 Vδ 사슬 성분이 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 및 CL 또는 Cβ 또는 Cδ 도메인을 포함할 때 바람직하다. 다시 말하면, 항체, BCR, 또는 TCR 사슬의 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 그런 클론된 단편들의 라이브러리는 발명의 추가의 측면을 형성한다.
이들 핵산은 편리하게도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 더불어 서열을 포함할 수 있다., 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오타이드의 분리를 돕기 위하여 핵산으로 삽입될 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열이 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오타이드의 분리를 돕기 위하여 삽입될 수 있다. 예를 들어, 6-히스티딘 마커 서열이 본 발명의 단백질을 정제하기 위한 편리한 수단을 제공한다. 암호화 서열을 제외한, 본 발명의 핵산은 선택적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
추가의 서열이 클로닝 및/또는 발현에서의 기능을 최적화하기 위하여, 폴리뉴클레오타이드의 분리를 돕기 위하여, 또는 폴리뉴클레오타이드의 세포 안으로의 도입을 개선하기 위하여 그런 클로닝 및/발현 서열에 추가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 Ausubel, 상기 동일; 또는 Sambrook, 상기 동일 참조).
본원에 개시된 라이브러리는 다양한 용도에서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 라이브러리는 복수의 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 복수의 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 암플리콘 또는 암플리콘 세트로부터의 복수의 서열 판독을 포함한다. 라이브러리는 보관될 수 있고 분석용 샘플을 생성하기 위해 여러 번 사용될 수 있다. 일부 용도는, 예를 들어, 유전형 다형태, RNA 프로세싱의 연구, 및 본원에 기술된 방법에 따라 시퀀싱을 수행하기 위한 대표적인 클론의 선택을 포함한다. 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 라이브러리, 예컨대 시퀀싱 또는 증폭을 위한 프라이머 또는 라이브러리가 생성될 수 있고, 여기서 복수의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 50,000,000, 100,000,000 또는 그 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 복수의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 50,000,000, 100,000,000 또는 그 이상의 특유한 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 이때 각각의 특유한 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드를 포함한다.
바코드
분자 바코드는 단일 분자, 예컨대 단일 세포로부터 또는 단일 용기로부터의 친화성-올리고뉴클레오타이드 복합체 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 복합체, 또는 폴리뉴클레오타이드 분자의 단일 올리고뉴클레오타이드에 고유한 정보를 포함한다. 용기 바코드는 상이한 단일 세포로부터 또는 상이한 단일 용기에 존재하는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여, 단일 세포로부터 또는 단일 용기에 존재하는 폴리뉴클레오타이드에 특유한 정보를 포함한다. 일부 구체예에서 특유한 정보는 뉴클레오타이드의 특유한 서열을 포함한다. 예를 들어, 분자 바코드 또는 용기 바코드의 서열은 그 분자 바코드 또는 용기 바코드를 포함하는 뉴클레오타이드의 특유한 또는 무작위 서열의 동일성 및 순서를 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열을 확인하기 위해 사용될 수 없다. 예를 들어, 분자 바코드는 한 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있지만, 분자 바코드는 그것이 부착되는 표적 폴리뉴클레오타이드를 측정하기 위해 사용될 수 없다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열의 동일성에 연결된 공지 서열이 아니다. 예를 들어, 용기 바코드는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있지만, 용기 바코드는 그것이 부착되는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드를 측정하기 위해 사용될 수 없다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 뉴클레오타이드의 무작의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 폴리뉴클레오타이드 상의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 특유한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 축퇴성 뉴클레오타이드 서열 또는 축퇴성 바코드를 포함한다. 축퇴성 바코드는 가변 뉴클레오타이드 염기 조성 또는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 축퇴성 바코드는 무작위 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 바코드 또는 용기 바코드의 보체 서열은 또한 분자 바코드 또는 용기 바코드 서열이다.
예를 들어, 바코드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바코드는 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 바코드는 특정 길이의 뉴클레오타이드를 가진다. 예를 들어, 바코드는 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 바코드에서 각각의 바코드는 적어도 약 2개의 뉴클레오타이드를 가진다. 예를 들어, 복수의 바코드에서 각각의 바코드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 바코드에서 각각의 바코드는 최대 약 1000 뉴클레오타이드를 가진다. 예를 들어, 복수의 바코드에서 각각의 바코드는 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
분자 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수를 초과할 수 있다. 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수를 초과할 수 있다. 예를 들어, 분자 바코드 또는 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수보다 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 클 수 있다.
상이한 분자 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수를 초과할 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 분자 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 크다.
단일 용기에서 상이한 분자 바코드의 수는 단일 용기에서 라벨링될 상이한 분자의 수를 초과할 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 용기의 상이한 분자 바코드의 수는 단일 용기에서 라벨링될 상이한 분자의 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 크다.
상이한 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수보다 적을 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 라벨링될 분자의 총 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 적다.
단일 용기에서 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 증폭된 생성물 분자의 수는 단일 용기에서 라벨링될 상이한 분자의 수를 초과할 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 용기에서 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 증폭된 생성물 분자의 수는 단일 용기에서 라벨링될 상이한 분자의 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 크다.
단일 용기에서 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 분자의 수는 단일 용기에서 라벨링될 상이한 분자의 수보다 적을 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 용기에서 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 분자의 수는 단일 용기에서 라벨링될 상이한 분자의 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 적다.
단일 용기에서 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 분자의 수는 한 분자일 수 있다. 단일 용기에서 증폭되지 않은 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 분자의 수는 한 분자일 수 있다.
일부 구체예에서, 상이한 분자 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 동일한 농도를 가진다. 일부 구체예에서, 상이한 용기 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 동일한 농도를 가진다.
일부 구체예에서, 상이한 분자 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 상이한 농도를 가진다. 일부 구체예에서, 상이한 용기 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 상이한 농도를 가진다.
분자 바코드 또는 용기 바코드의 집단에서 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 상이한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 집단의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000 또는 그 이상의 상이한 서열을 가질 수 있다. 그러므로, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 상이한 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 적어도 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012 또는 그 이상의 상이한 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012 또는 그 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012 또는 그 이상의 상이한 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 분자 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 증폭 반응에서 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AID 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AMB 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AID 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AID 서열과 상이한 AMB 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AID 서열과 동일한 AMB 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 용기 바코드와 상이한 AMB 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 용기 바코드와 동일한 AMB 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드 및 AMB 서열은 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AID 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 AID 서열과 동일한 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 AID 서열 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 동일한 분자 바코드 및 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 하나 이상의 앰플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각각의 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 증폭 반응에서 동일한 폴리뉴클레오타이드로부터 및 동일한 단일 세포 또는 용기로부터 유도되었다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용되지 않는다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용되지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 표적 특이적 영역이 서열을 정렬하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용되지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 표적 특이적 영역이 서열을 정렬하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 표적 특이적 영역이 서열을 정렬하기 위해 사용된다.
일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 AID를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 AMB를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 AID와 AMB를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 AID와 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 AMB와 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 분자 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 정렬된 서열은 동일한 분자 바코드 및 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용되고, 정렬된 서열은 앰플리콘 세트로부터의 둘 이상의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용되고, 정렬된 서열은 복수의 서열을 포함하며 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 증폭 반응에서 동일한 폴리뉴클레오타이드로부터 유도되었다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 정렬하기 위해 사용되고, 정렬된 서열은 복수의 서열을 포함하며 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오타이드는 단일 세포 또는 단일 용기로부터 유도되었다.
액적 생성
복수의 세포로부터의 개별적인 세포로부터의, 또는 그것으로부터 유도된 폴리뉴클레오타이드의 분자 및 용기 바코드화와 결합된 복수의 세포의 샘플을 작은 반응 부피로 나누는 것은 바이오마커 서열과 같은 서열의 레퍼토리의 고 처리량 시퀀싱을 가능하게 할 수 있다.
복수의 세포로부터의 개별적인 세포로부터의, 또는 그것으로부터 유도된 폴리뉴클레오타이드의 분자 및 용기 바코드화와 결합된 복수의 세포의 샘플을 작은 반응 부피로 나누는 것은 서열, 예컨대 유기체의 전사물의 퍼센트를 나타내는 서열의 레퍼토리의 고 처리량 시퀀싱을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 서열의 레퍼토리는 적어도 약 0.00001%, 0.00005%, 0.00010%, 0.00050%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 유기체의 전사물을 나타내는 복수의 서열을 포함할 수 있다.
복수의 면역 세포로부터의 개별적인 세포로부터의, 또는 그것으로부터 유도된 폴리뉴클레오타이드의 분자 및 용기 바코드화와 결합된 면역 세포의 샘플을 작은 반응 부피로 나누는 것은 중쇄 및 경쇄 서열의 레퍼토리의 고 처리량 시퀀싱을 가능하게 할 수 있다. 이들 방법은 또한 바코드화된 서열을 기반으로 한 시퀀싱 후에 중쇄 및 경쇄의 쌍 형성을 허용할 수 있다. 샘플을 본원에 기술된 대로 작은 반응 부피로 나누는 것은 또한 감소된 양의 시약의 사용을 가능하게 할 수 있고, 그로써 분석의 물질 비용을 저하시킬 수 있다.
어떤 경우에, 역전사 반응 및/또는 증폭 반응은 액적, 예컨대 액적 디지털 PCR로 수행된다. 특정 양태에서, 발명은 표적 물질의 전부 또는 일부를 포함하는 유체 구획을 제공한다. 일부 구체예에서, 구획은 액적이다. 명세서 전체를 통해 "액적"에 대한 참조가 이루어지는 한편, 그 용어는 다르게 표시되지 않는 한 유체 구획 및 유체 칸막이와 교체 가능하게 사용된다. 다르게 표시된 것을 제외하고, "액적"은 편리를 위해 사용되고 임의의 유체 칸막이 또는 구획이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 액적은 미국 특허 번호 7,622,280에 기술된 것과 같이, 에멀션 조성물 (또는 둘 이상의 혼합할 수 없는 유체의 혼합물)을 포함할 수 있다. 액적은 WO/2010/036352에 기술된 장치에 의해 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 에멀션은 혼합할 수 없는 액체 (예컨대 오일과 물)이 혼합물을 나타낼 수 있다. 오일-상 및/또는 유-중-수 에멀션은 수성 액적 내에 반응 혼합물의 구분을 허용한다. 에멀션은 연속적인 오일상 내에 수성 액적을 포함할 수 있다. 본원에서 제시된 에멀션은 수-중-유 에멀션일 수 있고, 여기서 액적은 연속적인 수성 상 내에 있는 오일 액적이다. 본원에서 제시된 액적은 구획 사이의 혼합을 방지하도록 디자인되고, 이때 각각의 구획은 그것의 내용물을 증발로부터 및 다른 구획의 내용물과 합쳐지는 것으로부터 보호한다.
본원에서 기술되는 혼합물 또는 에멀션은 안정하거나 불안정할 수 있다. 에멀션은 상대적으로 안정하고 최소한의 연합(coalescence)을 가진다. 연합은 작은 액적들이 조합하여 점진적으로 커지는 액적을 형성할 때 일어난다. 어떤 경우에, 액적 발생기로부터 생성된 액적의 0.00001%, 0.00005%, 0.00010%, 0.00050%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%가 다른 액적들과 연합한다. 에멀션은 또한 그것에 의해 분산된 상이 현탁액 밖으로 박편으로 빠져나오는 과정인 한정된 응집을 가질 수 있다.
약, 적어도 약 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 300, 400, 또는 500 마이크론, 또는 상기보다 미만의, 또는 상기보다 큰 평균 직경을 가진 액적들이 생성될 수 있다. 액적은 약 0.001 내지 약 500, 약 0.01 내지 약 500, 약 0.1 내지 약 500, 약 0.1 내지 약 100, 약 0.01 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 100 마이크론의 평균 직경을 가질 수 있다. 단일분산 또는 다중분산 에멀션을 제조하기 위해 미세채널 교차-흐름 집중 또는 물리적 교반을 사용하여 에멀션 액적을 제조하는 미세유체공학적 방법은 알려져 있다. 액적은 단일분산 액적일 수 있다. 액적은 액적의 크기가 액적의 평균 크기의 플러스 또는 마이너스 5%보다 크게 달라지지 않도록 생성될 수 있다. 어떤 경우에, 액적은 액적의 크기가 액적의 평균 크기의 플러스 또는 마이너스 2%보다 크게 달라지지 않도록 생성된다. 액적 발생기는 단일 샘플로부터 액적의 집단을 생성할 수 있고, 이때 액적의 크기는 액적의 총 집단의 평균 크기의 플러스 또는 마이너스 약 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10%보다 크게 달라지지 않는다.
높은 기계적 안정성은 미세유체공학적 조작 및 고-전단 유체 프로세싱 (예컨대 미세유체공학적 모세관에서 또는 유체 통로에서 90도 회전, 예컨대 밸브를 통해)에 유용할 수 있다. 사전- 및 후-열적 처리된 액적 또는 캡슐은 표준 피펫 조작 및 원심분리에 대해 기계적으로 안정할 수 있다.
액적은 수성 샘플을 통해 오일상을 흐르게 함으로써 형성될 수 있다. 수성 상은 세포, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 분자 바코드화된 폴리뉴클레오타이드, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 프라이머, 주형 핵산 및 효소, 예컨대 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 및/또는 역전사효소를 포함하여, 증폭 반응을 수행하기 위한 완충된 용액 및 시약을 포함할 수 있다.
수성상은 고체 표면, 예컨대 비드가 있거나 없이 증폭 반응을 수행하기 위한 완충된 용액 및 시약을 포함할 수 있다. 완충된 용액은 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 또는 200 mM, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 Tris를 포함할 수 있다. 어떤 경우에, 염화칼륨의 농도는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 mM, 또는 약 상기보다 많거나, 또는 약 상기보다 적을 수 있다. 완충된 용액은 약 15 mM Tris 및 50 mM KCl을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP를 포함하여, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 또는 700 μm 각각의, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도로 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에 dUTP는 수성상 내에서 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 또는 700, 800, 900, 또는 1000 μm, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도로 추가된다. 어떤 경우에, 염화 마그네슘 또는 아세트산 마그네슘 (MgCl2)이 약 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 또는 5.0 mM, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도로 수성 상에 추가된다. MgCl2의 농도는 약 3.2 mM일 수 있다. 어떤 경우에, 아세트산 마그네슘 또는 마그네슘이 사용된다. 어떤 경우에, 황산 마그네슘이 사용된다.
BSA 또는 소의 표피로부터의 젤라틴과 같은 비-특이적 차단제가 사용될 수 있고, 이때 젤라틴 또는 BSA는 대략 0.1 내지 0.9% w/v의 농도 범위로 존재한다. 다른 가능한 차단제는 베타락토글로불린, 카제인, 분유, 또는 다른 통상적인 차단제를 포함할 수 있다. 어떤 경우에, BSA 및 젤라틴의 바람직한 농도는 약 0.1% w/v이다.
수성 상 내에서 증폭을 위한 프라이머는 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 또는 2.0 μm, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도를 가질 수 있다. 수성 상 내에서 프라이머 농도는 약 0.05 내지 약 2, 약 0.1 내지 약 1.0, 약 0.2 내지 약 1.0, 약 0.3 내지 약 1.0, 약 0.4 내지 약 1.0, 또는 약 0.5 내지 약 1.0 μm일 수 있다. 프라이머의 농도는 약 0.5 μm일 수 있다. PCR에서 표적 핵산 농도에 대한 처리 가능한 범위는, 제한되는 것은 아니지만 약 1 pg 내지 약 500 ng을 포함한다.
어떤 경우에, 수성 상은 또한 제한되는 것은 아니지만, 비-특이적 바탕/차단 핵산 (예컨대 연어 정자 DNA), 생체보존제 (예컨대 나트륨 아지드), PCR 인핸서 (예컨대 베타인, 트레할로오스 등) 및 억제제 (예컨대 RNAse 억제제)를 포함하여, 추가제를 포함할 수 있다. 다른 추가제로는, 예컨대 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 글리세롤, 베타인 (1)수화물 (N,N,N-트라이메틸글리신 = [카록시-메틸] 트라이메틸암모늄), 트레할로오스, 7-데아자-2'-데옥시구아노신 트라이포스페이트 (dC7GTP 또는 7-데아자-2'-dGTP), BSA (우혈청 알부민), 포름아미드 (메탄아미드), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 다른 테트라알킬암모늄 유도체 (예컨대 테트라에틸암모늄 클로라이드 (TEA-Cl) 및 테트라프로필암모늄 클로라이드 (TPrA-Cl), 비-이온성 계면활성제 (예컨대 Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), 또는 PREXCEL-Q를 들 수 있다. 어떤 경우에, 수성 상은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 추가제를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 수성 상은 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 추가제를 포함할 수 있다.
어떤 경우에, 비-이온성 에틸렌 옥사이드/프로필렌 옥사이드 차단 공중합체는 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1.0%의 농도로 수성 상에 추가될 수 있다. 통상적인 생체계면활성제는 플루로닉 F-68, 테트로닉스, 및 Zonyl FSN과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 플루로닉 F-68은 약 0.5% w/v의 농도로 존재할 수 있다.
일부 경우에 황산 마그네슘은 유사한 농도에서 염화 마그네슘에 대해 치환될 수 있다. 다양한 판매회사로부터의 광범위한 통상적인, 상업적 PCR 완충액이 완충된 용액에 대해 치환될 수 있다.
에멀션은 고체-유사 계면 필름을 가지는 미소캡슐 안으로 가열함으로써 변환될 수 있는 액체-유사 계면 필름을 가지는 고도로 단일분산 액적을 제조하기 위해 제형될 수 있고; 그런 미소캡슐은 PCR 증폭과 같은 반응 과정을 통해 내용물을 보유할 수 있는 생체반응기로서 행동할 수 있다. 미소캡슐 형태로의 변환은 가열시 일어날 수 있다. 예를 들어, 그런 변환은 약 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 또는 95℃보다 큰 온도에서 일어날 수 있다. 일부 경우에 이 가열은 써모사이클러(thermocycler)를 사용하여 일어난다. 가열 과정 동안, 유체 또는 미네랄 오일 오버레이가 증발을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 과도한 연속상 오일은 가열 전에 제거될 수 있거나 제거될 수 없다. 생체적합성 캡슐은 광범위한 열적 및 기계적 프로세싱을 가로질러 연합 및/또는 응집에 대해 저항할 수 있다. 변환에 이어서, 캡슐은 약 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 또는 40℃, 또는 약 상기보다 큰, 또는 약 상기보다 작은 온도에서 보관될 수 있다. 이들 캡슐은 생화학적 용도에서, 예컨대 거대분자, 특히 핵산 또는 단백질의 믹스를 포함하는, 또는 둘 다 함께 포함하는 수성 생물학적 유체의 안정한, 디지털화된 캡슐화; 약물 및 백신 전달; 생체분자 라이브러리; 임상적 영상화 용도, 등에 유용할 수 있다.
미소캡슐은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고 특히 고온에서 연합에 저항할 수 있다. 따라서, PCR 증폭 반응은 매우 높은 밀도 (예컨대 단위 부피당 반응의 수)에서 일어날 수 있다. 어떤 경우에, 100,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 2,500,000, 5,000,000, 또는 10,000,000보다 많은 별도의 반응이 ml당 일어날 수 있다. 어떤 경우에, 반응은 단일 웰에서, 예컨대 미액적정 플레이트의 웰에서 반응 부피 사이의 내부-혼합 없이 일어난다. 미소캡슐은 또한 역전사, 프라이머 연장, 및/또는 PCR 반응이 일어나는 것을 가능하게 하기에 필요한 다른 성분들, 예컨대 프라이머, 프로브, dNTP, DNA 또는 RNA 폴리머라제 등을 포함할 수 있다. 이들 캡슐은 광범위한 열적 및 기계적 프로세싱에 걸쳐 연합 및 응집에 대한 저항을 나타낸다.
어떤 경우에, 증폭 단계는 디지털 PCR, 예컨대 미세유체공학-기반 디지털 PCR 또는 액적 디지털 PCR을 수행함으로써 수행된다.
액적은 미세유체공학 시스템 또는 장치를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 "미소 (미세)-" 접두어 (예를 들어, "미소채널" 또는 "미세유체공학적")는 일반적으로, 약 1 mm 미만, 일부 경우에는 약 100 마이크론 (마이크로미터) 미만의 폭 또는 직경을 가지는 요소 또는 물품을 나타낸다. 어떤 경우에, 요소 또는 물품은 유체가 그것을 통해 흐를 수 있는 채널을 포함한다. 추가로, 본원에서 사용되는 "미세유체공학적"은 적어도 하나의 미소규모 채널을 포함하는 장치, 기기 또는 시스템을 나타낸다.
