JP6821230B2 - ＣＡＲライブラリおよびｓｃＦｖの製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ＣＡＲライブラリおよびｓｃＦｖの製造方法に関する。
がん特異的抗原または標的抗原に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ：single chain Fv）を発現するＴ細胞（キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を用いた、がんの治療が試みられている。
ｓｃＦｖのスクリーニングは、生体から単離されたＢ細胞を用いたハイブリドーマを用いた方法、またはファージディスプレイ法により実施される。具体的に、前者は、抗原免疫後に、生体から単離したＢ細胞を用いてハイブリドーマのライブラリを作成する。そして、標的抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、前記ハイブリドーマが産生する抗体の抗原認識部位の配列を決定することにより実施される。
また、後者は、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含むｓｃＦｖのライブラリを作成後、各ｓｃＦｖをファージに発現させる。そして、標的抗原に結合するファージを選抜し、前記ファージにおけるポリヌクレオチドを同定することにより実施される。
しかしながら、いずれの方法も標的抗原に結合するｓｃＦｖを選抜できるが、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能するｓｃＦｖかは不明である。このため、前記選抜後、標的抗原結合性のｓｃＦｖをそれぞれＴ細胞に発現させ、機能するかを検討する必要がある。
そこで、本発明は、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖのスクリーニングに用いるＣＡＲライブラリ、およびそれを用いたｓｃＦｖの製造方法を提供する。
前記目的を達成するため、本発明のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)ライブラリは、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、
前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす；
条件１：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
本発明のｓｃＦｖの製造方法（以下、「第１のスクリーニング方法」ともいう）は、前記本発明のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第１の発現工程と、
前記第１の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む。
本発明によれば、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖのスクリーニングに用いるＣＡＲライブラリ、およびそれを用いたｓｃＦｖの製造方法を提供できる。
図１は、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図２は、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図３は、実施例１におけるA2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を示すグラフである。 図４は、実施例１におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。 図５は、実施例１におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。 図６は、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図７Ａは、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図７Ｂは、実施例１におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図８は、実施例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図９は、実施例２におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図１０は、実施例２におけるA2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を示すグラフである。 図１１は、実施例２におけるペプチド濃度が１０μｇ／ｍＬの場合におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。 図１２は、実施例２におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。 図１３は、実施例３におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図１４は、実施例４におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図１５は、実施例４におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。 図１６は、実施例５におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、3M4E5LH CARを発現するＴ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、L1-3M4E5H CARを発現するＴ細胞の結果を示す。 図１７は、実施例６におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図１８は、実施例６におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。 図１９は、実施例６におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。 図２０は、実施例７におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、3M4E5LH CARを発現するＴ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、3M4E5H-L1 CARを発現するＴ細胞の結果を示す。 図２１は、実施例７におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果Cを示す。 図２２は、実施例８におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図２３は、実施例８におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。 図２４は、実施例８におけるサイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。 図２５は、実施例９におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図２６は、実施例９におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。 図２７は、実施例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図２８は、実施例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図２９は、実施例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。 図３０は、実施例１０におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。 図３１は、実施例１０におけるＣＤ１９ダイマー陽性細胞の相対割合を示すグラフである。 図３２は、実施例１０における標的細胞量を変化させた際のＣＤ６９発現量の相対値を示すグラフである。 図３３は、実施例１０におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。 図３４は、実施例１１における生体における抗腫瘍活性に関する図である。 図３５は、実施例１２における構造的親和性の指標値と、機能的親和性の指標値との関係性を示すグラフである。 図３６は、実施例１３における細胞傷害性を示すグラフであるである。 図３７は、実施例１４における生体における全生存率に関する図である。 図３８は、実施例１４における生体における全生存率に関する図である。 図３９は、実施例１５における細胞の増殖比を示すグラフである。 図４０は、実施例１５におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。 図４１は、実施例１５における細胞傷害活性を示すグラフである。 図４２は、実施例１５における共培養前後のＣＤ８陽性ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＤ４陽性ＣＡＲ−Ｔ細胞中のＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の分布を示すドットプロットである。 図４３は、実施例１５における各ＣＡＲ−Ｔ細胞の分裂割合と、共培養前後のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の割合と、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性と、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陰性ＰＤ１陽性細胞の割合とを示すグラフである。 図４４は、実施例１５における本発明のスクリーニング方法により、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果に優れるｓｃＦｖを取得できるメカニズムを説明する図である。
＜ＣＡＲライブラリ＞
本発明のＣＡＲライブラリは、前述のように、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす。本発明のＣＡＲライブラリは、下記条件１または条件２を満たすことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
条件１：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（以下、「抗体等」ともいう）における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
本発明のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１のＣＡＲが、前記第１の抗原結合ドメインと、前記第１の膜貫通ドメインと、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域が、前記条件１または条件２を満たすことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
本発明のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１のＣＡＲは、前記第１の抗原結合ドメインと、前記第１の膜貫通ドメインと、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むタンパク質である。前記第１のＣＡＲは、例えば、抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに類似した構造を有し、前記抗原に結合する細胞外ドメインが、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第１の抗原結合ドメインに変更されている。本発明のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１のＣＡＲは、このように前記ＣＡＲと類似する構造を有する。このため、前記標的抗原と結合する第１のＣＡＲは、例えば、前記発現細胞において、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインを介してシグナルを誘導できる。そして、前記標的抗原と結合する第１のＣＡＲは、例えば、その発現細胞を活性化（例えば、増殖、活性化マーカーの発現等）することができる。すなわち、本発明のＣＡＲライブラリによれば、例えば、後述の第１のスクリーニング方法を用いて、前記ＣＡＲライブラリ発現細胞群における前記標的抗原と結合する第１のＣＡＲを発現する細胞の割合を上昇させることができる。したがって、本発明のＣＡＲライブラリによれば、例えば、ファージディスプレイ法と比較して、より少ない数または種類の核酸で、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記標的抗原と結合する第１のＣＡＲは、例えば、後述の第１のスクリーニング方法において、その発現細胞を活性化することができるため、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能するｓｃＦｖを含んでいるといえる。したがって、本発明のＣＡＲライブラリによれば、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖをスクリーニングできる。
また、本発明のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。前記第１のｓｃＦｖは、例えば、抗原に結合する抗体由来の一本鎖のポリペプチドであり、かつ前記抗原との結合能を保持するｓｃＦｖと類似する構造を有する。前記ｓｃＦｖは、前記抗原に結合する抗体の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域の断片（Ｆｖ）を連結したポリペプチドである。他方、前記第１のｓｃＦｖは、例えば、後述のように、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のうち一方が、前記標的抗原に結合する抗体等の可変領域であり、他方が、Ｂ細胞受容体に由来する可変領域、すなわち、前記標的抗原に結合するかが不明の可変領域である。本発明のＣＡＲライブラリは、前記第１のｓｃＦｖをこのような構成とすることにより、例えば、前記標的抗原に結合する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のスクリーニングを実施することができる。このため、本発明のＣＡＲライブラリによれば、例えば、前記標的抗原に結合する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を一度にスクリーニングするファージディスプレイ法と比較して、より少ない数または種類の核酸で、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。
本発明のＣＡＲライブラリにおいて、第１のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、第１のＣＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味する。前記核酸は、ＤＮＡから構成されてもよいし、ＲＮＡから構成されてもよいし、両者から構成されてもよい。前記核酸は、天然の核酸から構成されてもよいし、天然の核酸が修飾された修飾核酸から構成されてもよいし、ＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）、ＬＮＡ（Locked nucleic acid）、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、モルフォリノ等の人工核酸から構成されてもよいし、これらのうち２種類以上から構成されてもよい。
本発明において「ドメイン」は、例えば、ポリペプチドにおいて、立体構造または機能的にまとまった領域を意味する。前記ポリペプチドは、例えば、１０アミノ酸以上の長さを有するペプチドがあげられる。
前記第１のｓｃＦｖにおいて、前記標的抗原は、特に制限されず、任意の抗原とできる。前記標的抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、糖鎖抗原等があげられる。前記腫瘍抗原は、例えば、細胞のがん化により、新たに発現する抗原、発現量が増加する抗原等の抗原性を有する生体分子を意味する。前記腫瘍抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原でもよいし、腫瘍関連抗原でもよい。
前記腫瘍抗原は、例えば、５Ｔ４、α５β１−インテグリン、活性化型インテグリンβ７、７０７−ＡＰ、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＡＵＲＫＡ（AURORA A）、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β−カテニン、ＢＣＭＡ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＴＡＡ、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ抗原、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＬＬ１、ＣＴ、Cyclin A1、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２等）、ＧＤ２（Ganglioside G2）、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｉＣＥ、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−Ｒａｓ、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ（ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６等）、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、mesothelin（ＭＳＬＮ）、ミオシン、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、プロテイナーゼ−３、ＰＲＡＭＥ（Melanoma antigen preferentially expressed in tumors）、ｐ５３、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、前立腺腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＰＲＡＭＥ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＡＳ、ＲＨＡＭＭ（ＣＤ１６８）、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、サイログロブリン、サバイビン、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴまたはＴＲＴ）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＩＭ３、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＮＹ−Ｅｓｏ−１、ＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂ等があげられる。
前記ウイルス抗原は、例えば、アデノウイルス（adenovirus）等のアデノウイルス科（Adenoviridae）；コロナウイルス（coronavirus）等のコロナウイルス科（Coronaviridae）；エボラウイルス属（Ebolavirus）等のフィロウイルス科（Filoviridae）；Ｃ型肝炎ウイルス（HCV：hepatitis C virus）、デングウイルス(Dengue virus)、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、西ナイルウイルス（west Nile virus）、黄熱ウイルス（yellow fever virus）等のフラビウイルス科（Flaviviridae）；Ｂ型肝炎ウイルス（HVB：Hepatitis B Virus）等のヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）；単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1：herpes simplex virus-1）、単純ヘルペスウイルス２型（HSV-2：herpes simplex virus-2）、水痘・帯状疱疹ウイルス（VZV：varicella zoster virus）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV：human cytomegalovirus）、ＥＢウイルス（EBV：Epstein-Barr virus）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV：Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus）等のヘルペスウイルス科（Herpesviridae）；Ａ型インフルエンザウイルス属（Influenzavirus A）、Ｂ型インフルエンザウイルス属（Influenzavirus B）、Ｃ型インフルエンザウイルス属（Influenzavirus C）等のオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）；麻疹ウイルス（measles virus）、ヒトパラインフルエンザウイルス１〜４型（Human parainfluenza virus 1〜4）、ムンプスウイルス（Mumps virus）、RSウイルス（Respiratory syncytial virus）等のパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）；パルボウイルスＢ１９（Parvovirus B19）等のパルボウイルス科（Parvoviridae）；エンテロウイルス（enterovirus）、ポリオウイルス（poliovirus）、ヒトライノウイルスＡ〜Ｂ（human rhinovirus Ａ〜Ｂ）、Ａ型肝炎ウイルス（hepatitis A virus）、コクサッキーウイルス（coxsackievirus）、エコーウイルス（echo virus）等のピコルナウイルス科（Picornaviridae）；天然痘ウイルス（variola virus）、ワクチニアウイルス（Vaccinia virus）等のポックスウイルス科（Poxviridae）；ヒト免疫不全ウイルス（HIV：human immunodeficiency virus）-1, 2、ヒトＴリンパ好性ウイルス（HTLV：human T-lymphocytropic virus）-I,II等のレトロウイルス科（Retroviridae）；狂犬病ウイルス（Rabies virus）、水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus）等のラブドウイルス科（Rhabdoviridae）；風疹ウイルス（Rubella virus）、チクングニアウイルス（Chikungunya virus）等のトガウイルス科（Togaviridae）；等のウイルス由来の抗原があげられる。
前記細菌抗原は、例えば、破傷風菌（Clostridium tetani）等のクロストリジウム属（Clostridium）；大腸菌（Escherichia coli）等のエスケリキア属（Escherichia）；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）等のヘリコバクター属（Helicobacter）；レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophila）等のレジオネラ属（Legionella）；リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属（Listeria）；結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Mycobacterium gordonae）等のマイコバクテリウム属（Mycobacterium）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）等のナイセリア属（Neisseria）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）等のシュードモナス属（Pseudomonas）；チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhi）、パラチフス菌（Salmonella enterica serovar Paratyphi A）等のサルモネラ属（Salmonella）；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）等のブドウ球菌属（Staphylococcus）；肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）等のレンサ球菌属（Streptococcus）；等の細菌由来の抗原があげられる。
前記寄生虫抗原は、例えば、肝吸虫（Clonorchis sinensis）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、ヒトカイチュウ（Ascaris lumbricoides）、ヒト蟯虫（Enterobius vermicularis）、有鉤嚢虫（Cysticercus cellulosae）、広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）、エキノコックス（Echinococcus）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、マラリア原虫（Plasmodium）等の寄生虫由来の抗原があげられる。
本発明のＣＡＲライブラリにおいて、第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含む。前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有する。一般に、抗体分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、３ヶ所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Complemetarity determining region）を有している。ＣＤＲは、超可変領域（hypervariable domain）ともいう。ＣＤＲは、前記重鎖および軽鎖の可変領域でも、特に一次構造の変異性が高い領域であり、一次構造上において、通常、３ヶ所に分離している。本発明において、重鎖可変領域における３ヶ所のＣＤＲを、重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ末端（Ｎ末端）側から、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）と表し、軽鎖可変領域における３ヶ所のＣＤＲを、軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ末端側から、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）と表す。これらの部位は、立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
前記第１の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第１の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、前記条件１または条件２を満たす。
前記条件１では、前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、前記標的抗原に結合する抗体等を用い、前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３について、前記標的抗原への結合をスクリーニングする。前記抗体またはその抗原結合断片の具体例は、例えば、後述の本発明の抗体等における抗体および抗原結合断片の説明を援用できる。
前記標的抗原に結合する抗体等は、例えば、前記標的抗原に応じて公知の抗体等を使用できる。具体例として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５の複合体に対する抗体としては、例えば、３Ｍ４Ｅ５抗体が使用できる。また、ヒトＣＤ１９に対する抗体としては、例えば、ＦＭＣ６３抗体が使用できる。前記標的抗原に結合する抗体等は、例えば、後述の本発明の第１のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖであってもよいし、前記標的抗原を免疫することで得られた抗体でもよい。前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の重鎖可変領域において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３以外の領域、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記ＦＲは、一次構造上において、通常、４ヶ所に分離している。本発明において、前記重鎖可変領域における４ヶ所のＦＲを、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、重鎖ＦＲ１（ＦＲＨ１）、重鎖ＦＲ２（ＦＲＨ２）、重鎖ＦＲ３（ＦＲＨ３）、および重鎖ＦＲ４（ＦＲＨ４）と表す。なお、前記各ＣＤＲＨと、前記各ＦＲＨとは、例えば、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、ＦＲＨ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、ＣＤＲＨ３、およびＦＲＨ４の順序で配置されている。前記第１の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記標的抗原に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「標的抗原に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＨの説明における「標的抗原に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、Ｖ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片がＶＪ遺伝子再構築することで形成されたＶＪ遺伝子断片によりコードされる。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、Ｖ遺伝子断片と、Ｊ遺伝子断片とを人工的に組合せて設計した人工ＶＪ遺伝子断片がコードするポリペプチドを含むＢ細胞受容体であってもよい。また、生体内のＢ細胞は、例えば、ＶＪ遺伝子再構築後の軽鎖可変領域を発現している。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体であってもよい。この場合、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体があげられ、好ましくは、ヒト末梢血Ｂ細胞由来のＢ細胞受容体である。本発明のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１のＢ細胞受容体は、ＣＡＲライブラリをより容易に調製できることから、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域であることが好ましい。
前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記ＦＲは、一次構造上において、通常、４ヶ所に分離している。本発明において、前記軽鎖可変領域における４ヶ所のＦＲを、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、軽鎖ＦＲ１（ＦＲＬ１）、軽鎖ＦＲ２（ＦＲＬ２）、軽鎖ＦＲ３（ＦＲＬ３）、および軽鎖ＦＲ４（ＦＲＬ４）と表す。なお、前記各ＣＤＲＬと、前記各ＦＲＬとは、例えば、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、およびＦＲＬ４の順序で配置されている。前記第１の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第１のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＬの説明における「第１のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
つぎに、前記条件２では、前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記標的抗原に結合する抗体等に由来し、前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３について、前記標的抗原への結合をスクリーニングする。
前記第１の重鎖可変領域は、例えば、Ｖ遺伝子断片、Ｄ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片がＶＤＪ遺伝子再構築することで形成されたＶＤＪ遺伝子断片によりコードされる。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、Ｖ遺伝子断片と、Ｄ遺伝子断片と、Ｊ遺伝子断片とを人工的に組合せて設計した人工ＶＤＪ遺伝子断片がコードするポリペプチドを含むＢ細胞受容体であってもよい。また、生体内のＢ細胞は、例えば、ＶＤＪ遺伝子再構築後の重鎖可変領域を発現している。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体であってもよい。この場合、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体があげられ、好ましくは、ヒト末梢血Ｂ細胞由来のＢ細胞受容体である。本発明のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１のＢ細胞受容体は、ＣＡＲライブラリをより容易に調製できることから、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体の重鎖可変領域であることが好ましい。
前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第１のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＨの説明における「第１のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域において、前記標的抗原に結合する抗体等は、例えば、前記条件１における標的抗原に結合する抗体等の説明を援用できる。前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第１の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記標的抗原に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「標的抗原に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＬの説明における「標的抗原に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１のｓｃＦｖにおいて、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、リンカーペプチド（Ｆｖリンカーペプチド）により連結されている。前記Ｆｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のｓｃＦｖの前記標的抗原への結合を阻害しないことが好ましい。前記Ｆｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記Ｆｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記Ｆｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、下記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
Ｆｖリンカーペプチド１（配列番号１）
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
Ｆｖリンカーペプチド２（配列番号２）
GGGGSGGGGSGGGGS
Ｆｖリンカーペプチド１をコードする塩基配列（配列番号３）
5'-GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC-3'
Ｆｖリンカーペプチド２をコードする塩基配列（配列番号４）
5'-GGTGGAGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGCTCTGGTGGTGGAGGCTCG-3'
前記第１の抗原結合ドメインは、第１のｓｃＦｖを含むが、前記第１の結合ドメインは、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域を含む、ｓｃＦｖ以外の構造を有してもよい。具体例として、前記第１の結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ等としてもよい。
前記第１の膜貫通ドメインは、例えば、前記第１のＣＡＲが細胞に発現された場合、細胞膜を貫通する領域を占めるドメインである。前記第１の膜貫通ドメインは、例えば、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインでもよいし、人工的に設計した人工膜貫通ドメインでもよい。前者の場合、前記膜貫通タンパク質は、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８αまたはＣＤ８β）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ等、またはこれらと同等の機能を有する変異体があげられる。前記同等の機能を有する変異体は、例えば、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、膜貫通ドメインとして機能するポリペプチドである。前記「１個または数個」は、例えば、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１または２個である。後者の場合、前記人工膜貫通ドメインは、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン等の疎水性のアミノ酸から主に構成されるポリペプチドである。また、前記人工膜貫通ドメインは、例えば、各両端にフェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリペプチドを有してもよい。前記第１の膜貫通ドメインが前記膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインである場合、前記第１の膜貫通ドメインは、例えば、前記膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインと連続するＮ末端側またはＣ末端側の１個または数個のアミノ酸を含んでもよい。前記「１個または数個」は、例えば、前述の例示を援用できる。
前記第１の膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ２８の膜貫通ドメインあげられる。ＣＤ２８の膜貫通ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_006130で登録されているアミノ酸配列において、１５３番目から１７９番目の下記のアミノ酸配列（配列番号５）があげられる。なお、前記ＮＣＢＩアクセッション番号は、タンパク質の前駆体の全長アミノ酸配列に付与された番号である（以下、同様）。前記ＣＤ２８の膜貫通ドメインとしては、例えば、前記ＣＤ２８の膜貫通ドメインに加えて、そのＮ末端側の細胞外領域およびそのＣ末端側の細胞内領域を含む膜貫通ユニットを用いてもよい。
ＣＤ２８の膜貫通ドメイン（配列番号５）
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
ＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードする塩基配列（配列番号６）
5'-TTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG-3'
ＣＤ２８の膜貫通ユニット（配列番号７）
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＣＤ２８の膜貫通ユニットをコードする塩基配列（配列番号８）
5'-ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT-3’
前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、同一タンパク質内の第１の抗原結合ドメインが前記標的抗原と結合した際に、細胞内にシグナルを伝達可能なドメインである。前記第１のシグナル伝達ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体および共刺激分子の細胞質のアミノ酸配列、ならびにこれらのアミノ酸配列と同等の機能を有する変異体があげられる。前記同等の機能を有する変異体は、例えば、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内シグナル伝達ドメインとして機能するポリペプチドである。前記「1個または数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲ複合体を介する細胞内シグナル等の抗原依存的な細胞質シグナルにより活性化される（一次活性化）。そして、この活性化は、例えば、共刺激分子を介する細胞内シグナル等の抗原非特異的な細胞質シグナルにより増強される（二次活性化）。このため、Ｔ細胞は、例えば、前記ＴＣＲ複合体を介して活性化させるドメイン（一次活性化ドメイン）と、抗原非特異的に活性化させるドメイン（二次活性化ドメイン）とを有する。したがって、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、前記一次活性化ドメインおよび前記二次活性化ドメインの少なくとも一方を有し、好ましくは、両者を有する。
前記一次活性化ドメインは、例えば、ＴＣＲ複合体による一次活性化を調整可能である。前記一次活性化を誘導する一次活性化ドメインは、例えば、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインがあげられる。他方、前記一次活性化に対して抑制的に作用する一次活性化ドメインは、例えば、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインがあげられる。
前記ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ等の細胞内シグナル伝達ドメインまたはこれらと同等の機能を有する変異体があげられる。前記同等の機能を有する変異体は、例えば、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインとして機能するポリペプチドである。前記「１個または数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_932170.1で登録されているアミノ酸配列において、５２〜１６４番目のアミノ酸配列または下記配列番号９のアミノ酸配列があげられる。ＦｃεＲＩγのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_004097.1で登録されているアミノ酸配列において、４５〜８６番目のアミノ酸配列があげられる。ＦｃεＲＩβのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000130.1で登録されているアミノ酸配列において、２０１〜２４４番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ３γのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000064.1で登録されているアミノ酸配列において、１３９〜１８２番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ３δのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000723.1で登録されているアミノ酸配列において、１２８〜１７１番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ３εのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000724.1で登録されているアミノ酸配列において、１５３〜２０７番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ５のＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_055022.2で登録されているアミノ酸配列において、４０２〜４９５番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ２２のＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001762.2で登録されているアミノ酸配列において、７０７〜８４７番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ７９ａのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001774.1で登録されているアミノ酸配列において、１６６〜２２６番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ７９ｂのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000617.1で登録されているアミノ酸配列において、１８２〜２２９番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ６６ｄのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001806.2で登録されているアミノ酸配列において、１７７〜２５２番目のアミノ酸配列があげられる。
ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号９）
RVKSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインをコードする塩基配列（配列番号１０）
5'-CGAGTGAAGAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
前記二次活性化ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ等の細胞内シグナル伝達ドメインまたはこれらと同等の機能を有する変異体があげられる。前記同等の機能を有する変異体は、例えば、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、細胞内シグナル伝達ドメインとして機能するポリペプチドである。前記「１個または数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。具体的には、ＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001758.2で登録されているアミノ酸配列において、２３６〜３５１番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ４の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000607.1で登録されているアミノ酸配列において、４２１〜４５８番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ５の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_055022.2で登録されているアミノ酸配列において、４０２〜４９５番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ８αの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001759.3で登録されているアミノ酸配列において、２０７〜２３５番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ８βの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号AAA35664.1で登録されているアミノ酸配列において、１９６〜２１０番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号M63928.1で登録されているアミノ酸配列において、２１３〜２６０番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_006130.1で登録されているアミノ酸配列において、１８１〜２２０番目のアミノ酸配列（配列番号１１）があげられる。ＣＤ１３４の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_003318.1で登録されているアミノ酸配列において、２４１〜２７７番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ１３７の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001552.2で登録されているアミノ酸配列において、２１４〜２５５番目のアミノ酸配列があげられる。ＧＩＴＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_004186.1で登録されているアミノ酸配列において、１９３〜２４１番目のアミノ酸配列があげられる。ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_036224.1で登録されているアミノ酸配列において、１６６〜１９９番目のアミノ酸配列があげられる。
ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１１）
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする塩基配列（配列番号１２）
5'-CGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT-3'
前記第１のＣＡＲは、例えば、１または複数の第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。複数の第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、同じでもよいし、異なってもよい。前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、前記一次活性化ドメインとして、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むことが好ましい。また、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、前記二次活性化ドメインとして、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＤ１３７からなる群から選択された少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むことが好ましい。具体例として、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＤ１３７からなる群から選択された少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。これにより、本発明のＣＡＲライブラリは、例えば、後述の本発明の第１のスクリーニング方法において、ファージディスプレイ法と比較して、さらに少ない数または種類の核酸で、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む場合、ＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインのＣ末端側に配置されていることが好ましい。前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む場合、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、さらに、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７の少なくとも一方の細胞内シグナル伝達ドメインとを含んでもよい。
前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第１の膜貫通ドメインは、直接または間接的に連結されている。前記間接的な連結の場合、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第１の膜貫通ドメインは、スペーサーペプチドにより連結されていることが好ましい。前記スペーサーペプチドは、例えば、１〜３００個、１〜１００個、１０〜１００個、２５〜５０個のアミノ酸から構成される。前記スペーサーペプチドは、例えば、前記第１のＣＡＲと前記標的抗原との結合を促進し、且つ前記第１のＣＡＲと前記標的抗原が結合した際に、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインによるシグナル伝達を誘導および／または亢進するアミノ酸（例えば、システイン、セリン、スレオニン等）を含むことが好ましい。具体例として、前記スペーサーペプチドは、例えば、ＣＨ１領域、Ｌ領域等の免疫グロブリンの定常領域、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、またはＣＤ２８の部分領域等を利用できる。前記第１のスペーサーペプチドは、人工的に設計したアミノ酸配列でもよい。ＣＤ８αの部分領域は、例えば、ＣＤ８αのヒンジ領域があげられ、具体例として、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_001759.3で登録されているアミノ酸配列において、１１８〜１７８番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ８βの部分領域は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号AAA35664.1で登録されているアミノ酸配列において、１３５〜１９５番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ４の部分領域は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_000607.1で登録されているアミノ酸配列において、３１５〜３９６番目のアミノ酸配列があげられる。ＣＤ２８の部分領域は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_006130.1で登録されているアミノ酸配列において、１３７〜１５２番目のアミノ酸配列（配列番号１３）があげられる。前記スペーサーペプチドは、各例示のアミノ酸配列の一部でもよい。
ＣＤ２８の部分領域（細胞外領域）（配列番号１３）
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
ＣＤ２８の一部をコードする塩基配列（配列番号１４）
5'-ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCT-3'
前記第１のＣＡＲにおいて、各ドメイン間は、例えば、リンカーペプチド（ドメインリンカーペプチド）により連結されてもよい。前記ドメインリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記ドメインリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。
前記第１のＣＡＲは、例えば、下記式（１）（配列番号１５）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。下記式（１）において、Ｖ１およびＶ２は、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列である。下記式（１）において、Ｖ１およびＶ２間のアミノ酸配列が、Ｆｖリンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｖ２よりＣ末端側のアミノ酸配列が、スペーサーペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。下記式（１）において、Ｆｖリンカーペプチドは、Ｆｖリンカーペプチド１であるが、Ｆｖリンカーペプチド２であってもよい。
[Ｖ１]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[Ｖ２]-[IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS]-[RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR] ・・・（１）
前記第１のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、下記式（２）（配列番号１６）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。下記式（２）において、Ｎ１およびＮ２は、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする塩基配列、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする塩基配列である。下記式（２）において、Ｎ１およびＮ２間の塩基配列が、Ｆｖリンカーペプチドをコードする塩基配列であり、Ｎ２より３’端側のアミノ酸配列が、スペーサーペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする塩基配列である。下記式（２）において、Ｆｖリンカーペプチドをコードする塩基配列は、Ｆｖリンカーペプチド１をコードする塩基配列であるが、Ｆｖリンカーペプチド２をコードする塩基配列であってもよい。
5'-[Ｎ１]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[Ｎ２]-[ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT]-[CGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA]-3' ・・・（２）
本発明のＣＡＲライブラリは、例えば、複数種類の核酸を含むことが好ましい。この場合、本発明のＣＡＲライブラリは、例えば、複数種類の核酸の混合物である。前記複数種類の核酸は、例えば、その一部または全部が、異なる第１のＣＡＲをコードしていることが好ましく、異なる第１の抗原結合ドメインをコードしていることが好ましい。複数種類の核酸が異なる第１の抗原結合ドメインをコードしている場合、前記第１のＣＡＲにおける第１の抗原結合ドメイン以外の領域は、例えば、同じまたは異なるアミノ酸配列である。本発明のＣＡＲライブラリに含まれる前記核酸の種類は、例えば、１×１０５〜１×１０７種類、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類であり、好ましくは、約２×１０６種類（例えば、１×１０６〜３×１０６種類）である。前記ファージディスプレイ法では、約１×１０８種類の核酸が、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖのスクリーニングに必要となる。他方、本発明のＣＡＲライブラリによれば、例えば、約１×１０６種類の核酸であっても、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。このため、本発明のＣＡＲライブラリによれば、例えば、ファージディスプレイ法と比較して、より少ない数または種類の核酸で、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。前記核酸の種類は、例えば、核酸の不均一性（heterogeneity）ということもできる。前記不均一性は、例えば、制限酵素マッピング、各ＣＤＲおよび／または各ＦＲＨについてサンガー法等のシークエンス等で測定できる。
前記第１のＣＡＲは、例えば、Ｎ末端にシグナルペプチドを有してもよい。前記シグナルペプチドは、例えば、小胞体への輸送シグナルとなるシグナルペプチドがあげられる。前記第１のＣＡＲは、例えば、タグを有してもよい。前記タグは、例えば、ペプチドタグ、プロテインタグ等があげられる。前記タグは、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、切断型のＮＧＦＲ（nerve growth factor receptor）等があげられる。前記タグペプチドは、例えば、前記第１のＣＡＲのＮ末端およびＣ末端の少なくとも一方に付加される。前記タグが切断型のＮＧＦＲの場合、前記タグは、例えば、前記第１のＣＡＲのＣ末端側に配置される。これにより、本発明のＣＡＲライブラリは、例えば、１つの細胞に１種類の第１のＣＡＲをコードする核酸が導入されるよう、核酸の導入効率を調整できる。前記第１のＣＡＲと前記タグとは、リンカーペプチドにより連結されてもよい。
本発明において、前記第１のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、前記第１のＣＡＲのアミノ酸配列に基づき、常法により調製できる。具体例として、前記第１のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、前述の各ドメインのアミノ酸配列が登録されたデータベースにおいて、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、前記塩基配列に基づき、分子生物学的手法および／または化学的合成方法により調製できる。前記核酸の塩基配列は、例えば、本発明のＣＡＲライブラリを発現させる細胞の由来に応じて、コドン最適化してもよい。
前記第１のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、発現ベクターに導入されてもよい。前記発現ベクターは、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸を連結用ベクターに連結することで調製できる。前記連結用ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクター等のレトロウイルスベクター；アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクター等のウイルスベクターがあげられる。具体例として、前記連結用ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＣＭＶ、ｐＭＸ、ｐＥＬＰがあげられる。前記連結用ベクターは、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主に応じて、適宜設定することもできる。前記宿主は、特に制限されず、例えば、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等の哺乳類由来の培養細胞、免疫細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、リンパ球、顆粒球、マクロファージ等があげられる。前記リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、生体から単離された細胞、多能性幹細胞等の幹細胞から誘導された免疫細胞または免疫細胞由来の培養細胞である。前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞様の細胞でもよい。前記Ｔ細胞様の細胞は、例えば、Ｔ細胞に由来する培養細胞等があげられ、具体例として、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等があげられる。
前記発現ベクターは、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸の発現および前記第１のＣＡＲをコードする核酸がコードする第１のＣＡＲの少なくとも一方の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸の発現およびこれがコードする前記第１のＣＡＲの少なくとも一方の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記連結ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記連結ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記連結ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
＜第１のｓｃＦｖのスクリーニング方法＞
本発明の第１のスクリーニング方法は、前記本発明のＣＡＲライブラリ（以下、「第１のＣＡＲライブラリ」ともいう）を免疫細胞に発現させる第１の発現工程と、前記第１の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第１の接触工程と、前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む。本発明の第１のスクリーニング方法は、前記第１の発現工程、前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程を含み、前記第１の発現工程において、前記本発明のＣＡＲライブラリを用いることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第１のスクリーニング方法によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列に基づき、例えば、前記標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を作製できる。このため、前記第１のスクリーニング方法は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片のスクリーニング方法ということもできる。本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリの説明を援用できる。本発明のｓｃＦｖの製造方法によれば、新たなｓｃＦｖをスクリーニングすることができる。このため、本発明のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、ｓｃＦｖのスクリーニング方法ということもできる。
ファージディスプレイ法等により標的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等を製造する場合、約１×１０１０種類の抗体ライブラリを作成し、標的抗原に結合する抗体を取得した後に、前記抗体からｓｃＦｖを含むＣＡＲ等を調製する。そして、前記ＣＡＲ等について免疫細胞等を用いて、その有効性について検討する。他方、本発明の第１のスクリーニング方法では、前記本発明のＣＡＲライブラリと、前記免疫細胞とを用いるため、例えば、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖのスクリーニングと、前記ｓｃＦｖの免疫細胞における有効性の検討について同時に実施することができる。このため、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、例えば、標的抗原に結合する抗体を得るために用いられているファージディスプレイ法等と比較して、標的抗原に結合し、かつ免疫細胞等において有効に機能するＣＡＲに用いうるｓｃＦｖを簡便にスクリーニングできる。
前記第１の発現工程は、前記本発明のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる工程である。具体的には、前記第１の発現工程では、例えば、前記免疫細胞に、前記第１のＣＡＲライブラリを導入する。そして、前記第１の発現工程では、例えば、前記第１のＣＡＲライブラリが導入された免疫細胞を培養することにより、前記免疫細胞に前記第１のＣＡＲライブラリを発現させる。前記第１のＣＡＲライブラリの導入方法は、特に制限されず、例えば、公知の核酸の細胞への導入方法を利用できる。具体例として、前記第１のＣＡＲライブラリの導入方法は、例えば、リポソーム、カチオニックリピッド等の核酸導入試薬を用いる方法；レトロウイルス、レンチウイルス等のウイルスを用いる方法；等があげられる。前記免疫細胞の培養期間は、特に制限されず、例えば、６時間〜３０日、６〜９６時間、１〜３０日である。前記免疫細胞の培養温度は、例えば、２８〜３７℃である。
前記第１のＣＡＲライブラリは、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸でもよいし、前記第１のＣＡＲをコードする核酸が導入された発現ベクターでもよい。
前記免疫細胞は、特に制限されず、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、生体から単離された免疫細胞、多能性幹細胞等の幹細胞から誘導された免疫細胞または免疫細胞由来の培養細胞があげられる。前記単離された免疫細胞は、例えば、免疫細胞様の培養細胞でもよく、具体例として、Ｔ細胞様の培養細胞、ＮＫ細胞様の培養細胞、ＮＫＴ細胞様の培養細胞、Ｂ細胞様の培養細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、生体から単離された免疫細胞であり、具体例として、ヒト末梢血由来の免疫細胞があげられる。前記Ｔ細胞様の培養細胞は、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能する可能性がより高いｓｃＦｖをスクリーニングでき、また後述の第１の接触工程において、前記標的抗原と結合する第１のＣＡＲを発現する免疫細胞を富化できることから、Ｔ細胞またはＴ細胞様の培養細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞が好ましい。
前記第１の発現工程において、前記免疫細胞の数は、特に制限されず、例えば、１×１０５〜１×１０８細胞、１×１０５〜１×１０７細胞、１×１０５〜１×１０６細胞、１×１０６〜５×１０６細胞、１×１０６〜３×１０６細胞である。
前記第１の発現工程では、１つの免疫細胞あたり、平均して、１以下の第１のＣＡＲが発現するように、前記本発明のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させることが好ましい。これにより、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、前記標的抗原に結合しない非特異的な第１のＣＡＲの選抜を抑制できる。前記１つの細胞あたりに発現する第１のＣＡＲの数は、例えば、細胞数と、導入する核酸、ウイルス等のベクターとの量比を変更することにより調整できる。具体的には、前記第１の発現工程では、一定数の細胞に対して、導入するベクターの量比を減らすことにより、前記１つの細胞あたりに発現する第１のＣＡＲの数を低減できる。他方、前記第１の発現工程では、一定数の細胞に対して、導入するベクターの量比を増やすことにより、前記１つの細胞あたりに発現する第１のＣＡＲの数を増加できる。前記第１の発現工程において、前記免疫細胞へのベクターの導入効率は、特に制限されず、例えば、１０〜６０％、１０〜５０％、２０〜４０％、２５〜３５％とできる。
つぎに、前記第１の接触工程では、前記第１の発現工程で得られた免疫細胞（候補免疫細胞）と、前記標的抗原とを接触させる。前記候補免疫細胞と前記標的抗原との接触は、例えば、前記候補免疫細胞および前記標的抗原の共存下で培養することにより実施できる。培養期間は、例えば、６時間〜３０日、６〜９６時間、１〜３０日である。培養温度は、例えば、２８〜３７℃である。以下、前記免疫細胞がＴ細胞の場合、候補免疫細胞は、例えば、候補ＣＡＲ−Ｔということもできる。
前記候補免疫細胞が発現するＣＡＲは、例えば、１種類でもよいし、複数種類でもよいが、前者が好ましい。前記候補免疫細胞は、異なるアミノ酸配列を有するＣＡＲを発現する候補免疫細胞、すなわち、異なるＣＡＲを発現する２種類以上の候補免疫細胞の混合物であることが好ましい。
前記候補免疫細胞と接触させる標的抗原は、例えば、前記標的抗原の単量体、前記標的抗原の複合体、前記標的抗原の発現細胞等があげられ、好ましくは、前記標的抗原の発現細胞である。前記標的抗原の複合体は、例えば、前記標的抗原の多量体（マルチマー）があげられ、具体例として、前記標的抗原の二量体、四量体等があげられる。前記標的抗原の多量体は、例えば、タグを付加した標的抗原を抗体により架橋する方法、ビオチン化された標的抗原をアビジンにより複合体化する方法等により調製できる。前記標的抗原の発現細胞は、例えば、前記標的抗原を内在的に発現する細胞、前記標的抗原をコードする核酸を導入することにより前記標的抗原を発現させた細胞等があげられる。前記標的抗原を発現させる細胞は、例えば、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞等の培養細胞があげられる。
前記第１の接触工程では、前記標的抗原に加え、免疫細胞を活性化させる分子、いわゆる、共刺激分子をあわせて接触させてもよい。前記共刺激分子は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ等があげられる。前記共刺激分子は、例えば、前記共刺激分子の単量体、前記共刺激分子の複合体、前記共刺激分子の発現細胞等があげられ、好ましくは、前記共刺激分子の発現細胞である。前記共刺激分子の複合体は、例えば、前記標的抗原の複合体と同様にして調製できる。
前記標的抗原として、前記標的抗原の発現細胞を用いる場合、前記標的抗原の発現細胞は、免疫細胞を活性化させる分子、いわゆる、共刺激分子をあわせて発現することが好ましい。前記共刺激分子は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ等があげられる。前記標的抗原の発現細胞は、１種類の共刺激分子を発現してもよいし、２種類以上の共刺激分子を発現してもよい。前記標的抗原の発現細胞は、例えば、生体における抗原提示細胞と類似した機能を発揮でき、生体内で機能するＣＡＲを選抜できることから、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ４０、および４−１ＢＢＬからなる群から選択された少なくとも１つを発現することが好ましい。
本発明の第１のスクリーニング方法では、前記第１の接触工程において、候補免疫細胞と、標的抗原とを接触させる。このため、前記標的抗原に特異的なＣＡＲを発現する候補免疫細胞は、例えば、前記標的抗原へのＣＡＲの親和性（結合性）の程度に応じて、生体内と同様に、前記標的抗原と、持続的または間欠的に免疫シナプス様の構造を形成できる。これにより、前記標的抗原に特異的なＣＡＲを発現する候補免疫細胞は、例えば、前記標的抗原へのＣＡＲの親和性（結合性）の程度に応じて、ＣＡＲに由来する生存、活性化および／または増殖シグナルを受け取ることができる。この結果、前記第１の接触工程を経た候補免疫細胞において、前記標的抗原に特異的なＣＡＲを発現する候補免疫細胞は、例えば、前記標的抗原へのＣＡＲの親和性（結合性）の程度に応じて、生存、活性化マーカーの発現および／または細胞数の増加という表現型を示す。そして、後述の第１の選抜工程では、例えば、このような表現型が発現した候補免疫細胞を評価して、選抜する。このため、第１の選抜工程では、例えば、候補免疫細胞に発現しているＣＡＲの親和性に加えて、当該ＣＡＲが活性化した際に生じる表現型（機能性）に基づき、ＣＡＲをスクリーニングできる。したがって、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、前記第１の接触工程を備えることにより、生体内または免疫細胞において有効に機能するＣＡＲに用いうるｓｃＦｖを好適にスクリーニングできる。
前記第１の接触工程は、複数回実施してもよい。前記複数回は、例えば、１〜５回、２〜３回であり、好ましくは、２〜３回である。前記第１の接触工程を複数回実施する場合、１回目の第１の接触工程の実施後、前記候補免疫細胞を回収し、１回目の第１の接触工程と同様にして２回目の第１の接触工程をする。そして、所望の回数まで同様に回収および接触を繰り返し実施する。前記第１の接触工程を複数回実施することにより、前記第１の接触工程において、例えば、前記標的抗原と結合するＣＡＲを発現する候補免疫細胞を増殖および／または富化させることができるため、より効率よく、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記第１の接触工程を複数回実施することで増殖する候補免疫細胞が発現するＣＡＲは、例えば、後述の実施例で示しているように、前記ＣＡＲを発現する細胞に対して、前記標的抗原を発現している細胞が多い状況（例えば、がん）においても、前記ＣＡＲを発現する細胞を好適に標的抗原の刺激依存的に増殖させ、かつ前記ＣＡＲを発現する細胞において標的抗原依存的な細胞傷害活性等の活性化を誘導できる。このため、本発明の第１のスクリーニング方法は、前記第１の接触工程を複数回実施することで、例えば、生体内においてより好適に機能するＣＡＲに用いうるｓｃＦｖを好適にスクリーニングできる。
前記第１の接触工程は、候補免疫細胞において、標的抗原を認識するＣＡＲを発現する候補免疫細胞を、標的抗原により刺激しているともいえる。このため、第１の接触工程は、例えば、抗原刺激工程ということもできる。
前記第１の接触工程において、前記候補免疫細胞の数は、特に制限されず、例えば、１×１０５〜１×１０８細胞、１×１０５〜１×１０７細胞、１×１０５〜１×１０６細胞、１×１０６〜５×１０６細胞、１×１０６〜３×１０６細胞である。
前記第１の接触工程において、前記標的抗原として、前記標的抗原を発現する細胞を用いる場合、前記第１の接触工程において、前記候補免疫細胞（Ｅ）と、前記標的抗原を発現する細胞（Ｔ）の細胞比（Ｅ：Ｔ）は、例えば、２：１〜５０：１、５：１〜４０：１、１０：１〜３０：１、または約２０：１である。
そして、前記第１の選抜工程では、前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合したＴ細胞に発現する第１のＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する。前記標的抗原と前記候補免疫細胞との結合は、例えば、直接または間接的に評価できる。前記標的抗原と前記候補免疫細胞との結合は、例えば、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖとして用いたときに、Ｔ細胞の活性化および機能性の発揮を誘導しうるｓｃＦｖを取得できることから、間接的な評価により実施してもよい。
前記直接的な評価方法は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー等の抗体と抗原との結合検出方法より実施できる。具体例として、前記直接的な評価方法は、例えば、標識化された標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて実施できる。この場合、前記第１の選抜工程では、例えば、前記標識化された標的抗原と、前記候補免疫細胞とを接触させる。前記候補免疫細胞が前記標的抗原に結合するＣＡＲを発現している場合、前記標識化された標的抗原と、前記候補免疫細胞とは複合体を形成する。このため、前記第１の選抜工程では、例えば、前記標識を含む複合体を形成している候補免疫細胞を、前記標的抗原に結合したＴ細胞と評価できる。
具体例として、前記直接的な評価方法では、前記候補免疫細胞と、蛍光標識された標的抗原のマルチマーとを混合し、前記標的抗原に特異的なＣＡＲを発現する候補免疫細胞と、前記蛍光標識された標的抗原との複合体を形成させる。つぎに、得られた混合物を、フローサイトメトリーにより解析し、前記蛍光標識された標的抗原との複合体を形成している候補免疫細胞を、前記蛍光標識由来のシグナルに基づき、検出し、評価および選抜する。
また、前記間接的な評価方法は、例えば、以下のように実施できる。前記標的抗原と結合するＣＡＲを発現するＴ細胞は、例えば、前記標的抗原との結合により活性化する。このため、前記間接的な評価方法は、例えば、前記候補免疫細胞の活性化を指標に評価する。具体例として、前記候補免疫細胞が前記標的抗原と結合すると、例えば、前記免疫細胞では、前記標的抗原と未結合の候補免疫細胞と比較して、活性化マーカーの発現の上昇、サイトカインおよび／またはケモカインの産生量の増加、増殖等が生じる。具体例として、前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＢ細胞の場合、前記各細胞では、例えば、下記活性化マーカーの発現の上昇、下記サイトカインおよび／またはケモカインの産生量の増加、増殖等が生じる。このため、前記第１の選抜工程では、例えば、いずれか１つ以上の指標に基づき、前記候補免疫細胞が活性化していると判断される場合、前記活性化している免疫細胞を、前記標的抗原に結合した免疫細胞と評価できる。前記サイトカインおよび／またはケモカインの産生量の増加は、例えば、前記サイトカインおよび／またはケモカインの発現が誘導されると、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加するレポーターを用いてもよい。前記レポーターは、例えば、蛍光タンパク質があげられる。前記増殖は、例えば、細胞を、Carboxyfluorescein succinimidyl ester（ＣＦＳＥ）等の蛍光細胞染色色素等で染色し、蛍光強度の減衰を指標に評価できる。
・Ｔ細胞
活性化マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７a等
サイトカイン・ケモカイン：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β等
・ＮＫ細胞
活性化マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７a等
サイトカイン・ケモカイン：ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１２等
・ＮＫＴ細胞
活性化マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７a、ＣＤ２５等
サイトカイン・ケモカイン：ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２等
・Ｂ細胞
活性化マーカー：ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、Ｂ２２０等
サイトカイン・ケモカイン：ＣＸＣＲ４等
そして、前記標的抗原と結合した候補免疫細胞に発現する第１のＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する。前記第１の候補ｓｃＦｖの選抜は、例えば、前記標的抗原と結合した候補免疫細胞を選抜し、選抜された候補免疫細胞におけるｓｃＦｖまたはＣＡＲをコードする塩基配列を解読することにより実施できる。前記第１の選抜工程では、例えば、さらに、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける、重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とを特定してもよい。各ＣＤＲの特定は、例えば、ゲノム情報（例えば、ＩＭＧＴのホームページ<http://www.imgt.org/>）を参照し、公知の方法により実施できる。
これにより、前記標的抗原に結合する新たなｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記第１のＣＡＲライブラリにおける第１のＣＡＲが前記条件１を満たす場合、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、前記標的抗原に結合する新たな軽鎖可変領域をスクリーニングできる。前記第１のＣＡＲライブラリにおける第１のＣＡＲが前記条件２を満たす場合、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、前記標的抗原に結合する新たな重鎖可変領域をスクリーニングできる。
本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖの新たな重鎖可変領域または軽鎖可変領域を、それぞれ、前記第１のＣＡＲライブラリにおける標的抗原に結合する抗原等における重鎖可変領域または軽鎖可変領域として、他方の領域のスクリーニングを実施してもよい。この場合、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、さらに、前記第１の候補ｓｃＦｖに基づき、第２のＣＡＲライブラリを調製する調製工程を含む。
前記第２のＣＡＲライブラリは、例えば、第２のＣＡＲをコードする核酸を含む。また、前記第２のＣＡＲは、例えば、第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。また、前記第２の抗原結合ドメインは、例えば、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含む。
前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、第２のＣＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味する。
前記第２のｓｃＦｖにおいて、前記標的抗原は、前記第１のｓｃＦｖにおける標的抗原と同じである。前記第２のｓｃＦｖは、例えば、前記第１のｓｃＦｖと類似の構造を有する。
前記第２のｓｃＦｖは、例えば、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む。前記第２の重鎖可変領域は、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、下記条件３または条件４を満たす。
条件３：
前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
条件４：
前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
前記条件３は、例えば、前記条件１を満たす第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた第１の候補ｓｃＦｖを用いて、第２のＣＡＲライブラリを調製する場合である。前記条件３では、例えば、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記第１の候補ｓｃＦｖを用い、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３について、前記標的抗原への結合をスクリーニングする。
前記第２の重鎖可変領域における第２のＢ細胞受容体は、例えば、前記条件２の第１の重鎖可変領域の説明において、「第１のＢ細胞受容体」を「第２のＢ細胞受容体」に、「第１の重鎖可変領域」を「第２の重鎖可変領域」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第２のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＨの説明における「第２のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」と、前記各ＦＲＬの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」とは、同じｓｃＦｖであることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
つぎに、前記条件４は、例えば、前記条件２を満たす第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた第１の候補ｓｃＦｖを用いて、第２のＣＡＲライブラリを調製する場合である。前記条件４では、例えば、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、前記第１の候補ｓｃＦｖを用い、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３について、前記標的抗原への結合をスクリーニングする。
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」と、前記各ＦＲＨの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」とは、同じｓｃＦｖであることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域における第２のＢ細胞受容体は、例えば、前記条件１の第１の軽鎖可変領域の説明において、「第１のＢ細胞受容体」を「第２のＢ細胞受容体」に、「第１の軽鎖可変領域」を「第２の軽鎖可変領域」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第２のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＬの説明における「第２のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２のｓｃＦｖにおいて、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前述のリンカーペプチド（Ｆｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第２のｓｃＦｖにおけるＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のｓｃＦｖにおけるＦｖリンカーペプチドと同じでもよいし、異なってもよい。
