JP6821230B2 - CARライブラリおよびscFvの製造方法 - Google Patents
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Description
前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、
前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、
前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たす;
条件1:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件2:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
前記第1の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第1の接触工程と、
前記第1の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するCARの第1のscFvを、前記標的抗原に結合する第1の候補scFvとして選抜する第1の選抜工程とを含む。
本発明のCARライブラリは、前述のように、第1のキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含み、前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たす。本発明のCARライブラリは、下記条件1または条件2を満たすことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片(以下、「抗体等」ともいう)における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件2:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
Fvリンカーペプチド2(配列番号2)
GGGGSGGGGSGGGGS
5'-GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC-3'
Fvリンカーペプチド2をコードする塩基配列(配列番号4)
5'-GGTGGAGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGCTCTGGTGGTGGAGGCTCG-3'
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
5'-TTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG-3'
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
5'-ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT-3’
RVKSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
5'-CGAGTGAAGAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
5'-CGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT-3'
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
5'-ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCT-3'
[V1]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V2]-[IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS]-[RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR] ・・・(1)
5'-[N1]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N2]-[ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT]-[CGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA]-3' ・・・(2)
本発明の第1のスクリーニング方法は、前記本発明のCARライブラリ(以下、「第1のCARライブラリ」ともいう)を免疫細胞に発現させる第1の発現工程と、前記第1の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第1の接触工程と、前記第1の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するCARの第1のscFvを、前記標的抗原に結合する第1の候補scFvとして選抜する第1の選抜工程とを含む。本発明の第1のスクリーニング方法は、前記第1の発現工程、前記第1の接触工程および前記第1の選抜工程を含み、前記第1の発現工程において、前記本発明のCARライブラリを用いることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第1のスクリーニング方法によれば、CAR−T細胞において機能しうるscFvをスクリーニングできる。また、前記標的抗原に結合するscFvの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各CDRのアミノ酸配列に基づき、例えば、前記標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を作製できる。このため、前記第1のスクリーニング方法は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片のスクリーニング方法ということもできる。本発明の第1のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明のCARライブラリの説明を援用できる。本発明のscFvの製造方法によれば、新たなscFvをスクリーニングすることができる。このため、本発明のscFvの製造方法は、例えば、scFvのスクリーニング方法ということもできる。
・T細胞
活性化マーカー:CD69、CD107a等
サイトカイン・ケモカイン:IFN−γ、IL−12、IL−2、TNFα、MIP−1β等
・NK細胞
活性化マーカー:CD69、CD107a等
サイトカイン・ケモカイン:INF−γ、IL−12等
・NKT細胞
活性化マーカー:CD69、CD107a、CD25等
サイトカイン・ケモカイン:INF−γ、IL−2等
・B細胞
活性化マーカー:CD28、CD69、CD80、CD138、B220等
サイトカイン・ケモカイン:CXCR4等
前記第1の発現工程におけるCARライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第1の候補scFvにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
条件4:
前記第1の発現工程におけるCARライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第1の候補scFvにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
本発明のキメラ抗原受容体(CAR)ライブラリ細胞は、前記本発明のCARライブラリを発現する細胞を含む。本発明のCARライブラリ細胞は、前記本発明のCARライブラリを発現する細胞を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のCARライブラリ細胞発現細胞によれば、前記本発明の第1のスクリーニング方法を好適に実施できる。本発明のCARライブラリ細胞は、前記本発明のCARライブラリおよび第1のスクリーニング方法の説明を援用できる。
本発明のHLA−A*02:01およびNY−ESO−1157−165の複合体(以下、「A2/NY-ESO-1157」ともいう)に対する抗体またはその抗原結合断片は、前述のように、下記(H)の重鎖可変領域と、下記(L)の軽鎖可変領域とを含む。本発明の抗体等は、下記(H)の重鎖可変領域と、下記(L)の軽鎖可変領域とを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗体等は、A2/NY-ESO-1157に結合する。また、A2/NY-ESO-1157は、例えば、肺がん、悪性黒色腫、滑膜肉腫、骨髄腫等の特定のがん細胞に発現することが知られている。このため、本発明の抗体等は、例えば、A2/NY-ESO-1157発現がん細胞に対する二重特異性抗体、CAR−T細胞のCARの抗原結合ドメイン等として好適に使用できる。前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法等の説明を援用できる。
CDRH1が、下記(H1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH2が、下記(H2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH3が、下記(H3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
(H1)下記(H1-1)、(H1-2)または(H1-3)のアミノ酸配列
(H1-1)下記表1AのCDRH1のいずれかのアミノ酸配列
(H1-2)(H1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-3)(H1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2)下記(H2-1)、(H2-2)または(H2-3)のアミノ酸配列
(H2-1)下記表1AのCDRH2のいずれかのアミノ酸配列
(H2-2)(H2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-3)(H2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3)下記(H3-1)、(H3-2)または(H3-3)のアミノ酸配列
(H3-1)下記表1AのCDRH3のいずれかのアミノ酸配列
(H3-2)(H3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-3)(H3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
CDRL1が、下記(L1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL2が、下記(L2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL3が、下記(L3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
(L1)下記(L1-1)、(L1-2)または(L1-3)のアミノ酸配列
(L1-1)下記表1BのCDRL1のいずれかのアミノ酸配列
(L1-2)(L1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-3)(L1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2)下記(L2-1)、(L2-2)または(L2-3)のアミノ酸配列
(L2-1)下記表1BのCDRL2のいずれかのアミノ酸配列
(L2-2)(L2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-3)(L2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3)下記(L3-1)、(L3-2)または(L3-3)のアミノ酸配列
(L3-1)下記表1BのCDRL3のいずれかのアミノ酸配列
(L3-2)(L3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-3)(L3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(1)の抗体等は、例えば、抗体H1-3M4E5L群ともいう。前記組合せ(1)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、下記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、下記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、下記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LA)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(H1-A1)配列番号17(GGSISSNY)のアミノ酸配列
(H1-A2)配列番号17のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-A3)配列番号17のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2-A1)配列番号18(VSYSGST)のアミノ酸配列
(H2-A2)配列番号18のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-A3)配列番号18のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3-A1)配列番号19(ARESYYYYGMDV)のアミノ酸配列
(H3-A2)配列番号19のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-A3)配列番号19のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L1-A1)配列番号29(SRDVGGYNY)のアミノ酸配列
(L1-A2)配列番号29のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-A3)配列番号29のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-A1)配列番号30(DVI)のアミノ酸配列
(L2-A2)配列番号30のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-A3)配列番号30のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-A1)配列番号31(WSFAGSYYV)のアミノ酸配列
(L3-A2)配列番号31のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-A3)配列番号31のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H-A1)配列番号20のアミノ酸配列
配列番号20:QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(H-A2)配列番号20のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H-A3)配列番号20のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-A1)配列番号32のアミノ酸配列
配列番号32:QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
(L-A2)配列番号32のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-A3)配列番号32のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(2)の抗体等は、例えば、抗体H1-K52群ともいう。前記組合せ(2)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LB)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-B1)配列番号33(QSISSY)のアミノ酸配列
(L1-B2)配列番号33のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-B3)配列番号33のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-B1)配列番号34(AAS)のアミノ酸配列
(L2-B2)配列番号34のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-B3)配列番号34のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-B1)配列番号35(QQYYSTPQT)のアミノ酸配列
(L3-B2)配列番号35のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-B3)配列番号35のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-B1)配列番号36のアミノ酸配列
配列番号36:DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPQTFGPGTKVDIK
(L-B2)配列番号36のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-B3)配列番号36のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(3)の抗体等は、例えば、抗体H1-K73群ともいう。前記組合せ(3)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LC)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-C1)配列番号37(QSISSY)のアミノ酸配列
(L1-C2)配列番号37のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-C3)配列番号37のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-C1)配列番号38(AAS)のアミノ酸配列
(L2-C2)配列番号38のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-C3)配列番号38のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-C1)配列番号39(QQYESYRRS)のアミノ酸配列
(L3-C2)配列番号39のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-C3)配列番号39のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-C1)配列番号40のアミノ酸配列
配列番号40:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYRRSFGQGTKVEIK
(L-C2)配列番号40のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-C3)配列番号40のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(4)の抗体等は、例えば、抗体H1-K121-K124群ともいう。前記組合せ(4)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LD)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-D)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-D)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-D)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-D1)配列番号41(QSISSY)のアミノ酸配列
(L1-D2)配列番号41のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-D3)配列番号41のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-D1)配列番号42(AAS)のアミノ酸配列
(L2-D2)配列番号42のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-D3)配列番号42のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-D1)配列番号43(QQYNSYSRT)のアミノ酸配列
(L3-D2)配列番号43のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-D3)配列番号43のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-DA1)配列番号44のアミノ酸配列
配列番号44:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-DA2)配列番号44のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-DA3)配列番号44のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-DB1)配列番号45のアミノ酸配列
配列番号45:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-DB2)配列番号45のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-DB3)配列番号45のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(5)の抗体等は、例えば、抗体H1-K125群ともいう。前記組合せ(5)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LE)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-E)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-E)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-E)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-E1)配列番号46(QSISSY)のアミノ酸配列
(L1-E2)配列番号46のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-E3)配列番号46のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-E1)配列番号47(AAS)のアミノ酸配列
(L2-E2)配列番号47のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-E3)配列番号47のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-E1)配列番号48(QQYNSYSPCT)のアミノ酸配列
(L3-E2)配列番号48のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-E3)配列番号48のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-E1)配列番号49のアミノ酸配列
配列番号49:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPCTFGPGTKVDIK
(L-E2)配列番号49のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-E3)配列番号49のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(6)の抗体等は、例えば、抗体H1-K131群ともいう。前記組合せ(6)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LF)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-F)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-F)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-F)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-F1)配列番号50(QDISRY)のアミノ酸配列
(L1-F2)配列番号50のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-F3)配列番号50のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-F1)配列番号51(AAS)のアミノ酸配列
(L2-F2)配列番号51のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-F3)配列番号51のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-F1)配列番号52(QQYDNLIT)のアミノ酸配列
(L3-F2)配列番号52のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-F3)配列番号52のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-F1)配列番号53のアミノ酸配列
配列番号53:DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIK
(L-F2)配列番号53のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-F3)配列番号53のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(7)の抗体等は、例えば、抗体H1-K145群ともいう。前記組合せ(7)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LG)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-G)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-G)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-G)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-G1)配列番号54(QDISRY)のアミノ酸配列
(L1-G2)配列番号54のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-G3)配列番号54のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-G1)配列番号55(AAS)のアミノ酸配列
(L2-G2)配列番号55のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-G3)配列番号55のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-G1)配列番号56(QQYNSYSRT)のアミノ酸配列
(L3-G2)配列番号56のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-G3)配列番号56のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-G1)配列番号57のアミノ酸配列
配列番号57:DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-G2)配列番号57のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-G3)配列番号57のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(8)の抗体等は、例えば、抗体H1-K151群ともいう。前記組合せ(8)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LH)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-H)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-H)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-H)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-H1)配列番号58(QSISSY)のアミノ酸配列
(L1-H2)配列番号58のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-H3)配列番号58のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-H1)配列番号59(AAS)のアミノ酸配列