미세유체공학적 시스템 및 장치는 다양한 맥락에서, 전형적으로 소형화된 실험실 (예컨대 임상) 분석의 맥락에서 기술되었다. 다른 용도 역시 기술되어 있다., 예를 들어, 국제 특허 출원 공개공보 번호 WO 01/89788; WO 2006/040551; WO 2006/040554; WO 2004/002627; WO 2008/063227; WO 2004/091763; WO 2005/021151; WO 2006/096571; WO 2007/089541; WO 2007/081385 및 WO 2008/063227.
액적은 일반적으로 제2 담체 유체에 제1 샘플 유체의 양을 포함한다. 액적을 형성하기 위한 기술분야에 공지되어 있는 임의의 기술이 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 표적 물질 (예컨대 면역 세포)을 포함하는 샘플 유체 스트림을 흐르게 하여 흐르는 담체 유체의 2개의 개의 반대되는 스트림과 상호작용하게 하는 단계를 포함한다. 담체 유체는 샘플 유체와 혼합할 수 없다. 샘플 유체와 흐르는 담체 유체의 2개의 개의 반대되는 스트림과의 교차는 샘플 유체의 표적 물질을 포함하는 개별적인 샘플 액적 안으로의 칸막이를 초래한다.
담체 유체는 샘플 유체와 혼합할 수 없는 임의의 유체일 수 있다. 예시적인 담체 유체는 오일이다. 특정 구체예에서, 담체 유체는 계면활성제를 포함한다.
동일한 방법이 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)과 같은 증폭 반응, 또는 다중-가닥 대체 증폭과 같은 비-PCR 기반 증폭 반응, 또는 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 다른 방법을 위한 시약과 같은 다른 시약을 포함하는 개별적인 액적을 생성하는 데 적용될 수 있다. PCR-기반 증폭 반응을 수행하기에 적합한 시약은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 인간들에게 알려져 있고, 제한되는 것은 아니지만, DNA 폴리머라제, 전방 및 역 프라이머, 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트 (dNTP), 및 하나 이상의 완충액을 포함한다.
특정 구체예에서, 유체 구획은 표적 물질 (예컨대 면역 세포 및/또는 비드와 같은 고체 지지체)을 포함하는 제1 유체 파티션 (예컨대 액적) 및 제2 유체 (예컨대 유체 스트림으로서 또는 액적 내의)를 제공함으로써 형성된다. 제1 및 제2 유체는 침지되어 액적이 형성된다. 침지는 전기장을 2개의 유체에 인가함으로써 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 제2 유체는 증폭 반응, 예컨대 폴리머라제 사슬 반응 또는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다.
특정 양태에서, 발명은 각각의 구조체가 특유한 N-량체 및 기능적 N-량체를 포함하는 복수의 핵산 구조체를 얻은 단계를 포함하는, 특유하게 바코드화된 중쇄 및 경쇄 항체 서열 및/또는 알파 및 베타 사슬 TCR 서열 및/또는 감마 및 델타 사슬 TCR 서열의 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다. 기능적 N-량체는 무작위 N-량체, PCR 프라이머, 보편적 프라이머, 항체, 달라붙는 단부, 또는 임의의 다른 서열일 수 있다. 방법은 각각이 특유한 구조체의 하나 이상의 복사물을 포함하고 있는 수 N의 유체 구획의 M 세트를 제조하는 단계를 포함한다. 방법은 세트의 각각의 구획에 추가의 구조체를 추가하고, 그것을 각각의 세트에 대해 반복하여 각각이 특유한 쌍의 구조체를 포함하고 있는 NxM 구획을 제조함으로써 더 복잡한 바코드 라이브러리를 생성할 수 있다. 쌍은 새로운 구조체를 제조하기 위해 혼성화되거나 결찰될 수 있다. 바코드 라이브러리의 각각의 구조체에서, 각각의 특유한 N-량체는 시퀀싱, 프로브 혼성화, 다른 방법, 또는 방법들의 조합에 의한 확인을 위해 적응될 수 있다.
액적 라이브러리
일반적으로, 액적 라이브러리는 단일 수집에서 함께 통합된 다수의 라이브러리 요소들로 이루어진다. 라이브러리는 단일 라이브러리 요소에서부터 1x1015 라이브러리 요소 또는 그 이상으로 복잡성이 변할 수 있다. 각각의 라이브러리 요소는 고정된 농도의 하나 이상의 주어진 성분이다. 이 요소는, 제한되는 것은 아니지만, 세포, 비드, 아미노산, 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 폴리뉴클레오타이드 또는 소분자 화학적 화합물일 수 있다. 요소는 분자 바코드, 용기 바코드, 또는 둘 다와 같은 식별자를 포함할 수 있다.
세포 라이브러리 요소는, 제한되는 것은 아니지만, 하이브리도마, B-세포, T-세포, 일차 세포, 배양된 세포주, 암 세포, 줄기 세포, 또는 임의의 다른 세포 유형을 포함할 수 있다. 세포성 라이브러리 요소는 개개의 액적 내의 하나 내지는 수만 개의 다수의 세포를 캡슐화함으로써 제조된다. 캡슐화된 세포의 수는 일반적으로 세포의 수 밀도 및 액적의 부피로부터 푸아송 통계에 의해 주어진다. 그러나, 어떤 경우에는, 이 수는 Edd et al., Lab Chip, 8 (8):1262-1264, 2008에 설명된 대로 푸아송 통계로부터 벗어난다. 세포들의 상이한 성질은 각각 하나의 항체 또는 TCR을 생성하는 면역 세포와 같은, 복수의 세포 변이체를 가지고 대량으로 라이브러리가 제조될 수 있도록 하며, 전부 단일 출발 매체에 존재하고, 이후 매체는 최대 하나의 세포를 포함하는 개개의 액적 캡슐로 파괴된다. 다음에, 개개의 액적 캡슐 내의 세포가 용해되고, 용해된 세포로부터 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오타이드 및/또는 알파 및 베타 사슬 폴리뉴클레오타이드 및/또는 감마 및 델타 사슬 폴리뉴클레오타이드가 분자 바코드 및 용기 바코드로 바코드화되고 증폭되며, 그 다음 조합되고 통합되어 중쇄 및 경쇄 및/또는 알파 및 베타 사슬 및/또는 감마 및 델타 사슬 라이브러리 요소로 구성된 라이브러리가 형성된다.
비드 기반 라이브러리 요소는 하나 이상의 비드를 포함하고, 또한 항체, 효소 또는 다른 단백질과 같은 다른 시약을 포함할 수 있다. 모든 라이브러리 요소가 상이한 종류의 비드를 포함하지만 동일한 주변 매체를 가진 경우, 라이브러리 요소는 전부 단일 출발 유체로부터 제조될 수 있거나, 또는 다양한 출발 유체를 가질 수 있다. 변이체의 수집으로부터 대량으로 제조된 세포성 라이브러리의 경우, 라이브러리 요소는 다양한 출발 유체로부터 제조될 것이다. 복수의 세포를 가지고 출발할 때 둘 이상의 세포를 포함하는 단지 몇 개의 액적을 제외하고는 액적당 정확히 하나의 세포를 갖는 것이 바람직하다. 어떤 경우에는, 푸아송 통계로부터의 변차는 액적의 증대된 로딩을 제공하기 위해 달성될 수 있으며, 이로써 액적당 정확히 하나의 세포를 가진 더 많은 액적이 있게 되고, 예외로서 빈 액적이나 둘 이상의 세포를 포함하는 액적은 적어진다.
일부 구체예에서, 복수의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 가지고 출발할 때 둘 이상의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단지 몇 개의 액적을 제외하고는 액적당 정확히 하나의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 갖는 것이 바람직하다. 어떤 경우에는, 푸아송 통계로부터의 변차는 액적의 증대된 로딩을 제공하기 위해 달성될 수 있으며, 이로써 액적당 정확히 하나의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 가진 더 많은 액적이 있게 되고, 예외로서 빈 액적이나 둘 이상의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 액적은 적어진다.
액적 라이브러리의 예들은 비드, 세포, 소분자, DNA, 프라이머, 항체, 및 바코드화된 폴리뉴클레오타이드에 이르는 범위의, 상이한 내용물을 가진 액적의 수집이다. 액적은 크기가 대략 0.5 마이크론 내지 500 마이크론 직경이며, 이것은 약 1 피코리터 내지 1 나노리터에 상응한다. 그러나, 액적은 5 마이크론 정도로 작을 수 있고 500 마이크론 정도로 클 수 있다. 바람직하게, 액적은 100 마이크론 미만, 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론 직경이다. 가장 바람직한 크기는 약 20 내지 40 마이크론 직경 (10 내지 100 피코리터)이다. 액적 라이브러리의 테스트된 바람직한 특성은 삽투압 균형, 균일한 크기, 및 크기 범위를 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 액적 라이브러리 내에 포함된 액적은 바람직하게 크기가 균일하다. 즉, 라이브러리 내의 임의의 액적의 직경은 동일한 라이브러리 내의 다른 액적의 직경과 비교했을 때 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만으로 변할 것이다. 라이브러리에서 액적의 균일한 크기는 액적의 안정성 및 완전성을 유지하는데 중요할 수 있고, 또한 본원에서 기술된 다양한 생물학적 및 화학적 검정을 위한 라이브러리 내의 액적의 후속 사용에 필수적일 수 있다.
본 발명은 비혼화성 유체 내의 복수의 수성 액적을 포함하는 액적 라이브러리를 제공하며, 여기서 각각의 액적은 바람직하게 크기가 실질적으로 균일하고, 상이한 라이브러리 요소를 포함한다. 본 발명은 상이한 라이브러리 요소를 포함하는 단일 수성 유체를 제공하는 단계, 각각의 라이브러리 요소를 비혼화성 유체 내에서 수성 액적으로 캡슐화하는 단계를 포함하는 액적 라이브러리를 형성하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 상이한 종류의 요소 (예를 들어, 세포 또는 비드)가 동일한 매체에 포함된 단일 공급원에 초기 통합 후, 요소들은 액적에 캡슐화됨으로써 액적의 라이브러리가 생성되며, 여기서 상이한 종류의 비드 또는 세포를 가진 각각의 액적은 상이한 라이브러리 요소이다. 초기 용액의 희석은 캡슐화 과정을 가능하게 한다. 일부 구체예에서, 형성된 액적은 단일 요소를 포함하거나, 또는 아무 것도 포함하지 않을 것이다; 즉, 비어 있을 것이다. 다른 구체예에서, 형성된 액적은 라이브러리 요소의 다수의 카피를 포함할 것이다. 캡슐화될 요소는 일반적으로 일종의 변이체이다. 한 예에서, 요소는 혈액 샘플의 면역 세포이고, 각각의 면역 세포는 캡슐화되며, 이로써 면역 세포에서 뉴클레오타이드의 항체 서열이 증폭되고 바코드화된다.
예를 들어, 하나의 종류의 에멀젼 라이브러리에서, 상이한 매체 내에 상이한 입자, 즉 세포 또는 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 갖고 통합 전에 캡슐화된 라이브러리 요소가 았다. 한 예에서, 라이브러리 요소의 명시된 수, 즉 상이한 세포 또는 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 n개가 상이한 매체 내에 포함된다. 라이브러리 요소의 각각은 개별적으로 에멀젼화되어 통합되며, 이 지점에서 통합된 상이한 라이브러리 요소의 n개의 각각이 조합되고 단일 풀로 통합된다. 결과의 풀은 각각 상이한 종류의 입자를 포함하는 복수의 유중수 에멀젼 액적을 포함한다.
일부 구체예에서, 형성된 액적은 단일 라이브러리 요소를 포함하거나, 또는 아무것도 포함하지 않을 것이다; 즉, 비어 있을 것이다. 다른 구체예에서, 형성된 액적은 라이브러리 요소의 다수의 카피를 포함할 것이다. 비드의 함량은 푸아송 분포를 따르며, 이 경우 사건들이 공지된 평균 비율로 발생하고 마지막 사건 이래로 시간에 독립적으로 일어난다면 고정된 시간 기간 내에 다수의 사건이 발생할 확률을 표시하는 뚜렷한 확률 분포가 있다. 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 오일 및 계면활성제는 액적 간 라이브러리의 내용물의 교환을 방지한다.
프라이머
일반적으로, 한 쌍 이상의 프라이머가 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 프라이머 쌍의 하나의 프라이머는 정방향 프라이머일 수 있고, 프라이머 쌍의 하나의 프라이머는 역방향 프라이머일 수 있다.
어떤 경우에는, 프라이머의 제1 쌍이 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 제1 쌍의 하나의 프라이머는 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열에 상보성인 정방향 프라이머일 수 있고, 제1 쌍의 하나의 프라이머는 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제2 서열에 상보성인 역방향 프라이머일 수 있고, 제1 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 표적 유전자좌는 VH 또는 Vα 또는 Vγ 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 표적 유전자좌는 AID 서열 및/또는 AMB 서열을 포함한다.
어떤 경우에는, 프라이머의 제2 쌍이 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 제2 쌍의 하나의 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제1 서열에 상보성인 정방향 프라이머일 수 있고, 제2 쌍의 하나의 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제2 서열에 상보성인 역방향 프라이머일 수 있고, 제2 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 표적 유전자좌는 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 서열을 포함한다.
어떤 경우에는, 프라이머의 제3 쌍이 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 제3 쌍의 하나의 프라이머는 제3 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제1 서열에 상보성인 정방향 프라이머일 수 있고, 제3 쌍의 하나의 프라이머는 제3 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제2 서열에 상보성인 역방향 프라이머일 수 있고, 제3 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 제3 표적 유전자좌는 분자 바코드 또는 용기 바코드와 같은 바코드를 포함한다.
정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 길이는 표적 폴리뉴클레오타이드 및 표적 유전자좌의 서열에 의존할 수 있다. 예를 들어, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 길이 및/또는 TM은 최적화될 수 있다. 어떤 경우에는, 프라이머는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오타이드 길이일 수 있거나, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오타이드를 초과하는 길이일 수 있거나, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오타이드 미만의 길이일 수 있다. 어떤 경우에는, 프라이머는 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 15 내지 약 50, 약 15 내지 약 55, 약 15 내지 약 60, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 35, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 45, 약 20 내지 약 50, 약 20 내지 약 55, 또는 약 20 내지 약 60개 뉴클레오타이드 길이이다.
프라이머는 주형 폴리뉴클레오타이드에 결합하기 전에 단일-가닥 DNA일 수 있다. 어떤 경우에는, 프라이머는 초기에는 이중-가닥 서열을 포함한다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 사용에 의존할 수 있지만 약 6 내지 약 50개 뉴클레오타이드, 또는 약 15 내지 약 35개 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 혼성 복합체를 형성하기 위해 더 낮은 온도를 필요로 할 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머는 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만 주형과 혼성화하기에 충분히 상보성일 수 있다. 어떤 경우에는, 프라이머는 주형 폴리뉴클레오타이드와 결합하기 전에 부분적으로 이중-가닥일 수 있다. 이중-가닥 서열을 가진 프라이머는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 염기, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 염기를 초과하는, 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 염기 미만의 헤파린 루프를 가질 수 있다. 프라이머의 이중-가닥 부분은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 염기쌍, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 염기쌍 초과, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 염기쌍 미만, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 염기쌍일 수 있다. 주어진 표적 서열의 증폭을 위한 적합한 프라이머의 설계는 본 분야에 잘 공지되어 있다.
프라이머는 프라이머의 검출 또는 고정화를 허용하지만 프라이머의 기본적인 특성은 변경시키지 않는 추가의 특징을 포함할 수 있다 (예를 들어, DNA 합성의 개시 지점으로 작용하는). 예를 들어, 프라이머는 표적 핵산과 혼성화하지 않지만 클로닝이나 추가의 증폭, 또는 증폭된 생성물의 시퀀싱을 용이하게 하는 추가의 핵산 서열을 5' 단부에 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 서열은 범용 프라이머 결합 부위와 같은 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 혼성화할 만큼 주형에 충분히 상보성인 프라이머의 영역은 여기서 혼성화 영역이라고 언급될 수 있다.
다른 경우, 본원에서 기술된 방법 및 조성물에 이용된 프라이머는 하나 이상의 범용 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 범용 뉴클레오사이드의 비제한적 예들은 U.S. Appl. Pub. Nos. 2009/0325169 및 2010/0167353에 설명된 5-나이트로인돌 및 이노신이다.
프라이머는 2차 구조 및 자기-혼성화를 피하기 위해 공지된 변수에 따라서 설계될 수 있다. 상이한 프라이머 쌍들은 대략 동일한 온도에서, 예를 들어, 다른 프라이머 쌍의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 이내에서 어닐링되고 용융될 수 있다. 어떤 경우에는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, 10,000 또는 그 이상을 초과하는 프라이머가 초기에 사용된다. 이러한 프라이머는 본원에서 기술된 표적 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있다.
프라이머는, 제한되는 것은 아니지만, 본 분야에 공지된 방법을 사용한 적절한 서열의 클로닝 및 직접 화학 합성을 포함하는 여러 방법에 의해 제조될 수 있다 (Narang et al., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol. 68:109 (1979)). 프라이머는 또한 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 프라이머들은 동일한 용융 온도를 가질 수 있다. 프라이머들은 동일하지 않은 용융 온도를 가질 수 있다. 프라이머의 길이는 원하는 용융 온도를 가진 프라이머를 생성하기 위해 5' 단부 또는 3' 단부에서 연장되거나 단축될 수 있다. 프라이머 쌍의 프라이머들 중 하나는 나머지 하나의 프라이머보다 더 길 수 있다. 프라이머 쌍 내에서 프라이머의 3' 어닐링 길이는 상이할 수 있다. 또한, 각각의 프라이머 쌍의 어닐링 위치는 프라이머 쌍들의 서열 및 길이가 원하는 용융 온도를 얻도록 설계될 수 있다. 25개 염기쌍보다 적은 프라이머의 용융 온도를 결정하기 위한 식은 윌리스 법칙 (Wallace Rule) (TM=2 (A+T)+4 (G+C))이다. 컴퓨터 프로그램이 또한 프라이머 설계에 사용될 수 있다. 각각의 프라이머의 TM (용융 또는 어닐링 온도)은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산될 수 있다. 프라이머의 어닐링 온도는, 제한되는 것은 아니지만, 사이클 1, 2, 3, 4, 5, 사이클 6-10, 사이클 10-15, 사이클 15-20, 사이클 20-25, 사이클 25-30, 사이클 30-35, 또는 사이클 35-40을 포함하는 임의의 증폭 사이클 후 다시 계산되고 증가될 수 있다. 초기 증폭 사이클 후, 프라이머의 5' 절반이 관심의 각각의 유전자좌로부터 생성물에 편입될 수 있고, 이로써 각각의 프라이머의 5' 절반과 3' 절반의 서열 둘 다에 기초하여 TM이 다시 계산될 수 있다.
프라이머 부위는 프라이머가 혼성화하는 주형의 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 주형-지시된 핵산 합성을 위한 개시 지점으로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 4개의 상이한 뉴클레오타이드 및 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 역전사효소와 같은 중합 제제 또는 효소가 있을 때 주형-지시된 핵산 합성을 개시할 수 있다. 프라이머 쌍은 2개 프라이머: 주형 서열의 5' 단부와 혼성화하는 5' 업스트림 영역을 가진 제1 프라이머, 및 주형 서열의 3' 단부의 보체와 혼성화하는 3' 다운스트림 영역을 가진 제2 프라이머를 포함한다. 프라이머 세트는 둘 이상의 프라이머: 주형 서열 또는 복수의 주형 서열의 5' 단부와 혼성화하는 5' 업스트림 영역을 가진 제1 프라이머 또는 제1 복수의 프라이머, 및 주형 서열 또는 복수의 주형 서열의 3' 단부의 보체와 혼성화하는 3' 다운스트림 영역을 가진 제2 프라이머 또는 제2 복수의 프라이머를 포함한다. 프라이머는 표적 특이적 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 샘플 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 범용 프라이밍 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 PCR 프라이밍 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 폴리뉴클레오타이드의 증폭을 개시하는데 사용되는 PCR 프라이밍 서열을 포함한다 (Dieffenbach, PCR 프라이머: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, New York (2003)). 범용 프라이머 결합 부위 또는 서열은 폴리뉴클레오타이드 및/또는 앰플리콘에 범용 프라이머의 부착을 허용한다. 범용 프라이머는 본 분야에 잘 공지되어 있고, 제한되는 것은 아니지만, -47F (M13F), 알파MF, AOX3', AOX5', BGHr, CMV-30, CMV-50, CVMf, LACrmt, 람다 gt10F, 람다 gt10R, 람다 gt11F, 람다 gt11R, M13 rev, M13정방향 (-20), M13Reverse, male, p10SEQPpQE, pA-120, pet4, pGAP 정방향, pGLRVpr3, pGLpr2R, pKLAC14, pQEFS, pQERS, pucU1, pucU2, reversA, seqIREStam, seqIRESzpet, seqori, seqPCR, seqpIRES-, seqpIRES+, seqpSecTag, seqpSecTag+, seqretro+PSI, SP6, T3-prom, T7-prom, 및 T7-termInv를 포함한다. 여기 사용된 부착은 공유적 상호작용과 비공유적 상호작용을 둘 다 말하거나 또는 어느 하나를 말할 수 있다. 범용 프라이머 결합 부위에 범용 프라이머의 부착은 폴리뉴클레오타이드 및/또는 앰플리콘의 증폭, 검출, 및/또는 시퀀싱을 위해 사용될 수 있다. 범용 프라이머 결합 부위는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 범용 프라이머 결합 부위는 적어도 약 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 또는 10000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 범용 프라이머 결합 부위는 1-10, 10-20, 10-30 또는 10-100개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 범용 프라이머 결합 부위는 약 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 2-90, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-10, 1-900, 1-800, 1-700, 1-600, 1-500, 1-400, 1-300, 1-200, 1-100, 2-900, 2-800, 2-700, 2-600, 2-500, 2-400, 2-300, 2-200, 2-100, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 10-10, 5-900, 5-800, 5-700, 5-600, 5-500, 5-400, 5-300, 5-200, 5-100, 10-900, 10-800, 10-700, 10-600, 10-500, 10-400, 10-300, 10-200, 10-100, 25-900, 25-800, 25-700, 25-600, 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400, 200-300, 300-1000, 300-900, 300-800, 300-700, 300-600, 300-500, 300-400, 400-1000, 400-900, 400-800, 400-700, 400-600, 400-500, 500-1000, 500-900, 500-800, 500-700, 500-600, 600-1000, 600-900, 600-800, 600-700, 700-1000, 700-900, 700-800, 800-1000, 800-900, 또는 900-1000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함한다.