前記第２の抗原結合ドメインは、第２のｓｃＦｖを含むが、前記第２の結合ドメインは、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域を含む、ｓｃＦｖ以外の構造を有してもよい。具体例として、前記第２の結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ等としてもよい。
前記第２のＣＡＲにおいて、前記第２の膜貫通ドメインおよび第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、それぞれ、前記第１のＣＡＲライブラリにおける前記第１の膜貫通ドメインおよび第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、同じでもよいし、異なってもよい。前記第２のＣＡＲライブラリにおいて、前記第２の膜貫通ドメインおよび第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、それぞれ、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける第１の膜貫通ドメインおよび第１の細胞内シグナル伝達ドメインの説明を援用できる。
前記第２のＣＡＲにおいて、各ドメイン間は、例えば、リンカーペプチド（ドメインリンカーペプチド）により連結されてもよい。前記ドメインリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記ドメインリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。
前記第２のＣＡＲは、例えば、前記式（１）（配列番号１５）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。前記式（１）において、Ｖ１およびＶ２は、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列である。前記第２のＣＡＲにおける重鎖可変領域および軽鎖可変領域の順序は、例えば、より簡便に第２のＣＡＲライブラリを調製できることから、前記第１のＣＡＲにおける重鎖可変領域および軽鎖可変領域の順序と、逆の順序が好ましい。具体例として、前記第１のＣＡＲにおいて、Ｎ末端から、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がこの順序で配置されている場合、第２のＣＡＲにおいて、Ｎ末端から、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、この順序で配置されている。前記第１のＣＡＲにおいて、Ｎ末端から、軽鎖可変領域および重鎖可変領域がこの順序で配置されている場合、第２のＣＡＲにおいて、Ｎ末端から、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、例えば、この順序で配置されている。
前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、前記式（２）（配列番号１６）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記式（２）において、Ｎ１およびＮ２は、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする塩基配列、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする塩基配列である。
前記第２のＣＡＲライブラリは、例えば、複数種類の核酸を含むことが好ましい。この場合、前記第２のＣＡＲライブラリは、例えば、複数種類の核酸の混合物である。前記複数種類の核酸は、例えば、その一部または全部が、異なる第２のＣＡＲをコードしていることが好ましく、異なる第２の抗原結合ドメインをコードしていることが好ましい。複数種類の核酸が異なる第２の抗原結合ドメインをコードしている場合、前記第２のＣＡＲにおける第２の抗原結合ドメイン以外の領域は、例えば、同じまたは異なるアミノ酸配列である。前記第２のＣＡＲライブラリに含まれる前記核酸の種類は、例えば、１×１０５〜１×１０７種類、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類であり、好ましくは、約２×１０６種類（例えば、１×１０６〜３×１０６種類）である。
前記第２のＣＡＲは、例えば、Ｎ末端にシグナルペプチドを有してもよい。前記第２のＣＡＲは、例えば、タグを有してもよい。前記シグナルペプチドおよびタグは、例えば、前記第１のＣＡＲにおけるシグナルペプチドおよびタグの説明において、「第１のＣＡＲ」を「第２のＣＡＲ」に読み替えて、その説明を援用できる。
本発明において、前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、前記第２のＣＡＲのアミノ酸配列に基づき、常法により調製できる。具体例として、前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、前述の各ドメインのアミノ酸配列が登録されたデータベースにおいて、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、前記塩基配列に基づき、分子生物学的手法および／または化学的合成方法により調製できる。前記核酸の塩基配列は、例えば、前記第２のＣＡＲライブラリを発現させる細胞の由来に応じて、コドン最適化してもよい。
前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、発現ベクターに導入されてもよい。前記発現ベクターは、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける発現ベクターの説明を援用できる。
つぎに、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、前記第１のＣＡＲライブラリに代えて、前記調製工程において調製された第２のＣＡＲライブラリを用いる以外は、同様にして、発現工程、接触工程、および選抜工程を実施する。具体的には、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、さらに、前記第２のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第２の発現工程と、前記第２の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第２の接触工程と、前記第２の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第２のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第２の候補ｓｃＦｖとして第２の選抜工程とを含む。前記第１の発現工程、第１の接触工程、および第１の選抜工程における免疫細胞と、前記第２の発現工程、第２の接触工程、および第２の選抜工程における免疫細胞とは、同じでもよいし、異なってもよい。前記免疫細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞様の細胞が好ましい。
前記第２の発現工程は、例えば、前記第１の発現工程の説明において、「第１の発現工程」を「第２の発現工程」に、「第１のＣＡＲライブラリ」を「第２のＣＡＲライブラリ」に、「第１のＣＡＲ」を「第２のＣＡＲ」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第２の接触工程は、例えば、前記第１の接触工程の説明において、「第１の発現工程」を「第２の発現工程」に、「第１の接触工程」を「第２の接触工程」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第２の選抜工程は、例えば、前記第１の選抜工程の説明において、「第１の接触工程」を「第２の接触工程」に、「第１の選抜工程」を「第２の選抜工程」に、「第１のｓｃＦｖ」を「第２のｓｃＦｖ」に、「第１の候補ｓｃＦｖ」を「第２の候補ｓｃＦｖ」に、「第１のＣＡＲ」を「第２のＣＡＲ」に読み替えてその説明を援用できる。
これにより、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、前記標的抗原に結合する新たな重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するｓｃＦｖをスクリーニングできる。
本発明の第１のスクリーニング方法は、第１の候補ｓｃＦｖまたは第２の候補ｓｃＦｖに基づき、抗体またはその抗原結合断片を設計する設計工程を含んでもよい。前記設計工程は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とを、新たな抗体またはその抗原結合断片に移植することにより実施できる。具体的には、前記設計工程は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列と、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列とを、それぞれ、新たな抗体またはその抗原結合断片におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列とすることにより実施できる。前記設計工程におけるＣＤＲの移植は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおいて、１つのＣＤＲについて実施してもよいし、複数のＣＤＲについて実施してもよいが、全てのＣＤＲについて実施することが好ましい。前記新たな抗体およびその抗原結合断片の種類は、例えば、後述の本発明の抗体またはその抗原結合断片の種類の説明を援用できる。
前記設計工程では、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４と、軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４とを、新たな抗体またはその抗原結合断片に移植してもよい。この場合、前記設計工程では、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列と、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列とを、それぞれ、新たな抗体またはその抗原結合断片におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列と、軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列とすることにより実施できる。前記設計工程におけるＦＲの移植は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖまたは前記第２の候補ｓｃＦｖにおいて、１つのＦＲについて実施してもよいし、複数のＦＲについて実施してもよいが、全てのＦＲについて実施することが好ましい。
本発明の第１のスクリーニング方法では、前記第１の発現工程を含むが、本発明はこれに限定されず、前記第１の発現工程を含まなくてもよい。この場合、本発明の第１のスクリーニング方法は、例えば、予め調製された、前記本発明のＣＡＲライブラリを発現する免疫細胞（ＣＡＲライブラリ細胞）を用いて、第１の接触工程から実施できる。
＜ＣＡＲライブラリ細胞＞
本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライブラリ細胞は、前記本発明のＣＡＲライブラリを発現する細胞を含む。本発明のＣＡＲライブラリ細胞は、前記本発明のＣＡＲライブラリを発現する細胞を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のＣＡＲライブラリ細胞発現細胞によれば、前記本発明の第１のスクリーニング方法を好適に実施できる。本発明のＣＡＲライブラリ細胞は、前記本発明のＣＡＲライブラリおよび第１のスクリーニング方法の説明を援用できる。
本発明のＣＡＲライブラリ細胞の数は、例えば、１×１０５〜１×１０８細胞、１×１０５〜１×１０７細胞、１×１０５〜１×１０６細胞、１×１０６〜５×１０６細胞、１×１０６〜３×１０６細胞である。前記ＣＡＲライブラリ細胞は、例えば、それぞれが、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける異なるＣＡＲを発現することが好ましい。前記ＣＡＲライブラリ細胞は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリを発現しない細胞、すなわち、ＣＡＲライブラリが未導入の細胞を含んでもよい。
本発明のＣＡＲライブラリ細胞が発現するＣＡＲの種類は、１×１０６細胞のＣＡＲライブラリ細胞あたり、例えば、１×１０４〜１×１０７種類、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類、１×１０５〜１×１０６種類である。
本発明のＣＡＲライブラリ細胞は、例えば、前記本発明の第１のスクリーニング方法の第１の発現工程と同様にして、製造できる。本発明のＣＡＲライブラリ細胞は、例えば、免疫細胞由来の細胞であることが好ましく、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞由来であることが好ましい。
＜第１の抗体またはその抗原結合断片＞
本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５の複合体（以下、「A2/NY-ESO-1157」ともいう）に対する抗体またはその抗原結合断片は、前述のように、下記（Ｈ）の重鎖可変領域と、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域とを含む。本発明の抗体等は、下記（Ｈ）の重鎖可変領域と、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域とを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗体等は、A2/NY-ESO-1157に結合する。また、A2/NY-ESO-1157は、例えば、肺がん、悪性黒色腫、滑膜肉腫、骨髄腫等の特定のがん細胞に発現することが知られている。このため、本発明の抗体等は、例えば、A2/NY-ESO-1157発現がん細胞に対する二重特異性抗体、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲの抗原結合ドメイン等として好適に使用できる。前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法等の説明を援用できる。
（Ｈ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
（H1）下記（H1-1）、（H1-2）または（H1-3）のアミノ酸配列
（H1-1）下記表１ＡのＣＤＲＨ１のいずれかのアミノ酸配列
（H1-2）（H1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-3）（H1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2）下記（H2-1）、（H2-2）または（H2-3）のアミノ酸配列
（H2-1）下記表１ＡのＣＤＲＨ２のいずれかのアミノ酸配列
（H2-2）（H2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-3）（H2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3）下記（H3-1）、（H3-2）または（H3-3）のアミノ酸配列
（H3-1）下記表１ＡのＣＤＲＨ３のいずれかのアミノ酸配列
（H3-2）（H3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-3）（H3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（Ｌ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
（L1）下記（L1-1）、（L1-2）または（L1-3）のアミノ酸配列
（L1-1）下記表１ＢのＣＤＲＬ１のいずれかのアミノ酸配列
（L1-2）（L1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-3）（L1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2）下記（L2-1）、（L2-2）または（L2-3）のアミノ酸配列
（L2-1）下記表１ＢのＣＤＲＬ２のいずれかのアミノ酸配列
（L2-2）（L2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-3）（L2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3）下記（L3-1）、（L3-2）または（L3-3）のアミノ酸配列
（L3-1）下記表１ＢのＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列
（L3-2）（L3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-3）（L3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
本発明において、「ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１」は、例えば、ヒト主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）のＡ＊０２：０１アリルに由来するクラスＩ抗原を意味する。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１は、例えば、ヒトβ２−ミクログロブリンと複合体を形成している。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号HG794376で登録されているアミノ酸配列があげられる。ヒトβ２−ミクログロブリンのアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NM_004048.2で登録されているアミノ酸配列があげられる。
本発明において、「ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５」は、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質のアミノ酸配列において１５７〜１６５番目のアミノ酸（SLLMWITQC（配列番号２０６）からなるペプチドを意味する。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、例えば、ヒト肺がん、悪性黒色腫、滑膜肉腫、骨髄腫等のがんに発現するがん抗原である。ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号NM_001327.2で登録されているアミノ酸配列があげられる。
本発明において、「A2/NY-ESO-1157」は、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１とＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５とにより形成された複合体を意味し、具体的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のペプチド結合溝にＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５が結合した複合体を意味する。A2/NY-ESO-1157は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１とヒトβ２−ミクログロブリンとの複合体のペプチド結合溝にＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５が結合した複合体であることが好ましい。
本発明の抗体は、例えば、分子構造がイムノグロブリンである、いわゆる「抗体」でもよいし、その抗原結合断片でもよい。本発明の抗体等は、前述の前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域を有していればよい。本発明が抗体の場合、例えば、そのイムノグロブリンクラスおよびアイソタイプは、特に制限されない。前記イムノグロブリンクラスは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等があげられる。前記ＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等があげられる。
前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト（例えば、完全ヒト）抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体等であってもよい。
本発明における「抗原結合断片」は、前記抗体の一部分、例えば、部分断片であり、且つ、前記A2/NY-ESO-1157を認識（結合）するものを意味する。前記抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体およびこれらの重合体等があげられる。前記ｓｃＦｖは、例えば、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、リンカーを介して連結している。前記重鎖可変領域、前記リンカー、および前記軽鎖可変領域の順序は、Ｎ末端から、前記重鎖可変領域、前記リンカー、および前記軽鎖可変領域の順序でもよいし、Ｎ末端から、前記軽鎖可領域領、前記リンカー、および前記重鎖可変領域の順序でもよい。
本発明の抗体等は、前述の前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の他に、例えば、定常領域を有してもよく、前記定常領域は、例えば、ヒト定常領域、またはマウス定常領域である。抗体（イムノグロブリン）の場合、重鎖の定常領域は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３という領域を含み、軽鎖の定常領域は、例えば、ＣＬという領域を含む。本発明の抗体等が前記定常領域を有する場合、例えば、前記重鎖可変領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の少なくとも１つと結合し、前記軽鎖可変領域は、前記ＣＬと結合しており、前記重鎖可変領域は、例えば、ＣＨ１と直接結合している。
一般に、抗体分子の重鎖および軽鎖は、それぞれ、３ヶ所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Complemetarity determining region）を有している。ＣＤＲは、超可変領域（hypervariable domain）ともいう。ＣＤＲは、前記重鎖および軽鎖の可変領域でも、特に一次構造の変異性が高い領域であり、一次構造上において、通常、３ヶ所に分離している。本発明においては、重鎖における３ヶ所のＣＤＲを、重鎖のアミノ酸配列におけるアミノ末端側から、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）と表し、軽鎖における３ヶ所のＣＤＲを、軽鎖のアミノ酸配列におけるアミノ末端側から、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）と表す。これらの部位は、立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
前記（Ｈ）の重鎖可変領域において、前記ＣＤＲＨ１は、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ１である。前記ＣＤＲＨ２は、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ２である。前記ＣＤＲＨ３は、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ３である。
前記（Ｌ）の軽鎖可変領域において、前記ＣＤＲＬ１は、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１である。前記ＣＤＲＬ２は、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ２である。前記ＣＤＲＬ３は、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ３である。
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記アミノ酸の置換は、例えば、保存的置換であってもよい（以下、同様）。前記保存的置換は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または数個のアミノ酸を、他のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。「置換するアミノ酸」と「置換されるアミノ酸」とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、例えば、疎水性および親水性の指標（ハイドロパシー）、極性、電荷等の化学的性質、または、二次構造等の物理的性質等が類似していることが好ましい。前記性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、例えば、当該技術分野において公知である。具体例として、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）は、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等があげられ、極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等があげられ、陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）は、アルギニン、ヒスチジン、リジン等があげられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。
前記（Ｈ）の重鎖可変領域において、前記（H1-1）、（H2-1）および（H3-1）の組合せは、特に制限されず、例えば、それぞれ、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ１と、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ２と、前記（HA）または（HB）におけるＣＤＲＨ３との任意の組合せとできる。前記（H1-1）、（H2-1）および（H3-1）の組合せは、好ましくは、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３である。
前記（Ｌ）の軽鎖可変領域において、前記（L1-1）、（L2-1）および（L3-1）の組合せは、特に制限されず、例えば、それぞれ、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１と、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ２と、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ３との任意の組合せとできる。前記（L1-1）、（L2-1）および（L3-1）の組合せは、好ましくは、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３である。
前記（H1-1）、（H2-1）および（H3-1）と、前記（L1-1）、（L2-1）および（L3-1）との組合せは、特に制限されず、例えば、それぞれ、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ１、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ２、および前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ３と、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ２、ならびに前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ３との任意の組合せとできる。前記（H1-1）、（H2-1）および（H3-1）と、前記（L1-1）、（L2-1）および（L3-1）との組合せは、好ましくは、それぞれ、前記（HA）、（HB）または（HC）におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、前記（LA）〜（LQ）および（LR）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３との組合せであり、より好ましくは、下記表２の組合せである。
以下に、本発明の抗体等について、前記重鎖可変領域または重鎖と前記軽鎖可変領域または軽鎖との組合せについてより具体的に説明する。各組合せにおける重鎖可変領域および重鎖の説明は、互いに援用できる。また、各組合せにおける軽鎖可変領域および軽鎖の説明は、互いに援用できる。また、以下に示すアミノ酸配列および塩基配列において、下線で示すアミノ酸配列および塩基配列は、特に言及しない限り、ＣＤＲに対応するアミノ酸配列およびＣＤＲに対応するアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
本発明の抗体等において、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域との組合せは、例えば、前述のように、前記（１）〜（１８）の組合せである。
組合せ（１）
組合せ（１）の抗体等は、例えば、抗体H1-3M4E5L群ともいう。前記組合せ（１）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、下記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、下記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、下記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LA）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（H1-A）下記（H1-A1）、（H1-A2）または（H1-A3）のアミノ酸配列
（H1-A1）配列番号１７（GGSISSNY）のアミノ酸配列
（H1-A2）配列番号１７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-A3）配列番号１７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-A）下記（H2-A1）、（H2-A2）または（H2-A3）のアミノ酸配列
（H2-A1）配列番号１８（VSYSGST）のアミノ酸配列
（H2-A2）配列番号１８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-A3）配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-A）下記（H3-A1）、（H3-A2）または（H3-A3）のアミノ酸配列
（H3-A1）配列番号１９（ARESYYYYGMDV）のアミノ酸配列
（H3-A2）配列番号１９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-A3）配列番号１９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L1-A）下記（L1-A1）、（L1-A2）または（L1-A3）のアミノ酸配列
（L1-A1）配列番号２９（SRDVGGYNY）のアミノ酸配列
（L1-A2）配列番号２９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-A3）配列番号２９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-A）下記（L2-A1）、（L2-A2）または（L2-A3）のアミノ酸配列
（L2-A1）配列番号３０（DVI）のアミノ酸配列
（L2-A2）配列番号３０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-A3）配列番号３０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-A）下記（L3-A1）、（L3-A2）または（L3-A3）のアミノ酸配列
（L3-A1）配列番号３１（WSFAGSYYV）のアミノ酸配列
（L3-A2）配列番号３１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-A3）配列番号３１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、下記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LA）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（H-A）下記（H-A1）、（H-A2）または（H-A3）のアミノ酸配列
（H-A1）配列番号２０のアミノ酸配列
配列番号２０：QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
（H-A2）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H-A3）配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L-A）下記（L-A1）、（L-A2）または（L-A3）のアミノ酸配列
（L-A1）配列番号３２のアミノ酸配列
配列番号３２：QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
（L-A2）配列番号３２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-A3）配列番号３２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（H-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（H-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（H-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
前記（L-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号３２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号３２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-A1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-3M4E5L」ともいう。
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（２）
組合せ（２）の抗体等は、例えば、抗体H1-K52群ともいう。前記組合せ（２）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LB）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-B）下記（L1-B1）、（L1-B2）または（L1-B3）のアミノ酸配列
（L1-B1）配列番号３３（QSISSY）のアミノ酸配列
（L1-B2）配列番号３３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-B3）配列番号３３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-B）下記（L2-B1）、（L2-B2）または（L2-B3）のアミノ酸配列
（L2-B1）配列番号３４（AAS）のアミノ酸配列
（L2-B2）配列番号３４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-B3）配列番号３４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-B）下記（L3-B1）、（L3-B2）または（L3-B3）のアミノ酸配列
（L3-B1）配列番号３５（QQYYSTPQT）のアミノ酸配列
（L3-B2）配列番号３５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-B3）配列番号３５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（２）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LB）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-B）下記（L-B1）、（L-B2）または（L-B3）のアミノ酸配列
（L-B1）配列番号３６のアミノ酸配列
配列番号３６：DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPQTFGPGTKVDIK
（L-B2）配列番号３６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-B3）配列番号３６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号３６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号３６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-B1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K52」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（３）
組合せ（３）の抗体等は、例えば、抗体H1-K73群ともいう。前記組合せ（３）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LC）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-C）下記（L1-C1）、（L1-C2）または（L1-C3）のアミノ酸配列
（L1-C1）配列番号３７（QSISSY）のアミノ酸配列
（L1-C2）配列番号３７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-C3）配列番号３７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-C）下記（L2-C1）、（L2-C2）または（L2-C3）のアミノ酸配列
（L2-C1）配列番号３８（AAS）のアミノ酸配列
（L2-C2）配列番号３８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-C3）配列番号３８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-C）下記（L3-C1）、（L3-C2）または（L3-C3）のアミノ酸配列
（L3-C1）配列番号３９（QQYESYRRS）のアミノ酸配列
（L3-C2）配列番号３９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-C3）配列番号３９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（３）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LC）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-C）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-C）下記（L-C1）、（L-C2）または（L-C3）のアミノ酸配列
（L-C1）配列番号４０のアミノ酸配列
配列番号４０：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYRRSFGQGTKVEIK
（L-C2）配列番号４０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-C3）配列番号４０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-C1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-C1）、ＣＤＲＬ２の（L2-C1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-C1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-C2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-C1）、ＣＤＲＬ２の（L2-C1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-C1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-C3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-C1）、ＣＤＲＬ２の（L2-C1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-C1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-C1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K73」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（４）
組合せ（４）の抗体等は、例えば、抗体H1-K121-K124群ともいう。前記組合せ（４）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LD）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-D）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-D）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-D）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-D）下記（L1-D1）、（L1-D2）または（L1-D3）のアミノ酸配列
（L1-D1）配列番号４１（QSISSY）のアミノ酸配列
（L1-D2）配列番号４１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-D3）配列番号４１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-D）下記（L2-D1）、（L2-D2）または（L2-D3）のアミノ酸配列
（L2-D1）配列番号４２（AAS）のアミノ酸配列
（L2-D2）配列番号４２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-D3）配列番号４２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-D）下記（L3-D1）、（L3-D2）または（L3-D3）のアミノ酸配列
（L3-D1）配列番号４３（QQYNSYSRT）のアミノ酸配列
（L3-D2）配列番号４３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-D3）配列番号４３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（４）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LD）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-DA）または（L-DB）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-DA）下記（L-DA1）、（L-DA2）または（L-DA3）のアミノ酸配列
（L-DA1）配列番号４４のアミノ酸配列
配列番号４４：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
（L-DA2）配列番号４４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-DA3）配列番号４４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L-DB）下記（L-DB1）、（L-DB2）または（L-DB3）のアミノ酸配列
（L-DB1）配列番号４５のアミノ酸配列
配列番号４５：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
（L-DB2）配列番号４５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-DB3）配列番号４５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-DA1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-DA2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-DA3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
前記（L-DB1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-DB2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-DB3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-DA1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K121」ともいう。また、本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-DB1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K124」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（５）
組合せ（５）の抗体等は、例えば、抗体H1-K125群ともいう。前記組合せ（５）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LE）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-E）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-E）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-E）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-E）下記（L1-E1）、（L1-E2）または（L1-E3）のアミノ酸配列
（L1-E1）配列番号４６（QSISSY）のアミノ酸配列
（L1-E2）配列番号４６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-E3）配列番号４６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-E）下記（L2-E1）、（L2-E2）または（L2-E3）のアミノ酸配列
（L2-E1）配列番号４７（AAS）のアミノ酸配列
（L2-E2）配列番号４７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-E3）配列番号４７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-E）下記（L3-E1）、（L3-E2）または（L3-E3）のアミノ酸配列
（L3-E1）配列番号４８（QQYNSYSPCT）のアミノ酸配列
（L3-E2）配列番号４８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-E3）配列番号４８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（５）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LE）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-E）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-E）下記（L-E1）、（L-E2）または（L-E3）のアミノ酸配列
（L-E1）配列番号４９のアミノ酸配列
配列番号４９：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPCTFGPGTKVDIK
（L-E2）配列番号４９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-E3）配列番号４９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-E1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-E1）、ＣＤＲＬ２の（L2-E1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-E1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-E2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-E1）、ＣＤＲＬ２の（L2-E1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-E1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-E3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-E1）、ＣＤＲＬ２の（L2-E1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-E1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号４９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-E1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K125」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（６）
組合せ（６）の抗体等は、例えば、抗体H1-K131群ともいう。前記組合せ（６）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LF）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-F）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-F）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-F）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-F）下記（L1-F1）、（L1-F2）または（L1-F3）のアミノ酸配列
（L1-F1）配列番号５０（QDISRY）のアミノ酸配列
（L1-F2）配列番号５０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-F3）配列番号５０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-F）下記（L2-F1）、（L2-F2）または（L2-F3）のアミノ酸配列
（L2-F1）配列番号５１（AAS）のアミノ酸配列
（L2-F2）配列番号５１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-F3）配列番号５１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-F）下記（L3-F1）、（L3-F2）または（L3-F3）のアミノ酸配列
（L3-F1）配列番号５２（QQYDNLIT）のアミノ酸配列
（L3-F2）配列番号５２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-F3）配列番号５２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（６）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LF）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-F）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-F）下記（L-F1）、（L-F2）または（L-F3）のアミノ酸配列
（L-F1）配列番号５３のアミノ酸配列
配列番号５３：DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIK
（L-F2）配列番号５３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-F3）配列番号５３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-F1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-F1）、ＣＤＲＬ２の（L2-F1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-F1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-F2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-F1）、ＣＤＲＬ２の（L2-F1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-F1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号５３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-F3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-F1）、ＣＤＲＬ２の（L2-F1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-F1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号５３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-F1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K131」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（７）
組合せ（７）の抗体等は、例えば、抗体H1-K145群ともいう。前記組合せ（７）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LG）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-G）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-G）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-G）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-G）下記（L1-G1）、（L1-G2）または（L1-G3）のアミノ酸配列
（L1-G1）配列番号５４（QDISRY）のアミノ酸配列
（L1-G2）配列番号５４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-G3）配列番号５４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-G）下記（L2-G1）、（L2-G2）または（L2-G3）のアミノ酸配列
（L2-G1）配列番号５５（AAS）のアミノ酸配列
（L2-G2）配列番号５５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-G3）配列番号５５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-G）下記（L3-G1）、（L3-G2）または（L3-G3）のアミノ酸配列
（L3-G1）配列番号５６（QQYNSYSRT）のアミノ酸配列
（L3-G2）配列番号５６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-G3）配列番号５６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（７）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LG）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-G）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-G）下記（L-G1）、（L-G2）または（L-G3）のアミノ酸配列
（L-G1）配列番号５７のアミノ酸配列
配列番号５７：DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
（L-G2）配列番号５７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-G3）配列番号５７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-G1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-G1）、ＣＤＲＬ２の（L2-G1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-G1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-G2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-G1）、ＣＤＲＬ２の（L2-G1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-G1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号５７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-G3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-G1）、ＣＤＲＬ２の（L2-G1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-G1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号５７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-G1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K145」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（８）
組合せ（８）の抗体等は、例えば、抗体H1-K151群ともいう。前記組合せ（８）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LH）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-H）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-H）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-H）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-H）下記（L1-H1）、（L1-H2）または（L1-H3）のアミノ酸配列
（L1-H1）配列番号５８（QSISSY）のアミノ酸配列
（L1-H2）配列番号５８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-H3）配列番号５８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-H）下記（L2-H1）、（L2-H2）または（L2-H3）のアミノ酸配列
（L2-H1）配列番号５９（AAS）のアミノ酸配列
（L2-H2）配列番号５９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-H3）配列番号５９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-H）下記（L3-H1）、（L3-H2）または（L3-H3）のアミノ酸配列
（L3-H1）配列番号６０（QQYDNLIT）のアミノ酸配列
（L3-H2）配列番号６０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-H3）配列番号６０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（８）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LH）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-H）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-H）下記（L-H1）、（L-H2）または（L-H3）のアミノ酸配列
（L-H1）配列番号６１のアミノ酸配列
配列番号６１：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIK
（L-H2）配列番号６１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-H3）配列番号６１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-H1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-H1）、ＣＤＲＬ２の（L2-H1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-H1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-H2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-H1）、ＣＤＲＬ２の（L2-H1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-H1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号６１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-H3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-H1）、ＣＤＲＬ２の（L2-H1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-H1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号６１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-H1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K151」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（９）
組合せ（９）の抗体等は、例えば、抗体H1-K160群ともいう。前記組合せ（９）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LI）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-I）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-I）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-I）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-I）下記（L1-I1）、（L1-I2）または（L1-I3）のアミノ酸配列
（L1-I1）配列番号６２（QSVSSN）のアミノ酸配列
（L1-I2）配列番号６２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-I3）配列番号６２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-I）下記（L2-I1）、（L2-I2）または（L2-I3）のアミノ酸配列
（L2-I1）配列番号６３（GAS）のアミノ酸配列
（L2-I2）配列番号６３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-I3）配列番号６３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-I）下記（L3-I1）、（L3-I2）または（L3-I3）のアミノ酸配列
（L3-I1）配列番号６４（QQYNSYSRT）のアミノ酸配列
（L3-I2）配列番号６４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-I3）配列番号６４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（９）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LI）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-I）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-I）下記（L-I1）、（L-I2）または（L-I3）のアミノ酸配列
（L-I1）配列番号６５のアミノ酸配列
配列番号６５：EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
（L-I2）配列番号６５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-I3）配列番号６５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-I1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-I1）、ＣＤＲＬ２の（L2-I1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-I1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-I2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-I1）、ＣＤＲＬ２の（L2-I1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-I1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号６５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-I3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-I1）、ＣＤＲＬ２の（L2-I1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-I1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号６５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-I1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K160」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１０）
組合せ（１０）の抗体等は、例えば、抗体H1-K173群ともいう。前記組合せ（１０）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LJ）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-J）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-J）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-J）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-J）下記（L1-J1）、（L1-J2）または（L1-J3）のアミノ酸配列
（L1-J1）配列番号６６（QSISSY）のアミノ酸配列
（L1-J2）配列番号６６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-J3）配列番号６６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-J）下記（L2-J1）、（L2-J2）または（L2-J3）のアミノ酸配列
（L2-J1）配列番号６７（AAS）のアミノ酸配列
（L2-J2）配列番号６７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-J3）配列番号６７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-J）下記（L3-J1）、（L3-J2）または（L3-J3）のアミノ酸配列
（L3-J1）配列番号６８（QQYESYSRT）のアミノ酸配列
（L3-J2）配列番号６８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-J3）配列番号６８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１０）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LJ）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-J）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-J）下記（L-J1）、（L-J2）または（L-J3）のアミノ酸配列
（L-J1）配列番号６９のアミノ酸配列
配列番号６９：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYSRTFGQGTKVEIK
（L-J2）配列番号６９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-J3）配列番号６９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-J1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-J1）、ＣＤＲＬ２の（L2-J1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-J1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-J2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-J1）、ＣＤＲＬ２の（L2-J1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-J1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号６９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-J3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-J1）、ＣＤＲＬ２の（L2-J1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-J1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号６９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-J1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K173」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１１）
組合せ（１１）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L1群ともいう。前記組合せ（１１）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、下記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、下記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、下記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LK）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-K）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-K）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-K）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（H1-B）下記（H1-B1）、（H1-B2）または（H1-B3）のアミノ酸配列
（H1-B1）配列番号２１（GFTFSTYQ）のアミノ酸配列
（H1-B2）配列番号２１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-B3）配列番号２１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-B）下記（H2-B1）、（H2-B2）または（H2-B3）のアミノ酸配列
（H2-B1）配列番号２２（IVSSGGST）のアミノ酸配列
（H2-B2）配列番号２２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-B3）配列番号２２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-B）下記（H3-B1）、（H3-B2）または（H3-B3）のアミノ酸配列
（H3-B1）配列番号２３（AGELLPYYGMDV）のアミノ酸配列
（H3-B2）配列番号２３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-B3）配列番号２３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L1-K）下記（L1-K1）、（L1-K2）または（L1-K3）のアミノ酸配列
（L1-K1）配列番号７０（SSDVGGYDF）のアミノ酸配列
（L1-K2）配列番号７０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-K3）配列番号７０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-K）下記（L2-K1）、（L2-K2）または（L2-K3）のアミノ酸配列
（L2-K1）配列番号７１（DVN）のアミノ酸配列
（L2-K2）配列番号７１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-K3）配列番号７１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-K）下記（L3-K1）、（L3-K2）または（L3-K3）のアミノ酸配列
（L3-K1）配列番号７２（SSYAGSNSV）のアミノ酸配列
（L3-K2）配列番号７２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-K3）配列番号７２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１１）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、下記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LK）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-K）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（H-B）下記（H-B1）、（H-B2）または（H-B3）のアミノ酸配列
（H-B1）配列番号２４のアミノ酸配列
配列番号２４：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
（H-B2）配列番号２４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H-B3）配列番号２４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L-K）下記（L-K1）、（L-K2）または（L-K3）のアミノ酸配列
（L-K1）配列番号７３のアミノ酸配列
配列番号７３：QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGEAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVL
（L-K2）配列番号７３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-K3）配列番号７３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（H-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（H-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（H-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
前記（L-K1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-K1）、ＣＤＲＬ２の（L2-K1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-K1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-K2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-K1）、ＣＤＲＬ２の（L2-K1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-K1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-K3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-K1）、ＣＤＲＬ２の（L2-K1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-K1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-K1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L1」ともいう。
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１２）
組合せ（１２）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L66群ともいう。前記組合せ（１２）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LL）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-L）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-L）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-L）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-L）下記（L1-L1）、（L1-L2）または（L1-L3）のアミノ酸配列
（L1-L1）配列番号７４（SSDVGGYEF）のアミノ酸配列
（L1-L2）配列番号７４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-L3）配列番号７４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-L）下記（L2-L1）、（L2-L2）または（L2-L3）のアミノ酸配列
（L2-L1）配列番号７５（DVI）のアミノ酸配列
（L2-L2）配列番号７５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-L3）配列番号７５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-L）下記（L3-L1）、（L3-L2）または（L3-L3）のアミノ酸配列
（L3-L1）配列番号７６（SSYTSSSTYV）のアミノ酸配列
（L3-L2）配列番号７６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-L3）配列番号７６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１２）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LL）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-L）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-L）下記（L-L1）、（L-L2）または（L-L3）のアミノ酸配列
（L-L1）配列番号７７のアミノ酸配列
配列番号７７：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYEFVSWYQQHPGSAPKLIIYDVIERPFGVSYRFSASKSGNTASLTISGLQGEDEADYFCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVL
（L-L2）配列番号７７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-L3）配列番号７７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-L1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-L1）、ＣＤＲＬ２の（L2-L1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-L1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-L2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-L1）、ＣＤＲＬ２の（L2-L1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-L1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-L3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-L1）、ＣＤＲＬ２の（L2-L1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-L1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-L1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L66」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１３）
組合せ（１３）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L73群ともいう。前記組合せ（１３）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LM）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-M）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-M）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-M）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-M）下記（L1-M1）、（L1-M2）または（L1-M3）のアミノ酸配列
（L1-M1）配列番号７８（GSDVGAYDY）のアミノ酸配列
（L1-M2）配列番号７８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-M3）配列番号７８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-M）下記（L2-M1）、（L2-M2）または（L2-M3）のアミノ酸配列
（L2-M1）配列番号７９（DVS）のアミノ酸配列
（L2-M2）配列番号７９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-M3）配列番号７９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-M）下記（L3-M1）、（L3-M2）または（L3-M3）のアミノ酸配列
（L3-M1）配列番号８０（SSYSGSSTWV）のアミノ酸配列
（L3-M2）配列番号８０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-M3）配列番号８０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１３）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LM）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-M）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-M）下記（L-M1）、（L-M2）または（L-M3）のアミノ酸配列
（L-M1）配列番号８１のアミノ酸配列
配列番号８１：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGAYDYVSWYQHHPGRAPRLIIRDVSVRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSGSSTWVFGGGTKLTVL
（L-M2）配列番号８１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-M3）配列番号８１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-M1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-M1）、ＣＤＲＬ２の（L2-M1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-M1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-M2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-M1）、ＣＤＲＬ２の（L2-M1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-M1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号８１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-M3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-M1）、ＣＤＲＬ２の（L2-M1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-M1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号８１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-M1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L73」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１４）
組合せ（１４）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L80群ともいう。前記組合せ（１４）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LN）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-N）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-N）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-N）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-N）下記（L1-N1）、（L1-N2）または（L1-N3）のアミノ酸配列
（L1-N1）配列番号８２（SSDVGSYNL）のアミノ酸配列
（L1-N2）配列番号８２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-N3）配列番号８２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-N）下記（L2-N1）、（L2-N2）または（L2-N3）のアミノ酸配列
（L2-N1）配列番号８３（DVS）のアミノ酸配列
（L2-N2）配列番号８３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-N3）配列番号８３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-N）下記（L3-N1）、（L3-N2）または（L3-N3）のアミノ酸配列
（L3-N1）配列番号８４（SSYTSSSTFAV）のアミノ酸配列
（L3-N2）配列番号８４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-N3）配列番号８４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１４）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LN）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-N）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-N）下記（L-N1）、（L-N2）または（L-N3）のアミノ酸配列
（L-N1）配列番号８５のアミノ酸配列
配列番号８５：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVL
（L-N2）配列番号８５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-N3）配列番号８５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-N1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-N1）、ＣＤＲＬ２の（L2-N1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-N1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-N2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-N1）、ＣＤＲＬ２の（L2-N1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-N1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号８５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-N3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-N1）、ＣＤＲＬ２の（L2-N1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-N1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号８５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-N1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L80」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１５）
組合せ（１５）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L88群ともいう。前記組合せ（１５）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LO）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-O）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-O）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-O）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-O）下記（L1-O1）、（L1-O2）または（L1-O3）のアミノ酸配列
（L1-O1）配列番号８６（SSDVGGYNY）のアミノ酸配列
（L1-O2）配列番号８６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-O3）配列番号８６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-O）下記（L2-O1）、（L2-O2）または（L2-O3）のアミノ酸配列
（L2-O1）配列番号８７（DVS）のアミノ酸配列
（L2-O2）配列番号８７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-O3）配列番号８７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-O）下記（L3-O1）、（L3-O2）または（L3-O3）のアミノ酸配列
（L3-O1）配列番号８８（CSYAGGYYV）のアミノ酸配列
（L3-O2）配列番号８８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-O3）配列番号８８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１５）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LO）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-O）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-O）下記（L-O1）、（L-O2）または（L-O3）のアミノ酸配列
（L-O1）配列番号８９のアミノ酸配列
配列番号８９：QSALPQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYFCCSYAGGYYVFGTGTKLTVL
（L-O2）配列番号８９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-O3）配列番号８９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-O1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-O1）、ＣＤＲＬ２の（L2-O1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-O1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-O2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-O1）、ＣＤＲＬ２の（L2-O1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-O1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号８９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-O3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-O1）、ＣＤＲＬ２の（L2-O1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-O1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号８９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-O1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L88」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１６）
組合せ（１６）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L102群ともいう。前記組合せ（１６）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LP）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-P）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-P）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-P）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-P）下記（L1-P1）、（L1-P2）または（L1-P3）のアミノ酸配列
（L1-P1）配列番号９０（SSDVGGYNY）のアミノ酸配列
（L1-P2）配列番号９０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-P3）配列番号９０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-P）下記（L2-P1）、（L2-P2）または（L2-P3）のアミノ酸配列
（L2-P1）配列番号９１（DVS）のアミノ酸配列
（L2-P2）配列番号９１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-P3）配列番号９１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-P）下記（L3-P1）、（L3-P2）または（L3-P3）のアミノ酸配列
（L3-P1）配列番号９２（SSYAGSGSTPFV）のアミノ酸配列
（L3-P2）配列番号９２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-P3）配列番号９２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１６）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LP）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-P）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-P）下記（L-P1）、（L-P2）または（L-P3）のアミノ酸配列
（L-P1）配列番号９３のアミノ酸配列
配列番号９３：QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYCSSYAGSGSTPFVFGTGTKLTVL
（L-P2）配列番号９３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-P3）配列番号９３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-P1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-P1）、ＣＤＲＬ２の（L2-P1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-P1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-P2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-P1）、ＣＤＲＬ２の（L2-P1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-P1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号９３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-P3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-P1）、ＣＤＲＬ２の（L2-P1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-P1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号９３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-P1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L102」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１７）
組合せ（１７）の抗体等は、例えば、抗体3M4E5H-L124群ともいう。前記組合せ（１７）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LQ）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-Q）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-Q）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-Q）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-Q）下記（L1-Q1）、（L1-Q2）または（L1-Q3）のアミノ酸配列
（L1-Q1）配列番号９４（SSDVGGYNY）のアミノ酸配列
（L1-Q2）配列番号９４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-Q3）配列番号９４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-Q）下記（L2-Q1）、（L2-Q2）または（L2-Q3）のアミノ酸配列
（L2-Q1）配列番号９５（DVS）のアミノ酸配列
（L2-Q2）配列番号９５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-Q3）配列番号９５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-Q）下記（L3-Q1）、（L3-Q2）または（L3-Q3）のアミノ酸配列
（L3-Q1）配列番号９６（CSYAGRRYV）のアミノ酸配列
（L3-Q2）配列番号９６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-Q3）配列番号９６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１７）において、前記（HB）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LQ）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-Q）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-Q）下記（L-Q1）、（L-Q2）または（L-Q3）のアミノ酸配列
（L-Q1）配列番号９７のアミノ酸配列
配列番号９７：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSRVPDRFAGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGRRYVFGTGTKLTVL
（L-Q2）配列番号９７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-Q3）配列番号９７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-Q1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-Q1）、ＣＤＲＬ２の（L2-Q1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-Q1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-Q2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-Q1）、ＣＤＲＬ２の（L2-Q1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-Q1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号９７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-Q3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-Q1）、ＣＤＲＬ２の（L2-Q1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-Q1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号９７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-B1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-Q1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体3M4E5H-L124」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
組合せ（１８）
組合せ（１８）の抗体等は、例えば、抗体H73-3M4E5L群ともいう。前記組合せ（１８）において、前記（HC）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、下記（H1-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、下記（H2-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、下記（H3-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LA）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、前記（L1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、前記（L2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、前記（L3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（H1-C）下記（H1-C1）、（H1-C2）または（H1-C3）のアミノ酸配列
（H1-C1）配列番号２５（GGSISSYY）のアミノ酸配列
（H1-C2）配列番号２５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-C3）配列番号２５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-C）下記（H2-C1）、（H2-C2）または（H2-C3）のアミノ酸配列
（H2-C1）配列番号２６（INHSGST）のアミノ酸配列
（H2-C2）配列番号２６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-C3）配列番号２６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-C）下記（H3-C1）、（H3-C2）または（H3-C3）のアミノ酸配列
（H3-C1）配列番号２７（ARCPIYYYGMDV）のアミノ酸配列
（H3-C2）配列番号２７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-C3）配列番号２７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（１８）において、前記（HC）の重鎖可変領域は、例えば、下記（H-C）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LA）の軽鎖可変領域は、例えば、前記（L-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（H-C）下記（H-C1）、（H-C2）または（H-C3）のアミノ酸配列
（H-C1）配列番号２８のアミノ酸配列
配列番号２８：QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCPIYYYGMDVWGQGTTVTVSS
（H-C2）配列番号２８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H-C3）配列番号２８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（H-C1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-C1）、ＣＤＲＨ２の（H2-C1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-C1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（H-C2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-C1）、ＣＤＲＨ２の（H2-C1）、およびＣＤＲＨ３（H3-C1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（H-C3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-C1）、ＣＤＲＨ２の（H2-C1）、およびＣＤＲＨ３（H3-C1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-C1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-A1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H73-3M4E5L」ともいう。
前記重鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記重鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
本発明において、前記配列番号１７〜９７のアミノ酸配列は、例えば、ヒト由来のアミノ酸配列である。
本発明の抗体等とA2/NY-ESO-1157との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー等の抗体と抗原との結合検出方法より確認できる。
本発明の抗体等は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。本発明の抗体等は、医薬用化合物等の低分子化合物により修飾されてもよい。前記低分子化合物は、例えば、チューブリン阻害剤等の抗癌剤があげられる。本発明の抗体等は、例えば、前記低分子化合物に直接または間接的に修飾される。後者の場合、本発明の抗体等は、例えば、リンカーを介して、前記低分子化合物により修飾されている。
本発明の抗体等は、例えば、担体、多孔質体等に固定化されてもよい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。
本発明の抗体等の製造方法は、特に制限されず、例えば、前述のアミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子工学的に製造することができる。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、本発明は、この例示には限定されない。
まず、本発明の抗体等における、前記各領域、前記重鎖、および／または軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターを宿主に導入し、形質転換体を得る。そして、前記形質転換体を培養し、A2/NY-ESO-1157に結合する抗体を含む画分を回収し、得られた回収画分から、前記抗体を単離または精製する。
前記ベクターとしては、例えば、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列を含むベクター、前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含むベクター、前記重鎖をコードする核酸配列を含むベクター、前記軽鎖をコードする核酸配列を含むベクター等があげられる。前記宿主は、特に制限されず、前記ベクターを導入でき、前記ベクター内の前記核酸配列を発現できるものであればよい。前記宿主としては、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の哺乳類細胞等があげられる。前記ベクターを宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
前記形質転換体の培養方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記抗体を含む画分は、例えば、培養した前記形質転換体を破砕し、液体画分として回収できる。前記抗体の単離または精製は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
本発明において、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、例えば、動物への免疫により得られるモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（完全ヒト抗体ともいう）等があげられる。
前記キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とを連結した抗体である。前記キメラ抗体は、例えば、以下のようにして作製できる。まず、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体について、A2/NY-ESO-1157タンパク質と結合する可変領域（Ｖ領域）の遺伝子を調製し、前記可変領域の遺伝子と、ヒト抗体の定常領域（Ｃ領域）の遺伝子とを連結し、これを、さらに発現ベクターに連結する。そして、前記発現ベクターをトランスフェクトした細胞を培養し、培養液中に分泌される目的のキメラ抗体を回収する。これによりキメラ抗体を調製できる。前記可変領域の遺伝子の由来動物は、特に制限されず、例えば、ラット、マウス等があげられる。前記キメラ抗体の製造方法は、これには制限されず、例えば、特公平３−７３２８０号公報に記載の方法等の、公知の方法を参照して製造できる。
前記ヒト化抗体は、前記ＣＤＲのみをヒト以外の動物由来とし、他の領域をヒト由来とする抗体である。前記ヒト化抗体は、例えば、以下のようにして製造できる。まず、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体について、前記ＣＤＲの遺伝子を調製し、ヒト抗体の遺伝子、例えば、定常領域に移植（ＣＤＲグラフティング）し、これを、さらに発現ベクターに連結する。そして、前記発現ベクターをトランスフェクトした細胞を培養することによって、培養液中に、目的のＣＤＲを移植したヒト化抗体が分泌される。分泌されるヒト化抗体を回収することによって、調製できる。前記ＣＤＲの由来動物は、特に制限されず、例えば、ラット、マウス等があげられる。ヒト化抗体の製造方法は、これには限定されず、例えば、特表平４−５０６４５８号公報および特開昭６２−２９６８９０号公報等に記載の方法等の、公知の方法を参照して製造できる。
前記ヒト抗体は、全ての領域がヒト由来の抗体である。前記ヒト抗体は、例えば、ヒト以外の動物への、ヒト抗体遺伝子の導入によって作製できる。前記ヒト抗体遺伝子を導入する動物は、例えば、ヒト抗体産生用のトランスジェニック動物が使用できる。前記動物の種類は、特に制限されず、マウス等があげられる。前記ヒト抗体の製造方法は、例えば、Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994； Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997； 特表平４−５０４３６５号公報； 特表平７−５０９１３７号公報； ＷＯ９４／２５５８５号公報； Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；および特表平６−５００２３３号公報等に記載の、公知の方法を参照して製造できる。また、前記ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイ法を用いて製造することもでき、例えば、Marks, J. D. et al.: J. Mol. Biol., Vol.222, p.581-597, 1991等に記載の、公知の方法を参照して製造できる。
本発明の抗体等は、例えば、抗原を動物に免疫することによっても調製できる。前記抗原は、例えば、A2/NY-ESO-1157タンパク質があげられる。前記抗原は、複数回免疫することが好ましい。前記ペプチド断片は、例えば、抗原決定基（エピトープ）のみからなるペプチド断片でもよいし、前記抗原決定基を含むペプチド断片でもよい
前記動物への免疫により得られるモノクローナル抗体は、例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987))、Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）等に記載の方法等の、公知の方法を参照して製造できる。具体的には、例えば、抗原で動物を免疫し、前記免疫動物から採取した抗体産生細胞と、自己抗体産生能を欠く骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させ、ハイブリドーマを作製する。続いて、前記ハイブリドーマから抗体産生細胞をスクリーニングして、クローニングによりハイブリドーマの単一クローンを作製する。そして、このハイブリドーマクローンを動物に投与し、得られた腹腔からモノクローナル抗体を精製する。または、前記ハイブリドーマを培養して、その培養液からモノクローナル抗体を精製する。このように、前記ハイブリドーマクローンを作製することで、特異性が均一なモノクローナル抗体を安定に供給できる。
前記骨髄腫細胞は、例えば、マウス、ラット、ヒト等の由来であることが好ましい。前記骨髄腫細胞と前記抗体産生細胞とは、例えば、それぞれの由来が同一種でも異種でもよいが、同一種であることが好ましい。
本発明の第１の抗体等において、前記（Ｈ）の重鎖可変領域および（Ｌ）の軽鎖可変領域は、下記（Ｈ）の重鎖可変領域および（Ｌ）の軽鎖可変領域であってもよい。
（Ｈ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域；
（H1）下記（H1-1）、（H1-2）または（H1-3）のアミノ酸配列
（H1-1）下記条件（Ｈ１）のＣＤＲＨ１のいずれかのアミノ酸配列
（H1-2）（H1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-3）（H1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（H2）下記（H2-1）、（H2-2）または（H2-3）のアミノ酸配列
（H2-1）下記条件（Ｈ１）のＣＤＲＨ２のいずれかのアミノ酸配列
（H2-2）（H2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-3）（H2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（H3）下記（H3-1）、（H3-2）または（H3-3）のアミノ酸配列
（H3-1）下記条件（Ｈ１）のＣＤＲＨ３のいずれかのアミノ酸配列
（H3-2）（H3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-3）（H3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
条件（Ｈ１）
ＣＤＲＨ１は、ＧＸ１Ｘ２Ｘ3ＳＸ４Ｘ５Ｘ６（配列番号３２２）であり、
ＣＤＲＨ２は、Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＳＸ１１ＧＳＴ（配列番号３２３）であり、
ＣＤＲＨ３は、ＡＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＧＭＤＶ（配列番号３２４）であり、
Ｘ１は、ＧまたはＦであり、
Ｘ２は、ＳまたはＴであり、
Ｘ３は、ＩまたはＦであり、
Ｘ４は、ＳまたはＴであり、
Ｘ５は、ＮまたはＹであり、
Ｘ６は、ＹまたはＱであり、
Ｘ７は、存在しないか、Ｉであり、
Ｘ８は、ＶまたはＮであり、
Ｘ９は、ＳまたはＨであり、
Ｘ１０は、存在しないか、Ｙであり、
Ｘ１１は、存在しないか、Ｇであり、
Ｘ１２は、ＲまたはＧであり、
Ｘ１３は、ＥまたはＣであり、
Ｘ１４は、Ｓ、Ｌ、またはＰであり、
Ｘ１５は、Ｙ、Ｌ、またはＩであり、
Ｘ１６は、ＹまたはＰである。
（Ｌ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域；
（L1）下記（L1-1）、（L1-2）または（L1-3）のアミノ酸配列
（L1-1）下記条件（Ｌ１）および（Ｌ２）のＣＤＲＬ１のいずれかのアミノ酸配列
（L1-2）（L1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-3）（L1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L2）下記（L2-1）、（L2-2）または（L2-3）のアミノ酸配列
（L2-1）下記条件（Ｌ１）および（Ｌ２）のＣＤＲＬ２のいずれかのアミノ酸配列
（L2-2）（L2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-3）（L2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L3）下記（L3-1）、（L3-2）または（L3-3）のアミノ酸配列
（L3-1）下記条件（Ｌ１）および（Ｌ２）のＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列
（L3-2）（L3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-3）（L3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
条件（Ｌ１）
ＣＤＲＬ１は、ＱＸ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４（配列番号３１３）であり、
ＣＤＲＬ２は、ＡＡＳ（配列番号３４）またはＧＡＳ（配列番号６３）であり、
ＣＤＲＬ３は、ＱＱＹＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号３１４）であり、
Ｘ１は、ＳまたはＤであり、
Ｘ２は、ＩまたはＶであり、
Ｘ３は、ＳまたはＲであり、
Ｘ４は、ＹまたはＮであり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｅ、Ｎ、またはＤであり、
Ｘ６は、ＳまたはＮであり、
Ｘ７は、存在しないか、Ｔ、Ｙ、またはＳであり、
Ｘ８は、Ｐ、Ｓ、Ｒ、またはＬであり、
Ｘ９は、Ｑ、Ｒ、Ｐ、またはＩであり、
Ｘ１０は、存在しないか、ＳまたはＣであり、
Ｘ１１は、存在しないか、Ｔである；
条件（Ｌ２）
ＣＤＲＬ１は、Ｘ１Ｘ２ＤＶＧＸ3ＹＸ４Ｘ５（配列番号３１５）であり、
ＣＤＲＬ２は、ＤＶＮ（配列番号７１）、ＤＶＩ（配列番号７５）、またはＤＶＳ（配列番号７９）であり、
ＣＤＲＬ３は、Ｘ６ＳＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｖ（配列番号３１６）であり、
Ｘ１は、ＳまたはＧであり、
Ｘ２は、ＲまたはＳであり、
Ｘ３は、Ｇ、Ａ、またはＳであり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、またはＱであり、
Ｘ５は、Ｙ、Ｆ、Ｌ、またはＷであり、
Ｘ６は、Ｗ、Ｓ、またはＣであり、
Ｘ７は、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、
Ｘ８は、存在しないか、ＡまたはＴであり、
Ｘ９は、存在しないか、Ｇであり、
Ｘ１０は、存在しないか、Ｓであり、
Ｘ１１は、ＧまたはＳであり、
Ｘ１２は、存在しないか、Ｓであり、
Ｘ１３は、Ｓ、Ｔ、またはＲであり、
Ｘ１４は、Ｙ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｐ、またはＲであり、
Ｘ１５は、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ａ、またはＦである。
前記条件（Ｈ１）を満たす重鎖可変領域としては、例えば、前記（HA）、（HB）および（HC）の重鎖可変領域があげられる。
前記（Ｌ）の軽鎖可変領域において、（L1-1）、（L2-1）、および（L3-1）は、条件（Ｌ１）および（Ｌ２）において同一の条件または異なる条件を満たすが、同一の条件を満たすことが好ましい。
条件（Ｌ１）において、Ｘ７は、存在しないか、Ｔ、またはＹが好ましい。
条件（Ｌ２）において、Ｘ４は、Ｎ、Ｄ、またはＥが好ましい。Ｘ５は、Ｙ、Ｆ、またはＬが好ましい。Ｘ７は、ＦまたはＹが好ましい。
前記条件（Ｌ１）を満たす軽鎖可変領域としては、例えば、前記（LB）〜（LJ）の軽鎖可変領域があげられる。
前記条件（Ｌ２）を満たす軽鎖可変領域としては、例えば、前記（LA）および（LK）〜（LQ）の軽鎖可変領域があげられる。
前記（Ｈ）の重鎖可変領域および（Ｌ）の軽鎖可変領域において、前記（Ｈ）の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１がＧＦＴＦＳＴＹＱ（配列番号２１）であり、ＣＤＲＨ２がＩＶＳＳＧＧＳＴ（配列番号２２）であり、ＣＤＲＨ３がＡＧＥＬＬＰＹＹＧＭＤＶ（配列番号２３）である場合、前記（Ｌ）の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１が、ＳＲＤＶＧＧＹＮＹ（配列番号２９）であり、ＣＤＲＬ２がＤＶＩ（配列番号３０）であり、ＣＤＲＬ３がＷＳＦＡＧＳＹＹＶ（配列番号３１）以外のアミノ酸配列であることが好ましい。
＜第２の抗体またはその抗原結合断片＞
本発明のＣＤ１９に対する抗体またはその抗原結合断片（以下、「第２の抗体等」ともいう）は、下記（Ｈ）の重鎖可変領域と、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域とを含む。本発明の抗体等は、下記（Ｈ）の重鎖可変領域と、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域とを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗体等は、ＣＤ１９に結合する。また、ＣＤ１９は、例えば、正常なＢ細胞およびＢ細胞系のリンパ腫等の特定のがん細胞に発現することが知られている。このため、本発明の抗体等は、例えば、ＣＤ１９発現がん細胞に対する二重特異性抗体、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲの抗原結合ドメイン等として好適に使用できる。前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体またはその抗原結合断片等の説明を援用できる。
（Ｈ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
（H1）下記（H1-1）、（H1-2）または（H1-3）のアミノ酸配列
（H1-1）下記表３ＡのＣＤＲＨ１のいずれかのアミノ酸配列
（H1-2）（H1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-3）（H1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2）下記（H2-1）、（H2-2）または（H2-3）のアミノ酸配列
（H2-1）下記表３ＡのＣＤＲＨ２のいずれかのアミノ酸配列
（H2-2）（H2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-3）（H2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3）下記（H3-1）、（H3-2）または（H3-3）のアミノ酸配列
（H3-1）下記表３ＡのＣＤＲＨ３のいずれかのアミノ酸配列
（H3-2）（H3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-3）（H3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（Ｌ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
（L1）下記（L1-1）、（L1-2）または（L1-3）のアミノ酸配列
（L1-1）下記表３ＢのＣＤＲＬ１のいずれかのアミノ酸配列
（L1-2）（L1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-3）（L1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2）下記（L2-1）、（L2-2）または（L2-3）のアミノ酸配列
（L2-1）下記表３ＢのＣＤＲＬ２のいずれかのアミノ酸配列
（L2-2）（L2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-3）（L2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3）下記（L3-1）、（L3-2）または（L3-3）のアミノ酸配列
（L3-1）下記表３ＢのＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列
（L3-2）（L3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-3）（L3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
本発明において、「ＣＤ１９」は、例えば、分子量９５ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、例えば、Ｂ細胞の発生、活性化、分化の調整等に関与することがしられており、Ｂ細胞に主に発現している。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１７７０．６で登録されているアミノ酸配列があげられる。マウスＣＤ１９のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９８４４．２で登録されているアミノ酸配列があげられる。
前記（Ｈ）の重鎖可変領域において、前記ＣＤＲＨ１は、前記（HA）におけるＣＤＲＨ１である。前記ＣＤＲＨ２は、前記（HA）におけるＣＤＲＨ２である。前記ＣＤＲＨ３は、前記（HA）におけるＣＤＲＨ３である。
前記（Ｌ）の軽鎖可変領域において、前記ＣＤＲＬ１は、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１である。前記ＣＤＲＬ２は、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ２である。前記ＣＤＲＬ３は、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ３である。
前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記（LA）〜（LL）および（LM）において、同一の条件を満たしてもよいし、異なる条件を満たしてもよいが、同一の条件を満たすことが好ましい。前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が同一の条件を満たす場合、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記（LA）〜（LL）および（LM）のいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を満たす。
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記アミノ酸の置換は、例えば、保存的置換であってもよい（以下、同様）。前記保存的置換は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または数個のアミノ酸を、他のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。「置換するアミノ酸」と「置換されるアミノ酸」とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、例えば、疎水性および親水性の指標（ハイドロパシー）、極性、電荷等の化学的性質、または、二次構造等の物理的性質等が類似していることが好ましい。前記性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、例えば、当該技術分野において公知である。具体例として、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）は、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等があげられ、極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等があげられ、陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）は、アルギニン、ヒスチジン、リジン等があげられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。
前記（Ｌ）の軽鎖可変領域において、前記（L1-1）、（L2-1）および（L3-1）の組合せは、特に制限されず、例えば、それぞれ、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１と、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ２と、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ３との任意の組合せとできる。前記（L1-1）、（L2-1）および（L3-1）の組合せは、好ましくは、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３である。
以下に、本発明の抗体等について、前記重鎖可変領域または重鎖と前記軽鎖可変領域または軽鎖との組合せについてより具体的に説明する。各組合せにおける重鎖可変領域および重鎖の説明は、互いに援用できる。また、各組合せにおける軽鎖可変領域および軽鎖の説明は、互いに援用できる。また、以下に示すアミノ酸配列および塩基配列において、下線で示すアミノ酸配列および塩基配列は、特に言及しない限り、ＣＤＲに対応するアミノ酸配列およびＣＤＲに対応するアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
本発明の抗体等において、前記重鎖可変領域と前記軽鎖可変領域との組合せは、例えば、前述のように、前記（HA）と、前記（LA）〜（LL）および（LM）におけるいずれか１つの組合せである。
（HA）と（LA）と組合せ（組合せ（LA））
組合せ（LA）の抗体等は、例えば、抗体18H-L4群ともいう。前記組合せ（LA）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、下記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、下記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、下記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LA）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（H1-A）下記（H1-A1）、（H1-A2）または（H1-A3）のアミノ酸配列
（H1-A1）配列番号２１６（GFTFDDYA）のアミノ酸配列
（H1-A2）配列番号２１６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-A3）配列番号２１６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-A）下記（H2-A1）、（H2-A2）または（H2-A3）のアミノ酸配列
（H2-A1）配列番号２１７（ISWNSGRI）のアミノ酸配列
（H2-A2）配列番号２１７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-A3）配列番号２１７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-A）下記（H3-A1）、（H3-A2）または（H3-A3）のアミノ酸配列
（H3-A1）配列番号２１８（ARDQGYHYYDSAEHAFDI）のアミノ酸配列
（H3-A2）配列番号２１８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-A3）配列番号２１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L1-A）下記（L1-A1）、（L1-A2）または（L1-A3）のアミノ酸配列
（L1-A1）配列番号２２０（KLGDKY）のアミノ酸配列
（L1-A2）配列番号２２０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-A3）配列番号２２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-A）下記（L2-A1）、（L2-A2）または（L2-A3）のアミノ酸配列
（L2-A1）配列番号２２１（QDS）のアミノ酸配列
（L2-A2）配列番号２２１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-A3）配列番号２２１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-A）下記（L3-A1）、（L3-A2）または（L3-A3）のアミノ酸配列
（L3-A1）配列番号２２２（QAWDSSTHVV）のアミノ酸配列
（L3-A2）配列番号２２２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-A3）配列番号２２２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LA）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、下記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LA）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（H-A）下記（H-A1）、（H-A2）または（H-A3）のアミノ酸配列
（H-A1）配列番号２１９のアミノ酸配列
配列番号２１９：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
（H-A2）配列番号２１９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H-A3）配列番号２１９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L-A）下記（L-A1）、（L-A2）または（L-A3）のアミノ酸配列
（L-A1）配列番号２２３のアミノ酸配列
配列番号２２３：SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVL
（L-A2）配列番号２２３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-A3）配列番号２２３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（H-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（H-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２１９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（H-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２１９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
前記（L-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２２３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２２３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-A1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L4」ともいう。
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LB）との組合せ（組合せ（LB））
組合せ（LB）の抗体等は、例えば、抗体18H-L7群ともいう。前記組合せ（LB）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LB）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-B）下記（L1-B1）、（L1-B2）または（L1-B3）のアミノ酸配列
（L1-B1）配列番号２２４（SSDVGGYNY）のアミノ酸配列
（L1-B2）配列番号２２４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-B3）配列番号２２４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-B）下記（L2-B1）、（L2-B2）または（L2-B3）のアミノ酸配列
（L2-B1）配列番号２２５（DVS）のアミノ酸配列
（L2-B2）配列番号２２５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-B3）配列番号２２５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-B）下記（L3-B1）、（L3-B2）または（L3-B3）のアミノ酸配列
（L3-B1）配列番号２２６（GTWDTSLTAVV）のアミノ酸配列
（L3-B2）配列番号２２６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-B3）配列番号２２６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LB）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LB）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-B）下記（L-B1）、（L-B2）または（L-B3）のアミノ酸配列
（L-B1）配列番号２２７のアミノ酸配列
配列番号２２７：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVL
（L-B2）配列番号２２７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-B3）配列番号２２７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２２７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２２７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-B1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L7」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LC）との組合せ（組合せ（LC））
組合せ（LC）の抗体等は、例えば、抗体18H-L9群ともいう。前記組合せ（LC）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LC）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-C）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-C）下記（L1-C1）、（L1-C2）または（L1-C3）のアミノ酸配列
（L1-C1）配列番号２２８（WSNIGDDH）のアミノ酸配列
（L1-C2）配列番号２２８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-C3）配列番号２２８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-C）下記（L2-C1）、（L2-C2）または（L2-C3）のアミノ酸配列
（L2-C1）配列番号２２９（DTS）のアミノ酸配列
（L2-C2）配列番号２２９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-C3）配列番号２２９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-C）下記（L3-C1）、（L3-C2）または（L3-C3）のアミノ酸配列
（L3-C1）配列番号２３０（GTWESSLSGVV）のアミノ酸配列
（L3-C2）配列番号２３０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-C3）配列番号２３０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LC）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LC）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-C）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-C）下記（L-C1）、（L-C2）または（L-C3）のアミノ酸配列
（L-C1）配列番号２３１のアミノ酸配列
配列番号２３１：QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSWSNIGDDHVSWYQQFPGAAPKLLIYDTSKRPSRVADRFSGSKSGASATLAITGLQAGDEADYYCGTWESSLSGVVFGGGTELTVL
（L-C2）配列番号２３１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-C3）配列番号２３１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-C1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-C1）、ＣＤＲＬ２の（L2-C1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-C1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-C2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-C1）、ＣＤＲＬ２の（L2-C1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-C1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２３１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-C3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-C1）、ＣＤＲＬ２の（L2-C1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-C1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２３１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-C1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L9」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LD）との組合せ（組合せ（LD））
組合せ（LC）の抗体等は、例えば、抗体18H-L13群ともいう。前記組合せ（LD）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LD）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-D）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-D）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-D）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-D）下記（L1-D1）、（L1-D2）または（L1-D3）のアミノ酸配列
（L1-D1）配列番号２３２（SSDVGGYDY）のアミノ酸配列
（L1-D2）配列番号２３２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-D3）配列番号２３２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-D）下記（L2-D1）、（L2-D2）または（L2-D3）のアミノ酸配列
（L2-D1）配列番号２３３（DVT）のアミノ酸配列
（L2-D2）配列番号２３３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-D3）配列番号２３３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-D）下記（L3-D1）、（L3-D2）または（L3-D3）のアミノ酸配列
（L3-D1）配列番号２３４（SSYTTSTTWV）のアミノ酸配列
（L3-D2）配列番号２３４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-D3）配列番号２３４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LD）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LD）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-D）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-D）下記（L-D1）、（L-D2）または（L-D3）のアミノ酸配列
（L-D1）配列番号２３５のアミノ酸配列
配列番号２３５：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVL
（L-D2）配列番号２３５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-D3）配列番号２３５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-D1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-D2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２３５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-D3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-D1）、ＣＤＲＬ２の（L2-D1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-D1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２３５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-D1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L13」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LE）との組合せ（組合せ（LE））
組合せ（LE）の抗体等は、例えば、抗体18H-L14群ともいう。前記組合せ（LE）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LE）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-E）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-E）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-E）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-E）下記（L1-E1）、（L1-E2）または（L1-E3）のアミノ酸配列
（L1-E1）配列番号２３６（TSDVGTTNY）のアミノ酸配列
（L1-E2）配列番号２３６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-E3）配列番号２３６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-E）下記（L2-E1）、（L2-E2）または（L2-E3）のアミノ酸配列
（L2-E1）配列番号２３７（DVT）のアミノ酸配列
（L2-E2）配列番号２３７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-E3）配列番号２３７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-E）下記（L3-E1）、（L3-E2）または（L3-E3）のアミノ酸配列
（L3-E1）配列番号２３８（SYAGSYTFVV）のアミノ酸配列
（L3-E2）配列番号２３８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-E3）配列番号２３８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LE）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LE）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-E）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-E）下記（L-E1）、（L-E2）または（L-E3）のアミノ酸配列
（L-E1）配列番号２３９のアミノ酸配列
配列番号２３９：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTTSDVGTTNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFVVFGGGTELTVL
（L-E2）配列番号２３９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-E3）配列番号２３９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-E1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-E1）、ＣＤＲＬ２の（L2-E1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-E1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-E2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-E1）、ＣＤＲＬ２の（L2-E1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-E1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２３９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-E3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-E1）、ＣＤＲＬ２の（L2-E1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-E1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２３９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-E1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L14」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LF）との組合せ（組合せ（LF））
組合せ（LF）の抗体等は、例えば、抗体18H-L16群ともいう。前記組合せ（LF）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LF）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-F）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-F）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-F）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-F）下記（L1-F1）、（L1-F2）または（L1-F3）のアミノ酸配列
（L1-F1）配列番号２４０（SSDVGVYNY）のアミノ酸配列
（L1-F2）配列番号２４０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-F3）配列番号２４０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-F）下記（L2-F1）、（L2-F2）または（L2-F3）のアミノ酸配列
（L2-F1）配列番号２４１（DVS）のアミノ酸配列
（L2-F2）配列番号２４１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-F3）配列番号２４１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-F）下記（L3-F1）、（L3-F2）または（L3-F3）のアミノ酸配列
（L3-F1）配列番号２４２（AAWDDSLNGVV）のアミノ酸配列
（L3-F2）配列番号２４２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-F3）配列番号２４２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LF）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LF）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-F）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-F）下記（L-F1）、（L-F2）または（L-F3）のアミノ酸配列
（L-F1）配列番号２４３のアミノ酸配列
配列番号２４３：QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGVYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTQLTVL
（L-F2）配列番号２４３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-F3）配列番号２４３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-F1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-F1）、ＣＤＲＬ２の（L2-F1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-F1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-F2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-F1）、ＣＤＲＬ２の（L2-F1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-F1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２４３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-F3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-F1）、ＣＤＲＬ２の（L2-F1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-F1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２４３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-F1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L16」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LG）との組合せ（組合せ（LG））
組合せ（LG）の抗体等は、例えば、抗体18H-L17群ともいう。前記組合せ（LG）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LG）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-G）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-G）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-G）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-G）下記（L1-G1）、（L1-G2）または（L1-G3）のアミノ酸配列
（L1-G1）配列番号２４４（SSNIGNNY）のアミノ酸配列
（L1-G2）配列番号２４４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-G3）配列番号２４４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-G）下記（L2-G1）、（L2-G2）または（L2-G3）のアミノ酸配列
（L2-G1）配列番号２４５（DNV）のアミノ酸配列
（L2-G2）配列番号２４５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-G3）配列番号２４５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-G）下記（L3-G1）、（L3-G2）または（L3-G3）のアミノ酸配列
（L3-G1）配列番号２４６（AAWDDSLSAI）のアミノ酸配列
（L3-G2）配列番号２４６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-G3）配列番号２４６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LG）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LG）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-G）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-G）下記（L-G1）、（L-G2）または（L-G3）のアミノ酸配列
（L-G1）配列番号２４７のアミノ酸配列
配列番号２４７：QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVCWYQHLPGTAPKLLIYDNVKRPSGIPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSAIFGGGTELTVL
（L-G2）配列番号２４７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-G3）配列番号２４７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-G1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-G1）、ＣＤＲＬ２の（L2-G1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-G1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-G2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-G1）、ＣＤＲＬ２の（L2-G1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-G1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２４７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-G3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-G1）、ＣＤＲＬ２の（L2-G1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-G1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２４７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-G1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L17」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LH）との組合せ（組合せ（LH））
組合せ（LH）の抗体等は、例えば、抗体18H-L22群ともいう。前記組合せ（LH）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LH）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-H）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-H）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-H）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-H）下記（L1-H1）、（L1-H2）または（L1-H3）のアミノ酸配列
（L1-H1）配列番号２４８（SSDVGGYNY）のアミノ酸配列
（L1-H2）配列番号２４８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-H3）配列番号２４８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-H）下記（L2-H1）、（L2-H2）または（L2-H3）のアミノ酸配列
（L2-H1）配列番号２４９（DVS）のアミノ酸配列
（L2-H2）配列番号２４９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-H3）配列番号２４９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-H）下記（L3-H1）、（L3-H2）または（L3-H3）のアミノ酸配列
（L3-H1）配列番号２５０（HSYDSSLSHV）のアミノ酸配列
（L3-H2）配列番号２５０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-H3）配列番号２５０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LH）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LH）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-H）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-H）下記（L-H1）、（L-H2）または（L-H3）のアミノ酸配列
（L-H1）配列番号２５１のアミノ酸配列
配列番号２５１：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCHSYDSSLSHVFGTGTKVTVL
（L-H2）配列番号２５１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-H3）配列番号２５１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-H1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-H1）、ＣＤＲＬ２の（L2-H1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-H1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-H2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-H1）、ＣＤＲＬ２の（L2-H1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-H1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２５１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-H3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-H1）、ＣＤＲＬ２の（L2-H1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-H1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２５１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-H1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-L22」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LI）との組合せ（組合せ（LI））
組合せ（LI）の抗体等は、例えば、抗体H1-K4群ともいう。前記組合せ（LI）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LI）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-I）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-I）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-I）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-I）下記（L1-I1）、（L1-I2）または（L1-I3）のアミノ酸配列
（L1-I1）配列番号２５２（QSVSSN）のアミノ酸配列
（L1-I2）配列番号２５２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-I3）配列番号２５２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-I）下記（L2-I1）、（L2-I2）または（L2-I3）のアミノ酸配列
（L2-I1）配列番号２５３（GAS）のアミノ酸配列
（L2-I2）配列番号２５３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-I3）配列番号２５３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-I）下記（L3-I1）、（L3-I2）または（L3-I3）のアミノ酸配列
（L3-I1）配列番号２５４（QQYNNWPPLYT）のアミノ酸配列
（L3-I2）配列番号２５４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-I3）配列番号２５４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LI）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LI）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-I）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-I）下記（L-I1）、（L-I2）または（L-I3）のアミノ酸配列
（L-I1）配列番号２５５のアミノ酸配列
配列番号２５５：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPLYTFGQGTKLEIK
（L-I2）配列番号２５５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-I3）配列番号２５５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-I1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-I1）、ＣＤＲＬ２の（L2-I1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-I1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-I2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-I1）、ＣＤＲＬ２の（L2-I1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-I1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２５５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-I3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-I1）、ＣＤＲＬ２の（L2-I1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-I1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２５５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-I1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体H1-K4」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LJ）との組合せ（組合せ（LJ））
組合せ（LJ）の抗体等は、例えば、抗体18H-K5群ともいう。前記組合せ（LJ）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LJ）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-J）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-J）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-J）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-J）下記（L1-J1）、（L1-J2）または（L1-J3）のアミノ酸配列
（L1-J1）配列番号２５６（QSVSSY）のアミノ酸配列
（L1-J2）配列番号２５６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-J3）配列番号２５６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-J）下記（L2-J1）、（L2-J2）または（L2-J3）のアミノ酸配列
（L2-J1）配列番号２５７（DAS）のアミノ酸配列
（L2-J2）配列番号２５７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-J3）配列番号２５７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-J）下記（L3-J1）、（L3-J2）または（L3-J3）のアミノ酸配列
（L3-J1）配列番号２５８（QQSYSTLLYT）のアミノ酸配列
（L3-J2）配列番号２５８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-J3）配列番号２５８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LJ）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LJ）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-J）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-J）下記（L-J1）、（L-J2）または（L-J3）のアミノ酸配列
（L-J1）配列番号２５９のアミノ酸配列
配列番号２５９：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTLLYTFGQGTKLEIK
（L-J2）配列番号２５９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-J3）配列番号２５９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-J1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-J1）、ＣＤＲＬ２の（L2-J1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-J1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-J2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-J1）、ＣＤＲＬ２の（L2-J1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-J1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２５９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-J3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-J1）、ＣＤＲＬ２の（L2-J1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-J1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２５９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-J1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-K5」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LK）との組合せ（組合せ（LK））
組合せ（LK）の抗体等は、例えば、抗体18H-K6群ともいう。前記組合せ（LK）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LK）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-K）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-K）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-K）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-K）下記（L1-K1）、（L1-K2）または（L1-K3）のアミノ酸配列
（L1-K1）配列番号２６０（QSVSSY）のアミノ酸配列
（L1-K2）配列番号２６０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-K3）配列番号２６０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-K）下記（L2-K1）、（L2-K2）または（L2-K3）のアミノ酸配列
（L2-K1）配列番号２６１（DAS）のアミノ酸配列
（L2-K2）配列番号２６１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-K3）配列番号２６１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-K）下記（L3-K1）、（L3-K2）または（L3-K3）のアミノ酸配列
（L3-K1）配列番号２６２（QQYDSLPLT）のアミノ酸配列
（L3-K2）配列番号２６２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-K3）配列番号２６２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LK）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LK）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-K）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-K）下記（L-K1）、（L-K2）または（L-K3）のアミノ酸配列
（L-K1）配列番号２６３のアミノ酸配列
配列番号２６３：EIVLTRSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGISARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDIATYYCQQYDSLPLTFGGGTKLEIK
（L-K2）配列番号２６３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-K3）配列番号２６３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-K1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-K1）、ＣＤＲＬ２の（L2-K1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-K1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-K2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-K1）、ＣＤＲＬ２の（L2-K1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-K1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２６３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-K3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-K1）、ＣＤＲＬ２の（L2-K1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-K1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２６３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-K1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-K6」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LL）との組合せ（組合せ（LL））
組合せ（LL）の抗体等は、例えば、抗体18H-K9群ともいう。前記組合せ（LL）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LL）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-L）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-L）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-L）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-L）下記（L1-L1）、（L1-L2）または（L1-L3）のアミノ酸配列
（L1-L1）配列番号２６４（QTISASS）のアミノ酸配列
（L1-L2）配列番号２６４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-L3）配列番号２６４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-L）下記（L2-L1）、（L2-L2）または（L2-L3）のアミノ酸配列
（L2-L1）配列番号２６５（GAS）のアミノ酸配列
（L2-L2）配列番号２６５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-L3）配列番号２６５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-L）下記（L3-L1）、（L3-L2）または（L3-L3）のアミノ酸配列
（L3-L1）配列番号２６６（QQFNEWPLT）のアミノ酸配列
（L3-L2）配列番号２６６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-L3）配列番号２６６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LL）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LL）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-L）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-L）下記（L-L1）、（L-L2）または（L-L3）のアミノ酸配列
（L-L1）配列番号２６７のアミノ酸配列
配列番号２６７：EIVLTQSPATLSLSPGERATVSCRPSQTISASSVAWYQQKAGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNEWPLTFGGGTKVEIK
（L-L2）配列番号２６７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-L3）配列番号２６７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-L1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-L1）、ＣＤＲＬ２の（L2-L1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-L1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-L2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-L1）、ＣＤＲＬ２の（L2-L1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-L1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２６７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-L3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-L1）、ＣＤＲＬ２の（L2-L1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-L1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２６７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-L1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-K9」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
（HA）と（LM）との組合せ（組合せ（LM））
組合せ（LM）の抗体等は、例えば、抗体18H-K10群ともいう。前記組合せ（LM）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、ＣＤＲＨ１が、前記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ２が、前記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＨ３が、前記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記（LM）の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、ＣＤＲＬ１が、下記（L1-M）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ２が、下記（L2-M）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＣＤＲＬ３が、下記（L3-M）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（L1-M）下記（L1-M1）、（L1-M2）または（L1-M3）のアミノ酸配列
（L1-M1）配列番号２６８（QSVSSN）のアミノ酸配列
（L1-M2）配列番号２６８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-M3）配列番号２６８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-M）下記（L2-M1）、（L2-M2）または（L2-M3）のアミノ酸配列
（L2-M1）配列番号２６９（GAS）のアミノ酸配列
（L2-M2）配列番号２６９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-M3）配列番号２６９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-M）下記（L3-M1）、（L3-M2）または（L3-M3）のアミノ酸配列
（L3-M1）配列番号２７０（QQYGSSPDIFT）のアミノ酸配列
（L3-M2）配列番号２７０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-M3）配列番号２７０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記組合せ（LM）において、前記（HA）の重鎖可変領域は、例えば、前記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、前記（LM）の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-M）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
（L-M）下記（L-M1）、（L-M2）または（L-M3）のアミノ酸配列
（L-M1）配列番号２７１のアミノ酸配列
配列番号２７１：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPDIFTFGPGTKVDIK
（L-M2）配列番号２７１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-M3）配列番号２７１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
前記（L-M1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-M1）、ＣＤＲＬ２の（L2-M1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-M1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-M2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-M1）、ＣＤＲＬ２の（L2-M1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-M1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２７１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-M3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-M1）、ＣＤＲＬ２の（L2-M1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-M1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２７１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
本発明の抗体は、例えば、前記重鎖可変領域が、前記（H-A1）であり、前記軽鎖可変領域が、前記（L-M1）であり、この組合せの抗体を、以下、「抗体18H-K10」ともいう。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
本発明において、前記配列番号２１６〜２７１のアミノ酸配列は、例えば、ヒト由来のアミノ酸配列である。
本発明の抗体等とＣＤ１９との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー等の抗体と抗原との結合検出方法より確認できる。
本発明の抗体等は、例えば、標識物質により標識されてもよいし、担体、多孔質体等に固定化されてもよい。前記標識および固定化は、前述の説明を援用できる。
本発明の抗体等の製造方法は、特に制限されず、例えば、前述のアミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子工学的に製造することができる。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、本発明は、この例示には限定されない。
まず、本発明の抗体等における、前記各領域、前記重鎖、および／または軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むベクターを宿主に導入し、形質転換体を得る。そして、前記形質転換体を培養し、ＣＤ１９に結合する抗体を含む画分を回収し、得られた回収画分から、前記抗体を単離または精製する。
前記ベクターおよび前記ベクターが導入された形質転換体の培養方法は、前述の説明を援用できる。
本発明において、前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、例えば、動物への免疫により得られるモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（完全ヒト抗体ともいう）等があげられる。前記キメラ抗体およびヒト化抗体は、前述の説明を援用できる。
本発明の抗体等は、例えば、抗原を動物に免疫することによっても調製できる。前記抗原は、例えば、ＣＤ１９タンパク質があげられる。前記抗原は、複数回免疫することが好ましい。前記ペプチド断片は、例えば、抗原決定基（エピトープ）のみからなるペプチド断片でもよいし、前記抗原決定基を含むペプチド断片でもよい。前記モノクローナル抗体の製造方法は、前述の説明を援用できる。
本発明の第２の抗体等において、前記（Ｌ）の軽鎖可変領域は、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域であってもよい。
（Ｌ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域；
（L1）下記（L1-1）、（L1-2）または（L1-3）のアミノ酸配列
（L1-1）下記条件（Ｌ１）〜（Ｌ３）および（Ｌ４）のＣＤＲＬ１のいずれかのアミノ酸配列
（L1-2）（L1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-3）（L1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L2）下記（L2-1）、（L2-2）または（L2-3）のアミノ酸配列
（L2-1）下記条件（Ｌ１）〜（Ｌ３）および（Ｌ４）のＣＤＲＬ２のいずれかのアミノ酸配列
（L2-2）（L2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-3）（L2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L3）下記（L3-1）、（L3-2）または（L3-3）のアミノ酸配列
（L3-1）下記条件（Ｌ１）〜（Ｌ３）および（Ｌ４）のＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列
（L3-2）（L3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-3）（L3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
条件（Ｌ１）
ＣＤＲＬ１は、ＫＬＧＤＫＹ（配列番号２２０）であり、
ＣＤＲＬ２は、ＱＤＳ（配列番号２２１）であり、
ＣＤＲＬ３は、ＱＡＷＤＳＳＴＨＶ（配列番号２２２）である；
条件（Ｌ２）
ＣＤＲＬ１は、ＷＳＮＩＧＤＤＨ（配列番号２２８）であり、
ＣＤＲＬ２は、ＤＴＳ（配列番号２２９）であり、
ＣＤＲＬ３は、ＧＴＷＥＳＳＬＳＧＶＶ（配列番号２３０）である；
条件（Ｌ３）
ＣＤＲＬ１は、Ｘ１ＳＸ２Ｘ３ＧＸ４Ｘ５ＮＹ（配列番号３１７）であり、
ＣＤＲＬ２は、ＤＸ６Ｘ７（配列番号３１８）であり、
ＣＤＲＬ３は、Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７（配列番号３１９）であり、
Ｘ１は、ＳまたはＴであり、
Ｘ２は、ＤまたはＮであり、
Ｘ３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＡであり、
Ｘ４は、Ｇ、Ｔ、Ｖ、またはＮであり、
Ｘ５は、存在しないか、Ｙ、Ｔ、またはＳであり、
Ｘ６は、ＶまたはＮであり、
Ｘ７は、Ｓ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ８は、存在しないか、Ｇ、Ａ、またはＨであり、
Ｘ９は、Ｔ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ１０は、Ｗ、Ｙ、またはＦであり、
Ｘ１１は、ＡまたはＤであり、
Ｘ１２は、Ｔ、Ｇ、Ｄ、またはＳであり、
Ｘ１３は、ＬまたはＹであり、
Ｘ１４は、Ｔ、Ｎ、またはＳであり、
Ｘ１５は、Ａ、Ｆ、Ｇ、またはＨであり、
Ｘ１５は、ＶまたはＩであり、
Ｘ１７は、存在しないか、Ｖである；
条件（Ｌ４）
ＣＤＲＬ１は、ＱＸ１Ｘ２ＳＸ３ＳＸ４（配列番号３２０）であり、
ＣＤＲＬ２は、ＧＡＳ（配列番号２５３）またはＤＡＳ（配列番号２５７）であり、
ＣＤＲＬ３は、ＱＱＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＬＸ１２Ｔ（配列番号３２１）であり、
Ｘ１は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、またはＱであり、
Ｘ２は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＡであり、
Ｘ３は、存在しないか、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、またはＧであり、
Ｘ４は、Ｎ、Ｙ、またはＳであり、
Ｘ５は、存在しないか、Ｓであり、
Ｘ６は、Ｙ、Ｆ、またはＷであり、
Ｘ７は、Ｎ、Ｓ、Ｄ、またはＧであり、
Ｘ８は、Ｎ、Ｔ、Ｓ、またはＥであり、
Ｘ９は、Ｗ、Ｌ、またはＳであり、
Ｘ１０は、存在しないか、Ｐであり、
Ｘ１１は、存在しないか、ＰまたはＤであり、
Ｘ１２は、存在しないか、Ｙ、Ｆ、またはＷである。
前記（Ｌ）の軽鎖可変領域において、（L1-1）、（L2-1）、および（L3-1）は、条件（Ｌ１）〜（Ｌ４）において同一の条件または異なる条件を満たすが、同一の条件を満たすことが好ましい。
条件（Ｌ３）において、Ｘ３は、ＶまたはＩが好ましい。Ｘ５は、存在しないか、ＹまたはＴが好ましい。Ｘ１０は、ＷまたはＹが好ましい。
条件（Ｌ４）において、Ｘ１は、ＳまたはＴが好ましい。Ｘ２は、ＶまたはＩが好ましい。Ｘ６は、ＹまたはＦが好ましい。Ｘ１２は、存在しないか、ＹまたはＦが好ましい。
前記条件（Ｌ１）を満たす軽鎖可変領域としては、例えば、前記（LA）の軽鎖可変領域があげられる。
前記条件（Ｌ２）を満たす軽鎖可変領域としては、例えば、前記（LC）の軽鎖可変領域があげられる。
前記条件（Ｌ３）を満たす軽鎖可変領域としては、例えば、前記（LB）、（LE）、（LF）、（LG）、および（LH）の軽鎖可変領域があげられる。
前記条件（Ｌ４）を満たす軽鎖可変領域としては、例えば、前記（LI）、（LJ）、（LK）、（LL）、および（LM）の軽鎖可変領域があげられる。
＜遺伝子、発現ベクターおよび形質転換体＞
本発明のコード遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５の複合体に対する抗体もしくはその抗原結合断片またはＣＤ１９に対する抗体もしくはその抗原結合断片（以下、あわせて「本発明の抗体またはその抗原結合断片」または「本発明の抗体等」ともいう）のコード遺伝子であり、前記本発明の第１の抗体もしくは抗原結合断片のアミノ酸配列または前記本発明の第２の抗体もしくは抗原結合断片をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含む。
本発明のコード遺伝子を発現させることによって、前述した本発明の抗体等を得ることができる。本発明のコード遺伝子の配列は、特に制限されず、前記本発明の抗体等のアミノ酸配列をコードする配列であればよく、センス配列でもアンチセンス配列でもよい。
本発明の発現ベクターは、A2/NY-ESO-1157に対する抗体もしくはその抗原結合断片またはＣＤ１９に対する抗体もしくはその抗原結合断片の発現ベクターであり、前記本発明のコード遺伝子を含む。前記発現ベクターにおいて、前記コード遺伝子は、例えば、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片を発現可能に、前記連結用ベクターに連結されている。本発明の発現ベクターは、前記本発明の抗体等を発現できればよく、その他の構成は特に制限されない。
本発明の発現ベクターは、例えば、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列と前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む発現ベクターでもよいし、前記重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む発現ベクターと、前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む発現ベクターとのセットでもよい。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明のコード遺伝子を、連結用ベクターに連結することで調製できる。前記連結ベクターは、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける発現ベクターの説明を援用できる。前記コード遺伝子を連結する前記連結用ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、ｐＵＣ、ｐＭＸ等があげられる。前記連結用ベクターは、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主に応じて、適宜設定することもできる。前記宿主は、特に制限されず、例えば、ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞等があげられる。
本発明の形質転換体は、本発明の抗体等を発現する形質転換体であり、宿主と、前記本発明のコード遺伝子を含む。本発明の形質転換体は、前記本発明のコード遺伝子を発現可能に有していればよい。前記形質転換体は、例えば、前記本発明の発現ベクターを有することが好ましい。前記発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
本発明の遺伝子、発現ベクターおよび形質転換体は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、本発明の第２の抗体等の説明を援用できる。
＜第１のキメラ抗原受容体＞
本発明の第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、前述のように、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記抗原結合ドメインは、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の第１のＣＡＲは、前記抗原結合ドメインが、前記本発明の第１の抗体等を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第１のＣＡＲは、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクターおよび形質転換体の説明を援用できる。本発明の第１のＣＡＲは、例えば、A2/NY-ESO-1157発現がん細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲとして好適に使用できる。
前記抗原結合ドメインは、例えば、前記本発明の第１の抗体でもよいし、前記本発明の第１の抗体の抗原結合断片でもよい。前記抗原結合断片は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が好ましい。前記抗原結合ドメインがｓｃＦｖの場合、前記抗原結合ドメインにおいて、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、Ｃ末端またはＮ末端からこの順序で配置される。
前記抗原結合ドメインは、具体例として、例えば、下記（ＢＤ）のポリペプチドがあげられる。
（ＢＤ）下記（ＢＤ１）、（ＢＤ２）または（ＢＤ３）のポリペプチド
（ＢＤ１）配列番号９８〜１１７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ＢＤ２）配列番号９８〜１１７いずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
（ＢＤ３）配列番号９８〜１１７のいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
前記（ＢＤ１）のポリペプチドにおいて、前記配列番号９８〜１１７のアミノ酸配列は、例えば、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列である。前記配列番号９８〜１１７のアミノ酸配列における重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、例えば、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を参照できる。前記（ＢＤ２）および（ＢＤ３）のポリペプチドにおいて、前記配列番号９８〜１１７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列は、例えば、保存されている。前記配列番号９８〜１１７のアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列は、例えば、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
H1-3M4E5Lの抗原結合ドメイン（配列番号９８）
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
K52-H1の抗原結合ドメイン（配列番号９９）
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPQTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K73-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１００）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYRRSFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K121-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K124-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K125-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPCTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K131-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K145-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K151-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０６）
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K160-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０７）
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
K173-H1の抗原結合ドメイン（配列番号１０８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
L1-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１０９）
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGEAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
3M4E5H-L1の抗原結合ドメイン（配列番号１１０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGEAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVL
L66-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１１１）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYEFVSWYQQHPGSAPKLIIYDVIERPFGVSYRFSASKSGNTASLTISGLQGEDEADYFCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
L73-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１１２）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGAYDYVSWYQHHPGRAPRLIIRDVSVRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSGSSTWVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
L80-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１１３）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
L88-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１１４）
QSALPQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYFCCSYAGGYYVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
L102-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１１５）
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYCSSYAGSGSTPFVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
L124-3M4E5Hの抗原結合ドメイン（配列番号１１６）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSRVPDRFAGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGRRYVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
H73-3M4E5Lの抗原結合ドメイン（配列番号１１７）
QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCPIYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
前記（ＢＤ１）のポリペプチドにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の順序は、逆の順序でもよい。具体例として、前記（ＢＤ１）のポリペプチドは、配列番号９８〜１１７のアミノ酸配列において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を交換したアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよい。
前記（ＢＤ２）のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記（ＢＤ３）のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、それぞれ、前記本発明のＣＡＲライブラリの第１の膜貫通ドメインおよび第１の細胞内シグナル伝達ドメインの説明を援用できる。
本発明の第１のＣＡＲは、具体例として、例えば、下記（Ｃ）のポリペプチドがあげられる。
（Ｃ）下記（Ｃ１）、（Ｃ２）または（Ｃ３）のポリペプチド
（Ｃ１）配列番号１１８〜１３７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｃ２）配列番号１１８〜１３７のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
（Ｃ３）配列番号１１８〜１３７のいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチド
H1-3M4E5L CAR（配列番号１１８）
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K52-H1 CAR（配列番号１１９）
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPQTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K73-H1 CAR（配列番号１２０）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYRRSFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K121-H1 CAR（配列番号１２１）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K124-H1 CAR（配列番号１２２）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K125-H1 CAR（配列番号１２３）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPCTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K131-H1 CAR（配列番号１２４）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K145-H1 CAR（配列番号１２５）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K151-H1 CAR（配列番号１２６）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K160-H1 CAR（配列番号１２７）
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K173-H1 CAR（配列番号１２８）
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYSRTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L1-3M4E5H CAR（配列番号１２９）
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGEAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
3M4E5H-L1 CAR（配列番号１３０）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGEAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVLAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L66-3M4E5H CAR（配列番号１３１）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYEFVSWYQQHPGSAPKLIIYDVIERPFGVSYRFSASKSGNTASLTISGLQGEDEADYFCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L73-3M4E5H CAR（配列番号１３２）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGAYDYVSWYQHHPGRAPRLIIRDVSVRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSGSSTWVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L80-3M4E5H CAR（配列番号１３３）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L88-3M4E5H CAR（配列番号１３４）
QSALPQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYFCCSYAGGYYVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L102-3M4E5H CAR（配列番号１３５）
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYCSSYAGSGSTPFVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L124-3M4E5H CAR（配列番号１３６）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSRVPDRFAGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGRRYVFGTGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
H73-3M4E5L CAR（配列番号１３７）
QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCPIYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
前記（Ｃ１）のポリペプチドにおいて、前記配列番号１１８〜１３７のアミノ酸配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列である。前記（Ｃ２）および（Ｃ３）のポリペプチドにおいて、前記配列番号１１８〜１３７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列は、例えば、保存されている。前記配列番号１１８〜１３７のアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を参照できる。
前記（Ｃ２）のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記（Ｃ３）のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
本発明の第１のＣＡＲの製造方法は、特に制限されず、例えば、前述のアミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子工学的に製造することができる。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、本発明は、この例示には限定されない。
まず、本発明の第１のＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主に導入し、形質転換体を得る。そして、前記形質転換体を培養し、前記第１のＣＡＲを発現する形質転換体を得る。
前記発現ベクターは、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター等があげられ、例えば、前述の発現ベクターの説明を援用できる。前記宿主は、特に制限されず、例えば、前述の宿主の説明を援用できる。
＜第２のキメラ抗原受容体＞
本発明の第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、前述のように、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記抗原結合ドメインは、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の第２のＣＡＲは、前記抗原結合ドメインが、前記本発明の第２の抗体等を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第２のＣＡＲは、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクターおよび形質転換体の説明を援用できる。本発明の第２のＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９発現がん細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲとして好適に使用できる。
前記抗原結合ドメインは、例えば、前記本発明の第２の抗体でもよいし、前記本発明の第２の抗体の抗原結合断片でもよい。前記抗原結合断片は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が好ましい。前記抗原結合ドメインがｓｃＦｖの場合、前記抗原結合ドメインにおいて、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、Ｃ末端またはＮ末端からこの順序で配置される。
前記抗原結合ドメインは、具体例として、例えば、下記（ｂｄ）のポリペプチドがあげられる。
（ｂｄ）下記（ｂｄ１）、（ｂｄ２）または（ｂｄ３）のポリペプチド
（ｂｄ１）配列番号２７２〜２８４のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂｄ２）配列番号２７２〜２８４のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチド
（ｂｄ３）配列番号２７２〜２８４のいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチド
前記（ｂｄ１）のポリペプチドにおいて、前記配列番号２７２〜２８４のアミノ酸配列は、例えば、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列である。前記配列番号２７２〜２８４のアミノ酸配列における重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、例えば、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を参照できる。前記（ｂｄ２）および（ｂｄ３）のポリペプチドにおいて、前記配列番号２７２〜２８４のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列は、例えば、保存されている。前記配列番号２７２〜２８４のアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列は、例えば、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
L4-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７２）
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L7-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７３）
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L9-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７４）
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSWSNIGDDHVSWYQQFPGAAPKLLIYDTSKRPSRVADRFSGSKSGASATLAITGLQAGDEADYYCGTWESSLSGVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L13-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７５）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGLSSDVGGYDYVSWYQQHPGIAPKLMIYDVTNRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTSTTWVFGAGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L14-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７６）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTTSDVGTTNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L16-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７７）
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGVYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L17-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７８）
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVCWYQHLPGTAPKLLIYDNVKRPSGIPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSAIFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
L22-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２７９）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCHSYDSSLSHVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
K4-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２８０）
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPLYTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
K5-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２８１）
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTLLYTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
K6-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２８２）
EIVLTRSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGISARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDIATYYCQQYDSLPLTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
K9-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２８３）
EIVLTQSPATLSLSPGERATVSCRPSQTISASSVAWYQQKAGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNEWPLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
K10-18Hの抗原結合ドメイン（配列番号２８４）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPDIFTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
前記（ｂｄ１）のポリペプチドにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の順序は、逆の順序でもよい。具体例として、前記（ＢＤ１）のポリペプチドは、配列番号２７２〜２８４のアミノ酸配列において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を交換したアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよい。
前記（ｂｄ２）のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記（ｂｄ３）のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
前記膜貫通ドメインおよび前記細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、それぞれ、前記本発明のＣＡＲライブラリの第１の膜貫通ドメインおよび第１の細胞内シグナル伝達ドメインの説明を援用できる。
本発明の第２のＣＡＲは、具体例として、例えば、下記（ＣＡ）のポリペプチドがあげられる。
（ＣＡ）下記（ＣＡ１）、（ＣＡ２）または（ＣＡ３）のポリペプチド
（ＣＡ１）配列番号２８５〜２９７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ＣＡ２）配列番号２８５〜２９７のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチド
（ＣＡ３）配列番号２８５〜２９７のいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチド
L4-18H CAR（配列番号２８５）
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L7-18H CAR（配列番号２８６）
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L9-18H CAR（配列番号２８７）
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSWSNIGDDHVSWYQQFPGAAPKLLIYDTSKRPSRVADRFSGSKSGASATLAITGLQAGDEADYYCGTWESSLSGVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L13-18H CAR（配列番号２８８）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGLSSDVGGYDYVSWYQQHPGIAPKLMIYDVTNRPSGVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTSTTWVFGAGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L14-18H CAR（配列番号２８９）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTTSDVGTTNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFVVFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L16-18H CAR（配列番号２９０）
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGVYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L17-18H CAR（配列番号２９１）
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVCWYQHLPGTAPKLLIYDNVKRPSGIPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSAIFGGGTELTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L22-18H CAR（配列番号２９２）
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCHSYDSSLSHVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K4-18H CAR（配列番号２９３）
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPLYTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K5-18H CAR（配列番号２９４）
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTLLYTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K6-18H CAR（配列番号２９５）
EIVLTRSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGISARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDIATYYCQQYDSLPLTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K9-18H CAR（配列番号２９６）
EIVLTQSPATLSLSPGERATVSCRPSQTISASSVAWYQQKAGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNEWPLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K10-18H CAR（配列番号２９７）
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPDIFTFGPGTKVDIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
前記（ＣＡ１）のポリペプチドにおいて、前記配列番号２８５〜２９７のアミノ酸配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列である。前記（ＣＡ２）および（ＣＡ３）のポリペプチドにおいて、前記配列番号２８５〜２９７のアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列は、例えば、保存されている。前記配列番号２８５〜２９７のアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を参照できる。
前記（ＣＡ２）のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記（ＣＡ３）のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
本発明の第２のＣＡＲの製造方法は、特に制限されず、例えば、前述のアミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子工学的に製造することができる。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、本発明は、この例示には限定されない。
まず、本発明の第２のＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主に導入し、形質転換体を得る。そして、前記形質転換体を培養し、前記第２のＣＡＲを発現する形質転換体を得る。
前記発現ベクターは、例えば、前記第２のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター等があげられ、例えば、前述の発現ベクターの説明を援用できる。前記宿主は、特に制限されず、例えば、前述の宿主の説明を援用できる。
＜核酸＞
本発明の核酸は、前述のように、前記本発明のキメラ抗原受容体をコードする。本発明の核酸は、前記本発明の第１のキメラ抗原受容体または第２のキメラ抗原受容体（以下、あわせて「本発明のキメラ抗原受容体」ともいう）をコードすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の核酸によれば、例えば、細胞に本発明のＣＡＲを発現させることができる。本発明の核酸は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第１の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体第２のキメラ抗原受容体の説明を援用できる。
本発明の核酸は、例えば、前記本発明のＣＡＲのアミノ酸配列に基づき、常法により調製できる。具体例として、前記本発明のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、前述の各ドメインのアミノ酸配列が登録されたデータベースにおいて、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、前記塩基配列に基づき、分子生物学的手法および／または化学的合成方法により調製できる。前記核酸の塩基配列は、例えば、本発明のＣＡＲを発現させる細胞の由来に応じて、コドン最適化してもよい。
本発明の核酸は、具体例として、例えば、下記（ｃ）のポリヌクレオチドがあげられる。
（ｃ）下記（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）、（ｃ４）、（ｃ５）、または（ｃ６）のポリヌクレオチド（核酸）
（ｃ１）配列番号１１８〜１３７のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ２）配列番号１１８〜１３７のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ３）配列番号１１８〜１３７いずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ４）配列番号１３８〜１５７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ５）配列番号１３８〜１５７のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ６）配列番号１３８〜１５７のいずれかの塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、A2/NY-ESO-1157に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
前記（ｃ１）〜（ｃ３）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のポリペプチドの説明を援用できる。
前記（ｃ４）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号１３８〜１５７の塩基配列は、例えば、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記（ｃ５）および（ｃ６）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号１３８〜１５７の塩基配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、保存されている。前記配列番号１３８〜１５７の塩基配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の第１の抗体等における組合せ（１）〜（１８）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
前記（ｃ５）のポリヌクレオチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記（ｃ６）のポリヌクレオチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２８０個、１〜２１０個、１〜１４０個、１〜７０個、１〜６３個、１〜５６個、１〜４９個、１〜３５個、１〜２８個、１〜２１個、１〜１４個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
H1-3M4E5L CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１３８）
5'-CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTGGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K52-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１３９）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTGCCATGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGCAATATTATAGTACTCCTCAAACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K73-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４０）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAAGCAGGGAAAGCCCCTAAGCTTCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCAACCTATTACTGCCAACAGTATGAAAGTTATCGAAGGTCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K121-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４１）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K124-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４２）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K125-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４３）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCTCCGTGCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K131-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４４）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGATGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAATCTGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K145-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４５）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATGCTGCATCCAGATTGGAAAGTGGGGTCCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGATGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K151-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４６）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGATGACTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAATCTGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K160-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４７）
5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAACCTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K173-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４８）
5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAAGCAGGGAAAGCCCCTAAGCTTCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCAACCTATTACTGCCAACAGTATGAAAGTTATTCCCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L1-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４９）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGACTTTGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCGAAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGATGTCAATAACCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGGTGACTATTACTGCAGCTCATATGCAGGCAGCAACAGCGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
3M4E5H-L1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５０）
5'-GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGACTTTGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCGAAGCCCCCAAACTCCTCGTTTATGATGTCAATAACCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGGTGACTATTACTGCAGCTCATATGCAGGCAGCAACAGCGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L66-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５１）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGGACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGAATTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAGCGCCCCCAAACTCATTATTTATGACGTAATAGAGCGTCCCTTCGGTGTCTCCTATCGGTTCTCTGCCTCCAAGTCAGGCAACACGGCCTCCCTGACGATCTCTGGGCTCCAGGGTGAAGACGAGGCTGATTACTTCTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L73-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５２）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCGGCAGTGACGTTGGTGCTTATGACTATGTCTCCTGGTACCAACATCACCCAGGCAGAGCCCCCAGACTCATCATTCGTGATGTCAGTGTGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTCCTCATATTCAGGCAGCAGCACTTGGGTGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L80-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５３）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTTATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTTTCGCGGTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L88-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５４）
5'-CAATCTGCCCTGCCTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGCTGTTCGTATGCAGGCGGCTATTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L102-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５５）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGACTGAGGACGAGGCTGATTACTATTGCAGCTCATATGCAGGCAGCGGCAGCACCCCCTTTGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L124-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５６）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAAGGGTCCCTGATCGCTTCGCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAAGACGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCCGGCAGACGTTATGTGTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
H73-3M4E5L CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５７）
5'-CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTGCCCTATCTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTGGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
本発明の核酸は、他の具体例として、例えば、下記（ｃａ）のポリヌクレオチドがあげられる。
（ｃａ）下記（ｃａ１）、（ｃａ２）、（ｃａ３）、（ｃａ４）、（ｃａ５）、または（ｃａ６）のポリヌクレオチド（核酸）
（ｃａ１）配列番号２７２〜２８４のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃａ２）配列番号２７２〜２８４のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃａ３）配列番号２７２〜２８４のいずれかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃａ４）配列番号２９８〜３１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃａ５）配列番号２９８〜３１０のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃａ６）配列番号２９８〜３１０のいずれかの塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＣＤ１９に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
前記（ｃａ１）〜（ｃａ３）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（ＣＡ１）〜（ＣＡ３）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（ＣＡ１）〜（ＣＡ３）のポリペプチドの説明を援用できる。
前記（ｃａ４）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号２９８〜３１０の塩基配列は、例えば、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記（ｃａ５）および（ｃａ６）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号２９８〜３１０の塩基配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、保存されている。前記配列番号２９８〜３１０の塩基配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の第２の抗体等における組合せ（LA）〜（LM）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
前記（ｃａ５）のポリヌクレオチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
前記（ｃａ６）のポリヌクレオチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２８０個、１〜２１０個、１〜１４０個、１〜７０個、１〜６３個、１〜５６個、１〜４９個、１〜３５個、１〜２８個、１〜２１個、１〜１４個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
L4-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９８）
5'-TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCTCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCACACATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L7-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９９）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATACCAGCCTGACTGCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L9-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３００）
5'-CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCTGGTCCAACATTGGAGATGATCATGTCTCCTGGTACCAGCAGTTCCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACACTTCTAAGCGACCCTCACGCGTTGCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCGCGTCAGCCACCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGGGGACGAGGCCGACTATTATTGCGGAACATGGGAAAGCAGCCTGAGTGGTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L13-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０１）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGACTCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATGACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCATAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCACTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAGTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAACCAGCACGACTTGGGTCTTCGGAGCTGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L14-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０２）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCACCAGTGACGTTGGTACTACTAATTATGTCTCCTGGTACCAGCAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCCTAATTTATGATGTCACTAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGCCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCAGGCAGCTACACCTTCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L16-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０３）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGTTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGCCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTGTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L17-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０４）
5'-CAGTCTGTACTGACTCAACCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGCTCTGGCAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATTATGTATGCTGGTACCAACACCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTTCTCATTTATGACAATGTTAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGCCATATTCGGCGGAGGGACCGAGCTGACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
L22-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０５）
