CN113423720A - CAR文库和scFv的制造方法 - Google Patents
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Abstract
提供用于筛选能在CAR‑T细胞中发挥作用的scFv的CAR文库、及使用了其的scFv的制造方法。本发明的嵌合抗原受体(CAR)文库包含编码第1CAR的核酸，所述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，所述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)，所述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，所述第1重链可变区和所述第1轻链可变区满足规定的条件。
Description
技术领域
本发明涉及CAR文库和scFv的制造方法。
背景技术
正在尝试使用表达与癌症特异性抗原或靶抗原结合的单链抗体(scFv：singlechain Fv)的T细胞(表达嵌合抗原受体的T细胞、CAR-T细胞)治疗癌症。
scFv的筛选通过使用利用从生物体中分离出的B细胞的杂交瘤的方法、或噬菌体展示法而实施。具体而言，对于前者，在免疫抗原后，使用从生物体中分离出的B细胞制作杂交瘤的文库；接着，选择产生与靶抗原结合的抗体的杂交瘤，并确定上述杂交瘤所产生的抗体的抗原识别位点的序列，由此来实施。
另外，对于后者，在制作包含编码scFv的多核苷酸的scFv的文库后，在噬菌体中表达各scFv；接着，选择与靶抗原结合的噬菌体，并对上述噬菌体中的多核苷酸进行鉴定，由此来实施。
发明内容
发明要解决的问题
然而，虽然两种方法均能够选择与靶抗原结合的scFv，但是是否为在CAR-T细胞中发挥作用的scFv这一点并不明确。因此，需要在上述选择后使靶抗原结合性的scFv分别在T细胞中表达并研究是否发挥作用。
因此，本发明例如提供用于筛选能在CAR-T细胞中发挥作用的scFv的CAR文库、及使用了其的scFv的制造方法。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明的嵌合抗原受体(CAR)文库包含编码第1嵌合抗原受体(CAR)的核酸，
上述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，
上述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)，
上述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，
上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足下述条件1或条件2，
条件1：
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件2：
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本发明的scFv的制造方法(以下也称为“第1筛选方法”)包括如下工序：第1表达工序，使免疫细胞表达上述本发明的CAR文库；
第1接触工序，使上述第1表达工序中得到的免疫细胞与上述靶抗原接触；及
第1选择工序，选择上述第1接触工序中与上述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第1scFv作为能与上述靶抗原结合的第1候选scFv。
发明的效果
根据本发明，例如可以提供用于筛选能在CAR-T细胞中发挥作用的scFv的CAR文库、及使用了其的scFv的制造方法。
附图说明
图1是示出实施例1中的流式细胞仪的结果的点阵图(dot plot)。
图2是示出实施例1中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图3是示出实施例1中的A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例的图。
图4是示出实施例1中的CD69的表达量的变化的图。
图5是示出实施例1中的CD69的表达量的变化的图。
图6是示出实施例1中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图7A是示出实施例1中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图7B是示出实施例1中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图8是示出实施例2中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图9是示出实施例2中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图10是示出实施例2中的A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例的图。
图11是示出实施例2中的肽浓度为10μg/mL时的CD69的表达量的变化的图。
图12是示出实施例2中的CD69的表达量的变化的图。
图13是示出实施例3中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图14是示出实施例4中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图15是示出实施例4中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。
图16是示出实施例5中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出表达3M4E5LH CAR的T细胞的结果，(B)示出表达L1-3M4E5H CAR的T细胞的结果。
图17是示出实施例6中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图18是示出实施例6中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。
图19是示出实施例6中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。
图20是示出实施例7中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出表达3M4E5LH CAR的T细胞的结果，(B)示出表达3M4E5H-L1 CAR的T细胞的结果。
图21是示出实施例7中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果C。
图22是示出实施例8中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图23是示出实施例8中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。
图24是示出实施例8中的细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。
图25是示出实施例9中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图26是示出实施例9中的CD69的表达量的变化的图。
图27是示出实施例10中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图28是示出实施例10中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图29是示出实施例10中的流式细胞仪的结果的点阵图。
图30是示出实施例10中的CD69的表达量的变化的图。
图31是示出实施例10中的CD19二聚体阳性细胞的相对比例的图。
图32是示出实施例10中的改变靶细胞量时的CD69表达量的相对值的图。
图33是示出实施例10中的细胞因子产生细胞的比例的图。
图34是关于实施例11中的生物体中的抗肿瘤活性的图。
图35是示出实施例12中的结构亲和性指标值与功能亲和性指标值的相关性的图。
图36是示出实施例13中的细胞毒性的图。
图37是关于实施例14中的生物体中的总存活率的图。
图38是关于实施例14中的生物体中的总存活率的图。
图39是示出实施例15中的细胞的增殖比的图。
图40是示出实施例15中的细胞因子产生细胞的比例的图。
图41是示出实施例15中的细胞毒活性的图。
图42是示出实施例15中的共培养前后的CD8阳性CAR-T细胞和CD4阳性CAR-T细胞中的CD45RA/CD62L阳性细胞的分布的点阵图。
图43是示出实施例15中的各CAR-T细胞的裂解比例、共培养前后的CD45RA阳性CD62L阳性CCR7阳性细胞的比例、及CD45RA阴性CD62L阳性CCR7阳性与CD45RA阳性CD62L阴性PD1阳性细胞的比例的图。
图44是用于说明通过实施例15中的本发明的筛选方法能够获得在体内(in vivo)的抗肿瘤效果优异的scFv的机理的图。
具体实施方式
<CAR文库>
如前所述，本发明的CAR文库包含编码第1嵌合抗原受体(CAR)的核酸，上述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，上述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)，上述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足下述条件1或条件2。本发明的CAR文库的特征在于满足下述条件1或条件2，其它构成和条件没有特别限制。
条件1：
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段(以下也称为“抗体等”)中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件2：
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本发明的CAR文库的特征在于：上述第1CAR包含上述第1抗原结合结构域、上述第1跨膜结构域、及上述第1细胞内信号转导结构域，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足上述条件1或条件2，其它构成和条件没有特别限制。
本发明的CAR文库中，上述第1CAR是包含上述第1抗原结合结构域、上述第1跨膜结构域、及上述第1细胞内信号转导结构域的蛋白质。上述第1CAR例如具有类似于包含与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的CAR的结构，上述与抗原结合的胞外结构域被变更为筛选与上述靶抗原的结合的第1抗原结合结构域。本发明的CAR文库中，上述第1CAR如上所述具有与上述CAR相似的结构。因此，与上述靶抗原结合的第1CAR例如能够在上述表达细胞中通过上述第1细胞内信号转导结构域而诱导信号。此外，与上述靶抗原结合的第1CAR例如能够激活该表达细胞(例如，增殖、激活标记的表达等)。即，根据本发明的CAR文库，例如，能够使用后述的第1筛选方法来提高上述CAR文库表达细胞群中的、表达与上述靶抗原结合的第1CAR的细胞的比例。因此，根据本发明的CAR文库，例如，与噬菌体展示法相比，能够以更少数量或种类的核酸筛选与上述靶抗原结合的scFv。另外，与上述靶抗原结合的第1CAR例如在后述的第1筛选方法中能够激活该表达细胞，因此可以说包含在CAR-T细胞中发挥作用的scFv。因此，根据本发明的CAR文库，例如能够筛选能在CAR-T细胞中发挥作用的scFv。
另外，本发明的CAR文库中，上述第1抗原结合结构域包含能筛选与上述靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)。上述第1scFv例如是源自与抗原结合的抗体的单链的多肽，且具有类似于保持与上述抗原的结合能力的scFv的结构。上述scFv是将与上述抗原结合的抗体的重链(H链)和轻链(L链)的可变区的片段(Fv)连接而成的多肽。另一方面，对于上述第1scFv，如下所述，例如重链可变区和轻链可变区中的一者为与上述靶抗原结合的抗体等的可变区，另一者为源自B细胞受体的可变区、即与上述靶抗原结合与否不明确的可变区。本发明的CAR文库通过将上述第1scFv设为这样的构成，从而例如能够实施与上述靶抗原结合的重链可变区或轻链可变区的筛选。因此，根据本发明的CAR文库，例如跟一次性筛选与上述靶抗原结合的重链可变区和轻链可变区的噬菌体展示法相比，能够以更少数量或种类的核酸筛选与上述靶抗原结合的scFv。
本发明的CAR文库中，编码第1CAR的核酸例如是指编码第1CAR的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)。上述核酸可以由DNA构成，可以由RNA构成，也可以由两者构成。上述核酸可以由天然的核酸构成，可以由对天然的核酸进行了修饰的修饰核酸构成，可以由ENA(2'-O,4'-C-乙烯桥接核酸)、锁核酸(LNA：Locked nucleic acid)、肽核酸(PNA：Peptide NucleicAcid)、吗啉等人工核酸构成，也可以由这些中的2种以上构成。
本发明中“结构域”例如是指在多肽中立体结构上或功能上聚集的区域。上述多肽例如可列举出具有10个氨基酸以上的长度的肽。
上述第1scFv中，上述靶抗原没有特别限制，可以是任意的抗原。上述靶抗原例如可列举出肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、与自身免疫疾病相关的抗原、糖链抗原等。上述肿瘤抗原例如是指由于细胞的癌变而新表达的抗原、表达量增加的抗原等具有抗原性的生物分子。上述肿瘤抗原例如可以是肿瘤特异性抗原，也可以是肿瘤相关抗原。
上述肿瘤抗原例如可列举出：5T4、α5β1-整合素、激活型整合素β7、707-AP、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、ART-4、AURKA(AURORA A)、B7H4、BAGE、β-连环蛋白、BCMA、Bcr-abl、BTAA、MN/CA IX抗原、CA125、CA19-9、CA72-4、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD47、CD52、CD56、CD80、CD96、CD123、CDK4、癌胚抗原(CEA)、CLL1、CT、细胞周期蛋白(Cyclin)A1、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE(GAGE-1、GAGE-2等)、GD2(神经节苷脂G2，Ganglioside G2)、GnT-V、Gp100、HAGE、β-人绒毛膜促性腺激素(HCG)、HER2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、iCE、胰岛素生长因子(IGF)-1、IGF-2、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、K-Ras、LAGE、LDLR/FUT、MAGE(MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6等)、MART-1/黑色素瘤标记物(melan)-A、MART-2/Ski、MC1R、间皮素(mesothelin，MSLN)、肌球蛋白、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、蛋白酶-3、黑色素瘤优先表达抗原抗体(PRAME；肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原(Melanoma antigen preferentially expressed in tumors))、p53、p190次要bcr-abl、Pml/RARα、前列腺肿瘤抗原-1(PCTA-1)、PRAME、前列腺特异性抗原(PSA)、PSM、PSMA、RAGE、RAS、RHAMM(CD168)、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、甲状腺球蛋白、存活素、端粒酶反转录酶(TERT或TRT)、TEL/AML1、TGFβ、TIM3、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、NY-Eso-1、NY-Eso-B等。
上述病毒抗原例如可列举出源自下述病毒的抗原：腺病毒(adenovirus)等腺病毒科(Adenoviridae)；冠状病毒(coronavirus)等冠状病毒科(Coronaviridae)；埃波拉病毒属(Ebolavirus)等丝状病毒科(Filoviridae)；丙型肝炎病毒(HCV：hepatitis C virus)、登革病毒(Dengue virus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、西尼罗病毒(west Nile virus)、黄热病毒(yellow fever virus)等黄热病病毒科(Flaviviridae)；乙型肝炎病毒(HVB：Hepatitis B Virus)等嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)；单纯疱疹病毒1型(HSV-1：herpes simplex virus-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2：herpes simplex virus-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV：varicella zoster virus)、人巨细胞病毒(HCMV：humancytomegalovirus)、EB病毒(EBV：Epstein-Barr virus)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV：Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)等疱疹病毒科(Herpesviridae)；甲型流感病毒属(Influenzavirus A)、乙型流感病毒属(Influenzavirus B)、丙型流感病毒属(Influenzavirus C)等正粘病毒科(Orthomyxoviridae)；麻疹病毒(measles virus)、人副流感病毒1～4型(Human parainfluenza virus 1～4)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)等副粘病毒科(Paramyxoviridae)；细小病毒B19(Parvovirus B19)等细小病毒科(Parvoviridae)；肠病毒(enterovirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、人鼻病毒A～B(human rhinovirus A～B)、甲型肝炎病毒(hepatitis Avirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echo virus)等小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)；天花病毒(variola virus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)等痘病毒科(Poxviridae)；人免疫缺陷病毒(HIV：human immunodeficiency virus)-1,2、人类嗜T细胞病毒(HTLV：human T-lymphocytropic virus)-I,II等逆转录病毒科(Retroviridae)；狂犬病病毒(Rabies virus)、水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)等弹状病毒科(Rhabdoviridae)；风疹病毒(Rubella virus)、屈曲病毒(Chikungunya virus)等披膜病毒科(Togaviridae)；等。
上述细菌抗原例如可列举出源自下述细菌的抗原：破伤风梭菌(Clostridium tetani)等梭菌属(Clostridium)；大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏杆菌属(Escherichia)；幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)等螺杆菌属(Helicobacter)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)等军团菌属(Legionella)；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)等李斯特菌属(Listeria)；结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鸟[型]结核分支杆菌(Mycobacterium avium)、细胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)等分支杆菌属(Mycobacterium)；淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)等奈瑟菌属(Neisseria)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)等假单胞菌属(Pseudomonas)；伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi)、甲犁副伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Paratyphi A)等沙门氏菌属(Salmonella)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等葡萄球菌属(Staphylococcus)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)等链球菌属(Streptococcus)；等。
上述寄生虫抗原例如可列举出源自下述寄生虫的抗原：华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、人蛲虫(Enterobius vermicularis)、猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、棘球绦虫(Echinococcus)、痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)、疟原虫(Plasmodium)等。
本发明的CAR文库中，第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区。上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区具有与抗体分子中的重链可变区和轻链可变区同样的结构。通常，抗体分子的重链可变区和轻链可变区分别具有3个互补决定区(CDR：Complemetaritydetermining region)。CDR也称为高变区(hypervariable domain)。CDR是在上述重链和轻链的可变区中一级结构的突变性特别高的区域，在一级结构上通常分散在3个位置。本发明中，将重链可变区中的3个CDR从重链可变区的氨基酸序列中的氨基末端(N末端)侧起表示为重链CDR1(CDRH1)、重链CDR2(CDRH2)和重链CDR3(CDRH3)，将轻链可变区中的3个CDR从轻链可变区的氨基酸序列中的氨基末端侧起表示为轻链CDR1(CDRL1)、轻链CDR2(CDRL2)和轻链CDR3(CDRL3)。这些位点在立体结构上彼此接近，决定了对所结合的抗原的特异性。
上述第1重链可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第1轻链可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足上述条件1或条件2。
上述条件1下，上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3利用与上述靶抗原结合的抗体等对于上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3筛选与上述靶抗原的结合。上述抗体或其抗原结合片段的具体例例如可以援用后述的本发明的抗体等中的抗体和抗原结合片段的说明。
与上述靶抗原结合的抗体等例如可以根据上述靶抗原使用公知的抗体等。作为具体例，作为针对HLA-A*02：01和NY-ESO-1157-165的复合体的抗体，例如可以使用3M4E5抗体。另外，作为针对人CD19的抗体，例如可以使用FMC63抗体。与上述靶抗原结合的抗体等例如可以是通过后述的本发明的第1筛选方法而得到的scFv，也可以是通过免疫上述靶抗原而得到的抗体。上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由与上述靶抗原结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述靶抗原结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第1重链可变区中，除CDRH1、CDRH2和CDRH3以外的区域、即框架区(FR)例如可以包含与上述靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的FR。上述FR在一级结构上通常分散在4个位置。本发明中，将上述重链可变区中的4个FR从上述重链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起表示为重链FR1(FRH1)、重链FR2(FRH2)、重链FR3(FRH3)和重链FR4(FRH4)。需要说明的是，上述各CDRH与上述各FRH例如从上述重链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起依次配置有FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3和FRH4。上述第1重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由与上述靶抗原结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述靶抗原结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“与靶抗原结合的抗体等”与上述各FRH的说明中的“与靶抗原结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第1重链可变区例如可以包含与上述靶抗原结合的抗体等中的重链可变区。在此情况下，上述第1重链可变区例如可以是由与上述靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区例如由V基因片段和J基因片段重组VJ基因而形成的VJ基因片段编码。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是包含人工VJ基因片段所编码的多肽的B细胞受体，所述人工VJ基因片段是人工组合V基因片段和J基因片段而设计出的。另外，生物体内的B细胞例如表达VJ基因重组后的轻链可变区。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是源自分离的B细胞的B细胞受体。在此情况下，上述第1B细胞受体例如可列举出人源B细胞的B细胞受体，优选为人外周血B细胞来源的B细胞受体。本发明的CAR文库中，从能够更容易地制备CAR文库的角度出发，上述第1B细胞受体优选为源自分离的B细胞的B细胞受体的轻链可变区。
上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第1B细胞受体的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中，FR例如可以包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区的FR。上述FR在一级结构上通常分散在4个位置。本发明中，将上述轻链可变区中的4个FR从上述轻链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起表示为轻链FR1(FRL1)、轻链FR2(FRL2)、轻链FR3(FRL3)和轻链FR4(FRL4)。需要说明的是，上述各CDRL与上述各FRL例如从上述轻链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起依次配置有FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3和FRL4。上述第1轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第1B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第1B细胞受体”与上述各FRL的说明中的“第1B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第1轻链可变区例如可以包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区。在此情况下，上述第1轻链可变区例如可以是分别由上述第1B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
接着，上述条件2下，上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3源自与上述靶抗原结合的抗体等，对上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3筛选与上述靶抗原的结合。
上述第1重链可变区例如由V基因片段、D基因片段和J基因片段重组VDJ基因而形成的VDJ基因片段编码。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是包含人工VDJ基因片段所编码的多肽的B细胞受体，所述人工VDJ基因片段是将V基因片段、D基因片段和J基因片段进行人工组合设计而成的。另外，生物体内的B细胞例如表达VDJ基因重组后的重链可变区。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是源自分离的B细胞的B细胞受体。在此情况下，上述第1B细胞受体例如可列举出人源B细胞的B细胞受体，优选为人外周血B细胞来源的B细胞受体。本发明的CAR文库中，从能够更容易地制备CAR文库的方面考虑，上述第1B细胞受体优选为源自分离的B细胞的B细胞受体的重链可变区。
上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第1重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第1B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第1B细胞受体”与上述各FRH的说明中的“第1B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第1重链可变区例如可以包含上述第1B细胞受体中的重链可变区。在此情况下，上述第1重链可变区例如可以是由上述第1B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中，与上述靶抗原结合的抗体等例如可以援用上述条件1中的与靶抗原结合的抗体等的说明。上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由与上述靶抗原结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述靶抗原结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中，FR例如可以包含与上述靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的FR。上述第1轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由与上述靶抗原结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述靶抗原结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“与靶抗原结合的抗体等”与上述各FRL的说明中的“与靶抗原结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第1轻链可变区例如可以包含与上述靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区。在此情况下，上述第1轻链可变区例如可以是由与上述靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1scFv中，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区例如通过连接肽(Fv连接肽)而连接。上述Fv连接肽例如优选不阻碍上述第1scFv与上述靶抗原的结合。上述Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由下述序列号1或序列号2的氨基酸序列组成的多肽。
Fv连接肽1(序列号1)
Fv连接肽2(序列号2)
编码Fv连接肽1的碱基序列(序列号3)
编码Fv连接肽2的碱基序列(序列号4)
上述第1抗原结合结构域包含第1scFv，但上述第1结合结构域也可以具有包含上述重链可变区和上述轻链可变区的、除scFv以外的结构。作为具体例，上述第1结合结构域可以是Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv等。
上述第1跨膜结构域例如是在使细胞表达上述第1CAR的情况下占据贯通细胞膜的区域的结构域。上述第1跨膜结构域例如可以是跨膜蛋白的跨膜结构域，也可以是人工设计的人工跨膜结构域。前者的情况下，上述跨膜蛋白例如可列举出T细胞受体的α、β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(CD8α或CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS、GITR等、或与它们具有同等功能的突变体。上述具有同等功能的突变体例如是由缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且作为跨膜结构域发挥作用的多肽。上述“1个或数个”例如为1～15个、1～10个、1～5个、1或2个。后者的情况下，上述人工跨膜结构域例如是主要由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等疏水性的氨基酸构成的多肽。另外，上述人工跨膜结构域例如可以在各两端具有苯丙氨酸、色氨酸、及缬氨酸的三肽。上述第1跨膜结构域为上述跨膜蛋白的跨膜结构域时，上述第1跨膜结构域例如可以包含与上述跨膜蛋白的跨膜结构域连接的N末端侧或C末端侧的1个或数个氨基酸。上述“1个或数个”例如可以援用上述的示例。
上述第1跨膜结构域例如可列举出CD28的跨膜结构域。CD28的跨膜结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_006130注册的氨基酸序列中从第153位至第179位的下述的氨基酸序列(序列号5)。需要说明的是，上述NCBI注册号是对蛋白质的前体的全长氨基酸序列赋予的编号(以下同样)。作为上述CD28的跨膜结构域，例如除了上述CD28的跨膜结构域之外，还可以使用包含其N末端侧的胞外区及其C末端侧的胞内区的跨膜单元。
CD28的跨膜结构域(序列号5)
编码CD28的跨膜结构域的碱基序列(序列号6)
CD28的跨膜单元(序列号7)
编码CD28的跨膜单元的碱基序列(序列号8)
上述第1细胞内信号转导结构域例如为：当同一蛋白质内的第1抗原结合结构域与上述靶抗原结合时能将信号传递至细胞内的结构域。上述第1信号转导结构域例如可列举出T细胞受体(TCR)复合体和共刺激分子的细胞质的氨基酸序列、以及与这些氨基酸序列具有同等功能的突变体。上述具有同等功能的突变体例如是由缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且作为细胞内信号转导结构域发挥作用的多肽。上述“1个或数个”例如可以援用上述的说明。
T细胞例如被TCR复合体介导的细胞内信号等抗原依赖性细胞质信号激活(初级激活)。接着，该激活例如被共刺激分子介导的细胞内信号等抗原非特异性细胞质信号增强(次级激活)。因此，T细胞例如具有通过上述TCR复合体被激活的结构域(初级激活结构域)和抗原非特异性激活的结构域(次级激活结构域)。因此，上述第1细胞内信号转导结构域例如具有上述初级激活结构域和上述次级激活结构域中的至少一者，优选具有两者。
上述初级激活结构域例如能够调整基于TCR复合体的初级激活。诱导上述初级激活的初级激活结构域例如可列举出包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的细胞内信号转导结构域。另一方面，对上述初级激活具有抑制作用的初级激活结构域例如可列举出包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的细胞内信号转导结构域。