프라이머는 프라이머 확장 생성물의 합성에서의 사용이 양립되는 길이를 가질 수 있다. 프라이머는 8 내지 200개 뉴클레오타이드 길이인 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 프라이머의 길이는 주형 폴리뉴클레오타이드 및 주형 유전자좌의 서열에 의존할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 또는 프라이머 세트의 길이 및/또는 용융 온도 (TM)는 최적화될 수 있다. 어떤 경우에는, 프라이머는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오타이드 길이, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오타이드를 초과하는 길이, 또는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개 뉴클레오타이드 미만의 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머는 약 8-100개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 10-75, 15-60, 15-40, 18-30, 20-40, 21-50, 22-45, 25-40, 7-9, 12-15, 15-20, 15-25, 15-30, 15-45, 15-50, 15-55, 15-60, 20-25, 20-30, 20-35, 20-45, 20-50, 20-55, 또는 20-60개 뉴클레오타이드 길이 및 이들 사이의 임의의 길이이다. 일부 구체예에서, 프라이머는 최대 약 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 뉴클레오타이드 길이이다.
일반적으로, 한 쌍 이상의 프라이머가 지수방식 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 프라이머 쌍의 하나의 프라이머는 정방향 프라이머일 수 있고, 프라이머 쌍의 하나의 프라이머는 역방향 프라이머일 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머의 제1 쌍이 지수방식 중폭 반응에서 사용될 수 있으며, 제1 쌍의 하나의 프라이머는 제1 주형 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열에 상보성인 정방향 프라이머일 수 있고, 제1 쌍의 하나의 프라이머는 제1 주형 폴리뉴클레오타이드 분자의 제2 서열에 상보성인 역방향 프라이머일 수 있고, 제1 주형 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머의 제2 쌍이 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 제2 쌍의 하나의 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제1 서열에 상보성인 정방향 프라이머일 수 있고, 제2 쌍의 하나의 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제2 서열에 상보성인 역방향 프라이머일 수 있고, 제2 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 표적 유전자좌는 가변 경쇄 항체 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머의 제3 쌍이 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 제3 쌍의 하나의 프라이머는 제3 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제1 서열에 상보성인 정방향 프라이머일 수 있고, 제3 쌍의 하나의 프라이머는 제3 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 제2 서열에 상보성인 역방향 프라이머일 수 있고, 제3 주형 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 존재할 수 있다.
하나 이상의 프라이머는 복수의 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부에 대해 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 주형 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부 및/또는 5' 단부에 대해 어닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 주형 폴리뉴클레오타이드의 내부 영역에 대해 어닐링될 수 있다. 내부 영역은 복수의 주형 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부로부터 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1000개 뉴클레오타이드일 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 프라이머들의 고정된 패널을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 커스텀 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 대조군 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 하우스키핑 유전자 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 범용 프라이머를 포함할 수 있다. 범용 프라이머는 범용 프라이머 결합 부위에 대해 어닐링될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 커스텀 프라이머는 SBC, 표적 특이적 영역, 그것의 보체, 또는 이것들의 임의의 조합물에 대해 어닐링된다. 하나 이상의 프라이머는 범용 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 프라이머 확장, 역전사, 선형 확장, 비-지수방식 증폭, 지수방식 증폭, PCR, 또는 하나 이상의 표적 또는 주형 폴리뉴클레오타이드의 임의의 다른 증폭 방법을 수행하거나 증폭시키도록 설계될 수 있다.
표적 특이적 영역은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 표적 특이적 영역은 적어도 약 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 또는 10000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 특이적 영역은 약 5-10, 10-15, 10-20, 10-30, 15-30, 10-75, 15-60, 15-40, 18-30, 20-40, 21-50, 22-45, 25-40, 7-9, 12-15, 15-20, 15-25, 15-30, 15-45, 15-50, 15-55, 15-60, 20-25, 20-30, 20-35, 20-45, 20-50, 20-55, 20-60, 2-900, 2-800, 2-700, 2-600, 2-500, 2-400, 2-300, 2-200, 2-100, 25-900, 25-800, 25-700, 25-600, 25-500, 25-400, 25-300, 25-200, 25-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-200, 200-1000, 200-900, 200-800, 200-700, 200-600, 200-500, 200-400, 200-300, 300-1000, 300-900, 300-800, 300-700, 300-600, 300-500, 300-400, 400-1000, 400-900, 400-800, 400-700, 400-600, 400-500, 500-1000, 500-900, 500-800, 500-700, 500-600, 600-1000, 600-900, 600-800, 600-700, 700-1000, 700-900, 700-800, 800-1000, 800-900, 또는 900-1000개 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 포함한다.
프라이머는 2차 구조 및 자기-혼성화를 피하기 위해 공지된 변수에 따라서 설계될 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 프라이머 쌍들은 대략 동일한 온도에서, 예를 들어, 다른 프라이머 쌍의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 이내에서 어닐링되고 용융될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 프라이머에서 하나 이상의 프라이머는 대략 동일한 온도에서, 예를 들어, 복수의 프라이머에서 다른 프라이머의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 이내에서 어닐링되고 용융될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 프라이머에서 하나 이상의 프라이머는 복수의 프라이머에서 다른 프라이머와 상이한 온도에서 어닐링되고 용융될 수 있다.
본원에서 기술된 방법에서 하나 이상의 단계를 위한 복수의 프라이머는 약, 최대 약, 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 50,000,000, 100,000,000개의 상이한 프라이머를 포함하는 복수의 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 프라이머에서 각각의 프라이머는 상이한 표적 또는 주형 특이적 영역 또는 서열을 포함할 수 있다.
역전사
어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 역전사에 의해 RNA로부터 제조된다. 어떤 경우에는, 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리머라제를 사용하는 것과 같은 프라이머 확장에 의해 DNA로부터 제조된다.
본원에서 기술된 방법은 결합된 역전사-PCR (역전사-PCR)에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 역전사와 PCR이 2개의 분리된 단계에서 수행될 수 있다. 먼저, 샘플 mRNA의 cDNA 카피가 폴리뉴클레오타이드 dT 프라이머, 서열 특이적 프라이머, 범용 프라이머, 또는 본원에서 기술된 임의의 프라이머를 사용하여 합성될 수 있다.
역전사 및 PCR은 단일 폐쇄 용기 반응에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 3개의 프라이머가 이용될 수 있는데, 하나는 역전사를 위한 것이고, 2개는 PCR을 위한 것이다. 역전사를 위한 프라이머는 PCR 앰플리콘의 위치에 대해 3'에서 mRNA에 결합할 수 있다. 필수적인 것은 아니지만 역전사 프라이머는 RNA 잔기 또는 변형된 유사체, 예컨대 2'-O-메틸 RNA 염기를 포함할 수 있으며, 이들은 mRNA와 혼성화했을 때 RNase H에 대한 기질을 형성하지 않을 것이다.
역전사 반응을 수행하기 위한 온도는 사용된 역전사효소에 의존한다. 어떤 경우에는, 열안정한 역전사효소가 사용되고, 역전사 반응은 약 37℃ 내지 약 75℃, 약 37℃ 내지 약 50℃, 약 37℃ 내지 약 55℃, 약 37℃ 내지 약 60℃, 약 55℃ 내지 약 75℃, 약 55℃ 내지 약 60℃, 약 37℃, 또는 약 60℃에서 수행된다. 어떤 경우에는, 3개 이상의 비-주형 말단 뉴클레오타이드를 전사된 생성물의 말단으로 전달하는 역전사효소가 사용된다.
본원에서 기술된 역전사 반응 및 PCR 반응은 본 분야에 공지된 다양한 형식으로, 예컨대 튜브, 미세역가 플레이트, 미소유체 장치, 또는 바람직하게는 액적에서 수행될 수 있다.
역전사 반응은 5μL 내지 100μL, 또는 10μL 내지 20μL 반응 부피의 범위의 부피에서 수행될 수 있다. 액적에서 반응 부피는 1pL 내지 100nL, 또는 10pL 내지 1nL의 범위일 수 있다. 어떤 경우에는, 역전사 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피를 가진 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, PCR 반응은 1pL 내지 100nL, 바람직하게 10pL 내지 1nL의 반응 부피 범위를 가진 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, PCR 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피를 가진 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 역전사 반응 및 PCR 반응은 1pL 내지 100nL 또는 10pL 내지 1nL의 반응 부피 범위를 가진 동일한 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 역전사 반응 및 PCR 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피 또는 약 1pL 또는 1pL 미만인 부피를 가진 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 역전사 반응 및 PCR 반응은 상이한 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 역전사 반응 및 PCR 반응은 1pL 내지 100nL 또는 10pL 내지 1nL의 반응 부피 범위를 각각 가진 복수의 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 역전사 반응 및 PCR 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피를 각각 가진 복수의 액적에서 수행된다.
어떤 경우에는, 제1 PCR 반응은 1pL 내지 100nL, 바람직하게 10pL 내지 1nL의 반응 부피 범위를 가진 제1 액적에서 수행되고, 제2 PCR 반응은 1pL 내지 100nL, 바람직하게 10pL 내지 1nL의 반응 부피 범위를 가진 제2 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 제1 PCR 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피를 가진 제1 액적에서 수행되고, 제2 PCR 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피를 가진 제2 액적에서 수행된다.
어떤 경우에는, 제1 PCR 반응 및 제2 PCR 반응은 1pL 내지 100nL 또는 10pL 내지 1nL의 반응 부피 범위를 각각 가진 복수의 액적에서 수행된다. 어떤 경우에는, 제1 PCR 반응 및 제2 PCR 반응은 약 1nL 또는 1nL 미만인 부피를 각각 가진 복수의 액적에서 수행된다.
RNA와 같은 표적 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 역전사 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사될 수 있다. 하나 이상의 역전사 프라이머는 불변 영역과 같은 RNA의 영역에 상보성인 영역을 포함할 수 있다 (예를 들어, mRNA의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 또는 폴리-A 테일). 일부 구체예에서, 역전사 프라이머는 제1 RNA의 불변 영역에 상보성인 영역을 가진 제1 역전사 프라이머, 및 제2 RNA의 불변 영역에 상보성인 영역을 가진 제2 역전사 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 역전사 프라이머는 제1 RNA의 불변 영역에 상보성인 영역을 가진 제1 역전사 프라이머, 및 각각 하나 이상의 RNA의 불변 영역에 상보성인 영역을 가진 하나 이상의 역전사 프라이머를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 역전사 프라이머는 바코드를 포함하지 않는다.
역전사 프라이머는 RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 RNA에 상보성인 프라이머의 영역에 대해 5'이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 RNA에 상보성인 프라이머의 영역에 대해 3'이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 5' 오버행 영역이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 증폭 및/또는 시퀀싱 반응을 위한 프라이밍 부위를 포함한다. 본원에서 기술된 하나 이상의 프라이머를 사용하여 RNA 분자가 본 분야에 공지된 적합한 시약을 사용해서 역전사된다.
RNA 분자의 역전사 반응을 수행한 후, 결과의 cDNA 분자는 분자 바코드 및 용기 바코드로 바코드화되고 하나 이상의 PCR 반응, 예컨대 제1 및/또는 제2 PCR 반응에 의해 증폭될 수 있다. 제1 및/또는 제2 PCR 반응은 한 쌍의 프라이머 또는 복수의 프라이머 쌍을 이용할 수 있다. 제1 및/또는 제2 PCR 반응은 복수의 정방향/역방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용할 수 있다. 제1 및/또는 제2 PCR 반응은 복수의 정방향/역방향 프라이머 및 정방향 프라이머를 이용할 수 있다. 복수의 정방향/역방향 프라이머의 제1 및/또는 제2 프라이머는 cDNA 분자 또는 바코드화된 cDNA 분자에 상보성인 영역을 포함하는 정방향/역방향 프라이머일 수 있다. 복수의 정방향/역방향 프라이머의 제1 및/또는 제2 프라이머는 바코드화된 cDNA 분자에 상보성인 영역을 포함하는 정방향/역방향 프라이머일 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 하나 이상의 정방향/역방향 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 정방향/역방향 프라이머에서 정방향/역방향 프라이머의 각각은 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역 및 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 하나 이상의 다른 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 정방향/역방향 프라이머 및 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 정방향/역방향 프라이머, cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 정방향/역방향 프라이머, 및 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 V-세그먼트에 대해 제3 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제3 정방향/역방향 프라이머 등을 포함한다. 복수의 정방향/역방향 프라이머의 프라이머들은 샘플에 존재하는 면역 B-세포 또는 T-세포와 같은 세포에 의해 발현된 모든 V-세그먼트의 모든 가능한 업스트림 또는 다운스트림 영역에 대해 어닐링하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 하나 이상의 정방향/역방향 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 정방향/역방향 프라이머에서 정방향/역방향 프라이머의 각각은 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역 및 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 하나 이상의 다른 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 정방향/역방향 프라이머 및 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 정방향/역방향 프라이머, cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 정방향/역방향 프라이머, 및 cDNA 또는 바코드화된 cDNA의 C-세그먼트에 대해 제3 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제3 정방향/역방향 프라이머 등을 포함한다. 복수의 정방향/역방향 프라이머의 프라이머들은 샘플에 존재하는 면역 B-세포 또는 T-세포와 같은 세포에 의해 발현된 모든 C-세그먼트의 모든 가능한 업스트림 또는 다운스트림 영역에 대해 어닐링하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 하나 이상의 정방향/역방향 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 정방향/역방향 프라이머에서 정방향/역방향 프라이머의 각각은 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역 및 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 하나 이상의 다른 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 정방향/역방향 프라이머 및 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 정방향/역방향 프라이머, 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 정방향/역방향 프라이머, 및 바코드화된 cDNA의 분자 바코드에 대해 제3 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제3 정방향/역방향 프라이머 등을 포함한다. 복수의 정방향/역방향 프라이머의 프라이머들은 샘플에 존재하는 면역 B-세포 또는 T-세포와 같은 세포에 의해 발현된 모든 분자 바코드의 모든 가능한 업스트림 또는 다운스트림 영역에 대해 어닐링하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 하나 이상의 정방향/역방향 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 정방향/역방향 프라이머에서 정방향/역방향 프라이머의 각각은 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역 및 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 하나 이상의 다른 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 정방향/역방향 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 정방향/역방향 프라이머는 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 포워드/리버스 프라이머 및 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 포워드/리버스 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 포워드/리버스 프라이머, 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 포워드/리버스 프라이머, 및 바코드화된 cDNA의 용기 바코드에 대해 제3 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제3 포워드/리버스 프라이머 등을 포함한다. 복수의 포워드/리버스 프라이머의 프라이머들은 샘플에 존재하는 면역 B-세포 또는 T-세포와 같은 세포에 의해 발현된 모든 용기 바코드의 모든 가능한 업스트림 또는 다운스트림 영역에 대해 어닐링하는데 사용될 수 있다.
복수의 포워드/리버스 프라이머에서 포워드/리버스 프라이머는 RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역을 더 포함한다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 RNA에 상보성인 포워드/리버스 프라이머의 영역에 대해 5'이다 (즉, V 세그먼트의 업스트림 또는 다운스트림 영역). 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 RNA에 상보성인 포워드/리버스 프라이머의 영역에 대해 3'이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 5' 오버행 영역이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 증폭 및/또는 제2 시퀀싱 반응을 위한 프라이밍 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 증폭 및/또는 제3 시퀀싱 반응을 위한 프라이밍 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보성이 아닌 영역은 제2 및 제3 시퀀싱 반응을 위한 프라이밍 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 및 제3 시퀀싱 반응을 위한 프라이밍 부위의 서열은 동일하다. 본원에서 기술된 하나 이상의 포워드/리버스 프라이머 및 리버스 프라이머를 사용하여 cDNA 분자가 본 분야에 공지된 적합한 시약을 사용해서 증폭된다. 일부 구체예에서, 영역은 mRNA의 불변 영역 또는 폴리-A 테일과 같은, RNA의 영역에 상보성이다.
일부 구체예에서, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 하나 이상의 포워드/리버스 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 포워드/리버스 프라이머에서 포워드/리버스 프라이머의 각각은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 하나 이상의 포워드/리버스 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 포워드/리버스 프라이머에서 포워드/리버스 프라이머의 각각은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 AID에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 하나 이상의 포워드/리버스 프라이머를 포함하며, 여기서 복수의 포워드/리버스 프라이머에서 포워드/리버스 프라이머의 각각은 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 AMB에 대해 하나 이상의 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함한다. 예를 들어, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 포워드/리버스 프라이머, 및 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 하나 이상의 다른 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 포워드/리버스 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 포워드/리버스 프라이머 및 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 포워드/리버스 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 포워드/리버스 프라이머는 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 제1 및/또는 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 포워드/리버스 프라이머, 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 제2 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제2 포워드/리버스 프라이머, 및 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 바코드화된 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드, AID, 및/또는 AMB에 대해 제3 업스트림 또는 다운스트림 영역에 상보성인 영역을 포함하는 제3 포워드/리버스 프라이머 등을 포함한다.
증폭
용기 바코드가 표적 폴리뉴클레오타이드에 추가된 후, 표적 폴리뉴클레오타이드가 증폭될 수 있다. 예를 들어, 용기 바코드가 친화성-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드에 추가된 후, 올리고뉴클레오타이드가 증폭될 수 있다. 예를 들어, 용기 바코드가 세포 폴리뉴클레오타이드에 추가된 후, 용기 바코드화된 세포 폴리뉴클레오타이드가 증폭될 수 있다.
증폭 반응은 하나 이상의 추가제를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 하나 이상의 추가제는 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 글리세롤, 베타인 (일)수화물 (N,N,N-트라이메틸글리세린 = [카르복시-메틸]트라이메틸암모늄), 트레할로오스, 7-데아자-2'-데옥시트라이포스페이트 (dC7GTP 또는 7-데아자-2'-dGTP), BSA (소 혈청 알부민), 폼아미드 (메탄아미드), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 다른 테트라알킬암모늄 유도체 (예를 들어, 테트라에틸암모늄 클로라이드 (TEA-Cl) 및 테트라프로필암모늄 클로라이드 (TPrA-Cl), 비-이온성 세제 (예를 들어, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), 또는 PREXCEL-Q이다. 어떤 경우에는, 증폭 반응은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 추가제를 포함한다. 다른 경우, 증폭 반응은 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 추가제를 포함한다.
반응 부피 (예를 들어, 액적)에 포함된 샘플에 대해 열순환 반응이 수행될 수 있다. 액적은 다분산성 또는 바람직하게 단분산성일 수 있고, 교반, 음파처리 또는 미소유체방식으로 T-채널 접합을 통해 또는 당업자에 의해 다른 수단을 통해 생성될 수 있다. 밀도는 20,000 액적/40ul (1nL 액적), 200,000 액적/40ul (100pL 액적)을 초과할 수 있다. 액적은 열순환 동안 온전히 유지될 수 있다. 액적은 약 10,000 액적/μL, 100,000 액적/μL, 200,000 액적/μL, 300,000 액적/μL, 400,000 액적/μL, 500,000 액적/μL, 600,000 액적/μL, 700,000 액적/μL, 800,000 액적/μL, 900,000 액적/μL 또는 1,000,000 액적/μL를 초과하는 밀도에서 열순환 동안 온전히 유지될 수 있다. 다른 경우, 둘 이상의 액적은 열순환 동안 응집하지 않는다. 다른 경우, 100개 초과 또는 1,000개 초과 액적이 열순환 동안 응집하지 않는다.