5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCACTCCTATGACAGCAGCCTGAGTCATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K4-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０６）
5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCCTTGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K5-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０７）
5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCTTTTGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K6-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０８）
5'-GAAATTGTGTTGACACGGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCCTCCAACAGGGCCACTGGTATTTCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAGTCTCCCACTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K9-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０９）
5'-GAAATAGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCGTCTCCTGTAGGCCCAGTCAGACCATTAGTGCCAGTTCCGTAGCCTGGTATCAGCAGAAAGCTGGCCAGGCTCCACGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAATTTAATGAATGGCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K10-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３１０）
5'-GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAAAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCGATATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCTGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
本発明の核酸は、例えば、発現ベクターに導入されてもよい。前記発現ベクターは、例えば、前述の説明を援用できる。
本発明の核酸において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
＜細胞＞
本発明の細胞は、前述のように、前記本発明のキメラ抗原受容体を含む。本発明の細胞は、前記本発明のキメラ抗原受容体を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の細胞によれば、例えば、がんを治療できる。本発明の細胞は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸等の説明を援用できる。
本発明の細胞は、前記本発明のＣＡＲ以外のＣＡＲを発現してもよい。前記細胞は、Ｔ細胞が好ましい。前記Ｔ細胞は、例えば、前記Ｔ細胞様の細胞でもよい。
＜細胞の製造方法＞
本発明の細胞の製造方法は、前述のように、前記本発明の核酸を細胞に導入する導入工程を含む。本発明の細胞の製造方法は、前記導入工程において、前記本発明の核酸を細胞に導入することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の細胞の製造方法によれば、例えば、がんを治療可能な細胞を製造できる。本発明の細胞の製造方法は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸、細胞等の説明を援用できる。
前記細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞様の細胞が好ましい。
前記導入工程における核酸の導入方法は、特に制限されず、例えば、前記本発明の第１のスクリーニング方法における第１の発現工程の説明を援用できる。
本発明の細胞の製造方法は、例えば、前記導入工程後、前記細胞に前記核酸がコードするキメラ抗原受容体を発現させる発現工程を含んでもよい。前記発現工程は、例えば、前記導入工程後の細胞を培養することにより実施できる。
＜がん治療薬＞
本発明のがん治療薬（以下、「治療薬」ともいう）は、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を含む。本発明の治療薬は、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の治療薬によれば、例えば、がんを治療できる。本発明のがん治療薬は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法等の説明を援用できる。
本発明において、治療対象のがんは、特に制限されず、例えば、発現するキメラ抗原受容体の種類等に応じて、適宜決定できる。本発明のがん治療薬がA2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲに関連する細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸の場合、前記治療対象のがんは、例えば、悪性黒色腫、肺がん、滑膜肉腫、乳がん、食道がん、卵巣がん、膀胱がん、神経芽腫、骨髄腫等があげられる。本発明のがん治療薬がＣＤ１９に結合するＣＡＲに関連する細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸の場合、前記治療対象のがんは、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫等があげられる。
本発明の治療薬の投与条件は、特に制限されず、例えば、対象となるがんの種類、がんの進行度、患者の年齢等に応じて、投与形態、投与方法、投与時期、投与量等を適宜設定できる。本発明の治療薬の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記投与対象に、本発明の治療薬を投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与方法は、例えば、非経口投与、経口投与等があげられる。前記非経口投与は、例えば、局所投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、リンパ管内投与、腫瘍内投与等があげられる。
本発明の治療薬の投与形態は、特に制限されず、例えば、注射液（注射剤）、点滴静注液等の液剤等である。
本発明の治療薬において、前記細胞の配合量は、特に制限されない。また、前記細胞の投与条件は、特に制限されない。前記投与方法が静脈内投与の場合、前記細胞の投与条件は、例えば、ヒト成人男子に対する１回あたりの投与量（合計）は、例えば、１×１０８〜３×１０１０細胞であり、好ましくは、１×１０９〜１×１０１０細胞であり、投与回数は、例えば、１週間〜４週間に１回である。本発明の治療薬において、前記細胞の配合量は、例示した投与条件を実現できるような濃度で含まれていることが好ましい。
本発明の治療薬において、前記遺伝子、発現ベクター、または核酸の配合量は、特に制限されない。また、前記遺伝子、発現ベクター、または核酸の投与条件は、特に制限されない。前記投与方法が皮下注射または静脈注射等であり、ヒトに全身投与する場合、１回あたりの投与量（合計）は、例えば、５〜５０００ｍｇ、５０〜５００ｍｇであり、投与回数は、例えば、２週間〜８週間に１回である。
本発明の治療薬は、前記細胞、遺伝子、発現ベクター、および核酸のいずれか１種類のみを含んでもよいし、複数種類を含んでもよい。また、本発明の治療薬は、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物の配合量は、本発明の治療薬の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。前記添加物は、例えば、基剤、安定化剤、保存剤等があげられる。
＜がんの治療方法＞
本発明のがんの治療方法は、投与対象に、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を投与する投与工程を含む。本発明のがんの治療方法は、前記投与工程において、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸を投与することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の治療方法によれば、がんを治療できる。本発明のがんの治療方法は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法、治療薬等の説明を援用できる。
前記投与工程では、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、および核酸のうち、いずれか１種類を投与してもよいし、複数種類を投与してもよい。
＜抗体等または細胞、遺伝子、発現ベクター、もしくは核酸の使用＞
本発明は、がんの治療方法に使用するための、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片、または、がんの治療のための、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片である。また、本発明は、がんの治療用医薬の製造のための、前記本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用である。さらに、本発明は、がんの治療方法に使用するための、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、もしくは核酸、または、がんの治療のための、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、もしくは核酸である。また、本発明は、がんの治療用医薬の製造のための、前記本発明の細胞、遺伝子、発現ベクター、または核酸の使用である。本発明の使用は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法、治療薬、治療方法等の説明を援用できる。
＜ＢｓＡｂライブラリ＞
本発明の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）ライブラリは、第１の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）をコードする核酸を含み、前記第１のＢｓＡｂは、第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、前記第１の抗原結合ドメインは、第１の標的抗原に結合する第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、前記第２の抗原結合ドメインは、第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含み、前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たし、前記第１の標的抗原または前記第２の標的抗原は、免疫細胞活性化受容体である。
条件１：
前記第２の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第２の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、本発明のＢｓＡｂライブラリは、前記第１のＢｓＡｂは、第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、前記第１の抗原結合ドメインは、第１の標的抗原に結合する第１のｓｃＦｖを含み、前記第２の抗原結合ドメインは、第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含み、前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、前記条件１または条件２を満たし、前記第１の標的抗原または前記第２の標的抗原は、免疫細胞活性化受容体であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のＢｓＡｂライブラリは、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法、治療薬、治療方法等の説明を援用できる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１のＢｓＡｂは、前記第１の抗原結合ドメインと、前記第２の抗原結合ドメインとを含むタンパク質である。前記第１の抗原結合ドメインと、前記第２の抗原結合ドメインとは、それぞれ、第１の標的抗原に結合する第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）と、第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖとを含む。前記第２のｓｃＦｖは、例えば、ｓｃＦｖに類似した構造を有し、前記抗原に結合する細胞外ドメインが、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第２の抗原結合ドメインに変更されている。また、本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１の標的抗原または前記第２の標的抗原が、免疫細胞活性化受容体である。このため、前記第１の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２の標的抗原と結合する第１のＢｓＡｂは、例えば、前記第２の標的抗原および前記第１の標的抗原（前記免疫細胞活性化受容体）を発現可能な免疫細胞の共存下で、前記免疫細胞の前記免疫細胞活性化受容体を介してシグナルを誘導でき、その結果、前記免疫細胞を活性化（例えば、増殖、活性化マーカーの発現等）することができる。すなわち、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、前記第１の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、後述の第２のスクリーニング方法を用いて、前記ＢｓＡｂライブラリから発現されたＢｓＡｂ群において、前記免疫細胞を活性化させる第１のＢｓＡｂを前記第２の標的抗原と結合するＢｓＡｂとして選抜できる。このため、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、ハイブリドーマを用いる方法およびファージディスプレイを用いる方法と比較して、より簡便に、第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記第２の標的抗原と結合する第１のＢｓＡｂは、例えば、後述の第２のスクリーニング方法において、前記免疫細胞を活性化させることができるため、前記免疫細胞を活性化可能なＢｓＡｂといえる。したがって、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、前記第２の標的抗原を発現する細胞に対して、前記免疫細胞を介した傷害活性等を誘導しうるＢｓＡｂをスクリーニングできる。
また、前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２の標的抗原と結合する第１のＢｓＡｂは、例えば、前記第１の標的抗原および前記第２の標的抗原（前記免疫細胞活性化受容体）を発現可能な免疫細胞の共存下で、前記免疫細胞の免疫細胞活性化受容体を介してシグナルを誘導でき、その結果、免疫細胞を活性化（例えば、増殖、活性化マーカーの発現等）することができる。すなわち、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、後述の第２のスクリーニング方法を用いて、前記ＢｓＡｂライブラリから発現されたＢｓＡｂ群において、前記免疫細胞を活性化させる第１のＢｓＡｂを前記第２の標的抗原と結合するＢｓＡｂとして選抜できる。このため、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、ハイブリドーマを用いる方法およびファージディスプレイを用いる方法と比較して、より簡便に、第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記第２の標的抗原と結合する第１のＢｓＡｂは、例えば、後述の第２のスクリーニング方法において、前記免疫細胞を活性化させることができるため、免疫細胞を活性化可能なＢｓＡｂといえる。したがって、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、前記第１の標的抗原を発現する細胞に対して、免疫細胞を介した傷害活性等を誘導しうるＢｓＡｂをスクリーニングできる。
また、本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第２の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含む。前記第２のｓｃＦｖは、例えば、抗原に結合する抗体由来の一本鎖のポリペプチドであり、かつ前記抗原との結合能を保持するｓｃＦｖと類似する構造を有する。前記ｓｃＦｖは、前記抗原に結合する抗体の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域の断片（Ｆｖ）を連結したポリペプチドである。他方、前記第２のｓｃＦｖは、例えば、後述のように、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のうち一方が、前記第２の標的抗原に結合する抗体等の可変領域であり、他方が、Ｂ細胞受容体に由来する可変領域、すなわち、前記第２の標的抗原に結合するかが不明の可変領域である。本発明のＢｓＡｂライブラリは、前記第２のｓｃＦｖをこのような構成とすることにより、例えば、前記第２の標的抗原に結合する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のスクリーニングを実施することができる。このため、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、前記第２の標的抗原に結合する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を一度にスクリーニングするファージディスプレイ法と比較して、より少ない数または種類の核酸で、前記第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、第１のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、第１のＢｓＡｂのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味し、前述の説明を援用できる。
本発明において、「ＢｓＡｂ」は、例えば、抗体分子における２つの抗原結合部位が、それぞれ異なる標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。前記異なる標的抗原は、例えば、エピトープが異なることを意味し、異なる抗原のエピトープでもよいし、同じ抗原における異なるエピトープでもよい。前記「ＢｓＡｂ」は、例えば、公知の二重特異性抗体の構造を採用でき、具体例として、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、タンダブ（tanda）、ｓｃＦｖとダイアボディとの組合せであるフレキシボディ（flexibody）、タンデム（tandem）ｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ（登録商標）、Micromet社）、ＤＡＲＴ（登録商標）（MacroGenics社）、Ｆｃａｂ（商標）またはｍＡｂ２（商標）（F-star社）、Fc engineering抗体（Xencor社）またはDuoBody（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ社）等の構造が採用でき、ライブラリを容易に構築できることから好ましくは、タンデムｓｃＦｖである。前記タンデムｓｃＦｖは、例えば、２つのｓｃＦｖがリンカーペプチド（Ｆｖ間リンカーペプチド）により連結されたタンパク質であり、２つのｓｃＦｖは、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がリンカーペプチド（Ｆｖリンカーペプチド）により連結されている。
以下、第１のＢｓＡｂについて、第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合と、前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合とについて、それぞれ説明する。
（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体
前記免疫細胞活性化受容体は、例えば、前記免疫細胞に発現し、かつ、リガンドとの結合または複数の免疫細胞活性化受容体の架橋により前記免疫細胞活性化受容体が発現する免疫細胞を活性化可能な受容体を意味する。前記免疫細胞活性化受容体は、例えば、前記免疫細胞の種類に応じて適宜決定できる。具体例として、前記免疫細胞がＴ細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、ＣＤ３等があげられる。前記ＣＤ３は、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ηまたは、これらの複合体があげられる。前記免疫細胞がＮＫ細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、ＮＫ細胞の活性化受容体等があげられる。前記ＮＫ細胞の活性化受容体は、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＫＧ２Ｄ等があげられる。前記免疫細胞がＮＫＴ細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、ＣＤ３、前記ＮＫ細胞の活性化受容体等があげられる。前記免疫細胞がＢ細胞の場合、前記免疫細胞活性化受容体は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β等があげられる。
前記第１の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２の標的抗原は、特に制限されず、例えば、前記ＣＡＲライブラリにおける標的抗原の説明を援用できる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、第１のｓｃＦｖは、例えば、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含む。前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有する。一般に、抗体分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、３ヶ所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Complemetarity determining region）を有している。ＣＤＲは、超可変領域（hypervariable domain）ともいう。ＣＤＲは、前記重鎖および軽鎖の可変領域でも、特に一次構造の変異性が高い領域であり、一次構造上において、通常、３ヶ所に分離している。本発明において、重鎖可変領域における３ヶ所のＣＤＲを、重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ末端（Ｎ末端）側から、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）と表し、軽鎖可変領域における３ヶ所のＣＤＲを、軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ末端側から、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）と表す。これらの部位は、立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
前記第１の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第１の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。
前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とは、ＣＤ３等の免疫細胞活性化受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を用いる。前記抗体またはその抗原結合断片の具体例は、例えば、前述の本発明の抗体等における抗体および抗原結合断片の説明を援用できる。
前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体の種類に応じて、公知の抗体等を使用できる。具体例として、前記免疫細胞活性化受容体がＣＤ３の場合、ＣＤ３εに対する抗体は、例えば、ＯＫＴ３抗体、ＵＣＨＴ１抗体、Ｌ２K抗体、ＨＩＴ３a抗体、２８Ｆ１１抗体、２７Ｈ５抗体等があげられる。前記免疫細胞活性化受容体がＣＤ１９の場合、ＣＤ１９に対する抗体は、例えば、ＦＭＣ６３抗体、ＳＪ２５Ｃ１等があげられる。前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体を免疫することにより得られた抗体でもよい。前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等は、例えば、後述の本発明の第２のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖであってもよい。前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の重鎖可変領域において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３以外の領域、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記ＦＲは、一次構造上において、通常、４ヶ所に分離している。本発明において、前記重鎖可変領域における４ヶ所のＦＲを、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、重鎖ＦＲ１（ＦＲＨ１）、重鎖ＦＲ２（ＦＲＨ２）、重鎖ＦＲ３（ＦＲＨ３）、および重鎖ＦＲ４（ＦＲＨ４）と表す。なお、前記各ＣＤＲＨと、前記各ＦＲＨとは、例えば、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、ＦＲＨ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、ＣＤＲＨ３、およびＦＲＨ４の順序で配置されている。前記第１の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＨの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記ＦＲは、一次構造上において、通常、４ヶ所に分離している。本発明において、前記軽鎖可変領域における４ヶ所のＦＲを、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、軽鎖ＦＲ１（ＦＲＬ１）、軽鎖ＦＲ２（ＦＲＬ２）、軽鎖ＦＲ３（ＦＲＬ３）、および軽鎖ＦＲ４（ＦＲＬ４）と表す。なお、前記各ＣＤＲＬと、前記各ＦＲＬとは、例えば、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、およびＦＲＬ４の順序で配置されている。前記第１の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＬの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１のｓｃＦｖにおいて、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、第１のリンカーペプチド（第１のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のｓｃＦｖの前記免疫細胞活性化受容体への結合を阻害しないことが好ましい。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記第１のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含む。前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有し、その構造について、例えば、前記第１のｓｃＦｖの説明を援用できる。
前記第２の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第２の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、前記条件１または条件２を満たす。
前記条件１では、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、前記第２の標的抗原に結合する抗体等を用い、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３について、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする。前記抗体またはその抗原結合断片の具体例は、例えば、前述の本発明の抗体等における抗体および抗原結合断片の説明を援用できる。
前記第２の標的抗原に結合する抗体等は、例えば、前記第２の標的抗原に応じて公知の抗体等を使用できる。具体例として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５の複合体に対する抗体としては、例えば、３Ｍ４Ｅ５抗体が使用できる。また、ヒトＣＤ１９に対する抗体としては、例えば、ＦＭＣ６３抗体が使用できる。前記第２の標的抗原に結合する抗体等は、例えば、後述の本発明の第２のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖであってもよいし、前記第２の標的抗原を免疫することで得られた抗体でもよい。前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第２の標的抗原に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＨの説明における「第２の標的抗原に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、Ｖ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片がＶＪ遺伝子再構築することで形成されたＶＪ遺伝子断片によりコードされる。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、Ｖ遺伝子断片と、Ｊ遺伝子断片とを人工的に組合せて設計した人工ＶＪ遺伝子断片がコードするポリペプチドを含むＢ細胞受容体であってもよい。また、生体内のＢ細胞は、例えば、ＶＪ遺伝子再構築後の軽鎖可変領域を発現している。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体であってもよい。この場合、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体があげられ、好ましくは、ヒト末梢血Ｂ細胞由来のＢ細胞受容体である。本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１のＢ細胞受容体は、ＢｓＡｂライブラリをより容易に調製できることから、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第１のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＬの説明における「第１のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２のｓｃＦｖにおいて、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、第２のリンカーペプチド（第２のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第２のｓｃＦｖの前記第２の標的抗原への結合を阻害しないことが好ましい。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記第２のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のＦｖリンカーペプチドと同じでもよいし、異なってもよい。
つぎに、前記条件２では、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記第２の標的抗原に結合する抗体等に由来し、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３について、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、Ｖ遺伝子断片、Ｄ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片がＶＤＪ遺伝子再構築することで形成されたＶＤＪ遺伝子断片によりコードされる。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、Ｖ遺伝子断片と、Ｄ遺伝子断片と、Ｊ遺伝子断片とを人工的に組合せて設計した人工ＶＤＪ遺伝子断片がコードするポリペプチドを含むＢ細胞受容体であってもよい。また、生体内のＢ細胞は、例えば、ＶＤＪ遺伝子再構築後の重鎖可変領域を発現している。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体であってもよい。この場合、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体があげられ、好ましくは、ヒト末梢血Ｂ細胞由来のＢ細胞受容体である。本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１のＢ細胞受容体は、ＢｓＡｂライブラリをより容易に調製できることから、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体の重鎖可変領域であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第１のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＨの説明における「第１のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域において、前記第２の標的抗原に結合する抗体等は、例えば、前記条件１における第２の標的抗原に結合する抗体等の説明を援用できる。前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第２の標的抗原に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＬの説明における「第２の標的抗原に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２のｓｃＦｖにおいて、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、第２のリンカーペプチド（第２のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第２のｓｃＦｖの前記第２の標的抗原への結合を阻害しないことが好ましい。前記第２のＦｖリンカーペプチドの説明は、例えば、前記第１のＦｖリンカーペプチドの説明を援用できる。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のＦｖリンカーペプチドと、同じでもよいし、異なってもよい。
前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖは、例えば、直接または間接的に連結されている。前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖの連結は、例えば、前記第１のＢｓＡｂの種類に応じて、適宜設計できる。具体例として、前記第１のＢｓＡｂがタンデムｓｃＦｖの場合、前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖは、リンカーペプチド（Ｆｖ間リンカーペプチド）により連結されている。前記Ｆｖ間リンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記Ｆｖ間リンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記Ｆｖ間リンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
（２）第２の標的抗原：免疫細胞活性化受容体
前記第１の標的抗原は、特に制限されず、例えば、前記ＣＡＲライブラリにおける標的抗原の説明を援用できる。
前記第２の標的抗原は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」における第１の標的抗原の説明を援用できる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、第１のｓｃＦｖは、例えば、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含む。前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有し、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」における第１のｓｃＦｖの説明を援用できる。前記第１の重鎖可変領域は、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。
前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とは、前記第１の標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を用いる。前記抗体またはその抗原結合断片の具体例は、例えば、前述の本発明の抗体等における抗体および抗原結合断片の説明を援用できる。
前記第１の標的抗原に結合する抗体等は、例えば、前記第１の標的抗原の種類に応じて、公知の第１の標的抗原に結合する抗体等を使用できる。また、前記第１の標的抗原に結合する抗体等は、例えば、前記第１の標的抗原を免疫することにより得られた抗体でもよい。前記第１の標的抗原に結合する抗体等は、例えば、後述の本発明の第２のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖであってもよい。前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第１の標的抗原に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＨの説明における「第１の標的抗原に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記第１の標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の重鎖可変領域は、例えば、前記第１の標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の標的抗原に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の標的抗原に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第１の標的抗原に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＬの説明における「第１の標的抗原に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の標的抗原に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１のｓｃＦｖにおいて、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、第１のリンカーペプチド（第１のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のｓｃＦｖの前記第１の標的抗原への結合を阻害しないことが好ましい。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記第１のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含む。前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有し、その構造について、例えば、前記（１）における第１のｓｃＦｖの説明を援用できる。
前記第２の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第２の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、前記条件１または条件２を満たす。
前記条件１は、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等を用い、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３について、前記免疫細胞活性化受容体への結合をスクリーニングする。前記抗体またはその抗原結合断片の具体例は、例えば、前述の本発明の抗体等における抗体および抗原結合断片の説明を援用できる。
前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等は、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」における免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等の説明を援用できる。前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＨの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、Ｖ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片がＶＪ遺伝子再構築することで形成されたＶＪ遺伝子断片によりコードされる。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、Ｖ遺伝子断片と、Ｊ遺伝子断片とを人工的に組合せて設計した人工ＶＪ遺伝子断片がコードするポリペプチドを含むＢ細胞受容体であってもよい。また、生体内のＢ細胞は、例えば、ＶＪ遺伝子再構築後の軽鎖可変領域を発現している。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体であってもよい。この場合、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体があげられ、好ましくは、ヒト末梢血Ｂ細胞由来のＢ細胞受容体である。本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１のＢ細胞受容体は、ＢｓＡｂライブラリをより容易に調製できることから、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第１のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＬの説明における「第１のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第１のｓｃＦｖにおいて、前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、例えば、第１のリンカーペプチド（第１のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のｓｃＦｖの前記第１の標的抗原への結合を阻害しないことが好ましい。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記第１のＦｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記第１のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
つぎに、前記条件２では、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等に由来し、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３について、前記免疫細胞活性化受容体への結合をスクリーニングする。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、Ｖ遺伝子断片、Ｄ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片がＶＤＪ遺伝子再構築することで形成されたＶＤＪ遺伝子断片によりコードされる。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、Ｖ遺伝子断片と、Ｄ遺伝子断片と、Ｊ遺伝子断片とを人工的に組合せて設計した人工ＶＤＪ遺伝子断片がコードするポリペプチドを含むＢ細胞受容体であってもよい。また、生体内のＢ細胞は、例えば、ＶＤＪ遺伝子再構築後の重鎖可変領域を発現している。このため、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体であってもよい。この場合、前記第１のＢ細胞受容体は、例えば、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体があげられ、好ましくは、ヒト末梢血Ｂ細胞由来のＢ細胞受容体である。本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１のＢ細胞受容体は、ＢｓＡｂライブラリをより容易に調製できることから、単離されたＢ細胞由来のＢ細胞受容体の重鎖可変領域であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第１のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＨの説明における「第１のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の重鎖可変領域は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域において、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等は、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」における免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等の説明を援用できる。前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」と、前記各ＦＲＬの説明における「免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記免疫細胞活性化受容体に結合する抗体等における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第２のｓｃＦｖにおいて、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、第２のリンカーペプチド（第２のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第２のｓｃＦｖの前記免疫細胞活性化受容体への結合を阻害しないことが好ましい。前記第２のＦｖリンカーペプチドの説明は、例えば、前記第１のＦｖリンカーペプチドの説明を援用できる。前記第２のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のＦｖリンカーペプチドと、同じでもよいし、異なってもよい。
前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖは、例えば、直接または間接的に連結されてもよいし、前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖを共存させた場合、両者が会合（結合）するように形成してもよい。前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖの連結は、例えば、前記第１のＢｓＡｂの種類に応じて、適宜設計できる。具体例として、前記第１のＢｓＡｂがタンデムｓｃＦｖの場合、前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖは、リンカーペプチド（Ｆｖ間リンカーペプチド）により連結されている。前記Ｆｖ間リンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記Ｆｖ間リンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。具体例として、前記Ｆｖ間リンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。前記会合は、例えば、アミノ酸側鎖の電荷を利用できる。具体例として、前記会合は、例えば、一方の結合ドメインに正の電荷を有するアミノ酸のドメインを付加し、他方の結合ドメインに負の電荷を有するアミノ酸のドメインを付加することにより、誘導できる。また、前記会合は、例えば、タグ配列とタグ配列を認識するポリペプチドの組合せ等も利用できる。
本発明のＢｓＡｂライブラリにおいて、前記第１のＢｓＡｂにおける前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖの配置順序は、例えば、Ｎ末端側から、前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖがこの順序で配置されてもよいし、Ｎ末端側から、前記第２のｓｃＦｖおよび前記第１のｓｃＦｖがこの順序で配置されてもよいが、より簡便に第１のＢｓＡｂライブラリを調製できることから、後者が好ましい。
前記第１のＢｓＡｂは、例えば、下記式（３）（配列番号１５８）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。下記式（３）において、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、例えば、下記（Ｖ１）〜（Ｖ８）の組合せがあげられる。前記第２のｓｃＦｖが前記条件１を満たす場合、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、下記（Ｖ７）または（Ｖ８）が好ましい。また、前記第２のｓｃＦｖが前記条件２を満たす場合、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、およびＶ４は、下記（Ｖ５）または（Ｖ６）が好ましい。下記式（３）において、Ｖ１およびＶ２間のアミノ酸配列が、第１のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｖ２およびＶ３間のアミノ酸配列が、Ｆｖ間リンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｖ３およびＶ４間のアミノ酸配列が、第２のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列である。下記式（３）において、第１のＦｖリンカーペプチドおよび第２のＦｖリンカーペプチドは、Ｆｖリンカーペプチド１であるが、それぞれ、独立に、Ｆｖリンカーペプチド２であってもよい。
[Ｖ１]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[Ｖ２]-[SGSG]-[Ｖ３]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[Ｖ４] ・・・（３）
（Ｖ１）Ｖ１：ＶＨ１、Ｖ２：ＶＬ１、Ｖ３：ＶＨ２、Ｖ４：ＶＬ２
（Ｖ２）Ｖ１：ＶＬ１、Ｖ２：ＶＨ１、Ｖ３：ＶＨ２、Ｖ４：ＶＬ２
（Ｖ３）Ｖ１：ＶＨ１、Ｖ２：ＶＬ１、Ｖ３：ＶＬ２、Ｖ４：ＶＨ２
（Ｖ４）Ｖ１：ＶＬ１、Ｖ２：ＶＨ１、Ｖ３：ＶＬ２、Ｖ４：ＶＨ２
（Ｖ５）Ｖ１：ＶＨ２、Ｖ２：ＶＬ２、Ｖ３：ＶＨ１、Ｖ５：ＶＬ１
（Ｖ６）Ｖ１：ＶＨ２、Ｖ２：ＶＬ２、Ｖ３：ＶＬ１、Ｖ４：ＶＨ１
（Ｖ７）Ｖ１：ＶＬ２、Ｖ２：ＶＨ２、Ｖ３：ＶＨ１、Ｖ４：ＶＬ１
（Ｖ８）Ｖ１：ＶＬ２、Ｖ２：ＶＨ２、Ｖ３：ＶＬ１、Ｖ４：ＶＨ１
ＶＨ１：第１の重鎖可変領域
ＶＬ１：第１の軽鎖可変領域
ＶＨ２：第２の重鎖可変領域
ＶＬ２：第２の軽鎖可変領域
前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、下記式（４）（配列番号１５９）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。下記式（４）において、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４は、例えば、下記（Ｎ１）〜（Ｎ８）の組合せがあげられる。下記（Ｎ１）〜（Ｎ８）は、それぞれ、前記（Ｖ１）〜（Ｖ８）の組合せの第１のＢｓＡｂをコードする核酸である。下記式（４）において、Ｎ１およびＮ２間の塩基配列が、第１のＦｖリンカーペプチドをコードする塩基配列であり、Ｎ２およびＮ３間の塩基配列が、Ｆｖ間リンカーペプチドをコードする塩基配列であり、Ｎ３およびＮ４間の塩基配列が、第２のＦｖリンカーペプチドをコードする塩基配列である。下記式（４）において、第１のＦｖリンカーペプチドおよび第２のＦｖリンカーペプチドをコードする塩基配列は、Ｆｖリンカーペプチド１をコードする塩基配列であるが、それぞれ、独立に、Ｆｖリンカーペプチド２をコードする塩基配列であってもよい。
5'-[Ｎ１]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[Ｎ２]-[AGCGGATCTGGC]-[Ｎ３]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[Ｎ４]-3’ ・・・（４）
（Ｎ１）Ｎ１：ＮＨ１、Ｎ２：ＮＬ１、Ｎ３：ＮＨ２、Ｎ４：ＮＬ２
（Ｎ２）Ｎ１：ＮＬ１、Ｎ２：ＮＨ１、Ｎ３：ＮＨ２、Ｎ４：ＮＬ２
（Ｎ３）Ｎ１：ＮＨ１、Ｎ２：ＮＬ１、Ｎ３：ＮＬ２、Ｎ４：ＮＨ２
（Ｎ４）Ｎ１：ＮＬ１、Ｎ２：ＮＨ１、Ｎ３：ＮＬ２、Ｎ４：ＮＨ２
（Ｎ５）Ｎ１：ＮＨ２、Ｎ２：ＮＬ２、Ｎ３：ＮＨ１、Ｎ４：ＮＬ１
（Ｎ６）Ｎ１：ＮＨ２、Ｎ２：ＮＬ２、Ｎ３：ＮＬ１、Ｎ４：ＮＨ１
（Ｎ７）Ｎ１：ＮＬ２、Ｎ２：ＮＨ２、Ｎ３：ＮＨ１、Ｎ４：ＮＬ１
（Ｎ８）Ｎ１：ＮＬ２、Ｎ２：ＮＨ２、Ｎ３：ＮＬ１、Ｎ４：ＮＨ１
ＮＨ１：第１の重鎖可変領域をコードする塩基配列
ＮＬ１：第１の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
ＮＨ２：第２の重鎖可変領域をコードする塩基配列
ＮＬ２：第２の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
本発明のＢｓＡｂライブラリは、例えば、複数種類の核酸を含むことが好ましい。この場合、本発明のＢｓＡｂライブラリは、例えば、複数種類の核酸の混合物である。前記複数種類の核酸は、例えば、その一部または全部が、異なる第１のＢｓＡｂをコードしていることが好ましく、異なる第２の抗原結合ドメインをコードしていることが好ましい。複数種類の核酸が異なる第２の抗原結合ドメインをコードしている場合、前記第１のＢｓＡｂにおける第２の抗原結合ドメイン以外の領域は、例えば、同じまたは異なるアミノ酸配列である。本発明のＢｓＡｂライブラリに含まれる前記核酸の種類は、例えば、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類であり、好ましくは、約１×１０６種類（例えば、８×１０５〜２×１０６種類）である。前記ファージディスプレイ法では、約１×１０８種類の核酸が、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖのスクリーニングに必要となる。他方、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、約１×１０６種類の核酸であっても、前記第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。このため、本発明のＢｓＡｂライブラリによれば、例えば、ファージディスプレイ法と比較して、より少ない数または種類の核酸で、前記第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。
前記第１のＢｓＡｂは、例えば、Ｎ末端にシグナルペプチドを有してもよい。前記シグナルペプチドは、例えば、小胞体への輸送シグナルとなるシグナルペプチドがあげられる。前記第１のＢｓＡｂは、例えば、タグを有してもよい。前記タグは、例えば、ペプチドタグ、プロテインタグがあげられる。前記タグは、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、切断型のＮＧＦＲ（nerve growth factor receptor）等があげられる。前記タグペプチドは、例えば、前記第１のＢｓＡｂのＮ末端およびＣ末端の少なくとも一方に付加される。前記タグが切断型のＮＧＦＲの場合、前記タグは、例えば、前記第１のＢｓＡｂのＣ末端側に配置される。これにより、本発明のＢｓＡｂライブラリは、例えば、１つの細胞に１種類の第１のＢｓＡｂをコードする核酸が導入されるよう、核酸の導入効率を調整できる。前記第１のＢｓＡｂと前記タグとは、リンカーペプチドにより連結されてもよい。
本発明において、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、前記第１のＢｓＡｂのアミノ酸配列に基づき、常法により調製できる。具体例として、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、前述の各ドメインのアミノ酸配列が登録されたデータベースにおいて、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、前記塩基配列に基づき、分子生物学的手法および／または化学的合成方法により調製できる。前記核酸の塩基配列は、例えば、本発明のＢｓＡｂライブラリを発現させる細胞の由来に応じて、コドン最適化してもよい。
前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、発現ベクターに導入されてもよい。前記発現ベクターは、例えば、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸を連結用ベクターに連結することで調製できる。前記連結用ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクター等のレトロウイルスベクター；アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクター等のウイルスベクターがあげられる。具体例として、前記連結用ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＣＭＶ、ｐＭＸ、ｐＥＬＰ等があげられる。前記連結用ベクターは、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主に応じて、適宜設定することもできる。前記宿主は、特に制限されず、例えば、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等の哺乳類由来の培養細胞、免疫細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、リンパ球、顆粒球、マクロファージ等があげられる。前記リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、生体から単離された細胞、多能性幹細胞等の幹細胞から誘導された免疫細胞または免疫細胞由来の培養細胞である。前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞様の細胞でもよい。前記Ｔ細胞様の細胞は、例えば、Ｔ細胞に由来する培養細胞等があげられ、具体例として、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等があげられる。
前記発現ベクターは、例えば、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸の発現および前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸がコードする第１のＢｓＡｂの少なくとも一方の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸の発現およびこれがコードする前記第１のＢｓＡｂの少なくとも一方の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記連結ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記連結ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記連結ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
＜第２のスクリーニング方法＞
本発明の第２のｓｃＦｖのスクリーニング方法（以下、「第２のスクリーニング方法」ともいう）は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリから第１のＢｓＡｂを準備する第１の準備工程と、
前記第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第１のＢｓＡｂと、前記第２の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させ、
前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第１のＢｓＡｂと、前記第１の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程において、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂの第２のｓｃＦｖを、前記第２の標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む。
本発明の第２のスクリーニング方法は、前記第１の準備工程、前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程を含み、前記第１の準備工程において、前記本発明のＢｓＡｂライブラリを用いることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の第２のスクリーニング方法によれば、例えば、ハイブリドーマを用いる方法およびファージディスプレイを用いる方法と比較して、より簡便に、第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、本発明の第２のスクリーニング方法によれば、例えば、前記第１の標的抗原または第２の標的抗原を発現する細胞に対して、Ｔ細胞を介した傷害活性等を誘導しうるＢｓＡｂをスクリーニングできる。さらに、前記第２の標的抗原に結合するｓｃＦｖの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列に基づき、例えば、前記標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を作製できる。このため、前記第２のスクリーニング方法は、例えば、前記標的抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片のスクリーニング方法ということもできる。本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、第１の抗体等、第２の抗体等、遺伝子、発現ベクター、形質転換体、第１のキメラ抗原受容体、第２のキメラ抗原受容体、核酸、細胞、細胞の製造方法、治療薬、治療方法、ＢｓＡｂライブラリ等の説明を援用できる。本発明の第２のスクリーニング方法によれば、例えば、標的抗原に結合する新たなｓｃＦｖを製造できる。このため、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、ｓｃＦｖの製造方法ということもできる。
ファージディスプレイ法等により標的抗原に結合するＢｓＡｂ等を製造する場合、約１×１０１０種類の抗体ライブラリを作成し、標的抗原に結合する抗体を取得した後に、前記抗体からｓｃＦｖを含むＢｓＡｂ等を調製する。そして、前記ＢｓＡｂ等について免疫細胞等を用いて、その有効性について検討する。他方、本発明の第２のスクリーニング方法では、前記本発明のＢｓＡｂライブラリと、前記免疫細胞とを用いるため、例えば、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖのスクリーニングと、前記ライブラリから発現するＢｓＡｂの免疫細胞における有効性の検討について同時に実施することができる。このため、本発明の第２のスクリーニング方法によれば、例えば、標的抗原に結合する抗体を得るために用いられているファージディスプレイ法等と比較して、標的抗原に結合し、かつ免疫細胞等において有効に機能するＢｓＡｂに用いうるｓｃＦｖを簡便にスクリーニングできる。
前記第１の準備工程は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリから第１のＢｓＡｂを準備する工程である。前記第１のＢｓＡｂの準備方法は、特に制限されず、例えば、公知の核酸からタンパク質を合成する方法を利用できる。具体例として、前記第１の準備工程では、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリ（第１のＢｓＡｂライブラリ）を宿主に導入する。そして、前記第１の準備工程では、例えば、前記第１のＢｓＡｂライブラリが導入された宿主を培養することにより、前記宿主に前記ＢｓＡｂを発現させる。前記第１のＢｓＡｂライブラリの導入方法は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。前記宿主が細胞の場合、前記導入方法は、例えば、公知の核酸の細胞への導入方法を利用でき、前記本発明の第１のスクリーニング方法の前記第１の発現工程における導入方法の説明を援用できる。前記宿主の培養条件は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。具体例として、前記宿主が細胞の場合、前記細胞の培養期間は、特に制限されず、例えば、２４時間〜２週間、２４〜４８時間、１〜２週間である。前記細胞の培養温度は、例えば、２８〜３７℃である。
前記第１のＢｓＡｂライブラリは、例えば、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸でもよいし、前記第１のＢｓＡｂをコードする核酸が導入された発現ベクターでもよい。前記宿主は、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの説明を援用できる。前記宿主は、２９３細胞が好ましい。前記第１のＢｓＡｂは、ライブラリを容易に構築できることから、タンデムｓｃＦｖが好ましい。
つぎに、前記第１の接触工程では、前記第１のＢｓＡｂと、前記標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる。具体的には、前記第１のＢｓＡｂの第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第１の接触工程では、前記第１のＢｓＡｂと、前記第２の標的抗原と、前記免疫細胞とを接触させる。他方、前記第１のＢｓＡｂの第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第１の接触工程では、前記第１のＢｓＡｂと、前記第１の標的抗原と、前記免疫細胞とを接触させる。前記第１のＢｓＡｂと、前記標的抗原と、前記免疫細胞との接触は、例えば、前記第１のＢｓＡｂと、前記標的抗原と、前記免疫細胞との共存下で培養することにより実施できる。前記培養期間は、例えば、１〜９６時間、１〜６時間、６〜９６時間である。前記培養温度は、例えば、２８〜３７℃である。前記免疫細胞と、前記第１のＢｓＡｂの分子数の比は、例えば、１×１０６個の免疫細胞あたり、０．１ｐｍｏｌ以上の第１のＢｓＡｂとなるように設定されることが好ましい。
前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞は、前記免疫細胞活性化受容体を発現している免疫細胞でもよいし、所定の条件で前記免疫細胞活性化受容体の発現する免疫細胞でもよい。前記所定の条件は、例えば、前記免疫細胞の種類に応じて、適宜設定できる。前記免疫細胞は、前記免疫細胞活性化受容体の種類に応じて適宜決定できる。前記免疫細胞活性化受容体がＣＤ３の場合、前記免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞等があげられる。前記免疫細胞活性化受容体がＮＫ細胞の活性化受容体の場合、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞があげられる。前記免疫細胞活性化受容体がＣＤ１９、ＣＤ７９α、またはＣＤ７９βの場合、前記免疫細胞は、Ｂ細胞があげられる。前記Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＢ細胞は、それぞれ、前述のＴ細胞様の培養細胞、ＮＫ細胞様の培養細胞、ＮＫＴ細胞様の培養細胞、およびＢ細胞様の培養細胞であってもよい。前記免疫細胞活性化受容体および免疫細胞は、それぞれ、ＣＤ３およびＴ細胞またはＴ細胞様の培養細胞であることが好ましい。これにより、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、前記第１の標的抗原または第２の標的抗原を発現する細胞に対して、Ｔ細胞を介した傷害活性を誘導する可能性が高いＢｓＡｂをスクリーニングできる。
前記第１のＢｓＡｂは、例えば、１種類でもよいし、複数種類でもよい。後者の場合、前記第１の接触工程では、例えば、前記第１のＢｓＡｂとして、アミノ酸配列の異なる複数種類の第１のＢｓＡｂの混合物を使用する。
前記第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第１の接触工程において接触させる第２の標的抗原は、例えば、前記第２の標的抗原の単量体、前記第２の標的抗原の複合体、前記第２の標的抗原の発現細胞等があげられ、好ましくは、前記第２の標的抗原の発現細胞である。前記第２の標的抗原の複合体は、例えば、前記第２の標的抗原の多量体（マルチマー）があげられ、具体例として、前記標的抗原の二量体、四量体等があげられる。前記第２の標的抗原の多量体は、例えば、タグを付加した標的抗原を抗体により架橋する方法、ビオチン化された標的抗原をアビジンにより複合体化する方法等により調製できる。前記第２の標的抗原の発現細胞は、例えば、前記第２の標的抗原を内在的に発現する細胞、前記第２の標的抗原をコードする核酸を導入することにより前記第２の標的抗原を発現させた細胞等があげられる。前記第２の標的抗原を発現させる細胞は、例えば、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞等があげられる。前記第２の標的抗原を発現させる細胞は、例えば、前記宿主と同じでもよいし、異なってもよい。
前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第１の接触工程において接触させる第１の標的抗原は、例えば、前記第１の標的抗原の単量体、前記第１の標的抗原の複合体、前記第１の標的抗原の発現細胞等があげられ、好ましくは、前記第１の標的抗原の発現細胞である。前記第１の標的抗原の複合体は、例えば、前記第１の標的抗原の多量体（マルチマー）があげられ、具体例として、前記標的抗原の二量体、四量体等があげられる。前記第１の標的抗原の多量体は、例えば、タグを付加した標的抗原を抗体により架橋する方法、ビオチン化された標的抗原をアビジンにより複合体化する方法等により調製できる。前記第１の標的抗原の発現細胞は、例えば、前記第１の標的抗原を内在的に発現する細胞、前記第１の標的抗原をコードする核酸を導入することにより前記第２の標的抗原を発現させた細胞等があげられる。前記第１の標的抗原を発現させる細胞は、例えば、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｋ５６２細胞等の培養細胞等があげられる。前記第１の標的抗原を発現させる細胞は、例えば、前記宿主と同じでもよいし、異なってもよい。
そして、前記第１の選抜工程では、前記第１の接触工程において、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂの第２のｓｃＦｖを、前記第２の標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する。前記第２の標的抗原と前記第１のＢｓＡｂとの結合は、例えば、直接または間接的に評価できるが、前記第１の標的抗原または第２の標的抗原を発現する細胞に対して、Ｔ細胞を介した傷害活性等を誘導しうるＢｓＡｂをスクリーニングできることから間接的な評価が好ましい。
前記直接的な評価方法は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー等の抗体と抗原との結合検出方法より実施できる。具体例として、前記直接的な評価方法は、例えば、標識化された第１の標的抗原または第２の標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて実施できる。この場合、前記第１の選抜工程では、例えば、前記第１のＢｓＡｂと、前記標識化された第１の標的抗原または第２の標的抗原と、前記免疫細胞とを接触させる。前記第１のＢｓＡｂが前記２の標的抗原に結合する場合、前記第１のＢｓＡｂと、前記標識化された第１の標的抗原または第２の標的抗原と、前記免疫細胞とは複合体を形成する。このため、前記第１の選抜工程では、例えば、前記標識を含む複合体を形成している免疫細胞が存在する場合、前記第１のＢｓＡｂは、前記第２の標的抗原に結合していると評価できる。
また、前記間接的な評価方法は、例えば、以下のように実施できる。前記第２の標的抗原と結合する第１のＢｓＡｂは、例えば、前記免疫細胞の免疫細胞活性化受容体を架橋する。すると、前記免疫細胞活性化受容体を架橋された免疫細胞は、例えば、前記免疫細胞活性化受容体から生じたシグナルにより活性化する。このため、前記間接的な評価方法は、例えば、前記免疫細胞の活性化を指標に評価する。具体例として、前記第１のＢｓＡｂが前記第２の標的抗原と結合すると、例えば、前記第２の標的抗原と未結合の第１のＢｓＡｂが存在する場合と比較して、前記免疫細胞における活性化マーカーの発現の上昇、サイトカインおよび／またはケモカインの産生量の増加、増殖等が生じる。具体例として、前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＢ細胞の場合、前記各細胞では、例えば、下記活性化マーカーの発現の上昇、下記サイトカインおよび／またはケモカインの産生量の増加、増殖等が生じる。このため、前記第１の選抜工程では、例えば、いずれか１つ以上の指標に基づき、前記免疫細胞が活性化していると判断される場合、前記免疫細胞を活性化させた第１のＢｓＡｂを、前記第２の標的抗原に結合していると評価できる。前記サイトカインおよび／またはケモカインの産生量の増加は、例えば、前記サイトカインおよび／またはケモカインの発現が誘導されると、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が増加するレポーターを用いてもよい。前記レポーターは、例えば、蛍光タンパク質があげられる。
・Ｔ細胞
活性化マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７a等
サイトカイン・ケモカイン：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β等
・ＮＫ細胞
活性化マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７a等
サイトカイン・ケモカイン：ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１２等
・ＮＫＴ細胞
活性化マーカー：ＣＤ６９、ＣＤ１０７a、ＣＤ２５等
サイトカイン・ケモカイン：ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２等
・Ｂ細胞
活性化マーカー：ＣＤ２８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、Ｂ２２０等
サイトカイン・ケモカイン：ＣＸＣＲ４等
そして、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂの第２のｓｃＦｖを、前記第２の標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する。前記第１の候補ｓｃＦｖの選抜は、例えば、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂを発現させた宿主を選抜し、選抜された宿主におけるｓｃＦｖまたはＢｓＡｂをコードする塩基配列を解読することにより実施できる。前記第１の選抜工程では、例えば、さらに、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける、重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とを特定してもよい。各ＣＤＲの特定は、例えば、ゲノム情報を参照し、公知の方法により実施できる。
これにより、前記第２の標的抗原に結合する新たなｓｃＦｖをスクリーニングできる。また、前記第１のＢｓＡｂライブラリにおける第１のＢｓＡｂが前記条件１を満たす場合、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、前記第２の標的抗原に結合する新たな軽鎖可変領域をスクリーニングできる。前記第１のＢｓＡｂライブラリにおける第１のＢｓＡｂが前記条件２を満たす場合、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、前記第２の標的抗原に結合する新たな重鎖可変領域をスクリーニングできる。
前記第１のＢｓＡｂが複数種類のＢｓＡｂを含む場合、前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程は、１回でもよいし、複数回でもよいが、複数回実施することが好ましい。前記複数回は、例えば、２〜５回、２〜４回であり、好ましくは、２〜３回である。この場合、前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程を１セットとし、前記セットを複数回実施することが好ましい。前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程を複数回実施する場合、１回目の第１の接触工程および第１の選抜工程の実施後、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂを発現する宿主から、例えば、新たな第１のＢｓＡｂを準備する。この場合、新たな第１のＢｓＡｂが含むＢｓＡｂの種類数は、１つ前の回に第１の接触工程および第１の選抜工程に供したＢｓＡｂの種類数より少ないことが好ましい。前記新たな第１のＢｓＡｂは、例えば、第１のＢｓＡｂを発現する宿主を回収後、希釈する。そして、前記希釈後の宿主を、回収時の細胞密度より低い密度で再播種後、培養し、培養上清を回収することにより、新たな第１のＢｓＡｂを調製できる。そして、本発明の第２のスクリーニング方法では、例えば、新たな第１のＢｓＡｂを用いて、前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程を実施する。そして、所望の回数まで同様に接触および選抜を繰り返し実施し、例えば、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂを発現する宿主を単クローン化する。これにより、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂをより確実に同定できる。
本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖの新たな重鎖可変領域または軽鎖可変領域を、それぞれ、前記第１のＢｓＡｂライブラリの第２のｓｃＦｖにおける第２の標的抗原に結合する抗原等における重鎖可変領域または軽鎖可変領域として、他方の領域のスクリーニングを実施してもよい。この場合、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、さらに、前記第１の候補ｓｃＦｖに基づき、第２のＢｓＡｂライブラリを調製する調製工程を含む。
前記第２のＣＡＲライブラリは、例えば、第２のＢｓＡｂをコードする核酸を含む。また、前記第２のＢｓＡｂは、例えば、第３の抗原結合ドメインと、第４の抗原結合ドメインとを含む。前記第３の抗原結合ドメインは、例えば、前記第１の標的抗原に結合する第３のｓｃＦｖを含む。また、前記第４の抗原結合ドメインは、例えば、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第４のｓｃＦｖを含む。
前記第２のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、第２のＢｓＡｂのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味する。
本発明の第２のスクリーニング方法において、前記第２のＢｓＡｂは、例えば、前記第１のＢｓＡｂと同じ構造を有してもよいし、異なる構造を有してもよい。前記第２のＢｓＡｂは、ライブラリを容易に構築できることから、タンデムｓｃＦｖであることが好ましい。
前記第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、第２のＢｓＡｂにおける前記第１の標的抗原は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の第１のＢｓＡｂにおける前記第１の標的抗原と同じでもよいし、異なってもよい。後者の場合、前記第２のＢｓＡｂの第１の標的抗原は、例えば、前記第１のＢｓＡｂの第１の標的抗原とは異なるサブユニットまたは複合体である。
前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２のＢｓＡｂにおける前記第１の標的抗原は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（２）第２の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の第１のＢｓＡｂにおける前記第１の標的抗原と同じであり、その説明を援用できる。
前記第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２のＢｓＡｂにおける前記第２の標的抗原は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の第１のＢｓＡｂにおける前記第２の標的抗原と同じであり、その説明を援用できる。
前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２のＢｓＡｂにおける前記第２の標的抗原は、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（２）第２の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の第１のＢｓＡｂにおける前記第２の標的抗原と同じでもよいし、異なってもよい。後者の場合、前記第２のＢｓＡｂの第２の標的抗原は、例えば、前記第１のＢｓＡｂの第１の標的抗原とは異なるサブユニットまたは複合体である。
前記第３のｓｃＦｖは、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリにおける「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の第１のｓｃＦｖの説明において、「第１のｓｃＦｖ」を「第３のｓｃＦｖ」に、「第１の重鎖可変領域」を「第３の重鎖可変領域」に、「第１の軽鎖可変領域」を「第３の軽鎖可変領域」に読み替えて、その説明を援用できる。前記第２のＢｓＡｂにおける第３のｓｃＦｖは、前記第１のＢｓＡｂにおける第１のｓｃＦｖと同じでもよいし、異なってもよい。
前記第３のｓｃＦｖにおいて、前記第３の重鎖可変領域および前記第３の軽鎖可変領域は、例えば、第３のリンカーペプチド（第３のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第３のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第３のｓｃＦｖの前記第２の標的抗原への結合を阻害しないことが好ましい。前記第３のＦｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記第３のＦｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記第３のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
前記第２のＢｓＡｂにおいて、第４のｓｃＦｖは、第４の重鎖可変領域と、第４の軽鎖可変領域とを含む。前記第４の重鎖可変領域および前記第４の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有し、その構造について、例えば、前記第１のｓｃＦｖの説明を援用できる。
前記第４の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第４の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第４の重鎖可変領域および前記第４の軽鎖可変領域は、下記条件３または条件４を満たす。
条件３：
前記第１の準備工程におけるＢｓＡｂライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第１の候補ＢｓＡｂにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件４：
前記第１の準備工程におけるＢｓＡｂライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第１の候補ＢｓＡｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
前記条件３は、例えば、前記条件１を満たす第１のＢｓＡｂライブラリを用いてスクリーニングされた第１の候補ｓｃＦｖを用いて、第２のＢｓＡｂライブラリを調製する場合である。前記条件３では、例えば、前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記第１の候補ｓｃＦｖを用い、前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３について、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする。
前記第４の重鎖可変領域における第２のＢ細胞受容体は、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の条件２の第２の重鎖可変領域の説明において、「第１のＢ細胞受容体」を「第２のＢ細胞受容体」に、「第２の重鎖可変領域」を、「第４の重鎖可変領域」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第２のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＨの説明における「第２のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第４の重鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第４の重鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体における重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４の軽鎖可変領域において、ＦＲは、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第４の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」と、前記各ＦＲＬの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」とは、同じｓｃＦｖであることが好ましい。
前記第４の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第４の軽鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