上述包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d等的细胞内信号转导结构域、或与它们具有同等功能的突变体。上述具有同等功能的突变体例如是由缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且作为包含ITAM的细胞内信号转导结构域发挥作用的多肽。上述“1个或数个”例如可以援用上述的说明。CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_932170.1注册的氨基酸序列中第52～164位的氨基酸序列或下述序列号9的氨基酸序列。FcεRIγ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_004097.1注册的氨基酸序列中第45～86位的氨基酸序列。FcεRIβ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_000130.1注册的氨基酸序列中第201～244位的氨基酸序列。CD3γ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_000064.1注册的氨基酸序列中第139～182位的氨基酸序列。CD3δ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_000723.1注册的氨基酸序列中第128～171位的氨基酸序列。CD3ε的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_000724.1注册的氨基酸序列中第153～207位的氨基酸序列。CD5的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_055022.2注册的氨基酸序列中第402～495位的氨基酸序列。CD22的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_001762.2注册的氨基酸序列中第707～847位的氨基酸序列。CD79a的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_001774.1注册的氨基酸序列中第166～226位的氨基酸序列。CD79b的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_000617.1注册的氨基酸序列中第182～229位的氨基酸序列。CD66d的包含ITAM的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_001806.2注册的氨基酸序列中第177～252位的氨基酸序列。
CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域(序列号9)
编码CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域的碱基序列(序列号10)
上述次级激活结构域可列举出CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD154、GITR、ICOS等的细胞内信号转导结构域或与它们具有同等功能的突变体。上述具有同等功能的突变体例如是由缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且作为细胞内信号转导结构域发挥作用的多肽。上述“1个或数个”例如可以援用上述的说明。具体而言，CD2的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_001758.2注册的氨基酸序列中第236～351位的氨基酸序列。CD4的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_000607.1注册的氨基酸序列中第421～458位的氨基酸序列。CD5的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_055022.2注册的氨基酸序列中第402～495位的氨基酸序列。CD8α的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_001759.3注册的氨基酸序列中第207～235位的氨基酸序列。CD8β的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号AAA35664.1注册的氨基酸序列中第196～210位的氨基酸序列。CD27的细胞内信号转导结构域例如可列举出NCBI注册号M63928.1注册的氨基酸序列中第213～260位的氨基酸序列。CD28的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_006130.1注册的氨基酸序列中第181～220位的氨基酸序列(序列号11)。CD134的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_003318.1注册的氨基酸序列中第241～277位的氨基酸序列。CD137的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_001552.2注册的氨基酸序列中第214～255位的氨基酸序列。GITR的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_004186.1注册的氨基酸序列中第193～241位的氨基酸序列。ICOS的细胞内信号转导结构域例如可列举出以NCBI注册号NP_036224.1注册的氨基酸序列中第166～199位的氨基酸序列。
CD28的细胞内信号转导结构域(序列号11)
编码CD28的细胞内信号转导结构域的碱基序列(序列号12)
上述第1CAR例如包含1个或多个第1细胞内信号转导结构域。包含多个第1细胞内信号转导结构域时，上述第1细胞内信号转导结构域可以相同，也可以不同。上述第1细胞内信号转导结构域例如优选包括CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域作为上述初级激活结构域。另外，上述第1细胞内信号转导结构域例如优选包含选自由CD27、CD28和CD137组成的组中的至少一者的细胞内信号转导结构域作为上述次级激活结构域。作为具体例，上述第1细胞内信号转导结构域例如包括CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域、及选自由CD27、CD28和CD137组成的组中的至少一者的细胞内信号转导结构域。由此，例如，在后述的本发明的第1筛选方法中，本发明的CAR文库与噬菌体展示法相比能够以更少数量或种类的核酸筛选与上述靶抗原结合的scFv。上述第1细胞内信号转导结构域包括CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域、及CD28的细胞内信号转导结构域时，CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域优选配置于CD28的细胞内信号转导结构域的C末端侧。上述第1细胞内信号转导结构域包括CD3ζ的包含ITAM的细胞内信号转导结构域、及CD28的细胞内信号转导结构域时，上述第1细胞内信号转导结构域可以进一步包括CD134和CD137中的至少一者的细胞内信号转导结构域。
上述第1抗原结合结构域和上述第1跨膜结构域直接或间接地连接。上述间接连接的情况下，上述第1抗原结合结构域和上述第1跨膜结构域优选通过间隔肽而连接。上述间隔肽例如由1～300个、1～100个、10～100个、25～50个氨基酸构成。上述间隔肽例如优选包含促进上述第1CAR与上述靶抗原的结合、且在上述第1CAR与上述靶抗原已结合时诱导和/或增强上述第1细胞内信号转导结构域的信号传递的氨基酸(例如，半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)。作为具体例，上述间隔肽例如可以利用CH1区、L区等免疫球蛋白的恒定区、CD4、CD8α、CD8β、或CD28的部分区域等。上述第1间隔肽也可以是人工设计的氨基酸序列。CD8α的部分区域例如可列举出CD8α的铰链区域，作为具体例，可列举出以NCBI注册号NP_001759.3注册的氨基酸序列中第118～178位的氨基酸序列。CD8β的部分区域例如可列举出NCBI注册号AAA35664.1注册的氨基酸序列中第135～195位的氨基酸序列。CD4的部分区域例如可列举出以NCBI注册号NP_000607.1注册的氨基酸序列中第315～396位的氨基酸序列。CD28的部分区域例如可列举出以NCBI注册号NP_006130.1注册的氨基酸序列中第137～152位的氨基酸序列(序列号13)。上述间隔肽也可以是各示例的氨基酸序列的一部分。
CD28的部分区域(胞外区)(序列号13)
编码CD28的一部分的碱基序列(序列号14)
上述第1CAR中，各结构域间例如也可以通过连接肽(结构域连接肽)而连接。上述结构域连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述结构域连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。
上述第1CAR例如可列举出由下述式(1)(序列号15)所示的氨基酸序列组成的多肽。下述式(1)中，V1与V2分别为重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列、或轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。下述式(1)中，V1与V2之间的氨基酸序列为Fv连接肽的氨基酸序列，V2至C末端侧的氨基酸序列为间隔肽、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的氨基酸序列。下述式(1)中，Fv连接肽为Fv连接肽1，但也可以为Fv连接肽2。
[V1]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V2]-[IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS]-[RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR]…(1)
上述编码第1CAR的核酸例如可列举出由下述式(2)(序列号16)所示的碱基序列组成的多核苷酸。下述式(2)中，N1和N2分别为编码重链可变区和轻链可变区的碱基序列、或编码轻链可变区和重链可变区的碱基序列。下述式(2)中，N1与N2之间的碱基序列为编码Fv连接肽的碱基序列，N2至3’端侧的氨基酸序列为编码间隔肽、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的碱基序列。下述式(2)中，编码Fv连接肽的碱基序列为编码Fv连接肽1的碱基序列，但也可以为编码Fv连接肽2的碱基序列。
5’-[N1]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N2]-[ATCGAAGTGATGTACCCCCCTCCCTACCTGGACAACGAGAAGTCCAACGGCACCATTATCCACGTGAAGGGAAAGCACCTGTGCCCCAGCCCTCTGTTCCCTGGCCCTAGCAAGCCTTTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGAGTGCTGGCCTGTTATAGCCTGCTCGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGCGCAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCCGGACCCACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCT]-[CGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA]-3’…(2)
本发明的CAR文库例如优选包含多种核酸。在此情况下，本发明的CAR文库例如为多种核酸的混合物。上述多种核酸例如优选其一部分或全部编码不同的第1CAR，优选编码不同的第1抗原结合结构域。多种核酸编码不同的第1抗原结合结构域时，上述第1CAR中的除第1抗原结合结构域以外的区域例如为相同的或不同的氨基酸序列。本发明的CAR文库中包含的上述核酸的种类例如为1×105～1×107种、1×105～1×106种、1×106～5×106种，优选为约2×106种(例如，1×106～3×106种)。上述噬菌体展示法中，与上述靶抗原结合的scFv的筛选中需要约1×108种核酸。另一方面，利用本发明的CAR文库，例如，即使为约1×106种核酸，也能够筛选与上述靶抗原结合的scFv。因此，利用本发明的CAR文库，例如，与噬菌体展示法相比，能够以更少的数量或种类的核酸筛选与上述靶抗原结合的scFv。上述核酸的种类例如也可以称为核酸的不均一性(heterogeneity)。上述不均一性例如可以通过限制性内切酶作图、对于各CDR和/或各FRH通过桑格测序法(Sanger sequencing)等测序等进行测定。
上述第1CAR例如可以在N末端具有信号肽。上述信号肽例如可列举出成为向内质网的转运信号的信号肽。上述第1CAR例如可以具有标签。上述标签例如可列举出肽标签、蛋白质标签等。上述标签例如可列举出FLAG(注册商标)标签、HA标签、His标签、Myc标签、V5标签、切割型的神经生长因子受体(NGFR：nerve growth factor receptor)等。上述标签肽例如可添加到上述第1CAR的N末端和C末端的至少一者中。上述标签为切割型的NGFR的情况下，上述标签例如配置于上述第1CAR的C末端侧。由此，本发明的CAR文库例如可以以在1个细胞中导入1种编码第1CAR的核酸的方式来调整核酸的导入效率。上述第1CAR与上述标签也可以通过连接肽而连接。
本发明中，上述编码第1CAR的核酸例如可以基于上述第1CAR的氨基酸序列并利用常规方法而制备。作为具体例，上述编码第1CAR的核酸例如可以如下制备：在注册了上述的各结构域的氨基酸序列的数据库中，获得编码上述氨基酸序列的碱基序列，基于上述碱基序列，利用分子生物学方法和/或化学合成方法进行制备。上述核酸的碱基序列例如可以根据表达本发明的CAR文库的细胞的来源进行密码子最优化。
上述编码第1CAR的核酸例如可以导入表达载体中。上述表达载体例如可以通过将上述编码第1CAR的核酸与连接用载体连接而制备。上述连接用载体的种类没有特别限制，例如可列举出致癌RNA病毒载体、慢病毒载体、假型载体等逆转录病毒载体；腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿肾病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒(EBV)载体、HSV载体等病毒载体。作为具体例，上述连接用载体例如可列举出pUC、pCMV、pMX、pELP。上述连接用载体例如也可以根据导入上述表达载体的宿主进行适宜设定。上述宿主没有特别限制，例如可列举出CHO细胞、Jurkat细胞、Jurkat76细胞等源自哺乳类的培养细胞、免疫细胞等。上述免疫细胞例如可列举出淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞等。上述淋巴细胞例如可列举出T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞等。上述免疫细胞例如为从生物体中分离出的细胞、由多能干细胞等干细胞诱导的免疫细胞或源自免疫细胞的培养细胞。上述T细胞也可以是T细胞样的细胞。上述T细胞样的细胞例如可列举出源自T细胞的培养细胞等，作为具体例，可列举出Jurkat细胞、Jurkat76细胞等。
上述表达载体例如优选具有调控序列，所述调控序列对上述编码第1CAR的核酸的表达和上述编码第1CAR的核酸所编码的第1CAR中的至少一者的表达进行调节。上述调控序列例如可列举出启动子、终止子、增强子、聚腺苷酸化信号序列、复制起点序列(ori)等。上述表达载体中，上述调控序列的配置没有特别限制。上述表达载体中，上述调控序列例如以能够在功能上调节上述编码第1CAR的核酸的表达和其所编码的上述第1CAR中的至少一者的表达的方式配置即可，可以基于公知的方法进行配置。上述调控序列例如可以利用上述连接载体所预先具备的序列，也可以进一步将上述调控序列插入上述连接载体中，也可以将上述连接载体所具备的调控序列置换为其它调控序列。
上述表达载体例如可以进一步具有选择标记的编码序列。上述选择标记例如可列举出抗药性标记、荧光蛋白标记、酶标记、细胞表面受体标记等。
<第1scFv的筛选方法>
本发明的第1筛选方法包括如下工序：第1表达工序，使免疫细胞表达上述本发明的CAR文库(以下也称为“第1CAR文库”)；第1接触工序，使上述第1表达工序中得到的免疫细胞与上述靶抗原接触；及第1选择工序，选择上述第1接触工序中与上述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第1scFv作为能与上述靶抗原结合的第1候选scFv。本发明的第1筛选方法的特征在于，包括上述第1表达工序、上述第1接触工序和上述第1选择工序，在上述第1表达工序中使用上述本发明的CAR文库，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的第1筛选方法，能够筛选能在CAR-T细胞中发挥作用的scFv。另外，基于与上述靶抗原结合的scFv的重链可变区和轻链可变区的各CDR的氨基酸序列，例如能够制作能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。因此，上述第1筛选方法例如也可以称为与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段的筛选方法。本发明的第1筛选方法例如可以援用上述本发明的CAR文库的说明。根据本发明的scFv的制造方法，能够筛选新的scFv。因此，本发明的scFv的制造方法例如也可以称为scFv的筛选方法。
利用噬菌体展示法等制造与靶抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)等时，制作约1×1010种的抗体文库，获得与靶抗原结合的抗体后，由上述抗体制备包含scFv的CAR等。然后，对于上述CAR等，使用免疫细胞等对其有效性进行研究。另一方面，本发明的第1筛选方法中，由于使用上述本发明的CAR文库及上述免疫细胞，因此例如能够同时实施与上述靶抗原结合的scFv的筛选、及上述scFv在免疫细胞中的有效性的研究。因此，根据本发明的第1筛选方法，例如，与用于得到与靶抗原结合的抗体的噬菌体展示法等相比，能够简便地筛选与靶抗原结合且在免疫细胞等中有效地发挥作用的CAR中所能使用的scFv。
上述第1表达工序是使免疫细胞表达上述本发明的CAR文库的工序。具体而言，上述第1表达工序中，例如，将上述第1CAR文库导入至上述免疫细胞中。然后，在上述第1表达工序中，例如，通过培养导入了上述第1CAR文库的免疫细胞，从而使上述免疫细胞表达上述第1CAR文库。上述第1CAR文库的导入方法没有特别限制，例如可以利用公知的向细胞导入核酸的方法。作为具体例，上述第1CAR文库的导入方法例如可列举出使用脂质体、阳离子脂质体等核酸导入试剂的方法；使用逆转录病毒、慢病毒等病毒的方法；等。上述免疫细胞的培养期没有特别限制，例如可列举出6小时～30天、6～96小时，1～30天。上述免疫细胞的培养温度例如为28～37℃。
上述第1CAR文库例如可以是上述编码第1CAR的核酸，也可以是导入了上述编码第1CAR的核酸的表达载体。
上述免疫细胞没有特别限制，例如可列举出T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞等。上述免疫细胞例如可列举出从生物体中分离出的免疫细胞、由多能干细胞等干细胞诱导的免疫细胞或源自免疫细胞的培养细胞。上述分离的免疫细胞例如可以是免疫细胞样的培养细胞，作为具体例，可列举出T细胞样的培养细胞、NK细胞样的培养细胞、NKT细胞样的培养细胞、B细胞样的培养细胞等。上述免疫细胞例如是从生物体中分离出的免疫细胞，作为具体例可列举出人外周血来源的免疫细胞。上述T细胞样的培养细胞例如可列举出Jurkat细胞、Jurkat76细胞等。例如从能够筛选在CAR-T细胞中发挥作用的可能性更高的scFv、并且在后述的第1接触工序中能够富集表达与上述靶抗原结合的第1CAR的免疫细胞的方面考虑，上述免疫细胞优选T细胞或T细胞样的培养细胞、NK细胞、NKT细胞。
上述第1表达工序中，上述免疫细胞的数量没有特别限制，例如为1×105～1×108个细胞、1×105～1×107个细胞、1×105～1×106个细胞、1×106～5×106个细胞、1×106～3×106个细胞。
上述第1表达工序中，优选以使每个免疫细胞平均表达1个以下的第1CAR的方式使免疫细胞表达上述本发明的CAR文库。由此，本发明的第1筛选方法例如能够抑制不与上述靶抗原结合的非特异性第1CAR的选择。上述每个细胞所表达的第1CAR的数量例如可以通过变更细胞数与所导入的核酸、病毒等载体的量比而调整。具体而言，上述第1表达工序中，通过降低所导入的载体相对于一定数量的细胞的量比，从而能够减少上述每个细胞所表达的第1CAR的数量。另一方面，上述第1表达工序中，通过增加所导入的载体相对于一定数量的细胞的量比，从而能够增加上述每个细胞所表达的第1CAR的数量。上述第1表达工序中，载体向上述免疫细胞中的导入效率没有特别限制，例如可以为10～60％、10～50％、20～40％、25～35％。
接着，在上述第1接触工序中，使上述第1表达工序中得到的免疫细胞(候选免疫细胞)与上述靶抗原接触。上述候选免疫细胞与上述靶抗原的接触例如可以通过在上述候选免疫细胞和上述靶抗原共存下进行培养而实施。培养期例如为6小时～30天、6～96小时，1～30天。培养温度例如为28～37℃。以下，上述免疫细胞为T细胞时，候选免疫细胞例如也可以称为候选CAR-T。
上述候选免疫细胞所表达的CAR例如可以是1种，也可以是多种，但优选前者。上述候选免疫细胞优选为表达具有不同的氨基酸序列的CAR的候选免疫细胞、即表达不同的CAR的2种以上候选免疫细胞的混合物。
与上述候选免疫细胞接触的靶抗原例如可列举出上述靶抗原的单体、上述靶抗原的复合体、表达上述靶抗原的细胞等，优选为表达上述靶抗原的细胞。上述靶抗原的复合体例如可列举出上述靶抗原的多聚体(polymer)，作为具体例，可列举出上述靶抗原的二聚体、四聚体等。上述靶抗原的多聚体例如可以利用如下方法制备：通过抗体使添加了标签的靶抗原交联的方法、通过亲和素使经生物素化的靶抗原复合体化的方法等，从而制备。表达上述靶抗原的细胞例如可列举出内源性表达上述靶抗原的细胞、通过导入编码上述靶抗原的核酸而表达了上述靶抗原的细胞等。表达上述靶抗原的细胞例如可列举出293细胞、293T细胞、K562细胞等培养细胞。
上述第1接触工序中，除了上述靶抗原之外，可以使激活免疫细胞的分子、所谓的共刺激分子一起进行接触。上述共刺激分子例如可列举出CD27、CD40、CD40L、CD80、CD83、CD86、OX40L、4-1BBL、GITRL、ICOS等。上述共刺激分子例如可列举出上述共刺激分子的单体、上述共刺激分子的复合体、表达上述共刺激分子的细胞等，优选为表达上述共刺激分子的细胞。上述共刺激分子的复合体例如可以与上述靶抗原的复合体同样地制备。
使用表达上述靶抗原的细胞作为上述靶抗原时，上述表达靶抗原的细胞优选同时表达激活免疫细胞的分子、所谓的共刺激分子。上述共刺激分子例如可列举出CD27、CD40、CD40L、CD80、CD83、CD86、OX40L、4-1BBL、GITRL、ICOS等。上述表达靶抗原的细胞可以表达1种共刺激分子，也可以表达2种以上的共刺激分子。例如从能够发挥与生物体中的抗原提呈细胞相似的功能、且能够选择在生物体内发挥作用的CAR的方面考虑，上述表达靶抗原的细胞优选表达选自由CD80、CD83、CD40、及4-1BBL组成的组中的至少1个。
本发明的第1筛选方法中，在上述第1接触工序中，使候选免疫细胞与靶抗原接触。因此，表达上述靶抗原特异性的CAR的候选免疫细胞例如可以根据CAR与上述靶抗原的亲和性(结合性)的程度，与生物体内同样地与上述靶抗原持续地或间歇地形成免疫突触样的结构。由此，表达上述靶抗原特异性的CAR的候选免疫细胞例如可以根据CAR与上述靶抗原的亲和性(结合性)的程度，接收来自CAR的存活、激活和/或增殖信号。其结果，经过上述第1接触工序的候选免疫细胞中，表达上述靶抗原特异性的CAR的候选免疫细胞例如可以根据CAR与上述靶抗原的亲和性(结合性)的程度显示出表达存活、激活标记和/或细胞数增加这样的表型。接着，在后述的第1选择工序中，例如，评价并选择表现出这种表型的候选免疫细胞。因此，第1选择工序中，例如，除了候选免疫细胞所表达的CAR的亲和性之外，还可以基于该CAR被激活时所产生的表型(功能性)来筛选CAR。因此，本发明的第1筛选方法例如通过具备上述第1接触工序，从而能够适宜地筛选在生物体内或免疫细胞中有效地发挥作用的CAR中所能使用的scFv。
上述第1接触工序可以实施多次。上述多次例如为1～5次、2～3次，优选为2～3次。实施多次上述第1接触工序时，实施第1次第1接触工序后，回收上述候选免疫细胞，与第1次的第1接触工序同样地进行第2次的第1接触工序。接着，同样地重复实施回收和接触直至达到期望的次数。通过实施多次上述第1接触工序，从而在上述第1接触工序中，例如能够增殖和/或富集表达与上述靶抗原结合的CAR的候选免疫细胞，因此能够更有效地筛选与上述靶抗原结合的scFv。另外，对于通过实施多次上述第1接触工序而增殖的候选免疫细胞所表达的CAR而言，例如后述的实施例所示，即使在表达上述靶抗原的细胞比表达上述CAR的细胞多的情况(例如，癌症)下，也适宜地以靶抗原刺激依赖性的方式使表达上述CAR的细胞增殖，且能够在表达上述CAR的细胞中诱导靶抗原依赖性细胞毒活性等的激活。因此，本发明的第1筛选方法通过实施多次上述第1接触工序，例如能够适宜地筛选在生物体内更适宜地发挥作用的CAR中所能使用的scFv。
也可以说，上述第1接触工序通过靶抗原刺激了候选免疫细胞中的表达识别靶抗原的CAR的候选免疫细胞。因此，第1接触工序例如也可以称为抗原刺激工序。
上述第1接触工序中，上述候选免疫细胞的数量没有特别限制，例如为1×105～1×108个细胞、1×105～1×107个细胞、1×105～1×106个细胞、1×106～5×106个细胞、1×106～3×106个细胞。
上述第1接触工序中使用表达上述靶抗原的细胞作为上述靶抗原时，在上述第1接触工序中，上述候选免疫细胞(E)与表达上述靶抗原的细胞(T)的细胞比(E：T)例如为2：1～50：1、5：1～40：1、10：1～30：1或约20：1。
此外，上述第1选择工序中，选择上述第1接触工序中与上述靶抗原结合的T细胞中表达的第1CAR的第1scFv作为能与上述靶抗原结合的第1候选scFv。上述靶抗原与上述候选免疫细胞的结合例如可以直接或间接地评价。对于上述靶抗原与上述候选免疫细胞的结合，例如在用作嵌合抗原受体的scFv时，从能够获得可诱导T细胞的激活和功能性的发挥的scFv的角度出发，可以通过间接评价来实施。
上述直接评价方法例如可以通过表面等离子共振(SPR)、流式细胞仪等检测抗体与抗原的结合的方法而实施。作为具体例，上述直接评价方法例如可以使用经标记的靶抗原的单体或多聚体而实施。在此情况下，上述第1选择工序中，例如，使上述经标记的靶抗原与上述候选免疫细胞接触。上述候选免疫细胞表达与上述靶抗原结合的CAR时，上述经标记的靶抗原与上述候选免疫细胞形成复合体。因此，上述第1选择工序中，例如可以将形成了包含上述标记的复合体的候选免疫细胞评价为与上述靶抗原结合的T细胞。
作为具体例，上述直接评价方法中，将上述候选免疫细胞与经荧光标记的靶抗原的多聚体混合，使表达上述靶抗原特异性的CAR的候选免疫细胞与上述经荧光标记的靶抗原形成复合体。接着，通过流式细胞仪对得到的混合物进行解析，基于来自上述荧光标记的信号检测、评价和选择与上述经荧光标记的靶抗原形成了复合体的候选免疫细胞。
另外，上述间接评价方法例如可以如下所示而实施。表达与上述靶抗原结合的CAR的T细胞例如因与上述靶抗原结合而被激活。因此，上述间接评价方法例如以上述候选免疫细胞的激活为指标进行评价。作为具体例，上述候选免疫细胞与上述靶抗原结合时，例如，上述免疫细胞相较于未与上述靶抗原结合的候选免疫细胞会发生激活标记的表达上调、细胞因子和/或趋化因子的产生量增加、增殖等。作为具体例，上述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞时，上述各细胞中例如会发生下述激活标记的表达上调、下述细胞因子和/或趋化因子的产生量增加、增殖等。因此，上述第1选择工序中，例如，在基于任意1个以上的指标判断上述候选免疫细胞被激活时，可以将上述被激活的免疫细胞评价为与上述靶抗原结合的免疫细胞。对于上述细胞因子和/或趋化因子的产生量的增加，例如可以使用当上述细胞因子和/或趋化因子的表达被诱导时mRNA或蛋白质的表达量会增加的报道基因。上述报道基因例如可列举出荧光蛋白。上述增殖例如可以用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)等荧光细胞染色色素等将细胞染色并以荧光强度的衰减作为指标进行评价。
·T细胞
激活标记：CD69、CD107a等
细胞因子·趋化因子：IFN-γ、IL-12、IL-2、TNFα、MIP-1β等
·NK细胞
激活标记：CD69、CD107a等
细胞因子·趋化因子：INF-γ、IL-12等
·NKT细胞
激活标记：CD69、CD107a、CD25等
细胞因子·趋化因子：INF-γ、IL-2等
·B细胞
激活标记：CD28、CD69、CD80、CD138、B220等
细胞因子·趋化因子：CXCR4等
然后，选择与上述靶抗原结合的候选免疫细胞所表达的第1CAR的第1scFv作为能与上述靶抗原结合的第1候选scFv。上述第1候选scFv的选择例如可以通过如下方式实施：选择与上述靶抗原结合的候选免疫细胞，对所选择的候选免疫细胞中的编码scFv或CAR的碱基序列进行解析，从而实施。上述第1选择工序中，例如可以进一步鉴定上述第1候选scFv中的、重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、以及轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。各CDR的鉴定例如可以参照基因组信息(例如，IMGT的主页<http://www.imgt.org/>)并利用公知的方法而实施。
由此，能够筛选与上述靶抗原结合的新的scFv。另外，上述第1CAR文库中的第1CAR满足上述条件1时，利用本发明的第1筛选方法，能够筛选与上述靶抗原结合的新的轻链可变区。上述第1CAR文库中的第1CAR满足上述条件2时，利用本发明的第1筛选方法，能够筛选与上述靶抗原结合的新的重链可变区。
本发明的第1筛选方法例如可以将上述第1候选scFv的新的重链可变区或轻链可变区分别作为上述第1CAR文库中的与靶抗原结合的抗原等中的重链可变区或轻链可变区来实施其他区域的筛选。在此情况下，本发明的第1筛选方法例如进一步包括基于上述第1候选scFv来制备第2CAR文库的制备工序。
上述第2CAR文库例如包含编码第2CAR的核酸。另外，上述第2CAR例如包含第2抗原结合结构域、第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域。另外，上述第2抗原结合结构域例如包含能筛选与上述靶抗原的结合的第2scFv。
上述编码第2CAR的核酸例如是指编码第2CAR的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)。
上述第2scFv中，上述靶抗原与上述第1scFv中的靶抗原相同。上述第2scFv例如具有与上述第1scFv相似的结构。
上述第2scFv例如包含第2重链可变区和第2轻链可变区。上述第2重链可变区例如具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第2轻链可变区例如具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区例如满足下述条件3或条件4。
条件3：
上述第1表达工序中的CAR文库满足上述条件1时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含上述第1候选scFv中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
条件4：
上述第1表达工序中的CAR文库满足上述条件2时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含上述第1候选scFv中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
上述条件3例如是使用利用满足上述条件1的第1CAR文库所筛选的第1候选scFv来制备第2CAR文库的情况。上述条件3下，例如，上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3利用上述第1候选scFv对于上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3筛选与上述靶抗原的结合。
对于上述第2重链可变区中的第2B细胞受体，例如可以在上述条件2的第1重链可变区的说明中将“第1B细胞受体”替换为“第2B细胞受体”、将“第1重链可变区”替换为“第2重链可变区”并援用其说明。
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第2B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第2重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第2B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第2B细胞受体”与上述各FRH的说明中的“第2B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第2重链可变区例如可以包含上述第2B细胞受体中的重链可变区。在此情况下，上述第2重链可变区例如可以是由上述第2B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第1候选scFv的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中，FR例如可以包含上述第1候选scFv中的轻链可变区的FR。上述第2轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第1候选scFv的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第1候选scFv”与上述各FRL的说明中的“第1候选scFv”优选为相同的scFv。
上述第2轻链可变区例如可以包含上述第1候选scFv中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是分别由上述第1候选scFv中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
接着，上述条件4例如是使用利用满足上述条件2的第1CAR文库所筛选的第1候选scFv来制备第2CAR文库的情况。上述条件4中，例如，上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3使用上述第1候选scFv对于上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3筛选与上述靶抗原的结合。
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第1候选scFv的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第2重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第1候选scFv的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第1候选scFv”与上述各FRH的说明中的“第1候选scFv”优选为相同的scFv。
上述第2重链可变区例如可以包含上述第1候选scFv中的重链可变区。在此情况下，上述第2重链可变区例如可以是由上述第1候选scFv中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中的第2B细胞受体例如可以在上述条件1的第1轻链可变区的说明中将“第1B细胞受体”替换为“第2B细胞受体”、将“第1轻链可变区”替换为“第2轻链可变区”并援用其说明。
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第2B细胞受体的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第2B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第2B细胞受体”与上述各FRL的说明中的“第2B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第2轻链可变区例如可以包含上述第2B细胞受体中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是由上述第2B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2scFv中，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区例如通过上述的连接肽(Fv连接肽)而连接。上述第2scFv中的Fv连接肽例如可以与上述第1scFv中的Fv连接肽相同，也可以不同。
上述第2抗原结合结构域包含第2scFv，但上述第2结合结构域可以具有包含上述重链可变区和上述轻链可变区的、除scFv以外的结构。作为具体例，上述第2结合结构域可以是Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv等。
上述第2CAR中，上述第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域例如可以分别与上述第1CAR文库中的上述第1跨膜结构域和第1细胞内信号转导结构域相同，也可以不同。上述第2CAR文库中，上述第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域例如可以分别援用上述本发明的CAR文库中的第1跨膜结构域和第1细胞内信号转导结构域的说明。