제한되는 것은 아니지만, 대장균 DNA 폴리머라제, 대장균 DNA 폴리머라제 1의 Klenow 단편, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, 박테리오파지 29, REDTaq™, Genomic DNA 폴리머라제, 또는 시쿼나아제를 포함하는 프라이머 확장을 촉매화하는 임의의 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 어떤 경우에는, 열안정한 DNA 폴리머라제가 사용된다. 고온 시동 PCR이 또한 수행될 수 있으며, 이 경우 폴리머라제의 추가 전 2분 동안 반응물이 95℃로 가열되거나 또는 사이클 1의 제1 가열 단계까지 폴리머라제가 비활성 병태로 유지될 수 있다. 고온 시동 PCR은 비특이적 증폭을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. DNA의 증폭을 위해 임의의 수의 PCR 사이클이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 사이클, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 사이클 초과, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 사이클 미만일 수 있다. 증폭 사이클의 수는 약 1-45, 10-45, 20-45, 30-45, 35-45, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 10-15, 20-35, 25-35, 30-35, 또는 35-40일 수 있다.
표적 핵산의 증폭은 본 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 표적 핵산은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 등온 DNA 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 사용될 수 있는 PCR 기술의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, 정량적 PCR, 정량 형광 PCR (QF-PCR), 복합 형광 PCR (MF-PCR), 실시간 PCR (역전사-PCR), 단일 세포 PCR, 제한 단편 길이 다형성 PCR (PCR-RFLP), PCR-RFLP/역전사-PCR-RFLP, 고온 시동 PCR, 네스티드 PCR, 인시튜 폴로니 PCR, 인시튜 롤링 서클 증폭 (RCA), 디지털 PCR (dPCR), 액적 디지털 PCR (ddPCR), 브릿지 PCR, 피코리터 PCR 및 에멀젼 PCR을 포함한다. 다른 적합한 증폭 방법은 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 전사 증폭, 분자 반전 프로브 (MIP) PCR, 자기-지속 서열 복제, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 선택적 증폭, 공통 서열 프라임드 폴리머라제 연쇄 반응 (CP-PCR), 임의 프라임드 폴리머라제 연쇄 반응 (AP-PCR), 축퇴성 폴리뉴클레오타이드-프라임드 PCR (DOP-PCR) 및 핵산 기반 서열 증폭 (NABSA)을 포함한다. 여기 사용될 수 있는 다른 증폭 반응들은 미국 특허 번호 5,242,794; 5,494,810; 4,988,617; 및 6,582,938에 설명된 것들을 포함하며, Q 베타 레플리카아제 매개 RNA 증폭도 포함한다. 증폭은 등온 증폭, 예를 들어, 등온 선형 증폭일 수 있다.
일부 구체예에서, 증폭은 고체 지지체 상에서 일어나지 않는다. 일부 구체예에서, 증폭은 액적에서 고체 지지체 상에서 일어나지 않는다. 일부 구체예에서, 증폭은 증폭이 액적에서 이루어지지 않을 때 고체 지지체 상에서 일어나지 않는다.
시퀀싱
본원에서 기술된 방법 또는 방법 단계들 중 하나 이상을 수행한 후, 생성된 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 시퀀싱될 수 있다.
시퀀싱은 본 분야에 공지된 임의의 시퀀싱 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 시퀀싱은 고 처리량으로 수행될 수 있다. 적합한 차세대 시퀀싱 기술은 454 Life Sciences 플랫폼 (Roche, Branford, CT) (Margulies et al., Nature, 437, 376-380 (2005)); Illumina's Genome Analyzer, GoldenGate Methylation Assay, 또는 Infinium Methylation Assay, 즉 Infinium Human Methylation 27K BeadArray또는 VeraCode GoldenGate 메틸화 분석 (Illumina, San Diego, CA; Bibkova et al., Genome Res. 16, 383-393 (2006); 및 미국 특허 번호 6,306,597, 7,598,035, 7,232,656), 또는 Ligation, SOLid System 등에 의한 DNA 시퀀싱 (Applied Biosystems/Life Technologies; 미국 특허 번호 6,797,470, 7,083,917, 7,166,434, 7,320,865, 7,332,285, 7,364,858 및 7,429,453); 또는 Helicos True Single Molecule DNA 시퀀싱 기술 (Harris et al., Science, 320, 106-109 (2008); 및 미국 특허 번호 7,037,687, 7,645,596, 7,169,560 및 7,769,400), Pacific Biosciences의 단일 분자, 실시간 (SMRTTm) 기술, 및 시퀀싱 (Soni et al., Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007))를 포함한다. 이들 시스템은 샘플로부터 분리된 많은 폴리뉴클레오타이드의 복합적인 병렬 시퀀싱을 허용한다 (Dear, Brief Funct. Genomic Proteomic, 1 (4), 397-416 (2003) 및 McCaughan et al., J. Pathol., 220, 297-306 (2010)). 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 염료-변형된 프로브의 결찰에 의한 시퀀싱, 피로시퀀싱, 또는 단일-분자 시퀀싱에 의해 시퀀싱된다. 폴리뉴클레오타이드의 서열의 결정은 Helioscope™ 단일 분자 시퀀싱, Nanopore DNA 시퀀싱, Lynx Therapeutics' Massively Parallel Signature 시퀀싱 (MPSS), 454 피로시퀀싱, 단일 분자 실시간 (RNAP) 시퀀싱, Illumina (Solexa) 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, Ion Torrent™, 이온 반도체 시퀀싱, 단일 분자 SMRT™ 시퀀싱, Polony 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱, 및 VisiGen Biotechnologies 접근법과 같은 시퀀싱 방법에 의해 수행될 수 있다. 대안으로서, 폴리뉴클레오타이드의 서열의 결정은, 제한되는 것은 아니지만, Genome Analyzer IIx, HiSeq 및 MiSeq (Illumina), 단일 분자 실시간 (SMRT™) 기술, 예컨대 PacBio RS 시스템 (Pacific Biosciences (California)) 및 Solexa Sequencer, True Single Molecule Sequencing (tSMS™) 기술, 예컨대 HeliScope™ Sequencer (Helicos Inc. (Cambridge, MA))를 포함하는 시퀀싱 플랫폼을 사용할 수 있다. 시퀀싱은 MiSeq 시퀀싱을 포함할 수 있다. 시퀀싱은 HiSeq 시퀀싱을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드의 서열의 결정은 양 말단 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 고-처리량 시퀀싱, 샷건 시퀀싱, 염료-터미네이터 시퀀싱, 다중-프라이머 DNA 시퀀싱, 프라이머 워킹, Sanger 다이데옥시 시퀀싱, Maxim-Gilbert 시퀀싱, 피로시퀀싱, 참 단일 분자 시퀀싱, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함한다. 대안으로서, 폴리뉴클레오타이드의 서열은 전자현미경 또는 화학-감응성 전계효과 트랜지스터 (chemFET) 어레이에 의해 결정될 수 있다.
방법은 라이브러리에 존재하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 라이브러리에 존재하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열 판독 부위, 앰플리콘 서열, 또는 앰플리콘 세트 서열을 서로에 대해 정렬하는 단계를 더 포함할 수 있다.
정렬은 서열 판독 부위와 같은 테스트 서열을 하나 이상의 다른 테스트 서열, 기준 서열, 또는 이들의 조합물과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 정렬은 복수의 서열 또는 정렬된 서열로부터 공통 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 정렬은 동일한 분자 바코드 또는 용기 바코드를 각각 가진 복수의 서열로부터 공통 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬되는 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다. 둘 이상의 서열의 실제 비교는, 예를 들어, 수학적 알고리즘을 사용하는 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 비제한적 예는 Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90-5873-5877 (1993)에 설명된다. 이러한 알고리즘은 Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)에 설명된 대로 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 포함된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, NBLAST)의 임의의 관련된 변수들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교를 위한 변수는 스코어= 100, 워드 랭스=12로 설정될 수 있거나, 또는 바뀔 수 있다 (예를 들어, W=5 또는 W=20). 다른 예들은 Myers 및 Miller의 알고리즘, CABIOS (1989), ADVANCE, ADAM, BLAT, 및 FASTA를 포함한다. 일부 구체예에서, 2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 예를 들어, GCG 소프트웨어 패키지 (Accelrys, Cambridge, UK)의 GAP 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다.
시퀀싱은 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시퀀싱은 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 시퀀싱은 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 염기쌍을 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
시퀀싱은 1회당 적어도 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 시퀀싱 판독 부위를 포함할 수 있다. 여기 사용된 시퀀싱 판독 부위는 시퀀싱 기술에 의해 생성된 데이터의 시퀀스 또는 스트림으로부터 결정된 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 시퀀싱은 1회당 적어도 약 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000개, 또는 그 이상의 시퀀싱 판독 부위를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 시퀀싱은 1회당 약 1,000,000,000개를 초과하는 시퀀싱 판독 부위, 약 1,000,000,000개 미만의 시퀀싱 판독 부위, 또는 약 1,000,000,000개의 시퀀싱 판독 부위를 포함할 수 있다. 시퀀싱은 1회당 약 2,000,000,000개를 초과하는 시퀀싱 판독 부위, 약 2,000,000,000개 미만의 시퀀싱 판독 부위, 또는 약 2,000,000,000개의 시퀀싱 판독 부위를 포함할 수 있다.
효소
본원에서 기술된 방법 및 키트는 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 효소의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, 리가아제, 역전사효소, 폴리머라제, 및 제한 뉴클레아제를 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드에 어댑터의 부착은 하나 이상의 리가아제의 사용을 포함한다. 리가아제의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, DNA 리가아제, 예컨대 DNA 리가아제 I, DNA 리가아제 III, DNA 리가아제 IV, 및 T4 DNA 리가아제, 및 RNA 리가아제, 예컨대 T4 RNA 리가아제 I 및 T4 RNA 리가아제 II를 포함한다.
본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 역전사효소의 사용을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 역전사효소는 HIV-1 역전사효소, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소, 및 텔로머라아제 역전사효소이다. 일부 구체예에서, 역전사효소는 M-MLV 역전사효소이다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 프로테아제의 사용을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 폴리머라제의 사용을 포함한다. 폴리머라제의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제를 포함한다. 일부 구체예에서, DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 I, DNA 폴리머라제 II, DNA 폴리머라제 III 홀로엔자임, 및 DNA 폴리머라제 IV이다. 상업적으로 이용가능한 DNA 폴리머라제는, 제한되는 것은 아니지만, Bst 2.0 DNA Polymerase, Bst 2.0 WarmStart™ DNA Polymerase, Bst DNA Polymerase, Sulfolobus DNA Polymerase IV, Taq DNA Polymerase, 9°N™m DNA Polymerase, Deep VentR™ (exo-) DNA Polymerase, Deep VentR™ DNA Polymerase, HemoKlenTaq™, LongAmp® Taq DNA Polymerase, OneTaq® DNA Polymerase, Phusion® DNA Polymerase, Q5™ High-Fidelity DNA Polymerase, Therminator™ γ DNA Polymerase, Therminator™ DNA Polymerase, Therminator™ II DNA Polymerase, Therminator™ III DNA Polymerase, VentR® DNA Polymerase, VentR® (exo-) DNA Polymerase, Bsu DNA Polymerase, phi29 DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Terminal Transferase, Titanium® Taq Polymerase, KAPA Taq DNA Polymerase 및 KAPA Taq Hot Start DNA Polymerase를 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리머라제는 RNA 폴리머라제, 예컨대 RNA 폴리머라제 I, RNA 폴리머라제 II, RNA 폴리머라제 III, E. coli Poly (A) 폴리머라제, phi6 RNA 폴리머라제 (RdRP), Poly(U) 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 및 T7 RNA 폴리머라제이다.
추가 시약
본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 시약의 사용을 포함할 수 있다. 시약의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, PCR 시약, 결찰 시약, 역전사 시약, 효소 시약, 혼성화 시약, 샘플 제조 시약, 친화성 캡쳐 시약, 비드와 같은 고체 지지체, 및 핵산 정제 및/또는 분리를 위한 시약을 포함한다.
다른 구체예에서, 본원에서 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 지지체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법, 키트, 및 조성물은 지지체를 포함하지 않는다. 전형적으로, 고체 지지체는 하나 이상의 강성 또는 반-강성 표면을 포함하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 지지체는 비-고체 지지체이다. 지지체 또는 기질은 막, 종이, 플라스틱, 코팅된 표면, 평평한 표면, 유리, 슬라이드, 칩, 또는 이것들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지지체의 하나 이상의 표면은 실질적으로 평평하지만, 일부 구체예에서는, 예를 들어, 웰, 융기된 영역, 핀, 에칭된 트렌치 등의, 상이한 화합물에 대한 물리적으로 분리된 합성 영역이 있는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드, 수지, 겔, 마이크로스피어, 또는 다른 기하적 구성형태를 포함한다. 대안으로서, 고체 지지체는 실리카 칩, 마이크로입자, 나노입자, 플레이트, 및 어레이를 포함할 수 있다. 고체 지지체는 마이크로웰에서 자기-조립되는 비드의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 Illumina's BeadArray Technology를 포함한다. 대안으로서, 고체 지지체는 Abbott Molecular's Bead Array technology, 및 Applied Microarray's FlexiPlex™ 시스템을 포함한다. 다른 예에서, 고체 지지체는 플레이트이다. 플레이트의 예는, 제한되는 것은 아니지만, MSD 멀티-어레이 플레이트, MSD Multi-Spot® 플레이트, 마이크로플레이트, ProteOn 마이크로플레이트, AlphaPlate, DELFIA 플레이트, IsoPlate, 및 LumaPlate를 포함한다. 일부 구체예에서, 지지체는 복수의 비드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지지체는 어레이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지지체는 유리 슬라이드를 포함할 수 있다. 폴리머에 적용가능한 방법, 기질, 및 기술 (미국 특허 번호 5,744,305, 5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,936,324, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,269,846 및 6,428,752; 미국 특허 공개 번호 20090149340, 20080038559, 20050074787; 및 PCT 공개 번호 WO 00/58516, WO 99/36760, 및 WO 01/58593). 지지체에 폴리뉴클레오타이드의 부착은 아민-티올 가교, 말레이미드 가교, N-하이드록시석신이미드 또는 N-하이드록시설포석신이미드, Zenon 또는 SiteClick을 포함할 수 있다. 지지체에 라벨링된 핵산의 부착은 복수의 폴리뉴클레오타이드에 비오틴을 부착하고 하나 이상의 비드를 스트렙타비딘으로 코팅하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드이다. 비드의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, 스트렙타비딘 비드, 아가로오스 비드, 자기 비드, Dynabeads®, MACS® 마이크로비드, 항체 컨쥬게이트 비드 (예를 들어, 항-면역글로불린 마이크로비드), 단백질 A 컨쥬게이트 비드, 단백질 G 컨쥬게이트 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트 비드, 단백질 L 컨쥬게이트 비드, 폴리뉴클레오타이드 dT 컨쥬게이트 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 및 BcMag™ 카르복시-Terminated Magnetic Beads를 포함한다. 비드의 직경은 약 5μm, 10μm, 20μm, 25μm, 30μm, 35μm, 40μm, 45μm 또는 50μm일 수 있다. 고체 지지체는 어레이 또는 마이크로어레이일 수 있다. 고체 지지체는 분리된 영역들을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 어레이, 예를 들어, 어드레서블 어레이일 수 있다.
고체 지지체는 실질적으로 임의의 불용성 또는 고체 물질을 포함할 수 있고, 주로 수불용성 고체 지지체 조성물이 선택된다. 예를 들어, 고체 지지체는 실리카겔, 유리 (예를 들어, 제어된-기공 유리 (CPG)), 나일론, Sephadex®, Sepharose®, 셀룰로오스, 금속 표면 (예를 들어, 스틸, 금, 은, 알루미늄, 규소 및 구리), 자기 물질, 플라스틱 물질 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스터, 이불화폴리비닐리덴 (PVDF)) 등을 포함할 수 있거나, 또는 이것들로 본질적으로 구성될 수 있다. 이 구체예들에 따라서 사용하기 위한 비드의 예들은 비드가 핵산 분자와 상호작용할 수 있도록 하는 친화성 부분을 포함할 수 있다. 고체상 (예를 들어, 비드)은 결합 쌍의 일원을 포함할 수 있다 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체). 예를 들어, 비드는 스트렙타비딘-코팅된 비드일 수 있고, 비드 상에 고정되는 핵산 분자는 비오틴 부분을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 각각의 폴리뉴클레오타이드 분자는 폴리뉴클레오타이드를 더 안정화하기 위해 비오틴과 같은 친화성 부분을 2개를 포함할 수 있다. 비드는 핵산을 고정화하는데 사용하기 위한, 또는 다운스트림 스크리닝 또는 선택 과정에서 사용될 수 있는 추가의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비드는 친화성 부분, 형광 라벨 또는 형광 퀀처를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 비드는 자성을 가질 수 있다. 일부 예에서, 고체 지지체는 비드이다. 비드의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, 스트렙타비딘 비드, 아가로오스 비드, 자기 비드, Dynabeads®, MACS® 마이크로비드, 항체 컨쥬게이트 비드 (예를 들어, 항-면역글로불린 마이크로비드), 단백질 A 컨쥬게이트 비드, 단백질 G 컨쥬게이트 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트 비드, 단백질 L 컨쥬게이트 비드, 폴리뉴클레오타이드 dT 컨쥬게이트 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 및 BcMag™ Carboxy-Terminated Magnetic Beads를 포함한다. 비드 또는 입자는 팽윤성 (예를 들어, Wang 수지와 같은 중합성 비드) 또는 비-팽윤성 (예를 들어, CPG)일 수 있다. 일부 구체예에서, 고체상은 실질적으로 친수성이다. 일부 구체예에서, 고체상 (예를 들어, 비드)은 실질적으로 소수성이다. 일부 구체예에서, 고체상은 결합 쌍의 일원을 포함하고 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체), 실질적으로 소수성 또는 실질적으로 친수성이다. 일부 구체예에서, 고체상은 결합 쌍의 일원을 포함하고 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체), 고체 지지체 1mg당 약 1350 피코몰을 초과하는 자유 캡쳐제 (예를 들어, 자유 비오틴)의 결합 용량을 가진다. 일부 구체예에서, 결합 쌍의 일원을 포함하는 고체상의 결합 용량은 고체 지지체 1mg당 자유 캡쳐제가 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1800, 2000 피코몰을 초과하는 양이다. 본 발명에서 적합한 비드의 다른 예들은 금 콜로이드 또는 폴리스티렌 비드 또는 실리카 비드와 같은 비드이다. 실질적으로 모든 비드 반경이 사용될 수 있다. 비드의 예들은 150 나노미터 내지 10 마이크론의 범위의 반경을 가진 비드를 포함할 수 있다. 다른 크기들도 또한 사용될 수 있다.
본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 버퍼의 사용을 포함할 수 있다. 버퍼의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, 세척 버퍼, 결찰 버퍼, 혼성화 버퍼, 증폭 버퍼, 및 역전사 버퍼를 포함한다. 일부 구체예에서, 혼성화 버퍼는 상업적으로 이용가능한 버퍼, 예컨대 TMAC Hyb 용액, SSPE 혼성화 용액, 및 ECONO™ 혼성화 버퍼이다. 본원에서 개시된 버퍼는 하나 이상의 세제를 포함할 수 있다.
본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 캐리어의 사용을 포함할 수 있다. 캐리어는 본원에서 개시된 하나 이상의 반응의 효능을 증진시키거나 개선할 수 있다 (예를 들어, 결찰 반응, 역전사, 증폭, 혼성화). 캐리어는 분자 또는 그것의 임의의 생성물의 비-특이적 손실을 감소시키거나 방지할 수 있다 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 앰플리콘). 예를 들어, 캐리어는 표면에의 흡수를 통한 폴리뉴클레오타이드의 비-특이적 손실을 감소시킬 수 있다. 캐리어는 표면 또는 기질에 대한 폴리뉴클레오타이드의 친화성을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 용기, 에펜드로프 튜브, 피펫 팁). 대안으로서, 캐리어는 표면 또는 기질에 대한 폴리뉴클레오타이드의 친화성을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 비드, 어레이, 유리, 슬라이드, 칩). 캐리어는 폴리뉴클레오타이드를 변성으로부터 보호할 수 있다. 예를 들어, 캐리어는 RNA 분자를 리보뉴클레아제로부터 보호할 수 있다. 대안으로서, 캐리어는 DNA 분자를 DNase로부터 보호할 수 있다. 캐리어의 예들은, 제한되는 것은 아니지만, DNA 및/또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리펩타이드를 포함한다. DNA 캐리어의 예들은 플라스미드, 벡터, 폴리아데닐화 DNA, 및 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. RNA 캐리어의 예들은 폴리아데닐화 RNA, 파지 RNA, 파지 MS2 RNA, 대장균 RNA, 효모 RNA, 효모 tRNA, 포유류 RNA, 포유류 tRNA, 짧은 폴리아데닐화 합성 리보뉴클레오타이드 및 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. RNA 캐리어는 폴리아데닐화 RNA일 수 있다. 대안으로서, RNA 캐리어는 비-폴리아데닐화 RNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 캐리어는 박테리아, 효모, 또는 바이러스로부터 유래된다. 예를 들어, 캐리어는 박테리아, 효모 또는 바이러스로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 캐리어는 바실루스섭틸리스 (Bacillus subtilis)로부터 유래한 단백질이다. 다른 예에서, 캐리어는 에스체리키아 콜리 (Escherichia coli)로부터 유래한 폴리뉴클레오타이드이다. 대안으로서, 캐리어는 포유류 (예를 들어, 인간, 마우스, 염소, 래트, 소, 양, 돼지, 개 또는 토끼), 조류, 양서류 또는 파충류로부터 유래한 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드이다.