つぎに、前記条件４は、例えば、前記条件２を満たす第１のＢｓＡｂライブラリを用いてスクリーニングされた第１の候補ｓｃＦｖを用いて、第２のＢｓＡｂライブラリを調製する場合である。前記条件４では、例えば、前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、前記第１の候補ｓｃＦｖを用い、前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３について、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする。
前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖのＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」と、前記各ＦＲＨの説明における「第１の候補ｓｃＦｖ」とは、同じｓｃＦｖであることが好ましい。
前記第４の重鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第４の重鎖可変領域は、例えば、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４の軽鎖可変領域における第２のＢ細胞受容体は、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリの「（１）第１の標的抗原：免疫細胞活性化受容体」の条件１の第２の軽鎖可変領域の説明において、「第１のＢ細胞受容体」を「第２のＢ細胞受容体」に、「第２の軽鎖可変領域」を「第４の軽鎖可変領域」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「第２のＢ細胞受容体」と、前記各ＦＲＬの説明における「第２のＢ細胞受容体」とは、同じＢ細胞受容体であることが好ましい。
前記第４の軽鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域を含んでもよい。この場合、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記第２のＢ細胞受容体における軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
前記第４のｓｃＦｖにおいて、前記第４の重鎖可変領域および前記第４の軽鎖可変領域は、例えば、第４のリンカーペプチド（第４のＦｖリンカーペプチド）により連結されている。前記第４のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第４のｓｃＦｖの前記免疫細胞活性化受容体への結合を阻害しないことが好ましい。前記第４のＦｖリンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記第４のＦｖリンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。前記第４のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。前記第４のｓｃＦｖにおける第４のＦｖリンカーペプチドは、例えば、前記第１のｓｃＦｖにおける第１のＦｖリンカーペプチドと同じでもよいし、異なってもよい。
前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖは、例えば、直接または間接的に連結されていてもよいし、前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖを共存させた場合、両者が会合（結合）するように形成してもよい。前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖの連結は、例えば、前記第２のＢｓＡｂの種類に応じて、適宜設計できる。具体例として、前記第２のＢｓＡｂがタンデムｓｃＦｖの場合、前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖは、リンカーペプチド（Ｆｖ間リンカーペプチド）により連結されている。前記Ｆｖ間リンカーペプチドは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記Ｆｖ間リンカーペプチドは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（GGGGS）ｎがあげられる。前記ｎは、例えば、１〜６の整数である。具体例として、前記Ｆｖ間リンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えば、前記配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。前記会合は、例えば、アミノ酸側鎖の電荷を利用できる。具体例として、前記会合は、例えば、一方の結合ドメインに正の電荷を有するアミノ酸のドメインを付加し、他方の結合ドメインに負の電荷を有するアミノ酸のドメインを付加することにより、誘導できる。また、前記会合は、例えば、タグ配列とタグ配列を認識するポリペプチドの組合せ等も利用できる。
前記第２のＢｓＡｂにおいて、前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖの配置順序は、例えば、Ｎ末端側から、前記第３のｓｃＦｖおよび前記第４のｓｃＦｖがこの順序で配置されてもよいし、Ｎ末端側から、前記第４のｓｃＦｖおよび前記第３のｓｃＦｖがこの順序で配置されてもよい。
前記第２のＢｓＡｂは、例えば、下記式（５）（配列番号１６０）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。下記式（５）において、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８は、例えば、下記（Ｖ９）〜（Ｖ１６）の組合せがあげられる。前記第４のｓｃＦｖが前記条件３を満たす場合、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８は、下記（Ｖ１３）または（Ｖ１４）を満たすことが好ましい。前記第４のｓｃＦｖが前記条件４を満たす場合、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、およびＶ８は、下記（Ｖ１５）または（Ｖ１６）を満たすことが好ましい。下記式（５）において、Ｖ５およびＶ６間のアミノ酸配列が、第１のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｖ６およびＶ７間のアミノ酸配列が、Ｆｖ間リンカーペプチドのアミノ酸配列であり、Ｖ７およびＶ８間のアミノ酸配列が、第２のＦｖリンカーペプチドのアミノ酸配列である。下記式（４）において、第１のＦｖリンカーペプチドおよび第２のＦｖリンカーペプチドは、Ｆｖリンカーペプチド１であるが、それぞれ、独立に、Ｆｖリンカーペプチド２であってもよい。
[Ｖ５]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[Ｖ６]-[SGSG]-[Ｖ７]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[Ｖ８] ・・・（５）
（Ｖ９） Ｖ５：ＶＨ３、Ｖ６：ＶＬ３、Ｖ７：ＶＨ４、Ｖ８：ＶＬ４
（Ｖ１０）Ｖ５：ＶＬ３、Ｖ６：ＶＨ３、Ｖ７：ＶＨ４、Ｖ８：ＶＬ４
（Ｖ１１）Ｖ５：ＶＨ３、Ｖ６：ＶＬ３、Ｖ７：ＶＬ４、Ｖ８：ＶＨ４
（Ｖ１２）Ｖ５：ＶＬ３、Ｖ６：ＶＨ３、Ｖ７：ＶＬ４、Ｖ８：ＶＨ４
（Ｖ１３）Ｖ５：ＶＨ４、Ｖ６：ＶＬ４、Ｖ７：ＶＨ３、Ｖ８：ＶＬ３
（Ｖ１４）Ｖ５：ＶＨ４、Ｖ６：ＶＬ４、Ｖ７：ＶＬ３、Ｖ８：ＶＨ３
（Ｖ１５）Ｖ５：ＶＬ４、Ｖ６：ＶＨ４、Ｖ７：ＶＨ３、Ｖ８：ＶＬ３
（Ｖ１６）Ｖ５：ＶＬ４、Ｖ６：ＶＨ４、Ｖ７：ＶＬ３、Ｖ８：ＶＨ３
ＶＨ３：第３の重鎖可変領域
ＶＬ３：第３の軽鎖可変領域
ＶＨ４：第４の重鎖可変領域
ＶＬ４：第４の軽鎖可変領域
前記第２のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、下記式（６）（配列番号１６１）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。下記式（６）において、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、およびＮ８は、例えば、下記（Ｎ９）〜（Ｎ１６）の組合せがあげられる。下記（Ｎ９）〜（Ｎ１６）は、それぞれ、前記（Ｖ９）〜（Ｖ１６）の組合せの第２のＢｓＡｂをコードする核酸である。下記式（６）において、Ｎ５およびＮ６間の塩基配列が、第１のＦｖリンカーペプチドをコードする塩基配列であり、Ｎ６およびＮ７間の塩基配列が、Ｆｖ間リンカーペプチドをコードする塩基配列であり、Ｎ７およびＮ８間の塩基配列が、第２のＦｖリンカーペプチドをコードする塩基配列である。下記式（６）において、第１のＦｖリンカーペプチドおよび第２のＦｖリンカーペプチドをコードする塩基配列は、Ｆｖリンカーペプチド１をコードする塩基配列であるが、それぞれ、独立に、Ｆｖリンカーペプチド２をコードする塩基配列であってもよい。
5'-[Ｎ５]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[Ｎ６]-[AGCGGATCTGGC]-[Ｎ７]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[Ｎ８]-3’・・・（６）
（Ｎ９） Ｎ５：ＮＨ３、Ｎ６：ＮＬ３、Ｎ７：ＮＨ４、Ｎ８：ＮＬ４
（Ｎ１０）Ｎ５：ＮＬ３、Ｎ６：ＮＨ３、Ｎ７：ＮＨ４、Ｎ８：ＮＬ４
（Ｎ１１）Ｎ５：ＮＨ３、Ｎ６：ＮＬ３、Ｎ７：ＮＬ４、Ｎ８：ＮＨ４
（Ｎ１２）Ｎ５：ＮＬ３、Ｎ６：ＮＨ３、Ｎ７：ＮＬ４、Ｎ８：ＮＨ４
（Ｎ１３）Ｎ５：ＮＨ４、Ｎ６：ＮＬ４、Ｎ７：ＮＨ３、Ｎ８：ＮＬ３
（Ｎ１４）Ｎ５：ＮＨ４、Ｎ６：ＮＬ４、Ｎ７：ＮＬ３、Ｎ８：ＮＨ３
（Ｎ１５）Ｎ５：ＮＬ４、Ｎ６：ＮＨ４、Ｎ７：ＮＨ３、Ｎ８：ＮＬ３
（Ｎ１６）Ｎ５：ＮＬ４、Ｎ６：ＮＨ４、Ｎ７：ＮＬ３、Ｎ８：ＮＨ３
ＮＨ３：第３の重鎖可変領域をコードする塩基配列
ＮＬ３：第３の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
ＮＨ４：第４の重鎖可変領域をコードする塩基配列
ＮＬ４：第４の軽鎖可変領域をコードする塩基配列
前記第２のＢｓＡｂライブラリは、例えば、複数種類の核酸を含むことが好ましい。この場合、前記第２のＢｓＡｂライブラリは、例えば、複数種類の核酸の混合物である。前記複数種類の核酸は、例えば、その一部または全部が、異なる第２のＢｓＡｂをコードしていることが好ましく、異なる第４の抗原結合ドメインをコードしていることが好ましい。複数種類の核酸が異なる第４の抗原結合ドメインをコードしている場合、前記第２のＢｓＡｂにおける第４の抗原結合ドメイン以外の領域は、例えば、同じまたは異なるアミノ酸配列である。前記２のＢｓＡｂライブラリに含まれる前記核酸の種類は、例えば、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類であり、好ましくは、約１×１０６種類（例えば、８×１０５〜２×１０６種類）である。
前記第２のＢｓＡｂは、例えば、Ｎ末端にシグナルペプチドを有してもよい。前記第２のＢｓＡｂは、例えば、タグを有してもよい。前記シグナルペプチドおよびタグは、例えば、前記第１のＢｓＡｂにおけるシグナルペプチドおよびタグの説明において、「第１のＢｓＡｂ」を「第２のＢｓＡｂ」に読み替えて、その説明を援用できる。
本発明において、前記第２のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、前記第２のＢｓＡｂのアミノ酸配列に基づき、常法により調製できる。具体例として、前記第２のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、前述の各ドメインのアミノ酸配列が登録されたデータベースにおいて、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、前記塩基配列に基づき、分子生物学的手法および／または化学的合成方法により調製できる。前記核酸の塩基配列は、例えば、前記第２のＢｓＡｂライブラリを発現させる細胞の由来に応じて、コドン最適化してもよい。
前記第２のＢｓＡｂをコードする核酸は、例えば、発現ベクターに導入されてもよい。前記発現ベクターは、例えば、前記本発明のＢｓＡｂライブラリにおける発現ベクターの説明を援用できる。
つぎに、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、前記第１のＢｓＡｂライブラリに代えて、前記調製工程において調製された第２のＢｓＡｂライブラリを用いる以外は、同様にして、準備工程、接触工程、および選抜工程を実施する。具体的には、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、さらに、前記第２のＢｓＡｂライブラリから第２のＢｓＡｂを準備する第２の準備工程と、前記第２のＢｓＡｂと、前記標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能免疫細胞とを接触させる第２の接触工程と、前記第２の接触工程において、前記第２の標的抗原と結合した第２のＢｓＡｂの第４のｓｃＦｖを、前記第２の標的抗原に結合する第２の候補ｓｃＦｖとして選抜する第２の選抜工程とを含む。また、前記第２のＢｓＡｂの第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２の接触工程では、例えば、前記第２のＢｓＡｂと、前記第２の標的抗原と、前記免疫細胞とを接触させる。他方、前記第２のＢｓＡｂの第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、前記第２の接触工程では、例えば、前記第２のＢｓＡｂと、前記第１の標的抗原と、前記免疫細胞とを接触させる。
前記第２の準備工程は、例えば、前記第１の準備工程の説明において、「第１の準備工程」を「第２の準備工程」に、「第１のＢｓＡｂライブラリ」を「第２のＢｓＡｂライブラリ」に、「第１のＢｓＡｂ」を「第２のＢｓＡｂ」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第２の接触工程は、例えば、前記第１の接触工程の説明において、「第１の準備工程」を「第２の準備工程」に、「第１の接触工程」を「第２の接触工程」に読み替えてその説明を援用できる。
前記第２の選抜工程は、例えば、前記第１の選抜工程の説明において、「第１の接触工程」を「第２の接触工程」に、「第１の選抜工程」を「第２の選抜工程」に、「第２のｓｃＦｖ」を「第４のｓｃＦｖ」に、「第１の候補ｓｃＦｖ」を「第２の候補ｓｃＦｖ」に、「第１のＢｓＡｂ」を「第２のＢｓＡｂ」に読み替えてその説明を援用できる。
これにより、本発明の第２のスクリーニング方法は、例えば、前記第２の標的抗原に結合する新たな重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するｓｃＦｖをスクリーニングできる。
＜第３のｓｃＦｖの製造方法＞
本発明のｓｃＦｖの製造方法は、前述のように、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライブラリの発現細胞を動物に投与する第１の投与工程と、
前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する第１の採取工程とを含み、
前記第１のＣＡＲライブラリは、第１のＣＡＲをコードする核酸を含み、
前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす。
（条件１）
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（条件２）
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を動物に投与する第１の投与工程と、前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する第１の採取工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記本発明のＣＡＲライブラリ、第１のスクリーニング方法、およびＣＡＲライブラリ細胞の説明を援用できる。
ＣＡＲライブラリ発現細胞において、前記標的抗原に結合するｓｃＦｖを有するＣＡＲを発現している細胞は、前記動物内において、前記標的抗原依存的に活性化する。そして、活性化されたＣＡＲライブラリ発現細胞は、前記動物において、前記標的抗原を発現する部位に移動し、集積する。このため、本発明の製造方法は、前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取することで、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能しうり、さらに、例えば、局所浸潤にも関与しうるｓｃＦｖを製造できる。また、前記細胞は、前記標的抗原依存的に活性化するため、前記標的抗原が発現する組織に集積するＣＡＲライブラリ発現細胞におけるｓｃＦｖは、前記標的抗原を認識する可能性が高いといえる。したがって、本発明の製造方法は、例えば、前記標的抗原に結合し、Ｔ細胞等の免疫細胞を活性化しうるｓｃＦｖを製造できるといえる。
さらに、本発明の製造方法で用いる第１のＣＡＲライブラリにおいて、前記第１のＣＡＲは、前記第１の抗原結合ドメインと、前記第１の膜貫通ドメインと、前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むタンパク質である。前記第１のＣＡＲは、例えば、抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに類似した構造を有し、前記抗原に結合する細胞外ドメインが、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第１の抗原結合ドメインに変更されている。このため、本発明の製造方法によれば、前記標的抗原に結合し、Ｔ細胞等の免疫細胞を活性化しうる新たなｓｃＦｖをスクリーニングできる。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法において、前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞（以下、「第１の発現細胞」ともいう）は、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸を含む第１のＣＡＲライブラリを、細胞に導入することにより調製できる。このため、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第１の投与工程に先立ち、前記第１のＣＡＲライブラリを準備する第１の準備工程を含んでもよい。また、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第１の投与工程に先立ち、前記第１のＣＡＲライブラリを細胞に導入し、前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を調製する第１の調製工程を含んでもよい。
前記第１の準備工程は、前記第１のＣＡＲライブラリを準備する。前記第１のＣＡＲライブラリは、前述のように、第１のＣＡＲをコードする核酸を含む。前記第１のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、第１のＣＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味する。前記第１のＣＡＲライブラリは、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける第１のＣＡＲライブラリと同様であり、その説明を援用できる。
前記第１のｓｃＦｖにおいて、前記標的抗原は、例えば、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける説明を援用できる。
前記第１の調製工程では、前記第１のＣＡＲライブラリを細胞に導入し、前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を調製する。具体的には、前記第１の調製工程では、例えば、前記細胞に、前記第１のＣＡＲライブラリを導入する。そして、前記第１の調製工程では、例えば、前記第１のＣＡＲライブラリが導入された細胞を培養することにより、前記細胞に前記第１のＣＡＲライブラリを発現させる。前記第１のＣＡＲライブラリの導入方法は、特に制限されず、例えば、公知の核酸の細胞への導入方法を利用できる。具体例として、前記第１のＣＡＲライブラリの導入方法は、例えば、リポソーム、カチオニックリピッド等の核酸導入試薬を用いる方法、レトロウイルス、レンチウイルス等のウイルスを用いる方法等があげられる。前記細胞の培養期間は、特に制限されず、例えば、６時間〜３０日、６〜９６時間、１〜３０日である。前記細胞の培養温度は、例えば、２８〜３７℃である。
前記第１のＣＡＲライブラリは、例えば、前記第１のＣＡＲをコードする核酸でもよいし、前記第１のＣＡＲをコードする核酸が導入された発現ベクターでもよい。
前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等の哺乳類由来の培養細胞、免疫細胞等があげられる。前記免疫細胞は、特に制限されず、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、生体から単離された免疫細胞、多能性幹細胞等の幹細胞から誘導された免疫細胞または免疫細胞由来の培養細胞があげられる。前記単離された免疫細胞は、例えば、免疫細胞様の培養細胞でもよく、具体例として、Ｔ細胞様の培養細胞、ＮＫ細胞様の培養細胞、ＮＫＴ細胞様の培養細胞、Ｂ細胞様の培養細胞等があげられる。前記免疫細胞は、例えば、生体から単離された免疫細胞であり、具体例として、ヒト末梢血由来の免疫細胞があげられる。前記Ｔ細胞様の培養細胞は、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞等があげられる。前記細胞は、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能する可能性がより高いｓｃＦｖをスクリーニングできることから、Ｔ細胞またはＴ細胞様の培養細胞が好ましい。
つぎに、前記第１の投与工程では、前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を動物に投与する。前記第１の投与工程では、複数種類の第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を投与することが好ましい。この場合、前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞は、例えば、複数種類の発現細胞の混合物である。前記複数種類の発現細胞は、例えば、その一部または全部が、異なる第１のＣＡＲをコードしていることが好ましく、異なる第１の抗原結合ドメインをコードしていることが好ましい。複数種類の発現細胞が異なる第１の抗原結合ドメインをコードしている場合、前記第１のＣＡＲにおける第１の抗原結合ドメイン以外の領域は、例えば、同じまたは異なるアミノ酸配列である。前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞の種類は、例えば、前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞に含まれる前記第１のＣＡＲの種類ともいえる。前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞に含まれる前記第１のＣＡＲの種類は、例えば、１×１０５〜１×１０７種類、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類であり、好ましくは、約２×１０６種類（例えば、１×１０６〜３×１０６種類）である。前記第１のＣＡＲの種類は、例えば、１×１０６細胞あたりの種類である。前記第１のＣＡＲの種類は、例えば、第１のＣＡＲをコードする核酸の不均一性（heterogeneity）ということもできる。前記不均一性は、前述のように、例えば、制限酵素マッピング、各ＣＤＲおよび／または各ＦＲＨについてサンガー法等のシークエンス等で測定できる。
前記第１の発現細胞の投与条件は、特に制限されず、例えば、前記標的抗原の種類および量、ならびに前記動物における標的抗原の発現位置に応じて、投与形態、投与方法、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
前記動物（投与対象）は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類等があげられる。
前記動物は、免疫抑制動物であることが好ましい。前記動物がマウスの場合、前記免疫抑制マウスは、ヌードマウス、ＳＣＩＤ（Severe combined immunodeficiency）マウス、ＮＯＧ（NOD/Shi-scid,IL-2RγKO）マウス等があげられる。
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与方法は、例えば、非経口投与、経口投与等があげられる。前記非経口投与は、例えば、局所投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、リンパ管内投与、腫瘍内投与等があげられる。前記投与方法は、好ましくは、静脈内投与またはリンパ管内投与である。
前記第１の発現細胞の投与条件は、特に制限されない。前記投与方法が静脈内投与の場合、前記第第１の発現細胞の投与条件は、例えば、マウスに対する１回あたりの投与量（合計）は、例えば、１×１０６〜３×１０１０細胞であり、好ましくは、１×１０６〜１×１０８細胞、１×１０６〜１×１０７細胞、または約５×１０６細胞である。前記第１の発現細胞の投与回数は、例えば、１週間〜４週間に１回である。
前記動物は、例えば、前記標的抗原を内在性に発現してもよいし、外因性に発現してもよい。後者の場合、前記動物は、例えば、前記標的抗原をコードする核酸または発現ベクターを導入することにより発現させてもよいし、前記標的抗原を発現する細胞を導入することにより発現させてもよい。
前記標的抗原を発現する細胞を導入する場合、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第１の投与工程に先立ち、標的抗原を発現する細胞を前記動物に導入し、前記標的抗原を発現する組織を形成させる第１の形成工程を含んでもよい。前記導入される細胞は、例えば、標的抗原を発現する細胞でもよいし、分化後または特定の条件で標的抗原を発現する細胞でもよい。前記特定の条件で標的抗原を発現する細胞は、例えば、ドキシサイクリン等の誘導物質処理により標的抗原の発現が誘導される細胞等があげられる。導入された細胞により形成される組織の種類は、特に制限されず、前記標的抗原に応じて、適宜設定できる。前記組織は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。後者の場合、導入された細胞により、臓器が形成されてもよい。具体例として、前記標的抗原が腫瘍抗原の場合、前記第１の形成工程では、前記標的抗原を発現する腫瘍細胞を前記動物に、前記標的抗原を発現する腫瘍組織を形成させる。本発明において、前記「組織」は、例えば、細胞の集合体を意味する。前記集合体内の細胞の種類は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第１の投与工程後、前記標的抗原を前記動物に投与する第１の刺激工程を含む。本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第１の刺激工程を含むことで、前記第１の発現細胞において、標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞をプライミングでき、これにより、標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞をより効率よく前記標的抗原を発現する組織に集積させることができる。前記第１の刺激工程は、例えば、前記第１の投与工程後、後述の第１の採取工程に実施する。
前記第１の刺激工程は、例えば、前記標的抗原を用いた動物免疫と同様の方法で実施できる。具体的には、前記第１の刺激工程では、前記標的抗原、前記標的抗原をコードする核酸分子、または前記標的抗原を発現する細胞を前記動物に投与することにより、実施できる。前記標的抗原の投与においては、例えば、免疫賦活剤（アジュバント）を併用してもよい。
つぎに、前記第１の採取工程では、前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する。前記第１の採取工程では、組織に集積した前記第１の発現細胞を回収してもよいし、前記第１の発現細胞が集積した組織を採取し、前記組織から前記第１の発現細胞を回収してもよい。前記組織は、前述のように、１種類でもよい、２種類以上でもよい。後者の場合、前記第１の採取工程では、２種類以上の組織に集積した前記第１の発現細胞を回収することが好ましい。この場合、前記第１の採取工程では、前記第１の発現細胞が集積した２種類以上の組織を採取し、前記２種類以上の組織から前記第１の発現細胞を回収してもよい。前記第１の採取工程において、前記組織を採取する場合、前記組織の一部または全部を採取する。前記第１の採取工程では、前記第１の発現細胞の採取に先立ち、前記組織に前記第１の発現細胞が集積しているかを確認してもよい。前記確認は、例えば、２光子励起顕微鏡等のライブイメージングが可能な顕微鏡を用いて実施できる。また、前記確認を実施する場合、前記第１の発現細胞は、ＳＬＲ等のルシフェラーゼを発現させることが好ましい。また、前記確認を実施する場合、前記第１の発現細胞は、例えば、前記確認に先立ち、蛍光タンパク質等の標識物質により標識してもよい。
前記第１の採取工程は、前記第１の投与工程後、任意の期間後に実施してよい。前記第１の投与工程後、前記第１の採取工程までの期間は、例えば、８時間〜１ヶ月、１日〜２週間、１日〜１週間があげられる。前記第１の刺激工程後に、前記第１の採取工程を実施する場合、前記第１の投与工程後、前記第１の採取工程までの期間は、例えば、前記標的抗原特異的ＣＡＲを発現する細胞が活性化および集積する迄の時間であり、具体例として、１日〜２週間、１日〜１週間があげられる。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第１の採取工程後、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を、前記標的抗原で再刺激する第１の再刺激工程を含むことが好ましい。これにより、前記第１の再刺激工程では、前記標的抗原を発現する組織に集積した第１のＣＡＲライブラリ発現細胞において、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を増殖させることができる。このため、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第１の再刺激工程を含むことにより、例えば、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を富化でき、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞における第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列を容易に決定できる。
前記第１の再刺激工程において、前記標的抗原による再刺激の方法は、特に制限されず、例えば、前記組織から採取された第１のＣＡＲライブラリ発現細胞と、前記標的抗原とを共存させることにより実施できる。前記標的抗原は、例えば、前記共存下において、単体で存在してもよいし、二量体、三量体等の多量体として存在してもよいし、細胞として存在してもよい。前記標的抗原が細胞として存在する場合、前記細胞は、前記標的抗原を発現する細胞である。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第１の採取工程で採取された第１の発現細胞における第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定する第１の配列決定工程を含んでもよい。前記第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、例えば、前記第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を決定することにより実施できる。具体的には、前記第１の配列決定工程では、前記第１の採取工程で採取された第１の発現細胞から核酸を抽出し、前記核酸における前記第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を増幅し、前記塩基配列を決定することにより実施できる。これにより、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第１のＢ細胞受容体由来の第１の重鎖可変領域または第１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定できる。
前記第１の配列決定工程では、例えば、さらに、前記第１の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、前記第１の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とを特定してもよい。各ＣＤＲの特定は、例えば、ゲノム情報（例えば、ＩＭＧＴのホームページ<http://www.imgt.org/>）を参照し、公知の方法により実施できる。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第１の採取工程で採取された第１の発現細胞における第１のＢ細胞受容体由来の第１の重鎖可変領域または第１の軽鎖可変領域を、それぞれ、前記第１のＣＡＲライブラリにおける標的抗原に結合する抗原等における重鎖可変領域または軽鎖可変領域として、他方の領域のスクリーニングを実施してもよい。すなわち、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた第１のｓｃＦｖ（前記第１の採取工程で採取された第１の発現細胞における第１のｓｃＦｖ）において新たに同定された第１の重鎖可変領域または第１の軽鎖可変領域を用いて、他方の領域のスクリーニングを実施してもよい。この場合、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、さらに、前記第１の採取工程で採取された第１の発現細胞における第１のＢ細胞受容体由来の第１の重鎖可変領域または第１の軽鎖可変領域に基づき、第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を調製し、前記第１の投与工程および第１の採取工程と同様の工程を実施してもよい。この場合、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、第２のＣＡＲライブラリの発現細胞を動物に投与する第２の投与工程と、前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する第２の採取工程とを含む。
前記第２のＣＡＲライブラリは、例えば、第２のＣＡＲをコードする核酸を含む。また、前記第２のＣＡＲは、例えば、第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。また、前記第２の抗原結合ドメインは、例えば、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含む。
前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、第２のＣＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味する。
前記第２のｓｃＦｖにおいて、前記標的抗原は、前記第１のｓｃＦｖにおける標的抗原と同じである。前記第２のｓｃＦｖは、例えば、前記第１のｓｃＦｖと類似の構造を有する。
前記第２のｓｃＦｖは、例えば、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む。前記第２の重鎖可変領域は、例えば、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、下記条件３または条件４を満たす。
（条件３）
前記第１のＣＡＲライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞のｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
（条件４）
前記第１のＣＡＲライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞のｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法において、前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞（以下、「第２の発現細胞」ともいう）は、例えば、前記第２のＣＡＲをコードする核酸を含む第２のＣＡＲライブラリを、細胞に導入することにより調製できる。このため、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第２の投与工程に先立ち、前記第２のＣＡＲライブラリを準備する第２の準備工程を含んでもよい。また、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第２の投与工程に先立ち、前記第２のＣＡＲライブラリを細胞に導入し、前記第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を調製する第２の調製工程を含んでもよい。
前記第２の準備工程は、前記第２のＣＡＲライブラリを準備する。前記第２のＣＡＲライブラリは、前述のように、第２のＣＡＲをコードする核酸を含む。前記第２のＣＡＲをコードする核酸は、例えば、第２のＣＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を意味する。前記第２のＣＡＲライブラリは、前記本発明のＣＡＲライブラリにおける第２のＣＡＲライブラリと同様であり、その説明を援用できる。
前述のように、前記第２の重鎖可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する。前記第２の軽鎖可変領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する。また、前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、前記条件３または条件４を満たす。
前記条件３は、例えば、前記条件１を満たす第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた第１の軽鎖可変領域を用いて、第２のＣＡＲライブラリを調製する場合である。前記条件３では、例えば、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、前記第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた第１の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を用い、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３について、前記標的抗原への結合をスクリーニングする。
つぎに、前記条件４は、例えば、前記条件２を満たす第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた重鎖可変領域を用いて、第２のＣＡＲライブラリを調製する場合である。前記条件４では、例えば、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、前記第１のＣＡＲライブラリを用いてスクリーニングされた重鎖可変領域を用い、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３について、前記標的抗原への結合をスクリーニングする。
つぎに、前記第２の調製工程では、前記第２のＣＡＲライブラリを細胞に導入し、前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞を調製する。具体的には、前記第２の調製工程では、例えば、前記細胞に、前記第２のＣＡＲライブラリを導入する。そして、前記第２の調製工程では、例えば、前記第２のＣＡＲライブラリが導入された細胞を培養することにより、前記細胞に前記第２のＣＡＲライブラリを発現させる。前記第２のＣＡＲライブラリの導入方法は、例えば、前記第１のＣＡＲライブラリの導入方法の説明を援用できる。
前記第２のＣＡＲライブラリは、例えば、前記第２のＣＡＲをコードする核酸でもよいし、前記第２のＣＡＲをコードする核酸が導入された発現ベクターでもよい。
前記細胞は、特に制限されず、例えば、前記第１のＣＡＲライブラリにおける導入対象の細胞の説明を援用できる。
つぎに、前記第２の投与工程では、前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞を動物に投与する。前記第２の投与工程では、複数種類の第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を投与することが好ましい。この場合、前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞は、例えば、複数種類の発現細胞の混合物である。前記複数種類の発現細胞は、例えば、その一部または全部が、異なる第２のＣＡＲをコードしていることが好ましく、異なる第２の抗原結合ドメインをコードしていることが好ましい。複数種類の発現細胞が異なる第２の抗原結合ドメインをコードしている場合、前記第２のＣＡＲにおける第２の抗原結合ドメイン以外の領域は、例えば、同じまたは異なるアミノ酸配列である。前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞の種類は、例えば、前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞に含まれる前記第２のＣＡＲの種類ともいえる。前記第２のＣＡＲライブラリの発現細胞に含まれる前記第２のＣＡＲの種類は、例えば、１×１０５〜１×１０７種類、１×１０５〜１×１０６種類、１×１０６〜５×１０６種類であり、好ましくは、約２×１０６種類（例えば、１×１０６〜３×１０６種類）である。前記第２のＣＡＲの種類は、例えば、第２のＣＡＲをコードする核酸の不均一性（heterogeneity）ということもできる。前記不均一性は、前述のように、例えば、制限酵素マッピング、各ＣＤＲおよび／または各ＦＲＨについてサンガー法等のシークエンス等で測定できる。
前記第２の発現細胞の投与条件は、特に制限されず、例えば、前記第２の発現細胞の投与条件の説明を援用できる。
前記第２の投与工程において、前記動物は、例えば、前記標的抗原を内在性に発現してもよいし、外因性に発現してもよい。後者の場合、前記動物は、例えば、前記標的抗原をコードする核酸または発現ベクターを導入することにより発現させてもよいし、前記標的抗原を発現する細胞を導入することにより発現させてもよい。
前記標的抗原を発現する細胞を導入する場合、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第２の投与工程に先立ち、標的抗原を発現する細胞を前記動物に導入し、前記標的抗原を発現する組織を形成させる第２の形成工程を含んでもよい。前記導入される細胞は、例えば、標的抗原を発現する細胞でもよいし、分化後または特定の条件で標的抗原を発現する細胞でもよい。前記特定の条件で標的抗原を発現する細胞は、例えば、ドキシサイクリン等の誘導物質処理により標的抗原の発現が誘導される細胞等があげられる。導入された細胞により形成される組織の種類は、特に制限されず、前記標的抗原に応じて、適宜設定できる。前記組織は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。後者の場合、導入された細胞により、臓器が形成されてもよい。具体例として、前記標的抗原が腫瘍抗原の場合、前記第２の形成工程では、前記標的抗原を発現する腫瘍細胞を前記動物に、前記標的抗原を発現する腫瘍組織を形成させる。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第２の投与工程後、前記標的抗原を前記動物に投与する第２の刺激工程を含む。本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第２の刺激工程を含むことで、前記第２の発現細胞において、標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞をプライミングでき、これにより、標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞をより効率よく前記標的抗原を発現する組織に集積させることができる。前記第２の刺激工程は、例えば、前記第２の投与工程後、後述の第２の採取工程に実施する。
前記第２の刺激工程は、例えば、前記標的抗原を用いた動物免疫と同様の方法で実施できる。具体的には、前記第２の刺激工程では、前記標的抗原、前記標的抗原をコードする核酸分子、または前記標的抗原を発現する細胞を前記動物に投与することにより、実施できる。前記標的抗原の投与においては、例えば、免疫賦活剤（アジュバント）を併用してもよい。
つぎに、前記第２の採取工程では、前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する。前記第２の採取工程では、組織に集積した前記第２の発現細胞を回収してもよいし、前記第２の発現細胞が集積した組織を採取し、前記組織から前記第２の発現細胞を回収してもよい。前記組織は、前述のように、１種類でもよい、２種類以上でもよい。後者の場合、前記第２の採取工程では、２種類以上の組織に集積した前記第２の発現細胞を回収することが好ましい。この場合、前記第２の採取工程では、前記第２の発現細胞が集積した２種類以上の組織を採取し、前記２種類以上の組織から前記第２の発現細胞を回収してもよい。前記第２の採取工程において、前記組織を採取する場合、前記組織の一部または全部を採取する。前記第２の採取工程では、前記第２の発現細胞の採取に先立ち、前記組織に前記第２の発現細胞が集積しているかを確認してもよい。前記確認は、例えば、２光子励起顕微鏡等のライブイメージングか可能な顕微鏡を用いて実施できる。また、前記確認を実施する場合、前記第１の発現細胞は、ＳＬＲ等のルシフェラーゼを発現させることが好ましい。また、前記確認を実施する場合、前記第１の発現細胞は、例えば、前記確認に先立ち、蛍光タンパク質等の標識物質により標識してもよい。
前記第２の採取工程は、前記第２の投与工程後、任意の期間後に実施してよい。前記第２の投与工程後、前記第２の採取工程までの期間は、例えば、８時間〜１ヶ月、１日〜２週間、１日〜１週間があげられる。前記第２の刺激工程後に、前記第２の採取工程を実施する場合、前記第２の投与工程後、前記第２の採取工程までの期間は、例えば、前記標的抗原特異的ＣＡＲを発現する細胞が活性化および集積する迄の時間であり、具体例として、１日〜２週間、１日〜１週間があげられる。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第２の採取工程後、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を、前記標的抗原で再刺激する第２の再刺激工程を含むことが好ましい。これにより、前記第２の再刺激工程では、前記標的抗原を発現する組織に集積した第２のＣＡＲライブラリ発現細胞において、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を増殖させることができる。このため、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、前記第２の再刺激工程を含むことにより、例えば、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を富化でき、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞における第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列を容易に決定できる。
前記第２の再刺激工程において、前記標的抗原による再刺激の方法は、特に制限されず、例えば、前記第１の再刺激工程の説明において、「第１のＣＡＲライブラリ」を「第２のＣＡＲライブラリ」に読み替えて、その説明を援用できる。
本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第２の採取工程で採取された第２の発現細胞における第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定する第２の配列決定工程を含んでもよい。前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、例えば、前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を決定することにより実施できる。具体的には、前記第２の配列決定工程では、前記第２の採取工程で採取された第２の発現細胞から核酸を抽出し、前記核酸における前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を増幅し、前記塩基配列を決定することにより実施できる。これにより、本発明の第３のｓｃＦｖの製造方法は、例えば、前記第２のＢ細胞受容体由来の第２の重鎖可変領域または第２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定できる。
前記第２の配列決定工程では、例えば、さらに、前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と、前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３とを特定してもよい。各ＣＤＲの特定は、例えば、ゲノム情報（例えば、ＩＭＧＴのホームページ<http://www.imgt.org/>）を参照し、公知の方法により実施できる。
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、A2/NY-ESO-1157に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることを確認した。
（１）3M4E5 CARの調製
3M4E5 CARは、A2/NY-ESO-1157特異的抗体（clone：３Ｍ４Ｅ５）を用いて調製した。具体的には、３Ｍ４Ｅ５の免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域をコードする核酸（配列番号１６２）および３Ｍ４Ｅ５の免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域をコードする核酸（配列番号１６３）を、Ｆｖリンカーペプチド（GSTSGSGKPGSGEGSTKG：配列番号１）をコードする核酸（配列番号３）で連結することにより、3M4E5 scFv（をコードする核酸を調製した。３Ｍ４Ｅ５の重鎖可変領域、Ｆｖリンカーペプチド、および３Ｍ４Ｅ５の軽鎖可変領域をこの順番で連結したｓｃＦｖを、3M4E5HL scFvという。また、３Ｍ４Ｅ５の軽鎖可変領域、Ｆｖリンカーペプチド、および３Ｍ４Ｅ５の重鎖可変領域をこの順番で連結したｓｃＦｖを、3M4E5LH scFvという。
３Ｍ４Ｅ５の免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域をコードする核酸（配列番号１６２）
5’-GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCA-3'
３Ｍ４Ｅ５の免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域をコードする核酸（配列番号１６３）
5’-CAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTG-3'
3M4E5HL scFv（配列番号１６４）
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
3M4E5HL scFvをコードする核酸（配列番号１６５）
5’-GAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTG-3’
3M4E5LH scFv（配列番号１６６）
QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
3M4E5LH scFvをコードする核酸（配列番号１６７）
5’-CAGAGCGAGCTGACACAGCCTAGATCCGTGTCTGGCAGCCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGAGATGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATCATCCACGACGTGATCGAGCGGAGCAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATCAGCGGACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTTGGAGCTTCGCCGGCAGCTACTACGTGTTCGGCACCGGCACCGATGTGACCGTGCTGGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCA-3’
つぎに、3M4E5HL scFvおよび3M4E5LH scFvをコードする核酸の３’端に、それぞれ、ヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１６８）をコードする核酸（配列番号１６９）と、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸とを、５’端側からこの順番に配置されるように連結した。これにより、3M4E5HL scFvを含む3M4E5HL CARをコードする核酸および3M4E5LH scFvを含む3M4E5LH CARをコードする核酸を調製した。なお、ヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸と、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸とは、GeneArt（商標）（Thermo Fisher Scientific社）人工遺伝子合成サービスを利用し、取得した。また、ヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸の５’端には、NotIの制限酵素サイトを付加したものを使用した。
ヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１６８）
AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸（配列番号１６９）
5’-GCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT-3’
ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号１７０）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸（配列番号１７１）
5’-CGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3’
さらに、3M4E5HL CARをコードする核酸および3M4E5LH CARをコードする核酸の３’末端に、切断型のＮＧＦＲ遺伝子（ΔNGFR）をコードする核酸を、フーリン（furin）切断部位（RAKR：配列番号１７２）、スペーサー配列（SGSG：配列番号１７３）およびコドン最適化Ｐ２Ａ配列（ATNFSLLKQAGDVEENPGP：配列番号１７４）をコードする核酸を介して、連結した。これにより、タグ付加3M4E5HL CARをコードする核酸およびタグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を調製した。各核酸は、ｐＭＸ発現ベクターに導入した。
（２）第１のＣＡＲライブラリの調製
Ｂ細胞精製キット（CD19-positive selection kit、MACS（登録商標）beads、Miltenyi Biotec社製）を用いて、ヒト末梢血単核球から１〜３×１０６細胞のヒト末梢血Ｂ細胞を精製した。得られたＣＤ１９＋Ｂ細胞を回収後、ｃＤＮＡ合成キット（SMARTer（商標）RACE cDNA amplification kit、Takara Bio社製）を用いて、ＲＮＡを抽出し、さらに、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡと、5’-RACEプライマー、3’IGHCプライマーおよび3’IGHMプライマーの混合物とを用い、ＰＣＲにより、免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域および定常領域の一部を含むタンパク質をコードする核酸を増幅した。前記3’IGHCプライマーは、ヒトＩｇＧのＣＨ１領域にハイブリダイズする。また、3’IGHMプライマーは、ヒトＩｇＭのＣＨ１領域にハイブリダイズする。
5’-RACEプライマー（配列番号１７５）
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
3’IGHCプライマー（配列番号１７６）
5’-TGAGTTCCACGACACCGTCAC-3’
3’IGHMプライマー（配列番号１７７）
5’-TCCAGGACAAAGTGATGGAGTC-3’
つぎに、１回目のＰＣＲ産物と、改変5’-RACEプライマー、3’IGHJ1プライマー、3’IGHJ2プライマーおよび3’IGHJ3プライマーの混合物とを用い、semi-nested ＰＣＲを実施し、重鎖可変領域をコードする核酸を増幅した。これにより、ヒト末梢血Ｂ細胞由来の重鎖可変領域をコードする核酸のライブラリを調製した。前記3’IGHJ1プライマー、3’IGHJ2プライマーおよび3’IGHJ3プライマーは、重鎖のＪ領域（Ｊ遺伝子断片）にハイブリダイズする。
改変5’-RACEプライマー（配列番号１７８）
5’-GTGTGGTGGTACGGGAATTCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
3’IGHJ1プライマー（配列番号１７９）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGG-3’
3’IGHJ2プライマー（配列番号１８０）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGTC-3’
3’IGHJ3プライマー（配列番号１８１）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC-3’
つぎに、１回目のＰＣＲにおいて、3’IGHCプライマーおよび3’IGHMプライマーに代えて、3’IGKCプライマーおよび3’IGLCプライマーを用い、２回目のsemi-nested ＰＣＲにおいて、3’IGHJ1プライマー、3’IGHJ2プライマーおよび3’IGHJ3プライマーに代えて、3’IGKJ1プライマー、3’IGKJ2プライマー、3’IGKJ3プライマー、3’IGKJ4プライマー、3’IGLJ1プライマー、3’IGLJ2プライマー、3’IGLJ4プライマー、3’IGLJ5プライマー、および3’IGLJ7プライマーを用いた以外は、前記重鎖可変領域をコードする核酸の増幅と同様にして、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域をコードする核酸を増幅した。これにより、ヒト末梢血Ｂ細胞由来の軽鎖可変領域をコードする核酸のライブラリを調製した。3’IGKCプライマーおよび3’IGLCプライマーは、それぞれ、κ鎖およびλ鎖のＣＨ１領域にハイブリダイズする。また、3’IGKJ1プライマー、3’IGKJ2プライマー、3’IGKJ3プライマー、3’IGKJ4プライマー、3’IGLJ1プライマー、3’IGLJ2プライマー、3’IGLJ4プライマー、3’IGLJ5プライマー、および3’IGLJ7プライマーは、それぞれ、軽鎖のＪ領域（Ｊ遺伝子断片）にハイブリダイズする。
3’IGKCプライマー（配列番号１８２）
5’-AGGGTCAGAGGCCAAAGGATGG-3’
3’IGLCプライマー（配列番号１８３）
5’-CTTGGAGCTCCTCAGAGGAG-3’
3’IGKJ1プライマー（配列番号１８４）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’
3’IGKJ2プライマー（配列番号１８５）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’
3’IGKJ3プライマー（配列番号１８６）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’
3’IGKJ4プライマー（配列番号１８７）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’
3’IGLJ1プライマー（配列番号１８８）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’
3’IGLJ2プライマー（配列番号１８９）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’
3’IGLJ4プライマー（配列番号１９０）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAAAATGATCAGCTGGGTTCC-3’
3’IGLJ5プライマー（配列番号１９１）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTCAGCTCGGTCCC-3’
3’IGLJ7プライマー（配列番号１９２）
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3’
前記（１）の3M4E5HL scFvをコードする核酸の５’側の重鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血Ｂ細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hH-3M4E4L scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5HL scFvをコードする核酸に代えて、hH-3M4E4L scFvライブラリを用いた以外は、前記（１）と同様にして、タグが付加されたhH-3M4E4L CARライブラリを調製した。タグが付加されたhH-3M4E4L CARライブラリを、ｐＭＸ発現ベクターに導入し、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hH-3M4E4L CARライブラリにおける重鎖可変領域の不均一性（heterogeneity）は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約１×１０６種類であることを確認した。
（３）第１のＣＡＲライブラリ発現Ｔ細胞（第１の候補ＣＡＲ−Ｔ）の調製
Ｐｌａｔ−Ａ細胞（国立大学法人東京大学医科学研究所 北村俊雄先生より分与）に、トランスフェクション試薬（TransIT293、Takara Bio社製）を用い、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入し、エコトロピックレトロウイルス（Ecotropic retrovirus）を含む培養上清を調製した。前記Ｐｌａｔ−Ａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１０μｇ／ｍＬブラストサイジン含有ＤＭＥＭ培地で維持したものを使用した。つぎに、前記エコトロピックウイルスを含む培養上清を添加することにより、パッケージング細胞であるＰＧ１３細胞にhH-3M4E4L CARライブラリを導入し、hH-3M4E4L CARライブラリを含むGaLV-pseudotypedレトロウイルスを調製した。そして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスをヒト末梢血Ｔ細胞に感染させることにより、ＣＡＲ−Ｔを調製した。ＰＧ１３細胞の培地の組成は、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地とし、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とし、湿潤雰囲気下とした。以下、特に言及しない限り細胞の培養条件は同様とした。
つぎに、健常者からヒト末梢血単核球を単離した。得られたヒト末梢血単核球を、５０ｎｇ／ｍＬ 抗ＣＤ３抗体（clone：OKT3）および１００ＩＵ／ｍＬ ヒトＩＬ−２の存在下、２日間培養した。前記ヒト末梢血単核球の培地の組成は、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０％ヒトＡＢ血清（Sigma社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記培養後、GaLV-pseudotypedレトロウイルスの存在下、１０００×ｇ、３２℃の条件下で１時間遠心することにより、前記レトロウイルスをＴ細胞に感染させ、hH-3M4E4L CARライブラリをＴ細胞に導入した。同様のレトロウイルスの感染およびhH-3M4E4L CARライブラリの導入を、更に５回（合計６回）実施した。得られたＴ細胞について、ＰＥ標識anti-human NGFR mAb (clone：ME20.4）で染色後、フローサイトメーター（Gallios flow cytometer、Beckman Coulter社製）を用いて、Ｔ細胞上のタグの発現を確認することにより、３０％の導入効率で１つのhH-3M4E4L CARが１つのＴ細胞に発現していることを確認した。フローサイトメーターで得られたデータの解析には、解析ソフト（FlowJo Version 7.6.5 software、TreeStar社製）を用いた（以下、同様）。
前記hH-3M4E4 CARライブラリの導入後のＴ細胞を、前記ＰＥ標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、抗ＰＥマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社製）を用いて、hH-3M4E4 CARライブラリが導入されたＴ細胞を精製し、これを第１の候補ＣＡＲ−Ｔとした。
（４）標的抗原の発現細胞の調製
レトロウイルスを用いて、HLA-A*02:01をコードする核酸と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ４０、および４−１ＢＢＬをコードする核酸とを、Ｋ５６２細胞（ＨＬＡおよびＣＤ１９の発現無し、ＡＴＣＣより入手）に導入し、抗原提示細胞（ＡＰＣ、K562/A2）とした。
HLA-A*02:01をコードする核酸（配列番号１９３）
5'-ATGGCCGTCATGGCGCCCCGAACCCTCGTCCTGCTACTCTCGGGGGCTCTGGCCCTGACCCAGACCTGGGCGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTCTTCACATCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGTCCGGAGTATTGGGACGGGGAGACACGGAAAGTGAAGGCCCACTCACAGACTCACCGAGTGGACCTGGGGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGTTCTCACACCGTCCAGAGGATGTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACTGGCGCTTCCTCCGCGGGTACCACCAGTACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAAAGAGGACCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGGACATGGCAGCTCAGACCACCAAGCACAAGTGGGAGGCGGCCCATGTGGCGGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCACGGACGCCCCCAAAACGCATATGACTCACCACGCTGTCTCTGACCATGAAGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGAGCTTCTACCCTGCGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGGGAGGACCAGACCCAGGACACGGAGCTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGACAGGAGCAGAGATACACCTGCCATGTGCAGCATGAGGGTTTGCCCAAGCCCCTCACCCTGAGATGGGAGCCGTCTTCCCAGCCCACCATCCCCATCGTGGGCATCATTGCTGGCCTGGTTCTCTTTGGAGCTGTGATCACTGGAGCTGTGGTCGCTGCTGTGATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGATAGAAAAGGAGGGAGCTACTCTCAGGCTGCAAGCAGTGACAGTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCTCTCACAGCTTGTAAAGTG-3'
ＣＤ８０をコードする核酸（配列番号１９４）
5'-ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTTCCCAAGATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCAAGCAAGAGCATTTTCCTGATAACCTGCTCCCATCCTGGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCTTTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCCCTGTA-3'
ＣＤ８３をコードする核酸（配列番号１９５）
5'-ATGTCGCGCGGCCTCCAGCTTCTGCTCCTGAGCTGCGCCTACAGCCTGGCTCCCGCGACGCCGGAGGTGAAGGTGGCTTGCTCCGAAGATGTGGACTTGCCCTGCACCGCCCCCTGGGATCCGCAGGTTCCCTACACGGTCTCCTGGGTCAAGTTATTGGAGGGTGGTGAAGAGAGGATGGAGACACCCCAGGAAGACCACCTCAGGGGACAGCACTATCATCAGAAGGGGCAAAATGGTTCTTTCGACGCCCCCAATGAAAGGCCCTATTCCCTGAAGATCCGAAACACTACCAGCTGCAACTCGGGGACATACAGGTGCACTCTGCAGGACCCGGATGGGCAGAGAAACCTAAGTGGCAAGGTGATCTTGAGAGTGACAGGATGCCCTGCACAGCGTAAAGAAGAGACTTTTAAGAAATACAGAGCGGAGATTGTCCTGCTGCTGGCTCTGGTTATTTTCTACTTAACACTCATCATTTTCACTTGTAAGTTTGCACGGCTACAGAGTATCTTCCCAGATTTTTCTAAAGCTGGCATGGAACGAGCTTTTCTCCCAGTTACCTCCCCAAATAAGCATTTAGGGCTAGTGACTCCTCACAAGACAGAACTGGTA-3'
ＣＤ４０をコードする核酸（配列番号１９６）
5'-ATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTGCGTCCTCTGGGGCTGCTTGCTGACCGCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAGAAAAACAGTACCTAATAAACAGTCAGTGCTGTTCTTTGTGCCAGCCAGGACAGAAACTGGTGAGTGACTGCACAGAGTTCACTGAAACGGAATGCCTTCCTTGCGGTGAAAGCGAATTCCTAGACACCTGGAACAGAGAGACACACTGCCACCAGCACAAATACTGCGACCCCAACCTAGGGCTTCGGGTCCAGCAGAAGGGCACCTCAGAAACAGACACCATCTGCACCTGTGAAGAAGGCTGGCACTGTACGAGTGAGGCCTGTGAGAGCTGTGTCCTGCACCGCTCATGCTCGCCCGGCTTTGGGGTCAAGCAGATTGCTACAGGGGTTTCTGATACCATCTGCGAGCCCTGCCCAGTCGGCTTCTTCTCCAATGTGTCATCTGCTTTCGAAAAATGTCACCCTTGGACAAGCTGTGAGACCAAAGACCTGGTTGTGCAACAGGCAGGCACAAACAAGACTGATGTTGTCTGTGGTCCCCAGGATCGGCTGAGAGCCCTGGTGGTGATCCCCATCATCTTCGGGATCCTGTTTGCCATCCTCTTGGTGCTGGTCTTTATCAAAAAGGTGGCCAAGAAGCCAACCAATAAGGCCCCCCACCCCAAGCAGGAACCCCAGGAGATCAATTTTCCCGACGATCTTCCTGGCTCCAACACTGCTGCTCCAGTGCAGGAGACTTTACATGGATGCCAACCGGTCACCCAGGAGGATGGCAAAGAGAGTCGCATCTCAGTGCAGGAGAGACAG-3'
４−１ＢＢＬをコードする核酸（配列番号１９７）
5'-ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA-3'
（５）第１のスクリーニング方法（１回目）
前記（３）の第１の候補ＣＡＲ−Ｔと、前記（４）で調製したＡＰＣとを用いて、スクリーニングを行なった。具体的には、２×１０６第１の候補ＣＡＲ−Ｔと、１×１０５ＡＰＣとを各ウェル（２４ウェルプレート）に播種後、７日間共培養した。前記ＡＰＣは、２０Ｇｙでγ線処理後、１〜１０μｇ／ｍＬでNY-ESO-1157-165ペプチド（NY-ESO-1157ペプチド、SLLMWITQC：配列番号２０６）をパルスし、前記パルス後にHLA-A*02:01に結合していないペプチドを除去した細胞を用いた。また、前記第１の候補ＣＡＲ−ＴとＡＰＣとの共培養に用いた培地の組成は、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０％ヒトＡＢ血清（Sigma社製）、１０ＩＵ／ｍＬ ヒトＩＬ−２（Roche社製）、および１０ｎｇ／ｍＬ ヒトＩＬ−１５（PeproTech社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、第１の候補ＣＡＲ−Ｔを回収し、同様の条件でＡＰＣとの共培養をさらに２回（合計３回）実施した。これにより、A2/NY-ESO-1157と結合するhH-3M4E4L CARを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを富化した。
つぎに、富化後の第１の候補ＣＡＲ−Ｔを回収し、２０μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した。前記ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーは、ビオチン化HLA-A2/NY-ESO-1157の単量体と、ＰＥ標識ストレプトアビジン（Thermo Fisher Scientific社製）とを混合することにより調製した。前記染色後、前記Ｔ細胞をさらに、PC5標識anti-human CD8a mAb（clone：B9.11）、FITC標識anti-human CD4 mAb（clone：OKT4）、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。各抗体の濃度は、約１０μｇ／ｍＬとした。そして、テトラマー染色後の第１の候補ＣＡＲ−Ｔについて、前記フローサイトメーターを用いて、A2/NY-ESO-1157と結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔの存在を確認した（donor 1）。同様の試験を、異なる健常者由来のＴ細胞を用いて実施した（donor 2）。また、ポジティブコントロールは、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5HL CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、HLA-A*02:01およびHIV Gag77-85ペプチド（SLYNTVATL：配列番号１９８）の複合体（A2/HIV-Gag77）のテトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋、ＳＳＣ＋、ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図１に示す。
図１は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図１において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示す。図１に示すように、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかったＴ細胞（コントロール２）では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合するＴ細胞は存在しなかった。また、3M4E5HL CARを発現するＣＡＲ−Ｔ（3M4E5-CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔ（donor 1および2）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。このことから、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔに、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔが存在することがわかった。
つぎに、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを選抜し、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔが発現するＣＡＲを同定した。具体的には、前記（５）と同様にして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔを染色した。つぎに、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔからフローサイトメーター（FACSAria（商標）、Becton Dickinson社製）を用いた細胞選別により、ＮＧＦＲ＋ＣＤ８＋A2/NY-ESO-1157テトラマー＋画分、またはＮＧＦＲ＋ＣＤ４＋A2/NY-ESO-1157テトラマー＋画分を、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔとして分取した。総ＲＮＡ抽出試薬（TRIzol（登録商標）、Ambion社製）を用いて、得られた第１の候補ＣＡＲ−Ｔから総ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（Superscript（登録商標）III、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、前記総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡと、下記フォワードプライマー１およびリバースプライマー１の混合物とを用いて、ＰＣＲを実施し、ｓｃＦｖをコードする核酸を増幅した。クローニングキット（Gibson Assembly Master Mix、New England Biolab社製）を用い、得られたｓｃＦｖをコードする核酸を、ｓｃＦｖをコードする核酸がヒトＣＤ２８の部分領域の５’端に連結されるように、ｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに導入した（ｐＭＸ／ｓｃＦｖ発現ベクター）。ｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターは、ｐＭＸ発現ベクターにヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸（配列番号１６９）と、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸（配列番号１７１）とを、５’端側からこの順番に配置されるように連結し、導入することにより調製した。そして、得られたｐＭＸ／ｓｃＦｖ発現ベクターについて、サンガー法によりシークエンスすることで、ＣＡＲをコードする塩基配列（H1-3M4E5L CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１３８）およびH73-3M4E5L CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５７））を同定した。また、前記塩基配列に基づき、ｓｃＦｖのアミノ酸配列（H1-3M4E5L（配列番号９８）およびH73-3M4E5L（配列番号１１７））を同定した。そして、ｓｃＦｖのアミノ酸配列に基づき、前記表１Ａに示す新たな重鎖可変領域（HA）および（HC）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を同定した。また、前記ｐＭＸ／ｓｃＦｖ発現ベクターから、H1-3M4E5Lをコードするポリヌクレオチドを含むｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターおよびH73-3M4E5Lをコードするポリヌクレオチドを含むｐＭＸ／H73-3M4E5L発現ベクターを調製した。
フォワードプライマー１（配列番号１９９）
5'-ATCCCAGTGTGGTGGTACGGG-3'
リバースプライマー１（配列番号２００）
5'-GGGTACATCACTTCGATTGC-3'
（６）第１の候補ｓｃＦｖの解析
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターまたはｐＭＸ／H73-3M4E5L発現ベクターを用いた以外は、前記（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞にｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターまたはｐＭＸ／H73-3M4E5L発現ベクターを導入し、ｓｃＦｖとしてH1-3M4E5LまたはH73-3M4E5Lを含むＣＡＲ（H1-3M4E5L CARまたはH73-3M4E5L CAR）を発現させた。前記ＣＡＲ発現後のＪｕｒｋａｔ７６細胞を、前記ＰＥ標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗ＰＥマイクロビーズを用いて、H1-3M4E5L CARおよびH73-3M4E5L CARを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞（H1-3M4E5L CAR-TまたはH73-3M4E5L CAR T）を精製した。H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tについて、５μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後のH1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tについて、フローサイトメトリーにより解析した。ポジティブコントロールは、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターまたはｐＭＸ／H73-3M4E5L発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターまたはｐＭＸ／H73-3M4E5L発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図２に示す。
図２は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図２において、横軸は、A2/NY-ESO-1157テトラマーまたはA2/HIV-Gag77テトラマーで染色した際の平均蛍光強度を示し、縦軸は、側方散乱光（ＳＳＣ）の平均強度を示す。図２に示すように、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターまたはｐＭＸ／H73-3M4E5L発現ベクターを導入しなかったＪｕｒｋａｔ７６細胞（コントロール２）では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合する細胞は存在しなかった。また、3M4E5HL CAR-T（3M4E5 CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ほぼ全ての細胞がＡ２テトラマー＋であり、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、Ａ２テトラマー−であることから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ほぼ全ての細胞がＡ２テトラマー＋であり、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、Ａ２テトラマー−であった。このことから、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tは、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（７）第１の候補ｓｃＦｖの親和性
つぎに、前記（６）で得られたH1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tと、3M4E5LH CARを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞（3M4E5LH CAR-T）について、所定濃度（０．０００４１９４３０４、０．００１０４８５７６、０．００２６２１４４、０．００６５５３６、０．０１６３８４、０．０４０９６、０．１０２４、０．２５６、０．６４、１．６、４、または１０μｇ／ｍＬ）のＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した以外は、前記（６）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析した。そして、A2/NY-ESO-1157テトラマーの各濃度における、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を算出した。この結果を、図３に示す。
図３は、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を示すグラフである。図３において、横軸は、A2/NY-ESO-1157テトラマーの濃度を示し、縦軸は、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を示す。図３に示すように、各CAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーの濃度依存的にA2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合が増加した。また、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tは、3M4E5LH CAR-Tと同程度のA2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞を得るのに、A2/NY-ESO-1157テトラマーをより高濃度にする必要があることから、これらのCAR-TにおけるｓｃＦｖのA2/NY-ESO-1157テトラマーに対する親和性は異なることがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合する異なる親和性を有するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（８）第１の候補ｓｃＦｖの機能
つぎに、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tが、前記標的抗原との結合により、活性化するかを検討した。具体的には、３×１０５細胞のH1-3M4E5L CAR-TまたはH73-3M4E5L CAR-Tと、５×１０４細胞のＴ２細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）は、所定濃度（０．０００５、０．００１５、０．００４、０．０１、０．０４、０．１２２、０．３６６、１．１１、３．３３または１０μｇ／ｍＬ）でNY-ESO-1157ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）を用いた。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb（clone：FN50）およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後のH1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、ＮＧＦＲ＋細胞について、ＣＤ６９の平均蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールは、前記（６）で得られた3M4E5HL CAR-Tを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、NY-ESO-1157ペプチドに代えて、HIV Gag77-85ペプチドをパルスしたＴ２細胞（T2 + HIV Gag77）を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、各ペプチドの濃度について、コントロール２におけるＣＤ６９の平均蛍光強度を基準として、各サンプルのＣＤ６９の発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図４および５に示す。