上述第2CAR中，各结构域间例如也可以通过连接肽(结构域连接肽)而连接。上述结构域连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述结构域连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。
上述第2CAR例如可列举出由上述式(1)(序列号15)所示的氨基酸序列组成的多肽。上述式(1)中，V1和V2分别为重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列、或轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。对于上述第2CAR中的重链可变区和轻链可变区的顺序，例如，从能够更简便地制备第2CAR文库的方面考虑，优选与上述第1CAR中的重链可变区和轻链可变区的顺序相反的顺序。作为具体例，上述第1CAR中，从N末端起依次配置了重链可变区和轻链可变区时，第2CAR中，从N末端起例如依次配置轻链可变区和重链可变区。上述第1CAR中，从N末端起依次配置了轻链可变区和重链可变区时，第2CAR中，从N末端起例如依次配置重链可变区和轻链可变区。
上述编码第2CAR的核酸例如可列举出由上述式(2)(序列号16)所示的碱基序列组成的多核苷酸。上述式(2)中，N1和N2分别为编码重链可变区和轻链可变区的碱基序列、或编码轻链可变区和重链可变区的碱基序列。
上述第2CAR文库例如优选包含多种核酸。在此情况下，上述第2CAR文库例如为多种核酸的混合物。上述多种核酸例如优选其一部分或全部编码不同的第2CAR，优选编码不同的第2抗原结合结构域。多种核酸编码不同的第2抗原结合结构域时，上述第2CAR中的除第2抗原结合结构域以外的区域例如为相同的或不同的氨基酸序列。上述第2CAR文库中包含的上述核酸的种类例如为1×105～1×107种、1×105～1×106种、1×106～5×106种，优选为约2×106种(例如，1×106～3×106种)。
上述第2CAR例如可以在N末端具有信号肽。上述第2CAR例如可以具有标签。上述信号肽和标签例如可以在上述第1CAR中的信号肽和标签的说明中将“第1CAR”替换为“第2CAR”并援用其说明。
本发明中，上述编码第2CAR的核酸例如可以基于上述第2CAR的氨基酸序列并利用常规方法而制备。作为具体例，上述编码第2CAR的核酸例如可以如下制备：在注册了上述的各结构域的氨基酸序列的数据库中，获得编码上述氨基酸序列的碱基序列，基于上述碱基序列，利用分子生物学方法和/或化学合成方法进行制备。上述核酸的碱基序列例如可以根据表达上述第2CAR文库的细胞的来源进行密码子最优化。
上述编码第2CAR的核酸例如可以导入表达载体中。上述表达载体例如可以援用上述本发明的CAR文库中的表达载体的说明。
接着，本发明的第1筛选方法例如可以使用上述制备工序中制备的第2CAR文库代替上述第1CAR文库、并且除此以外同样地实施表达工序、接触工序、及选择工序。具体而言，本发明的第1筛选方法例如进一步包括如下工序：第2表达工序，使免疫细胞表达上述第2CAR文库；第2接触工序，使上述第2表达工序中得到的免疫细胞与上述靶抗原接触；及第2选择工序，将上述第2接触工序中与上述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第2scFv作为能与上述靶抗原结合的第2候选scFv。上述第1表达工序、第1接触工序、及第1选择工序中的免疫细胞可以与上述第2表达工序、第2接触工序、及第2选择工序中的免疫细胞相同，也可以不同。上述免疫细胞优选T细胞或T细胞样的细胞。
上述第2表达工序例如可以在上述第1表达工序的说明中将“第1表达工序”替换为“第2表达工序”、将“第1CAR文库”替换为“第2CAR文库”、将“第1CAR”替换为“第2CAR”并援用其说明。
上述第2接触工序例如可以在上述第1接触工序的说明中将“第1表达工序”替换为“第2表达工序”、将“第1接触工序”替换为“第2接触工序”并援用其说明。
上述第2选择工序例如可以在上述第1选择工序的说明中将“第1接触工序”替换为“第2接触工序”、将“第1选择工序”替换为“第2选择工序”、将“第1scFv”替换为“第2scFv”、将“第1候选scFv”替换为“第2候选scFv”、将“第1CAR”替换为“第2CAR”并援用其说明。
由此，本发明的第1筛选方法例如能够筛选具有与上述靶抗原结合的新的重链可变区和轻链可变区的scFv。
本发明的第1筛选方法可以包括基于第1候选scFv或第2候选scFv来设计抗体或其抗原结合片段的设计工序。上述设计工序例如可以通过如下方式实施：将上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、以及轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3移植到新的抗体或其抗原结合片段中，从而实施。具体而言，上述设计工序例如可以通过如下方式实施：分别将上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列、及上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列作为新的抗体或其抗原结合片段中的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列和轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列，从而实施。上述设计工序中的CDR的移植例如可以对上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的1个CDR实施，也可以对多个CDR实施，优选对全部CDR实施。上述新的抗体及其抗原结合片段的种类例如可以援用后述的本发明的抗体或其抗原结合片段的种类的说明。
上述设计工序中，可以将上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4以及轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4移植到新的抗体或其抗原结合片段中。在此情况下，上述设计工序中，例如，可以通过将上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列、及上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列分别作为新的抗体或其抗原结合片段中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列及轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列，从而实施。对于上述设计工序中的FR的移植，例如可以对上述第1候选scFv或上述第2候选scFv中的1个FR实施，也可以对多个FR实施，优选对全部FR实施。
本发明的第1筛选方法中包括上述第1表达工序，但本发明不限定于此，也可以不包括上述第1表达工序。在此情况下，本发明的第1筛选方法例如可以使用预先制备的、表达上述本发明的CAR文库的免疫细胞(CAR文库细胞)从第1接触工序开始实施。
<CAR文库细胞>
本发明的嵌合抗原受体(CAR)文库细胞包含表达上述本发明的CAR文库的细胞。本发明的CAR文库细胞的特征在于包含表达上述本发明的CAR文库的细胞，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的CAR文库细胞表达细胞，可以适宜地实施上述本发明的第1筛选方法。本发明的CAR文库细胞可以援用上述本发明的CAR文库和第1筛选方法的说明。
本发明的CAR文库细胞的数量例如为1×105～1×108个细胞、1×105～1×107个细胞、1×105～1×106个细胞、1×106～5×106个细胞、1×106～3×106个细胞。上述CAR文库细胞例如优选分别表达上述本发明的CAR文库中的不同的CAR。上述CAR文库细胞例如可以包含未表达上述本发明的CAR文库的细胞、即未导入CAR文库的细胞。
对于本发明的CAR文库细胞所表达的CAR的种类，每1×106个细胞的CAR文库细胞例如为1×104～1×107种、1×105～1×106种、1×106～5×106种、1×105～1×106种。
本发明的CAR文库细胞例如可以与上述本发明的第1筛选方法的第1表达工序同样地制造。本发明的CAR文库细胞例如优选为源自免疫细胞的细胞，优选为T细胞、NK细胞、NKT细胞来源。
<第1抗体或其抗原结合片段>
如前所述，本发明的针对HLA-A*02：01和NY-ESO-1157-165的复合体(以下也称为“A2/NY-ESO-1157”)的抗体或其抗原结合片段包含下述(H)的重链可变区和下述(L)的轻链可变区。本发明的抗体等的特征在于包含下述(H)的重链可变区和下述(L)的轻链可变区，其它构成和条件没有特别限制。本发明的抗体等与A2/NY-ESO-1157结合。另外，A2/NY-ESO-1157例如已知在肺癌、恶性黑色素瘤、滑膜肉瘤、骨髓瘤等特定的癌细胞中表达。因此，本发明的抗体等例如可以适宜地用作针对表达A2/NY-ESO-1157的癌细胞的双特异性抗体、CAR-T细胞的CAR的抗原结合结构域等。可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法等的说明。
(H)包含重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3的重链可变区
CDRH1是包含下述(H1)的氨基酸序列的多肽
CDRH2是包含下述(H2)的氨基酸序列的多肽
CDRH3是包含下述(H3)的氨基酸序列的多肽
(H1)下述(H1-1)、(H1-2)或(H1-3)的氨基酸序列
(H1-1)下述表1A的CDRH1中任意的氨基酸序列
(H1-2)相对于(H1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-3)在(H1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2)下述(H2-1)、(H2-2)或(H2-3)的氨基酸序列
(H2-1)下述表1A的CDRH2中任意的氨基酸序列
(H2-2)相对于(H2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-3)在(H2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3)下述(H3-1)、(H3-2)或(H3-3)的氨基酸序列
(H3-1)下述表1A的CDRH3中任意的氨基酸序列
(H3-2)相对于(H3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-3)在(H3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L)包含轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区
CDRL1是包含下述(L1)的氨基酸序列的多肽
CDRL2是包含下述(L2)的氨基酸序列的多肽
CDRL3是包含下述(L3)的氨基酸序列的多肽
(L1)下述(L1-1)、(L1-2)或(L1-3)的氨基酸序列
(L1-1)下述表1B的CDRL1中任意的氨基酸序列
(L1-2)相对于(L1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-3)在(L1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2)下述(L2-1)、(L2-2)或(L2-3)的氨基酸序列
(L2-1)下述表1B的CDRL2中任意的氨基酸序列
(L2-2)相对于(L2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-3)在(L2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3)下述(L3-1)、(L3-2)或(L3-3)的氨基酸序列
(L3-1)下述表1B的CDRL3中任意的氨基酸序列
(L3-2)相对于(L3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-3)在(L3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
[表1A]
[表1B]
本发明中，“HLA-A*02：01”例如是指源自人主要组织相容性复合物(MHC)的A*02：01等位基因的I类抗原。HLA-A*02：01例如与人β2-微球蛋白形成复合体。HLA-A*02：01的氨基酸序列例如可列举出以NCBI注册号HG794376注册的氨基酸序列。人β2-微球蛋白的氨基酸序列例如可列举出以NCBI注册号NM_004048.2注册的氨基酸序列。
本发明中，“NY-ESO-1157-165”例如是指由NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列中第157～165位的氨基酸(SLLMWITQC(序列号206)构成的肽。NY-ESO-1例如为人肺癌、恶性黑色素瘤、滑膜肉瘤、骨髓瘤等癌症中表达的癌抗原。NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列例如可列举出以NCBI注册号NM_001327.2注册的氨基酸序列。
本发明中，“A2/NY-ESO-1157”例如是指由HLA-A*02：01与NY-ESO-1157-165所形成的复合体，具体而言，是指NY-ESO-1157-165与HLA-A*02：01的肽结合沟结合而成的复合体。A2/NY-ESO-1157优选为NY-ESO-1157-165跟HLA-A*02：01与人β2-微球蛋白的复合体的肽结合沟结合而成的复合体。
本发明的抗体例如可以是分子结构为免疫球蛋白的所谓“抗体”，也可以是其抗原结合片段。本发明的抗体等具有上述的上述重链可变区和上述轻链可变区即可。本发明为抗体时，例如，其免疫球蛋白类型和同种型没有特别限制。上述免疫球蛋白类型例如可列举出IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等。上述IgG例如可列举出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。
上述抗体例如也可以为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人(例如，全人源)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体等。
本发明中的“抗原结合片段”是指为上述抗体的一部分、例如部分片段且识别(结合)上述A2/NY-ESO-1157者。上述抗原结合片段例如可列举出Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链Fv(scFv)、双特异性抗体和它们的聚合物等。上述scFv中，例如，上述重链可变区和上述轻链可变区通过连接体而连接。上述重链可变区、上述连接体、及上述轻链可变区的顺序可以是从N末端起为上述重链可变区、上述连接体、及上述轻链可变区的顺序，也可以是从N末端起上述轻链可变区、上述连接体、及上述重链可变区的顺序。
除了上述的上述重链可变区和上述轻链可变区之外，本发明的抗体等例如可以具有恒定区，上述恒定区例如为人恒定区或小鼠恒定区。抗体(免疫球蛋白)的情况下，重链的恒定区例如包含CH1、CH2和CH3这样的区域，轻链的恒定区例如包含CL这一区域。本发明的抗体等具有上述恒定区时，例如，上述重链可变区与CH1、CH2和CH3中的至少1个结合，上述轻链可变区与上述CL结合，上述重链可变区例如与CH1直接结合。
通常，抗体分子的重链和轻链分别具有3个互补决定区(CDR：Complemetaritydetermining region)。CDR也称为高变区(hypervariable domain)。CDR也是上述重链和轻链的可变区，是一级结构的突变性特别高的区域，在一级结构中通常分散在3个位置。本发明中，将重链中的3个CDR从重链的氨基酸序列中的氨基末端侧起表示为重链CDR1(CDRH1)、重链CDR2(CDRH2)和重链CDR3(CDRH3)，将轻链中的3个CDR从轻链的氨基酸序列中的氨基末端侧起表示为轻链CDR1(CDRL1)、轻链CDR2(CDRL2)和轻链CDR3(CDRL3)。这些位点在立体结构上彼此接近并决定了对所结合的抗原的特异性。
上述(H)的重链可变区中，上述CDRH1为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH1。上述CDRH2为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH2。上述CDRH3为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH3。
上述(L)的轻链可变区中，上述CDRL1为上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL1。上述CDRL2为上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL2。上述CDRL3为上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL3。
上述各CDR中，“同一性”例如是指适宜地比对要比较的序列彼此时的、一致性的程度，表示上述序列之间的氨基酸的精确匹配的发生率(％)。上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。上述同一性例如可以适宜地使用BLAST、FASTA等解析软件并利用缺省参数而算出(以下同样)。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述氨基酸的置换例如可以是保守性置换(以下同样)。上述保守性置换是指：将1个或数个氨基酸置换为其它氨基酸和/或氨基酸衍生物而实质上不改变蛋白质的功能。“要置换的氨基酸”和“被置换的氨基酸”例如优选性质和/或功能相似。具体而言，例如优选疏水性和亲水性的指标(Hydropathy)、极性、电荷等化学性质、或者二级结构等物理性质等相似。上述性质和/或功能相似的氨基酸或氨基酸衍生物例如在该技术领域中是公知的。作为具体例，非极性氨基酸(疏水性氨基酸)例如可列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等，极性氨基酸(中性氨基酸)可列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等，具有正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)可列举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等，具有负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)可列举出天冬氨酸、谷氨酸等。
上述(H)的重链可变区中，上述(H1-1)、(H2-1)和(H3-1)的组合没有特别限制，例如分别为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH1、与上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH2、与上述(HA)或(HB)中的CDRH3的任意的组合。上述(H1-1)、(H2-1)和(H3-1)的组合优选为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
上述(L)的轻链可变区中，上述(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)的组合没有特别限制，例如可以分别为上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL1、与上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL2、与上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL3的任意的组合。上述(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)的组合优选为上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL1、CDRL2和CDRL3。
上述(H1-1)、(H2-1)和(H3-1)、与上述(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)的组合没有特别限制，例如可以分别为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH1、上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH2、及上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH3、及上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL1、上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL2、以及上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL3的任意的组合。上述(H1-1)、(H2-1)和(H3-1)、与上述(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)的组合优选分别为上述(HA)、(HB)或(HC)中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、及上述(LA)～(LQ)和(LR)中的任意1个CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合，更优选为下述表2的组合。
[表2]
| 组合 | 重链可变区 | 轻链可变区 |
| (1) | (HA) | (LA) |
| (2) | (HA) | (LB) |
| (3) | (HA) | (LC) |
| (4) | (HA) | (LD) |
| (5) | (HA) | (LE) |
| (6) | (HA) | (LF) |
| (7) | (HA) | (LG) |
| (8) | (HA) | (LH) |
| (9) | (HA) | (LI) |
| (10) | (HA) | (LJ) |
| (11) | (HB) | (LK) |
| (12) | (HB) | (LL) |
| (13) | (HB) | (LM) |
| (14) | (HB) | (LN) |
| (15) | (HB) | (LO) |
| (16) | (HB) | (LP) |
| (17) | (HB) | (LQ) |
| (18) | (HC) | (LA) |
以下，对本发明的抗体等而言，对上述重链可变区或重链与上述轻链可变区或轻链的组合进行更具体地说明。各组合中的重链可变区和重链的说明可以互相援用。另外，各组合中的轻链可变区和轻链的说明可以互相援用。另外，以下所示的氨基酸序列和碱基序列中，只要没有特别声明，下划线所示的氨基酸序列和碱基序列就是对应于CDR的氨基酸序列和编码对应于CDR的氨基酸序列的碱基序列。
本发明的抗体等中，如前所述，上述重链可变区与上述轻链可变区的组合例如为上述(1)～(18)的组合。
组合(1)
组合(1)的抗体等例如也称为抗体H1-3M4E5L组。上述组合(1)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含下述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含下述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含下述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LA)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-A)的氨基酸序列的多肽。
(H1-A)下述(H1-A1)、(H1-A2)或(H1-A3)的氨基酸序列
(H1-A1)序列号17(GGSISSNY)的氨基酸序列
(H1-A2)相对于序列号17的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-A3)在序列号17的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2-A)下述(H2-A1)、(H2-A2)或(H2-A3)的氨基酸序列
(H2-A1)序列号18(VSYSGST)的氨基酸序列
(H2-A2)相对于序列号18的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-A3)在序列号18的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3-A)下述(H3-A1)、(H3-A2)或(H3-A3)的氨基酸序列
(H3-A1)序列号19(ARESYYYYGMDV)的氨基酸序列
(H3-A2)相对于序列号19的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-A3)在序列号19的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L1-A)下述(L1-A1)、(L1-A2)或(L1-A3)的氨基酸序列
(L1-A1)序列号29(SRDVGGYNY)的氨基酸序列
(L1-A2)相对于序列号29的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-A3)在序列号29的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-A)下述(L2-A1)、(L2-A2)或(L2-A3)的氨基酸序列
(L2-A1)序列号30(DVI)的氨基酸序列
(L2-A2)相对于序列号30的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-A3)在序列号30的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-A)下述(L3-A1)、(L3-A2)或(L3-A3)的氨基酸序列
(L3-A1)序列号31(WSFAGSYYV)的氨基酸序列
(L3-A2)相对于序列号31的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-A3)在序列号31的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(1)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由下述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LA)的轻链可变区例如包含由下述(L-A)的氨基酸序列组成的多肽。
(H-A)下述(H-A1)、(H-A2)或(H-A3)的氨基酸序列
(H-A1)序列号20的氨基酸序列
序列号20：QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCLVSGGSISSNYWSWIRQAPGKGLEWIGHVSYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARESYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(H-A2)相对于序列号20的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H-A3)在序列号20的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L-A)下述(L-A1)、(L-A2)或(L-A3)的氨基酸序列
(L-A1)序列号32的氨基酸序列
序列号32：QSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVL
(L-A2)相对于序列号32的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-A3)在序列号32的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(H-A1)的氨基酸序列例如是包含CDRH1的(H1-A1)、CDRH2的(H2-A1)和CDRH3的(H3-A1)的氨基酸序列的序列。上述(H-A2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-A1)、CDRH2的(H2-A1)和CDRH3(H3-A1)的氨基酸序列、且相对于序列号20的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(H-A3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-A1)、CDRH2的(H2-A1)和CDRH3(H3-A1)的氨基酸序列、且在序列号20的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
上述(L-A1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-A1)、CDRL2的(L2-A1)和CDRL3的(L3-A1)的氨基酸序列的序列。上述(L-A2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-A1)、CDRL2的(L2-A1)和CDRL3的(L3-A1)的氨基酸序列、且相对于序列号32的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-A3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-A1)、CDRL2的(L2-A1)和CDRL3的(L3-A1)的氨基酸序列、且在序列号32的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-A1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-3M4E5L”。
上述重链可变区的多肽和上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述重链可变区的多肽和上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(2)
组合(2)的抗体等例如也称为抗体H1-K52组。上述组合(2)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LB)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-B)的氨基酸序列的多肽。
(L1-B)下述(L1-B1)、(L1-B2)或(L1-B3)的氨基酸序列
(L1-B1)序列号33(QSISSY)的氨基酸序列
(L1-B2)相对于序列号33的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-B3)在序列号33的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-B)下述(L2-B1)、(L2-B2)或(L2-B3)的氨基酸序列
(L2-B1)序列号34(AAS)的氨基酸序列
(L2-B2)相对于序列号34的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-B3)在序列号34的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-B)下述(L3-B1)、(L3-B2)或(L3-B3)的氨基酸序列
(L3-B1)序列号35(QQYYSTPQT)的氨基酸序列
(L3-B2)相对于序列号35的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-B3)在序列号35的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(2)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LB)的轻链可变区例如包含由下述(L-B)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-B)下述(L-B1)、(L-B2)或(L-B3)的氨基酸序列
(L-B1)序列号36的氨基酸序列
序列号36：DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPQTFGPGTKVDIK
(L-B2)相对于序列号36的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-B3)在序列号36的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-B1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-B1)、CDRL2的(L2-B1)和CDRL3的(L3-B1)的氨基酸序列的序列。上述(L-B2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-B1)、CDRL2的(L2-B1)和CDRL3的(L3-B1)的氨基酸序列、且相对于序列号36的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-B3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-B1)、CDRL2的(L2-B1)和CDRL3的(L3-B1)的氨基酸序列、且在序列号36的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-B1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K52”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(3)
组合(3)的抗体等例如也称为抗体H1-K73组。上述组合(3)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LC)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-C)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-C)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-C)的氨基酸序列的多肽。
(L1-C)下述(L1-C1)、(L1-C2)或(L1-C3)的氨基酸序列
(L1-C1)序列号37(QSISSY)的氨基酸序列
(L1-C2)相对于序列号37的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-C3)在序列号37的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-C)下述(L2-C1)、(L2-C2)或(L2-C3)的氨基酸序列
(L2-C1)序列号38(AAS)的氨基酸序列
(L2-C2)相对于序列号38的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-C3)在序列号38的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-C)下述(L3-C1)、(L3-C2)或(L3-C3)的氨基酸序列
(L3-C1)序列号39(QQYESYRRS)的氨基酸序列
(L3-C2)相对于序列号39的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-C3)在序列号39的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(3)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LC)的轻链可变区例如包含由下述(L-C)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-C)下述(L-C1)、(L-C2)或(L-C3)的氨基酸序列
(L-C1)序列号40的氨基酸序列
序列号40：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYRRSFGQGTKVEIK
(L-C2)相对于序列号40的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-C3)在序列号40的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-C1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-C1)、CDRL2的(L2-C1)和CDRL3的(L3-C1)的氨基酸序列的序列。上述(L-C2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-C1)、CDRL2的(L2-C1)和CDRL3的(L3-C1)的氨基酸序列、且相对于序列号40的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-C3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-C1)、CDRL2的(L2-C1)和CDRL3的(L3-C1)的氨基酸序列、且在序列号40的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-C1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K73”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(4)