(L2-H2)配列番号59のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-H3)配列番号59のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-H1)配列番号60(QQYDNLIT)のアミノ酸配列
(L3-H2)配列番号60のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-H3)配列番号60のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-H1)配列番号61のアミノ酸配列
配列番号61:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIK
(L-H2)配列番号61のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-H3)配列番号61のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(9)の抗体等は、例えば、抗体H1-K160群ともいう。前記組合せ(9)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LI)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-I)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-I)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-I)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-I1)配列番号62(QSVSSN)のアミノ酸配列
(L1-I2)配列番号62のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-I3)配列番号62のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-I1)配列番号63(GAS)のアミノ酸配列
(L2-I2)配列番号63のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-I3)配列番号63のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-I1)配列番号64(QQYNSYSRT)のアミノ酸配列
(L3-I2)配列番号64のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-I3)配列番号64のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-I1)配列番号65のアミノ酸配列
配列番号65:EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-I2)配列番号65のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-I3)配列番号65のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(10)の抗体等は、例えば、抗体H1-K173群ともいう。前記組合せ(10)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LJ)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-J)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-J)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-J)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-J1)配列番号66(QSISSY)のアミノ酸配列
(L1-J2)配列番号66のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-J3)配列番号66のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-J1)配列番号67(AAS)のアミノ酸配列
(L2-J2)配列番号67のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-J3)配列番号67のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-J1)配列番号68(QQYESYSRT)のアミノ酸配列
(L3-J2)配列番号68のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-J3)配列番号68のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-J1)配列番号69のアミノ酸配列
配列番号69:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYSRTFGQGTKVEIK
(L-J2)配列番号69のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-J3)配列番号69のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(11)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L1群ともいう。前記組合せ(11)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、下記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、下記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、下記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LK)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-K)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-K)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-K)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(H1-B1)配列番号21(GFTFSTYQ)のアミノ酸配列
(H1-B2)配列番号21のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-B3)配列番号21のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2-B1)配列番号22(IVSSGGST)のアミノ酸配列
(H2-B2)配列番号22のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-B3)配列番号22のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3-B1)配列番号23(AGELLPYYGMDV)のアミノ酸配列
(H3-B2)配列番号23のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-B3)配列番号23のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L1-K1)配列番号70(SSDVGGYDF)のアミノ酸配列
(L1-K2)配列番号70のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-K3)配列番号70のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-K1)配列番号71(DVN)のアミノ酸配列
(L2-K2)配列番号71のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-K3)配列番号71のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-K1)配列番号72(SSYAGSNSV)のアミノ酸配列
(L3-K2)配列番号72のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-K3)配列番号72のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H-B1)配列番号24のアミノ酸配列
配列番号24:EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
(H-B2)配列番号24のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H-B3)配列番号24のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-K1)配列番号73のアミノ酸配列
配列番号73:QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGEAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVL
(L-K2)配列番号73のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-K3)配列番号73のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(12)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L66群ともいう。前記組合せ(12)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LL)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-L)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-L)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-L)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-L1)配列番号74(SSDVGGYEF)のアミノ酸配列
(L1-L2)配列番号74のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-L3)配列番号74のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-L1)配列番号75(DVI)のアミノ酸配列
(L2-L2)配列番号75のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-L3)配列番号75のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-L1)配列番号76(SSYTSSSTYV)のアミノ酸配列
(L3-L2)配列番号76のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-L3)配列番号76のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-L1)配列番号77のアミノ酸配列
配列番号77:QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYEFVSWYQQHPGSAPKLIIYDVIERPFGVSYRFSASKSGNTASLTISGLQGEDEADYFCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVL
(L-L2)配列番号77のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-L3)配列番号77のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(13)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L73群ともいう。前記組合せ(13)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LM)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-M)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-M)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-M)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-M1)配列番号78(GSDVGAYDY)のアミノ酸配列
(L1-M2)配列番号78のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-M3)配列番号78のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-M1)配列番号79(DVS)のアミノ酸配列
(L2-M2)配列番号79のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-M3)配列番号79のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-M1)配列番号80(SSYSGSSTWV)のアミノ酸配列
(L3-M2)配列番号80のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-M3)配列番号80のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-M1)配列番号81のアミノ酸配列
配列番号81:QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGAYDYVSWYQHHPGRAPRLIIRDVSVRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSGSSTWVFGGGTKLTVL
(L-M2)配列番号81のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-M3)配列番号81のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(14)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L80群ともいう。前記組合せ(14)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LN)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-N)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-N)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-N)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-N1)配列番号82(SSDVGSYNL)のアミノ酸配列
(L1-N2)配列番号82のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-N3)配列番号82のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-N1)配列番号83(DVS)のアミノ酸配列
(L2-N2)配列番号83のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-N3)配列番号83のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-N1)配列番号84(SSYTSSSTFAV)のアミノ酸配列
(L3-N2)配列番号84のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-N3)配列番号84のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-N1)配列番号85のアミノ酸配列
配列番号85:QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVL
(L-N2)配列番号85のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-N3)配列番号85のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(15)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L88群ともいう。前記組合せ(15)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LO)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-O)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-O)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-O)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-O1)配列番号86(SSDVGGYNY)のアミノ酸配列
(L1-O2)配列番号86のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-O3)配列番号86のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-O1)配列番号87(DVS)のアミノ酸配列
(L2-O2)配列番号87のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-O3)配列番号87のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-O1)配列番号88(CSYAGGYYV)のアミノ酸配列
(L3-O2)配列番号88のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-O3)配列番号88のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-O1)配列番号89のアミノ酸配列
配列番号89:QSALPQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYFCCSYAGGYYVFGTGTKLTVL
(L-O2)配列番号89のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-O3)配列番号89のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(16)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L102群ともいう。前記組合せ(16)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LP)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-P)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-P)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-P)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-P1)配列番号90(SSDVGGYNY)のアミノ酸配列
(L1-P2)配列番号90のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-P3)配列番号90のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-P1)配列番号91(DVS)のアミノ酸配列
(L2-P2)配列番号91のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-P3)配列番号91のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-P1)配列番号92(SSYAGSGSTPFV)のアミノ酸配列
(L3-P2)配列番号92のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-P3)配列番号92のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-P1)配列番号93のアミノ酸配列
配列番号93:QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYCSSYAGSGSTPFVFGTGTKLTVL
(L-P2)配列番号93のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-P3)配列番号93のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(17)の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L124群ともいう。前記組合せ(17)において、前記(HB)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LQ)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-Q)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-Q)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-Q)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-Q1)配列番号94(SSDVGGYNY)のアミノ酸配列
(L1-Q2)配列番号94のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-Q3)配列番号94のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-Q1)配列番号95(DVS)のアミノ酸配列
(L2-Q2)配列番号95のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-Q3)配列番号95のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-Q1)配列番号96(CSYAGRRYV)のアミノ酸配列
(L3-Q2)配列番号96のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-Q3)配列番号96のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-Q1)配列番号97のアミノ酸配列
配列番号97:QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSRVPDRFAGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGRRYVFGTGTKLTVL
(L-Q2)配列番号97のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-Q3)配列番号97のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(18)の抗体等は、例えば、抗体H73-3M4E5L群ともいう。前記組合せ(18)において、前記(HC)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、下記(H1-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、下記(H2-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、下記(H3-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LA)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、前記(L1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、前記(L2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、前記(L3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(H1-C1)配列番号25(GGSISSYY)のアミノ酸配列
(H1-C2)配列番号25のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-C3)配列番号25のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2-C1)配列番号26(INHSGST)のアミノ酸配列
(H2-C2)配列番号26のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-C3)配列番号26のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3-C1)配列番号27(ARCPIYYYGMDV)のアミノ酸配列
(H3-C2)配列番号27のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-C3)配列番号27のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H-C1)配列番号28のアミノ酸配列
配列番号28:QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCPIYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(H-C2)配列番号28のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H-C3)配列番号28のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
CDRH1が、下記(H1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH2が、下記(H2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH3が、下記(H3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域;
(H1)下記(H1-1)、(H1-2)または(H1-3)のアミノ酸配列
(H1-1)下記条件(H1)のCDRH1のいずれかのアミノ酸配列
(H1-2)(H1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-3)(H1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(H2)下記(H2-1)、(H2-2)または(H2-3)のアミノ酸配列
(H2-1)下記条件(H1)のCDRH2のいずれかのアミノ酸配列
(H2-2)(H2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-3)(H2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(H3)下記(H3-1)、(H3-2)または(H3-3)のアミノ酸配列
(H3-1)下記条件(H1)のCDRH3のいずれかのアミノ酸配列
(H3-2)(H3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-3)(H3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
条件(H1)
CDRH1は、GX1X2X3SX4X5X6(配列番号322)であり、
CDRH2は、X7X8X9X10SX11GST(配列番号323)であり、
CDRH3は、AX12X13X14X15X16GMDV(配列番号324)であり、
X1は、GまたはFであり、
X2は、SまたはTであり、
X3は、IまたはFであり、
X4は、SまたはTであり、
X5は、NまたはYであり、
X6は、YまたはQであり、
X7は、存在しないか、Iであり、
X8は、VまたはNであり、
X9は、SまたはHであり、
X10は、存在しないか、Yであり、
X11は、存在しないか、Gであり、
X12は、RまたはGであり、
X13は、EまたはCであり、
X14は、S、L、またはPであり、
X15は、Y、L、またはIであり、
X16は、YまたはPである。
CDRL1が、下記(L1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL2が、下記(L2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL3が、下記(L3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域;
(L1)下記(L1-1)、(L1-2)または(L1-3)のアミノ酸配列