본원에서 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 대조군 제제의 사용을 포함할 수 있다. 대조군 제제는 대조군 폴리뉴클레오타이드, 비활성 효소, 비-특이적 경쟁자를 포함할 수 있다. 대안으로서, 대조군 제제는 선명한 혼성화, 선명한 프로브 대조군, 핵산 주형, 스파이크-인 대조군, PCR 증폭 대조군을 포함한다. PCR 증폭 대조군은 양성 대조군일 수 있다. 다른 예에서, PCR 증폭 대조군은 음성 대조군이다. 핵산 주형 대조군은 공지된 농도를 가질 수 있다. 대조군 제제는 하나 이상의 라벨을 포함할 수 있다.
스파이크-인 대조군은 반응 또는 샘플에 추가되는 주형일 수 있다. 예를 들어, 스파이크-인 주형은 증폭 반응에 추가될 수 있다. 스파이크-인 주형은 제1 증폭 사이클 후 임의의 시기에 증폭 반응에 추가될 수 있다. 일부 구체예에서, 스파이크-인 주형은 사이클 수 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50회 후에 증폭 반응에 추가된다. 스파이크-인 주형은 마지막 증폭 사이클 전 임의의 시기에 증폭 반응에 추가될 수 있다. 스파이크-인 주형은 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 핵산 염기쌍을 포함할 수 있다. 스파이크-인 주형은 DNA, RNA, 또는 이것들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 스파이크-인 주형은 하나 이상의 라벨을 포함할 수 있다.
본원에서 개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있는, 이들과 함께 사용될 수 있는, 이들의 제조에 사용될 수 있는, 또는 이들의 생성물인 분자, 물질, 조성물, 및 성분이 본원에서 개시된다. 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 그룹 등이 개시되었을 때 이들 분자 및 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 종합적 조합 및 순열이 명백히 개시될 수 없다 해도 각각은 여기 구체적으로 고려되며 설명된다는 것이 이해된다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 핵산이 개시되고 논의되고 이 뉴클레오타이드 또는 핵산을 포함하는 다수의 분자에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형이 개시된 경우, 이 뉴클레오타이드 또는 핵산의 각각의 조합 및 순열과 모든 조합 및 순열 그리고 가능한 변형이 반대의 설명이 없다면 구체적으로 고려된다. 이 개념은 제한되는 것은 아니지만, 개시된 방법 및 조성물을 사용하고 제조하는 방법의 단계를 포함하여 이 출원의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 여러 추가의 단계가 있는 경우, 이들 추가의 단계의 각각은 개시된 방법의 임의의 특정한 구체예 또는 구체예들의 조합에서 수행될 수 있다는 것과 각각의 이러한 조합은 구체적으로 고려되며 개시된 것으로 간주되어야 한다는 것이 이해된다.
본원에서 기술된 일부 구체예가 여기 제시되고 설명되었지만, 이러한 구체예들은 단지 예시로서만 제공된다. 다양한 변형, 변화 및 치환이 여기 제공된 개시로부터 벗어나지 않고 당업자에 의해 일어날 것이다. 본원에서 기술된 구체예에 대한 다양한 대안들이 본원에서 기술된 방법을 실시하는데 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
달리 설명되지 않는다면 여기 사용된 모든 기술과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌들은 여기 사용될 수 있는 방법 및 조성물의 구체예들을 포함한다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-9119102); Benjamin Lewin, Genes IX, published by J하나의s & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Mol. Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers (ed.), Mol. Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
본 개시의 표준 과정은, 예를 들어, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); 또는 Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl (eds.), Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)). Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), 및 Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)에 설명된다.
실시예
실시예 1 - T-세포의 집단에서 단일 T-림프구의 면역형 결정
인간 T 림프구에서 CD4 및 CD8 mRNA와 표면 단백질 발현을 분석함으로써 본원에서 기술된 면역표현형 결정 방법을 검증했다 (도 1). 정식으로 성숙한 T-세포는 CD4 서브타입 또는 CD8 서브타입이 될 것이라고 예상된다. CD4 서브타입은 CD4 mRNA와 CD4 단백질을 함께 발현하고 CD8 mRNA나 CD8 단백질 중 어느 하나를 발현한다. CD8 서브타입은 CD8 mRNA와 CD8 단백질을 함께 발현하고 CD4 mRNA나 CD4 단백질 중 어느 하나를 발현한다.
30,000개의 T-세포를 CD4 Antigen ID 서열을 포함하는 CD4-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 및 CD8 Antigen ID 서열을 포함하는 CD8-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 둘 다와 함께 인큐베이션했다. 또한, 단일-세포 에멀젼 실험에서 T-세포의 CD4, CD8 및 TCR mRNA 함량을 분석했다. T-세포 수용체 알파, T-세포 수용체 베타, CD4 및 CD8 mRNA를 cDNA로 역전사하고, 폴리머라제 연쇄 반응을 통해서 액적-특이적 바코드 서열을 cDNA 및 항체-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 융합했다. 에멀젼으로부터 이 DNA를 추출하고 차세대 시퀀싱로 분석했다.
거의 모든 액적-바코드 (단일세포와 관련된)가 CD4-특이적 Antigen ID 또는 CD8-특이적 Antigen ID와 관련되었다. mRNA와 표면 단백질-기반 배치 사이에 실질적인 일치가 발견되었다 (도 3).
실시예 2
면역 레퍼토리의 시퀀싱은 기초 면역학, 자가면역, 감염성 질환 및 종양학에서 광범위하게 적용된다. 많은 연구들이 순환 혈액에서 BCR 및 TCR 다양성을 조사했지만, 암의 성장이나 퇴행과 매우 관련된 기능을 가진 TIL의 면역 수용체에 대한 관심은 점점 증가하고 있으며, 이것은 아직도 가변적이며 거의 특성화되지 않았다. TIL을 더 잘 이해하기 위한 중요한 단계는 이들의 BCR 및 TCR의 회수 및 기능적 특성화일 것인데, 이것은 새로운 종양-관련된 항원의 확인을 허용할 수 있기 때문이다. 종양 항원은 결정적으로 암 백신을 개발하고 체크포인트 억제제의 역할을 이해하고 고상 종양에서 키메라 항원 수용체 T-세포 (CAR-T) 요법을 발전시키기 위해 필요하다. 그러나, 면역 시퀀싱에서 수십년간의 기술적 진보에도 불구하고 어떤 연구에서도 관찰된 레퍼토리를 제한하고 편향시키는 단계인 시험관내 배양이나 세포 정렬 없이 종양과 같은 이종성 샘플로부터 전장의 자생적으로 쌍을 이룬 BCR (중쇄 및 경쇄)과 TCR (알파 및 베타 사슬)을 회수하지 못했었다. 일차 미배양 면역세포는 시험관내 자극된 세포보다 수용체 RNA를 10배 더 적게 포함할 수 있기 때문에 기술적으로 특히 더 어렵다. 복잡한 이종성 샘플로부터 자생적으로 쌍을 이룬 BCR 및 TCR의 포괄적인 분석을 허용하기 위해 다수의 단일 세포의 병렬 분리와 DNA 바코드화를 위한 미소유체 에멀젼-기반 방법이 개발되었다. 시간당 최대 백만 개의 세포가 약 65 피코리터의 개개의 에멀젼 액적에서 분리된다. 세포가 용해된 액적 내에서 표적 mRNA가 표적-특이적 프라이머로 역 전사되고, 2-단계 DNA 바코드화 과정에서 분자-특이적 바코드와 액적-특이적 바코드 둘 다가 cDNA에 부착된다. 후속의 회수 및 차세대 시퀀싱 후, 이중 바코드화 전략은 서열 판독 부위의 기원 분자 및 세포로의 클러스터화를 허용한다. 이것은 오류 및 증폭 편향의 광범위한 교정, mRNA 및 세포 수준에서의 클론 카운팅, 중쇄 아이소타입 결정, 및 중요하게는 극도로 높은 처리량으로 BCR 및 TCR의 전장의 자생적으로 쌍을 이룬 V (D)J 서열의 동시 회수를 허용한다.
종양-침윤 림프구 (TIL)는 항암 면역 반응에 중요하지만, 예측 불가능한 과다함, 표현형 및 기능으로 인하여 연구에 어려움이 있다. 세포-정렬, 자극 또는 배양이 필요하지 않은 심도 있는 TIL 특성화를 위한 방법이 본 발명자들에 의해 개발되었다. 에멀젼-기반, 단일-세포 바코드화 방법은 수백만 개의 투입 세포 중에서 림프구로부터 자생적으로 쌍을 이룬 B-세포 및 T-세포 수용체 (BCR 및 TCR) 서열을 캡쳐한다. 이전 접근법과 달리, 회수된 가변 영역은 전장이며, 추가의 mRNA 및 단백질 표적을 동반할 수 있다. 이 방법은 난소 선암종으로부터의 400,000개의 미정렬된 세포를 가공하고, 11,000개를 넘는 TIL로부터 쌍을 이룬 BCR과 TCR을 회수하기 전에, 건강한 인간 혈액으로부터의 3백만 개의 B-세포와 HIV 환자로부터의 350,000개의 B-세포를 가지고 검증되었다. 우리 결과는 임의의 쌍을 이룬 BCR 또는 TCR 레퍼토리의 가장 심도 있는 샘플링을 나타내며, 에멀젼에서 단일-세포로부터 RNA 시퀀싱과 단백질 측정의 동시 수행을 최초로 증명한다.
실시예 3 - 건강한 혈액 샘플로부터 B-세포 V H V L 쌍의 대규모 회수
이 기술은 처음으로 개발되었으며, 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 음성 비드 부화에 의해 분리된 3백만 개의 B-세포를 가지고 페어링 능력 및 처리량이 평가되었다. 에멀젼을 6개의 분리된 분획으로 분할했고, 이들을 시퀀싱 전 병렬 가공하고 재혼합하지 않았다. 에멀젼을 액적 당 0.2개 세포로 로딩했고, 이는 점유된 액적의 약 90%가 단일 세포를 포함한다는 푸아송 예상을 제공하는데, 이것은 에멀젼 액적 관찰과 일치했다 (도 5a). 에멀젼 파괴 및 추가의 라이브러리 가공 단계 후, 양 말단 325 + 300bp 시퀀싱을 Illumina MiSeq로 수행했다. 시퀀싱 데이터를 가공하기 위해, 액적 및 분자 바코드를 함께 사용하여 각각의 원 mRNA 분자로부터 PCR 복제 판독 부위를 수집하고, 적어도 2개의 판독 부위로부터 구축된 mRNA 서열만을 유지한 각각의 mRNA에 대해 공통 서열을 결정했다. 포워드 및 리버스 판독 부위를 봉합하여 5' UTR, 완전한 V (D)J 서열, 및 아이소타입 결정에 충분한 불변 영역을 포함하는 전장 생성물을 생성했다. IMGT High-VQuest 및/또는 IgBLAST로 재정렬된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 해석했다.
결과의 데이터셋은 적어도 하나의 중쇄 (VH) 및 하나의 경쇄 (VL) mRNA와 관련된 324,988개의 액적 바코드를 포함했고, 이때 중쇄 클러스터링 분석에 의해 추정했을 때 229,869개의 상이한 클론 계통이 존재한다. 이 원 데이터셋은 다중-세포뿐만 아니라 단일-세포 액적의 데이터를 포함하므로, 비-일치 중쇄 또는 경쇄 V (D)J 서열에 연결된 액적 바코드를 필터링하여 단일-세포 액적의 데이터를 부화시켰다 (도 5b). 이 단계는 전형적인 면역 레퍼토리의 높은 다양성에 의해 아마도 이루어지는데, 여기서 2개의 무작위 세포로부터의 VH 또는 VL mRNA는 거의 절대 일치하지 않을 것이다. 결과의 부화된 데이터셋은 259,368개의 VHVL 액적 바코드를 포함했고 182,745개의 VH 클론 계통을 포함했으며, 이는 지금까지 쌍을 이룬 면역 레퍼토리의 가장 심도 있는 샘플링을 나타낸다. 클론 관련된 세포는 이들의 VHVL 페어링에 일관성을 나타내야 하므로 클론 확장의 발생을 확인함으로써 페어링의 정확도를 직접 추정했다. 2,604개의 VH 클론이 확인되었고, 이것은 둘 이상의 에멀젼 분획에서 관찰되었으며, 높은 신뢰성으로 클론 확장된 세포가 되었다. 분획 전체에서 이들 VH 클론과 쌍을 이루는 VL 서열의 일관성은 매우 높았고 96.1%의 페어링 정확도를 나타냈는데, 이는 259,368개의 VHVL 쌍을 가진 전체 필터링된 데이터셋에서 높은 신뢰성을 허용한다. 교차-분획 VH 및 VL 서열은 각각의 분획에서 상이한 액적 및 분자 바코드와 변함없이 관련되었으며, 따라서 라이브러리 교차-오염을 나타내지 않았다. 일부 B-세포는 다중 경쇄를 발현한다고 알려져 있으므로 이 분석은 페어링 정확도를 과소평가할 수 있다. 259,368개의 필터링된 VHVL 액적 바코드 또는 "VHVL 쌍" 중 75.0%는 IgM 및/또는 IgD (도 5c)를 포함했으며, 이것은 자생 B-세포의 전형적인 IgM+IgD+ 표현형이 주어질 때 예상된 대로 함께 자주 관찰되었다. IgA (18.3%) 및 IgG (6.6%) VHVL 쌍의 더 낮지만 실질적인 분획이 또한 발견되었다. 모든 VH 아이소타입은 약 3:2의 비율로 Igκ 또는 Igλ와 쌍을 이루었다. 182,745개의 VH 클론 계통에서 클론 확장을 클론과 관련된 액적 바코드의 수 및 에멀젼 분획 전체에서 클론의 관찰을 이용한 2개의 가지 방식으로 평가했다. 다수의 액적 바코드에서 보이는 클론은 클론 확장 또는 다중-바코드 액적을 반영할 수 있는데, 이것은 바코드의 액적으로의 초기 λ=1 푸아송 분산이 주어졌을 때 액적의 약 37%에서 예상된다. 그러나, >8 액적 바코드로 표시되는 임의의 클론이 진짜로 확장될 수 있는 것 같다 (<10-6 단일 액적에서의 푸아송 확률). 클론의 전체 6.0%가 둘 이상의 분획에서 보였지만, 8을 초과하는 액적 바코드에서 보인 클론의 경우 (전체 0.7%), 이들 중 99%가 둘 이상의 분획에서 보였다. 100개의 가장 빈번한 클론 (각각 30-137개의 액적 바코드, 도 5d)은 6개 분획 중 적어도 5개에서 전부 보였다. 따라서, 바코드 카운팅과 독립적 분획 분석의 조합은 커다란 바탕의 비-확장 클론들에서의 거의 확장되지 않은 계통의 검출을 허용한다. 그러나, 주지할 점은 심지어 가장 풍부한 확장된 클론은 천 단위로 1 미만의 세포에 존재하며, 이는 인간 말초 면역 레퍼토리의 다양성을 예시한다는 것이다.
발현 수준의 추정치로서 쌍 내의 각각의 VH 및 VL 사슬의 캡쳐된 mRNA 수가 사용된다 (도 5e). 일반적으로, 액적 바코드당 10개 미만의 중쇄 (평균 2.0) mRNA와 경쇄 (평균 4.0) mRNA가 캡쳐되었으며, 거의 유일하게 IgG와 IgA 발현 세포로부터 세포 당 수십에서 수백 개의 캡쳐된 중쇄 및 경쇄 mRNA를 가진 액적 바코드의 작은 집단이 관찰되었다. 흥미롭게도 쌍 내에서 VH 및 VL 돌연변이의 정도는 각각의 아이소타입 (IgG에 대한 VH 대 VL)과 아이소타입 (IgG 대 IgM) 사이에서 강하게 상관되었다 (도 2f). 또한, IgG와 IgA 쌍은 거의 모든 VH 및 VL 사슬에서 실질적으로 돌연변이가 일어났다. 반면 IgM과 IgD 쌍은 VH 또는 VL 돌연변이를 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과는 IgM 및 IgD에서 IgG 또는 IgA로의 등급 전환, 면역글로불린 발현 증가 및 세포 내의 중쇄 및 경쇄 유전자좌 모두에 영향을 주는 체세포 초돌연변이로 이어지는 B-세포 활성화 메커니즘과 일치한다. 고도로 돌연변이된 VH 사슬이 고도로 돌연변이된 VL 사슬과 쌍을 이루는 경향이 있다는 이 관찰에 더하여, 이 방법은 휴지기 인간 B 세포 레퍼토리로부터 다수의 전장의 자생적으로 쌍을 이룬 BCR을 생성할 수 있다.
실시예 4 - HIV 엘리트 컨트롤러로부터 공지의 저빈도 V H V L 쌍의 회수
쌍 형성 민감도 및 분석의 정확성을 추가로 증명하는 것으로서, 여러 개의 드문 (10,000개 중 <1 세포) 천연 VHVL 쌍이 기존에 있고 대중적으로 알려져 있는 샘플을 처리하였다. 기억 B 세포가 최근 몇년 동안에 HIV 중화 활성을 나타내는 항체에 대해 중쇄가 발굴되어 있는 HIV 엘리트 컨트롤러 환자로부터 말초 B-세포를 얻었다. 350,000개의 B-세포를 처리하여 총 38,620개의 여과된 VHVL 쌍을 얻었다. 흥미롭게도, 개체는 이전의 건강한 샘플 (도 3A) 또는 전형적인 건강한 말초 B-세포 레퍼토리보다 더 큰 비율의 IgG를 나타냈다. 이 데이터세트로부터의 VH 서열을 PGT121을 포함한 이 개체로부터의 모든 보고된 광범위 중화 항체 (bNAb)와 비교하였고 8개의 밀접한 또는 동일한 VH 서열을 찾았는데, 이것은 이 bNAb의 패밀리가 순환하는 B-세포의 0.03% 미만을 대표하는 것을 나타낸다. 결정적으로, 이 중쇄들에 쌍을 이룬 모든 경쇄는 예상했던 유사하게 드문 bNAb 계통의 것이었고, 이것은 앞서 보고된 것과 같이 동일한 Igλ-V3-21/J3 재정렬 및 홀마크 트리플 코돈 삽입 (hallmark triple codon insertion)을 나타낸 것이며, 본 발명자들의 방법의 고정확성 및 민감성을 지지하는 것이다. 나아가, 이 개체로부터의 모든 공지된 및 새롭게 생성된 PGT121-유사 VHVL 쌍의 계통발생 나무에서 (도 3B), VH 및 VL 나무는 거울같은 위치를 차지하는 VH 및 VL 쌍의 서열과 현저하게 유사한 위상을 나타내며, 이것은 공유된 계통발생적 이력을 반영하는 것일 가능성이 있다. 여기서 발견된 변이체 쌍은 이 규칙과 잘 맞는다. 흥미롭게도, 2개의 개의 공개된 항체 PGT122 및 PGT123은 예외로 나타난다; 이 2개의 쌍에 대한 지지는 발견되지 않지만, 대신 원래 보고서에서 확인되지 않은 쌍 형성을 나타낸 PGT122VH:PGT123VL-유사 및 PGT123VH:PGT122VL-유사 쌍이 발견되었다. 8개의 신규한 PGT-유사 VHVL 쌍의 완전한 영역을 암호화하는 DNA를 합성하였고, 항체를 정체 IgG로서 발현시키고 그것들이 HIV의 다중 위스트레인을 중화시키는 능력을 테스트하였다 (도 6C). 항체는 잘 발현되었고 모두 바이러스에 대해 강한 중화 활성을 나타냈는데, 이것은 관련된 생물학적 샘플로부터 천연적으로 쌍을 이룬 기능성 항체 변이체을 신속하게 생성하는 데 본 발명자들의 접근법이 활용될 수 있음을 증명한다.