组合(4)的抗体等例如也称为抗体H1-K121-K124组。上述组合(4)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LD)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-D)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-D)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-D)的氨基酸序列的多肽。
(L1-D)下述(L1-D1)、(L1-D2)或(L1-D3)的氨基酸序列
(L1-D1)序列号41(QSISSY)的氨基酸序列
(L1-D2)相对于序列号41的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-D3)在序列号41的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-D)下述(L2-D1)、(L2-D2)或(L2-D3)的氨基酸序列
(L2-D1)序列号42(AAS)的氨基酸序列
(L2-D2)相对于序列号42的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-D3)在序列号42的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-D)下述(L3-D1)、(L3-D2)或(L3-D3)的氨基酸序列
(L3-D1)序列号43(QQYNSYSRT)的氨基酸序列
(L3-D2)相对于序列号43的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-D3)在序列号43的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(4)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LD)的轻链可变区例如包含由下述(L-DA)或(L-DB)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-DA)下述(L-DA1)、(L-DA2)或(L-DA3)的氨基酸序列
(L-DA1)序列号44的氨基酸序列
序列号44：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-DA2)相对于序列号44的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-DA3)在序列号44的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L-DB)下述(L-DB1)、(L-DB2)或(L-DB3)的氨基酸序列
(L-DB1)序列号45的氨基酸序列
序列号45：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-DB2)相对于序列号45的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-DB3)在序列号45的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-DA1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列的序列。上述(L-DA2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列、且相对于序列号44的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-DA3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列、且在序列号44的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
上述(L-DB1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列的序列。上述(L-DB2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列、且相对于序列号45的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-DB3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列、且在序列号45的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-DA1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K121”。另外，对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-DB1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K124”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(5)
组合(5)的抗体等例如也称为抗体H1-K125组。上述组合(5)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LE)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-E)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-E)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-E)的氨基酸序列的多肽。
(L1-E)下述(L1-E1)、(L1-E2)或(L1-E3)的氨基酸序列
(L1-E1)序列号46(QSISSY)的氨基酸序列
(L1-E2)相对于序列号46的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-E3)在序列号46的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-E)下述(L2-E1)、(L2-E2)或(L2-E3)的氨基酸序列
(L2-E1)序列号47(AAS)的氨基酸序列
(L2-E2)相对于序列号47的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-E3)在序列号47的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-E)下述(L3-E1)、(L3-E2)或(L3-E3)的氨基酸序列
(L3-E1)序列号48(QQYNSYSPCT)的氨基酸序列
(L3-E2)相对于序列号48的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-E3)在序列号48的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(5)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LE)的轻链可变区例如包含由下述(L-E)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-E)下述(L-E1)、(L-E2)或(L-E3)的氨基酸序列
(L-E1)序列号49的氨基酸序列
序列号49：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPCTFGPGTKVDIK
(L-E2)相对于序列号49的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-E3)在序列号49的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-E1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-E1)、CDRL2的(L2-E1)和CDRL3的(L3-E1)的氨基酸序列的序列。上述(L-E2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-E1)、CDRL2的(L2-E1)和CDRL3的(L3-E1)的氨基酸序列、且相对于序列号49的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-E3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-E1)、CDRL2的(L2-E1)和CDRL3的(L3-E1)的氨基酸序列、且在序列号49的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-E1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K125”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(6)
组合(6)的抗体等例如也称为抗体H1-K131组。上述组合(6)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LF)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-F)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-F)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-F)的氨基酸序列的多肽。
(L1-F)下述(L1-F1)、(L1-F2)或(L1-F3)的氨基酸序列
(L1-F1)序列号50(QDISRY)的氨基酸序列
(L1-F2)相对于序列号50的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-F3)在序列号50的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-F)下述(L2-F1)、(L2-F2)或(L2-F3)的氨基酸序列
(L2-F1)序列号51(AAS)的氨基酸序列
(L2-F2)相对于序列号51的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-F3)在序列号51的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-F)下述(L3-F1)、(L3-F2)或(L3-F3)的氨基酸序列
(L3-F1)序列号52(QQYDNLIT)的氨基酸序列
(L3-F2)相对于序列号52的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-F3)在序列号52的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(6)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LF)的轻链可变区例如包含由下述(L-F)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-F)下述(L-F1)、(L-F2)或(L-F3)的氨基酸序列
(L-F1)序列号53的氨基酸序列
序列号53：DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIK
(L-F2)相对于序列号53的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-F3)在序列号53的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-F1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-F1)、CDRL2的(L2-F1)和CDRL3的(L3-F1)的氨基酸序列的序列。上述(L-F2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-F1)、CDRL2的(L2-F1)和CDRL3的(L3-F1)的氨基酸序列、且相对于序列号53的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-F3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-F1)、CDRL2的(L2-F1)和CDRL3的(L3-F1)的氨基酸序列、且在序列号53的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-F1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K131”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(7)
组合(7)的抗体等例如也称为抗体H1-K145组。上述组合(7)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LG)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-G)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-G)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-G)的氨基酸序列的多肽。
(L1-G)下述(L1-G1)、(L1-G2)或(L1-G3)的氨基酸序列
(L1-G1)序列号54(QDISRY)的氨基酸序列
(L1-G2)相对于序列号54的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-G3)在序列号54的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-G)下述(L2-G1)、(L2-G2)或(L2-G3)的氨基酸序列
(L2-G1)序列号55(AAS)的氨基酸序列
(L2-G2)相对于序列号55的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-G3)在序列号55的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-G)下述(L3-G1)、(L3-G2)或(L3-G3)的氨基酸序列
(L3-G1)序列号56(QQYNSYSRT)的氨基酸序列
(L3-G2)相对于序列号56的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-G3)在序列号56的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(7)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LG)的轻链可变区例如包含由下述(L-G)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-G)下述(L-G1)、(L-G2)或(L-G3)的氨基酸序列
(L-G1)序列号57的氨基酸序列
序列号57：DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQDISRYLNWYQQKPGKAPKLLLYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-G2)相对于序列号57的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-G3)在序列号57的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-G1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-G1)、CDRL2的(L2-G1)和CDRL3的(L3-G1)的氨基酸序列的序列。上述(L-G2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-G1)、CDRL2的(L2-G1)和CDRL3的(L3-G1)的氨基酸序列、且相对于序列号57的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-G3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-G1)、CDRL2的(L2-G1)和CDRL3的(L3-G1)的氨基酸序列、且在序列号57的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-G1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K145”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(8)
组合(8)的抗体等例如也称为抗体H1-K151组。上述组合(8)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LH)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-H)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-H)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-H)的氨基酸序列的多肽。
(L1-H)下述(L1-H1)、(L1-H2)或(L1-H3)的氨基酸序列
(L1-H1)序列号58(QSISSY)的氨基酸序列
(L1-H2)相对于序列号58的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-H3)在序列号58的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-H)下述(L2-H1)、(L2-H2)或(L2-H3)的氨基酸序列
(L2-H1)序列号59(AAS)的氨基酸序列
(L2-H2)相对于序列号59的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-H3)在序列号59的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-H)下述(L3-H1)、(L3-H2)或(L3-H3)的氨基酸序列
(L3-H1)序列号60(QQYDNLIT)的氨基酸序列
(L3-H2)相对于序列号60的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-H3)在序列号60的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(8)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LH)的轻链可变区例如包含由下述(L-H)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-H)下述(L-H1)、(L-H2)或(L-H3)的氨基酸序列
(L-H1)序列号61的氨基酸序列
序列号61：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYDNLITFGQGTRLEIK
(L-H2)相对于序列号61的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-H3)在序列号61的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-H1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-H1)、CDRL2的(L2-H1)和CDRL3的(L3-H1)的氨基酸序列的序列。上述(L-H2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-H1)、CDRL2的(L2-H1)和CDRL3的(L3-H1)的氨基酸序列、且相对于序列号61的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-H3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-H1)、CDRL2的(L2-H1)和CDRL3的(L3-H1)的氨基酸序列、且在序列号61的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-H1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K151”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(9)
组合(9)的抗体等例如也称为抗体H1-K160组。上述组合(9)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LI)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-I)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-I)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-I)的氨基酸序列的多肽。
(L1-I)下述(L1-I1)、(L1-I2)或(L1-I3)的氨基酸序列
(L1-I1)序列号62(QSVSSN)的氨基酸序列
(L1-I2)相对于序列号62的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-I3)在序列号62的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-I)下述(L2-I1)、(L2-I2)或(L2-I3)的氨基酸序列
(L2-I1)序列号63(GAS)的氨基酸序列
(L2-I2)相对于序列号63的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-I3)在序列号63的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-I)下述(L3-I1)、(L3-I2)或(L3-I3)的氨基酸序列
(L3-I1)序列号64(QQYNSYSRT)的氨基酸序列
(L3-I2)相对于序列号64的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-I3)在序列号64的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(9)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LI)的轻链可变区例如包含由下述(L-I)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-I)下述(L-I1)、(L-I2)或(L-I3)的氨基酸序列
(L-I1)序列号65的氨基酸序列
序列号65：EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISRLEPEDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKVEIK
(L-I2)相对于序列号65的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-I3)在序列号65的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-I1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-I1)、CDRL2的(L2-I1)和CDRL3的(L3-I1)的氨基酸序列的序列。上述(L-I2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-I1)、CDRL2的(L2-I1)和CDRL3的(L3-I1)的氨基酸序列，且相对于序列号65的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-I3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-I1)、CDRL2的(L2-I1)和CDRL3的(L3-I1)的氨基酸序列，且在序列号65的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-I1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K160”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(10)
组合(10)的抗体等例如也称为抗体H1-K173组。上述组合(10)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LJ)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-J)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-J)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-J)的氨基酸序列的多肽。
(L1-J)下述(L1-J1)、(L1-J2)或(L1-J3)的氨基酸序列
(L1-J1)序列号66(QSISSY)的氨基酸序列
(L1-J2)相对于序列号66的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-J3)在序列号66的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-J)下述(L2-J1)、(L2-J2)或(L2-J3)的氨基酸序列
(L2-J1)序列号67(AAS)的氨基酸序列
(L2-J2)相对于序列号67的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-J3)在序列号67的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-J)下述(L3-J1)、(L3-J2)或(L3-J3)的氨基酸序列
(L3-J1)序列号68(QQYESYSRT)的氨基酸序列
(L3-J2)相对于序列号68的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-J3)在序列号68的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(10)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LJ)的轻链可变区例如包含由下述(L-J)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-J)下述(L-J1)、(L-J2)或(L-J3)的氨基酸序列
(L-J1)序列号69的氨基酸序列
序列号69：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDVATYYCQQYESYSRTFGQGTKVEIK
(L-J2)相对于序列号69的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-J3)在序列号69的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-J1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-J1)、CDRL2的(L2-J1)和CDRL3的(L3-J1)的氨基酸序列的序列。上述(L-J2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-J1)、CDRL2的(L2-J1)和CDRL3的(L3-J1)的氨基酸序列、且相对于序列号69的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-J3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-J1)、CDRL2的(L2-J1)和CDRL3的(L3-J1)的氨基酸序列、且在序列号69的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-J1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K173”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(11)
组合(11)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L1组。上述组合(11)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1为包含下述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2为包含下述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3为包含下述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LK)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-K)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-K)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-K)的氨基酸序列的多肽。
(H1-B)下述(H1-B1)、(H1-B2)或(H1-B3)的氨基酸序列
(H1-B1)序列号21(GFTFSTYQ)的氨基酸序列
(H1-B2)相对于序列号21的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-B3)在序列号21的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2-B)下述(H2-B1)、(H2-B2)或(H2-B3)的氨基酸序列
(H2-B1)序列号22(IVSSGGST)的氨基酸序列
(H2-B2)相对于序列号22的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-B3)在序列号22的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3-B)下述(H3-B1)、(H3-B2)或(H3-B3)的氨基酸序列
(H3-B1)序列号23(AGELLPYYGMDV)的氨基酸序列
(H3-B2)相对于序列号23的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-B3)在序列号23的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L1-K)下述(L1-K1)、(L1-K2)或(L1-K3)的氨基酸序列
(L1-K1)序列号70(SSDVGGYDF)的氨基酸序列
(L1-K2)相对于序列号70的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-K3)在序列号70的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-K)下述(L2-K1)、(L2-K2)或(L2-K3)的氨基酸序列
(L2-K1)序列号71(DVN)的氨基酸序列
(L2-K2)相对于序列号71的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-K3)在序列号71的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-K)下述(L3-K1)、(L3-K2)或(L3-K3)的氨基酸序列
(L3-K1)序列号72(SSYAGSNSV)的氨基酸序列
(L3-K2)相对于序列号72的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-K3)在序列号72的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(11)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由下述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LK)的轻链可变区例如包含由下述(L-K)的氨基酸序列组成的多肽。
(H-B)下述(H-B1)、(H-B2)或(H-B3)的氨基酸序列
(H-B1)序列号24的氨基酸序列
序列号24：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSS
(H-B2)相对于序列号24的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H-B3)在序列号24的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L-K)下述(L-K1)、(L-K2)或(L-K3)的氨基酸序列
(L-K1)序列号73的氨基酸序列
序列号73：QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYDFVSWYQQHPGFAPKLLVYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCSSYAGSNSVFGTGTKVTVL
(L-K2)相对于序列号73的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-K3)在序列号73的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(H-B1)的氨基酸序列例如是包含CDRH1的(H1-B1)、CDRH2的(H2-B1)和CDRH3的(H3-B1)的氨基酸序列的序列。上述(H-B2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-B1)、CDRH2的(H2-B1)和CDRH3(H3-B1)的氨基酸序列、且相对于序列号24的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(H-B3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-B1)、CDRH2的(H2-B1)和CDRH3(H3-B1)的氨基酸序列、且在序列号24的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
上述(L-K1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-K1)、CDRL2的(L2-K1)和CDRL3的(L3-K1)的氨基酸序列的序列。上述(L-K2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-K1)、CDRL2的(L2-K1)和CDRL3的(L3-K1)的氨基酸序列、且相对于序列号73的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-K3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-K1)、CDRL2的(L2-K1)和CDRL3的(L3-K1)的氨基酸序列、且在序列号73的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-K1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L1”。
上述重链可变区的多肽和上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述重链可变区的多肽和上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(12)
组合(12)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L66组。上述组合(12)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LL)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-L)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-L)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-L)的氨基酸序列的多肽。
(L1-L)下述(L1-L1)、(L1-L2)或(L1-L3)的氨基酸序列