図４は、ペプチド濃度が１０μｇ／ｍＬの場合におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。図４において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＣＤ６９の発現上昇の割合を示す。図４に示すように、コントロール２では、ＣＤ６９の発現上昇は生じなかった。他方、3M4E5HL CAR-T（ポジティブコントロール）は、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、ＣＤ６９の発現が上昇し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化していることが確認できた。また、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tは、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、ＣＤ６９の発現が上昇し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化した。さらに、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tは、3M4E5 HL CAR-Tと比較して、T2 + HIV Gag77刺激時のＣＤ６９の発現量の上昇率を基準とした、ＣＤ６９の発現上昇率が高い。このため、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR-Tは、3M4E5 HL CAR-Tと比較して、A2/NY-ESO-1157に対する特異性が高いことがわかった。また、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能し、かつより特異性の高いｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
つぎに、NY-ESO-1157ペプチドの段階希釈時のＣＤ６９の発現変化の結果を図５に示す。図５は、ＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。図５において、横軸は、NY-ESO-1157ペプチドの濃度を示し、縦軸は、ＣＤ６９の発現上昇の割合を示す。図５に示すように、各CAR-Tは、NY-ESO-1157ペプチドの濃度依存的にＣＤ６９の発現が上昇した。また、H1-3M4E5L CAR-TおよびH73-3M4E5L CAR Tは、3M4E5LH CAR-Tと比較して、ＣＤ６９の発現上昇がシャープであり、A2/NY-ESO-1157に対する特異性が高いことがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能し、かつより特異性の高いｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（９）第２のＣＡＲライブラリの調製
第１のＣＡＲライブラリからスクリーニングされた重鎖可変領域（HA）を用いて、第２のＣＡＲライブラリを調製した。具体的には、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸が導入されたｐＭＸ発現ベクターについて、重鎖可変領域（3M4E5H）をコードする核酸を、重鎖可変領域（HA）をコードする核酸で置換した（3M4E5L-H1発現ベクター）。つぎに、3M4E5L-H1発現ベクターについて、軽鎖可変領域（3M4E5L）をコードする核酸を、前記（２）の軽鎖可変領域をコードする核酸のライブラリで置換した。これにより、第２のＣＡＲライブラリを含む発現ベクター（hK-H1 CARライブラリの発現ベクター）を調製した。なお、hK-H1 CARライブラリにおける重鎖可変領域の不均一性（heterogeneity）は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約１×１０６種類であることを確認した。
（１０）第２のＣＡＲライブラリ発現Ｔ細胞（第２の候補ＣＡＲ−Ｔ）の調製
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hK-H1 CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記（３）と同様にして、hK-H1 CARライブラリが導入されたＴ細胞を精製し、これを第２の候補ＣＡＲ−Ｔとした。
（１１）第１のスクリーニング方法（２回目）
つぎに、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔに代えて、前記第２の候補ＣＡＲ−Ｔを用いた以外は、前記（５）と同様にして、A2/NY-ESO-1157と結合するＣＡＲを発現する第２の候補ＣＡＲ−Ｔの存在を確認した（donor 1）。同様の試験を、異なる健常者由来のヒト末梢血Ｂ細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリを用いて実施した（donor 2）。また、ポジティブコントロールは、hK-H1 CARライブラリの発現ベクターに代えて、ｐＭＸ／3M4E5L-H1発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-3M4E5L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図６に示す。
図６は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図６において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示す。図６に示すように、hK-H1 CARライブラリの発現ベクターを導入しなかったＴ細胞（コントロール２）では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合するＴ細胞は存在しなかった。また、3M4E5L-H1 CARを発現するＣＡＲ−Ｔ（3M4E5L-H1 CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが再確認できた。そして、前記第２の候補ＣＡＲ−Ｔ（donor 1および2）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。このことから、前記第２の候補ＣＡＲ−Ｔに、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第２の候補ＣＡＲ−Ｔが存在することがわかった。
つぎに、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第２の候補ＣＡＲ−Ｔを選抜し、前記第２の候補ＣＡＲ−Ｔが発現するＣＡＲを同定した。具体的には、A2/NY-ESO-1157テトラマーを用いて前記第２の候補ＣＡＲ−Ｔを染色した。つぎに、前記第２の候補ＣＡＲ−Ｔからフローサイトメーターを用いた細胞選別により、ＮＧＦＲ＋ＣＤ８＋A2/NY-ESO-1157テトラマー＋画分、またはＮＧＦＲ＋ＣＤ４＋A2/NY-ESO-1157テトラマー＋画分を、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第２の候補ＣＡＲ−Ｔとして分取した。A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔに代えて、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第２の候補ＣＡＲ−Ｔを用いた以外は、前記（５）と同様にして、ｓｃＦｖを調製し、ｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに導入した。そして、得られたｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターについて、サンガー法によりシークエンスすることで、ＣＡＲをコードする塩基配列（K52-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１３９）、K73-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４０）、K121-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４１）、K124-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４２）、K125-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４３）、K131-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４４）、K145-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４５）、K151-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４６）、K160-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４７）、K173-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４８））を同定した。また、前記塩基配列に基づき、ｓｃＦｖのアミノ酸配列（K52-H1（配列番号９９）、K73-H1（配列番号１００）、K121-H1（配列番号１０１）、K124-H1（配列番号１０２）、K125-H1（配列番号１０３）、K131-H1（配列番号１０４）、K145-H1（配列番号１０５）、K151-H1（配列番号１０６）、K160-H1（配列番号１０７）、K173-H1（配列番号１０８））を同定した。そして、ｓｃＦｖのアミノ酸配列に基づき、前記表１Ｂ記載の新たな軽鎖可変領域（LB）〜（LJ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を同定した。
（１２）第２の候補ｓｃＦｖの解析
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターのｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドに代えて、前記（１１）の各ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドが導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを用いた以外は、前記（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞に各ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドが導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを導入し、ｓｃＦｖとしてK52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1、またはK173-H1を含むＣＡＲを発現させた。前記ＣＡＲ発現後のＪｕｒｋａｔ７６細胞を、前記ＰＥ標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗ＰＥマイクロビーズを用いて、各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞を精製した。精製された各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞について、５μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。また、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに代えて、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。ポジティブコントロールは、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図７（Ａ）および（Ｂ）に示す。
図７（Ａ）および（Ｂ）は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図７（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示し、縦軸は、側方散乱光（ＳＳＣ）の平均強度を示す。図７（Ａ）および（Ｂ）に示すように、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを導入しなかったＪｕｒｋａｔ７６細胞（コントロール２）では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合する細胞は存在しなかった。また、3M4E5LH CAR-T（3M4E5-CARポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ほぼ全ての細胞がＡ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、H1-3M4E5L、K52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1、またはK173-H1を含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ほぼ全てまたは一部の細胞がＡ２テトラマー＋画分に存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。このことから、H1-3M4E5L、K52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1、またはK173-H1を含むＣＡＲは、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合する新たな重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。また、A2/NY-ESO-1157テトラマーでの染色の程度が異なるＣＡＲを発現するＴ細胞が存在することから、標的抗原に対して異なる親和性を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
［実施例２］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、A2/NY-ESO-1157に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることを確認した。
（１）第１のＣＡＲライブラリの調製
前記実施例１（１）の3M4E5LH scFvをコードする核酸の５’側の軽鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血Ｂ細胞由来の軽鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hL-3M4E4H scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5LH scFvをコードする核酸に代えて、hL-3M4E4H scFvライブラリを用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、タグが付加されたhL-3M4E4H CARライブラリを調製した。タグが付加されたhL-3M4E4H CARライブラリを、ｐＭＸ発現ベクターに導入し、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hL-3M4E4H CARライブラリの重鎖可変領域の不均一性は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで確認した。
（２）第１のＣＡＲライブラリ発現Ｔ細胞（第１の候補ＣＡＲ−Ｔ）の調製
前記hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、hL-3M4E4H CARライブラリが導入されたＴ細胞を精製し、これを第１の候補ＣＡＲ−Ｔとした。
（３）第１のスクリーニング方法
前記実施例１（３）の第１の候補ＣＡＲ−Ｔに代えて、前記実施例２（２）の第１の候補ＣＡＲ−Ｔを用いた以外は、前記実施例１（５）と同様にして、A2/NY-ESO-1157と結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔの存在を確認した（donor 1）。同様の試験を、異なる健常者由来のヒト末梢血Ｂ細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリを用いて実施した（donor 2）。また、ポジティブコントロールは、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図８に示す。
図８は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図８において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示す。図８に示すように、hL-3M4E4H CARライブラリの発現ベクターを導入しなかったＴ細胞（コントロール２）では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合するＴ細胞は存在しなかった。また、3M4E5LH CARを発現するＣＡＲ−Ｔ（3M4E5-CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔ（donor 1および2）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。このことから、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔに、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔが存在することがわかった。
つぎに、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを選抜し、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔが発現するＣＡＲを同定した。具体的には、前記実施例２（３）と同様にして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔを染色した。つぎに、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔからフローサイトメーターを用いた細胞選別により、ＮＧＦＲ＋ＣＤ８＋A2/NY-ESO-1157テトラマー＋画分、またはＮＧＦＲ＋ＣＤ４＋A2/NY-ESO-1157テトラマー＋画分を、A2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔとして分取した。前記実施例１（５）のA2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔに代えて、新たに分取したA2/NY-ESO-1157に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを用いた以外は、前記実施例１（５）と同様にして、ｓｃＦｖを調製し、ｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに導入した。そして、得られたｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターについて、サンガー法によりシークエンスすることにより、ＣＡＲをコードする塩基配列（L1-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４９）、L66-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５１）、L73-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５２）、L80-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５３）、L88-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５４）、L102-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５５）、およびL124-3M4E5 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号１５６））を同定した。また、前記塩基配列に基づき、ｓｃＦｖのアミノ酸配列（L1-3M4E5（配列番号１０９）、L66-3M4E5（配列番号１１１）、L73-3M4E5（配列番号１１２）、L80-3M4E5（配列番号１１３）、L88-3M4E5（配列番号１１４）、L102-3M4E5（配列番号１１５）、およびL124-3M4E5（配列番号１１６））を同定した。そして、ｓｃＦｖのアミノ酸配列に基づき、前記表１Ｂ記載の新たな軽鎖可変領域（LK）〜（LQ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を同定した。
（４）第１の候補ｓｃＦｖの解析
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターのｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドに代えて、前記実施例２（３）の各ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドが導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞に各ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドが導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを導入し、ｓｃＦｖとしてL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むＣＡＲを発現させた。前記ＣＡＲ発現後のＪｕｒｋａｔ７６細胞を、前記ＰＥ標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗ＰＥマイクロビーズを用いて、各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞を精製した。精製された各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞について、５μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。ポジティブコントロールは、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図９に示す。
図９は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図９において、横軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示し、縦軸は、側方散乱光（ＳＳＣ）の平均強度を示す。図９に示すように、各ｓｃＦｖを導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターを導入しなかったＪｕｒｋａｔ７６細胞（コントロール２）では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合する細胞は存在しなかった。また、3M4E5LH CAR-T（3M4E5 CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ほぼ全ての細胞がＡ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ほぼ全てまたは一部の細胞がＡ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。このことから、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むＣＡＲは、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合する新たな重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。また、A2/NY-ESO-1157テトラマーでの染色の程度が異なるＣＡＲを発現するＴ細胞が存在することから、標的抗原に対して異なる親和性を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（５）第１の候補ｓｃＦｖの親和性
つぎに、前記実施例２（４）で得られたL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞と、3M4E5LH CAR-Tについて、所定濃度（０．０００４１９４３０４、０．００１０４８５７６、０．００２６２１４４、０．００６５５３６、０．０１６３８４、０．０４０９６、０．１０２４、０．２５６、０．６４、１．６、４、または１０μｇ／ｍＬ）のＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した以外は、前記（６）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析した。そして、A2/NY-ESO-1157テトラマーの各濃度における、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を算出した。この結果を、図１０に示す。
図１０は、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を示すグラフである。図１０において、横軸は、A2/NY-ESO-1157テトラマーの濃度を示し、縦軸は、A2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合を示す。図１０に示すように、各CAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーの濃度依存的にA2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞の割合が増加した。また、L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、3M4E5LH CAR-Tと同程度のA2/NY-ESO-1157テトラマー陽性細胞を得るのに、A2/NY-ESO-1157テトラマーをより高濃度にする必要があることから、これらのCAR-TにおけるｓｃＦｖのA2/NY-ESO-1157テトラマーに対する親和性は異なることがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合する異なる親和性を有するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（６）第１の候補ｓｃＦｖの機能
つぎに、ｓｃＦｖとしてL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を発現するCAR-Tが、前記標的抗原との結合により、活性化するかを検討した。具体的には、３×１０５細胞の各CAR-Tと、５×１０４細胞のＴ２細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）は、所定濃度（０．０００５、０．００１５、０．００４、０．０１、０．０４、０．１２２、０．３６６、１．１１、３．３３または１０μｇ／ｍＬ）でNY-ESO-1157-165ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）を用いた。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、各CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb（clone：FN50）およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、ＮＧＦＲ＋細胞について、ＣＤ６９の平均蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールは、ｐＭＸ／H1-3M4E5L発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、NY-ESO-1157-165ペプチドに代えて、HIV Gag77-85ペプチドをパルスしたＴ２細胞（T2 + HIV Gag77）を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、前記発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるＣＤ６９の平均蛍光強度を基準として、各サンプルのＣＤ６９の発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図１１に示す。
図１１は、ペプチド濃度が１０μｇ／ｍＬの場合におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。図１１において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＣＤ６９の発現上昇の割合を示す。図１１に示すように、コントロール２では、ＣＤ６９の発現上昇は生じなかった。他方、3M4E5LH CAR-T（ポジティブコントロール）は、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、ＣＤ６９の発現が上昇し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化していることが確認できた。また、ｓｃＦｖとしてL1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、またはL124-3M4E5を発現するCAR-Tは、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、ＣＤ６９の発現が上昇し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化した。また、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能し、かつより特異性の高いｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
つぎに、NY-ESO-1157ペプチドの段階希釈時のＣＤ６９の発現変化の結果を図１２に示す。図１２は、ＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。図１２において、横軸は、NY-ESO-1157ペプチドの濃度を示し、縦軸は、ＣＤ６９の発現上昇の割合を示す。図１２に示すように、各CAR-Tは、NY-ESO-1157ペプチドの濃度依存的にＣＤ６９の発現が上昇した。また、ｓｃＦｖとして、L1-3M4E5またはL102-3M4E5を発現するCAR-Tは、3M4E5LH CAR-Tと比較して、ＣＤ６９の発現上昇がシャープであり、A2/NY-ESO-1157に対する特異性が高いことがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能し、かつより特異性の高いｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
［実施例３］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることを確認した。
（１）FMC63 CARの調製
前記A2/NY-ESO-1157特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に代えて、ヒトＣＤ１９特異的抗体（clone：ＦＭＣ６３）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、FMC63HL scFvまたはFMC63LH scFvをコードする核酸を調製し、３’末端にタグを付加したタグ付加FMC63HL CARおよびタグ付加FMC63LH CARをコードする核酸を取得した。各核酸は、ｐＭＸ発現ベクターに導入した。
FMC63HL scFv（配列番号２０１）
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
FMC63HL scFvをコードする核酸（配列番号２０２）
5'-GAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGACTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACAGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCTCGGAAAGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTTACAGTGTCCTCGGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGATATCCAGATGACCCAGACAACAAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACA-3'
FMC63LH scFv（配列番号２０３）
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63LH scFvをコードする核酸（配列番号２０４）
5'-GATATCCAGATGACCCAGACAACAAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCAAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAAGAGGATATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGAAACTGCAAGAGTCTGGCCCTGGACTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACAGTCAGCGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCTCGGAAAGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTTACAGTGTCCTCG-3'
（２）第１のＣＡＲライブラリの調製
前記実施例３（１）のFMC63HL scFvをコードする核酸の５’側の重鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血Ｂ細胞由来の重鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hH-FMC63L scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5LH scFvをコードする核酸に代えて、hH-FMC63L scFvライブラリを用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、タグが付加されたhH-FMC63L CARライブラリを調製した。タグが付加されたhH-FMC63L CARライブラリを、ｐＭＸ発現ベクターに導入し、hH-FMC63L CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hH-FMC63L CARライブラリの重鎖可変領域の不均一性は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約１×１０６種類であることを確認した。
（３）第１のＣＡＲライブラリ発現Ｔ細胞（第１の候補ＣＡＲ−Ｔ）の調製
前記hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hH-FMC63L CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、hH-FMC63L CARライブラリが導入されたＴ細胞を精製し、これを第１の候補ＣＡＲ−Ｔとした。
（４）標的抗原の発現細胞の調製
レトロウイルスを用いて、ヒトＣＤ１９をコードする核酸を、Ｋ５６２細胞に導入し、抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９）とした。
ヒトＣＤ１９をコードする核酸（配列番号２０５）
5'-ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGGAGGAAAAGAAAGCGAATGACTGACCCCACCAGGAGATTCTTCAAAGTGACGCCTCCCCCAGGAAGCGGGCCCCAGAACCAGTACGGGAACGTGCTGTCTCTCCCCACACCCACCTCAGGCCTCGGACGCGCCCAGCGTTGGGCCGCAGGCCTGGGGGGCACTGCCCCGTCTTATGGAAACCCGAGCAGCGACGTCCAGGCGGATGGAGCCTTGGGGTCCCGGAGCCCGCCGGGAGTGGGCCCAGAAGAAGAGGAAGGGGAGGGCTATGAGGAACCTGACAGTGAGGAGGACTCCGAGTTCTATGAGAACGACTCCAACCTTGGGCAGGACCAGCTCTCCCAGGATGGCAGCGGCTACGAGAACCCTGAGGATGAGCCCCTGGGTCCTGAGGATGAAGACTCCTTCTCCAACGCTGAGTCTTATGAGAACGAGGATGAAGAGCTGACCCAGCCGGTCGCCAGGACAATGGACTTCCTGAGCCCTCATGGGTCAGCCTGGGACCCCAGCCGGGAAGCAACCTCCCTGGGGTCCCAGTCCTATGAGGATATGAGAGGAATCCTGTATGCAGCCCCCCAGCTCCGCTCCATTCGGGGCCAGCCTGGACCCAATCATGAGGAAGATGCAGACTCTTATGAGAACATGGATAATCCCGATGGGCCAGACCCAGCCTGGGGAGGAGGGGGCCGCATGGGCACCTGGAGCACCAGG-3'
（５）第１のスクリーニング方法
前記実施例３（３）の第１の候補ＣＡＲ−Ｔと、前記実施例３（４）で調製したＡＰＣ−ＣＤ１９とを用いて、スクリーニングを行なった。具体的には、２×１０６第１の候補ＣＡＲ−Ｔと、１×１０５ＡＰＣ−ＣＤ１９とを各ウェル（２４ウェルプレート）に播種後、７日間共培養した。前記ＡＰＣ−ＣＤ１９は、２０Ｇｙでγ線処理した細胞を用いた。また、前記第１の候補ＣＡＲ−ＴとＡＰＣ−ＣＤ１９との共培養に用いた培地の組成は、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０％ヒトＡＢ血清（Sigma社製）、１０ＩＵ／ｍＬ ヒトＩＬ−２（Roche社製）、および１０ｎｇ／ｍＬ ヒトＩＬ−１５（PeproTech社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、第１の候補ＣＡＲ−Ｔを回収し、同様の条件でＡＰＣ−Ｃ１９との共培養をさらに２回（合計３回）実施した。これにより、ヒトＣＤ１９と結合するhH-FMC63L CARを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを富化した。
つぎに、富化後の第１の候補ＣＡＲ−Ｔを回収し、２０μｇ／ｍＬ ＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーで染色した。前記ＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーは、ヒトＣＤ１９の細胞外ドメインのＣ末端にＳＧＳＧリンカーを介してヒスタグを付加した溶解型ＣＤ１９を用いて調製した。具体的には、前記ＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーは、前記溶解型ＣＤ１９と、ＰＥ標識anti-His mAb（clone：GG11-8F3.5.1）とを、モル数が２：１となるように混合することにより調製した。前記染色後、前記Ｔ細胞を、さらにPC5標識anti-human CD8a mAb（clone：B9.11）、FITC標識anti-human CD4 mAb（clone：OKT4）、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。そして、ダイマー染色後の第１の候補ＣＡＲ−Ｔについて、前記フローサイトメーターを用いて、ＣＤ１９と結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔの存在を確認した。また、ポジティブコントロールは、hH-FMC63L CARライブラリの発現ベクターに代えて、タグ付加FMC63HL CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。なお、タグ付加FMC63LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた場合も、タグ付加FMC63HL CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた場合と同様の結果を得ている。また、コントロール１は、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-FMC63L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図１３に示す。
図１３は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図１３において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、ＣＤ１９ダイマーの平均蛍光強度を示す。図１３に示すように、hH-FMC63 CARライブラリの発現ベクターを導入しなかったＴ細胞（コントロール２）では、ＣＤ１９ダイマーに結合するＴ細胞は存在しなかった。また、FMC63 CARを発現するＣＡＲ−Ｔ（FMC63-CAR、ポジティブコントロール）は、ＣＤ１９ダイマーで染色した場合、ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった場合、ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分が存在しないことから、ＣＤ１９ダイマーに結合することが確認できた。そして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔは、ＣＤ１９ダイマーで染色した場合、ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分が存在し、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった場合、ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分が存在しなかった。このことから、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔに、ＣＤ１９ダイマーに結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔが存在することがわかった。これらの結果から、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。なお、データは示していないが、ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分の細胞は、ＣＤ６９の発現が、ＣＤ１９ダイマー−画分の細胞と比較して上昇しており、ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分の細胞に発現するＣＡＲがＴ細胞の活性化機能を有することが確認された。
［実施例４］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲが、標的抗原に対して高い特異性を有することを確認した。
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、ｓｃＦｖ（抗原結合ドメイン）としてL1-3M4E5HまたはH73-3M4E5Lをコードするポリヌクレオチドが導入されたｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクター（それぞれ、L1-3M4E5H発現ベクターおよびH73-3M4E5L発現ベクター）を用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、得られたGaLV-pseudotypedレトロウイルスを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、前記レトロウイルスをＴ細胞に感染させ、L1-3M4E5H発現ベクターまたはH73-3M4E5L発現ベクターをＴ細胞に導入した。同様のレトロウイルスの感染およびL1-3M4E5H発現ベクターまたはH73-3M4E5L発現ベクターの導入を、更に５回（合計６回）実施した。得られたＴ細胞について、２０μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した。前記染色後、前記Ｔ細胞をさらに、PC5標識anti-human CD8a mAb（clone：B9.11）、FITC標識anti-human CD4 mAb（clone：OKT4）、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。各抗体の濃度は、約１０μｇ／ｍＬとした。そして、テトラマー染色後のＴ細胞について、前記フローサイトメーターを用いて、A2/NY-ESO-1157と結合するＣＡＲを発現するＴ細胞の存在を確認した。また、ポジティブコントロールは、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5HL CARまたはタグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図１４に示す。
図１４は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図１４において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示す。図１４に示すように、コントロール２では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合するＴ細胞は存在しなかった。また、3M4E5HL CARまたは3M4E5LH CARを発現するCAR-T（3M4E5HL CAR または3M4E5LH CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、L1-3M4E5H CAR-TまたはH73-3M4E5L CAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。
つぎに、前記レトロウイルス感染後の各Ｔ細胞が、前記標的抗原との結合により、活性化し、サイトカインを産生するかを検討した。具体的には、前記６回のレトロウイルス感染後のＴ細胞（CAR-T）について、３×１０５細胞のＴ細胞と、５×１０４細胞のＴ２細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）は、１０μｇ／ｍＬでNY-ESO-1157ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）を用いた。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、Ｔ細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定後、透過処理を行ない、APC標識anti-human IL-2 mAb（clone：MQ1-17H12）、PE標識anti-human TNFα mAb（clone：Mab11）、PC7標識anti-human IFN-γ mAb（clone：B27）、FITC標識anti-human CD4 mAb (clone：OKT4)、PC5標識anti-human CD8a mAb (clone：B9.11)、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。前記染色後のCAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、CAR-T（NGFR陽性画分）におけるＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２産生量を測定した。ポジティブコントロールは、ｓｃＦｖとして3M4E5HLまたは3M4E5LHをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、NY-ESO-1157ペプチドに代えて、A2/HIV-Gag77ペプチドを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図１５に示す。
図１５は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。図１５において、横軸は、サンプル（ＣＡＲ）の種類を示し、縦軸は、サイトカインの産生増加の割合を示す。図１５に示すように、コントロール２では、サイトカインの産生増加は生じなかった。他方、3M4E5LH CAR-Tまたは3M4E5HL CAR-T（ポジティブコントロール）は、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生量が増加し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化していることが確認できた。また、3M4E5HL CAR-Tまたは3M4E5LH CAR-Tを、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生が増加し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化し、サイトカインを産生していた。さらに、3M4E5HL CAR-Tまたは3M4E5LH CAR-Tは、T2 + HIV Gag77で刺激した場合におけるサイトカインの産生がコントロール２と同等以下であり、ポジティブコントロールより低かった。以上のことから、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲが、標的抗原に対して高い特異性を有することがわかった。
［実施例５］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲが、スクリーニングに用いた標的抗原に結合する抗体と異なる抗原認識性を示すことを確認した。
前記実施例４と同様にして、L1-3M4E5H CARを発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞を作製した。つぎに、３×１０５細胞のＴ細胞と、５×１０４細胞のＴ２細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）は、１０μｇ／ｍＬでNY-ESO-1157ペプチドまたはNY-ESO-1157ペプチドの変異ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）を用いた。前記変異ペプチドは、NY-ESO-1157ペプチドのアミノ酸配列において、各アミノ酸を１つずつアラニンに置換したペプチドである。前記共培養後、培養上清を回収し、前記実施例４と同様にして、CAR-TにおけるＩＦＮ−γの濃度を測定した。コントロールは、3M4E5LH CARを発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157ペプチドに代えて、A2/HIV-Gag77ペプチドを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、発現ベクターを導入しなかったＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図１６に示す。
図１６は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、3M4E5LH CARを発現するＴ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、L1-3M4E5H CARを発現するＴ細胞の結果を示す。図１６（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、ペプチドの種類を示し、縦軸は、サイトカイン産生量の変化を示す。図１６（Ａ）に示すように、3M4E5LH CARは、NY-ESO-1157ペプチドの１６０〜１６２番のアミノ酸を認識するのに対して、（Ｂ）に示すように、L1-3M4E5H CARは、NY-ESO-1157ペプチドの１５８および１６０〜１６２番のアミノ酸を認識していた。これらの結果から、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲが、スクリーニングに用いた標的抗原に結合する抗体と異なる抗原認識性を示すことがわかった。
［実施例６］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲについて、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との順序を交換しても、抗原認識性を維持することを確認した。
前記L1-3M4E5H発現ベクターにおいて、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドと、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの順序を逆にすることにより、3M4E5H-L1発現ベクターを作製した。
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、3M4E5H-L1発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、得られたGaLV-pseudotypedレトロウイルスを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、前記レトロウイルスをＴ細胞に感染させ、3M4E5H-L1発現ベクターをＴ細胞に導入した。同様のレトロウイルスの感染および3M4E5H-L1発現ベクターの導入を、更に５回（合計６回）実施した。得られたＴ細胞について、２０μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した。前記染色後、前記Ｔ細胞をさらに、PC5標識anti-human CD8a mAb（clone：B9.11）、FITC標識anti-human CD4 mAb（clone：OKT4）、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。各抗体の濃度は、約１０μｇ／ｍＬとした。そして、テトラマー染色後のＴ細胞について、前記フローサイトメーターを用いて、A2/NY-ESO-1157と結合するＣＡＲを発現するＴ細胞の存在を確認した。また、ポジティブコントロールは、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、タグ付加3M4E5LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋、ＳＳＣ＋、ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図１７に示す。
図１７は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図１７において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示す。図１７に示すように、コントロール２では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合するＴ細胞は存在しなかった。また、3M4E5LH CARを発現するCAR-T（3M4E5LH CAR、ポジティブコントロール）は、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しないことから、A2/NY-ESO-1157に結合し、A2/HIV-Gag77に結合しないことが確認できた。そして、3M4E5H-L1を発現するCAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。
つぎに、前記レトロウイルス感染後の各Ｔ細胞が、前記標的抗原との結合により、活性化し、サイトカインを産生するかを検討した。具体的には、前記６回のレトロウイルス感染後のＴ細胞（CAR-T）について、３×１０５細胞のＴ細胞と、５×１０４細胞のＴ２細胞または前記実施例１（４）で調製したＡＰＣとを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）およびＡＰＣは、１０μｇ／ｍＬでNY-ESO-1157ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）またはＡＰＣ（K562/A2/NY-ESO-1）を用いた。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、Ｔ細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定後、透過処理を行ない、APC標識anti-human IL-2 mAb（clone：MQ1-17H12）、PE標識anti-human TNFα mAb（clone：Mab11）、PC7標識anti-human IFN-γ抗体（clone：B27）、FITC標識anti-human CD4 mAb (clone：OKT4)、PC5標識anti-human CD8a mAb (clone：B9.11)、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。前記染色後のCAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、CAR-T（NGFR陽性画分）におけるＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２産生量を測定した。ポジティブコントロールは、ｓｃＦｖとして3M4E5LHをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、前記Ｔ２細胞において、コントロール１は、NY-ESO-1157ペプチドに代えて、HIV-Gag77ペプチドを用いた以外は、同様にして実施した。前記ＡＰＣ（K562/A2/NY-ESO-1）において、コントロール１は、NY-ESO-1を遺伝子導入していないK562/A2を用いた以外は、同様に実施した。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図１８および１９に示す。
Ｔ２細胞を用いた結果を図１８に示す。図１８は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。図１８において、横軸は、サンプル（ＣＡＲ）の種類を示し、縦軸は、サイトカインの産生増加の割合を示す。図１８に示すように、コントロール２では、サイトカインの産生増加は生じなかった。他方、3M4E5LH CAR-T（ポジティブコントロール）は、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生量が増加し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化していることが確認できた。また、3M4E5H-L1 CAR-Tを、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生が増加し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化し、サイトカインを産生していた。さらに、3M4E5H-L1 CAR-Tは、T2 + HIV Gag77で刺激した場合におけるサイトカインの産生がコントロール２と同等以下であり、ポジティブコントロールより低かった。
ＡＰＣを用いた結果を図１９に示す。図１９は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。図１９において、横軸は、サンプル（ＣＡＲ）の種類を示し、縦軸は、サイトカインの産生増加の割合を示す。図１９に示すように、コントロール２では、サイトカインの産生増加は生じなかった。他方、3M4E5LH CAR-T（ポジティブコントロール）は、K562/A2/NY-ESO-1で刺激すると、K562/A2で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生量が増加し、K562/A2/NY-ESO-1に結合して活性化していることが確認できた。また、3M4E5H-L1 CAR-Tを、K562/A2/NY-ESO-1で刺激すると、K562/A2で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生が増加し、K562/A2/NY-ESO-1に結合して活性化し、サイトカインを産生していた。さらに、3M4E5H-L1 CAR-Tは、K562/A2で刺激した場合におけるサイトカインの産生がコントロール２と同等であり、ポジティブコントロールより低かった。以上のことから、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲについて、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との順序を交換しても、抗原認識性を維持できることがわかった。
［実施例７］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲが、スクリーニングに用いた標的抗原に結合する抗体と異なる抗原認識性を示すことおよびＣＡＲにおけるｓｃＦｖの交差反応性を制御しながらスクリーニングできることを確認した。
（１）抗原認識性
前記実施例６と同様にして、3M4E5H-L1 CARを発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞を作製した。つぎに、３×１０５細胞のＴ細胞と、５×１０４細胞のＴ２細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）は、１０μｇ／ｍＬでNY-ESO-1157ペプチドまたはNY-ESO-1157ペプチドの変異ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）を用いた。前記変異ペプチドは、NY-ESO-1157ペプチドのアミノ酸配列において、各アミノ酸を１つずつアラニンに置換したペプチドである。前記共培養後、培養上清を回収し、前記実施例４と同様にして、CAR-TにおけるＩＬ−２の産生量を測定した。コントロールは、3M4E5LH CARを発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157ペプチドに代えて、A2/HIV-Gag77ペプチドを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、発現ベクターを導入しなかったＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いた以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図２０に示す。
図２０は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、3M4E5LH CARを発現するＴ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、3M4E5H-L1 CARを発現するＴ細胞の結果を示す。図２０（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、ペプチドの種類を示し、縦軸は、サイトカイン産生量の変化を示す。図２０（Ａ）に示すように、3M4E5LH CARは、主にNY-ESO-1157ペプチドの１６０〜１６２番のアミノ酸を認識するのに対して、（Ｂ）に示すように、3M4E5H-L1 CARは、NY-ESO-1157ペプチドの１５８、１６０〜１６２、および１６４番のアミノ酸を認識していた。これらの結果から、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲが、スクリーニングに用いた標的抗原に結合する抗体と異なる抗原認識性を示すことがわかった。
（２）交差反応性
前記実施例７（１）で示したように、3M4E5LH CARは、NY-ESO-1157ペプチドの１６０〜１６２番のアミノ酸を認識するのに対して、3M4E5H-L1 CARは、NY-ESO-1157ペプチドの１５８および１６０〜１６２番、１６４番目のアミノ酸を認識する。3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARの他のペプチドに対する交差反応性を検討するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に結合し、かつ3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARと交差反応しうるペプチドを含むヒトタンパク質について、アルゴリズム（netMHC4.0、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）を用いて予測した。タンパク質のデータベースとしては、uniprotKB/swissprotを用いた。また、得られたタンパク質におけるペプチドにおいて、NY-ESO-1157ペプチドと相同性が高い相同ペプチド（homologous peptide）を、アルゴリズム（ScanProsit、https://prosite.expasy.org/scanprosite/）を用いて絞り込んだ。その結果、交差反応しうるペプチド（配列番号２０７：GLRMWIKQV）を含む、Lysophospholipase-like protein 1（LYPLAL1）タンパク質がヒットした。そこで、Ｋ５６２細胞に、LYPLAL1タンパク質を発現させ、3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARの交差反応性を検討した。
レトロウイルスを用いて、HLA-A*02:01をコードする核酸と、ΔNGFRを前記フーリン切断部位、前記スペーサー配列および前記コドン最適化Ｐ２Ａ配列を介して付加したLYPLAL1（配列番号２０８）またはNY-ESO-1（配列番号２０９）をコードする核酸とをＫ５６２細胞（ＨＬＡおよびＣＤ１９の発現無し）に導入し、抗原提示細胞（K562/A2/NY-ESO-1またはK562/A2/LYPLAL1）とした。また、ΔNGFRを付加したNY-ESO-1またはLYPLAL1をコードする核酸を導入しなかった以外は同様にして、抗原提示細胞（K562/A2）を調製した。前記実施例６と同様にして、3M4E5LH CAR-Tと3M4E5H-L1 CAR-Tを調製し、３×１０５細胞のCAR-T細胞と、５×１０４細胞の抗原提示細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、CAR-Tを回収し、パラホルムアルデヒドで固定後、透過処理を行ない、APC標識anti-human IL-2 mAb（clone：MQ1-17H12）、PE標識anti-human TNFα mAb（clone：Mab11）、PC7標識anti-human IFN-γ抗体（clone：B27）、FITC標識anti-human CD4 mAb (clone：OKT4)、PC5標識anti-human CD8a mAb (clone：B9.11)およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。前記染色後のCAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、CAR-T（NGFR陽性画分）におけるＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２の産生量を測定した。前記ＡＰＣにおいて、コントロール１は、NY-ESO-1を遺伝子導入していないK562/A2を用いた。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図２１に示す。
LYPLAL1をコードする核酸分子（配列番号２０８）
5'-ATGGCGGCTGCATCTGGAAGCGTGCTGCAGAGATGTATCGTGTCCCCAGCCGGCAGACATAGCGCCAGCCTGATTTTTCTGCACGGCAGCGGCGATTCTGGCCAGGGACTGAGAATGTGGATCAAACAGGTGCTGAACCAGGACCTGACCTTCCAGCACATCAAGATCATCTACCCCACCGCTCCACCTCGGAGCTACACACCTATGAAGGGCGGCATCAGCAACGTTTGGTTCGACCGGTTCAAGATCACCAACGACTGCCCCGAGCACCTGGAATCCATCGACGTGATGTGTCAGGTGCTCACCGACCTGATCGACGAGGAAGTGAAGTCCGGCATCAAGAAGAACAGAATCCTGATCGGCGGCTTCAGCATGGGCGGCTGTATGGCCATTCACCTGGCCTACAGAAACCACCAGGATGTGGCTGGCGTGTTCGCCCTGAGCAGCTTTCTGAACAAAGCCAGCGCCGTGTATCAGGCCCTGCAGAAATCTAACGGCGTGCTGCCTGAGCTGTTCCAGTGTCATGGCACAGCCGATGAGCTGGTGCTGCACTCTTGGGCCGAAGAGACAAATAGCATGCTGAAAAGCCTGGGCGTGACCACCAAGTTCCACAGCTTCCCCAACGTGTACCACGAGCTGAGCAAGACCGAGCTGGACATCCTGAAACTGTGGATTCTGACCAAGCTGCCCGGCGAGATGGAAAAGCAGAAG-3'
ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする核酸分子（配列番号２０９）
5'-ATGCAGGCCGAAGGCCGGGGCACAGGGGGTTCGACGGGCGATGCTGATGGCCCAGGAGGCCCTGGCATTCCTGATGGCCCAGGGGGCAATGCTGGCGGCCCAGGAGAGGCGGGTGCCACGGGCGGCAGAGGTCCCCGGGGCGCAGGGGCAGCAAGGGCCTCGGGGCCGGGAGGAGGCGCCCCGCGGGGTCCGCATGGCGGCGCGGCTTCAGGGCTGAATGGATGCTGCAGATGCGGGGCCAGGGGGCCGGAGAGCCGCCTGCTTGAGTTCTACCTCGCCATGCCTTTCGCGACACCCATGGAAGCAGAGCTGGCCCGCAGGAGCCTGGCCCAGGATGCCCCACCGCTTCCCGTGCCAGGGGTGCTTCTGAAGGAGTTCACTGTGTCCGGCAACATACTGACTATCCGACTGACTGCTGCAGACCACCGCCAACTGCAGCTCTCCATCAGCTCCTGTCTCCAGCAGCTTTCCCTGTTGATGTGGATCACGCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTTTTGGCTCAGCCTCCCTCAGGGCAGAGGCGC-3'
図２１は、サイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。図２１において、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。図２１において、各グラフの横軸は、サンプル（ＣＡＲ）の種類を示し、縦軸は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、またはＩＬ−２陽性細胞の割合を示す。図２１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、コントロール１（Control）では、サイトカインの産生増加は生じなかった。他方、ポジティブコントロール（K562/A2/NY-ESO-1）では、3M4E5H-L1 CARまたは3M4E5LH CARを発現するＴ細胞は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２を産生した。また、図２１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、LYPLAL1を提示する抗原提示細胞（K562/A2/LYPLAL1）と共培養した場合、3M4E5LH CARおよび3M4E5H-L1 CARを発現するＴ細胞におけるサイトカイン産生細胞の割合は、バックグラウンドであるコントロール２（K562/A2）と同程度であり、交差反応性を示さなかった。これらの結果から、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、ＣＡＲが含むｓｃＦｖの交差反応性を制御できることがわかった。
［実施例８］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲについて、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との順序を交換することで、抗原特異性が変化することを確認した。
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、3M4E5H-L1発現ベクターまたはL1-3M4E5H発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、得られたGaLV-pseudotypedレトロウイルスを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、前記レトロウイルスをＴ細胞に感染させ、3M4E5H-L1発現ベクターまたはL1-3M4E5H発現ベクターをＴ細胞に導入した。同様のレトロウイルスの感染および3M4E5H-L1発現ベクターまたはL1-3M4E5H発現ベクターの導入を、更に５回（合計６回）実施した。得られたＴ細胞について、２０μｇ／ｍＬ ＰＥ標識A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した。前記染色後、前記Ｔ細胞をさらに、PC5標識anti-human CD8a mAb（clone：B9.11）、FITC標識anti-human CD4 mAb（clone：OKT4）、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。各抗体の濃度は、約１０μｇ／ｍＬとした。そして、テトラマー染色後のＴ細胞について、前記フローサイトメーターを用いて、A2/NY-ESO-1157と結合するＣＡＲを発現するＴ細胞の存在を確認した。また、コントロール１は、A2/NY-ESO-1157テトラマーに代えて、A2/HIV-Gag77テトラマーを用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋、ＳＳＣ＋、ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図２２に示す。
図２２は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図２２において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、Ａ２テトラマーの平均蛍光強度を示す。図２２に示すように、コントロール２では、A2/NY-ESO-1157またはA2/HIV-Gag77に結合するＴ細胞は存在しなかった。また、L1-3M4E5Hまたは3M4E5H-L1を発現するCAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在し、A2/HIV-Gag77テトラマーで染色した場合、ＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分が存在しなかった。さらに、L1-3M4E5Hまたは3M4E5H-L1を発現するCAR-Tについて、ＣＤ８−またはＣＤ８＋のＡ２テトラマー＋画分を比較すると、ＣＤ８−Ａ２テトラマー＋画分およびＣＤ８＋Ａ２テトラマー＋画分のいずれにおいても3M4E5H-L1 CAR-Tは、L1-3M4E5H CAR-Tと比較して、A2/NY-ESO-1157に強く結合しており、抗原特異性が異なった。
つぎに、前記レトロウイルス感染後の各Ｔ細胞が、前記標的抗原との結合により、活性化し、サイトカインを産生するかを検討した。具体的には、前記６回のレトロウイルス感染後のＴ細胞（CAR-T）について、３×１０５細胞のＴ細胞と、５×１０４細胞のＴ２細胞または前記実施例１（４）で調製したＡＰＣとを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記Ｔ２細胞（HLA-A*02:01発現細胞）およびＡＰＣは、１０μｇ／ｍＬでNY-ESO-1157ペプチドをパルスした細胞（T2 + NY-ESO-1157）またはＡＰＣ（K562/A2/NY-ESO-1）を用いた。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、Ｔ細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定後、透過処理を行ない、APC標識anti-human IL-2 mAb（clone：MQ1-17H12）、PE標識anti-human TNFα mAb（clone：Mab11）、PC7標識anti-human IFN-γ抗体（clone：B27）、FITC標識anti-human CD4 mAb (clone：OKT4)、PC5標識anti-human CD8a mAb (clone：B9.11)およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。前記染色後のCAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、CAR-T（NGFR陽性画分）におけるＣＤ８陽性細胞またはＣＤ４陽性細胞のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２の産生量を測定した。また、前記Ｔ２細胞において、コントロール１は、NY-ESO-1157ペプチドに代えて、HIV-Gag77ペプチドを用いた以外は、同様にして実施した。前記ＡＰＣ (K562/A2/NY-ESO-1)において、コントロール１は、NY-ESO-1を遺伝子導入していないK562/A2を用いた。コントロール２は、hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、コントロール２におけるサイトカインの産生量を基準として、各サンプルのサイトカインの産生増加の割合を算出した。これらの結果を図２３および２４に示す。
Ｔ２細胞を用いた結果を図２３に示す。図２３は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。図２３において、横軸は、サンプル（ＣＡＲ）の種類を示し、縦軸は、サイトカインの産生増加の割合を示す。図２３に示すように、コントロール２では、サイトカインの産生増加は生じなかった。他方、L1-3M4E5H CAR-Tまたは3M4E5H-L1 CAR-Tは、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、T2 + HIV Gag77で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生量が増加し、A2/NY-ESO-1157に結合して活性化していることが確認できた。また、T2 + NY-ESO-1157で刺激すると、3M4E5H-L1 CAR-Tは、L1-3M4E5H CAR-Tと比較して、多量のサイトカインを産生した。
ＡＰＣを用いた結果を図２４に示す。図２４は、サイトカイン産生量の変化を示すグラフであり、（Ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の結果を示し、（Ｂ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の結果を示す。図２４において、横軸は、サンプル（ＣＡＲ）の種類を示し、縦軸は、サイトカインの産生増加の割合を示す。図２４に示すように、コントロール２では、サイトカインの産生増加は生じなかった。他方、L1-3M4E5H CAR-Tまたは3M4E5H-L1 CAR-Tは、K562/A2/NY-ESO-1で刺激すると、K562/A2で刺激した場合と比較して、サイトカインの産生量が増加し、K562/A2/NY-ESO-1に結合して活性化していることが確認できた。また、K562/A2/NY-ESO-1で刺激すると、3M4E5H-L1 CAR-Tは、L1-3M4E5H CAR-Tと比較して、多量のサイトカインを産生した。本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲについて、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域との順序を交換することで、抗原特異性が変化することがわかった。また、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたＣＡＲについて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の順序を交換することにより、標的抗原に対する特異性を向上できる可能性があることがわかった。
［実施例９］
本発明の第１のスクリーニング方法により、標的抗原における認識部位が異なるｓｃＦｖをスクリーニングできることを確認した。
まず、前記実施例１（９）〜（１２）および前記実施例２（１）〜（３）と同様にして、第２の候補ＣＡＲ−Ｔが発現するＣＡＲおよび第１の候補ＣＡＲ−Ｔが発現するＣＡＲを同定し、新たなＣＡＲ（L52-3M4E5H CARおよびK156-H1 CAR）を取得した。下記アミノ酸配列および塩基配列において、下線で示す配列が、L52またはL156のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲ３Ｌのアミノ酸配列もしくは塩基配列である。
L52-3M4E5H CAR（配列番号２１０）
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNLGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGSTTRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAGVFGGGTQLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
L52-3M4E5H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号２１１）
5'-CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACCTCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAGCACCACTCGGCCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGGGGTGTTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCACCTACCAGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTCCAGCGGCGGCTCTACAGCCTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGGGAGCTGCTGCCCTACTACGGCATGGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACAGTGTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
K156-H1 CAR（配列番号２１２）
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNNWPPKFTFGPGTKVDIRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
K156-H1 CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号２１３）
5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGAAATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAGAGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGATACCCTGTCCCTCACCTGTCTTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTAATTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACATGTCTCCTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCTCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA-3'
hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターのｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドに代えて、L52-3M4E5H CARまたはK156-H1 CARをコードするポリヌクレオチドが導入されたＣＡＲ発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（６）および（８）と同様にして、A2/NY-ESO-1157テトラマーおよびA2/HIV-Gag77テトラマーに対する結合性およびＣＤ６９の発現上昇の割合をフローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ６９の発現上昇の割合の解析において、コントロール１は、CAR-Tを添加しなかった以外は同様にして実施した。また、コントロール２は、NY-ESO-1157ペプチドまたはHIV Gag77-85ペプチドをパルスしなかった以外は同様にして実施した。これらの結果を図２５および２６に示す。
図２５は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図２５において、横軸は、A2/NY-ESO-1157テトラマーまたはA2/HIV-Gag77テトラマーで染色した際の平均蛍光強度を示し、縦軸は、側方散乱光（ＳＳＣ）の平均強度を示す。図２５に示すように、L52-3M4E5H CAR-TおよびK156-H1 CAR-Tは、A2/NY-ESO-1157テトラマーで染色される画分を有し、かつA2/HIV-Gag77テトラマーで染色される画分を有した。すなわち、L52-3M4E5H CARおよびK156-H1 CARは、A2/NY-ESO-1157およびA2/HIV-Gag77と結合した。これは、L52-3M4E5H CARおよびK156-H1 CARのｓｃＦｖが、L1-3M4E5H CARのｓｃＦｖ等と比較して、ペプチドおよびＨＬＡ分子の複合体において、ＨＬＡ分子寄りの部位を認識して結合しているためであると推定される。
図２６は、ペプチド濃度が１０μｇ／ｍＬの場合におけるＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。図２６において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＣＤ６９の発現上昇の割合を示す。図２６に示すように、コントロール１では、ＣＤ６９の発現上昇は生じなかった。他方、L52-3M4E5H CAR-TおよびK156-H1 CAR-Tは、ペプチドをパルスしていない抗原提示細胞（コントロール２、T2）、およびA2/NY-ESO-1157（T2+NY-ESO-1157）またはA2/HIV-Gag77（T2+HIV Gag57）でパルスした抗原提示細胞で刺激すると、ＣＤ６９の発現が上昇した。コントロール２においてもＣＤ６９の発現が生じていることから、L52-3M4E5H CARおよびK156-H1 CARのｓｃＦｖが、L1-3M4E5H CARのｓｃＦｖ等と比較して、ペプチドおよびＨＬＡ分子の複合体において、ＨＬＡ分子寄りの部位を認識して結合していることが裏付けられた。
以上のことから、本発明の第１のスクリーニング方法により、標的抗原における認識部位が異なるｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった、すなわち、標的抗原における異なる部位に対する結合性を有するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
［実施例１０］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることを確認した。
（１）clone18 CARの調製
ヒトＣＤ１９特異的抗体であるＦＭＣ６３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に代えて、ヒトＣＤ１９特異的抗体（clone18（国際公開第2016/033570号参照））の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いた以外は、前記実施例３（１）と同様にして、clone18 scFvまたはclone18 scFvをコードする核酸を調製した。各核酸は、ｐＭＸ発現ベクターに導入した。なお、各ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を下線で示す。
clone18LH scFv（配列番号２１４）
QSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCCSYAGRYNSVLFGGGTKLTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