(L1-1)下記条件(L1)および(L2)のCDRL1のいずれかのアミノ酸配列
(L1-2)(L1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-3)(L1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(L2)下記(L2-1)、(L2-2)または(L2-3)のアミノ酸配列
(L2-1)下記条件(L1)および(L2)のCDRL2のいずれかのアミノ酸配列
(L2-2)(L2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-3)(L2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(L3)下記(L3-1)、(L3-2)または(L3-3)のアミノ酸配列
(L3-1)下記条件(L1)および(L2)のCDRL3のいずれかのアミノ酸配列
(L3-2)(L3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-3)(L3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
条件(L1)
CDRL1は、QX1X2SX3X4(配列番号313)であり、
CDRL2は、AAS(配列番号34)またはGAS(配列番号63)であり、
CDRL3は、QQYX5X6X7X8X9X10X11(配列番号314)であり、
X1は、SまたはDであり、
X2は、IまたはVであり、
X3は、SまたはRであり、
X4は、YまたはNであり、
X5は、Y、E、N、またはDであり、
X6は、SまたはNであり、
X7は、存在しないか、T、Y、またはSであり、
X8は、P、S、R、またはLであり、
X9は、Q、R、P、またはIであり、
X10は、存在しないか、SまたはCであり、
X11は、存在しないか、Tである;
条件(L2)
CDRL1は、X1X2DVGX3YX4X5(配列番号315)であり、
CDRL2は、DVN(配列番号71)、DVI(配列番号75)、またはDVS(配列番号79)であり、
CDRL3は、X6SX7X8X9X10X11X12X13X14X15V(配列番号316)であり、
X1は、SまたはGであり、
X2は、RまたはSであり、
X3は、G、A、またはSであり、
X4は、N、D、E、またはQであり、
X5は、Y、F、L、またはWであり、
X6は、W、S、またはCであり、
X7は、F、Y、またはWであり、
X8は、存在しないか、AまたはTであり、
X9は、存在しないか、Gであり、
X10は、存在しないか、Sであり、
X11は、GまたはSであり、
X12は、存在しないか、Sであり、
X13は、S、T、またはRであり、
X14は、Y、N、T、F、P、またはRであり、
X15は、Y、S、W、A、またはFである。
本発明のCD19に対する抗体またはその抗原結合断片(以下、「第2の抗体等」ともいう)は、下記(H)の重鎖可変領域と、下記(L)の軽鎖可変領域とを含む。本発明の抗体等は、下記(H)の重鎖可変領域と、下記(L)の軽鎖可変領域とを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗体等は、CD19に結合する。また、CD19は、例えば、正常なB細胞およびB細胞系のリンパ腫等の特定のがん細胞に発現することが知られている。このため、本発明の抗体等は、例えば、CD19発現がん細胞に対する二重特異性抗体、CAR−T細胞のCARの抗原結合ドメイン等として好適に使用できる。前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体またはその抗原結合断片等の説明を援用できる。
CDRH1が、下記(H1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH2が、下記(H2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH3が、下記(H3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
(H1)下記(H1-1)、(H1-2)または(H1-3)のアミノ酸配列
(H1-1)下記表3AのCDRH1のいずれかのアミノ酸配列
(H1-2)(H1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-3)(H1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2)下記(H2-1)、(H2-2)または(H2-3)のアミノ酸配列
(H2-1)下記表3AのCDRH2のいずれかのアミノ酸配列
(H2-2)(H2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-3)(H2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3)下記(H3-1)、(H3-2)または(H3-3)のアミノ酸配列
(H3-1)下記表3AのCDRH3のいずれかのアミノ酸配列
(H3-2)(H3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-3)(H3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
CDRL1が、下記(L1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL2が、下記(L2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL3が、下記(L3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
(L1)下記(L1-1)、(L1-2)または(L1-3)のアミノ酸配列
(L1-1)下記表3BのCDRL1のいずれかのアミノ酸配列
(L1-2)(L1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-3)(L1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2)下記(L2-1)、(L2-2)または(L2-3)のアミノ酸配列
(L2-1)下記表3BのCDRL2のいずれかのアミノ酸配列
(L2-2)(L2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-3)(L2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3)下記(L3-1)、(L3-2)または(L3-3)のアミノ酸配列
(L3-1)下記表3BのCDRL3のいずれかのアミノ酸配列
(L3-2)(L3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-3)(L3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LA)の抗体等は、例えば、抗体18H-L4群ともいう。前記組合せ(LA)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、下記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、下記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、下記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LA)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(H1-A1)配列番号216(GFTFDDYA)のアミノ酸配列
(H1-A2)配列番号216のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-A3)配列番号216のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2-A1)配列番号217(ISWNSGRI)のアミノ酸配列
(H2-A2)配列番号217のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-A3)配列番号217のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3-A1)配列番号218(ARDQGYHYYDSAEHAFDI)のアミノ酸配列
(H3-A2)配列番号218のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-A3)配列番号218のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L1-A1)配列番号220(KLGDKY)のアミノ酸配列
(L1-A2)配列番号220のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-A3)配列番号220のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-A1)配列番号221(QDS)のアミノ酸配列
(L2-A2)配列番号221のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-A3)配列番号221のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-A1)配列番号222(QAWDSSTHVV)のアミノ酸配列
(L3-A2)配列番号222のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-A3)配列番号222のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H-A1)配列番号219のアミノ酸配列
配列番号219:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
(H-A2)配列番号219のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H-A3)配列番号219のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-A1)配列番号223のアミノ酸配列
配列番号223:SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVL
(L-A2)配列番号223のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-A3)配列番号223のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LB)の抗体等は、例えば、抗体18H-L7群ともいう。前記組合せ(LB)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LB)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-B)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-B1)配列番号224(SSDVGGYNY)のアミノ酸配列
(L1-B2)配列番号224のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-B3)配列番号224のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-B1)配列番号225(DVS)のアミノ酸配列
(L2-B2)配列番号225のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-B3)配列番号225のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-B1)配列番号226(GTWDTSLTAVV)のアミノ酸配列
(L3-B2)配列番号226のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-B3)配列番号226のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-B1)配列番号227のアミノ酸配列
配列番号227:QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVL
(L-B2)配列番号227のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-B3)配列番号227のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LC)の抗体等は、例えば、抗体18H-L9群ともいう。前記組合せ(LC)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LC)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-C)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-C1)配列番号228(WSNIGDDH)のアミノ酸配列
(L1-C2)配列番号228のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-C3)配列番号228のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-C1)配列番号229(DTS)のアミノ酸配列
(L2-C2)配列番号229のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-C3)配列番号229のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-C1)配列番号230(GTWESSLSGVV)のアミノ酸配列
(L3-C2)配列番号230のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-C3)配列番号230のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-C1)配列番号231のアミノ酸配列
配列番号231:QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSWSNIGDDHVSWYQQFPGAAPKLLIYDTSKRPSRVADRFSGSKSGASATLAITGLQAGDEADYYCGTWESSLSGVVFGGGTELTVL
(L-C2)配列番号231のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-C3)配列番号231のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LC)の抗体等は、例えば、抗体18H-L13群ともいう。前記組合せ(LD)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LD)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-D)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-D)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-D)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-D1)配列番号232(SSDVGGYDY)のアミノ酸配列
(L1-D2)配列番号232のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-D3)配列番号232のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-D1)配列番号233(DVT)のアミノ酸配列
(L2-D2)配列番号233のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-D3)配列番号233のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-D1)配列番号234(SSYTTSTTWV)のアミノ酸配列
(L3-D2)配列番号234のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-D3)配列番号234のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-D1)配列番号235のアミノ酸配列
配列番号235:QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVL
(L-D2)配列番号235のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-D3)配列番号235のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LE)の抗体等は、例えば、抗体18H-L14群ともいう。前記組合せ(LE)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LE)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-E)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-E)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-E)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-E1)配列番号236(TSDVGTTNY)のアミノ酸配列
(L1-E2)配列番号236のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-E3)配列番号236のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-E1)配列番号237(DVT)のアミノ酸配列
(L2-E2)配列番号237のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-E3)配列番号237のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-E1)配列番号238(SYAGSYTFVV)のアミノ酸配列
(L3-E2)配列番号238のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-E3)配列番号238のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-E1)配列番号239のアミノ酸配列
配列番号239:QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTTSDVGTTNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFVVFGGGTELTVL
(L-E2)配列番号239のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-E3)配列番号239のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LF)の抗体等は、例えば、抗体18H-L16群ともいう。前記組合せ(LF)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LF)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-F)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-F)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-F)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-F1)配列番号240(SSDVGVYNY)のアミノ酸配列
(L1-F2)配列番号240のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-F3)配列番号240のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-F1)配列番号241(DVS)のアミノ酸配列
(L2-F2)配列番号241のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-F3)配列番号241のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-F1)配列番号242(AAWDDSLNGVV)のアミノ酸配列
(L3-F2)配列番号242のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-F3)配列番号242のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-F1)配列番号243のアミノ酸配列
配列番号243:QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGVYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTQLTVL
(L-F2)配列番号243のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-F3)配列番号243のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LG)の抗体等は、例えば、抗体18H-L17群ともいう。前記組合せ(LG)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LG)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-G)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-G)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-G)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-G1)配列番号244(SSNIGNNY)のアミノ酸配列
(L1-G2)配列番号244のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-G3)配列番号244のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-G1)配列番号245(DNV)のアミノ酸配列
(L2-G2)配列番号245のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-G3)配列番号245のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-G1)配列番号246(AAWDDSLSAI)のアミノ酸配列
(L3-G2)配列番号246のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-G3)配列番号246のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-G1)配列番号247のアミノ酸配列
配列番号247:QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVCWYQHLPGTAPKLLIYDNVKRPSGIPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSAIFGGGTELTVL
(L-G2)配列番号247のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-G3)配列番号247のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LH)の抗体等は、例えば、抗体18H-L22群ともいう。前記組合せ(LH)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LH)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-H)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-H)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-H)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-H1)配列番号248(SSDVGGYNY)のアミノ酸配列
(L1-H2)配列番号248のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-H3)配列番号248のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-H1)配列番号249(DVS)のアミノ酸配列
(L2-H2)配列番号249のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-H3)配列番号249のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-H1)配列番号250(HSYDSSLSHV)のアミノ酸配列
(L3-H2)配列番号250のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-H3)配列番号250のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-H1)配列番号251のアミノ酸配列
配列番号251:QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCHSYDSSLSHVFGTGTKVTVL
(L-H2)配列番号251のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-H3)配列番号251のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LI)の抗体等は、例えば、抗体H1-K4群ともいう。前記組合せ(LI)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LI)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-I)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-I)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-I)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-I1)配列番号252(QSVSSN)のアミノ酸配列
(L1-I2)配列番号252のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-I3)配列番号252のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-I1)配列番号253(GAS)のアミノ酸配列
(L2-I2)配列番号253のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-I3)配列番号253のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-I1)配列番号254(QQYNNWPPLYT)のアミノ酸配列
(L3-I2)配列番号254のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-I3)配列番号254のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-I1)配列番号255のアミノ酸配列
配列番号255:EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPLYTFGQGTKLEIK
(L-I2)配列番号255のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-I3)配列番号255のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LJ)の抗体等は、例えば、抗体18H-K5群ともいう。前記組合せ(LJ)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LJ)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-J)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-J)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-J)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-J1)配列番号256(QSVSSY)のアミノ酸配列
(L1-J2)配列番号256のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-J3)配列番号256のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-J1)配列番号257(DAS)のアミノ酸配列