(L1-L1)序列号74(SSDVGGYEF)的氨基酸序列
(L1-L2)相对于序列号74的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-L3)在序列号74的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-L)下述(L2-L1)、(L2-L2)或(L2-L3)的氨基酸序列
(L2-L1)序列号75(DVI)的氨基酸序列
(L2-L2)相对于序列号75的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-L3)在序列号75的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-L)下述(L3-L1)、(L3-L2)或(L3-L3)的氨基酸序列
(L3-L1)序列号76(SSYTSSSTYV)的氨基酸序列
(L3-L2)相对于序列号76的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-L3)在序列号76的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(12)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由上述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LL)的轻链可变区例如包含由下述(L-L)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-L)下述(L-L1)、(L-L2)或(L-L3)的氨基酸序列
(L-L1)序列号77的氨基酸序列
序列号77：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYEFVSWYQQHPGSAPKLIIYDVIERPFGVSYRFSASKSGNTASLTISGLQGEDEADYFCSSYTSSSTYVFGTGTKVTVL
(L-L2)相对于序列号77的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-L3)在序列号77的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-L1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-L1)、CDRL2的(L2-L1)和CDRL3的(L3-L1)的氨基酸序列的序列。上述(L-L2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-L1)、CDRL2的(L2-L1)和CDRL3的(L3-L1)的氨基酸序列、且相对于序列号77的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-L3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-L1)、CDRL2的(L2-L1)和CDRL3的(L3-L1)的氨基酸序列、且在序列号77的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-L1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L66”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(13)
组合(13)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L73组。上述组合(13)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LM)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-M)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-M)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-M)的氨基酸序列的多肽。
(L1-M)下述(L1-M1)、(L1-M2)或(L1-M3)的氨基酸序列
(L1-M1)序列号78(GSDVGAYDY)的氨基酸序列
(L1-M2)相对于序列号78的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-M3)在序列号78的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-M)下述(L2-M1)、(L2-M2)或(L2-M3)的氨基酸序列
(L2-M1)序列号79(DVS)的氨基酸序列
(L2-M2)相对于序列号79的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-M3)在序列号79的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-M)下述(L3-M1)、(L3-M2)或(L3-M3)的氨基酸序列
(L3-M1)序列号80(SSYSGSSTWV)的氨基酸序列
(L3-M2)相对于序列号80的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-M3)在序列号80的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(13)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由上述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LM)的轻链可变区例如包含由下述(L-M)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-M)下述(L-M1)、(L-M2)或(L-M3)的氨基酸序列
(L-M1)序列号81的氨基酸序列
序列号81：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGAYDYVSWYQHHPGRAPRLIIRDVSVRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSGSSTWVFGGGTKLTVL
(L-M2)相对于序列号81的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-M3)在序列号81的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-M1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-M1)、CDRL2的(L2-M1)和CDRL3的(L3-M1)的氨基酸序列的序列。上述(L-M2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-M1)、CDRL2的(L2-M1)和CDRL3的(L3-M1)的氨基酸序列、且相对于序列号81的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-M3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-M1)、CDRL2的(L2-M1)和CDRL3的(L3-M1)的氨基酸序列、且在序列号81的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-M1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L73”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(14)
组合(14)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L80组。上述组合(14)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LN)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-N)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-N)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-N)的氨基酸序列的多肽。
(L1-N)下述(L1-N1)、(L1-N2)或(L1-N3)的氨基酸序列
(L1-N1)序列号82(SSDVGSYNL)的氨基酸序列
(L1-N2)相对于序列号82的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-N3)在序列号82的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-N)下述(L2-N1)、(L2-N2)或(L2-N3)的氨基酸序列
(L2-N1)序列号83(DVS)的氨基酸序列
(L2-N2)相对于序列号83的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-N3)在序列号83的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-N)下述(L3-N1)、(L3-N2)或(L3-N3)的氨基酸序列
(L3-N1)序列号84(SSYTSSSTFAV)的氨基酸序列
(L3-N2)相对于序列号84的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-N3)在序列号84的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(14)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由上述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LN)的轻链可变区例如包含由下述(L-N)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-N)下述(L-N1)、(L-N2)或(L-N3)的氨基酸序列
(L-N1)序列号85的氨基酸序列
序列号85：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSYRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTFAVFGGGTQLTVL
(L-N2)相对于序列号85的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-N3)在序列号85的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-N1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-N1)、CDRL2的(L2-N1)和CDRL3的(L3-N1)的氨基酸序列的序列。上述(L-N2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-N1)、CDRL2的(L2-N1)和CDRL3的(L3-N1)的氨基酸序列、且相对于序列号85的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-N3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-N1)、CDRL2的(L2-N1)和CDRL3的(L3-N1)的氨基酸序列、且在序列号85的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-N1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L80”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(15)
组合(15)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L88组。上述组合(15)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LO)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-O)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-O)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-O)的氨基酸序列的多肽。
(L1-O)下述(L1-O1)、(L1-O2)或(L1-O3)的氨基酸序列
(L1-O1)序列号86(SSDVGGYNY)的氨基酸序列
(L1-O2)相对于序列号86的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-O3)在序列号86的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-O)下述(L2-O1)、(L2-O2)或(L2-O3)的氨基酸序列
(L2-O1)序列号87(DVS)的氨基酸序列
(L2-O2)相对于序列号87的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-O3)在序列号87的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-O)下述(L3-O1)、(L3-O2)或(L3-O3)的氨基酸序列
(L3-O1)序列号88(CSYAGGYYV)的氨基酸序列
(L3-O2)相对于序列号88的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-O3)在序列号88的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(15)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由上述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LO)的轻链可变区例如包含由下述(L-O)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-O)下述(L-O1)、(L-O2)或(L-O3)的氨基酸序列
(L-O1)序列号89的氨基酸序列
序列号89：QSALPQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYFCCSYAGGYYVFGTGTKLTVL
(L-O2)相对于序列号89的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-O3)在序列号89的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-O1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-O1)、CDRL2的(L2-O1)和CDRL3的(L3-O1)的氨基酸序列的序列。上述(L-O2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-O1)、CDRL2的(L2-O1)和CDRL3的(L3-O1)的氨基酸序列、且相对于序列号89的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-O3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-O1)、CDRL2的(L2-O1)和CDRL3的(L3-O1)的氨基酸序列、且在序列号89的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-O1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L88”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(16)
组合(16)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L102组。上述组合(16)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LP)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-P)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-P)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-P)的氨基酸序列的多肽。
(L1-P)下述(L1-P1)、(L1-P2)或(L1-P3)的氨基酸序列
(L1-P1)序列号90(SSDVGGYNY)的氨基酸序列
(L1-P2)相对于序列号90的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-P3)在序列号90的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-P)下述(L2-P1)、(L2-P2)或(L2-P3)的氨基酸序列
(L2-P1)序列号91(DVS)的氨基酸序列
(L2-P2)相对于序列号91的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-P3)在序列号91的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-P)下述(L3-P1)、(L3-P2)或(L3-P3)的氨基酸序列
(L3-P1)序列号92(SSYAGSGSTPFV)的氨基酸序列
(L3-P2)相对于序列号92的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-P3)在序列号92的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(16)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由上述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LP)的轻链可变区例如包含由下述(L-P)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-P)下述(L-P1)、(L-P2)或(L-P3)的氨基酸序列
(L-P1)序列号93的氨基酸序列
序列号93：QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQTEDEADYYCSSYAGSGSTPFVFGTGTKLTVL
(L-P2)相对于序列号93的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-P3)在序列号93的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-P1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-P1)、CDRL2的(L2-P1)和CDRL3的(L3-P1)的氨基酸序列的序列。上述(L-P2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-P1)、CDRL2的(L2-P1)和CDRL3的(L3-P1)的氨基酸序列、且相对于序列号93的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-P3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-P1)、CDRL2的(L2-P1)和CDRL3的(L3-P1)的氨基酸序列、且在序列号93的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-P1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L102”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(17)
组合(17)的抗体等例如也称为抗体3M4E5H-L124组。上述组合(17)中，上述(HB)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-B)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LQ)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-Q)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-Q)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-Q)的氨基酸序列的多肽。
(L1-Q)下述(L1-Q1)、(L1-Q2)或(L1-Q3)的氨基酸序列
(L1-Q1)序列号94(SSDVGGYNY)的氨基酸序列
(L1-Q2)相对于序列号94的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-Q3)在序列号94的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-Q)下述(L2-Q1)、(L2-Q2)或(L2-Q3)的氨基酸序列
(L2-Q1)序列号95(DVS)的氨基酸序列
(L2-Q2)相对于序列号95的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-Q3)在序列号95的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-Q)下述(L3-Q1)、(L3-Q2)或(L3-Q3)的氨基酸序列
(L3-Q1)序列号96(CSYAGRRYV)的氨基酸序列
(L3-Q2)相对于序列号96的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-Q3)在序列号96的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(17)中，上述(HB)的重链可变区例如包含由上述(H-B)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LQ)的轻链可变区例如包含由下述(L-Q)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-Q)下述(L-Q1)、(L-Q2)或(L-Q3)的氨基酸序列
(L-Q1)序列号97的氨基酸序列
序列号97：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSRVPDRFAGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGRRYVFGTGTKLTVL
(L-Q2)相对于序列号97的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-Q3)在序列号97的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-Q1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-Q1)、CDRL2的(L2-Q1)和CDRL3的(L3-Q1)的氨基酸序列的序列。上述(L-Q2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-Q1)、CDRL2的(L2-Q1)和CDRL3的(L3-Q1)的氨基酸序列、且相对于序列号97的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-Q3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-Q1)、CDRL2的(L2-Q1)和CDRL3的(L3-Q1)的氨基酸序列、且在序列号97的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-B1)，上述轻链可变区为上述(L-Q1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体3M4E5H-L124”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
组合(18)
组合(18)的抗体等例如也称为抗体H73-3M4E5L组。上述组合(18)中，上述(HC)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含下述(H1-C)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含下述(H2-C)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含下述(H3-C)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LA)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含上述(L1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含上述(L2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含上述(L3-A)的氨基酸序列的多肽。
(H1-C)下述(H1-C1)、(H1-C2)或(H1-C3)的氨基酸序列
(H1-C1)序列号25(GGSISSYY)的氨基酸序列
(H1-C2)相对于序列号25的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-C3)在序列号25的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2-C)下述(H2-C1)、(H2-C2)或(H2-C3)的氨基酸序列
(H2-C1)序列号26(INHSGST)的氨基酸序列
(H2-C2)相对于序列号26的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-C3)在序列号26的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3-C)下述(H3-C1)、(H3-C2)或(H3-C3)的氨基酸序列
(H3-C1)序列号27(ARCPIYYYGMDV)的氨基酸序列
(H3-C2)相对于序列号27的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-C3)在序列号27的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(18)中，上述(HC)的重链可变区例如包含由下述(H-C)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LA)的轻链可变区例如包含由上述(L-A)的氨基酸序列组成的多肽。
(H-C)下述(H-C1)、(H-C2)或(H-C3)的氨基酸序列
(H-C1)序列号28的氨基酸序列
序列号28：QLQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARCPIYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(H-C2)相对于序列号28的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H-C3)在序列号28的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(H-C1)的氨基酸序列例如是包含CDRH1的(H1-C1)、CDRH2的(H2-C1)和CDRH3的(H3-C1)的氨基酸序列的序列。上述(H-C2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-C1)、CDRH2的(H2-C1)和CDRH3(H3-C1)的氨基酸序列、且相对于序列号28的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(H-C3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-C1)、CDRH2的(H2-C1)和CDRH3(H3-C1)的氨基酸序列、且在序列号28的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-C1)，上述轻链可变区为上述(L-A1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H73-3M4E5L”。
上述重链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述重链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
本发明中，上述序列号17～97的氨基酸序列例如为人源的氨基酸序列。
本发明的抗体等与A2/NY-ESO-1157的结合例如可以通过表面等离子共振(SPR)、流式细胞仪等抗体与抗原的结合检测方法进行确认。
本发明的抗体等例如可以进一步具有标记物。上述标记物没有特别限制，例如可列举出荧光物质、色素、同位素、酶等。上述荧光物质例如可列举出芘、TAMRA、荧光素、Cy3色素、Cy5色素、FAM色素、罗丹明色素、德克萨斯红色素、JOE、MAX、HEX、TYE等荧光团，上述色素例如可列举出Alexa488、Alexa647等Alexa色素等。本发明的抗体等也可以被药物用化合物等低分子化合物修饰。上述低分子化合物例如可列举出微管蛋白抑制剂等抗癌药。本发明的抗体等例如直接或间接地被上述低分子化合物修饰。后者的情况下，本发明的抗体等例如通过连接体被上述低分子化合物修饰。
本发明的抗体等例如可以固定化于载体、多孔体等上。上述载体没有特别限制，例如可列举出基板、微珠、容器等，上述容器例如可列举出微孔板、管等。
本发明的抗体等的制造方法没有特别限制，例如可以基于上述的氨基酸序列信息通过基因工程方法进行制造。具体而言，例如可以如下方式进行。需要说明的是，本发明不限定于该示例。
首先，将包含编码本发明的抗体等中的、上述各区域、上述重链、和/或轻链的氨基酸序列的核酸序列的载体导入宿主中，得到转化体。接着，培养上述转化体，回收包含与A2/NY-ESO-1157结合的抗体的级分，从得到的回收级分中分离或纯化上述抗体。
作为上述载体，例如可列举出：包含编码上述重链可变区的核酸序列的载体、包含编码上述轻链可变区的核酸序列的载体、包含编码上述重链的核酸序列的载体、包含编码上述轻链的核酸序列的载体等。上述宿主没有特别限制，只要为能导入上述载体、且能表达上述载体内的上述核酸序列者即可。作为上述宿主，例如可列举出HEK细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、SP2/0细胞等哺乳类细胞等。将上述载体导入宿主的方法没有特别限制，可以采用公知的方法。
上述转化体的培养方法没有特别限制，可以根据上述宿主的种类进行适宜确定。包含上述抗体的级分例如可以将培养的上述转化体破碎、以液体级分的形式进行回收。上述抗体的分离或纯化没有特别限制，可以采用公知的方法。
本发明中，上述抗体例如为单克隆抗体。上述单克隆抗体例如可列举出通过使动物免疫而得到的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(也称为全人源抗体)等。
上述嵌合抗体是连接了除人以外的动物来源抗体的可变区和人抗体的恒定区的抗体。上述嵌合抗体例如可以如下方式制作。首先，对于除人以外的动物来源的单克隆抗体，制备与A2/NY-ESO-1157蛋白结合的可变区(V区)的基因，将上述可变区的基因与人抗体的恒定区(C区)的基因连接，将其进而与表达载体连接。接着，培养转染了上述表达载体的细胞，回收被分泌至培养液中的目标嵌合抗体。由此能够制备嵌合抗体。上述可变区的基因的来源动物没有特别限制，例如可列举出大鼠、小鼠等。上述嵌合抗体的制造方法不限制于此，例如可以参照日本特公平3-73280号公报中记载的方法等公知的方法进行制造。
上述人源化抗体是仅将上述CDR设定为除人以外的动物来源、将其它区域设定为人源的抗体。上述人源化抗体例如可以如下方式制造。首先，对于除人以外的动物来源的单克隆抗体，制备上述CDR的基因，将其移植至人抗体的基因、例如恒定区(CDR grafting)，进而将其与表达载体连接。然后，通过培养转染了上述表达载体的细胞，移植了目标CDR的人源化抗体被分泌到培养液中。通过回收所分泌的人源化抗体而可以进行制备。上述CDR的来源动物没有特别限制，例如可列举出大鼠、小鼠等。人源化抗体的制造方法不限定于此，例如可以参照日本特表平4-506458号公报和日本特开昭62-296890号公报等中记载的方法等公知的方法进行制造。
上述人抗体是全部区域源自人的抗体。上述人抗体例如可以通过向除人以外的动物导入人抗体基因而制作。导入上述人抗体基因的动物例如可以使用人抗体产生用的转基因(transgenetic)的动物。上述动物的种类没有特别限制，可列举出小鼠等。上述人抗体的制造方法例如可以参照如下公知的方法进行制造，所述公知的方法为：Nature Genetics,Vol.7,p.13-21,1994；Nature Genetics,Vol.15,p.146-156,1997；日本特表平4-504365号公报；日本特表平7-509137号公报；WO94/25585号公报；Nature,Vol.368,p.856-859,1994；及日本特表平6-500233号公报等中记载的公知的方法。另外，上述人抗体例如也可以使用噬菌体展示法进行制造，例如可以参照Marks,J.D.et al.：J.Mol.Biol.,Vol.222,p.581-597,1991等中记载的公知的方法进行制造。
本发明的抗体等例如也可以通过使动物免疫抗原而制备。上述抗原例如可列举出A2/NY-ESO-1157蛋白。上述抗原优选进行多次免疫。上述肽片段例如可以是仅由抗原决定簇(表位)组成的肽片段，也可以是包含上述抗原决定簇的肽片段。
上述通过使动物免疫而得到的单克隆抗体例如可以参照『Current Protocols inMolecular Biology』(John Wiley&Sons(1987))、Antibodies：A Laboratory Manual,Ed.Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等中记载的方法等公知的方法进行制造。具体而言，例如，用抗原免疫动物，使从上述免疫动物中采集的抗体产生细胞与缺乏自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞(myeloma)融合，从而制作杂交瘤。接着，从上述杂交瘤中筛选抗体产生细胞，通过克隆制作杂交瘤的单个克隆。然后，向动物给予该杂交瘤克隆，从得到的腹腔中纯化单克隆抗体。或者，培养上述杂交瘤，从该培养液中纯化单克隆抗体。如此，通过制作上述杂交瘤克隆，从而能够稳定地供给特异性均匀的单克隆抗体。
上述骨髓瘤细胞例如优选为小鼠、大鼠、人等的来源。上述骨髓瘤细胞与上述抗体产生细胞各自的来源例如任选相同的物种或不同的物种，但优选为相同的物种。
本发明的第1抗体等中，上述(H)的重链可变区和(L)的轻链可变区也可以为下述(H)的重链可变区和(L)的轻链可变区。
(H)包含重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3的重链可变区
CDRH1是包含下述(H1)的氨基酸序列的多肽
CDRH2是包含下述(H2)的氨基酸序列的多肽
CDRH3是包含下述(H3)的氨基酸序列的多肽
(H1)下述(H1-1)、(H1-2)或(H1-3)的氨基酸序列
(H1-1)下述条件(H1)的CDRH1中任意的氨基酸序列
(H1-2)相对于(H1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-3)在(H1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2)下述(H2-1)、(H2-2)或(H2-3)的氨基酸序列
(H2-1)下述条件(H1)的CDRH2中任意的氨基酸序列
(H2-2)相对于(H2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-3)在(H2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3)下述(H3-1)、(H3-2)或(H3-3)的氨基酸序列
(H3-1)下述条件(H1)的CDRH3中任意的氨基酸序列
(H3-2)相对于(H3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-3)在(H3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列；
条件(H1)
CDRH1为GX1X2X3SX4X5X6(序列号322)，
CDRH2为X7X8X9X10SX11GST(序列号323)，
CDRH3为AX12X13X14X15X16GMDV(序列号324)，
X1为G或F，
X2为S或T，
X3为I或F，
X4为S或T，
X5为N或Y，
X6为Y或Q，
X7不存在或为I，
X8为V或N，
X9为S或H，
X10不存在或为Y，
X11不存在或为G，
X12为R或G，