실시예 5 - 종양 침윤 림프구로부터 B-세포 및 T-세포 수용체 쌍
쌍을 이룬 수용체의 고 처리량 회수를 위한 에멀젼 바코드화를 검증한 후, 면역 수용체를 종양으로부터 직접 회수했다. 프로테아제-해리된 절제된 난소 선암종 샘플을 취하여 400,000개의 미정렬 세포를 에멀젼에 집어넣었다. 샘플의 분리된 알리쿼트의 CD3/CD19 염색은 이 물질 중 B 세포 (~5%) 및 T 세포 (~20%)에 침윤한 실질적인 수를 제시했다. 에멀젼 중의 단일 세포 분산은 덩어리가 보인다는 일부 제한이 있었지만 정제된 세포와 유사했고, 샘플의 세포 유형 이종성에 의해 예상된 대로 액적 내에서 세포 크기 및 모양에 광범한 변동이 있었다 (도 7a).
T 세포 수용체 알파 및 베타 사슬의 불변 영역을 표적화하는 프라이머가 이전에 사용된 BCR 프라이머와 함께 사용되었고, 시퀀싱 및 엄격한 필터링 후에 BCR 또는 TCR 생성물제품과 연결된 수천 개의 액적 바코드를 회수했다. 단일 세포 정확도를 평가하기 위해 액적 바코드 내의 4개의 표적 유전자좌 (VH, VL, Vα, Vβ)의 모든 가능한 조합을 카운팅했다 (도 7b). 둘 이상의 표적 사슬을 가진 액적 바코드의 대부분 (97.9%)은 생물학적으로 기대되는 BCR VH+VL 또는 TCR Vα+Vβ 쌍을 포함했고, 오직 2.1%만이 혼합된 BCR-TCR 조합을 포함했다. 생성물의 바코드화는 표적 사슬과 관련하여 편향되기 때문에, 이 결과는 결과의 6,056개의 BCR VHVL 및 5,217개의 TCR VαVβ 쌍에 높은 정도의 신뢰도를 허용한다. 모두 존재하기는 했지만 (IgE 오직 <0.05%) 다른 아이소타입과 비교하여 IgG (> 80%)의 두드러진 우세가 나타났다 (도 7c). 카파 및 람다 경쇄는 말초혈 데이터셋과 유사한 비율로 존재했다.
말초 혈액과 유사하게, BCR 아이소타입과 VH 및 VL 사슬의 돌연변이 수준 간에 상관성이 관찰되었고, 이때 IgG 및 IgA 쌍은 IgD 및 IgM보다 큰 VH 및 VL 돌연변이 및 각각의 아이소타입 내에서 VH와 VL 사이에 돌연변이의 일반적인 상관성을 나타냈다 (도 7d). 흥미롭게도, IgD, IgM 및 IgA 쌍이 종양 및 말초혈 데이터셋 (도 5f) 간에 매우 유사한 돌연변이 분포를 나타냈지만, 종양 IgG 분획은 또한 말초 혈액에서 관찰되지 않은 돌연변이가 거의 없었던 서열을 실질적인 비율로 포함했다. TCR 및 IgD를 포함하는 BCR의 경우, 말초 혈액으로부터의 BCR 결과에 대해 액적 바코드당 유사한 수의 캡쳐된 mRNA가 관찰되었다 (도 7e, 액적 바코드당 거의 <10). 현저한 대조적으로, 종양-유래된 IgM, IgA 및 IgG 쌍은 대부분의 액적 바코드에서 캡쳐된 수백 또는 수천 개의 표적 mRNA에서 평균 발현 수준이 10-100배 증가한 것으로 나타났다. 다음에, 캡쳐된 TIL-TCR 및 BCR 레퍼토리의 다양성을 평가했다 (도 7f). 총 5,217개 TCR 쌍 중 2,423개의 분리된 TCR 베타 클론이 관찰되었다. 7개 클론은 >1%의 빈도로 존재했고, 상위 클론은 모든 액적 바코드의 16.9%를 차지했다. 6,056개의 총 BCR 쌍 중 1,518개의 분리된 중쇄 클론이 관찰되었고, 15개 클론은 >1% 빈도를 나타냈으며 어느 것도 >5% 아니었다. 이것은 건강한 말초 BCR 레퍼토리보다 실절적으로 더 제한된 다양성을 나타내지만 (어느 클론도 0.06%을 초과하는 빈도로 존재하지 않는다), 종양 샘플에서 이렇게 많은 유형-전환된, 돌연변이되고 고도로 발현된 클론의 존재는 TIL 특성화를 위한 심도 있고 민감한 샘플링 접근법의 필요성을 증명한다. 이들 방법은 사전 정렬 또는 한정된 TIL 집단의 외인성 활성화를 필요로 하지 않고 B 세포 및 T 세포 둘 다에서 다수의 TIL 면역 수용체 쌍을 동시에 신속하게 검색할 수 있다.
실시예 6 - 관심의 추가의 표현형 마커의 캡쳐
액적 바코드에 의한 수용체 사슬의 결합은 잠재적으로 면역 수용체 이외의 추가 표적의 캡쳐를 허용한다. 이 가능성을 조사하기 위해 CD4+ 및 CD8+ 집단으로 건강한 T 세포를 자기 비드 농축에 의해 분리하고, TCR 알파 및 베타 사슬 및 CD4 및 CD8 mRNA를 표적화하는 프라이머를 사용하여 각각의 유형의 20,000개의 세포를 별도의 에멀션 런에 넣었다. 시퀀싱 후, CD4+ 분리된 세포의 TCR Vα 및 Vβ ("TCR 쌍")를 포함하는 액적 바코드 3,861개 중 47.0%만이 CD4 mRNA와 연결되었고, 오직 0.3%만 CD8 mRNA와 연결되었. 반대로, CD8+ 분리된 세포로부터 2,235개의 TCR 쌍 중에서 50.6%는 CD8 mRNA와 연결되었고, 오직 0.6%만 CD4 mRNA와 연결되었다. 이것은 이전의 보고와 유사하게 세포 표현형에 대한 mRNA 기반 접근법의 높은 특이성이나 제한된 민감성을 증명한다. 반대로, 세포 표면 수용체와 같은 단백질은 암호화하는 mRNA보다 훨씬 높은 수 (세포당 1,000-100,000)로 존재하기 때문에 잠재적으로 더 쉽게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 잠재적으로 세포 표현형과 직접 연결된다. 각각의 세포에서 표적 단백질 수준을 측정하기 위해, 커스텀 올리고뉴클레오타이드 DNA 라벨을 항-인간 CD4 및 CD8 항체에 컨쥬게이션하고, 에멀젼 내에 30,000개의 세포를 집어넣기 전에 라벨링된 항체를 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 비-분리된 혼합물과 함께 인큐베이션했다 (도 8a). DNA 라벨은 항체-특이적 서열 태그와 분자 바코드 및 증폭된 액적 바코드에 대한 서열 상보성을 지니며, 에멀젼 액적 바코드화 및 분자 카운팅은 mRNA와 유사하다. DNA 라벨은 TCR, CD4 및 CD8 mRNA를 동시에 표적화했다. 시퀀싱 및 필터링 후, 3,682개의 액적 바코드가 높은 신뢰도로 TCR VαVβ 쌍으로 확인되었다. 이전의 실험과 일치하여, TCR 쌍의 약 절반 (52%)이 mRNA에 기초하여 CD4 또는 CD8 상태로 배정될 수 있다 (도 8b). 그러나, 액적 바코드의 95% 이상은 CD4/8 단백질 (평균 1.0)보다 CD4/8 단백질 (평균 20.5)에서 훨씬 더 높은 액적 당 평균 분자 수와 함께 단백질 상태에 기초하여 CD4 또는 CD8을 배정받을 수 있다. mRNA와 단백질 신호 사이의 일치도는 높았다 (도 8c): mRNA와 단백질 호출은 주어진 액적에서 96.0%가 일치했다. 드물게 CD4와 CD8 단백질이 모두 검출되었는데, 아마도 액적이 2개 이상의 세포를 포함하고 있었는 결과일 것이다. 에멀젼 바코드화는 최초로 단일 세포 면역 수용체를 mRNA 및 단백질 마커에 직접 연결할 수 있게 한다. 항-PD-1 및 항-MTLA-4와 같은 확장된 면역 종양 관련 마커 세트를 가지고 TIL에 이 접근법을 적용하는 것도 보증된다.
실시예 7 - 인간 샘플
건강한 레퍼토리 확인을 위한 혈액 샘플을 개인 게놈 프로젝트의 승인하에 수집하였다. HIV bNAb 실험을 위한 PBMC를 IAVI 프로토콜 G 집단으로부터의 HIV-1 감염된 공여체인 공여체 17로부터 얻었다. 모든 인간 HIV 샘플을 르완다 공화국 국가 윤리 위원회, 에모리 대학 생명윤리 위원회, 잠비아 대학 연구윤리 위원회, 채링 크로스 연구윤리 위원회, UVRI 과학 및 윤리 위원회, 뉴사우스웨일즈 연구윤리 위원회, 세인트 빈센트 병원 및 동부 시드니 지역 헬스 서비스, 케냐타 국립병원 윤리 및 연구 위원회, 케이프타운 대학 연구윤리 위원회, 국제 임상시험심사위원회, 태국 마히돌대학 윤리위원회, 월터리드 미육군 연구소 (WRAIR) 임상시험심사위원회, 및 코트디부아르 "국가 윤리 자문위원회" (CNESVS)에 의해 승인된 임상 프로토콜하에 고지에 입각한 서면 동의로 수집하였다. 단일 공여체로부터의 저온보존된, 분리된 절제된 난소 선암종을 IRB 승인 프로토콜하에 컨버전트 바이올로직스 (Conversant Biologics)로부터 고지에 입각한 서면 동의로 얻었다.
실시예 8 - 세포 준비
3백만 개의 건강한 B 세포를 연구하기 위해 나트륨 헤파린 (BD)을 포함하는 Vacutainer CPT 세포 준비 튜브에 50mL 혈액을 채취하고, 1800 x g에서 20분간 원심분리하고, 세포 준비 버퍼 (2% 태아 소 혈청 및 2mM EDTA로 보충된 1x PBS)로 2번 세척하고, 200 x g에서 회전시켜 혈소판을 제거하고, 결과의 PBMC를 RPMI-1640 배지 (Life Technologies) + 20% 태아 소 혈청 + 10% DMSO에 -80℃에서 필요할 때까지 동결보존했다. 에멀젼 생성 전에 PBMC를 해동하고, 세포 준비 버퍼로 2번 세척하고 카운팅했다. 제조자의 지시에 따라서 음성 선택-기반 인간 T-세포 부화 키트 (Stem Cell Technologies)를 사용하여 B 세포를 분리했다. 세포를 20μm 셀 스트레이너에 통과시키고 세포 준비 버퍼에서 6.2 x 106 세포/mL (3백만 개 B-세포 실험) 또는 3.1 x 106 세포/mL (PGT-공여체 및 난소 종양 실험)로 희석했다.
실시예 9 - 에멀젼에서 면역 수용체 바코드화
Mitos Flow Rate 센서가 각각 구비된, 단일 공기 압축기에 의해 구동되는 3개의 Mitos P-펌프 (Dolomite Microfluidics)로 에멀젼 생성 플랫폼을 구성했고, 2개의 수성상과 하나의 친불소성 (플루오로philic) 오일 연속상의 친불소성 코팅된 석영 돌로마이트 소형 2-시약 칩으로의 유동을 컴퓨터 제어했다. 하나의 수성 유입 채널은 원하는 액적당 세포 점유 수준을 생성하는데 필요한 밀도로 세포를 포함했고, 2회째 수성 채널은 용해물과 반응물 믹스를 포함했는데, 이것은 AbPair™ 반응 버퍼 및 올리고뉴클레오타이드 (www.abvitro.com/catalog AV2070-1S 및 AV2080-1S), 5 유닛/μL MuMLV-기반 역전사효소 (Thermo Scientific) 및 0.1 유닛/μL Herculase II PCR 폴리머라제로 구성된다. 100μL Hamilton Microliter 주사기를 사용하여 LR 믹스 각각 ~100μL를 2회 주입하여 100μL 내경 PEEK 튜빙 샘플 루프를 오버로딩했다. 100μL Hamilton Gastight 주사기를 사용하여 ~110μL의 세포 현탁액을 ~100μL, 0.2mm 내경 FEP 튜빙 루프에 로딩했다. 에멀젼은 2개의 시약 칩을 통해 동일한 유속으로 수성상을 집중 유동 분사하여 칩의 2개의 오일 채널로부터의 오일 흐름을 동시에 형성함으로써 형성되었다. 칩 출구 채널을 떠나는 에멀젼을 차가운 블록 상의 0.2mL PCR 스트립 튜브 (에펜도르프)에 적하한 다음, 튜브의 바닥으로부터 피펫팅하여 과량의 오일을 제거하고, 40μL의 오버레이 용액을 추가하고 (25mM Na-EDTA, pH 8.0), 튜브를 전사물 태그화 반응을 위해 표준 열순환기로 옮겼다. 45분 역전사 (RT) 단계 동안 RNA는 표적-특이적 RT 프라이머와 함께 42℃에서 역전사되고, 무작위화된 분자 바코드를 포함하는 범용 어댑터 서열을 주형-전환에 기초하여 추가했다. RT 후, 에멀젼을 40 사이클 열순환 (각각의 사이클: 82℃에서 10초, 65℃에서 25초)하여 초기 용해 및 반응 믹스에서 30,000cp/μL로 희석된 액적 바코드 주형의 PCR 증폭을 수행하여, 15,000cp/μL 또는 ~65pl 액적당 ~1pl의 최종 혼합물의 농도를 생성한다. 액적 바코드의 한 단부는 Illumina read 2 ("P7") 프라이머 부위를 포함하고, 나머지 단부는 범용 어댑터 올리고뉴클레오타이드의 공통 서열과 일치한다. 따라서, PCR 동안 주형-전환된 cDNA는 증폭된 액적 바코드 가닥에 대해 어닐링되고, 표적, 분자 바코드 및 액적 바코드 서열을 포함하는 전장 생성물을 행성하기 위해 중첩 확장에 의해 스플라이싱될 수 있다.
실시예 10 - 에멀젼 파괴, 정화, 다운스트림 PCR, 통합 및 시퀀싱
열순환 후, 피펫으로 윗층 용액을 제거하고 40μL 에멀젼 파괴 용액 (1:1 FC-40:퍼플루오로옥탄올)을 15μL 용해물 정화 용액 (12.5μL Qiagen 프로테아제, 2.5μL 0.5M Na-EDTA, pH 8.0)과 함께 추가했다. 10회 인버팅하여 에멀젼을 파괴한 후 혼합물을 50℃에서 15분 그리고 95℃에서 3분 인큐베이션하여 프로테아제를 비활성화했다. 1분 동안 15,000 x g에서 원심분리하여 수성상을 분리한 후 회수된 물질을 엄격히 정제해서 올리고뉴클레오타이드, 시약 및 과잉의 액적 바코드 PCR 생성물을 제거했다. 전장 생성물은 RT 프라이머의 5' 비오틴화로 인해 비오틴을 포함하므로 이들은 스트렙타비딘 비드 상에서 정화에 의해 과잉의 액적 바코드 PCR 생성물로부터 효과적으로 분리될 수 있으며, 이로써 중첩-확장 접근법에서의 공통된 문제인 다운스트림 PCR 재조합 인공산물이 최소화된다. 먼저 제조자의 지시에 따라서 1:1 비율로 AMPure XP 비드 (Agencourt)를 사용하여 생성물을 정제하고, 이어서 제조자의 지시에 따라서 스트렙타비딘 비드 (New England Biolabs)를 사용하여 정화하고, 이어서 95℃에서 탈이온수로 용리하고, 이후 1:1 비율로 AMPure XP 비드를 사용하여 2차 정화했다. 다음에, 생성물을 B- 또는 T-세포 수용체 표적의 불변 영역에 특이적인 프라이머가 액적 바코드 서열의 범용 단부에 특이적인 프라이머와 함께 사용되는 표적 부화 PCR에 넣었다. 이 리버스 프라이머는 또한 제조자의 지시에 따라서 MiSeq 기기에서 다중 시퀀싱을 위한 6-염기 색인 바코드를 포함했다. 따라서, 오직 전장 액적-바코드화된 표적 서열만 이 단계에서 증폭된다. 먼저 모든 표적을 98℃ 10초; 64℃ 20초; 72℃ 15초의 7 사이클 동안 함께 증폭했는데, 이것은 제조자-권장 조건하에 Q5 Hot Start 폴리머라제 (New England Biolabs)를 사용하며 반응을 시작할 때 2분 98℃ 폴리머라제 활성화 단계를 포함한다. 이후, 1.5:1 비드:PCR 비율에서 AMPure XP 정화를 수행했다. 다음에, 이전과 동일한 열순환 조건을 사용하여 각각의 사슬 (VH, VL, Vα, Vβ)을 개별적으로 표적화하는 2회째 7 사이클을 수행했고, 이어서 AMPure XP 정화를 수행했다. 다음에, 전장 Illumina 시퀀싱 어댑터를 추가하고 동일한 열순환 조건에서 5-15 사이클 (qPCR에 의해 판단된 수율에 따라서)의 최종 PCR을 수행하여 TapeStation D1000 (Agilent)의 정량을 위한 충분한 물질을 생성했다. 다음에, 라이브러리를 통합하고 V3 2 x 300bp MiSeq 플랫폼 (Illumina)에서 시퀀싱했다.
실시예 11 - MiSeq 플랫폼에 대한 변형
BCR 또는 TCR의 완전한 가변 V (D)J 영역의 재구성은 양 말단 Illumina 판독 부위의 봉합을 필요로 한다. 이 과정을 개선하기 위해 2 x 300bp 키트의 포워드 판독 부위를 325bp로 확장시켰다. 면역 수용체 라이브러리는 불변 영역 프라이머 부위에서 제한된 다양성을 가지므로 10% phiX 스파이크-인을 사용하여 제한된 라이브러리 다양성의 문제를 완화했다.
실시예 12 - 판독 부위의 생물정보학 가공의 개요
Illumina MiSeq 판독 부위를 pRESTO 패키지 (버전 0.4) 주변에 구축된 커스텀 파이프라인을 사용하여 가공하고, 각각의 액적으로부터 mRNA 분자에 대한 전장 공통 서열을 생성해서 IgBLAST 및/또는 IMGT/HighV-QUEST로 해석한 후, 커스텀 스크립트 및 Change-O 패키지를 사용하여 정렬, 필터링 및 가공해서 통계를 산출했다.
실시예 13 - 판독 부위 가공 및 해석, 아이소타입 배치
pRESTO 및 Change-O 패키지를 이용하는 커스텀 파이프라인에서 원 판독 부위 가공, V (D)J 해석 및 클론 배치를 수행했다. 간단히 말해서, Illumina 양 말단 325 + 300bp 원 판독 부위에 품질-관리, 프라이머-트리밍, 및 프라이머 부위의 퍼지 매칭을 통한 액적-특이적 (DB) 및 분자-특이적 바코드 (MB) 확인이 이루어졌다. 종합하면, DB와 MB는 기원 분자를 고유하게 특정하고, 이 고유한 분자 식별자 (UMI)를 사용하여 동일한 분자로부터 유래한 일치하는 PCR 복제 판독 부위 (최소 2개)를 그룹화함으로써 각각의 mRNA 서열에 대한 컨센서스를 생성할 수 있었다. 아이소타입-특이적 프라이밍은 프라이머-트리밍된 서열 내에서 공지된 아이소타입-특이적 불변 영역의 퍼지 매칭에 의해 확인되었다. IgBLAST를 사용하여 V (D)J 생식세포 계열 세그먼트 및 재정렬 구조를 결정했고, Change-O와 커스텀 스크립트에 의해 파싱된 IMGT/HighV-QUEST로 확인했다.
Change-O에서 실시된 대로 매칭된 IGHV 유전자, IGHJ 유전자, 및 정션 길이를 가진 기능적 V (D)J 서열의 그룹 내에서 단일-결합 클러스터화를 통해서 클론을 배치했다. 3백만 개의 순환하는 세포 데이터셋에 대해, 대칭 전이/전환 모델을 사용하여 4.0의 가중된 클론내 거리가 클론들 내의 최근접-아웃 거리 컷오프로서 사용되었다.