(L2-J2)配列番号257のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-J3)配列番号257のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-J1)配列番号258(QQSYSTLLYT)のアミノ酸配列
(L3-J2)配列番号258のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-J3)配列番号258のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-J1)配列番号259のアミノ酸配列
配列番号259:EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTLLYTFGQGTKLEIK
(L-J2)配列番号259のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-J3)配列番号259のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LK)の抗体等は、例えば、抗体18H-K6群ともいう。前記組合せ(LK)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LK)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-K)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-K)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-K)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-K1)配列番号260(QSVSSY)のアミノ酸配列
(L1-K2)配列番号260のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-K3)配列番号260のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-K1)配列番号261(DAS)のアミノ酸配列
(L2-K2)配列番号261のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-K3)配列番号261のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-K1)配列番号262(QQYDSLPLT)のアミノ酸配列
(L3-K2)配列番号262のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-K3)配列番号262のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-K1)配列番号263のアミノ酸配列
配列番号263:EIVLTRSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGISARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDIATYYCQQYDSLPLTFGGGTKLEIK
(L-K2)配列番号263のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-K3)配列番号263のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LL)の抗体等は、例えば、抗体18H-K9群ともいう。前記組合せ(LL)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LL)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-L)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-L)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-L)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-L1)配列番号264(QTISASS)のアミノ酸配列
(L1-L2)配列番号264のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-L3)配列番号264のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-L1)配列番号265(GAS)のアミノ酸配列
(L2-L2)配列番号265のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-L3)配列番号265のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-L1)配列番号266(QQFNEWPLT)のアミノ酸配列
(L3-L2)配列番号266のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-L3)配列番号266のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-L1)配列番号267のアミノ酸配列
配列番号267:EIVLTQSPATLSLSPGERATVSCRPSQTISASSVAWYQQKAGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNEWPLTFGGGTKVEIK
(L-L2)配列番号267のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-L3)配列番号267のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
組合せ(LM)の抗体等は、例えば、抗体18H-K10群ともいう。前記組合せ(LM)において、前記(HA)の重鎖可変領域は、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、CDRH1が、前記(H1-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH2が、前記(H2-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRH3が、前記(H3-A)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記(LM)の軽鎖可変領域は、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含み、CDRL1が、下記(L1-M)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL2が、下記(L2-M)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、CDRL3が、下記(L3-M)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
(L1-M1)配列番号268(QSVSSN)のアミノ酸配列
(L1-M2)配列番号268のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-M3)配列番号268のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2-M1)配列番号269(GAS)のアミノ酸配列
(L2-M2)配列番号269のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-M3)配列番号269のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3-M1)配列番号270(QQYGSSPDIFT)のアミノ酸配列
(L3-M2)配列番号270のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-M3)配列番号270のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L-M1)配列番号271のアミノ酸配列
配列番号271:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPDIFTFGPGTKVDIK
(L-M2)配列番号271のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L-M3)配列番号271のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
CDRL1が、下記(L1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL2が、下記(L2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL3が、下記(L3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域;
(L1)下記(L1-1)、(L1-2)または(L1-3)のアミノ酸配列
(L1-1)下記条件(L1)〜(L3)および(L4)のCDRL1のいずれかのアミノ酸配列
(L1-2)(L1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-3)(L1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(L2)下記(L2-1)、(L2-2)または(L2-3)のアミノ酸配列
(L2-1)下記条件(L1)〜(L3)および(L4)のCDRL2のいずれかのアミノ酸配列
(L2-2)(L2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-3)(L2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
(L3)下記(L3-1)、(L3-2)または(L3-3)のアミノ酸配列
(L3-1)下記条件(L1)〜(L3)および(L4)のCDRL3のいずれかのアミノ酸配列
(L3-2)(L3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-3)(L3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列;
条件(L1)
CDRL1は、KLGDKY(配列番号220)であり、
CDRL2は、QDS(配列番号221)であり、
CDRL3は、QAWDSSTHV(配列番号222)である;
条件(L2)
CDRL1は、WSNIGDDH(配列番号228)であり、
CDRL2は、DTS(配列番号229)であり、
CDRL3は、GTWESSLSGVV(配列番号230)である;
条件(L3)
CDRL1は、X1SX2X3GX4X5NY(配列番号317)であり、
CDRL2は、DX6X7(配列番号318)であり、
CDRL3は、X8X9X10X11X12SX13X14X15X16X17(配列番号319)であり、
X1は、SまたはTであり、
X2は、DまたはNであり、
X3は、V、I、L、またはAであり、
X4は、G、T、V、またはNであり、
X5は、存在しないか、Y、T、またはSであり、
X6は、VまたはNであり、
X7は、S、I、またはVであり、
X8は、存在しないか、G、A、またはHであり、
X9は、T、S、またはAであり、
X10は、W、Y、またはFであり、
X11は、AまたはDであり、
X12は、T、G、D、またはSであり、
X13は、LまたはYであり、
X14は、T、N、またはSであり、
X15は、A、F、G、またはHであり、
X15は、VまたはIであり、
X17は、存在しないか、Vである;
条件(L4)
CDRL1は、QX1X2SX3SX4(配列番号320)であり、
CDRL2は、GAS(配列番号253)またはDAS(配列番号257)であり、
CDRL3は、QQX5X6X7X8X9X10X11LX12T(配列番号321)であり、
X1は、S、T、N、またはQであり、
X2は、V、I、L、またはAであり、
X3は、存在しないか、A、I、V、L、またはGであり、
X4は、N、Y、またはSであり、
X5は、存在しないか、Sであり、
X6は、Y、F、またはWであり、
X7は、N、S、D、またはGであり、
X8は、N、T、S、またはEであり、
X9は、W、L、またはSであり、
X10は、存在しないか、Pであり、
X11は、存在しないか、PまたはDであり、
X12は、存在しないか、Y、F、またはWである。
本発明のコード遺伝子は、HLA−A*02:01およびNY−ESO−1157−165の複合体に対する抗体もしくはその抗原結合断片またはCD19に対する抗体もしくはその抗原結合断片(以下、あわせて「本発明の抗体またはその抗原結合断片」または「本発明の抗体等」ともいう)のコード遺伝子であり、前記本発明の第1の抗体もしくは抗原結合断片のアミノ酸配列または前記本発明の第2の抗体もしくは抗原結合断片をコードする核酸(ポリヌクレオチド)を含む。
本発明の第1のキメラ抗原受容体(CAR)は、前述のように、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記抗原結合ドメインは、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の第1のCARは、前記抗原結合ドメインが、前記本発明の第1の抗体等を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第1のCARは、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクターおよび形質転換体の説明を援用できる。本発明の第1のCARは、例えば、A2/NY-ESO-1157発現がん細胞に対するCAR−T細胞のCARとして好適に使用できる。
(BD)下記(BD1)、(BD2)または(BD3)のポリペプチド
(BD1)配列番号98〜117のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
(BD2)配列番号98〜117いずれかのアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
(BD3)配列番号98〜117のいずれかのアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
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QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGAYDYVSWYQHHPGRAPRLIIRDVSVRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSGSSTWVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
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QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSRVPDRFAGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGRRYVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
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(C)下記(C1)、(C2)または(C3)のポリペプチド
(C1)配列番号118〜137のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
(C2)配列番号118〜137のいずれかのアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
(C3)配列番号118〜137のいずれかのアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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本発明の第2のキメラ抗原受容体(CAR)は、前述のように、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記抗原結合ドメインは、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の第2のCARは、前記抗原結合ドメインが、前記本発明の第2の抗体等を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第2のCARは、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクターおよび形質転換体の説明を援用できる。本発明の第2のCARは、例えば、CD19発現がん細胞に対するCAR−T細胞のCARとして好適に使用できる。
(bd)下記(bd1)、(bd2)または(bd3)のポリペプチド
(bd1)配列番号272〜284のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
(bd2)配列番号272〜284のいずれかのアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、CD19に結合するポリペプチド
(bd3)配列番号272〜284のいずれかのアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、CD19に結合するポリペプチド
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
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(CA)下記(CA1)、(CA2)または(CA3)のポリペプチド
(CA1)配列番号285〜297のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
(CA2)配列番号285〜297のいずれかのアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、CD19に結合するポリペプチド
(CA3)配列番号285〜297のいずれかのアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、CD19に結合するポリペプチド
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGLSSDVGGYDYVSWYQQHPGIAPKLMIYDVTNRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTSTTWVFGAGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTTSDVGTTNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPDIFTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
本発明の核酸は、前述のように、前記本発明のキメラ抗原受容体をコードする。本発明の核酸は、前記本発明の第1のキメラ抗原受容体または第2のキメラ抗原受容体(以下、あわせて「本発明のキメラ抗原受容体」ともいう)をコードすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の核酸によれば、例えば、細胞に本発明のCARを発現させることができる。本発明の核酸は、例えば、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第1の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第1のキメラ抗原受容体第2のキメラ抗原受容体の説明を援用できる。
(c)下記(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、または(c6)のポリヌクレオチド(核酸)
(c1)配列番号118〜137のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c2)配列番号118〜137のいずれかのアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c3)配列番号118〜137いずれかのアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c4)配列番号138〜157のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(c5)配列番号138〜157のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(c6)配列番号138〜157のいずれかの塩基配列において、1個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTGGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTGCCATGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGCAATATTATAGTACTCCTCAAACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAAGCAGGGAAAGCCCCTAAGCTTCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCAACCTATTACTGCCAACAGTATGAAAGTTATCGAAGGTCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCTCCGTGCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGATGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAATCTGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGATGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGATGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAATCTGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAACCTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAAGCAGGGAAAGCCCCTAAGCTTCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCAACCTATTACTGCCAACAGTATGAAAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGACTTTGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCGAAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGATGTCAATAACCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGGTGACTATTACTGCAGCTCATATGCAGGCAGCAACAGCGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGACTTTGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCGAAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGATGTCAATAACCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGGTGACTATTACTGCAGCTCATATGCAGGCAGCAACAGCGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGGACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGAATTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAGCGCCCCCAAACTCATTATTTATGACGTAATAGAGCGTCCCTTCGGTGTCTCCTATCGGTTCTCTGCCTCCAAGTCAGGCAACACGGCCTCCCTGACGATCTCTGGGCTCCAGGGTGAAGACGAGGCTGATTACTTCTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCGGCAGTGACGTTGGTGCTTATGACTATGTCTCCTGGTACCAACATCACCCAGGCAGAGCCCCCAGACTCATCATTCGTGATGTCAGTGTGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTCCTCATATTCAGGCAGCAGCACTTGGGTGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTTATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTTTCGCGGTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAATCTGCCCTGCCTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGCTGTTCGTATGCAGGCGGCTATTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGACTGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCAGCTCATATGCAGGCAGCGGCAGCACCCCCTTTGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAAGGGTCCCTGATCGCTTCGCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAAGACGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCCGGCAGACGTTATGTGTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTGCCCTATCTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTGGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
(ca)下記(ca1)、(ca2)、(ca3)、(ca4)、(ca5)、または(ca6)のポリヌクレオチド(核酸)
(ca1)配列番号272〜284のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(ca2)配列番号272〜284のいずれかのアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、CD19に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(ca3)配列番号272〜284のいずれかのアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、CD19に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(ca4)配列番号298〜310のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(ca5)配列番号298〜310のいずれかの塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、CD19に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(ca6)配列番号298〜310のいずれかの塩基配列において、1個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、CD19に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