X13为E或C，
X14为S、L或P，
X15为Y、L或I，
X16为Y或P。
(L)包含轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区
CDRL1是包含下述(L1)的氨基酸序列的多肽
CDRL2是包含下述(L2)的氨基酸序列的多肽
CDRL3是包含下述(L3)的氨基酸序列的多肽
(L1)下述(L1-1)、(L1-2)或(L1-3)的氨基酸序列
(L1-1)下述条件(L1)和(L2)的CDRL1中任意的氨基酸序列
(L1-2)相对于(L1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-3)在(L1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2)下述(L2-1)、(L2-2)或(L2-3)的氨基酸序列
(L2-1)下述条件(L1)和(L2)的CDRL2中任意的氨基酸序列
(L2-2)相对于(L2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-3)在(L2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3)下述(L3-1)、(L3-2)或(L3-3)的氨基酸序列
(L3-1)下述条件(L1)和(L2)的CDRL3中任意的氨基酸序列
(L3-2)相对于(L3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-3)在(L3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列；
条件(L1)
CDRL1为QX1X2SX3X4(序列号313)，
CDRL2为AAS(序列号34)或GAS(序列号63)，
CDRL3为QQYX5X6X7X8X9X10X11(序列号314)，
X1为S或D，
X2为I或V，
X3为S或R，
X4为Y或N，
X5为Y、E、N或D，
X6为S或N，
X7不存在或为T、Y或S，
X8为P、S、R或L，
X9为Q、R、P或I，
X10不存在或为S或C，
X11不存在或为T；
条件(L2)
CDRL1为X1X2DVGX3YX4X5(序列号315)，
CDRL2为DVN(序列号71)、DVI(序列号75)或DVS(序列号79)，
CDRL3为X6SX7X8X9X10X11X12X13X14X15V(序列号316)，
X1为S或G，
X2为R或S，
X3为G、A或S，
X4为N、D、E或Q，
X5为Y、F、L或W，
X6为W、S或C，
X7为F、Y或W，
X8不存在或为A或T，
X9不存在或为G，
X10不存在或为S，
X11为G或S，
X12不存在或为S，
X13为S、T或R，
X14为Y、N、T、F、P或R，
X15为Y、S、W、A或F。
作为满足上述条件(H1)的重链可变区，例如可列举出上述(HA)、(HB)和(HC)的重链可变区。
上述(L)的轻链可变区中，(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)在条件(L1)和(L2)中满足相同的条件或不同的条件，但优选满足相同的条件。
条件(L1)中，X7优选不存在或为T或Y。
条件(L2)中，X4优选N、D或E。X5优选Y、F或L。X7优选F或Y。
作为满足上述条件(L1)的轻链可变区，例如可列举出上述(LB)～(LJ)的轻链可变区。
作为满足上述条件(L2)的轻链可变区，例如可列举出上述(LA)和(LK)～(LQ)的轻链可变区。
上述(H)的重链可变区和(L)的轻链可变区中，上述(H)的重链可变区的CDRH1为GFTFSTYQ(序列号21)、CDRH2为IVSSGGST(序列号22)、CDRH3为AGELLPYYGMDV(序列号23)时，优选上述(L)的轻链可变区的CDRL1为SRDVGGYNY(序列号29)，CDRL2为DVI(序列号30)，CDRL3为除WSFAGSYYV(序列号31)以外的氨基酸序列。
<第2抗体或其抗原结合片段>
本发明的针对CD19的抗体或其抗原结合片段(以下也称为“第2抗体等”)包含下述(H)的重链可变区和下述(L)的轻链可变区。本发明的抗体等的特征在于包含下述(H)的重链可变区和下述(L)的轻链可变区，其它构成和条件没有特别限制。本发明的抗体等与CD19结合。另外，CD19例如已知在正常的B细胞和B细胞系的淋巴瘤等特定的癌细胞中表达。因此，本发明的抗体等例如可以适宜地用作针对表达CD19的癌细胞的双特异性抗体、CAR-T细胞的CAR的抗原结合结构域等。可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体或其抗原结合片段等的说明。
(H)包含重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3的重链可变区
CDRH1是包含下述(H1)的氨基酸序列的多肽
CDRH2是包含下述(H2)的氨基酸序列的多肽
CDRH3是包含下述(H3)的氨基酸序列的多肽
(H1)下述(H1-1)、(H1-2)或(H1-3)的氨基酸序列
(H1-1)下述表3A的CDRH1中任意的氨基酸序列
(H1-2)相对于(H1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-3)在(H1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2)下述(H2-1)、(H2-2)或(H2-3)的氨基酸序列
(H2-1)下述表3A的CDRH2中任意的氨基酸序列
(H2-2)相对于(H2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-3)在(H2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3)下述(H3-1)、(H3-2)或(H3-3)的氨基酸序列
(H3-1)下述表3A的CDRH3中任意的氨基酸序列
(H3-2)相对于(H3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-3)在(H3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L)包含轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区
CDRL1是包含下述(L1)的氨基酸序列的多肽
CDRL2是包含下述(L2)的氨基酸序列的多肽
CDRL3是包含下述(L3)的氨基酸序列的多肽
(L1)下述(L1-1)、(L1-2)或(L1-3)的氨基酸序列
(L1-1)下述表3B的CDRL1中任意的氨基酸序列
(L1-2)相对于(L1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-3)在(L1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2)下述(L2-1)、(L2-2)或(L2-3)的氨基酸序列
(L2-1)下述表3B的CDRL2中任意的氨基酸序列
(L2-2)相对于(L2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-3)在(L2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3)下述(L3-1)、(L3-2)或(L3-3)的氨基酸序列
(L3-1)下述表3B的CDRL3中任意的氨基酸序列
(L3-2)相对于(L3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-3)在(L3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
[表3A]
[表3B]
本发明中，“CD19”例如是分子量95kDa的I型跨膜糖蛋白。CD19例如已知参与B细胞的产生、活化、分化的调整等，主要在B细胞中表达。人CD19的氨基酸序列例如可列举出以NCBI注册号NM_001770.6注册的氨基酸序列。小鼠CD19的氨基酸序列例如可列举出以NCBI注册号NM_009844.2注册的氨基酸序列。
上述(H)的重链可变区中，上述CDRH1为上述(HA)中的CDRH1。上述CDRH2为上述(HA)中的CDRH2。上述CDRH3为上述(HA)中的CDRH3。
上述(L)的轻链可变区中，上述CDRL1为上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL1。上述CDRL2为上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL2。上述CDRL3为上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL3。
上述CDRL1、CDRL2和CDRL3在上述(LA)～(LL)和(LM)中可以满足相同的条件，可以满足不同的条件，但优选满足相同的条件。上述CDRL1、CDRL2和CDRL3满足相同的条件时，上述CDRL1、CDRL2和CDRL3满足上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL1、CDRL2和CDRL3。
上述各CDR中，“同一性”例如是指适宜地比对要比较的序列彼此时的、同一性程度，表示上述序列之间的氨基酸的精确匹配的发生率(％)。上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。上述同一性例如可以适宜地使用BLAST、FASTA等解析软件并利用缺省参数而算出(以下同样)。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述氨基酸的置换例如可以是保守性置换(以下同样)。上述保守性置换是指：将1个或数个氨基酸置换为其它氨基酸和/或氨基酸衍生物而实质上不改变蛋白质的功能。“要置换的氨基酸”和“被置换的氨基酸”例如优选性质和/或功能相似。具体而言，例如优选疏水性和亲水性的指标(Hydropathy)、极性、电荷等化学性质、或者二级结构等物理性质等相似。上述性质和/或功能相似的氨基酸或氨基酸衍生物例如在该技术领域中是公知的。作为具体例，非极性氨基酸(疏水性氨基酸)例如可列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等，极性氨基酸(中性氨基酸)可列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等，具有正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)可列举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等，具有负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)可列举出天冬氨酸、谷氨酸等。
上述(L)的轻链可变区中，上述(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)的组合没有特别限制，例如可以分别为上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL1、与上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL2、与上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL3的任意组合。上述(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)的组合优选为上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个CDRL1、CDRL2和CDRL3。
以下，对本发明的抗体等而言，对上述重链可变区或重链与上述轻链可变区或轻链的组合进行更具体地说明。各组合中的重链可变区和重链的说明可以互相援用。另外，各组合中的轻链可变区和轻链的说明可以互相援用。另外，以下所示的氨基酸序列和碱基序列中，只要没有特别声明，下划线所示的氨基酸序列和碱基序列是对应于CDR的氨基酸序列和编码对应于CDR的氨基酸序列的碱基序列。
本发明的抗体等中，上述重链可变区与上述轻链可变区的组合例如，如前所述，是上述(HA)、与上述(LA)～(LL)和(LM)中的任意1个的组合。
(HA)与(LA)和组合(组合(LA))
组合(LA)的抗体等例如也称为抗体18H-L4组。上述组合(LA)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含下述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含下述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含下述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LA)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-A)的氨基酸序列的多肽。
(H1-A)下述(H1-A1)、(H1-A2)或(H1-A3)的氨基酸序列
(H1-A1)序列号216(GFTFDDYA)的氨基酸序列
(H1-A2)相对于序列号216的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-A3)在序列号216的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2-A)下述(H2-A1)、(H2-A2)或(H2-A3)的氨基酸序列
(H2-A1)序列号217(ISWNSGRI)的氨基酸序列
(H2-A2)相对于序列号217的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-A3)在序列号217的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3-A)下述(H3-A1)、(H3-A2)或(H3-A3)的氨基酸序列
(H3-A1)序列号218(ARDQGYHYYDSAEHAFDI)的氨基酸序列
(H3-A2)相对于序列号218的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-A3)在序列号218的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L1-A)下述(L1-A1)、(L1-A2)或(L1-A3)的氨基酸序列
(L1-A1)序列号220(KLGDKY)的氨基酸序列
(L1-A2)相对于序列号220的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-A3)在序列号220的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-A)下述(L2-A1)、(L2-A2)或(L2-A3)的氨基酸序列
(L2-A1)序列号221(QDS)的氨基酸序列
(L2-A2)相对于序列号221的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-A3)在序列号221的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-A)下述(L3-A1)、(L3-A2)或(L3-A3)的氨基酸序列
(L3-A1)序列号222(QAWDSSTHVV)的氨基酸序列
(L3-A2)相对于序列号222的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-A3)在序列号222的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LA)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由下述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LA)的轻链可变区例如包含由下述(L-A)的氨基酸序列组成的多肽。
(H-A)下述(H-A1)、(H-A2)或(H-A3)的氨基酸序列
(H-A1)序列号219的氨基酸序列
序列号219：EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
(H-A2)相对于序列号219的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H-A3)在序列号219的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L-A)下述(L-A1)、(L-A2)或(L-A3)的氨基酸序列
(L-A1)序列号223的氨基酸序列
序列号223：SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTHVVFGGGTKLTVL
(L-A2)相对于序列号223的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-A3)在序列号223的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(H-A1)的氨基酸序列例如是包含CDRH1的(H1-A1)、CDRH2的(H2-A1)和CDRH3的(H3-A1)的氨基酸序列的序列。上述(H-A2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-A1)、CDRH2的(H2-A1)和CDRH3(H3-A1)的氨基酸序列、且相对于序列号219的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(H-A3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRH1的(H1-A1)、CDRH2的(H2-A1)和CDRH3(H3-A1)的氨基酸序列、且在序列号219的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
上述(L-A1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-A1)、CDRL2的(L2-A1)和CDRL3的(L3-A1)的氨基酸序列的序列。上述(L-A2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-A1)、CDRL2的(L2-A1)和CDRL3的(L3-A1)的氨基酸序列、且相对于序列号223的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-A3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-A1)、CDRL2的(L2-A1)和CDRL3的(L3-A1)的氨基酸序列、且在序列号223的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-A1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L4”。
上述重链可变区的多肽和上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述重链可变区的多肽和上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LB)的组合(组合(LB))
组合(LB)的抗体等例如也称为抗体18H-L7组。上述组合(LB)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LB)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-B)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-B)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-B)的氨基酸序列的多肽。
(L1-B)下述(L1-B1)、(L1-B2)或(L1-B3)的氨基酸序列
(L1-B1)序列号224(SSDVGGYNY)的氨基酸序列
(L1-B2)相对于序列号224的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-B3)在序列号224的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-B)下述(L2-B1)、(L2-B2)或(L2-B3)的氨基酸序列
(L2-B1)序列号225(DVS)的氨基酸序列
(L2-B2)相对于序列号225的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-B3)在序列号225的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-B)下述(L3-B1)、(L3-B2)或(L3-B3)的氨基酸序列
(L3-B1)序列号226(GTWDTSLTAVV)的氨基酸序列
(L3-B2)相对于序列号226的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-B3)在序列号226的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LB)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LB)的轻链可变区例如包含由下述(L-B)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-B)下述(L-B1)、(L-B2)或(L-B3)的氨基酸序列
(L-B1)序列号227的氨基酸序列
序列号227：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVL
(L-B2)相对于序列号227的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-B3)在序列号227的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-B1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-B1)、CDRL2的(L2-B1)和CDRL3的(L3-B1)的氨基酸序列的序列。上述(L-B2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-B1)、CDRL2的(L2-B1)和CDRL3的(L3-B1)的氨基酸序列、且相对于序列号227的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-B3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-B1)、CDRL2的(L2-B1)和CDRL3的(L3-B1)的氨基酸序列、且在序列号227的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-B1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L7”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LC)的组合(组合(LC))
组合(LC)的抗体等例如也称为抗体18H-L9组。上述组合(LC)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LC)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-C)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-C)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-C)的氨基酸序列的多肽。
(L1-C)下述(L1-C1)、(L1-C2)或(L1-C3)的氨基酸序列
(L1-C1)序列号228(WSNIGDDH)的氨基酸序列
(L1-C2)相对于序列号228的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-C3)在序列号228的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-C)下述(L2-C1)、(L2-C2)或(L2-C3)的氨基酸序列
(L2-C1)序列号229(DTS)的氨基酸序列
(L2-C2)相对于序列号229的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-C3)在序列号229的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-C)下述(L3-C1)、(L3-C2)或(L3-C3)的氨基酸序列
(L3-C1)序列号230(GTWESSLSGVV)的氨基酸序列
(L3-C2)相对于序列号230的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-C3)在序列号230的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LC)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LC)的轻链可变区例如包含由下述(L-C)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-C)下述(L-C1)、(L-C2)或(L-C3)的氨基酸序列
(L-C1)序列号231的氨基酸序列
序列号231：QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSWSNIGDDHVSWYQQFPGAAPKLLIYDTSKRPSRVADRFSGSKSGASATLAITGLQAGDEADYYCGTWESSLSGVVFGGGTELTVL
(L-C2)相对于序列号231的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-C3)在序列号231的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-C1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-C1)、CDRL2的(L2-C1)和CDRL3的(L3-C1)的氨基酸序列的序列。上述(L-C2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-C1)、CDRL2的(L2-C1)和CDRL3的(L3-C1)的氨基酸序列、且相对于序列号231的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-C3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-C1)、CDRL2的(L2-C1)和CDRL3的(L3-C1)的氨基酸序列、且在序列号231的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-C1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L9”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LD)的组合(组合(LD))
组合(LC)的抗体等例如也称为抗体18H-L13组。上述组合(LD)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LD)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-D)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-D)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-D)的氨基酸序列的多肽。
(L1-D)下述(L1-D1)、(L1-D2)或(L1-D3)的氨基酸序列
(L1-D1)序列号232(SSDVGGYDY)的氨基酸序列
(L1-D2)相对于序列号232的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-D3)在序列号232的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-D)下述(L2-D1)、(L2-D2)或(L2-D3)的氨基酸序列
(L2-D1)序列号233(DVT)的氨基酸序列
(L2-D2)相对于序列号233的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-D3)在序列号233的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-D)下述(L3-D1)、(L3-D2)或(L3-D3)的氨基酸序列
(L3-D1)序列号234(SSYTTSTTWV)的氨基酸序列
(L3-D2)相对于序列号234的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-D3)在序列号234的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LD)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LD)的轻链可变区例如包含由下述(L-D)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-D)下述(L-D1)、(L-D2)或(L-D3)的氨基酸序列
(L-D1)序列号235的氨基酸序列
序列号235：QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQTGDEADYYCGTWDTSLTAVVFGGGTELTVL
(L-D2)相对于序列号235的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-D3)在序列号235的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-D1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列的序列。上述(L-D2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列、且相对于序列号235的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-D3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-D1)、CDRL2的(L2-D1)和CDRL3的(L3-D1)的氨基酸序列、且在序列号235的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-D1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L13”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LE)的组合(组合(LE))
组合(LE)的抗体等例如也称为抗体18H-L14组。上述组合(LE)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LE)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-E)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-E)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-E)的氨基酸序列的多肽。
(L1-E)下述(L1-E1)、(L1-E2)或(L1-E3)的氨基酸序列
(L1-E1)序列号236(TSDVGTTNY)的氨基酸序列
(L1-E2)相对于序列号236的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-E3)在序列号236的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-E)下述(L2-E1)、(L2-E2)或(L2-E3)的氨基酸序列
(L2-E1)序列号237(DVT)的氨基酸序列
(L2-E2)相对于序列号237的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-E3)在序列号237的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-E)下述(L3-E1)、(L3-E2)或(L3-E3)的氨基酸序列
(L3-E1)序列号238(SYAGSYTFVV)的氨基酸序列
(L3-E2)相对于序列号238的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-E3)在序列号238的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LE)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LE)的轻链可变区例如包含由下述(L-E)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-E)下述(L-E1)、(L-E2)或(L-E3)的氨基酸序列
(L-E1)序列号239的氨基酸序列
序列号239：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTTSDVGTTNYVSWYQQHPGKAPKLLIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFVVFGGGTELTVL
(L-E2)相对于序列号239的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-E3)在序列号239的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-E1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-E1)、CDRL2的(L2-E1)和CDRL3的(L3-E1)的氨基酸序列的序列。上述(L-E2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-E1)、CDRL2的(L2-E1)和CDRL3的(L3-E1)的氨基酸序列、且相对于序列号239的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-E3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-E1)、CDRL2的(L2-E1)和CDRL3的(L3-E1)的氨基酸序列、且在序列号239的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-E1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L14”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LF)的组合(组合(LF))
组合(LF)的抗体等例如也称为抗体18H-L16组。上述组合(LF)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LF)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-F)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-F)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-F)的氨基酸序列的多肽。
(L1-F)下述(L1-F1)、(L1-F2)或(L1-F3)的氨基酸序列
(L1-F1)序列号240(SSDVGVYNY)的氨基酸序列
(L1-F2)相对于序列号240的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-F3)在序列号240的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-F)下述(L2-F1)、(L2-F2)或(L2-F3)的氨基酸序列
(L2-F1)序列号241(DVS)的氨基酸序列
(L2-F2)相对于序列号241的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-F3)在序列号241的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-F)下述(L3-F1)、(L3-F2)或(L3-F3)的氨基酸序列
(L3-F1)序列号242(AAWDDSLNGVV)的氨基酸序列
(L3-F2)相对于序列号242的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-F3)在序列号242的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LF)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LF)的轻链可变区例如包含由下述(L-F)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-F)下述(L-F1)、(L-F2)或(L-F3)的氨基酸序列