clone18LH scFvをコードする核酸（配列番号２１５）
5'-CAATCTGCTCTGACACAGCCTAGAAGCGTGTCCGGCTTTCCTGGCCAGAGCGTGACCATCAGCTGTACCGGCACCACCTCCGATGACGTGTCCTGGTATCAGCAGCATCCTGGCAAAGCCCCTCAGCTGATGCTGTACGACGTGTCCAAAAGACCTAGCGGCGTGCCCCACAGATTCAGCGGATCTAGAAGTGGCAGAGCCGCCAGCCTGATCATCTCTGGACTGCAGACAGAGGACGAGGCCGACTACTTCTGCTGTAGCTACGCCGGCAGATACAACAGCGTGCTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGACAGTGCTGGGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGCGAAGTGCAGCTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGACGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCGGCATCTCTTGGAACAGCGGCAGAATCGGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTTCCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCAGGGCTACCACTACTACGACTCTGCCGAGCACGCCTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACAGTGGTCACCGTTAGTTCT-3'
（２）第１のＣＡＲライブラリの調製
前記実施例１０（１）のclone18LH scFvをコードする核酸の５’側の軽鎖可変領域をコードする核酸を、前記ヒト末梢血Ｂ細胞由来の軽鎖可変領域の核酸を含むライブラリで置換することにより、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを調製した。そして、3M4E5LH scFvをコードする核酸に代えて、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを調製した。つぎに、hK-clone18H scFvライブラリおよびhL-clone18H scFvライブラリを、実施例１（１）のヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸と、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸とが、各ライブラリの３’端側にこの順番で配置されるようにｐＭＸ発現ベクターに導入し、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターを調製した。なお、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARの軽鎖可変領域の不均一性は、制限酵素マッピングおよび各領域をサンガー法によりシークエンスすることで、約１×１０６種類であることを確認した。
（３）第１のＣＡＲライブラリ発現Ｔ細胞（第１の候補ＣＡＲ−Ｔ）の調製
前記hH-3M4E4L CARライブラリの発現ベクターに代えて、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリが導入されたＴ細胞を精製し、これを第１の候補ＣＡＲ−Ｔとした。
（４）標的抗原の発現細胞の調製
前記実施例３（４）と同様にして、レトロウイルスを用いて、ヒトＣＤ１９をコードする核酸を、Ｋ５６２細胞に導入し、抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９）とした。
（５）第１のスクリーニング方法
前記実施例１０（３）の第１の候補ＣＡＲ−Ｔと、前記実施例１０（４）で調製したＡＰＣ−ＣＤ１９とを用いた以外は、前記実施例３（５）と同様にして、ヒトＣＤ１９と結合するhK-clone18H CARまたはhL-clone18H CARを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを富化した。
つぎに、富化後の第１の候補ＣＡＲ−Ｔを回収し、４０μｇ／ｍＬ ＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーで染色した。前記ＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーは、ヒトＣＤ１９の細胞外ドメインのＣ末端にＳＧＳＧリンカーを介してヒスタグを付加した溶解型ＣＤ１９を用いて調製した。具体的には、前記ＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーは、前記溶解型ＣＤ１９と、ＰＥ標識anti-His mAb（clone：GG11-8F3.5.1）とを、モル数が２：１となるように混合することにより調製した。前記染色後、前記Ｔ細胞を、さらにPC5標識anti-human CD8a mAb（clone：B9.11）、FITC標識anti-human CD4 mAb（clone：OKT4）、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。そして、ダイマー染色後の第１の候補ＣＡＲ−Ｔについて、前記フローサイトメーターを用いて、ＣＤ１９と結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔの存在を確認した。また、ポジティブコントロールは、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターに代えて、clone18LH CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった以外は、同様にして実施した。コントロール２は、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18Hライブラリの発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。同様の試験を、異なる健常者由来の末梢血Ｂ細胞由来の軽鎖可変領域の核酸を含むライブラリを用いて実施した（donor 2）。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図２７に示す。
図２７は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図２７において、横軸は、ＣＤ８ａの平均蛍光強度を示し、縦軸は、ＣＤ１９ダイマーの平均蛍光強度を示す。図２７に示すように、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターを導入しなかったＴ細胞（コントロール２）では、ＣＤ１９ダイマーに結合するＴ細胞は存在しなかった。また、clone18LH CARを発現するＣＡＲ−Ｔ（clone18LH、ポジティブコントロール）は、ＣＤ１９ダイマーで染色した場合、ＣＤ１９ダイマー＋画分（各ドットプロットの右上画分）が存在し、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった場合、ＣＤ１９ダイマー＋画分が存在しないことから、ＣＤ１９ダイマーに結合することが確認できた。そして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔは、hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターを導入したいずれの集団においても、ＣＤ１９ダイマーで染色した場合、ＣＤ１９ダイマー＋画分が存在し、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった場合、ＣＤ１９ダイマー＋画分が存在しなかった。このことから、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔに、ＣＤ１９ダイマーに結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔが存在することがわかった。これらの結果から、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、異なる抗体を用いても、標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
つぎに、ＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔを選抜し、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔが発現するＣＡＲを同定した。具体的には、前記実施例１０（５）と同様にして、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔを染色した。つぎに、前記第１の候補ＣＡＲ−Ｔからフローサイトメーター（FACSAria（商標）、Becton Dickinson社製）を用いた細胞選別により、ＮＧＦＲ＋ＣＤ８＋ＣＤ１９ダイマー＋画分、またはＮＧＦＲ＋ＣＤ４＋ＣＤ１９ダイマー＋画分を、ＣＤ１９に結合するＣＡＲを発現する第１の候補ＣＡＲ−Ｔとして分取した。総ＲＮＡ抽出試薬（TRIzol（登録商標）、Ambion社製）を用いて、得られた第１の候補ＣＡＲ−Ｔから総ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（Superscript（登録商標）III、Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、前記総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
得られたｃＤＮＡと、前記フォワードプライマー１（配列番号１９９）および前記リバースプライマー１（配列番号２００）の混合物とを用いて、ＰＣＲを実施し、ｓｃＦｖをコードする核酸を増幅した。クローニングキット（Gibson Assembly Master Mix、New England Biolab社製）を用い、得られたｓｃＦｖをコードする核酸を、ｓｃＦｖをコードする核酸がヒトＣＤ２８の部分領域の５’端に連結されるように、ｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターに導入した（ｐＭＸ／ｓｃＦｖ発現ベクター）。ｐＭＸ／ＣＡＲ発現ベクターは、ｐＭＸ発現ベクターにヒトＣＤ２８の部分領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸（配列番号１６９）と、ヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸（配列番号１７１）とを、５’端側からこの順番に配置されるように連結し、導入することにより調製した。そして、得られたｐＭＸ／ｓｃＦｖ発現ベクターについて、サンガー法によりシークエンスすることで、ＣＡＲをコードする塩基配列（L4-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９８）、L7-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９９）、L9-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３００）、L13-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０１）、L14-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０２）、L16-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０３）、L17-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０４）、L22-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０５）、K4-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０６）、K5-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０７）、K6-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０８）、K9-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０９）、K10-18H CARをコードするポリヌクレオチド（配列番号３１０））を同定した。また、前記塩基配列に基づき、ｓｃＦｖのアミノ酸配列（L4-18H（配列番号２７２）、L7-18H（配列番号２７３）、L9-18H（配列番号２７４）、L13-18H（配列番号２７５）、L14-18H（配列番号２７６）、L16-18H（配列番号２７７）、L17-18H（配列番号２７８）、L22-18H（配列番号２７９）、K4-18H（配列番号２８０）、K5-18H（配列番号２８１）、K6-18H（配列番号２８２）、K9-18H（配列番号２８３）、K10-18H（配列番号２８４））を同定した。そして、ｓｃＦｖのアミノ酸配列に基づき、前記表３Ｂに示す新たな軽鎖可変領域（LA）〜（LM）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を同定した。また、前記ｐＭＸ／ｓｃＦｖ発現ベクターから、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＭＸ／L4-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L7-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L9-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L13-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L14-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L16-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L17-18H発現ベクター、ｐＭＸ／L22-18H発現ベクター、ｐＭＸ／K4-18H発現ベクター、ｐＭＸ／K5-18H発現ベクター、ｐＭＸ／K6-18H発現ベクター、ｐＭＸ／K9-18H発現ベクター、ｐＭＸ／K10-18H発現ベクター）を調製した。
（６）第１の候補ｓｃＦｖの解析
hK-clone18H CARライブラリおよびhL-clone18H CARライブラリの発現ベクターに代えて、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１０（３）と同様にして、GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を調製した。つぎに、前記GaLV-pseudotypedレトロウイルスを含む培養上清を添加することにより、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞に各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入し、ｓｃＦｖとしてL4-18H、L7-18H、L9-18H、L13-18H、L14-18H、L16-18H、L17-18H、L22-18H、K4-18H、K5-18H、K6-18H、K9-18H、またはK10-18Hを含む各ＣＡＲ（L4-18H CAR、L7-18H CAR、L9-18H CAR、L13-18H CAR、L14-18H CAR、L16-18H CAR、L17-18H CAR、L22-18H CAR、K4-18H CAR、K5-18H CAR、K6-18H CAR、K9-18H CAR、またはK10-18H CAR）を発現させた。前記ＣＡＲ発現後のＪｕｒｋａｔ７６細胞を、前記ＰＥ標識anti-human NGFR mAbと反応させた。前記反応後、前記抗ＰＥマイクロビーズを用いて、各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞（L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T、またはK10-18H CAR-T）を精製した。各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞について、前記実施例１０（５）と同様にして染色した。前記染色後の各ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ７６細胞について、フローサイトメトリーにより解析した。ポジティブコントロールは、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに代えて、タグ付加clone18LH CARまたはclone18HL CARをコードする核酸を含む発現ベクターを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、ＣＤ１９ダイマーで染色しなかった以外は同様にして実施した。コントロール２は、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。ＦＳＣ＋ＳＳＣ＋ＮＧＦＲ＋細胞にゲートをかけた結果を図２８および２９に示す。
図２８および２９は、フローサイトメトリーの結果を示すドットプロットである。図２８および２９において、横軸は、ＣＤ１９ダイマーで染色した際の平均蛍光強度を示し、縦軸は、側方散乱光（ＳＳＣ）の平均強度を示す。図２８および２９に示すように、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかったＪｕｒｋａｔ７６細胞（コントロール２）では、ＣＤ１９に結合する細胞は存在しなかった。また、clone18LH CAR-Tおよびclone18HL CAR-T（clone18LH CARまたはclone18HL CAR、ポジティブコントロール）は、ＣＤ１９ダイマーで染色した場合、ほぼ全ての細胞がＣＤ１９ダイマー＋であり、ＣＤ１９ダイマーで染色しない場合、ＣＤ１９ダイマー−であることから、ＣＤ１９に結合していることが確認できた。そして、L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T、またはK10-18H CAR-Tは、ＣＤ１９ダイマーで染色した場合、ＣＤ１９ダイマー＋であり、ＣＤ１９ダイマーで染色しない場合、ＣＤ１９ダイマー−であった。このことから、L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T、またはK10-18H CAR-Tは、ＣＤ１９ダイマーに結合することがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（７）第１の候補ｓｃＦｖの機能
つぎに、前記実施例１０（６）で得られた各CAR-Tが、前記標的抗原との結合により、活性化するかを検討した。具体的には、２×１０５細胞の各CAR-Tと、５×１０４細胞の抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９またはＲａｊｉ細胞）とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９）は、前記実施例１０（４）と同様にして調製した。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記共培養後、各CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb（clone：FN50）およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、ＮＧＦＲ＋細胞について、ＣＤ６９の平均蛍光強度を測定した。ポジティブコントロールは、前記実施例１０（６）で得られたclone18LH CAR-Tおよびclone18HL CAR-Tを用いた以外は、同様に実施した。また、コントロール１は、ＣＤ１９をコードする核酸を導入していないＫ５６２細胞を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。そして、共培養前のＣＤ６９の平均蛍光強度を基準として、各サンプルのＣＤ６９の発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図３０に示す。
図３０は、ＣＤ６９の発現量の変化を示すグラフである。図３０において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＣＤ６９の発現上昇の割合を示す。図３０に示すように、コントロール２では、ＣＤ６９の発現上昇はほとんど生じなかった。他方、clon19LH CAR-Tおよびclon19HL CAR-T（ポジティブコントロール）は、ＡＰＣ−ＣＤ１９（K562/CD19）またはＲａｊｉ細胞（Raji）で刺激すると、コントロール１（K562）で刺激した場合と比較して、ＣＤ６９の発現が上昇し、ＣＤ１９に結合して活性化していることが確認できた。また、L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T、またはK10-18H CAR-Tは、ＡＰＣ−ＣＤ１９（K562/CD19）またはＲａｊｉ細胞（Raji）で刺激すると、コントロール１（K562）で刺激した場合と比較して、ＣＤ６９の発現が上昇し、ＣＤ１９に結合して活性化した。また、各CAR-TのＣＤ６９の発現上昇率は、大きく異なることから、ＣＤ１９に対する特異性が異なるｓｃＦｖがスクリーニングできていることがわかった。
（８）第１の候補ｓｃＦｖの親和性
つぎに、前記実施例１０（６）で得られたL4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、およびK9-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tが、前記標的抗原との親和性の違いを検討した。各CAR-Tについて、所定濃度（１．２５、２．５、５、１０、２０、または４０μｇ／ｍＬ）のＰＥ標識ＣＤ１９ダイマーで染色後、V450標識 anti-human NGFR mAbで染色した以外は、前記実施例１０（６）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析した。そして、ＣＤ１９ダイマーの各濃度における、ＣＤ１９ダイマー陽性細胞の割合を算出後、４０μｇ／ｍＬのＣＤ１９ダイマーで染色した際のＣＤ１９ダイマー陽性細胞の割合を基準として、各ＣＤ１９ダイマーで染色した際のＣＤ１９ダイマー陽性細胞の相対割合を算出した。この結果を、図３１に示す。
図３１は、ＣＤ１９ダイマー陽性細胞の相対割合を示すグラフである。図３１において、横軸は、ＣＤ１９ダイマーの濃度を示し、縦軸は、ＣＤ１９ダイマー陽性細胞の相対割合を示す。図３１に示すように、各CAR-Tは、ＣＤ１９ダイマーの濃度依存的にＣＤ６９陽性細胞の割合が増加した。また、各CAR-Tは、様々な染色強度を示すことから、これらのCAR-TにおけるｓｃＦｖのＣＤ１９ダイマーに対する親和性は異なることがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合する異なる親和性を有するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（９）第１の候補ｓｃＦｖの応答性
つぎに、前記（６）で得られたL4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、およびK9-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tが、前記標的抗原を発現する細胞に対する応答性の違いを検討した。具体的には、２×１０５細胞の各CAR-Tと、５×１０４細胞の抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９）とＫ５６２細胞との混合細胞とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記混合細胞におけるＡＰＣ−ＣＤ１９（Ａ）とＫ５６２（Ｋ）との比率（Ａ：Ｋ）は、所定比率（０：１００、６．２５：９３．７５、１２．５：８７．５、５０：５０、１００：０）とした。前記共培養後、各CAR-Tを回収し、FITC標識anti-human CD69 mAb（clone：FN50）およびV450標識anti-human NGFR mAbで染色した。前記染色後の各CAR-Tについて、前記フローサイトメーターを用いて、ＮＧＦＲ＋細胞について、ＣＤ６９陽性細胞の割合を測定した。比率（Ａ：Ｋ）＝１００：０におけるＣＤ６９陽性細胞の割合を基準として、各比率（Ａ：Ｋ）で培養した際のＣＤ６９陽性細胞の相対割合（％ Maximal responses）を算出した。また、これらの結果を図３２に示す。
図３２は、ＣＤ６９陽性細胞の相対割合を示すグラフである。図３２において、横軸は、比率（Ａ：Ｋ）を示し、縦軸は、ＣＤ６９陽性細胞の相対割合（％ Maximal responses）を示す。図３２に示すように、各CAR-Tは、ＡＰＣ−ＣＤ１９（Ａ）の比率に比例してＣＤ６９陽性細胞の割合が増加した。また、各CAR-Tは、ＡＰＣ−ＣＤ１９に対して様々に反応性を示すことから、これらのCAR-TにおけるｓｃＦｖの標的細胞に対する親和性は異なることがわかった。すなわち、本発明の第１のスクリーニング方法によれば、標的抗原に結合する異なる親和性を有するｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
（１０）第１の候補ｓｃＦｖの機能
つぎに、前記（６）で得られたL4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、およびK9-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tが、前記標的抗原との結合により、サイトカイン産生するかを検討した。具体的には、３×１０５細胞の各CAR-Tと、５×１０４細胞の抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９またはＲａｊｉ細胞）とを各ウェル（９６ウェルプレート）に播種後、５時間共培養した。前記抗原提示細胞（ＡＰＣ−ＣＤ１９）は、前記実施例１０（４）と同様にして調製した。また、前記共培養の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。前記培養後、５μｍｏｌ／ＬとなるようにＢＦＡを添加し、さらに５時間培養した。そして、培養後の細胞を、１％PFAで固定後、細胞膜の透過処理を行った。さらに、APC標識anti-human IL-2 mAb（clone：MQ1-17H12）、PE標識anti-human TNFα mAb（clone：Mab11）、PC7標識anti-human IFN-γ mAb（clone：B27）、FITC標識anti-human CD4 mAb (clone：OKT4)、PC5標識anti-human CD8a mAb (clone：B9.11)、およびV450標識anti-human NGFR mAb（clone：C40-1457）で染色した。前記染色後の細胞について、前記フローサイトメーターで測定した。そして、サイトカイン発現の割合を算出した。ポジティブコントロールは、前記実施例１０（６）で得られたclone18LH CAR-Tを用いた以外は、同様に実施した。コントロール１は、ＣＤ１９をコードする核酸を導入していないＫ５６２細胞を用いた以外は、同様にして実施した。コントロール２は、各CARをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入しなかった以外は、同様にして実施した。これらの結果を図３３に示す。
図３３は、サイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。図３３において、横軸は、ＣＡＲ−Ｔの種類を示し、縦軸は、各サイトカインの産生細胞の割合を示す。また、図３３において、上段は、ＣＤ８陽性ＣＡＲ−Ｔの結果を示し、下段は、ＣＤ４陽性ＣＡＲ−Ｔの結果を示す。図３３に示すように、標的抗原であるＣＤ１９を発現するＡＰＣ−ＣＤ１９またはＲａｊｉ細胞が存在する場合、標的抗原を発現しないコントロール１（K562）またはコントロール２と比較して、各ＣＡＲ−ＴのＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生細胞の割合の上昇が生じ、各ＣＡＲ−Ｔが活性化していることがわかった。これらの結果から、本発明のスクリーニング方法によれば、ＣＤ１９に結合し、かつＣＡＲ−Ｔにおいてエフェクター機能を誘導可能なｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
［実施例１１］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を発揮することを確認した。
前記実施例１０と同様にして、L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tとを調製した。
ＳＬＲを発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ／ＳＬＲ細胞）は、Ｋ５６２細胞に代えて、Ｒａｊｉ細胞を用い、ヒトＣＤ１９をコードするポリヌクレオチドに代えて、ＳＬＲをコードするポリヌクレオチドを用いた以外は、前記実施例１（４）と同様にして、調製した。なお、ＳＬＲは細胞内タンパク質であるため、ＳＬＲをコードするポリヌクレオチドには、切断型のＮＧＦＲ遺伝子（ΔNGFR）をコードする核酸を、フーリン（furin）切断部位（RAKR：配列番号１７２）、スペーサー配列（SGSG：配列番号１７３）およびコドン最適化Ｐ２Ａ配列（ATNFSLLKQAGDVEENPGP：配列番号１７４）をコードするポリヌクレオチドを介して、連結した。
ＳＬＲタンパク質（SLR/furin-sgsg-p2a/dNGFR、配列番号３１１）
MEEENIVNGDRPRDLVFPGTAGLQLYQSLYKYSYITDGIIDAHTNEVISYAQIFETSCRLAVSLEKYGLDHNNVVAICSENNIHFFGPLIAALYQGIPMATSNDMYTEREMIGHLNISKPCLMFCSKKSLPFILKVQKHLDFLKKVIVIDSMYDINGVECVFSFVSRYTDHAFDPVKFNPKEFDPLERTALIMTSSGTTGLPKGVVISHRSITIRFVHSSDPIYGTRIAPDTSILAIAPFHHAFGLFTALAYFPVGLKIVMVKKFEGEFFLKTIQNYKIASIVVPPPIMVYLAKSPLVDEYNLSSLTEIACGGSPLGRDIADKVAKRLKVHGILQGYGLTETCSALILSPNDRELKKGAIGTPMPYVQVKVIDINTGKALGPREKGEICFKSQMLMKGYHNNPQATRDALDKDGWLHTGDLGYYDEDRFIYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELENLLLQHPNISDAGVIGIPDEFAGQLPSACVVLEPGKTMTEKEVQDYIAELVTTTKHLRGGVVFIDSIPKGPTGKLMRNELRAIFAREQAKSKLRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNS
ＳＬＲをコードするポリヌクレオチド（配列番号３１２）
5'-ATGGAAGAAGAGAACATCGTGAATGGCGATCGCCCTCGGGATCTGGTGTTCCCTGGCACAGCCGGCCTGCAGCTGTATCAGTCCCTGTATAAATACTCTTACATCACCGACGGAATCATCGACGCCCACACCAACGAGGTGATCTCCTATGCCCAGATTTTCGAAACAAGTTGCCGCCTGGCCGTGAGCCTGGAGAAGTATGGCCTGGATCACAACAACGTGGTGGCCATTTGCAGCGAGAACAACATCCACTTCTTCGGCCCTCTGATCGCTGCCCTATACCAGGGGATTCCAATGGCCACATCCAACGATATGTACACCGAGAGGGAGATGATCGGCCACCTGAACATCTCCAAGCCATGTCTGATGTTCTGTTCCAAGAAGTCCCTGCCATTCATCCTGAAGGTGCAGAAGCACCTGGACTTTCTCAAGAAGGTGATCGTGATCGACAGCATGTACGACATCAACGGCGTGGAGTGCGTGTTCAGTTTCGTGTCCCGGTACACCGATCATGCGTTCGATCCAGTGAAGTTCAACCCTAAAGAGTTTGATCCCCTGGAGAGAACCGCGCTGATCATGACATCCTCTGGAACAACCGGCCTGCCTAAGGGCGTGGTGATCAGCCACAGGAGCATCACCATCAGATTCGTCCACAGCAGCGATCCCATCTACGGCACCCGCATCGCCCCAGATACATCCATCCTGGCCATCGCCCCTTTCCACCACGCCTTCGGACTGTTTACCGCCCTGGCTTACTTTCCAGTGGGCCTGAAGATCGTGATGGTGAAAAAGTTTGAGGGCGAGTTCTTCCTGAAGACCATCCAGAACTACAAGATCGCTTCTATCGTGGTGCCTCCTCCAATCATGGTGTATCTGGCCAAGAGCCCTCTGGTGGATGAGTACAATCTGTCCAGCCTGACAGAGATCGCCTGTGGCGGCTCCCCTCTGGGCAGAGACATCGCCGACAAGGTGGCCAAGAGACTGAAGGTCCACGGCATCCTGCAGGGCTATGGCCTGACCGAGACCTGTAGCGCCCTGATCCTGAGCCCCAACGATAGAGAGCTGAAGAAGGGCGCCATCGGCACCCCTATGCCCTATGTCCAGGTGAAGGTGATTGACATCAACACCGGCAAAGCCCTGGGACCAAGAGAGAAGGGCGAGATTTGCTTCAAGAGCCAGATGCTGATGAAGGGCTACCACAACAACCCACAGGCCACCAGGGATGCCCTGGACAAGGACGGGTGGCTGCACACCGGCGATCTGGGCTACTACGACGAGGACAGATTCATCTATGTGGTGGATCGGCTGAAAGAACTCATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAGCTGGAGAACTTGCTTCTGCAGCACCCTAACATCTCTGATGCCGGCGTCATCGGCATCCCAGACGAGTTTGCCGGCCAGCTGCCTTCCGCCTGTGTCGTGCTGGAGCCTGGCAAGACCATGACCGAGAAGGAGGTGCAGGATTATATCGCCGAGCTGGTGACCACCACCAAGCACCTGCGGGGCGGCGTGGTGTTCATCGACAGCATTCCGAAAGGCCCAACAGGCAAGCTGATGAGAAACGAGCTGAGGGCCATCTTTGCCCGCGAGCAGGCCAAGTCCAAGCTGAGGGCCAAGCGGTCCGGATCCGGAGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCATGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGCTGA-3'
５週齢のＮＯＧマウス（NOD/Shi-scid,IL-2RγKO・Jicマウス、In-Vivo Science社から購入）に１．５Ｇｙのγ線を照射した。つぎに、図３４（Ａ）に示すように、前記ＮＯＧマウスに、５×１０５個のＲａｊｉ／ＳＬＲ細胞を静脈投与し、移植した。前記移植後を０日目として、５日目に、２×１０６個の各CAR-Tを静脈投与した。そして、前記移植後６、９、１３、および１７日目における腫瘍の大きさをイメージアナライザー（AEQUORIA-2D/8600 bioluminescence imaging assays、Hamamatsu Photonics社製）により測定した。コントロールは、前記CARを導入していないＴ細胞を投与した以外は、同様にして測定した。なお、各群３匹で実施した。これらの結果を図３４に示す。
図３４は、生体における抗腫瘍活性に関する図である。図３４において、（Ａ）は、プロトコルを示し、（Ｂ）は、イメージアナライザーで測定された写真であり、（Ｃ）は、腫瘍の大きさを示すグラフである。図３４（Ｂ）において、白線で囲った領域は、腫瘍が存在する領域である。図３４（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、前記CAR-T投与群は、コントロールと比較して、腫瘍の大きさが縮小した。また、前記L17-18H CAR-TまたはK5-18H CAR-T投与群は、前記clone18LH CAR-T投与群と比較して、腫瘍が有意に縮小した。これらの結果から、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を発揮することがわかった。また、本発明のスクリーニング方法によれば、鋳型とするｓｃＦｖと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、優れたエフェクター機能を誘導可能なｓｃＦｖをスクリーニングできることがわかった。
［実施例１２］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法の第１の選抜工程および第２の選抜工程において、間接的な評価方法に基づく選抜、すなわち、標的抗原とＣＡＲとの結合により生じる候補免疫細胞の活性化指標の評価に基づく選抜により、ＣＡ−Ｔ細胞を機能的に活性化しうるｓｃＦｖを含むＣＡＲをスクリーニング出来ることを確認した。
L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、L124-3M4E5、H73-3M4E5、H1-3M4E5、または3M4E5LH CAR-Tについて、実施例２（５）および（７）の結果から、テトラマー陽性細胞の割合が、陽性細胞の最大割合の半分となるテトラマー濃度（ＥＣ５０）を構造的親和性の指標値として算出した。前記構造的親和性は、標的抗原に対するＣＡＲ（ｓｃＦｖ）の特異性ということもできる。また、L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、L124-3M4E5、H73-3M4E5、H1-3M4E5、または3M4E5LH CAR-Tについて、実施例２（６）および（８）の結果から、ＣＤ６９の発現上昇率が、ＣＤ６９の最大発現上昇率の半分となるテトラマー濃度（ＥＣ）を機能的親和性の指標値として算出した。前記機能的親和性は、標的抗原に結合した際にＣＡＲがＴ細胞を活性化させる能力を意味する。そして、L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、L124-3M4E5、H73-3M4E5、H1-3M4E5、または3M4E5LH CAR-Tについて、構造的親和性の指標値と、機能的親和性の指標値との相関性を検討した。この結果を図３５に示す。
図３５は、構造的親和性の指標値と、機能的親和性の指標値との関係性を示すグラフである。図３５において、横軸は、構造的親和性の指標値（Structural avidity）を示し、縦軸は、機能的親和性の指標値（Functional avidity）を示す。図３５に示すように、構造的親和性の指標値および機能的親和性の指標値が高い領域では、正の相関性が見られるものの、構造的親和性の指標値が低くなると、構造的親和性の指標値と機能的親和性の指標値との相関性は見られなくなった。これらの結果から、標的抗原とＣＡＲとの結合により生じる候補免疫細胞の活性化指標の評価に基づき、候補ｓｃＦｖを選抜することで、標的抗原とＣＡＲとの結合により、候補ｓｃＦｖを選抜する場合と比較して、ＣＡＲ−Ｔ細胞を機能的に活性化しうるｓｃＦｖを含むＣＡＲをスクリーニング出来ることがわかった。
［実施例１３］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を発揮することを確認した。
前記実施例１０と同様にして、L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tとを調製した。
つぎに、５．０×１０３個の標的細胞であるＡＰＣ−ＣＤ１９（K562/CD19）またはＲａｊｉ細胞（Raji）について、クロム５１（５１Ｃｒ）存在下で、１．５時間培養することにより、クロム５１でラベルした。つぎに、前記L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、またはclone18LH CAR-T（Ｅ）と、前記クロム５１でラベルしたターゲット細胞（Ｔ）について、Ｅ：Ｔが、２０：１、１０：１、５：１または２．５：１となるように、前記標的細胞を培養しているウェルに、各ＣＡＲ−Ｔ細胞を添加した。そして、５〜６時間培養後、上清を回収し、１分間あたりの放射線の計数率（ＣＰＭ：count per minute）を、AccuFLEXg7010（HITACHI社製）を用いて測定した。また、コントロール１は、ＣＡＲ−Ｔ細胞に代えて、ＮＧＦＲの発現ベクターを導入したＴ細胞を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記標的細胞として、Ｋ５６２細胞を用いた以外は同様にして測定した。そして、下記式（１）に基づき、細胞傷害性（特異的融解の割合）を測定した。これらの結果を、図３６に示す。

Ｋ＝（ＬＥ−ＬＳ）／（ＬＭａｘ−ＬＳ）×１００（％） ・・・（１）
Ｋ：細胞傷害性
ＬＥ：ＣＰＭの測定値
ＬＳ：ターゲット細胞のみの場合のＣＰＭの測定値
ＬＭａｘ：ターゲット細胞のみのウェルに0.2%Triton-X含有PBSを添加した場合のＣＰＭの測定値
図３６は、細胞傷害性を示すグラフである。図３６において、横軸はＥ／Ｔ比を示し、縦軸は、細胞傷害性を示す。図３６に示すように、標的抗原であるＣＤ１９を発現しないＫ５６２を標的細胞として用いた場合（コントロール２）、特異的な細胞傷害は生じず、各群における細胞傷害性は同等であった。また、ＣＤ１９特異的なＣＡＲを発現してないＴ細胞を用いた場合（コントロール１）、いずれの標的細胞に対しても特異的な細胞傷害は生じなかった。他方、標的抗原であるＣＤ１９を発現するＫ５６２およびＲａｊｉ細胞をターゲット細胞として用いた場合、L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、またはclone18LH CAR-T添加群では、エフェクターの量比依存的に細胞傷害性が増大した。また、L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、およびclone18LH CAR-T添加群において、細胞傷害性に大きな違いはなかった。これらの結果から、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害活性を発揮し、かつL17-18H CAR-TおよびK5-18H CAR-Tは、clone18LH CAR-Tと同等の細胞傷害活性を示すことがわかった。
［実施例１４］
本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を発揮することを確認した。
前記実施例１０と同様にして、L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tとを調製した。つぎに、実施例１１と同様にして、ＳＬＲを発現するＲａｊｉ細胞を調製した。
５週齢のＮＯＧマウス（NOD/Shi-scid,IL-2RγKO・Jicマウス、In-Vivo Science社から購入）に１．５Ｇｙのγ線を照射した。つぎに、図３７（Ａ）および図３８（Ａ）に示すように、前記ＮＯＧマウスに、５×１０５個のＲａｊｉ／ＳＬＲ細胞を静脈投与し、移植した。前記移植後を０日目として、５日目または７日目に、２×１０６個の各CAR-Tを静脈投与した。前記移植後、経時的に腫瘍の大きさを前記イメージアナライザーにより測定し、かつマウスの生存率を測定した。なお、各群５匹で実施した。コントロールは、ＣＡＲ−Ｔ細胞に代えて、ＮＧＦＲの発現ベクターを導入したＴ細胞を用いた以外は同様にして実施した。これらの結果を図３７および図３８に示す。
図３７および図３８は、生体における全生存率に関する図である。図３７および図３８において、（Ａ）は、プロトコルを示し、（Ｂ）は、全生存率を示すKaplan-Meier曲線である。図３７（Ｂ）に示すように、腫瘍が小さい時期、すなわち、初期がんの状態においては、L17-18H CAR-TまたはK5-18H CAR-Tの投与群と、clone18LH CAR-Tの投与群との間で、全生存率に大きな違いはなく、抗腫瘍効果はほぼ同等であった。また、図には示していないが、イメージアナライザーによる画像分析においても同様の結果が得られた。他方、図３８（Ｂ）に示すように、腫瘍が十分に浸潤している時期、すなわち、腫瘍が進行している状態においては、clone18LH CAR-Tの投与群と比較して、L17-18H CAR-TまたはK5-18H CAR-Tの投与群では、全生存率が大きく向上し、L17-18H CAR-T投与群では、１００％の生存率であった。また、図には示していないが、イメージアナライザーによる画像分析においても同様の結果が得られた。
これらの結果から、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を発揮することがわかった。また、本発明のＣＡＲライブラリを用いた本発明のスクリーニング方法により得られたｓｃＦｖを含むＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、進行している腫瘍モデルにおいても十分な治療効果を奏することがわかった。
［実施例１５］
本発明のスクリーニング方法により、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果に優れるｓｃＦｖを取得できるメカニズムを検討した。
（１）細胞増殖能の比較
前記実施例１０と同様にして、L17-18H CAR-Tと、clone18LH CAR-Tとを調製した。つぎに、２０Ｇｙでγ線照射したＡＰＣ−ＣＤ１９（K562/CD19）またはＲａｊｉ細胞（Raji）（Ｔ）と、L17-18H CAR-Tまたはclone18LH CAR-T（Ｅ）とについて、Ｅ：Ｔが、１：１または１０：１となるように、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を培養しているウェルに、標的細胞を添加した。前記標的細胞添加時を基準として、５日間培養した。前記培養では、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を培地に添加した。さらに、培養５日目において、培養開始時と同じ条件で、各ＣＡＲ−Ｔ細胞を再刺激した。そして、培養開始時から所定時（０、３、５、７または１０日）における細胞数をカウントし、培養開始時の細胞数を１とした際の細胞数比を増殖比として算出した。これらの結果を図３９に示す。
図３９は、細胞の増殖比を示すグラフである。図３９において、横軸は、培養開始時からの時間を示し、縦軸は、増殖比を示す。図３９に示すように、いずれのＥ：Ｔ比においても、本発明のスクリーニング方法で得られるＣＡＲは、Ｔ細胞の増殖誘導能が高かった。また、Ｅ：Ｔ＝１：１においても、L17-18H CAR-Tは、clone18LH CAR-Tと比較して、優れた増殖比を示すことから、L17-18H CAR-Tは、標的抗原が多い環境、例えば、腫瘍が進行し、腫瘍細胞が多い状況においても増殖性に優れていることがわかった。
（２）サイトカイン産生能の比較
前記実施例１５（１）の培養１０日目のL17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tのサイトカイン産生能について検討した。具体的には、３．０×１０５細胞のＣＡＲ−Ｔ細胞と、５．０×１０４個の標的細胞（Ｋ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＡＰＣ−ＣＤ１９（K562/CD19）とを共培養した。２時間培養後、５μｇ／ｍＬとなるように、Brefeldin A（BFA）を添加し、さらに、１４〜１８時間培養した。そして、ＣＡＲ−Ｔ細胞を回収後、１％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定後、細胞膜の透過処理を行い、ＰＥ標識抗ヒトＴＮＦ−α抗体（clone MAb11）、ＡＰＣ標識抗ヒトＩＬ−２抗体（clone MQ1-17H12）およびＰＣ７標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（clone B27）と、ＰＣ５標識抗ヒトＣＤ８抗体（clone B9.11）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（clone OKT4）およびＶ４５０標識anti-human NGFR（clone：C40-1457）で染色した。前記染色後のＣＡＲ−Ｔ細胞について、前記フローサイトメーターで測定し、各サイトカインを産生している細胞の割合を算出した。これらの結果を図４０に示す。
図４０は、サイトカイン産生能を示すグラフである。図４０において、横軸は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の種類を示し、縦軸は、サイトカイン産生細胞の割合を示し、図の上部は、１０日目までの培養条件を示す。図４０に示すように、L17-18H CAR-Tは、clone18LH CAR-Tと比較して、いずれのサイトカインについても、サイトカイン産生細胞の割合がやや低かった、すなわち、サイトカイン産生能がやや弱いことがわかった。
（３）細胞傷害活性の比較
前記実施例１５（１）の培養１０日目のL17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tの細胞傷害活性について検討した。つぎに、５．０×１０３個の標的細胞であるＡＰＣ−ＣＤ１９（K562/CD19）またはＲａｊｉ細胞（Raji）およびＫ５６２細胞について、クロム５１（５１Ｃｒ）存在下で、１．５時間培養することにより、クロム５１でラベルした。
つぎに、前記L17-18H CAR-Tまたはclone18LH CAR-T（Ｅ）と、前記クロム５１でラベルしたターゲット細胞（Ｔ）について、Ｅ：Ｔが、１０：１、５：１または２．５：１となるように、前記標的細胞を培養しているウェルに、各ＣＡＲ−Ｔ細胞を添加した。そして、５〜６時間培養後、上清を回収し、１分間あたりの放射線の計数率（ＣＰＭ：count per minute）を、AccuFLEXg7010を用いて測定した。そして、前記式（１）に基づき、細胞傷害性（特異的融解の割合）を測定した。これらの結果を、図４１に示す。
図４１は、細胞傷害活性を示すグラフである。図４１において、横軸は、Ｅ：Ｔ比を示し、縦軸は、細胞傷害活性を示し、図の上部は、１０日目までの培養条件を示す。図４１に示すように、L17-18H CAR-Tは、clone18LH CAR-Tと同等の細胞傷害活性を示すことが分かった。
（４）Ｔ細胞の疲弊の比較
４人の異なるドナー（ヒト）由来のＴ細胞を用いた以外は、前記実施例１０と同様にして、L17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tを調製した。得られたＣＡＲ−Ｔ細胞について、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＣＦＳＥを含むＰＢＳ内で、１５分間３７℃でインキュベートし、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識した。つぎに、２０Ｇｙでγ線照射したＲａｊｉ細胞（Raji）（Ｔ）と、L17-18H CAR-Tまたはclone18LH CAR-T（Ｅ）とについて、Ｅ：Ｔが、１：１または５：１となるように、それぞれをウェルに添加した。前記標的細胞添加時を基準として、３日間培養した。
前記培養後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を回収し、PE標識抗PD-1抗体（clone EH12.2H7）、APC標識CD45RA抗体（clone HI100）、PC7標識CCR7抗体（clone G043H7）、BV421標識CD62L抗体（clone DREG-56）、PC5標識CD8抗体（clone B9.11）、APC-Cy7標識CD4抗体（clone RPA-T4）で染色後、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。得られたCFSEの蛍光強度のＭＦＩから、下記式（２）に基づき、分裂したＣＡＲ−Ｔ細胞の割合を算出した。また、共培養前後のＣＤ８陽性ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＤ４陽性ＣＡＲ−Ｔ細胞中のＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の分布を、図４２に示す。さらに、各ＣＡＲ−Ｔ細胞の分裂割合と、共培養前後のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の割合と、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性と、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陰性ＰＤ１陽性細胞の割合とを、図４３に示す。

Proliferation（%）=（control MFI-sample MFI)/control MFI×100 ・・・（２）
control MFI：K562細胞株とE:T＝1:1の条件で共培養したＣＡＲ−Ｔ細胞のＭＦＩ
sample MFI：各ＣＡＲ−Ｔ細胞のＭＦＩ
図４２は、共培養前後のＣＤ８陽性ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＤ４陽性ＣＡＲ−Ｔ細胞中のＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の分布を示すドットプロットである。また、図４３は、各ＣＡＲ−Ｔ細胞の分裂割合と、共培養前後のＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性細胞の割合と、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性ＣＣＲ７陽性と、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陰性ＰＤ１陽性細胞の割合とを示すグラフである。図４２および図４３に示すように、共培養前のL17-18H CAR-Tおよびclone18LH CAR-Tの形質は概ね同じであった。他方で、ｉｎ ｖｉｖｏ環境を模倣していると考えられる腫瘍が多い環境下（Raji/CAR-T E/T 1:1）で刺激した場合、L17-18H CAR-Tは、clone18LH CAR-Tと比較して、再現性をもって優れた増幅性を示した。さらに、同様の環境下において、L17-18H CAR-Tは、clone18LH CAR-Tと比較して、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋の若いＴ細胞形質が保持されやすいこと、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋のセントラルメモリーＴ細胞の割合が増加すること、同時にＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−ＰＤ１＋の疲弊したＴ細胞の割合が低下することが明らかとなった。
以上のことから、本発明の第１のスクリーニング方法では、以下のようなメカニズムで、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果に優れるｓｃＦｖを取得できると推定された。なお、前記推定により、本発明は何ら制限されない。本発明のスクリーニング方法では、図４４に示すように、ＣＡＲライブラリを導入したＴ細胞等の免疫細胞（ＣＡＲライブラリ細胞）について、第１の接触工程または第２の接触工程において、標的抗原と接触させる。これにより、前記ＣＡＲライブラリ細胞において、標的抗原に特異的なＣＡＲを発現する細胞が増殖する。ただし、前記第１の接触工程および第２の接触工程において、個々のｓｃＦｖのアミノ酸配列の異なるＣＡＲライブラリ細胞からみると、E/T ratioは極めて低い状況となる（図４４ Step1）。この結果、L17-18H CAR-Tのような低いE/T ratioにおいても増幅しやすい特徴を持つＣＡＲライブラリ細胞が、前記第１の接触工程および第２の接触工程において、最終的に濃縮されることになる（図４４ Step2）。そして、このような特徴を持つＣＡＲライブラリ細胞が富化された状態で、前記第１の選抜工程および第２の選抜工程を実施するため、相対的に、低いE/T ratioにおいても増幅しやすく、かつ増殖し続けても疲弊しにくい特徴を持つＣＡＲライブラリ細胞由来のｓｃＦｖが選抜されることになる（図４４ Step3）。他方、L17-18H CAR-Tに示されるように、低いE/T ratioにおいて増幅可能なＣＡＲライブラリ細胞は、通常の細胞傷害活性を示す。したがって、本発明のスクリーニング方法によれば、優れた増殖能を示し、かつ細胞傷害活性を示すｓｃＦｖを備えるＣＡＲライブラリ細胞が選抜されるため、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても高い抗腫瘍活性を付与可能なｓｃＦｖを備えるＣＡＲをスクリーニングできると推定された。なお、上記メカニズムは、ＣＡＲの基本骨格を変えても同様に生じるため、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ以外の細胞内ドメイン等を有するＣＡＲを用いてスクリーニングを行なっても、同様にｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果に優れるｓｃＦｖを取得できると推定される。
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１９年２月４日に出願された日本出願特願２０１９−０１８２６９、２０１９年５月１８日に出願された日本出願特願２０１９−０９４１８８、２０１９年７月３０日に出願された日本出願特願２０１９−１４０１２１、および２０１９年１０月４日に出願された日本出願特願２０１９−１８４０７１を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、
前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす、ＣＡＲライブラリ；
条件１：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（付記２）
前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、付記１記載のＣＡＲライブラリ。
（付記３）
前記第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、付記１または２記載のＣＡＲライブラリ。
（付記４）
前記第１のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、付記１から３のいずれかに記載のＣＡＲライブラリ。
（付記５）
付記１から４のいずれかに記載のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第１の発現工程と、
前記第１の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む、ｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記６）
前記第１の候補ｓｃＦｖに基づき、第２のＣＡＲライブラリを調製する調製工程を含み、
前記第２のＣＡＲライブラリは、第２のＣＡＲをコードする核酸を含み、
前記第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第２の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含み、
前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、
前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、下記条件３または条件４を満たし、
さらに、前記第２のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第２の発現工程と、
前記第２の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第２の接触工程と、
前記第２の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第２のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第２の候補ｓｃＦｖとして第２の選抜工程とを含む、付記５記載の製造方法（スクリーニング方法）；
条件３：
前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件４：
前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（付記７）
前記第２の接触工程を複数回実施する、付記６記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記８）
前記第２の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するｓｃＦｖを、前記第２の候補ｓｃＦｖとして選抜する、付記６または７記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記９）
前記第２のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、付記６から８のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記１０）
前記第１の接触工程を複数回実施する、付記５から９のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記１１）
前記第１の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
検出された免疫細胞に発現するｓｃＦｖを、前記第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する、付記５から１０のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記１２）
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、付記５から１１のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記１３）
下記（Ｈ）の重鎖可変領域と、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域とを含む、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５の複合体に対する抗体またはその抗原結合断片。
（Ｈ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
（H1）下記（H1-1）、（H1-2）または（H1-3）のアミノ酸配列
（H1-1）前記表１ＡのＣＤＲＨ１のいずれかのアミノ酸配列
（H1-2）（H1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-3）（H1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2）下記（H2-1）、（H2-2）または（H2-3）のアミノ酸配列
（H2-1）前記表１ＡのＣＤＲＨ２のいずれかのアミノ酸配列
（H2-2）（H2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-3）（H2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3）下記（H3-1）、（H3-2）または（H3-3）のアミノ酸配列
（H3-1）前記表１ＡのＣＤＲＨ３のいずれかのアミノ酸配列
（H3-2）（H3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-3）（H3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（Ｌ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
（L1）下記（L1-1）、（L1-2）または（L1-3）のアミノ酸配列
（L1-1）前記表１ＢのＣＤＲＬ１のいずれかのアミノ酸配列
（L1-2）（L1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-3）（L1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2）下記（L2-1）、（L2-2）または（L2-3）のアミノ酸配列
（L2-1）前記表１ＢのＣＤＲＬ２のいずれかのアミノ酸配列
（L2-2）（L2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-3）（L2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3）下記（L3-1）、（L3-2）または（L3-3）のアミノ酸配列
（L3-1）前記表１ＢのＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列
（L3-2）（L3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-3）（L3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（付記１４）
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組合せが、前記表２のいずれかの組合せである、付記１３記載の抗体またはその抗原結合断片。
（付記１５）
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記抗原結合ドメインは、付記１３または１４記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。
（付記１６）
前記抗原結合断片は、一本鎖抗体である、付記１５記載のキメラ抗原受容体。
（付記１７）
付記１５または１６記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
（付記１８）
付記１５または１６記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。
（付記１９）
前記細胞は、Ｔ細胞を含む、付記１８記載の細胞。
（付記２０）
付記１７記載の核酸を細胞に導入する導入工程を含む、細胞の製造方法。
（付記２１）
前記細胞は、Ｔ細胞を含む、付記２０記載の細胞の製造方法。
（付記２２）
第１の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）をコードする核酸を含み、
前記第１のＢｓＡｂは、第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、第１の標的抗原に結合する第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第２の抗原結合ドメインは、第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含み、
前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、
前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たし、
前記第１の標的抗原または前記第２の標的抗原は、免疫細胞活性化受容体である、ＢｓＡｂライブラリ；
条件１：
前記第２の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件２：
前記第２の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第２の標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（付記２３）
前記第１のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、付記２２記載のＢｓＡｂライブラリ。
（付記２４）
前記免疫細胞活性化受容体は、ＣＤ３である、付記２２または２３記載のＢｓＡｂライブラリ。
（付記２５）
付記２２から２４のいずれかに記載のＢｓＡｂライブラリから第１のＢｓＡｂを準備する第１の準備工程と、
前記第１の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第１のＢｓＡｂと、前記第２の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させ、
前記第２の標的抗原が免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第１のＢｓＡｂと、前記第１の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる第１の接触工程と、
前記第１の接触工程において、前記第２の標的抗原と結合した第１のＢｓＡｂの第２のｓｃＦｖを、前記第２の標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む、ｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記２６）
前記第１の候補ｓｃＦｖに基づき、第２のＢｓＡｂライブラリを調製する調製工程を含み、
前記第２のＢｓＡｂライブラリは、前記第２のＢｓＡｂをコードする核酸を含み、
前記第２のＢｓＡｂは、第３の抗原結合ドメインと、第４の抗原結合ドメインとを含み、
前記第３の抗原結合ドメインは、前記第１の標的抗原に結合する第３のｓｃＦｖを含み、
前記第４の抗原結合ドメインは、前記第２の標的抗原への結合をスクリーニングする第４のｓｃＦｖを含み、
前記第４のｓｃＦｖは、第４の重鎖可変領域と、第４の軽鎖可変領域とを含み、
前記第４の重鎖可変領域および前記第４の軽鎖可変領域は、下記条件３または条件４を満たし、
さらに、前記第２のＢｓＡｂライブラリから第２のＢｓＡｂを準備する第２の準備工程と、
前記第１の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第２のＢｓＡｂと、前記第２の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させ、
前記第２の標的抗原が前記免疫細胞活性化受容体の場合、
前記第２のＢｓＡｂと、前記第１の標的抗原と、前記免疫細胞活性化受容体を発現可能な免疫細胞とを接触させる第２の接触工程と、
前記第２の接触工程において、前記第２の標的抗原と結合した第２のＢｓＡｂの第４のｓｃＦｖを、前記第２の標的抗原に結合する第２の候補ｓｃＦｖとして選抜する第２の選抜工程とを含む、付記２５記載のｓｃＦｖ製造方法（スクリーニング方法）；
条件３：
前記第１の準備工程におけるＢｓＡｂライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第１の候補ＢｓＡｂにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
条件４：
前記第１の準備工程におけるＢｓＡｂライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第４の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第１の候補ＢｓＡｂにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第４の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（付記２７）
前記第２の接触工程および前記第２の選抜工程を１セットとし、前記セットを複数回実施する、付記２６記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記２８）
前記第２の選抜工程において、前記免疫細胞の活性化分子の発現を検出し、
前記免疫細胞の活性化分子を誘導した第２のＢｓＡｂを、前記第２の候補ＢｓＡｂとして選抜する、付記２６または２７記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記２９）
前記第２のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、付記２５から２８のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記３０）
前記第１の接触工程および前記第１の選抜工程を１セットし、前記セットを複数回実施する、付記２５から２９のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記３１）
前記第１の選抜工程において、前記免疫細胞の活性化分子の発現を検出し、
前記免疫細胞の活性化分子を誘導した第１のＢｓＡｂを、前記第１の候補ＢｓＡｂとして選抜する、付記２５から３０のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記３２）
前記免疫細胞活性化受容体は、ＣＤ３である、付記２５から３１のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記３３）
前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、付記２５から３２のいずれかに記載のｓｃＦｖの製造方法（スクリーニング方法）。
（付記３４）
下記（Ｈ）の重鎖可変領域と、下記（Ｌ）の軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ１９に対する抗体またはその抗原結合断片。
（Ｈ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである重鎖可変領域
（H1）下記（H1-1）、（H1-2）または（H1-3）のアミノ酸配列
（H1-1）前記表３ＡのＣＤＲＨ１のいずれかのアミノ酸配列
（H1-2）（H1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-3）（H1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2）下記（H2-1）、（H2-2）または（H2-3）のアミノ酸配列
（H2-1）前記表３ＡのＣＤＲＨ２のいずれかのアミノ酸配列
（H2-2）（H2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-3）（H2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3）下記（H3-1）、（H3-2）または（H3-3）のアミノ酸配列
（H3-1）前記表３ＡのＣＤＲＨ３のいずれかのアミノ酸配列
（H3-2）（H3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-3）（H3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（Ｌ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである軽鎖可変領域
（L1）下記（L1-1）、（L1-2）または（L1-3）のアミノ酸配列
（L1-1）前記表３ＢのＣＤＲＬ１のいずれかのアミノ酸配列
（L1-2）（L1-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-3）（L1-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2）下記（L2-1）、（L2-2）または（L2-3）のアミノ酸配列
（L2-1）前記表３ＢのＣＤＲＬ２のいずれかのアミノ酸配列
（L2-2）（L2-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-3）（L2-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3）下記（L3-1）、（L3-2）または（L3-3）のアミノ酸配列
（L3-1）前記表３ＢのＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列
（L3-2）（L3-1）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-3）（L3-1）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（付記３５）
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組合せが、前記表２のいずれかの組合せである、付記３４記載の抗体またはその抗原結合断片。
（付記３６）
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記抗原結合ドメインは、付記３４または３５記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。
（付記３７）
前記抗原結合断片は、一本鎖抗体である、付記３６記載のキメラ抗原受容体。
（付記３８）
付記３６または３７記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
（付記３９）
付記３６または３７記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。
（付記４０）
前記細胞は、Ｔ細胞を含む、付記３９記載の細胞。
（付記４１）
付記３８記載の核酸を細胞に導入する導入工程を含む、細胞の製造方法。
（付記４２）
前記細胞は、Ｔ細胞を含む、付記４１記載の細胞の製造方法。
（付記４３）
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライブラリの発現細胞を動物に投与する第１の投与工程と、
前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する第１の採取工程とを含み、
前記第１のＣＡＲライブラリは、第１のＣＡＲをコードする核酸を含み、
前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングする第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす、ｓｃＦｖの製造方法：
（条件１）
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
（条件２）
前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（付記４４）
前記第１の投与工程において、複数種類の第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を投与する、付記４３記載の製造方法。
（付記４５）
前記第１の投与工程後、前記標的抗原を前記動物に投与する第１の刺激工程を含む、付記４３または４４記載の製造方法。
（付記４６）
前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を、前記標的抗原で再刺激する第１の再刺激工程を含む、付記４３から４５のいずれかに記載の製造方法。
（付記４７）
前記第１の投与工程に先立ち、標的抗原を発現する細胞を前記動物に導入し、前記標的抗原を発現する組織を形成させる第１の形成工程を含む、付記４３から４６のいずれかに記載の製造方法。
（付記４８）
発現する組織に集積した前記第１のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する、付記４３から４７のいずれかに記載の製造方法。
（付記４９）
前記第１のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、付記４３から４８のいずれかに記載の製造方法。
（付記５０）
第２のＣＡＲライブラリの発現細胞を動物に投与する第２の投与工程と、
前記動物において、標的抗原を発現する組織に集積した前記第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する第２の採取工程とを含み、
前記第２のＣＡＲライブラリは、第２のＣＡＲをコードする核酸を含み、
前記第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記第２の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングする第２のｓｃＦｖを含み、
前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、
前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、下記条件３または条件４を満たす、付記４３から４９のいずれかに記載の製造方法：
（条件３）
前記第１のＣＡＲライブラリが前記条件１を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞のｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
（条件４）
前記第１のＣＡＲライブラリが前記条件２を満たす場合、
前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞のｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
（付記５１）
前記第２の投与工程において、複数種類の第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を投与する、付記５０記載の製造方法。
（付記５２）
前記第２の投与工程後、前記標的抗原を前記動物に投与する第２の刺激工程を含む、付記５０または５１記載の製造方法。
（付記５３）
前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞を、前記標的抗原で再刺激する第１の再刺激工程を含む、付記５０から５２のいずれかに記載の製造方法。
（付記５４）
前記第２の投与工程に先立ち、標的抗原を発現する細胞を前記動物に導入し、前記標的抗原を発現する組織を形成させる第２の形成工程を含む、付記５０から５３のいずれかに記載の製造方法。
（付記５５）
前記第２の採取工程において、前記標的抗原を発現する組織を採取し、前記標的抗原を発現する組織に集積した前記第２のＣＡＲライブラリ発現細胞を、前記標的抗原特異的なＣＡＲを発現する細胞として採取する、付記５０から５４のいずれかに記載の製造方法。
（付記５６）
前記第２のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、付記５０から５５のいずれかに記載の製造方法。
（付記５７）
前記発現細胞は、Ｔ細胞である、付記４３から５６のいずれかに記載の製造方法。
（付記５８）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、付記４３から５７のいずれかに記載の製造方法。
（付記５９）
前記動物は、非ヒト動物である、付記４３から５８のいずれかに記載の製造方法。
（付記６０）
前記動物は、免疫抑制動物である、付記４３から５９のいずれかに記載の製造方法。
以上説明したように、本発明によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞において機能しうるｓｃＦｖのスクリーニングに用いるＣＡＲライブラリ、およびそれを用いたｓｃＦｖのスクリーニング方法を提供できる。このため、本発明は、医薬分野等において、極めて有用といえる。

Claims (12)

  1. 第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、
    前記第１のＣＡＲは、第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
    前記第１の抗原結合ドメインは、標的抗原への結合をスクリーニングされる第１の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、
    前記第１のｓｃＦｖは、第１の重鎖可変領域と、第１の軽鎖可変領域とを含み、
    前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、下記条件１または条件２を満たす、ＣＡＲライブラリ；
    条件１：
    前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
    前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
    条件２：
    前記第１の重鎖可変領域における重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第１のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
    前記第１の軽鎖可変領域における軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記標的抗原に結合する抗体もしくはその抗原結合断片における軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
  2. 前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１記載のＣＡＲライブラリ。
  3. 前記第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１または２記載のＣＡＲライブラリ。
  4. 前記第１のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＡＲライブラリ。
  5. 請求項１から４のいずれか一項に記載のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第１の発現工程と、
    前記第１の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第１の接触工程と、
    前記第１の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第１のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する第１の選抜工程とを含む、ｓｃＦｖの製造方法。
  6. 前記第１の候補ｓｃＦｖに基づき、第２のＣＡＲライブラリを調製する調製工程を含み、
    前記第２のＣＡＲライブラリは、第２のＣＡＲをコードする核酸を含み、
    前記第２のＣＡＲは、第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
    前記第２の抗原結合ドメインは、前記標的抗原への結合をスクリーニングされる第２のｓｃＦｖを含み、
    前記第２のｓｃＦｖは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域とを含み、
    前記第２の重鎖可変領域および前記第２の軽鎖可変領域は、下記条件３または条件４を満たし、
    さらに、前記第２のＣＡＲライブラリを免疫細胞に発現させる第２の発現工程と、
    前記第２の発現工程で得られた免疫細胞と、前記標的抗原とを接触させる第２の接触工程と、
    前記第２の接触工程において前記標的抗原と結合した免疫細胞に発現するＣＡＲの第２のｓｃＦｖを、前記標的抗原に結合する第２の候補ｓｃＦｖとして第２の選抜工程とを含む、請求項５記載の製造方法；
    条件３：
    前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件１を満たす場合、
    前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
    前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む；
    条件４：
    前記第１の発現工程におけるＣＡＲライブラリが前記条件２を満たす場合、
    前記第２の重鎖可変領域におけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記第１の候補ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
    前記第２の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、第２のＢ細胞受容体の軽鎖可変領域におけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。
  7. 前記第２の接触工程を複数回実施する、請求項６記載のｓｃＦｖの製造方法。
  8. 前記第２の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
    検出された免疫細胞に発現するｓｃＦｖを、前記第２の候補ｓｃＦｖとして選抜する、請求項６または７記載のｓｃＦｖの製造方法。
  9. 前記第２のＢ細胞受容体は、ヒト由来Ｂ細胞のＢ細胞受容体である、請求項６から８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖの製造方法。
  10. 前記第１の接触工程を複数回実施する、請求項５から９のいずれか一項に記載のｓｃＦｖの製造方法。
  11. 前記第１の選抜工程において、前記標的抗原のモノマーまたはマルチマーを用いて、前記標的抗原に結合する免疫細胞を検出し、
    検出された免疫細胞に発現するｓｃＦｖを、前記第１の候補ｓｃＦｖとして選抜する、請求項５から１０のいずれか一項に記載のｓｃＦｖの製造方法。
  12. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞である、請求項５から１１のいずれか一項に記載のｓｃＦｖの製造方法。
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