5'-TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCTCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCACACATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATACCAGCCTGACTGCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCTGGTCCAACATTGGAGATGATCATGTCTCCTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACACTTCTAAGCGACCCTCACGCGTTGCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCGCGTCAGCCACCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGGGGACGAGGCCGACTATTATTGCGGAACATGGGAAAGCAGCCTGAGTGGTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGACTCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCATAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCACTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAGTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAACCAGCACGACTTGGGTCTTCGGAGCTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCACCAGTGACGTTGGTACTACTAATTATGTCTCCTGGTACCAGCAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCCTAATTTATGATGTCACTAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGCCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCAGGCAGCTACACCTTCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
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5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCACTCCTATGACAGCAGCCTGAGTCATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
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5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCTTTTGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
5'-GAAATTGTGTTGACACGGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCCTCCAACAGGGCCACTGGTATTTCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAGTCTCCCACTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
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5'-GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAAAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCGATATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
本発明の細胞は、前述のように、前記本発明のキメラ抗原受容体を含む。本発明の細胞は、前記本発明のキメラ抗原受容体を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞によれば、例えば、がんを治療できる。本発明の細胞は、例えば、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第1のキメラ抗原受容体、第2のキメラ抗原受容体、核酸等の説明を援用できる。
本発明の細胞の製造方法は、前述のように、前記本発明の核酸を細胞に導入する導入工程を含む。本発明の細胞の製造方法は、前記導入工程において、前記本発明の核酸を細胞に導入することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の細胞の製造方法によれば、例えば、がんを治療可能な細胞を製造できる。本発明の細胞の製造方法は、例えば、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第1のキメラ抗原受容体、第2のキメラ抗原受容体、核酸、細胞等の説明を援用できる。
本発明のがん治療薬(以下、「治療薬」ともいう)は、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を含む。本発明の治療薬は、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の治療薬によれば、例えば、がんを治療できる。本発明のがん治療薬は、例えば、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第1のキメラ抗原受容体、第2のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法等の説明を援用できる。
本発明のがんの治療方法は、投与対象に、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を投与する投与工程を含む。本発明のがんの治療方法は、前記投与工程において、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を投与することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の治療方法によれば、がんを治療できる。本発明のがんの治療方法は、例えば、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第1のキメラ抗原受容体、第2のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法、治療薬等の説明を援用できる。
本発明は、がんの治療方法に使用するための、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片、または、がんの治療のための、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片である。また、本発明は、がんの治療用医薬の製造のための、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用である。さらに、本発明は、がんの治療方法に使用するための、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、もしくは核酸、または、がんの治療のための、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、もしくは核酸である。また、本発明は、がんの治療用医薬の製造のための、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸の使用である。本発明の使用は、例えば、前記本発明のCARライブラリ、第1のスクリーニング方法、第1の抗体等、第2の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第1のキメラ抗原受容体、第2のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法、治療薬、治療方法等の説明を援用できる。
本発明の二重特異性抗体(BsAb)ライブラリは、第1の二重特異性抗体(BsAb)をコードする核酸を含み、前記第1のBsAbは、第1の抗原結合ドメインと、第2の抗原結合ドメインとを含み、前記第1の抗原結合ドメインは、第1の標的抗原に結合する第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、前記第2の抗原結合ドメインは、第2の標的抗原への結合をスクリーニングする第2のscFvを含み、前記第2のscFvは、第2の重鎖可変領域と、第2の軽鎖可変領域とを含み、前記第2の重鎖可変領域および前記第2の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たし、前記第1の標的抗原または前記第2の標的抗原は、免疫細胞活性化受容体である。
前記第2の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第2の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件2:
前記第2の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第2の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
前記免疫細胞活性化受容体は、例えば、前記免疫細胞に発現し、かつ、リガンドとの結合または複数の免疫細胞活性化受容体の架橋により前記免疫細胞活性化受容体が発現する免疫細胞を活性化可能な受容体を意味する。前記免疫細胞活性化受容体は、例えば、前記免疫細胞の種類に応じて適宜決定できる。具体例として、前記免疫細胞がT細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、CD3等があげられる。前記CD3は、例えば、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD3ηまたは、これらの複合体があげられる。前記免疫細胞がNK細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、NK細胞の活性化受容体等があげられる。前記NK細胞の活性化受容体は、例えば、CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、NKG2D/NKG2D等があげられる。前記免疫細胞がNKT細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、CD3、前記NK細胞の活性化受容体等があげられる。前記免疫細胞がB細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、例えば、CD19、CD79α、CD79β等があげられる。
前記第1の標的抗原は、特に制限されず、例えば、前記CARライブラリにおける標的抗原の説明を援用できる。
[V1]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V2]-[SGSG]-[V3]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V4] ・・・(3)
(V2)V1:VL1、V2:VH1、V3:VH2、V4:VL2
(V3)V1:VH1、V2:VL1、V3:VL2、V4:VH2
(V4)V1:VL1、V2:VH1、V3:VL2、V4:VH2
(V5)V1:VH2、V2:VL2、V3:VH1、V5:VL1
(V6)V1:VH2、V2:VL2、V3:VL1、V4:VH1
(V7)V1:VL2、V2:VH2、V3:VH1、V4:VL1
(V8)V1:VL2、V2:VH2、V3:VL1、V4:VH1
VH1:第1の重鎖可変領域
VL1:第1の軽鎖可変領域
VH2:第2の重鎖可変領域
VL2:第2の軽鎖可変領域
5'-[N1]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N2]-[AGCGGATCTGGC]-[N3]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N4]-3’ ・・・(4)
(N2)N1:NL1、N2:NH1、N3:NH2、N4:NL2
(N3)N1:NH1、N2:NL1、N3:NL2、N4:NH2
(N4)N1:NL1、N2:NH1、N3:NL2、N4:NH2
(N5)N1:NH2、N2:NL2、N3:NH1、N4:NL1
(N6)N1:NH2、N2:NL2、N3:NL1、N4:NH1
(N7)N1:NL2、N2:NH2、N3:NH1、N4:NL1
(N8)N1:NL2、N2:NH2、N3:NL1、N4:NH1
NH1:第1の重鎖可変領域をコードする塩基配列
NL1:第1の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
NH2:第2の重鎖可変領域をコードする塩基配列
NL2:第2の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
本発明の第2のscFvのスクリーニング方法(以下、「第2のスクリーニング方法」ともいう)は、前記本発明のBsAbライブラリから第1のBsAbを準備する第1の準備工程と、
前記第1の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第1のBsAbと、前記第2の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させ、
前記第2の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第1のBsAbと、前記第1の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる第1の接触工程と、
前記第1の接触工程において、前記第2の標的抗原と結合した第1のBsAbの第2のscFvを、前記第2の標的抗原に結合する第1の候補scFvとして選抜する第1の選抜工程とを含む。
・T細胞
活性化マーカー:CD69、CD107a等
サイトカイン・ケモカイン:IFN−γ、IL−12、IL−2、TNFα、MIP−1β等
・NK細胞
活性化マーカー:CD69、CD107a等
サイトカイン・ケモカイン:INF−γ、IL−12等
・NKT細胞
活性化マーカー:CD69、CD107a、CD25等
サイトカイン・ケモカイン:INF−γ、IL−2等
・B細胞
活性化マーカー:CD28、CD69、CD80、CD138、B220等
サイトカイン・ケモカイン:CXCR4等
前記第1の準備工程におけるBsAbライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第4の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第4の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第1の候補BsAbにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件4:
前記第1の準備工程におけるBsAbライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第4の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第1の候補BsAbにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第4の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
[V5]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V6]-[SGSG]-[V7]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V8] ・・・(5)
(V10)V5:VL3、V6:VH3、V7:VH4、V8:VL4
(V11)V5:VH3、V6:VL3、V7:VL4、V8:VH4
(V12)V5:VL3、V6:VH3、V7:VL4、V8:VH4
(V13)V5:VH4、V6:VL4、V7:VH3、V8:VL3
(V14)V5:VH4、V6:VL4、V7:VL3、V8:VH3
(V15)V5:VL4、V6:VH4、V7:VH3、V8:VL3
(V16)V5:VL4、V6:VH4、V7:VL3、V8:VH3
VH3:第3の重鎖可変領域
VL3:第3の軽鎖可変領域
VH4:第4の重鎖可変領域
VL4:第4の軽鎖可変領域
5'-[N5]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N6]-[AGCGGATCTGGC]-[N7]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N8]-3’・・・(6)
(N10)N5:NL3、N6:NH3、N7:NH4、N8:NL4
(N11)N5:NH3、N6:NL3、N7:NL4、N8:NH4
(N12)N5:NL3、N6:NH3、N7:NL4、N8:NH4
(N13)N5:NH4、N6:NL4、N7:NH3、N8:NL3
(N14)N5:NH4、N6:NL4、N7:NL3、N8:NH3
(N15)N5:NL4、N6:NH4、N7:NH3、N8:NL3
(N16)N5:NL4、N6:NH4、N7:NL3、N8:NH3
NH3:第3の重鎖可変領域をコードする塩基配列
NL3:第3の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
NH4:第4の重鎖可変領域をコードする塩基配列
NL4:第4の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
本発明のscFvの製造方法は、前述のように、第1のキメラ抗原受容体(CAR)ライブラリの発現細胞を動物に投与する第1の投与工程と、
前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第1のCARライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞として採取する第1の採取工程とを含み、
前記第1のCARライブラリは、第1のCARをコードする核酸を含み、
前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、
前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、
前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たす。
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(条件2)
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
前記第1のCARライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞のscFvにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
(条件4)
前記第1のCARライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞のscFvにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、A2/NY-ESO-1157に結合するscFvをスクリーニングできることを確認した。
3M4E5 CARは、A2/NY-ESO-1157特異的抗体(clone:3M4E5)を用いて調製した。具体的には、3M4E5の免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域をコードする核酸(配列番号162)および3M4E5の免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域をコードする核酸(配列番号163)を、Fvリンカーペプチド(GSTSGSGKPGSGEGSTKG:配列番号1)をコードする核酸(配列番号3)で連結することにより、3M4E5 scFv(をコードする核酸を調製した。3M4E5の重鎖可変領域、Fvリンカーペプチド、および3M4E5の軽鎖可変領域をこの順番で連結したscFvを、3M4E5HL scFvという。また、3M4E5の軽鎖可変領域、Fvリンカーペプチド、および3M4E5の重鎖可変領域をこの順番で連結したscFvを、3M4E5LH scFvという。
5’-GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCA-3'
5’-CAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTG-3'
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
5’-GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTG-3’
QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
5’-CAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTGGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCA-3’
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
5’-GCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT-3’
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
5’-CGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3’
B細胞精製キット(CD19-positive selection kit、MACS(登録商標)beads、Miltenyi Biotec社製)を用いて、ヒト末梢血単核球から1〜3×106細胞のヒト末梢血B細胞を精製した。得られたCD19+B細胞を回収後、cDNA合成キット(SMARTer(商標)RACE cDNA amplification kit、Takara Bio社製)を用いて、RNAを抽出し、さらに、前記RNAからcDNAを合成した。
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
3’IGHCプライマー(配列番号176)
5’-TGAGTTCCACGACACCGTCAC-3’
3’IGHMプライマー(配列番号177)
5’-TCCAGGACAAAGTGATGGAGTC-3’
5’-GTGTGGTGGTACGGGAATTCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
3’IGHJ1プライマー(配列番号179)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGG-3’
3’IGHJ2プライマー(配列番号180)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGTC-3’
3’IGHJ3プライマー(配列番号181)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3’
5’-AGGGTCAGAGGCCAAAGGATGG-3’
3’IGLCプライマー(配列番号183)
5’-CTTGGAGCTCCTCAGAGGAG-3’
3’IGKJ1プライマー(配列番号184)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’
3’IGKJ2プライマー(配列番号185)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’
3’IGKJ3プライマー(配列番号186)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’
3’IGKJ4プライマー(配列番号187)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’
3’IGLJ1プライマー(配列番号188)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’
3’IGLJ2プライマー(配列番号189)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’
3’IGLJ4プライマー(配列番号190)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAAAATGATCAGCTGGGTTCC-3’
3’IGLJ5プライマー(配列番号191)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTCAGCTCGGTCCC-3’
3’IGLJ7プライマー(配列番号192)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3’
Plat−A細胞(国立大学法人東京大学医科学研究所 北村俊雄先生より分与)に、トランスフェクション試薬(TransIT293、Takara Bio社製)を用い、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入し、エコトロピックレトロウイルス(Ecotropic retrovirus)を含む培養上清を調製した。前記Plat−A細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS)、1μg/mLピューロマイシン、10μg/mLブラストサイジン含有DMEM培地で維持したものを使用した。つぎに、前記エコトロピックウイルスを含む培養上清を添加することにより、パッケージング細胞であるPG13細胞にhH-3M4E4L CARライブラリを導入し、hH-3M4E4L CARライブラリを含むGaLV-pseudotypedレトロウイルスを調製した。そして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスをヒト末梢血T細胞に感染させることにより、CAR−Tを調製した。PG13細胞の培地の組成は、10%FCS含有DMEM培地とし、培養条件は、37℃、5%CO2とし、湿潤雰囲気下とした。以下、特に言及しない限り細胞の培養条件は同様とした。
レトロウイルスを用いて、HLA-A*02:01をコードする核酸と、CD80、CD83、CD40、および4−1BBLをコードする核酸とを、K562細胞(HLAおよびCD19の発現無し、ATCCより入手)に導入し、抗原提示細胞(APC、K562/A2)とした。
5'-ATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCTCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACGCCCCCAAAACGCATATGACTCACCACGCTGTCTCTGACCATGAAGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGAGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTTTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCTTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTG-3'
5'-ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTTCCCAAGATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCAAGCAAGAGCATTTTCCTGATAACCTGCTCCCATCCTGGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCTTTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCCCTGTA-3'
5'-ATGTCGCGCGGCCTCCAGCTTCTGCTCCTGAGCTGCGCCTACAGCCTGGCTCCCGCGACGCCGGAGGTGAAGGTGGCTTGCTCCGAAGATGTGGACTTGCCCTGCACCGCCCCCTGGGATCCGCAGGTTCCCTACACGGTCTCCTGGGTCAAGTTATTGGAGGGTGGTGAAGAGAGGATGGAGACACCCCAGGAAGACCACCTCAGGGGACAGCACTATCATCAGAAGGGGCAAAATGGTTCTTTCGACGCCCCCAATGAAAGGCCCTATTCCCTGAAGATCCGAAACACTACCAGCTGCAACTCGGGGACATACAGGTGCACTCTGCAGGACCCGGATGGGCAGAGAAACCTAAGTGGCAAGGTGATCTTGAGAGTGACAGGATGCCCTGCACAGCGTAAAGAAGAGACTTTTAAGAAATACAGAGCGGAGATTGTCCTGCTGCTGGCTCTGGTTATTTTCTACTTAACACTCATCATTTTCACTTGTAAGTTTGCACGGCTACAGAGTATCTTCCCAGATTTTTCTAAAGCTGGCATGGAACGAGCTTTTCTCCCAGTTACCTCCCCAAATAAGCATTTAGGGCTAGTGACTCCTCACAAGACAGAACTGGTA-3'
5'-ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCCCTGGTGGTGATCCCCATCATCTTCGGGATCCTGTTTGCCATCCTCTTGGTGCTGGTCTTTATCAAAAAGGTGGCCAAGAAGCCAACCAATAAGGCCCCCCACCCCAAGCAGGAACCCCAGGAGATCAATTTTCCCGACGATCTTCCTGGCTCCAACACTGCTGCTCCAGTGCAGGAGACTTTACATGGATGCCAACCGGTCACCCAGGAGGATGGCAAAGAGAGTCGCATCTCAGTGCAGGAGAGACAG-3'
5'-ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA-3'