(L-F1)序列号243的氨基酸序列
序列号243：QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGVYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSANTASLTISGLQAEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTQLTVL
(L-F2)相对于序列号243的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-F3)在序列号243的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-F1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-F1)、CDRL2的(L2-F1)和CDRL3的(L3-F1)的氨基酸序列的序列。上述(L-F2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-F1)、CDRL2的(L2-F1)和CDRL3的(L3-F1)的氨基酸序列、且相对于序列号243的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-F3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-F1)、CDRL2的(L2-F1)和CDRL3的(L3-F1)的氨基酸序列、且在序列号243的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-F1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L16”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LG)的组合(组合(LG))
组合(LG)的抗体等例如也称为抗体18H-L17组。上述组合(LG)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LG)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-G)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-G)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-G)的氨基酸序列的多肽。
(L1-G)下述(L1-G1)、(L1-G2)或(L1-G3)的氨基酸序列
(L1-G1)序列号244(SSNIGNNY)的氨基酸序列
(L1-G2)相对于序列号244的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-G3)在序列号244的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-G)下述(L2-G1)、(L2-G2)或(L2-G3)的氨基酸序列
(L2-G1)序列号245(DNV)的氨基酸序列
(L2-G2)相对于序列号245的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-G3)在序列号245的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-G)下述(L3-G1)、(L3-G2)或(L3-G3)的氨基酸序列
(L3-G1)序列号246(AAWDDSLSAI)的氨基酸序列
(L3-G2)相对于序列号246的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-G3)在序列号246的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LG)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LG)的轻链可变区例如包含由下述(L-G)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-G)下述(L-G1)、(L-G2)或(L-G3)的氨基酸序列
(L-G1)序列号247的氨基酸序列
序列号247：QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVCWYQHLPGTAPKLLIYDNVKRPSGIPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSAIFGGGTELTVL
(L-G2)相对于序列号247的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-G3)在序列号247的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-G1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-G1)、CDRL2的(L2-G1)和CDRL3的(L3-G1)的氨基酸序列的序列。上述(L-G2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-G1)、CDRL2的(L2-G1)和CDRL3的(L3-G1)的氨基酸序列、且相对于序列号247的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-G3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-G1)、CDRL2的(L2-G1)和CDRL3的(L3-G1)的氨基酸序列、且在序列号247的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-G1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L17”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LH)的组合(组合(LH))
组合(LH)的抗体等例如也称为抗体18H-L22组。上述组合(LH)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LH)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-H)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-H)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-H)的氨基酸序列的多肽。
(L1-H)下述(L1-H1)、(L1-H2)或(L1-H3)的氨基酸序列
(L1-H1)序列号248(SSDVGGYNY)的氨基酸序列
(L1-H2)相对于序列号248的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-H3)在序列号248的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-H)下述(L2-H1)、(L2-H2)或(L2-H3)的氨基酸序列
(L2-H1)序列号249(DVS)的氨基酸序列
(L2-H2)相对于序列号249的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-H3)在序列号249的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-H)下述(L3-H1)、(L3-H2)或(L3-H3)的氨基酸序列
(L3-H1)序列号250(HSYDSSLSHV)的氨基酸序列
(L3-H2)相对于序列号250的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-H3)在序列号250的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LH)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LH)的轻链可变区例如包含由下述(L-H)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-H)下述(L-H1)、(L-H2)或(L-H3)的氨基酸序列
(L-H1)序列号251的氨基酸序列
序列号251：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCHSYDSSLSHVFGTGTKVTVL
(L-H2)相对于序列号251的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-H3)在序列号251的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-H1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-H1)、CDRL2的(L2-H1)和CDRL3的(L3-H1)的氨基酸序列的序列。上述(L-H2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-H1)、CDRL2的(L2-H1)和CDRL3的(L3-H1)的氨基酸序列、且相对于序列号251的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-H3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-H1)、CDRL2的(L2-H1)和CDRL3的(L3-H1)的氨基酸序列、且在序列号251的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-H1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-L22”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LI)的组合(组合(LI))
组合(LI)的抗体等例如也称为抗体H1-K4组。上述组合(LI)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LI)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-I)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-I)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-I)的氨基酸序列的多肽。
(L1-I)下述(L1-I1)、(L1-I2)或(L1-I3)的氨基酸序列
(L1-I1)序列号252(QSVSSN)的氨基酸序列
(L1-I2)相对于序列号252的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-I3)在序列号252的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-I)下述(L2-I1)、(L2-I2)或(L2-I3)的氨基酸序列
(L2-I1)序列号253(GAS)的氨基酸序列
(L2-I2)相对于序列号253的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-I3)在序列号253的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-I)下述(L3-I1)、(L3-I2)或(L3-I3)的氨基酸序列
(L3-I1)序列号254(QQYNNWPPLYT)的氨基酸序列
(L3-I2)相对于序列号254的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-I3)在序列号254的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LI)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LI)的轻链可变区例如包含由下述(L-I)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-I)下述(L-I1)、(L-I2)或(L-I3)的氨基酸序列
(L-I1)序列号255的氨基酸序列
序列号255：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPLYTFGQGTKLEIK
(L-I2)相对于序列号255的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-I3)在序列号255的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-I1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-I1)、CDRL2的(L2-I1)和CDRL3的(L3-I1)的氨基酸序列的序列。上述(L-I2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-I1)、CDRL2的(L2-I1)和CDRL3的(L3-I1)的氨基酸序列、且相对于序列号255的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-I3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-I1)、CDRL2的(L2-I1)和CDRL3的(L3-I1)的氨基酸序列、且在序列号255的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-I1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体H1-K4”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LJ)的组合(组合(LJ))
组合(LJ)的抗体等例如也称为抗体18H-K5组。上述组合(LJ)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LJ)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-J)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-J)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-J)的氨基酸序列的多肽。
(L1-J)下述(L1-J1)、(L1-J2)或(L1-J3)的氨基酸序列
(L1-J1)序列号256(QSVSSY)的氨基酸序列
(L1-J2)相对于序列号256的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-J3)在序列号256的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-J)下述(L2-J1)、(L2-J2)或(L2-J3)的氨基酸序列
(L2-J1)序列号257(DAS)的氨基酸序列
(L2-J2)相对于序列号257的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-J3)在序列号257的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-J)下述(L3-J1)、(L3-J2)或(L3-J3)的氨基酸序列
(L3-J1)序列号258(QQSYSTLLYT)的氨基酸序列
(L3-J2)相对于序列号258的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-J3)在序列号258的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LJ)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LJ)的轻链可变区例如包含由下述(L-J)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-J)下述(L-J1)、(L-J2)或(L-J3)的氨基酸序列
(L-J1)序列号259的氨基酸序列
序列号259：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTLLYTFGQGTKLEIK
(L-J2)相对于序列号259的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-J3)在序列号259的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-J1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-J1)、CDRL2的(L2-J1)和CDRL3的(L3-J1)的氨基酸序列的序列。上述(L-J2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-J1)、CDRL2的(L2-J1)和CDRL3的(L3-J1)的氨基酸序列、且相对于序列号259的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-J3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-J1)、CDRL2的(L2-J1)和CDRL3的(L3-J1)的氨基酸序列、且在序列号259的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-J1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-K5”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LK)的组合(组合(LK))
组合(LK)的抗体等例如也称为抗体18H-K6组。上述组合(LK)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LK)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-K)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-K)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-K)的氨基酸序列的多肽。
(L1-K)下述(L1-K1)、(L1-K2)或(L1-K3)的氨基酸序列
(L1-K1)序列号260(QSVSSY)的氨基酸序列
(L1-K2)相对于序列号260的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-K3)在序列号260的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-K)下述(L2-K1)、(L2-K2)或(L2-K3)的氨基酸序列
(L2-K1)序列号261(DAS)的氨基酸序列
(L2-K2)相对于序列号261的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-K3)在序列号261的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-K)下述(L3-K1)、(L3-K2)或(L3-K3)的氨基酸序列
(L3-K1)序列号262(QQYDSLPLT)的氨基酸序列
(L3-K2)相对于序列号262的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-K3)在序列号262的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LK)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LK)的轻链可变区例如包含由下述(L-K)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-K)下述(L-K1)、(L-K2)或(L-K3)的氨基酸序列
(L-K1)序列号263的氨基酸序列
序列号263：EIVLTRSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGISARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDIATYYCQQYDSLPLTFGGGTKLEIK
(L-K2)相对于序列号263的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-K3)在序列号263的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-K1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-K1)、CDRL2的(L2-K1)和CDRL3的(L3-K1)的氨基酸序列的序列。上述(L-K2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-K1)、CDRL2的(L2-K1)和CDRL3的(L3-K1)的氨基酸序列、且相对于序列号263的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-K3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-K1)、CDRL2的(L2-K1)和CDRL3的(L3-K1)的氨基酸序列、且在序列号263的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-K1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-K6”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LL)的组合(组合(LL))
组合(LL)的抗体等例如也称为抗体18H-K9组。上述组合(LL)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LL)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-L)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-L)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-L)的氨基酸序列的多肽。
(L1-L)下述(L1-L1)、(L1-L2)或(L1-L3)的氨基酸序列
(L1-L1)序列号264(QTISASS)的氨基酸序列
(L1-L2)相对于序列号264的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-L3)在序列号264的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-L)下述(L2-L1)、(L2-L2)或(L2-L3)的氨基酸序列
(L2-L1)序列号265(GAS)的氨基酸序列
(L2-L2)相对于序列号265的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-L3)在序列号265的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-L)下述(L3-L1)、(L3-L2)或(L3-L3)的氨基酸序列
(L3-L1)序列号266(QQFNEWPLT)的氨基酸序列
(L3-L2)相对于序列号266的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-L3)在序列号266的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LL)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LL)的轻链可变区例如包含由下述(L-L)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-L)下述(L-L1)、(L-L2)或(L-L3)的氨基酸序列
(L-L1)序列号267的氨基酸序列
序列号267：EIVLTQSPATLSLSPGERATVSCRPSQTISASSVAWYQQKAGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFNEWPLTFGGGTKVEIK
(L-L2)相对于序列号267的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-L3)在序列号267的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-L1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-L1)、CDRL2的(L2-L1)和CDRL3的(L3-L1)的氨基酸序列的序列。上述(L-L2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-L1)、CDRL2的(L2-L1)和CDRL3的(L3-L1)的氨基酸序列、且相对于序列号267的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-L3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-L1)、CDRL2的(L2-L1)和CDRL3的(L3-L1)的氨基酸序列、且在序列号267的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-L1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-K9”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
(HA)与(LM)的组合(组合(LM))
组合(LM)的抗体等例如也称为抗体18H-K10组。上述组合(LM)中，上述(HA)的重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1是包含上述(H1-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH2是包含上述(H2-A)的氨基酸序列的多肽，CDRH3是包含上述(H3-A)的氨基酸序列的多肽。另外，上述(LM)的轻链可变区包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，CDRL1是包含下述(L1-M)的氨基酸序列的多肽，CDRL2是包含下述(L2-M)的氨基酸序列的多肽，CDRL3是包含下述(L3-M)的氨基酸序列的多肽。
(L1-M)下述(L1-M1)、(L1-M2)或(L1-M3)的氨基酸序列
(L1-M1)序列号268(QSVSSN)的氨基酸序列
(L1-M2)相对于序列号268的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-M3)在序列号268的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2-M)下述(L2-M1)、(L2-M2)或(L2-M3)的氨基酸序列
(L2-M1)序列号269(GAS)的氨基酸序列
(L2-M2)相对于序列号269的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-M3)在序列号269的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3-M)下述(L3-M1)、(L3-M2)或(L3-M3)的氨基酸序列
(L3-M1)序列号270(QQYGSSPDIFT)的氨基酸序列
(L3-M2)相对于序列号270的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-M3)在序列号270的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述各CDR中，“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述各CDR中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述组合(LM)中，上述(HA)的重链可变区例如包含由上述(H-A)的氨基酸序列组成的多肽。另外，上述(LM)的轻链可变区例如包含由下述(L-M)的氨基酸序列组成的多肽。
(L-M)下述(L-M1)、(L-M2)或(L-M3)的氨基酸序列
(L-M1)序列号271的氨基酸序列
序列号271：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPDIFTFGPGTKVDIK
(L-M2)相对于序列号271的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L-M3)在序列号271的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
上述(L-M1)的氨基酸序列例如是包含CDRL1的(L1-M1)、CDRL2的(L2-M1)和CDRL3的(L3-M1)的氨基酸序列的序列。上述(L-M2)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-M1)、CDRL2的(L2-M1)和CDRL3的(L3-M1)的氨基酸序列、且相对于序列号271的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。上述(L-M3)的氨基酸序列例如可以是包含CDRL1的(L1-M1)、CDRL2的(L2-M1)和CDRL3的(L3-M1)的氨基酸序列、且在序列号271的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
对于本发明的抗体，例如，上述重链可变区为上述(H-A1)，上述轻链可变区为上述(L-M1)，以下也将该组合的抗体称为“抗体18H-K10”。
上述轻链可变区的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述轻链可变区的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
本发明中，上述序列号216～271的氨基酸序列例如为人源的氨基酸序列。
本发明的抗体等与CD19的结合例如可以通过表面等离子共振(SPR)、流式细胞仪等抗体与抗原的结合检测方法进行确认。
本发明的抗体等例如可以通过标记物标记，也可以固定化于载体、多孔体等上。上述标记和固定化可以援用上述的说明。
本发明的抗体等制造方法没有特别限制，例如可以基于上述的氨基酸序列信息通过基因工程方法进行制造。具体而言，例如可以如下方式进行。需要说明的是，本发明不限定于该示例。
首先，将包含编码本发明的抗体等中的、上述各区域、上述重链、和/或轻链的氨基酸序列的核酸序列的载体导入宿主中，得到转化体。然后，培养上述转化体，回收包含与CD19结合的抗体的级分，从得到的回收级分中分离或纯化上述抗体。
上述载体和导入了上述载体的转化体的培养方法可以援用上述的说明。
本发明中，上述抗体例如为单克隆抗体。上述单克隆抗体例如可列举出通过使动物免疫而得到的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(也称为全人源抗体)等。上述嵌合抗体和人源化抗体可以援用上述的说明。
本发明的抗体等例如也可以通过使动物免疫抗原而制备。上述抗原例如可列举出CD19蛋白。上述抗原优选进行多次免疫。上述肽片段例如可以是仅由抗原决定簇(表位)组成的肽片段，也可以是包含上述抗原决定簇的肽片段。上述单克隆抗体的制造方法可以援用上述的说明。
本发明的第2抗体等中，上述(L)的轻链可变区也可以为下述(L)的轻链可变区。
(L)包含轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区
CDRL1是包含下述(L1)的氨基酸序列的多肽
CDRL2是包含下述(L2)的氨基酸序列的多肽
CDRL3是包含下述(L3)的氨基酸序列的多肽
(L1)下述(L1-1)、(L1-2)或(L1-3)的氨基酸序列
(L1-1)下述条件(L1)～(L3)和(L4)的CDRL1中任意的氨基酸序列
(L1-2)相对于(L1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-3)在(L1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2)下述(L2-1)、(L2-2)或(L2-3)的氨基酸序列
(L2-1)下述条件(L1)～(L3)和(L4)的CDRL2中任意的氨基酸序列
(L2-2)相对于(L2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-3)在(L2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3)下述(L3-1)、(L3-2)或(L3-3)的氨基酸序列
(L3-1)下述条件(L1)～(L3)和(L4)的CDRL3中任意的氨基酸序列
(L3-2)相对于(L3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-3)在(L3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列；
条件(L1)
CDRL1为KLGDKY(序列号220)，
CDRL2为QDS(序列号221)，
CDRL3为QAWDSSTHV(序列号222)；
条件(L2)
CDRL1为WSNIGDDH(序列号228)，
CDRL2为DTS(序列号229)，
CDRL3为GTWESSLSGVV(序列号230)；
条件(L3)
CDRL1为X1SX2X3GX4X5NY(序列号317)，
CDRL2为DX6X7(序列号318)，
CDRL3为X8X9X10X11X12SX13X14X15X16X17(序列号319)，
X1为S或T，
X2为D或N，
X3为V、I、L或A，
X4为G、T、V或N，
X5不存在或为Y、T或S，
X6为V或N，
X7为S、I或V，
X8不存在或为G、A或H，
X9为T、S或A，
X10为W、Y或F，
X11为A或D，
X12为T、G、D或S，
X13为L或Y，
X14为T、N或S，
X15为A、F、G或H，
X15为V或I，
X17不存在或为V；
条件(L4)
CDRL1为QX1X2SX3SX4(序列号320)，
CDRL2为GAS(序列号253)或DAS(序列号257)，
CDRL3为QQX5X6X7X8X9X10X11LX12T(序列号321)，
X1为S、T、N或Q，
X2为V、I、L或A，
X3不存在或为A、I、V、L或G，
X4为N、Y或S，
X5不存在或为S，
X6为Y、F或W，
X7为N、S、D或G，
X8为N、T、S或E，
X9为W、L或S，
X10不存在或为P，
X11不存在或为P或D，
X12不存在或为Y、F或W。
上述(L)的轻链可变区中，(L1-1)、(L2-1)和(L3-1)在条件(L1)～(L4)中满足相同的条件或不同的条件，但优选满足相同的条件。
条件(L3)中，X3优选V或I。X5优选不存在或为Y或T。X10优选W或Y。
条件(L4)中，X1优选S或T。X2优选V或I。X6优选Y或F。X12优选不存在或为Y或F。
作为满足上述条件(L1)的轻链可变区，例如可列举出上述(LA)的轻链可变区。
作为满足上述条件(L2)的轻链可变区，例如可列举出上述(LC)的轻链可变区。
作为满足上述条件(L3)的轻链可变区，例如可列举出上述(LB)、(LE)、(LF)、(LG)和(LH)的轻链可变区。
作为满足上述条件(L4)的轻链可变区，例如可列举出上述(LI)、(LJ)、(LK)、(LL)和(LM)的轻链可变区。
<基因、表达载体和转化体>
本发明的编码基因是针对HLA-A*02：01和NY-ESO-1157-165的复合体的抗体或其抗原结合片段或者针对CD19的抗体或其抗原结合片段(以下也统称为本发明的抗体或其抗原结合片段”或“本发明的抗体等”)的编码基因，包含编码上述本发明的第1抗体或抗原结合片段的氨基酸序列或者上述本发明的第2抗体或抗原结合片段的核酸(多核苷酸)。
通过表达本发明的编码基因，从而能够得到上述的本发明的抗体等。本发明的编码基因的序列没有特别限制，只要是编码上述本发明的抗体等的氨基酸序列的序列即可，可以是正义序列或反义序列。
本发明的表达载体是针对A2/NY-ESO-1157的抗体或其抗原结合片段或者针对CD19的抗体或其抗原结合片段的表达载体，包含上述本发明的编码基因。上述表达载体中，上述编码基因例如以能表达上述本发明的抗体或其抗原结合片段的方式与上述连接用载体连接。本发明的表达载体只要能表达上述本发明的抗体等即可，其它构成没有特别限制。
本发明的表达载体例如可以是包含编码上述重链可变区的核酸序列和编码上述轻链可变区的核酸序列的表达载体，也可以是包含编码上述重链可变区的核酸序列的表达载体和包含编码上述轻链可变区的核酸序列的表达载体的组件。本发明的表达载体例如可以通过将上述本发明的编码基因连接至连接用载体上而制备。上述连接载体例如可以援用上述本发明的CAR文库中的表达载体的说明。连接上述编码基因的上述连接用载体的种类没有特别限制，例如可列举出pUC、pMX等。上述连接用载体例如也可以根据导入上述表达载体的宿主进行适宜设定。上述宿主没有特别限制，例如可列举出CHO细胞等哺乳类细胞等。