실시예 14 - 액적 면역 수용체 포함 필터링 및 페어링 충실도 계산
액적으로부터 B-세포 서열 회수의 정확도는 이 바코드화 방법에서 액적내 mRNA 서열 일치를 사용하고, 교차-분획 페어링 일치를 통한 2개의 가지 방식으로 평가될 수 있다. 각각의 액적 내에서 유전자좌마다 다수의 mRNA가 캡쳐된다. 하나의 세포로부터 발현된 V (D)J 서열들은 일치해야 한다. 서열 일치를 한정하기 위한 다중 정렬된 V (D)J 세그먼트의 2% 서열 다양성 (평균 쌍별 뉴클레오타이드 차이 pi55<0.02)의 컷오프를 사용하여, 액적당 둘 이상의 생산적 VDJ와 하나의 생산적 VJ 서열의 존재가 잠정적 면역 수용체 포함 또는 다중-세포 점유로서 생물정보학 방식으로 표시된다. 대립형질 방식으로 배제된 각각의 액적에 대해 중쇄 및 경쇄 공통 서열을 구축했고, 클론 한정 및 교차-분획 페어링 분석에 사용했다. 3백만 개의 순환하는 B-세포 데이터셋에 대해, 각각의 VH 계통은 데이터셋에서 20,000개를 초과하는 경쇄 클론 중 하나 (이상적인 경우에)와 관련된다. VHVL 쌍을 가진 259,368개의 면역-유전자좌배제된 액적 중 10,870개의 VDJ 중쇄 유전자좌 재정렬 클러스터가 6개의 물리적으로 분리된 에멀젼 분획 중 적어도 2개에 존재했다. 이들 클러스터는 확대된 계통을 표시하거나 또는 동일한 VJ 엑손의 독립적이지만 유사한 재정렬을 표시한다. VDJ 재정렬이 2개의 복제물에 걸친 일치된 VJ 재정렬과 한 쌍인 경우, 양 실험은 독립적으로 참 양성을 산출했다 (더 희귀한 재정렬을 가진 2,604개의 클론에 대해 35,922개의 가능한 쌍별 비교 중 33,157개). 따라서, 각각의 복제물에 대한 정확도는 96.1% (0.923 ^ 0.5)이다.
실시예 15 - HIV bNAb 후보 서열 발견
tblastx, MUSCLE, 및 PhyML을 사용하여 문헌으로부터 선별된 공지된 bNAb HCDR3s, VDJ 서열 및 17 계통에 대한 유사성에 대해 우리의 38,620개의 VHVL 쌍을 발굴하고, 이어서 전체 V (D)J 아미노산 서열의 계통수를 수동으로 검사해서 공지된 bNAb 서열과 섞인 항체 후보를 선택함으로써 HIV에 대한 새로 자생적으로 쌍을 이룬 광범위 중화 항체 (BNAbs)를 발견했다.
실시예 16 - HIV bNAb 단백질 발현 및 정제
항체 서열을 합성하고 앞서 설명된 중쇄 및 경쇄 벡터에 클로닝했다. 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 제조자의 프로토콜에 따라서 293펙틴 (Invitrogen)을 사용하여 293 FreeStyle 세포에 동시-트랜스펙션했다 (1:1 비). 트랜스펙션 후 4일째에 항체 상청액을 수거하고 단백질-A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다. 추가 분석에 사용하기 전에 정제된 항체는 PBS로 버퍼 교환되었다.
실시예 17 - 슈도바이러스 생성 및 중화 분석
HIV-1 Env 발현 플라스미드 및 Env-결핍 게놈 백본 플라스미드 (pSG3ΔEnv)로 293T 세포를 트랜스펙션하여 슈도바이러스를 생성했다. 트랜스펙션 72시간 후에 슈도바이러스를 수거해서 중화 분석에 사용했다. 1회차의 복제 슈도바이러스 분석 및 TZM-B1 표적 세포를 사용하여 중화 활성을 평가했다. 간단히 말해서, TZM-B1 세포를 96웰 평판 플레이트에 파종했다. 37℃에서 1시간 동안 항체의 연속 희석물과 함께 미리 인큐베이션한 슈도바이러스를 플레이트에 추가했다. 용해 및 Bright-Glo 루시페라아제 기질 (Promega)의 추가시 감염 후 72시간에 루시페라아제 리포터 유전자 발현을 정량했다. IC50 값을 결정하기 위해 용량-반응 곡선을 비선형 회귀에 의해 피팅했다.
실시예 18 - 난소 종양 표적 사슬 확인
에멀젼에 해리된 난소 종양 조직으로부터 BCR과 TCR를 동시에 캡쳐한 후, 앞서 설명된 대로 분자 및 액적 바코드를 사용하여 판독 부위를 필터링하고, 이후 4개의 가능한 표적 사슬 유형 (BCR VH, BCR VL, TCR Vα, TCR Vβ)의 각각의 존재를 탐색했다. 표적 사슬은 이들이 적어도 2개의 mRNA에 의해 지원될 때 보유되었고, 각각은 적어도 2개의 시퀀싱 판독 부위를 가진다. BCR VHVL 또는 TCR VαVβ 쌍만을 포함하는 모든 액적 바코드를 더 분석했다. 상이한 CDR3 아미노산 서열에 기초하여 BCR 중쇄 및 TCR 베타 사슬 클론은 명명되었다.
실시예 19 - DNA-라벨링된 항체 염색을 통한 에멀젼에서의 단백질 검출
고유한 5bp Antigen ID 서열을 포함하도록 단일-가닥 200bp DNA 올리고뉴클레오타이드를 설계하고 5' 아미노 기로 변형시켰다 (집적 DNA 기술). 마우스 단클론성 항-인간 CD4 (BioLegend, #300516) 및 CD8a (BioLegend, #301018) 항체를 제조자의 프로토콜에 따라서 Thunder-Link 키트 (Innova Biosciences)를 사용하여 DNA 올리고뉴클레오타이드 태그에 컨쥬게이션했다. 에멀젼에 앞서 세포 라벨링라벨 말초혈로부터 음성 선택된 200백만 개의 T-세포를 400μL 세포 버퍼 + 2mM EDTA + 0.05% 나트륨아지드에 희석했다. 단일-가닥 연어 정자 DNA를 200μg/mL의 최종 농도로 세포에 추가하고 세포를 5분 동안 실온에서 회전시켰다. CD4 및 CD8a DNA-라벨링된 항체 (각각 5nM의 최종 농도로)의 혼합물을 세포에 추가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 세포를 세포 버퍼 + 2mM EDTA + 0.05% 나트륨아지드 + 200μg/mL 단일-가닥 연어 정자 DNA로 3번 세척했다. 에멀젼 분석으로 들어가기 전에 세포 버퍼 + 0.05% 나트륨아지드에 세포를 재현탁했다. 30,000개의 세포를 에멀젼 시퀀싱에 사용했다.
실시예 20 - 테트라머 - 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 염색
각각 스트렙타비딘 코어 및 형광단을 가진 4개의 MHC-펩타이드 복합체로 구성된 테트라머-올리고뉴클레오타이드를 생성했다. 각각의 테트라머 올리고뉴클레오타이드는 또한 하기 기술된 바와 같이 정량에 사용을 위한 분자 바코드 및/또는 테트라머 ID 코드를 포함하였다. 예시적인 형광-라벨링된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 도 18에서 나타난다.
2개의 상이한 TCR의 친화성을 결정하기 위한 예시적인 방법이 본원에서 기술된다. MHC-펩타이드에 대하여 공지된 상이한 친화성을 가진 T-세포의 2개의 집단을 MHC-펩타이드 테트라머 (pMHC)를 포함한 다양한 농도의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션한다. 미결합 테트라머-올리고뉴클레오타이드를 세척하고, 세포를 에멀젼 분석에 넣고 시퀀싱한다. 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 농도에서 각각의 T-세포에 대한 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드의 서열 판독 부위에 기초하여 결합 신호를 계산한다 (도 19). 더 높은 농도의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션된 T-세포는 더 높은 결합 신호를 나타낼 것으로 예상된다. 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 MHC-펩타이드에 대하여 더 높은 친화성을 갖는 TCR를 가진 T-세포는 작용 가능한 범위의 분석 내에서 같은 농도의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 MHC-펩타이드에 대하여 더 낮은 친화성을 갖는 TCR을 가진 T-세포와 비교하여 더 높은 결합 신호를 나타낼 것으로 예상된다. 예를 들어, 도 19에서 log[테트라머] -8 내지 -4의 농도에서 TCR1에 대한 결합 신호는 TCR2의 것보다 높으며, 이 분석에서 TCR1이 사용된 테트라머 시약에 대해 더 높은 친화성을 가질 것으로 예상된다는 것을 나타낸다.
실시예 21 - 통상적인 MHC - 펩타이드 테트라머 염색과 비교되는 테트라머 - 올리고 뉴클레오타이드 컨쥬게이트 염색
본원에서 기술된 바와 같이 예시적인 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 시약의 결합 특이성을 테스트하기 위한 양성 대조군을 제공하기 위해 표적-특이적 T 세포를 생성했다. 표적-특이적 T 세포를 생성하기 위한 예시적인 방법은 일반적으로 Ho et al., J. Immunol . Methods, 310:1-2, 40-52에 의해 기술되어 있다.　 간략히 말하면, 수지상세포를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 2일 동안 배양한 후 이어서, 전염증성 사이토카인의 존재 하에 제3 일부터 인큐베이션하여 성숙한 수지상세포를 생성함으로써 HLA-A02:01을 가진 정상 인간 공여체로부터 얻어진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플의 부착 분획으로부터 유래된다. 제4 일에, 결과로 생성된 성숙한 수지상세포를 수거하고, 세척한 다음, MHC-펩타이드 테트라머 (pMHC)에 사용되어야 할 원하는 표적-유래된 펩타이드로 펄스하였다. 제5 일에, 정상 인간 공여체의 자가조직 CD8+ T-세포를 펩타이드-펄스된 수지상세포와 함께 인큐베이션한다. 제8 일에, 배양물에서 항원-특이적 T-세포를 포함하는 배양물에 대한 지표로서 IFNγ를 측정한다. 반응성 동시-배양물의 세포를 선택하고 펩타이드-펄스된 수지상세포로 2 또는 3회 재자극하여 항원-특이적 T-세포를 부화시킨다. 일부 구체예에서, 이들 항원 특이적 T-세포를 이러한 부화된 집단으로부터 근본적으로 Ho et al. 2006에 의해 기술된 바와 같이 세포 분류 및/또는 제한 희석 클로닝에 의해 생성한다. 표적 특이적이 아닌 CD8+ T-세포를 T-세포 대조군 집단으로 사용하였다.
표적 특이적 CD8+ T-세포 및 비-특이적 CD8+ T-세포 대조군 집단을 형광-라벨링된 표준 MHC-펩타이드 테트라머 또는 다양한 감소하는 농도의 형광-라벨링된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 표준 MHC-펩타이드 테트라머 또는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대해 양성인 세포 염색의 존재를 유동 세포 분석법에 의해 확인하였다. 표준 MHC-펩타이드 테트라머 및 비-특이적 CD8+ T-세포와 함께 인큐베이션된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 둘 다 양성 염색을 거의 내지 전혀 나타내지 않았다 (도 21, 상단 행 유동 세포 분석 플롯). 표적 특이적 CD8+ T-세포와 함께 인큐베이션된 표준 MHC-펩타이드 테트라머는 강력한 이중 양성 MHC-펩타이드 테트라머+ CD8+ 세포 집단을 나타냈다 (도 21, 하단 행, 좌측 유동 세포 분석 플롯). 표적 특이적 CD8+ T-세포와 함께 인큐베이션된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 강력한 이중 양성 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트+ CD8+ 세포 집단을 나타냈으며, 여기서 이러한 이중 양성 집단은 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 농도가 감소함에 따라 감소하였다 (도 21, 하단 행, 우측 3개의 유동 세포 분석 플롯). 이는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 표준 MHC-펩타이드 테트라머와 유사하게 표적 특이적 T-세포에 결합하고, 표적 특이적 T-세포에 결합하는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 농도 의존적임을 나타냈다.
실시예 22 - 테트라머 - 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 결합 신호
또한, 표적-특이적 (TCR에 결합하는) 또는 비-특이적 T 세포 (TCR에 결합하지 않는)를, 일반적으로 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 세포 당 결합된 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 수를 평가하는데 사용하였다. 비-결합 TCR 세포 집단 및 결합 TCR 세포 집단을 결합 TCR 집단의 TCR, 뿐만 아니라 적어도 하나의 고유한 올리고뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 분자 바코드, 테트라머 ID 코드, 및/또는 Antigen ID 코드)에 의해 인식되는 MHC-펩타이드 테트라머를 포함하는 다양한 농도의 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 함께 별도로 인큐베이션했다. 미결합 테트라머-올리고뉴클레오타이드를 세척했고, 세포를 에멀젼 분석에 넣고 시퀀싱했다. 결합 신호를 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 농도에서 각각의 테트라머에 대한 올리고뉴클레오타이드의 서열 판독 부위의 수에 기초하여 계산으며, 이는 도 21에서 그래프 형태로 표시된다. 도 21에서 도시된 결과는 테트라머-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 용량-의존적 방식으로 1차 표적 T 세포 상에서 TCR을 특이적으로 인식하고 그것에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.

Claims (97)

  1. T 세포 수용체 (TCR)를 선택하는 방법으로서,
    (a) 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계;
    (b) 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를
    (i) 복수의 용기 중 한 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분, 및
    (ii) 용기에서 복수의 T 세포의 단일 T 세포의 TCR 폴리뉴클레오타이드
    에 부착시키는 단계; 및
    (c) 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 서열 정보를 생성하는 단계.
  2. T 세포 수용체 (TCR)의 결합 친화성을 결정하는 방법으로서,
    (a) 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계;
    (b) 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 서열 정보를 생성하는 단계; 및
    (c) 서열 정보에 기초하여 pMHC 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한 TCR의 결합 친화성을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  3. T 세포 수용체 (TCR)를 선택하는 방법으로서,
    (a) 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계로서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 검출 부분을 포함하는 단계;
    (b) 검출 부분의 검출에 기초하여 (a)의 복수의 T 세포로부터 부화된 T 세포 집단을 획득하는 단계;
    (c) pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 결합된 단일 T 세포를 부화된 집단으로부터 복수의 용기의 제1 용기로 분리하는 단계;
    (d) 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를
    (i) 제1 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분, 및
    (ii) 제1 용기에서 단일 T 세포의 TCR 폴리뉴클레오타이드
    에 부착시키는 단계; 및
    (e) 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 서열 정보를 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. T 세포 수용체 (TCR)를 선택하는 방법으로서,
    (a) 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계로서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 검출 부분을 포함하는 단계;
    (b) 검출 부분의 검출에 기초하여 (a)의 복수의 T 세포로부터 부화된 T 세포 집단을 획득하는 단계;
    (c) pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 결합된 단일 T 세포를 부화된 집단으로부터 복수의 용기의 제1 용기로 분리하는 단계;
    (d) 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 서열 정보를 생성하는 단계; 및
    (e) 서열 정보에 기초하여 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한, TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 결합 친화성을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  5. 제3 항 또는 제4 항에 있어서, 부화된 T 세포 집단은 접촉 단계 이후 복수의 T 세포에서 총 T 세포에 대한 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 결합된 T 세포의 비율보다 더 높은 총 T 세포에 대한 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 결합된 T 세포의 비율을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. T 세포 수용체 (TCR)를 선택하는 방법으로서,
    (a) 세포에 대한 제1 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 비율로 제1 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 제1 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계;
    (b) 세포에 대한 제1 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 비율보다 더 낮은 세포에 대한 제2 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 비율로 제2 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 제2 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계;
    (c) 제1 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를
    (i) 복수의 용기의 제1 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분, 및
    (ii) 제1 용기에서 제1 T 세포 집단의 단일 T 세포의 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드
    에 접촉시키는 단계;
    (d) 제2 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를
    (i) 복수의 용기의 제2 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분, 및
    (ii) 제2 용기에서 제2 T 세포 집단의 단일 T 세포의 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드
    에 부착시키는 단계;
    (e) 제1 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 서열 정보의 제1 세트를 생성하는 단계;
    (f) 제2 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 서열 정보의 제2 세트를 생성하는 단계;
    (g) 서열 정보의 제1 세트에 기초하여 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한, 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 제1 결합 신호를 결정하고, 서열 정보의 제2 세트에 기초하여 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한, 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 제2 결합 신호를 결정하는 단계
    를 포함하며, 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드 및 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드는 동일한 TCR을 암호화하는 방법.