前記(3)の第1の候補CAR−Tと、前記(4)で調製したAPCとを用いて、スクリーニングを行なった。具体的には、2×106第1の候補CAR−Tと、1×105APCとを各ウェル(24ウェルプレート)に播種後、7日間共培養した。前記APCは、20Gyでγ線処理後、1〜10μg/mLでNY-ESO-1157-165ペプチド(NY-ESO-1157ペプチド、SLLMWITQC:配列番号206)をパルスし、前記パルス後にHLA-A*02:01に結合していないペプチドを除去した細胞を用いた。また、前記第1の候補CAR−TとAPCとの共培養に用いた培地の組成は、50μg/mLゲンタマイシン、10%ヒトAB血清(Sigma社製)、10IU/mL ヒトIL−2(Roche社製)、および10ng/mL ヒトIL−15(PeproTech社製)含有RPMI1640培地とした。前記共培養後、第1の候補CAR−Tを回収し、同様の条件でAPCとの共培養をさらに2回(合計3回)実施した。これにより、A2/NY-ESO-1157と結合するhH-3M4E4L CARを発現する第1の候補CAR−Tを富化した。
5'-ATCCCAGTGTGGTGGTACGGG-3'
リバースプライマー1(配列番号200)
5'-GGGTACATCACTTCGATTGC-3'
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、pMX/H1-3M4E5L発現ベクターまたはpMX/H73-3M4E5L発現ベクターを用いた以外は、前記(3)と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Jurkat76細胞にpMX/H1-3M4E5L発現ベクターまたはpMX/H73-3M4E5L発現ベクターを導入し、scFvとしてH1-3M4E5LまたはH73-3M4E5Lを含むCAR(H1-3M4E5L CARまたはH73-3M4E5L CAR)を発現させた。前記CAR発現後のJurkat76細胞を、前記PE標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗PEマイクロビーズを用いて、H1-3M4E5L CARおよびH73-3M4E5L CARを発現するJurkat76細胞(H1-3M4E5L CAR-TまたはH73-3M4E5L CAR T)を精製した。H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tについて、5μg/mL PE標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後のH1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tについて、フローサイトメトリーにより解析した。ポジティブコントロールは、pMX/H1-3M4E5L発現ベクターまたはpMX/H73-3M4E5L発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、pMX/H1-3M4E5L発現ベクターまたはpMX/H73-3M4E5L発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。FSC+SSC+NGFR+細胞にゲートをかけた結果を図2に示す。
つぎに、前記(6)で得られたH1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tと、3M4E5LH CARを発現するJurkat76細胞(3M4E5LH CAR-T)について、所定濃度(0.0004194304、0.001048576、0.00262144、0.0065536、0.016384、0.04096、0.1024、0.256、0.64、1.6、4、または10μg/mL)のPE標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した以外は、前記(6)と同様にして、フローサイトメトリーにより解析した。そして、A2/NY-ESO-1157テトラマーの各濃度における、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を算出した。この結果を、図3に示す。
つぎに、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tが、前記標的抗原との結合により、活性化するかを検討した。具体的には、3×105細胞のH1-3M4E5L CAR-TまたはH73-3M4E5L CAR-Tと、5×104細胞のT2細胞とを各ウェル(96ウェルプレート)に播種後、5時間共培養した。前記T2細胞(HLA-A*02:01発現細胞)は、所定濃度(0.0005、0.0015、0.004、0.01、0.04、0.122、0.366、1.11、3.33または10μg/mL)でNY-ESO-1157ペプチドをパルスした細胞(T2 + NY-ESO-1157)を用いた。また、前記共培養の培養液は、10%FCS含有RPMI1640培地とした。前記共培養後、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb(clone:FN50)およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後のH1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、NGFR+細胞について、CD69の平均蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールは、前記(6)で得られた3M4E5HL CAR-Tを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、NY-ESO-1157ペプチドに代えて、HIV Gag77-85ペプチドをパルスしたT2細胞(T2 + HIV Gag77)を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、pMX/H1-3M4E5L発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、各ペプチドの濃度について、コントロール2におけるCD69の平均蛍光強度を基準として、各サンプルのCD69の発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図4および5に示す。
第1のCARライブラリからスクリーニングされた重鎖可変領域(HA)を用いて、第2のCARライブラリを調製した。具体的には、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸が導入されたpMX発現ベクターについて、重鎖可変領域(3M4E5H)をコードする核酸を、重鎖可変領域(HA)をコードする核酸で置換した(3M4E5L-H1発現ベクター)。つぎに、3M4E5L-H1発現ベクターについて、軽鎖可変領域(3M4E5L)をコードする核酸を、前記(2)の軽鎖可変領域をコードする核酸のライブラリで置換した。これにより、第2のCARライブラリを含む発現ベクター(hK-H1 CARライブラリの発現ベクター)を調製した。なお、hK-H1 CARライブラリにおける重鎖可変領域の不均一性(heterogeneity)は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約1×106種類であることを確認した。
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hK-H1 CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記(3)と同様にして、hK-H1 CARライブラリが導入されたT細胞を精製し、これを第2の候補CAR−Tとした。
つぎに、前記第1の候補CAR−Tに代えて、前記第2の候補CAR−Tを用いた以外は、前記(5)と同様にして、A2/NY-ESO-1157と結合するCARを発現する第2の候補CAR−Tの存在を確認した(donor 1)。同様の試験を、異なる健常者由来のヒト末梢血B細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリを用いて実施した(donor 2)。また、ポジティブコントロールは、hK-H1 CARライブラリの発現ベクターに代えて、pMX/3M4E5L-H1発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、hH-3M4E5L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。FSC+SSC+NGFR+細胞にゲートをかけた結果を図6に示す。
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターのscFvをコードするポリヌクレオチドに代えて、前記(11)の各scFvをコードするポリヌクレオチドが導入されたpMX/CAR発現ベクターを用いた以外は、前記(3)と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Jurkat76細胞に各scFvをコードするポリヌクレオチドが導入されたpMX/CAR発現ベクターを導入し、scFvとしてK52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1、またはK173-H1を含むCARを発現させた。前記CAR発現後のJurkat76細胞を、前記PE標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗PEマイクロビーズを用いて、各CARを発現するJurkat76細胞を精製した。精製された各CARを発現するJurkat76細胞について、5μg/mL PE標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CARを発現するJurkat76細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。また、各scFvを導入されたpMX/CAR発現ベクターに代えて、pMX/H1-3M4E5L発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。ポジティブコントロールは、各scFvを導入されたpMX/CAR発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、各scFvを導入されたpMX/CAR発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。NGFR+細胞にゲートをかけた結果を図7(A)および(B)に示す。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、A2/NY-ESO-1157に結合するscFvをスクリーニングできることを確認した。
前記実施例1(1)の3M4E5LH scFvをコードする核酸の5’側の軽鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血B細胞由来の軽鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hL-3M4E4H scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5LH scFvをコードする核酸に代えて、hL-3M4E4H scFvライブラリを用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、タグが付加されたhL-3M4E4H CARライブラリを調製した。タグが付加されたhL-3M4E4H CARライブラリを、pMX発現ベクターに導入し、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hL-3M4E4H CARライブラリの重鎖可変領域の不均一性は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで確認した。
前記hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記実施例1(3)と同様にして、hL-3M4E4H CARライブラリが導入されたT細胞を精製し、これを第1の候補CAR−Tとした。
前記実施例1(3)の第1の候補CAR−Tに代えて、前記実施例2(2)の第1の候補CAR−Tを用いた以外は、前記実施例1(5)と同様にして、A2/NY-ESO-1157と結合するCARを発現する第1の候補CAR−Tの存在を確認した(donor 1)。同様の試験を、異なる健常者由来のヒト末梢血B細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリを用いて実施した(donor 2)。また、ポジティブコントロールは、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。FSC+SSC+NGFR+細胞にゲートをかけた結果を図8に示す。
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターのscFvをコードするポリヌクレオチドに代えて、前記実施例2(3)の各scFvをコードするポリヌクレオチドが導入されたpMX/CAR発現ベクターを用いた以外は、前記実施例1(3)と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Jurkat76細胞に各scFvをコードするポリヌクレオチドが導入されたpMX/CAR発現ベクターを導入し、scFvとしてL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むCARを発現させた。前記CAR発現後のJurkat76細胞を、前記PE標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗PEマイクロビーズを用いて、各CARを発現するJurkat76細胞を精製した。精製された各CARを発現するJurkat76細胞について、5μg/mL PE標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CARを発現するJurkat76細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。ポジティブコントロールは、各scFvを導入されたpMX/CAR発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、各scFvを導入されたpMX/CAR発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。NGFR+細胞にゲートをかけた結果を図9に示す。
つぎに、前記実施例2(4)で得られたL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むCARを発現するJurkat76細胞と、3M4E5LH CAR-Tについて、所定濃度(0.0004194304、0.001048576、0.00262144、0.0065536、0.016384、0.04096、0.1024、0.256、0.64、1.6、4、または10μg/mL)のPE標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した以外は、前記(6)と同様にして、フローサイトメトリーにより解析した。そして、A2/NY-ESO-1157テトラマーの各濃度における、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を算出した。この結果を、図10に示す。
つぎに、scFvとしてL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を発現するCAR-Tが、前記標的抗原との結合により、活性化するかを検討した。具体的には、3×105細胞の各CAR-Tと、5×104細胞のT2細胞とを各ウェル(96ウェルプレート)に播種後、5時間共培養した。前記T2細胞(HLA-A*02:01発現細胞)は、所定濃度(0.0005、0.0015、0.004、0.01、0.04、0.122、0.366、1.11、3.33または10μg/mL)でNY-ESO-1157-165ペプチドをパルスした細胞(T2 + NY-ESO-1157)を用いた。また、前記共培養の培養液は、10%FCS含有RPMI1640培地とした。前記共培養後、各CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb(clone:FN50)およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、NGFR+細胞について、CD69の平均蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールは、pMX/H1-3M4E5L発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、NY-ESO-1157-165ペプチドに代えて、HIV Gag77-85ペプチドをパルスしたT2細胞(T2 + HIV Gag77)を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、前記発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、コントロール2におけるCD69の平均蛍光強度を基準として、各サンプルのCD69の発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図11に示す。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、CD19に結合するscFvをスクリーニングできることを確認した。
前記A2/NY-ESO-1157特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に代えて、ヒトCD19特異的抗体(clone:FMC63)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、FMC63HL scFvまたはFMC63LH scFvをコードする核酸を調製し、3’末端にタグを付加したタグ付加FMC63HL CARおよびタグ付加FMC63LH CARをコードする核酸を取得した。各核酸は、pMX発現ベクターに導入した。
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
5'-GAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGACTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACAGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCTCGGAAAGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTTACAGTGTCCTCGGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGATATCCAGATGACCCAGACAACAAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACA-3'
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
5'-GATATCCAGATGACCCAGACAACAAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGACTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACAGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCTCGGAAAGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTTACAGTGTCCTCG-3'
前記実施例3(1)のFMC63HL scFvをコードする核酸の5’側の重鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血B細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hH-FMC63L scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5LH scFvをコードする核酸に代えて、hH-FMC63L scFvライブラリを用いた以外は、前記実施例1(1)と同様にして、タグが付加されたhH-FMC63L CARライブラリを調製した。タグが付加されたhH-FMC63L CARライブラリを、pMX発現ベクターに導入し、hH-FMC63L CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hH-FMC63L CARライブラリの重鎖可変領域の不均一性は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約1×106種類であることを確認した。
前記hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hH-FMC63L CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記実施例1(3)と同様にして、hH-FMC63L CARライブラリが導入されたT細胞を精製し、これを第1の候補CAR−Tとした。
レトロウイルスを用いて、ヒトCD19をコードする核酸を、K562細胞に導入し、抗原提示細胞(APC−CD19)とした。
5'-ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGGAGGAAAAGAAAGCGAATGACTGACCCCACCAGGAGATTCTTCAAAGTGACGCCTCCCCCAGGAAGCGGGCCCCAGAACCAGTACGGGAACGTGCTGTCTCTCCCCACACCCACCTCAGGCCTCGGACGCGCCCAGCGTTGGGCCGCAGGCCTGGGGGGCACTGCCCCGTCTTATGGAAACCCGAGCAGCGACGTCCAGGCGGATGGAGCCTTGGGGTCCCGGAGCCCGCCGGGAGTGGGCCCAGAAGAAGAGGAAGGGGAGGGCTATGAGGAACCTGACAGTGAGGAGGACTCCGAGTTCTATGAGAACGACTCCAACCTTGGGCAGGACCAGCTCTCCCAGGATGGCAGCGGCTACGAGAACCCTGAGGATGAGCCCCTGGGTCCTGAGGATGAAGACTCCTTCTCCAACGCTGAGTCTTATGAGAACGAGGATGAAGAGCTGACCCAGCCGGTCGCCAGGACAATGGACTTCCTGAGCCCTCATGGGTCAGCCTGGGACCCCAGCCGGGAAGCAACCTCCCTGGGGTCCCAGTCCTATGAGGATATGAGAGGAATCCTGTATGCAGCCCCCCAGCTCCGCTCCATTCGGGGCCAGCCTGGACCCAATCATGAGGAAGATGCAGACTCTTATGAGAACATGGATAATCCCGATGGGCCAGACCCAGCCTGGGGAGGAGGGGGCCGCATGGGCACCTGGAGCACCAGG-3'
前記実施例3(3)の第1の候補CAR−Tと、前記実施例3(4)で調製したAPC−CD19とを用いて、スクリーニングを行なった。具体的には、2×106第1の候補CAR−Tと、1×105APC−CD19とを各ウェル(24ウェルプレート)に播種後、7日間共培養した。前記APC−CD19は、20Gyでγ線処理した細胞を用いた。また、前記第1の候補CAR−TとAPC−CD19との共培養に用いた培地の組成は、50μg/mLゲンタマイシン、10%ヒトAB血清(Sigma社製)、10IU/mL ヒトIL−2(Roche社製)、および10ng/mL ヒトIL−15(PeproTech社製)含有RPMI1640培地とした。前記共培養後、第1の候補CAR−Tを回収し、同様の条件でAPC−C19との共培養をさらに2回(合計3回)実施した。これにより、ヒトCD19と結合するhH-FMC63L CARを発現する第1の候補CAR−Tを富化した。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたCARが、標的抗原に対して高い特異性を有することを確認した。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたCARが、スクリーニングに用いた標的抗原に結合する抗体と異なる抗原認識性を示すことを確認した。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたCARについて、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との順序を交換しても、抗原認識性を維持することを確認した。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたCARが、スクリーニングに用いた標的抗原に結合する抗体と異なる抗原認識性を示すことおよびCARにおけるscFvの交差反応性を制御しながらスクリーニングできることを確認した。
前記実施例6と同様にして、3M4E5H-L1 CARを発現するCD8陽性T細胞およびCD4陽性T細胞を作製した。つぎに、3×105細胞のT細胞と、5×104細胞のT2細胞とを各ウェル(96ウェルプレート)に播種後、5時間共培養した。前記T2細胞(HLA-A*02:01発現細胞)は、10μg/mLでNY-ESO-1157ペプチドまたはNY-ESO-1157ペプチドの変異ペプチドをパルスした細胞(T2 + NY-ESO-1157)を用いた。前記変異ペプチドは、NY-ESO-1157ペプチドのアミノ酸配列において、各アミノ酸を1つずつアラニンに置換したペプチドである。前記共培養後、培養上清を回収し、前記実施例4と同様にして、CAR-TにおけるIL−2の産生量を測定した。コントロールは、3M4E5LH CARを発現するCD8陽性T細胞またはCD4陽性T細胞を用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、A2/NY-ESO-1157ペプチドに代えて、A2/HIV-Gag77ペプチドを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、発現ベクターを導入しなかったCD8陽性T細胞またはCD4陽性T細胞を用いた以外は、同様にして実施した。そして、コントロール2におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図20に示す。
前記実施例7(1)で示したように、3M4E5LH CARは、NY-ESO-1157ペプチドの160〜162番のアミノ酸を認識するのに対して、3M4E5H-L1 CARは、NY-ESO-1157ペプチドの158および160〜162番、164番目のアミノ酸を認識する。3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARの他のペプチドに対する交差反応性を検討するため、HLA−A*02:01に結合し、かつ3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARと交差反応しうるペプチドを含むヒトタンパク質について、アルゴリズム(netMHC4.0、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)を用いて予測した。タンパク質のデータベースとしては、uniprotKB/swissprotを用いた。また、得られたタンパク質におけるペプチドにおいて、NY-ESO-1157ペプチドと相同性が高い相同ペプチド(homologous peptide)を、アルゴリズム(ScanProsit、https://prosite.expasy.org/scanprosite/)を用いて絞り込んだ。その結果、交差反応しうるペプチド(配列番号207:GLRMWIKQV)を含む、Lysophospholipase-like protein 1(LYPLAL1)タンパク質がヒットした。そこで、K562細胞に、LYPLAL1タンパク質を発現させ、3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARの交差反応性を検討した。
5'-ATGGCGGCTGCATCTGGAAGCGTGCTGCAGAGATGTATCGTGTCCCCAGCCGGCAGACATAGCGCCAGCCTGATTTTTCTGCACGGCAGCGGCGATTCTGGCCAGGGACTGAGAATGTGGATCAAACAGGTGCTGAACCAGGACCTGACCTTCCAGCACATCAAGATCATCTACCCCACCGCTCCACCTCGGAGCTACACACCTATGAAGGGCGGCATCAGCAACGTTTGGTTCGACCGGTTCAAGATCACCAACGACTGCCCCGAGCACCTGGAATCCATCGACGTGATGTGTCAGGTGCTCACCGACCTGATCGACGAGGAAGTGAAGTCCGGCATCAAGAAGAACAGAATCCTGATCGGCGGCTTCAGCATGGGCGGCTGTATGGCCATTCACCTGGCCTACAGAAACCACCAGGATGTGGCTGGCGTGTTCGCCCTGAGCAGCTTTCTGAACAAAGCCAGCGCCGTGTATCAGGCCCTGCAGAAATCTAACGGCGTGCTGCCTGAGCTGTTCCAGTGTCATGGCACAGCCGATGAGCTGGTGCTGCACTCTTGGGCCGAAGAGACAAATAGCATGCTGAAAAGCCTGGGCGTGACCACCAAGTTCCACAGCTTCCCCAACGTGTACCACGAGCTGAGCAAGACCGAGCTGGACATCCTGAAACTGTGGATTCTGACCAAGCTGCCCGGCGAGATGGAAAAGCAGAAG-3'
5'-ATGCAGGCCGAAGGCCGGGGCACAGGGGGTTCGACGGGCGATGCTGATGGCCCAGGAGGCCCTGGCATTCCTGATGGCCCAGGGGGCAATGCTGGCGGCCCAGGAGAGGCGGGTGCCACGGGCGGCAGAGGTCCCCGGGGCGCAGGGGCAGCAAGGGCCTCGGGGCCGGGAGGAGGCGCCCCGCGGGGTCCGCATGGCGGCGCGGCTTCAGGGCTGAATGGATGCTGCAGATGCGGGGCCAGGGGGCCGGAGAGCCGCCTGCTTGAGTTCTACCTCGCCATGCCTTTCGCGACACCCATGGAAGCAGAGCTGGCCCGCAGGAGCCTGGCCCAGGATGCCCCACCGCTTCCCGTGCCAGGGGTGCTTCTGAAGGAGTTCACTGTGTCCGGCAACATACTGACTATCCGACTGACTGCTGCAGACCACCGCCAACTGCAGCTCTCCATCAGCTCCTGTCTCCAGCAGCTTTCCCTGTTGATGTGGATCACGCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTTTTGGCTCAGCCTCCCTCAGGGCAGAGGCGC-3'
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたCARについて、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との順序を交換することで、抗原特異性が変化することを確認した。
本発明の第1のスクリーニング方法により、標的抗原における認識部位が異なるscFvをスクリーニングできることを確認した。
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNLGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGSTTRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAGVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
5'-CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACCTCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAGCACCACTCGGCCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGGGGTGTTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNNWPPKFTFGPGTKVDIRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGAAATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAGAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、CD19に結合するscFvをスクリーニングできることを確認した。
ヒトCD19特異的抗体であるFMC63の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に代えて、ヒトCD19特異的抗体(clone18(国際公開第2016/033570号参照))の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いた以外は、前記実施例3(1)と同様にして、clone18 scFvまたはclone18 scFvをコードする核酸を調製した。各核酸は、pMX発現ベクターに導入した。なお、各scFvにおける重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を下線で示す。
QSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCCSYAGRYNSVLFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
5'-CAATCTGCTCTGACACAGCCTAGAAGCGTGTCCGGCTTTCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCACCTCCGATGACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCTGGCAAAGCCCCTCAGCTGATGCTGTACGACGTGTCCAAAAGACCTAGCGGCGTGCCCCACAGATTCAGCGGATCTAGAAGTGGCAGAGCCGCCAGCCTGATCATCTCTGGACTGCAGACAGAGGACGAGGCCGACTACTTCTGCTGTAGCTACGCCGGCAGATACAACAGCGTGCTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGACAGTGCTGGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCT-3'
前記実施例10(1)のclone18LH scFvをコードする核酸の5’側の軽鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血B細胞由来の軽鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5LH scFvをコードする核酸に代えて、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを用いた以外は、前記実施例1(2)と同様にして、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを調製した。つぎに、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを、実施例1(1)のヒトCD28の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸と、ヒトCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸とが、各ライブラリの3’端側にこの順番で配置されるようにpMX発現ベクターに導入し、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARの軽鎖可変領域の不均一性は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約1×106種類であることを確認した。
前記hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記実施例1(3)と同様にして、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリが導入されたT細胞を精製し、これを第1の候補CAR−Tとした。
前記実施例3(4)と同様にして、レトロウイルスを用いて、ヒトCD19をコードする核酸を、K562細胞に導入し、抗原提示細胞(APC−CD19)とした。
前記実施例10(3)の第1の候補CAR−Tと、前記実施例10(4)で調製したAPC−CD19とを用いた以外は、前記実施例3(5)と同様にして、ヒトCD19と結合するhK-clone18H CARまたはhL-clone18H CARを発現する第1の候補CAR−Tを富化した。
hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターに代えて、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いた以外は、前記実施例10(3)と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Jurkat76細胞に各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入し、scFvとしてL4-18H、L7-18H、L9-18H、L13-18H、L14-18H、L16-18H、L17-18H、L22-18H、K4-18H、K5-18H、K6-18H、K9-18H、またはK10-18Hを含む各CAR(L4-18H CAR、L7-18H CAR、L9-18H CAR、L13-18H CAR、L14-18H CAR、L16-18H CAR、L17-18H CAR、L22-18H CAR、K4-18H CAR、K5-18H CAR、K6-18H CAR、K9-18H CAR、またはK10-18H CAR)を発現させた。前記CAR発現後のJurkat76細胞を、前記PE標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗PEマイクロビーズを用いて、各CARを発現するJurkat76細胞(L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T、またはK10-18H CAR-T)を精製した。各CARを発現するJurkat76細胞について、前記実施例10(5)と同様にして染色した。前記染色後の各CARを発現するJurkat76細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。ポジティブコントロールは、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに代えて、タグ付加clone18LH CARまたはclone18HL CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、CD19ダイマーで染色しなかった以外は同様にして実施した。コントロール2は、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。FSC+SSC+NGFR+細胞にゲートをかけた結果を図28および29に示す。
つぎに、前記実施例10(6)で得られた各CAR-Tが、前記標的抗原との結合により、活性化するかを検討した。具体的には、2×105細胞の各CAR-Tと、5×104細胞の抗原提示細胞(APC−CD19またはRaji細胞)とを各ウェル(96ウェルプレート)に播種後、5時間共培養した。前記抗原提示細胞(APC−CD19)は、前記実施例10(4)と同様にして調製した。また、前記共培養の培養液は、10%FCS含有RPMI1640培地とした。前記共培養後、各CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb(clone:FN50)およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、NGFR+細胞について、CD69の平均蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールは、前記実施例10(6)で得られたclone18LH CAR-Tおよびclone18HL CAR-Tを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール1は、CD19をコードする核酸を導入していないK562細胞を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、共培養前のCD69の平均蛍光強度を基準として、各サンプルのCD69の発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図30に示す。
つぎに、前記実施例10(6)で得られたL4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、およびK9-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tが、前記標的抗原との親和性の違いを検討した。各CAR-Tについて、所定濃度(1.25、2.5、5、10、20、または40μg/mL)のPE標識CD19ダイマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した以外は、前記実施例10(6)と同様にして、フローサイトメトリーにより解析した。そして、CD19ダイマーの各濃度における、CD19ダイマー陽性細胞の割合を算出後、40μg/mLのCD19ダイマーで染色した際のCD19ダイマー陽性細胞の割合を基準として、各CD19ダイマーで染色した際のCD19ダイマー陽性細胞の相対割合を算出した。この結果を、図31に示す。
つぎに、前記(6)で得られたL4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、およびK9-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tが、前記標的抗原を発現する細胞に対する応答性の違いを検討した。具体的には、2×105細胞の各CAR-Tと、5×104細胞の抗原提示細胞(APC−CD19)とK562細胞との混合細胞とを各ウェル(96ウェルプレート)に播種後、5時間共培養した。前記混合細胞におけるAPC−CD19(A)とK562(K)との比率(A:K)は、所定比率(0:100、6.25:93.75、12.5:87.5、50:50、100:0)とした。前記共培養後、各CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb(clone:FN50)およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、NGFR+細胞について、CD69陽性細胞の割合を測定した。比率(A:K)=100:0におけるCD69陽性細胞の割合を基準として、各比率(A:K)で培養した際のCD69陽性細胞の相対割合(% Maximal responses)を算出した。また、これらの結果を図32に示す。
つぎに、前記(6)で得られたL4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、およびK9-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tが、前記標的抗原との結合により、サイトカイン産生するかを検討した。具体的には、3×105細胞の各CAR-Tと、5×104細胞の抗原提示細胞(APC−CD19またはRaji細胞)とを各ウェル(96ウェルプレート)に播種後、5時間共培養した。前記抗原提示細胞(APC−CD19)は、前記実施例10(4)と同様にして調製した。また、前記共培養の培養液は、10%FCS含有RPMI1640培地とした。前記培養後、5μmol/LとなるようにBFAを添加し、さらに5時間培養した。そして、培養後の細胞を、1%PFAで固定後、細胞膜の透過処理を行った。さらに、APC標識anti-human IL-2 mAb(clone:MQ1-17H12)、PE標識anti-human TNFα mAb(clone:Mab11)、PC7標識anti-human IFN-γ mAb(clone:B27)、FITC標識anti-human CD4 mAb (clone:OKT4)、PC5標識anti-human CD8a mAb (clone:B9.11)、およびV450標識anti-human NGFR mAb(clone:C40-1457)で染色した。前記染色後の細胞について、前記フローサイトメーターで測定した。そして、サイトカイン発現の割合を算出した。ポジティブコントロールは、前記実施例10(6)で得られたclone18LH CAR-Tを用いた以外は、同様に実施した。コントロール1は、CD19をコードする核酸を導入していないK562細胞を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール2は、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。これらの結果を図33に示す。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたscFvを含むCARが、in vivoで抗腫瘍効果を発揮することを確認した。
MEEENIVNGDRPRDLVFPGTAGLQLYQSLYKYSYITDGIIDAHTNEVISYAQIFETSCRLAVSLEKYGLDHNNVVAICSENNIHFFGPLIAALYQGIPMATSNDMYTEREMIGHLNISKPCLMFCSKKSLPFILKVQKHLDFLKKVIVIDSMYDINGVECVFSFVSRYTDHAFDPVKFNPKEFDPLERTALIMTSSGTTGLPKGVVISHRSITIRFVHSSDPIYGTRIAPDTSILAIAPFHHAFGLFTALAYFPVGLKIVMVKKFEGEFFLKTIQNYKIASIVVPPPIMVYLAKSPLVDEYNLSSLTEIACGGSPLGRDIADKVAKRLKVHGILQGYGLTETCSALILSPNDRELKKGAIGTPMPYVQVKVIDINTGKALGPREKGEICFKSQMLMKGYHNNPQATRDALDKDGWLHTGDLGYYDEDRFIYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELENLLLQHPNISDAGVIGIPDEFAGQLPSACVVLEPGKTMTEKEVQDYIAELVTTTKHLRGGVVFIDSIPKGPTGKLMRNELRAIFAREQAKSKLRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNS
5'-ATGGAAGAAGAGAACATCGTGAATGGCGATCGCCCTCGGGATCTGGTGTTCCCTGGCACAGCCGGCCTGCAGCTGTATCAGTCCCTGTATAAATACTCTTACATCACCGACGGAATCATCGACGCCCACACCAACGAGGTGATCTCCTATGCCCAGATTTTCGAAACAAGTTGCCGCCTGGCCGTGAGCCTGGAGAAGTATGGCCTGGATCACAACAACGTGGTGGCCATTTGCAGCGAGAACAACATCCACTTCTTCGGCCCTCTGATCGCTGCCCTATACCAGGGGATTCCAATGGCCACATCCAACGATATGTACACCGAGAGGGAGATGATCGGCCACCTGAACATCTCCAAGCCATGTCTGATGTTCTGTTCCAAGAAGTCCCTGCCATTCATCCTGAAGGTGCAGAAGCACCTGGACTTTCTCAAGAAGGTGATCGTGATCGACAGCATGTACGACATCAACGGCGTGGAGTGCGTGTTCAGTTTCGTGTCCCGGTACACCGATCATGCGTTCGATCCAGTGAAGTTCAACCCTAAAGAGTTTGATCCCCTGGAGAGAACCGCGCTGATCATGACATCCTCTGGAACAACCGGCCTGCCTAAGGGCGTGGTGATCAGCCACAGGAGCATCACCATCAGATTCGTCCACAGCAGCGATCCCATCTACGGCACCCGCATCGCCCCAGATACATCCATCCTGGCCATCGCCCCTTTCCACCACGCCTTCGGACTGTTTACCGCCCTGGCTTACTTTCCAGTGGGCCTGAAGATCGTGATGGTGAAAAAGTTTGAGGGCGAGTTCTTCCTGAAGACCATCCAGAACTACAAGATCGCTTCTATCGTGGTGCCTCCTCCAATCATGGTGTATCTGGCCAAGAGCCCTCTGGTGGATGAGTACAATCTGTCCAGCCTGACAGAGATCGCCTGTGGCGGCTCCCCTCTGGGCAGAGACATCGCCGACAAGGTGGCCAAGAGACTGAAGGTCCACGGCATCCTGCAGGGCTATGGCCTGACCGAGACCTGTAGCGCCCTGATCCTGAGCCCCAACGATAGAGAGCTGAAGAAGGGCGCCATCGGCACCCCTATGCCCTATGTCCAGGTGAAGGTGATTGACATCAACACCGGCAAAGCCCTGGGACCAAGAGAGAAGGGCGAGATTTGCTTCAAGAGCCAGATGCTGATGAAGGGCTACCACAACAACCCACAGGCCACCAGGGATGCCCTGGACAAGGACGGGTGGCTGCACACCGGCGATCTGGGCTACTACGACGAGGACAGATTCATCTATGTGGTGGATCGGCTGAAAGAACTCATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAGCTGGAGAACTTGCTTCTGCAGCACCCTAACATCTCTGATGCCGGCGTCATCGGCATCCCAGACGAGTTTGCCGGCCAGCTGCCTTCCGCCTGTGTCGTGCTGGAGCCTGGCAAGACCATGACCGAGAAGGAGGTGCAGGATTATATCGCCGAGCTGGTGACCACCACCAAGCACCTGCGGGGCGGCGTGGTGTTCATCGACAGCATTCCGAAAGGCCCAACAGGCAAGCTGATGAGAAACGAGCTGAGGGCCATCTTTGCCCGCGAGCAGGCCAAGTCCAAGCTGAGGGCCAAGCGGTCCGGATCCGGAGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCATGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGCTGA-3'
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法の第1の選抜工程および第2の選抜工程において、間接的な評価方法に基づく選抜、すなわち、標的抗原とCARとの結合により生じる候補免疫細胞の活性化指標の評価に基づく選抜により、CA−T細胞を機能的に活性化しうるscFvを含むCARをスクリーニング出来ることを確認した。
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたscFvを含むCARが、in vitroで細胞傷害活性を発揮することを確認した。
K=(LE−LS)/(LMax−LS)×100(%) ・・・(1)
K:細胞傷害性
LE:CPMの測定値
LS:ターゲット細胞のみの場合のCPMの測定値
LMax:ターゲット細胞のみのウェルに0.2%Triton-X含有PBSを添加した場合のCPMの測定値
本発明のCARライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたscFvを含むCARが、in vivoで抗腫瘍効果を発揮することを確認した。
本発明のスクリーニング方法により、in vivoでの抗腫瘍効果に優れるscFvを取得できるメカニズムを検討した。
前記実施例10と同様にして、L17-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tとを調製した。つぎに、20Gyでγ線照射したAPC−CD19(K562/CD19)またはRaji細胞(Raji)(T)と、L17-18H CAR-Tまたはclone18LH CAR-T(E)とについて、E:Tが、1:1または10:1となるように、前記CAR−T細胞を培養しているウェルに、標的細胞を添加した。前記標的細胞添加時を基準として、5日間培養した。前記培養では、10U/mLのIL−2および10ng/mLのIL−15を培地に添加した。さらに、培養5日目において、培養開始時と同じ条件で、各CAR−T細胞を再刺激した。そして、培養開始時から所定時(0、3、5、7または10日)における細胞数をカウントし、培養開始時の細胞数を1とした際の細胞数比を増殖比として算出した。これらの結果を図39に示す。
前記実施例15(1)の培養10日目のL17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tのサイトカイン産生能について検討した。具体的には、3.0×105細胞のCAR−T細胞と、5.0×104個の標的細胞(K562細胞、Raji細胞、APC−CD19(K562/CD19)とを共培養した。2時間培養後、5μg/mLとなるように、Brefeldin A(BFA)を添加し、さらに、14〜18時間培養した。そして、CAR−T細胞を回収後、1%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定後、細胞膜の透過処理を行い、PE標識抗ヒトTNF−α抗体(clone MAb11)、APC標識抗ヒトIL−2抗体(clone MQ1-17H12)およびPC7標識抗ヒトIFN−γ抗体(clone B27)と、PC5標識抗ヒトCD8抗体(clone B9.11)、FITC標識抗CD4抗体(clone OKT4)およびV450標識anti-human NGFR(clone:C40-1457)で染色した。前記染色後のCAR−T細胞について、前記フローサイトメーターで測定し、各サイトカインを産生している細胞の割合を算出した。これらの結果を図40に示す。
前記実施例15(1)の培養10日目のL17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tの細胞傷害活性について検討した。つぎに、5.0×103個の標的細胞であるAPC−CD19(K562/CD19)またはRaji細胞(Raji)およびK562細胞について、クロム51(51Cr)存在下で、1.5時間培養することにより、クロム51でラベルした。
4人の異なるドナー(ヒト)由来のT細胞を用いた以外は、前記実施例10と同様にして、L17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tを調製した。得られたCAR−T細胞について、0.5μmol/L CFSEを含むPBS内で、15分間37℃でインキュベートし、CAR−T細胞をCFSEで標識した。つぎに、20Gyでγ線照射したRaji細胞(Raji)(T)と、L17-18H CAR-Tまたはclone18LH CAR-T(E)とについて、E:Tが、1:1または5:1となるように、それぞれをウェルに添加した。前記標的細胞添加時を基準として、3日間培養した。
Proliferation(%)=(control MFI-sample MFI)/control MFI×100 ・・・(2)
control MFI:K562細胞株とE:T=1:1の条件で共培養したCAR−T細胞のMFI
sample MFI:各CAR−T細胞のMFI
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
(付記1)
第1のキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含み、
前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、
前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、
前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たす、CARライブラリ;
条件1:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件2:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(付記2)
前記第1の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、付記1記載のCARライブラリ。
(付記3)
前記第1の膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインを含む、付記1または2記載のCARライブラリ。
(付記4)
前記第1のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、付記1から3のいずれかに記載のCARライブラリ。
(付記5)
付記1から4のいずれかに記載のCARライブラリを免疫細胞に発現させる第1の発現工程と、
前記第1の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第1の接触工程と、
前記第1の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するCARの第1のscFvを、前記標的抗原に結合する第1の候補scFvとして選抜する第1の選抜工程とを含む、scFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記6)
前記第1の候補scFvに基づき、第2のCARライブラリを調製する調製工程を含み、
前記第2のCARライブラリは、第2のCARをコードする核酸を含み、
前記第2のCARは、第2の抗原結合ドメインと、第2の膜貫通ドメインと、第2の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第2の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第2のscFvを含み、
前記第2のscFvは、第2の重鎖可変領域と、第2の軽鎖可変領域とを含み、
前記第2の重鎖可変領域および前記第2の軽鎖可変領域は、下記条件3または条件4を満たし、
さらに、前記第2のCARライブラリを免疫細胞に発現させる第2の発現工程と、
前記第2の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第2の接触工程と、
前記第2の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するCARの第2のscFvを、前記標的抗原に結合する第2の候補scFvとして第2の選抜工程とを含む、付記5記載の製造方法(スクリーニング方法);
条件3:
前記第1の発現工程におけるCARライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第1の候補scFvにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件4:
前記第1の発現工程におけるCARライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第1の候補scFvにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(付記7)