  7. 제1 항 또는 제3 항에 있어서, 서열 정보에 기초하여 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 대한, TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 결합 친화성을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6 항에 있어서, 제1 결합 신호 및 제2 결합 신호에 기초하여 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드 및 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 동일한 TCR의 결합 친화성을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6 항에 있어서, 제1 및 제2 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 동일한 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6 항 또는 제9 항에 있어서, 제1 및 제2 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 MHC는 동일한 서브타입인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. T 세포 수용체 (TCR)를 선택하는 방법으로서,
    (a) 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자를 복수의 T 세포에 접촉시키는 단계,
    (b) (i) 복수의 용기의 제1 용기에서 제1 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분에,
    (ii) 제1 용기에서 T 세포 집단의 제1 단일 T 세포의 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드를,
    (iii) 복수의 용기의 제2 용기에서 제2 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분에, 및
    (iv) 제2 용기에서 T 세포 집단의 제2 단일 T 세포의 TCR 폴리뉴클레오타이드에
    부착시키는 단계;
    (c) (i) 제1 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 TCR 폴리뉴클레오타이드 용기 바코드 서열 판독 부위 및 올리고뉴클레오타이드 용기 바코드 서열 판독 부위를 포함하는 서열 정보의 제1 세트를 생성하고,
    (ii) 제2 용기에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 올리고뉴클레오타이드 부분 또는 그것의 보체 및 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 시퀀싱하고, 이로써 TCR 폴리뉴클레오타이드 용기 바코드 서열 판독 부위 및 올리고뉴클레오타이드 용기 바코드 서열 판독 부위를 포함하는 서열 정보의 제2 세트를 생성하는 단계;
    (d) 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 결합 친화성과 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 결합 친화성을 비교하는 단계로서, 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 결합 친화성은 서열 정보의 제1 세트에 기초하여 결정되고, 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR의 결합 친화성을 결정하는 단계는 서열 정보의 제2 세트에 기초하여 결정되는 단계; 및
    (e) 비교 단계에 기초하여 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 TCR을 선택하는 단계로서, 제1 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 선택된 TCR은 제2 TCR 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 TCR보다 더 강력한 결합 친화성을 갖는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 제1 단일 T 세포는 질환 또는 병태를 가진 환자의 것임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 제2 단일 T 세포는 질환 또는 병태가 없는 환자의 것임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항 또는 제6 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 검출 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14 항에 있어서, 부화된 T 세포 집단을 획득하는 단계는 검출 부분의 검출을 기반으로 하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14 항 또는 제15 항에 있어서, 검출 부분은 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기에서 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체의 용기 바코드 서열은 복수의 용기의 제2 용기 내의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 앰플리콘의 용기 바코드 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 정보는 TCR 폴리뉴클레오타이드 용기 바코드 서열 판독 부위 및 올리고뉴클레오타이드 용기 바코드 서열 판독 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1 항 또는 제6 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 접촉 단계 이후, 접촉 단계 이후 복수의 T 세포에서 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 결합된 T 세포의 퍼센트보다 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 결합된 T 세포의 더 높은 퍼센트를 포함하는 부화된 T 세포 집단을 획득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단일 세포에 결합된 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 수를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 단일 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자에 고유한 테트라머 분자 바코드 (TMB) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21 항에 있어서, 서열 정보는 테트라머 분자 바코드 서열 판독 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21 항 또는 제22 항에 있어서, 단일 T 세포에 결합된 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 수는 서열 정보로부터 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 T 세포에 결합된 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 수는 테트라머 분자 바코드 서열 판독 부위로부터 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제21 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자의 각각의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트 분자는 고유한 TMB 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 pMHC 부분은 pMHC의 멀티머, 선택적으로는 pMHC의 테트라머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, MHC는 가용성 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 pMHC 부분의 펩타이드는 합성 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, pMHC 부분은 단일 T 세포의 T-세포 수용체 (TCR)에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1 항 내지 제29 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 부분은 테트라머 식별 서열 (TID)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30 항에 있어서, TID는 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 펩타이드 또는 pMHC 부분에 대해 바코드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 용기 내의 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 서열 정보에 기초하여 용기 내의 단일 T 세포의 특징을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서, 서열 정보는 테트라머 식별 (TID) 서열 또는 그것의 보체를 포함하고 및/또는 TID 서열을 가진 분자의 카피수를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제1 항 내지 제34 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 접촉 단계 이후 복수의 T 세포를 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1 항 또는 제6 항 내지 제35 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 용기에서 단일 T 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 단일 T 세포는 분리 단계 전에 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1 항 내지 제37 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단일 T 세포를 용해시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 용해 단계는 단일 T 세포가 용기에서 분리된 후인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1 항 내지 제39 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 T 세포는 복수의 미분류된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1 항 내지 제40 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 제1 용기 내의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체의 용기 바코드 서열은 복수의 용기의 제2 용기 내의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체의 용기 바코드 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1 항 내지 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 단일 용기 내의 각각의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체의 용기 바코드 서열은 동일한 용기 바코드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 임의의 단일 용기 내의 각각의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체의 용기 바코드 서열은 복수의 용기의 임의의 다른 단일 용기 내의 각각의 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체의 용기 바코드 서열에 고유한 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1 항 내지 제43 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드 부분에 부착하는 단계 및 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 단일 T 세포의 TCR 폴리뉴클레오타이드에 부착하는 단계를 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제1 항 내지 제44 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1 항 내지 제45 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 TCR 세포 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 단계 및 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 증폭시키는 단계를 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제44 항 내지 제47 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 폴리뉴클레오타이드의 용기 바코드 서열과 올리고뉴클레오타이드의 용기 바코드 서열은 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제1 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기로부터 올리고뉴클레오타이드, 그것의 증폭된 생성물 또는 그것의 보체를 통합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제49 항에 있어서, 방법은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기로부터 올리고뉴클레오타이드, 그것의 증폭된 생성물 또는 그것의 보체, 및 TCR 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 통합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제49 항 또는 제50 항에 있어서, 통합 단계는 시퀀싱 전인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제1 항 내지 제51 항 중 어느 한 항에 있어서, pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 상이한 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52 항에 있어서, 복수의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 고유한 테트라머 식별 (TID) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제1 항 내지 제53 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 융합 서열을 포함하고 부착 단계는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 융합 서열에 부착시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1 항 내지 제54 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 결합 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1 항 내지 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 불변 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제1 항 내지 제56 항 중 어느 한 항에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제1 항 내지 제57 항 중 어느 한 항에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 테트라머 식별 (TID) 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제1 항 내지 제58 항 중 어느 한 항에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 테트라머 분자 바코드 (TMB) 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59 항에 있어서, 분석 단계는 하나 이상의 용기 바코드 서열, 하나 이상의 TID 서열, 하나 이상의 테트라머 분자 바코드 (TMB) 서열, 또는 이것들의 조합의 빈도를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제59 항 또는 제60 항에 있어서, 분석 단계는 비교하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제57 항 내지 제61 항 중 어느 한 항에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 테트라머 식별 (TID) 서열과 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 테트라머 분자 바코드 (TMB) 서열을 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제44 항 내지 제62 항 중 어느 한 항에서, 방법은 TCR 폴리뉴클레오타이드, 그것의 보체, 그것의 증폭된 생성물, 또는 이것들의 조합을 시퀀싱하고, 이로써 TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제63 항에 있어서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위와 TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제63 항 또는 제64 항에 있어서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열과 TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열을 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제63 항 내지 제65 항 중 어느 한 항에서, 방법은 TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위를 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제63 항 내지 제66 항 중 어느 한 항에서, TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 용기 바코드 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제63 항 내지 제67 항 중 어느 한 항에서, TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위의 분자 바코드 서열을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제63 항 내지 제68 항 중 어느 한 항에서, 방법은 분석 또는 비교에 기초하여 세포의 특징을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제57 항 내지 제69 항 중 어느 한 항에서, 방법은 올리고뉴클레오타이드 서열 판독 부위에 기초하여 TCR을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제63 항 내지 제70 항 중 어느 한 항에서, TCR 폴리뉴클레오타이드 서열 판독 부위에 기초하여 TCR을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제1 항 내지 제71 항 중 어느 한 항에서, 올리고뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 및 TCR 폴리뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 용기 내의 동일한 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제1 항 내지 제72 항 중 어느 한 항에서, 올리고뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 증폭 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제72 항 또는 제73 항에 있어서, TCR 폴리뉴클레오타이드에 부착된 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 증폭 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제1 항 내지 제74 항 중 어느 한 항에서, 용기는 고체 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제1 항 내지 제74 항 중 어느 한 항에서, 용기는 고체 지지체를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제1 항 내지 제76 항 중 어느 한 항에서, 복수의 용기의 각각의 용기는 단일 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제1 항 내지 제77 항 중 어느 한 항에서, 용기는 웰, 에멀젼, 또는 액적인 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제1 항 내지 제78 항 중 어느 한 항에서, 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 결합되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제1 항 내지 제78 항 중 어느 한 항에서, 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제1 항 내지 제80 항 중 어느 한 항에서, 방법은 복수의 분자 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 분자 바코드화된 폴리뉴클레오타이드의 분자 바코드 서열을 TCR 폴리뉴클레오타이드에 부착시키는 단계를 더 포함하며, 분자 바코드 서열은 단일 TCR 폴리뉴클레오타이드 분자 및 그것의 증폭된 생성물에 대해 바코드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제1 항 내지 제81 항 중 어느 한 항에서, 부착 단계는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 올리고뉴클레오타이드에 결찰하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제1 항 내지 제82 항 중 어느 한 항에서, 부착 단계는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 효소를 가지고 올리고뉴클레오타이드에 부착시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제1 항 내지 제83 항 중 어느 한 항에서, 부착 단계는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체를 올리고뉴클레오타이드에 혼성화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제84 항에 있어서, 부착 단계는 올리고뉴클레오타이드를 연장시키는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제1 항 내지 제85 항 중 어느 한 항에서, 부착 단계는 주형 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제1 항 내지 제86 항 중 어느 한 항에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제1 항 내지 제86 항 중 어느 한 항에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥인 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제1 항 내지 제88 항 중 어느 한 항에서, 올리고뉴클레오타이드는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제1 항 내지 제88 항 중 어느 한 항에서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제1 항 내지 제90 항 중 어느 한 항에서, 세포 폴리뉴클레오타이드는 가변 영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제1 항 내지 제91 항 중 어느 한 항에서, 방법은 가변 영역 서열을 포함하는 자생 TCR 사슬 서열들을 짝짓는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제1 항 내지 제92 항 중 어느 한 항에서, TCR 폴리뉴클레오타이드는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제1 항 내지 제93 항 중 어느 한 항에서, TCR 폴리뉴클레오타이드는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제94 항에 있어서, RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 복수의 용기를 포함하는 조성물로서, 복수의 용기 중 한 용기는
    (a) 복수의 세포를 포함하는 샘플의 단일 세포, 및
    (b) 용기 바코드 서열을 포함하는 용기 바코드화된 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하며,
    용기는 단일 T 세포의 TCR에 결합하는 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 더 포함하는 조성물.
  97. 복수의 용기를 포함하는 조성물로서, 복수의 용기 중 한 용기는
    (a) 복수의 T 세포를 포함하는 샘플의 단일 용해된 세포, 및
    (b) 단일 용해된 T 세포의 TCR에 결합하는 pMHC 부분을 포함하는 pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트
    를 포함하며,
    pMHC-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 올리고뉴클레오타이드 부분은 용기 바코드 서열을 포함하고, 단일 용해된 T 세포의 TCR 폴리뉴클레오타이드는 동일한 용기 바코드 서열을 포함하는 조성물.
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Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
KR102090851B1 (ko) 2012-08-14 2020-03-19 10엑스 제노믹스, 인크. 마이크로캡슐 조성물 및 방법
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
DK2954065T3 (da) 2013-02-08 2021-09-06 10X Genomics Inc Opdeling og bearbejdning af analytter og andre arter
ES2857908T3 (es) 2013-08-28 2021-09-29 Becton Dickinson Co Análisis masivamente paralelo de células individuales
KR102596508B1 (ko) 2014-04-10 2023-10-30 10엑스 제노믹스, 인크. 시약을 캡슐화 및 구획화하기 위한 유체 디바이스, 시스템, 및 방법, 및 이의 응용
WO2015188839A2 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
US12312640B2 (en) 2014-06-26 2025-05-27 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
MX2016016904A (es) 2014-06-26 2017-03-27 10X Genomics Inc Analisis de secuencias de acidos nucleicos.
KR102531677B1 (ko) 2014-06-26 2023-05-10 10엑스 제노믹스, 인크. 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
KR20170073667A (ko) 2014-10-29 2017-06-28 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화 핵산 서열 분석을 위한 방법 및 조성물
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
KR102321863B1 (ko) 2015-01-12 2021-11-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리
BR112017018054A2 (pt) 2015-02-24 2018-07-24 10X Genomics Inc métodos para a cobertura de sequências de ácidos nucleicos direcionadas
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
US11390914B2 (en) 2015-04-23 2022-07-19 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
CN108026524A (zh) 2015-09-11 2018-05-11 赛卢拉研究公司 用于核酸文库标准化的方法和组合物
WO2017053905A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Abvitro Llc Affinity-oligonucleotide conjugates and uses thereof
RU2757135C2 (ru) 2015-09-24 2021-10-11 АБВИТРО ЭлЭлСи Композиции антител к вич и способы их применения
DK3882357T3 (da) 2015-12-04 2022-08-29 10X Genomics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til analyse af nukleinsyrer
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) * 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
JP7116062B2 (ja) * 2017-01-10 2022-08-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 多重化シグナル増幅
US12264411B2 (en) 2017-01-30 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
US20230183791A1 (en) 2017-03-24 2023-06-15 National University Of Singapore Methods For Multiplex Detection Of Molecules
WO2018203575A1 (ja) 2017-05-02 2018-11-08 国立大学法人 東京大学 細胞またはその由来物の動的変化のモニタリング方法およびそれを用いた細胞分類方法
EP3620535A4 (en) * 2017-05-02 2021-01-13 The University of Tokyo METHOD FOR THE INTEGRAL DETECTION OF NON-DESTRUCTIVE MEASUREMENT INFORMATION AND GENOMIC INFORMATION OF A CELL
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3445876B1 (en) 2017-05-26 2023-07-05 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3631012B1 (en) * 2017-05-26 2022-06-08 AbVitro LLC High-throughput polynucleotide library sequencing and transcriptome analysis
WO2018226293A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US20200292526A1 (en) 2017-09-07 2020-09-17 Juno Therapeutics, Inc. Methods of identifying cellular attributes related to outcomes associated with cell therapy
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
EP3710594B1 (en) * 2017-11-16 2023-07-19 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate Methods to measure functional heterogeneity among single cells
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
GB201801481D0 (en) * 2018-01-30 2018-03-14 Immunovia Ab Methods, conjugates and systems
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
WO2019168923A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 University Of Kansas Techniques for generating cell-based therapeutics using recombinant t cell receptor genes
WO2019195166A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
WO2019213294A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
WO2019213237A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
WO2019226631A1 (en) * 2018-05-21 2019-11-28 The Regents Of The University Of California Single cell mapping and transcriptome analysis
WO2019236548A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Compositions and methods for screening aptamers
WO2019236571A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Compositions and methods involving non-natural aptamer libraries
CN118853827A (zh) 2018-10-01 2024-10-29 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
CN112969789A (zh) 2018-11-08 2021-06-15 贝克顿迪金森公司 使用随机引发的单细胞全转录组分析
EP3876956A4 (en) 2018-11-08 2022-12-28 The Regents of The University of California SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETING CANCER CELLS
US12371694B2 (en) 2018-11-14 2025-07-29 University Of Hawaii Compositions and methods for the synthesis and identification of covalent aptamers
US12545950B2 (en) 2018-12-07 2026-02-10 Qiagen Sciences, Llc Methods for preparing CDNA samples for RNA sequencing, and CDNA samples and uses thereof
EP3894552B1 (en) 2018-12-13 2026-01-28 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
MX2021007292A (es) * 2018-12-18 2021-09-21 Mbl Int Corp Composiciones de conjugados de estreptavidina-oligo de ocupación de pmhc.
WO2020142724A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 Cogen Immune Medicine, Inc. Peptide libraries and methods of use thereof
ES2945227T3 (es) 2019-01-23 2023-06-29 Becton Dickinson Co Oligonucleótidos asociados con anticuerpos
JP6821230B2 (ja) * 2019-02-04 2021-01-27 国立大学法人愛媛大学 ＣＡＲライブラリおよびｓｃＦｖの製造方法
EP3924506A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Becton Dickinson and Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
CN109979528B (zh) * 2019-03-28 2021-06-25 广州基迪奥生物科技有限公司 一种单细胞免疫组库测序数据的分析方法
EP3947724A4 (en) * 2019-04-02 2023-06-14 Mission Bio, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR CHARACTERIZING TUMORS AND IDENTIFYING TUMOR HETEROGENEITY
US11365441B2 (en) 2019-05-22 2022-06-21 Mission Bio, Inc. Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of DNA, RNA and protein
CN114051534B (zh) 2019-07-22 2025-02-21 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
WO2021030447A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Mission Bio, Inc. Method, system and apparatus for multi-omic simultaneous detection of protein expression, single nucleotide variations, and copy number variations in the same single cells
CN114616467A (zh) * 2019-10-03 2022-06-10 瑞泽恩制药公司 筛选原代人类细胞中的同源t细胞和表位反应性的高通量方法
JP2022550596A (ja) * 2019-10-05 2022-12-02 ミッション バイオ インコーポレイテッド シングルセルで同時に検出されるコピー数変動及び単一ヌクレオチド変動のための方法、システム、及び装置
EP4048313A4 (en) * 2019-10-25 2023-05-31 Phitonex, Inc. POLYNUCLEOTIDE-LINKED BIOCONJUGATES AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
CN111223532B (zh) * 2019-11-14 2023-06-20 腾讯科技（深圳）有限公司 确定目标化合物的反应物的方法、设备、装置、介质
WO2021113290A1 (en) 2019-12-03 2021-06-10 Alamar Biosciences, Inc. Nucleic acid linked immune-sandwich assay (nulisa)
EP4090763B1 (en) 2020-01-13 2024-12-04 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
ES2993319T3 (en) 2020-01-29 2024-12-27 Becton Dickinson Co Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
US12449419B1 (en) 2020-02-12 2025-10-21 10X Genomics, Inc. Methods for detecting binding of peptide-MHC monomers to T cells
EP4111168A1 (en) 2020-02-25 2023-01-04 Becton Dickinson and Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
CA3172909A1 (en) * 2020-03-18 2021-09-23 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Single-cell combinatorial indexed cytometry sequencing
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
WO2021247593A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
WO2022009642A1 (ja) * 2020-07-06 2022-01-13 ソニーグループ株式会社 生体粒子分析方法及び生体粒子分析システム
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US12391940B2 (en) 2020-07-31 2025-08-19 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
EP4121557A4 (en) 2020-08-06 2024-05-01 Singular Genomics Systems, Inc. SPATIAL SEQUENCING
WO2022076914A1 (en) * 2020-10-09 2022-04-14 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for profiling immune repertoire
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
EP4263859A1 (en) 2020-12-15 2023-10-25 Becton, Dickinson and Company Single cell secretome analysis
CN117178061A (zh) * 2021-02-23 2023-12-05 10X基因组学有限公司 单细胞聚糖谱分析
US20240310375A1 (en) * 2021-03-10 2024-09-19 Sony Group Corporation Bioparticle analysis method and reagent kit for bioparticle analysis
IL305599A (en) * 2021-03-19 2023-11-01 Paris Sciences Et Lettres Methods for the selective analysis of cells or organelles
US20240327822A1 (en) * 2021-08-12 2024-10-03 The University Of Hong Kong Materials and methods to comprehensively define adaptive immune responses
EP4430206A1 (en) * 2021-11-10 2024-09-18 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023108000A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Fred Hutchinson Cancer Center Synthetic constructs and methods for processing antigen-specific cells
WO2023225201A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for characterizing t cell, or t cell-like, receptors from single cells
WO2024015378A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing antigen-binding molecules expressed by immune cells
WO2024192051A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Turnstone Biologics Corp. Composition of selected tumor infiltrating lymphocytes and related methods of producing and using the same
WO2025080865A1 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Turnstone Biologics Corp. Combination of tumor infiltrating lymphocytes (til) and low dose radiation
WO2025096638A2 (en) 2023-10-30 2025-05-08 Turnstone Biologics Corp. Genetically modified tumor infilitrating lymphocytes and methods of producing and using the same

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242794A (en) 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US5019384A (en) 1986-06-30 1991-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Immunonodulating compositions and their use
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
EP0428534B1 (en) 1988-06-14 1995-03-29 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5168038A (en) 1988-06-17 1992-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In situ transcription in cells and tissues
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5733523A (en) 1990-12-10 1998-03-31 Akzo Nobel N.V. Targeted delivery of a therapeutic entity using complementary oligonucleotides
JP3266311B2 (ja) 1991-05-02 2002-03-18 生化学工業株式会社 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
US5384261A (en) 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5550215A (en) 1991-11-22 1996-08-27 Holmes; Christopher P. Polymer reversal on solid surfaces
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5491074A (en) 1993-04-01 1996-02-13 Affymax Technologies Nv Association peptides
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5631734A (en) 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
US6090555A (en) 1997-12-11 2000-07-18 Affymetrix, Inc. Scanned image alignment systems and methods
EP0758403B1 (en) 1994-05-05 1998-06-24 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide repeat arrays
US5571639A (en) 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US5795716A (en) 1994-10-21 1998-08-18 Chee; Mark S. Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation
US5599695A (en) 1995-02-27 1997-02-04 Affymetrix, Inc. Printing molecular library arrays using deprotection agents solely in the vapor phase
US5635363A (en) 1995-02-28 1997-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
WO1997019193A2 (en) * 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US5981956A (en) 1996-05-16 1999-11-09 Affymetrix, Inc. Systems and methods for detection of labeled materials
JP4468488B2 (ja) 1996-05-29 2010-05-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出
US6174670B1 (en) 1996-06-04 2001-01-16 University Of Utah Research Foundation Monitoring amplification of DNA during PCR
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6620587B1 (en) 1997-05-28 2003-09-16 Discerna Limited Ribosome complexes as selection particles for in vitro display and evolution of proteins
JP2001521753A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 アフィメトリックス インコーポレイテッド 成人臓器及び胎児臓器中の発現プロフィール
US6428752B1 (en) 1998-05-14 2002-08-06 Affymetrix, Inc. Cleaning deposit devices that form microarrays and the like
US6269846B1 (en) 1998-01-13 2001-08-07 Genetic Microsystems, Inc. Depositing fluid specimens on substrates, resulting ordered arrays, techniques for deposition of arrays
US6054276A (en) 1998-02-23 2000-04-25 Macevicz; Stephen C. DNA restriction site mapping
US5936324A (en) 1998-03-30 1999-08-10 Genetic Microsystems Inc. Moving magnet scanner
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
WO1999057321A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and dna molecules
ATE255583T1 (de) 1998-07-10 2003-12-15 Meiji Seika Kaisha Metallkomplexe von chlorinderivaten zum abschirmen von röntgenstrahlen
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
CA2366459A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Affymetrix, Inc. Universal arrays
US6582938B1 (en) 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
US6686184B1 (en) 2000-05-25 2004-02-03 President And Fellows Of Harvard College Patterning of surfaces utilizing microfluidic stamps including three-dimensionally arrayed channel networks
US7902121B2 (en) 2001-07-02 2011-03-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University MHC-antigen arrays for detection and characterization of immune responses
EP1421115B1 (en) 2001-08-31 2005-03-02 Avidex Limited Soluble t cell receptor
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
EP2127736A1 (en) 2003-04-10 2009-12-02 The President and Fellows of Harvard College Formation and control of fluidic species
BRPI0414004A (pt) 2003-08-27 2006-10-24 Harvard College controle eletrÈnico de espécies fluìdicas
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7643818B2 (en) 2004-11-22 2010-01-05 Seven Networks, Inc. E-mail messaging to/from a mobile terminal
EP2248578B1 (en) 2005-03-04 2012-06-06 President and Fellows of Harvard College Method for forming multiple emulsions
US20100227770A1 (en) 2005-09-13 2010-09-09 Randall True Brownian microbarcodes for bioassays
EP1984738A2 (en) 2006-01-11 2008-10-29 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
GB0600927D0 (en) * 2006-01-17 2006-02-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Assay and materials therefor
AU2007210152A1 (en) 2006-01-27 2007-08-09 President And Fellows Of Harvard College Fluidic droplet coalescence
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
EP4190448A3 (en) 2006-05-11 2023-09-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic devices
CN102083575B (zh) 2007-06-25 2014-09-17 阿费梅特里克斯公司 刻印的微码
DK2644707T3 (en) 2008-04-30 2015-06-29 Integrated Dna Tech Inc RNase-H-based assays using modified RNA monomers.
US8911948B2 (en) 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
CN102405402A (zh) 2008-09-23 2012-04-04 阔达生命有限公司 基于液滴的测定系统
US10464987B2 (en) 2009-10-06 2019-11-05 Abbvie Inc. Human single-chain T cell receptors
ES2730951T3 (es) * 2010-10-08 2019-11-13 Harvard College Secuenciación inmune de alto rendimiento
WO2012048341A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
WO2014145047A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding
WO2014144495A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abvitro, Inc. Single cell bar-coding for antibody discovery
WO2015006379A2 (en) * 2013-07-08 2015-01-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Selection of cells for elimination
CN106460033B (zh) * 2013-12-30 2021-12-24 阿特雷卡公司 使用核酸条形码分析与单细胞缔合的核酸
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
EP3152232B1 (en) 2014-06-06 2019-11-13 Herlev Hospital Determining antigen recognition through barcoding of mhc multimers
WO2015188839A2 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2016044227A1 (en) * 2014-09-15 2016-03-24 Abvitro, Inc. High-throughput nucleotide library sequencing
EP4636401A2 (en) 2014-12-19 2025-10-22 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell-receptor repertoire
WO2017053905A1 (en) * 2015-09-24 2017-03-30 Abvitro Llc Affinity-oligonucleotide conjugates and uses thereof

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