前記第2の接触工程を複数回実施する、付記6記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記8)
前記第2の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するscFvを、前記第2の候補scFvとして選抜する、付記6または7記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記9)
前記第2のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、付記6から8のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記10)
前記第1の接触工程を複数回実施する、付記5から9のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記11)
前記第1の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するscFvを、前記第1の候補scFvとして選抜する、付記5から10のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記12)
前記免疫細胞は、T細胞である、付記5から11のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記13)
下記(H)の重鎖可変領域と、下記(L)の軽鎖可変領域とを含む、HLA−A*02:01およびNY−ESO−1157−165の複合体に対する抗体またはその抗原結合断片。
(H)重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
CDRH1が、下記(H1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH2が、下記(H2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH3が、下記(H3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
(H1)下記(H1-1)、(H1-2)または(H1-3)のアミノ酸配列
(H1-1)前記表1AのCDRH1のいずれかのアミノ酸配列
(H1-2)(H1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-3)(H1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2)下記(H2-1)、(H2-2)または(H2-3)のアミノ酸配列
(H2-1)前記表1AのCDRH2のいずれかのアミノ酸配列
(H2-2)(H2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-3)(H2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3)下記(H3-1)、(H3-2)または(H3-3)のアミノ酸配列
(H3-1)前記表1AのCDRH3のいずれかのアミノ酸配列
(H3-2)(H3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-3)(H3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L)軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3を含み、
CDRL1が、下記(L1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL2が、下記(L2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL3が、下記(L3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
(L1)下記(L1-1)、(L1-2)または(L1-3)のアミノ酸配列
(L1-1)前記表1BのCDRL1のいずれかのアミノ酸配列
(L1-2)(L1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-3)(L1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2)下記(L2-1)、(L2-2)または(L2-3)のアミノ酸配列
(L2-1)前記表1BのCDRL2のいずれかのアミノ酸配列
(L2-2)(L2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-3)(L2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3)下記(L3-1)、(L3-2)または(L3-3)のアミノ酸配列
(L3-1)前記表1BのCDRL3のいずれかのアミノ酸配列
(L3-2)(L3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-3)(L3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(付記14)
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組合せが、前記表2のいずれかの組合せである、付記13記載の抗体またはその抗原結合断片。
(付記15)
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記抗原結合ドメインは、付記13または14記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。
(付記16)
前記抗原結合断片は、一本鎖抗体である、付記15記載のキメラ抗原受容体。
(付記17)
付記15または16記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
(付記18)
付記15または16記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。
(付記19)
前記細胞は、T細胞を含む、付記18記載の細胞。
(付記20)
付記17記載の核酸を細胞に導入する導入工程を含む、細胞の製造方法。
(付記21)
前記細胞は、T細胞を含む、付記20記載の細胞の製造方法。
(付記22)
第1の二重特異性抗体(BsAb)をコードする核酸を含み、
前記第1のBsAbは、第1の抗原結合ドメインと、第2の抗原結合ドメインとを含み、
前記第1の抗原結合ドメインは、第1の標的抗原に結合する第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、
前記第2の抗原結合ドメインは、第2の標的抗原への結合をスクリーニングする第2のscFvを含み、
前記第2のscFvは、第2の重鎖可変領域と、第2の軽鎖可変領域とを含み、
前記第2の重鎖可変領域および前記第2の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たし、
前記第1の標的抗原または前記第2の標的抗原は、免疫細胞活性化受容体である、BsAbライブラリ;
条件1:
前記第2の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第2の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件2:
前記第2の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第2の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(付記23)
前記第1のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、付記22記載のBsAbライブラリ。
(付記24)
前記免疫細胞活性化受容体は、CD3である、付記22または23記載のBsAbライブラリ。
(付記25)
付記22から24のいずれかに記載のBsAbライブラリから第1のBsAbを準備する第1の準備工程と、
前記第1の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第1のBsAbと、前記第2の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させ、
前記第2の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第1のBsAbと、前記第1の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる第1の接触工程と、
前記第1の接触工程において、前記第2の標的抗原と結合した第1のBsAbの第2のscFvを、前記第2の標的抗原に結合する第1の候補scFvとして選抜する第1の選抜工程とを含む、scFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記26)
前記第1の候補scFvに基づき、第2のBsAbライブラリを調製する調製工程を含み、
前記第2のBsAbライブラリは、前記第2のBsAbをコードする核酸を含み、
前記第2のBsAbは、第3の抗原結合ドメインと、第4の抗原結合ドメインとを含み、
前記第3の抗原結合ドメインは、前記第1の標的抗原に結合する第3のscFvを含み、
前記第4の抗原結合ドメインは、前記第2の標的抗原への結合をスクリーニングする第4のscFvを含み、
前記第4のscFvは、第4の重鎖可変領域と、第4の軽鎖可変領域とを含み、
前記第4の重鎖可変領域および前記第4の軽鎖可変領域は、下記条件3または条件4を満たし、
さらに、前記第2のBsAbライブラリから第2のBsAbを準備する第2の準備工程と、
前記第1の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第2のBsAbと、前記第2の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させ、
前記第2の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第2のBsAbと、前記第1の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる第2の接触工程と、
前記第2の接触工程において、前記第2の標的抗原と結合した第2のBsAbの第4のscFvを、前記第2の標的抗原に結合する第2の候補scFvとして選抜する第2の選抜工程とを含む、付記25記載のscFv製造方法(スクリーニング方法);
条件3:
前記第1の準備工程におけるBsAbライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第4の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第4の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第1の候補BsAbにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件4:
前記第1の準備工程におけるBsAbライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第4の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第1の候補BsAbにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第4の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(付記27)
前記第2の接触工程および前記第2の選抜工程を1セットとし、前記セットを複数回実施する、付記26記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記28)
前記第2の選抜工程において、前記免疫細胞の活性化分子の発現を検出し、
前記免疫細胞の活性化分子を誘導した第2のBsAbを、前記第2の候補BsAbとして選抜する、付記26または27記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記29)
前記第2のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、付記25から28のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記30)
前記第1の接触工程および前記第1の選抜工程を1セットし、前記セットを複数回実施する、付記25から29のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記31)
前記第1の選抜工程において、前記免疫細胞の活性化分子の発現を検出し、
前記免疫細胞の活性化分子を誘導した第1のBsAbを、前記第1の候補BsAbとして選抜する、付記25から30のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記32)
前記免疫細胞活性化受容体は、CD3である、付記25から31のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記33)
前記免疫細胞は、T細胞である、付記25から32のいずれかに記載のscFvの製造方法(スクリーニング方法)。
(付記34)
下記(H)の重鎖可変領域と、下記(L)の軽鎖可変領域とを含む、CD19に対する抗体またはその抗原結合断片。
(H)重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
CDRH1が、下記(H1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH2が、下記(H2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRH3が、下記(H3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
(H1)下記(H1-1)、(H1-2)または(H1-3)のアミノ酸配列
(H1-1)前記表3AのCDRH1のいずれかのアミノ酸配列
(H1-2)(H1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H1-3)(H1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H2)下記(H2-1)、(H2-2)または(H2-3)のアミノ酸配列
(H2-1)前記表3AのCDRH2のいずれかのアミノ酸配列
(H2-2)(H2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H2-3)(H2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(H3)下記(H3-1)、(H3-2)または(H3-3)のアミノ酸配列
(H3-1)前記表3AのCDRH3のいずれかのアミノ酸配列
(H3-2)(H3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(H3-3)(H3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L)軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3を含み、
CDRL1が、下記(L1)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL2が、下記(L2)のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
CDRL3が、下記(L3)のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
(L1)下記(L1-1)、(L1-2)または(L1-3)のアミノ酸配列
(L1-1)前記表3BのCDRL1のいずれかのアミノ酸配列
(L1-2)(L1-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L1-3)(L1-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L2)下記(L2-1)、(L2-2)または(L2-3)のアミノ酸配列
(L2-1)前記表3BのCDRL2のいずれかのアミノ酸配列
(L2-2)(L2-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L2-3)(L2-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(L3)下記(L3-1)、(L3-2)または(L3-3)のアミノ酸配列
(L3-1)前記表3BのCDRL3のいずれかのアミノ酸配列
(L3-2)(L3-1)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(L3-3)(L3-1)のアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列
(付記35)
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組合せが、前記表2のいずれかの組合せである、付記34記載の抗体またはその抗原結合断片。
(付記36)
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記抗原結合ドメインは、付記34または35記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。
(付記37)
前記抗原結合断片は、一本鎖抗体である、付記36記載のキメラ抗原受容体。
(付記38)
付記36または37記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
(付記39)
付記36または37記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。
(付記40)
前記細胞は、T細胞を含む、付記39記載の細胞。
(付記41)
付記38記載の核酸を細胞に導入する導入工程を含む、細胞の製造方法。
(付記42)
前記細胞は、T細胞を含む、付記41記載の細胞の製造方法。
(付記43)
第1のキメラ抗原受容体(CAR)ライブラリの発現細胞を動物に投与する第1の投与工程と、
前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第1のCARライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞として採取する第1の採取工程とを含み、
前記第1のCARライブラリは、第1のCARをコードする核酸を含み、
前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、
前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、
前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たす、scFvの製造方法:
(条件1)
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
(条件2)
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(付記44)
前記第1の投与工程において、複数種類の第1のCARライブラリ発現細胞を投与する、付記43記載の製造方法。
(付記45)
前記第1の投与工程後、前記標的抗原を前記動物に投与する第1の刺激工程を含む、付記43または44記載の製造方法。
(付記46)
前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞を、前記標的抗原で再刺激する第1の再刺激工程を含む、付記43から45のいずれかに記載の製造方法。
(付記47)
前記第1の投与工程に先立ち、標的抗原を発現する細胞を前記動物に導入し、前記標的抗原を発現する組織を形成させる第1の形成工程を含む、付記43から46のいずれかに記載の製造方法。
(付記48)
発現する組織に集積した前記第1のCARライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞として採取する、付記43から47のいずれかに記載の製造方法。
(付記49)
前記第1のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、付記43から48のいずれかに記載の製造方法。
(付記50)
第2のCARライブラリの発現細胞を動物に投与する第2の投与工程と、
前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第2のCARライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞として採取する第2の採取工程とを含み、
前記第2のCARライブラリは、第2のCARをコードする核酸を含み、
前記第2のCARは、第2の抗原結合ドメインと、第2の膜貫通ドメインと、第2の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第2の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第2のscFvを含み、
前記第2のscFvは、第2の重鎖可変領域と、第2の軽鎖可変領域とを含み、
前記第2の重鎖可変領域および前記第2の軽鎖可変領域は、下記条件3または条件4を満たす、付記43から49のいずれかに記載の製造方法:
(条件3)
前記第1のCARライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞のscFvにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
(条件4)
前記第1のCARライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞のscFvにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。
(付記51)
前記第2の投与工程において、複数種類の第2のCARライブラリ発現細胞を投与する、付記50記載の製造方法。
(付記52)
前記第2の投与工程後、前記標的抗原を前記動物に投与する第2の刺激工程を含む、付記50または51記載の製造方法。
(付記53)
前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞を、前記標的抗原で再刺激する第1の再刺激工程を含む、付記50から52のいずれかに記載の製造方法。
(付記54)
前記第2の投与工程に先立ち、標的抗原を発現する細胞を前記動物に導入し、前記標的抗原を発現する組織を形成させる第2の形成工程を含む、付記50から53のいずれかに記載の製造方法。
(付記55)
前記第2の採取工程において、前記標的抗原を発現する組織を採取し、前記標的抗原を発現する組織に集積した前記第2のCARライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なCARを発現する細胞として採取する、付記50から54のいずれかに記載の製造方法。
(付記56)
前記第2のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、付記50から55のいずれかに記載の製造方法。
(付記57)
前記発現細胞は、T細胞である、付記43から56のいずれかに記載の製造方法。
(付記58)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、付記43から57のいずれかに記載の製造方法。
(付記59)
前記動物は、非ヒト動物である、付記43から58のいずれかに記載の製造方法。
(付記60)
前記動物は、免疫抑制動物である、付記43から59のいずれかに記載の製造方法。
Claims (12)
- 第1のキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含み、
前記第1のCARは、第1の抗原結合ドメインと、第1の膜貫通ドメインと、第1の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第1の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングされる第1の一本鎖抗体(scFv)を含み、
前記第1のscFvは、第1の重鎖可変領域と、第1の軽鎖可変領域とを含み、
前記第1の重鎖可変領域および前記第1の軽鎖可変領域は、下記条件1または条件2を満たす、CARライブラリ;
条件1:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件2:
前記第1の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域(CDRH)1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第1のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第1の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域(CDRL)1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。 - 前記第1の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1記載のCARライブラリ。
- 前記第1の膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインを含む、請求項1または2記載のCARライブラリ。
- 前記第1のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、請求項1から3のいずれか一項に記載のCARライブラリ。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のCARライブラリを免疫細胞に発現させる第1の発現工程と、
前記第1の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第1の接触工程と、
前記第1の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するCARの第1のscFvを、前記標的抗原に結合する第1の候補scFvとして選抜する第1の選抜工程とを含む、scFvの製造方法。 - 前記第1の候補scFvに基づき、第2のCARライブラリを調製する調製工程を含み、
前記第2のCARライブラリは、第2のCARをコードする核酸を含み、
前記第2のCARは、第2の抗原結合ドメインと、第2の膜貫通ドメインと、第2の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第2の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングされる第2のscFvを含み、
前記第2のscFvは、第2の重鎖可変領域と、第2の軽鎖可変領域とを含み、
前記第2の重鎖可変領域および前記第2の軽鎖可変領域は、下記条件3または条件4を満たし、
さらに、前記第2のCARライブラリを免疫細胞に発現させる第2の発現工程と、
前記第2の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第2の接触工程と、
前記第2の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するCARの第2のscFvを、前記標的抗原に結合する第2の候補scFvとして第2の選抜工程とを含む、請求項5記載の製造方法;
条件3:
前記第1の発現工程におけるCARライブラリが前記条件1を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、前記第1の候補scFvにおける軽鎖可変領域のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む;
条件4:
前記第1の発現工程におけるCARライブラリが前記条件2を満たす場合、
前記第2の重鎖可変領域におけるCDRH1、CDRH2、およびCDRH3は、それぞれ、前記第1の候補scFvにおける重鎖可変領域のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含み、
前記第2の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3は、それぞれ、第2のB細胞受容体の軽鎖可変領域におけるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。 - 前記第2の接触工程を複数回実施する、請求項6記載のscFvの製造方法。
- 前記第2の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するscFvを、前記第2の候補scFvとして選抜する、請求項6または7記載のscFvの製造方法。 - 前記第2のB細胞受容体は、ヒト由来B細胞のB細胞受容体である、請求項6から8のいずれか一項に記載のscFvの製造方法。
- 前記第1の接触工程を複数回実施する、請求項5から9のいずれか一項に記載のscFvの製造方法。
- 前記第1の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するscFvを、前記第1の候補scFvとして選抜する、請求項5から10のいずれか一項に記載のscFvの製造方法。 - 前記免疫細胞は、T細胞である、請求項5から11のいずれか一項に記載のscFvの製造方法。
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