本发明的转化体是表达本发明的抗体等的转化体，包含宿主和上述本发明的编码基因。本发明的转化体只要以能表达的方式具有上述本发明的编码基因即可。上述转化体例如优选具有上述本发明的表达载体。将上述表达载体导入上述宿主中的方法没有特别限制，可以采用公知的方法。
本发明的基因、表达载体和转化体例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、本发明的第2抗体等的说明。
<第1嵌合抗原受体>
如前所述，本发明的第1嵌合抗原受体(CAR)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域，上述抗原结合结构域包含上述本发明的抗体或其抗原结合片段。本发明的第1CAR的特征在于，上述抗原结合结构域包含上述本发明的第1抗体等，其它构成和条件没有特别限制。本发明的第1CAR可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体和转化体的说明。本发明的第1CAR例如可以适宜地用作针对表达A2/NY-ESO-1157的癌细胞的CAR-T细胞的CAR。
上述抗原结合结构域例如可以是上述本发明的第1抗体，也可以是上述本发明的第1抗体的抗原结合片段。上述抗原结合片段优选为单链抗体(scFv)。上述抗原结合结构域为scFv的情况下，在上述抗原结合结构域中，从C末端或N末端起依次配置上述重链可变区和上述轻链可变区。
作为上述抗原结合结构域的具体例，例如可列举出下述(BD)的多肽。
(BD)下述(BD1)、(BD2)或(BD3)的多肽
(BD1)由序列号98～117中任意的氨基酸序列组成的多肽
(BD2)由相对于序列号98～117中任意的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成、且与A2/NY-ESO-1157结合的多肽
(BD3)由在序列号98～117中任意的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且与A2/NY-ESO-1157结合的多肽
上述(BD1)的多肽中，上述序列号98～117的氨基酸序列例如是包含上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。上述序列号98～117的氨基酸序列中的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列例如可以参照包含上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。上述(BD2)和(BD3)的多肽中，上述序列号98～117的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所对应的氨基酸序列例如是保守的。上述序列号98～117的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列例如可以参照包含上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列。
H1-3M4E5L的抗原结合结构域(序列号98)
K52-H1的抗原结合结构域(序列号99)
K73-H1的抗原结合结构域(序列号100)
K121-H1的抗原结合结构域(序列号101)
K124-H1的抗原结合结构域(序列号102)
K125-H1的抗原结合结构域(序列号103)
K131-H1的抗原结合结构域(序列号104)
K145-H1的抗原结合结构域(序列号105)
K151-H1的抗原结合结构域(序列号106)
K160-H1的抗原结合结构域(序列号107)
K173-H1的抗原结合结构域(序列号108)
L1-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号109)
3M4E5H-L1的抗原结合结构域(序列号110)
L66-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号111)
L73-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号112)
L80-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号113)
L88-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号114)
L102-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号115)
L124-3M4E5H的抗原结合结构域(序列号116)
H73-3M4E5L的抗原结合结构域(序列号117)
上述(BD1)的多肽中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的顺序也可以是相反的顺序。作为具体例，上述(BD1)的多肽也可以是由序列号98～117的氨基酸序列中交换了重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的氨基酸序列组成的多肽。
上述(BD2)的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(BD3)的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述跨膜结构域和上述细胞内信号转导结构域例如可以分别援用上述本发明的CAR文库的第1跨膜结构域和第1细胞内信号转导结构域的说明。
作为本发明的第1CAR的具体例，例如可列举出下述(C)的多肽。
(C)下述(C1)、(C2)或(C3)的多肽
(C1)由序列号118～137中任意的氨基酸序列组成的多肽
(C2)由相对于序列号118～137中任意的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成、且与A2/NY-ESO-1157结合的多肽
(C3)由在序列号118～137中任意的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且与A2/NY-ESO-1157结合的多肽
H1-3M4E5L CAR(序列号118)
K52-H1 CAR(序列号119)
K73-H1 CAR(序列号120)
K121-H1 CAR(序列号121)
K124-H1 CAR(序列号122)
K125-H1 CAR(序列号123)
K131-H1 CAR(序列号124)
K145-H1 CAR(序列号125)
K151-H1 CAR(序列号126)
K160-H1 CAR(序列号127)
K173-H1 CAR(序列号128)
L1-3M4E5H CAR(序列号129)
3M4E5H-L1 CAR(序列号130)
L66-3M4E5H CAR(序列号131)
L73-3M4E5H CAR(序列号132)
L80-3M4E5H CAR(序列号133)
L88-3M4E5H CAR(序列号134)
L102-3M4E5H CAR(序列号135)
L124-3M4E5H CAR(序列号136)
H73-3M4E5L CAR(序列号137)
上述(C1)的多肽中，上述序列号118～137的氨基酸序列例如为分别包含上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。上述(C2)和(C3)的多肽中，上述序列号118～137的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所对应的氨基酸序列例如是保守的。上述序列号118～137的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列例如可以分别参照包含上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
上述(C2)的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(C3)的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
本发明的第1CAR的制造方法没有特别限制，例如可以基于上述的氨基酸序列信息通过基因工程方法进行制造。具体而言，例如可以如下方式进行。需要说明的是，本发明不限定于该示例。
首先，将包含编码本发明的第1CAR的核酸的表达载体导入宿主中，得到转化体。此外，培养上述转化体，得到表达上述第1CAR的转化体。
上述表达载体例如可列举出包含编码上述第1CAR的核酸的载体等，例如可以援用上述的表达载体的说明。上述宿主没有特别限制，例如可以援用上述的宿主的说明。
<第2嵌合抗原受体>
如前所述，本发明的第2嵌合抗原受体(CAR)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域，上述抗原结合结构域包含上述本发明的抗体或其抗原结合片段。本发明的第2CAR的特征在于上述抗原结合结构域包含上述本发明的第2抗体等，其它构成和条件没有特别限制。本发明的第2CAR可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体和转化体的说明。本发明的第2CAR例如可以适宜地用作针对表达CD19的癌细胞的CAR-T细胞的CAR。
上述抗原结合结构域例如可以是上述本发明的第2抗体，也可以是上述本发明的第2抗体的抗原结合片段。上述抗原结合片段优选单链抗体(scFv)。上述抗原结合结构域为scFv的情况下，在上述抗原结合结构域中，从C末端或N末端起依次配置上述重链可变区和上述轻链可变区。
作为上述抗原结合结构域的具体例，例如可列举出下述(bd)的多肽。
(bd)下述(bd1)、(bd2)或(bd3)的多肽
(bd1)由序列号272～284中任意的氨基酸序列组成的多肽
(bd2)由相对于序列号272～284中任意的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成、且与CD19结合的多肽
(bd3)由在序列号272～284中任意的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且与CD19结合的多肽
上述(bd1)的多肽中，上述序列号272～284的氨基酸序列例如是包含上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。上述序列号272～284的氨基酸序列中的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列例如可以参照包含上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。上述(bd2)和(bd3)的多肽中，上述序列号272～284的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所对应的氨基酸序列例如是保守的。上述序列号272～284的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列例如可以参照包含上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列。
L4-18H的抗原结合结构域(序列号272)
L7-18H的抗原结合结构域(序列号273)
L9-18H的抗原结合结构域(序列号274)
L13-18H的抗原结合结构域(序列号275)
L14-18H的抗原结合结构域(序列号276)
L16-18H的抗原结合结构域(序列号277)
L17-18H的抗原结合结构域(序列号278)
L22-18H的抗原结合结构域(序列号279)
K4-18H的抗原结合结构域(序列号280)
K5-18H的抗原结合结构域(序列号281)
K6-18H的抗原结合结构域(序列号282)
K9-18H的抗原结合结构域(序列号283)
K10-18H的抗原结合结构域(序列号284)
上述(bd1)的多肽中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的顺序也可以是相反的顺序。作为具体例，上述(BD1)的多肽也可以是由序列号272～284的氨基酸序列中交换了重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的氨基酸序列组成的多肽。
上述(bd2)的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(bd3)的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
上述跨膜结构域和上述细胞内信号转导结构域例如可以分别援用上述本发明的CAR文库的第1跨膜结构域和第1细胞内信号转导结构域的说明。
作为本发明的第2CAR的具体例，例如可列举出下述(CA)的多肽。
(CA)下述(CA1)、(CA2)或(CA3)的多肽
(CA1)由序列号285～297中任意的氨基酸序列组成的多肽
(CA2)由相对于序列号285～297中任意的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成、且与CD19结合的多肽
(CA3)由在序列号285～297中任意的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且与CD19结合的多肽L4-18H CAR(序列号285)
L7-18H CAR(序列号286)
L9-18H CAR(序列号287)
L13-18H CAR(序列号288)
L14-18H CAR(序列号289)
L16-18H CAR(序列号290)
L17-18H CAR(序列号291)
L22-18H CAR(序列号292)
K4-18H CAR(序列号293)
K5-18H CAR(序列号294)
K6-18H CAR(序列号295)
K9-18H CAR(序列号296)
K10-18H CAR(序列号297)
上述(CA1)的多肽中，上述序列号285～297的氨基酸序列例如为分别包含上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。上述(CA2)和(CA3)的多肽中，上述序列号285～297的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所对应的氨基酸序列例如是保守的。上述序列号285～297的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列例如可以分别参照包含上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
上述(CA2)的多肽中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(CA3)的多肽中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
本发明的第2CAR的制造方法没有特别限制，例如可以基于上述的氨基酸序列信息通过基因工程方法进行制造。具体而言，例如可以如下方式进行。需要说明的是，本发明不限定于该示例。
首先，将包含编码本发明的第2CAR的核酸的表达载体导入宿主中，得到转化体。接着，培养上述转化体，得到表达上述第2CAR的转化体。
上述表达载体例如可列举出包含上述编码第2CAR的核酸的载体等，例如可以援用上述的表达载体的说明。上述宿主没有特别限制，例如可以援用上述的宿主的说明。
<核酸>
如前所述，本发明的核酸编码上述本发明的嵌合抗原受体。本发明的核酸的特征在于编码上述本发明的第1嵌合抗原受体或第2嵌合抗原受体(以下也统称为“本发明的嵌合抗原受体”)，其它构成和条件没有特别限制。利用本发明的核酸，例如能够使细胞表达本发明的CAR。本发明的核酸例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第1抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体的说明。
本发明的核酸例如可以基于上述本发明的CAR的氨基酸序列并利用常规方法制备。作为具体例，上述本发明的编码CAR的核酸例如可以如下方式制备：在注册了上述的各结构域的氨基酸序列的数据库中，获得编码上述氨基酸序列的碱基序列，基于上述碱基序列，利用分子生物学方法和/或化学合成方法进行制备。上述核酸的碱基序列例如可以根据表达本发明的CAR的细胞的来源进行密码子最优化。
作为本发明的核酸的具体例，例如可列举出下述(c)的多核苷酸。
(c)下述(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)或(c6)的多核苷酸(核酸)
(c1)编码由序列号118～137中任意的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸
(c2)编码由相对于序列号118～137中任意的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成、且与A2/NY-ESO-1157结合的多肽的多核苷酸
(c3)编码由序列号118～137中任意的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且与A2/NY-ESO-1157结合的多肽的多核苷酸
(c4)由序列号138～157中任意的碱基序列组成的多核苷酸
(c5)由相对于序列号138～157中任意的碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列组成、且编码与A2/NY-ESO-1157结合的多肽的多核苷酸
(c6)由序列号138～157中任意的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个碱基的碱基序列组成、且编码与A2/NY-ESO-1157结合的多肽的多核苷酸
上述(c1)～(c3)的多核苷酸分别为编码上述(C1)～(C3)的多肽的核酸，可以援用上述(C1)～(C3)的多肽的说明。
上述(c4)的多核苷酸中，上述序列号138～157的碱基序列例如是编码包含含有上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。上述(c5)和(c6)的多核苷酸中，上述序列号138～157的碱基序列的编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所对应的氨基酸序列的多核苷酸例如是保守的。上述序列号138～157的碱基序列中的编码各CDR的氨基酸序列的碱基序列例如可以分别参照包含上述本发明的第1抗体等中的组合(1)～(18)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列。
上述(c5)的多核苷酸中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(c6)的多核苷酸中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～280个、1～210个、1～140个、1～70个、1～63个、1～56个、1～49个、1～35个、1～28个、1～21个、1～14个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
编码H1-3M4E5L CAR的多核苷酸(序列号138)
编码K52-H1 CAR的多核苷酸(序列号139)
编码K73-H1 CAR的多核苷酸(序列号140)
编码K121-H1 CAR的多核苷酸(序列号141)
编码K124-H1 CAR的多核苷酸(序列号142)
编码K125-H1 CAR的多核苷酸(序列号143)
编码K131-H1 CAR的多核苷酸(序列号144)
编码K145-H1 CAR的多核苷酸(序列号145)
编码K151-H1 CAR的多核苷酸(序列号146)
编码K160-H1 CAR的多核苷酸(序列号147)
编码K173-H1 CAR的多核苷酸(序列号148)
编码L1-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号149)
编码3M4E5H-L1 CAR的多核苷酸(序列号150)
编码L66-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号151)
编码L73-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号152)
编码L80-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号153)
编码L88-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号154)
编码L102-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号155)
编码L124-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号156)
编码H73-3M4E5L CAR的多核苷酸(序列号157)
作为本发明的核酸的其它具体例，例如可列举出下述(ca)的多核苷酸。
(ca)下述(ca1)、(ca2)、(ca3)、(ca4)、(ca5)或(ca6)的多核苷酸(核酸)
(ca1)编码由序列号272～284中任意的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸
(ca2)编码由相对于序列号272～284中任意的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列组成、且与CD19结合的多肽的多核苷酸
(ca3)编码由序列号272～284中任意的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列组成、且与CD19结合的多肽的多核苷酸
(ca4)由序列号298～310中任意的碱基序列组成的多核苷酸
(ca5)由相对于序列号298～310中任意的碱基序列具有80％以上的同一性的碱基序列组成、且编码与CD19结合的多肽的多核苷酸
(ca6)由序列号298～310中任意的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个碱基的碱基序列组成、且编码与CD19结合的多肽的多核苷酸
上述(ca1)～(ca3)的多核苷酸是分别编码上述(CA1)～(CA3)的多肽的核酸，可以援用上述(CA1)～(CA3)的多肽的说明。
上述(ca4)的多核苷酸中，上述序列号298～310的碱基序列例如是编码包含如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列含有上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区。上述(ca5)和(ca6)的多核苷酸中，上述序列号298～310的碱基序列的编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3所对应的氨基酸序列的多核苷酸例如是保守的。上述序列号298～310的碱基序列中的编码各CDR的氨基酸序列的碱基序列例如可以分别参照包含上述本发明的第2抗体等中的组合(LA)～(LM)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列中的各CDR的氨基酸序列。
上述(ca5)的多核苷酸中，上述“同一性”分别为例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上。
上述(ca6)的多核苷酸中，与置换等相关的“1个或数个”分别为例如1～280个、1～210个、1～140个、1～70个、1～63个、1～56个、1～49个、1～35个、1～28个、1～21个、1～14个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个、1个。
编码L4-18H CAR的多核苷酸(序列号298)
编码L7-18H CAR的多核苷酸(序列号299)
编码L9-18H CAR的多核苷酸(序列号300)
编码L13-18H CAR的多核苷酸(序列号301)
编码L14-18H CAR的多核苷酸(序列号302)
编码L16-18H CAR的多核苷酸(序列号303)
编码L17-18H CAR的多核苷酸(序列号304)
编码L22-18H CAR的多核苷酸(序列号305)
编码K4-18H CAR的多核苷酸(序列号306)
编码K5-18H CAR的多核苷酸(序列号307)
编码K6-18H CAR的多核苷酸(序列号308)
编码K9-18H CAR的多核苷酸(序列号309)
编码K10-18H CAR的多核苷酸(序列号310)
本发明的核酸例如可以导入表达载体中。上述表达载体例如可以援用上述的说明。
本发明的核酸中，上述各种多核苷酸例如可以通过公知的基因工学方法或合成方法进行制造。
<细胞>
如前所述，本发明的细胞包含上述本发明的嵌合抗原受体。本发明的细胞的特征在于包含上述本发明的嵌合抗原受体，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的细胞，例如能够治疗癌症。本发明的细胞例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸等的说明。
本发明的细胞可以表达除上述本发明的CAR以外的CAR。上述细胞优选T细胞。上述T细胞例如也可以是上述T细胞样的细胞。
<细胞的制造方法>
如前所述，本发明的细胞的制造方法包括将上述本发明的核酸导入细胞中的导入工序。本发明的细胞的制造方法的特征在于在上述导入工序中将上述本发明的核酸导入细胞中，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的细胞的制造方法，例如，可以制造能治疗癌症的细胞。本发明的细胞的制造方法例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸、细胞等的说明。
上述细胞优选T细胞或T细胞样的细胞。
上述导入工序中的核酸的导入方法没有特别限制，例如可以援用上述本发明的第1筛选方法中的第1表达工序的说明。
本发明的细胞的制造方法例如可以包括：在上述导入工序后使上述细胞表达上述核酸所编码的嵌合抗原受体的表达工序。上述表达工序例如可以通过培养上述导入工序后的细胞而实施。
<癌症治疗药>
本发明的癌症治疗药(以下也称为“治疗药”)包含上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸。本发明的治疗药的特征在于包含上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸，其它构成和条件没有特别限制。根据本发明的治疗药，例如能够治疗癌症。本发明的癌症治疗药例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸、细胞、细胞的制造方法等的说明。
本发明中，治疗对象的癌症没有特别限制，例如可以根据所表达的嵌合抗原受体的种类等进行适宜确定。本发明的癌症治疗药为跟与A2/NY-ESO-1157结合的CAR相关的细胞、基因、表达载体或核酸的情况下，上述治疗对象的癌症例如可列举出恶性黑色素瘤、肺癌、滑膜肉瘤、乳腺癌、食道癌、卵巣癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、骨髓瘤等。本发明的癌症治疗药为跟与CD19结合的CAR相关的细胞、基因、表达载体或核酸的情况下，上述治疗对象的癌症例如可列举出B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤等。
本发明的治疗药的给药条件没有特别限制，例如根据成为对象的癌症的种类、癌症的进度、患者的年龄等适宜设定给药方式、给药方法、给药时期、给药量等。本发明的治疗药的使用方法没有特别限制，例如向上述给药对象给予本发明的治疗药即可。
上述给药对象例如可列举出细胞、组织或器官。上述给药对象例如可列举出人、除人以外的非人动物。上述非人动物例如可列举出小鼠、大鼠、狗、猴子、兔子、绵羊、马、猪等哺乳类等。上述给药例如可以是体内(in vivo)或体外(in vitro)。
上述给药方法没有特别限制，例如可以根据给药对象进行适宜确定。上述给药方法例如可列举出非经口给药、经口给药等。上述非经口给药例如可列举出局部给药、皮下给药、皮内给药、肌肉给药、腹腔内给药、静脉内给药、淋巴管内给药、肿瘤内给药等。
本发明的治疗药的给药方式没有特别限制，例如可列举出注射液(注射剂)、点滴静脉注射液等液体制剂等。
本发明的治疗药中，上述细胞的配混量没有特别限制。另外，上述细胞的给药条件没有特别限制。上述给药方法为静脉内给药的情况下，对于上述细胞的给药条件，例如对成人男子每1次的给药量(总计)例如为1×108～3×1010细胞，优选为1×109～1×1010细胞，给药次数例如每1～4周1次。对于本发明的治疗药中的上述细胞的配混量，优选以能够实现示例的给药条件的浓度来包含。
本发明的治疗药中，上述基因、表达载体或核酸的配混量没有特别限制。另外，上述基因、表达载体或核酸的给药条件没有特别限制。上述给药方法为皮下注射或静脉注射等，在对人进行全身给药的情况下，每1次的给药量(总计)例如为5～5000mg、50～500mg，给药次数例如为每2周～8周1次。
本发明的治疗药可以仅包含上述细胞、基因、表达载体和核酸中的任意一种，也可以包含多种。另外，本发明的治疗药可以进一步包含其它添加物。上述添加物的配混量只要不阻碍本发明的治疗药的功能就没有特别限制。上述添加物没有特别限制，例如优选药学上可接受的添加物。上述添加物的种类没有特别限制，例如可以根据给药对象的种类进行适宜选择。上述添加物例如可列举出基质、稳定剂、保存剂等。
<癌症的治疗方法>
本发明的癌症的治疗方法包括向给药对象给予上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸的给予工序。本发明的癌症的治疗方法的特征在于在上述给予工序中给予上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸，其它工序和条件没有特别限制。根据本发明的治疗方法，能够治疗癌症。本发明的癌症的治疗方法例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸、细胞、细胞的制造方法、治疗药等的说明。
上述给予工序中，可以给予上述本发明的细胞、基因、表达载体和核酸中的任意一种，也可以给予多种。
<抗体等或细胞、基因、表达载体或核酸的应用>
本发明为用于在治疗癌症的方法中使用的上述本发明的抗体或其抗原结合片段、或为用于治疗癌症的上述本发明的抗体或其抗原结合片段。另外，本发明为用于制造癌症的治疗用药物的上述本发明的抗体或其抗原结合片段的应用。进而，本发明为用于在治疗癌症的方法中使用的上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸、或者用于治疗癌症的上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸。另外，本发明为用于制造癌症的治疗用药物的上述本发明的细胞、基因、表达载体或核酸的应用。本发明的应用例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸、细胞、细胞的制造方法、治疗药、治疗方法等的说明。
<BsAb文库>
本发明的双特异性抗体(BsAb)文库包含编码第1双特异性抗体(BsAb)的核酸，上述第1BsAb包含第1抗原结合结构域和第2抗原结合结构域，上述第1抗原结合结构域包含与第1靶抗原结合的第1单链抗体(scFv)，上述第2抗原结合结构域包含能筛选与第2靶抗原的结合的第2scFv，上述第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足下述条件1或条件2，上述第1靶抗原或上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体。
条件1：
上述第2重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述第2靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件2：
上述第2重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述第2靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本发明的BsAb文库中，本发明的BsAb文库中，上述第1BsAb包含第1抗原结合结构域和第2抗原结合结构域，上述第1抗原结合结构域包含与第1靶抗原结合的第1scFv，上述第2抗原结合结构域包含能筛选与第2靶抗原的结合的第2scFv，上述第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足上述条件1或条件2，上述第1靶抗原或上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体，其它构成和条件没有特别限制。本发明的BsAb文库例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸、细胞、细胞的制造方法、治疗药、治疗方法等的说明。
本发明的BsAb文库中，上述第1BsAb是包含上述第1抗原结合结构域和上述第2抗原结合结构域的蛋白质。上述第1抗原结合结构域和上述第2抗原结合结构域分别包含与第1靶抗原结合的第1单链抗体(scFv)、及筛选与第2靶抗原结合的第2scFv。上述第2scFv例如具有与scFv相似的结构，与上述抗原结合的胞外结构域被变更为筛选与上述第2靶抗原的结合的第2抗原结合结构域。另外，本发明的BsAb文库中，上述第1靶抗原或上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体。因此，上述第1靶抗原为上述免疫细胞激活受体时，与上述第2靶抗原结合的第1BsAb例如能够在表达上述第2靶抗原和上述第1靶抗原(上述免疫细胞激活受体)的免疫细胞的共存下，通过上述免疫细胞的上述免疫细胞激活受体而诱导信号，其结果，能够激活上述免疫细胞(例如，增殖、激活标记的表达等)。即，利用本发明的BsAb文库，上述第1靶抗原为上述免疫细胞激活受体时，使用后述的第2筛选方法，可以在上述BsAb文库所表达的BsAb组中选择激活上述免疫细胞的第1BsAb作为与上述第2靶抗原结合的BsAb。因此，利用本发明的BsAb文库，例如，与使用杂交瘤的方法和使用噬菌体展示的方法相比，能够更简便地筛选与第2靶抗原结合的scFv。另外，与上述第2靶抗原结合的第1BsAb例如在后述的第2筛选方法中能够激活上述免疫细胞，因此可以说是能够激活上述免疫细胞的BsAb。因此，利用本发明的BsAb文库，例如，能够筛选对表达上述第2靶抗原的细胞诱导上述免疫细胞介导性细胞毒性等的BsAb。
另外，上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，与上述第2靶抗原结合的第1BsAb例如能在表达上述第1靶抗原和上述第2靶抗原(上述免疫细胞激活受体)的免疫细胞的共存下，通过上述免疫细胞的免疫细胞激活受体而诱导信号，其结果，能够激活免疫细胞(例如，增殖、激活标记的表达等)。即，利用本发明的BsAb文库，上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，可以使用后述的第2筛选方法在上述BsAb文库所表达的BsAb组中选择激活上述免疫细胞的第1BsAb作为与上述第2靶抗原结合的BsAb。因此，利用本发明的BsAb文库，例如，与使用杂交瘤的方法和使用噬菌体展示的方法相比，能够更简便地筛选与第2靶抗原结合的scFv。另外，与上述第2靶抗原结合的第1BsAb例如在后述的第2筛选方法中能够激活上述免疫细胞，因此可以说是能激活免疫细胞的BsAb。因此，利用本发明的BsAb文库，例如，能够筛选对表达上述第1靶抗原的细胞能诱导免疫细胞诱导性细胞毒性等的BsAb。
另外，本发明的BsAb文库中，上述第2抗原结合结构域包含能筛选与上述靶抗原的结合的第2scFv。上述第2scFv例如是源自与抗原结合的抗体的单链的多肽，且具有跟保持与上述抗原的结合能力的scFv相似的结构。上述scFv是将与上述抗原结合的抗体的重链(H链)和轻链(L链)的可变区的片段(Fv)连接而成的多肽。另一方面，上述第2scFv中，例如，如下所述，重链可变区和轻链可变区中的一者为与上述第2靶抗原结合的抗体等的可变区，另一者为源自B细胞受体的可变区，即与上述第2靶抗原结合与否不明确的可变区。本发明的BsAb文库通过将上述第2scFv设为这样的构成，从而例如能够实施与上述第2靶抗原结合的重链可变区或轻链可变区的筛选。因此，利用本发明的BsAb文库，例如，跟一次性筛选与上述第2靶抗原结合的重链可变区和轻链可变区的噬菌体展示法相比，能够以更少数量或种类的核酸筛选与上述第2靶抗原结合的scFv。
本发明的BsAb文库中，编码第1BsAb的核酸例如是指编码第1BsAb的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)，可以援用上述的说明。
本发明中，“BsAb”例如是指抗体分子中的2个抗原结合位点分别与不同的靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。上述不同的靶抗原例如是指表位不同，既可以是不同抗原的表位，也可以是相同抗原中的不同的表位。上述“BsAb”例如可以采用公知的双特异性抗体的结构，作为具体例，可以采用双可变区抗体(DVD-Ig(商标))、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、tandab、作为scFv与双链抗体的组合的flexibody、串联(tandem)scFv(例如，BiTE(注册商标)、Micromet公司)、DART(注册商标)(MacroGenics公司)、Fcab(商标)或mAb2(商标)(F-star公司)、Fc engineering抗体(Xencor公司)或DuoBody(注册商标)(Genmab公司)等的结构，从能够容易地构建文库的方面考虑，优选为串联scFv。上述串联scFv例如是2个scFv通过连接肽(Fv间连接肽)连接而成的蛋白质，2个scFv中，重链可变区和轻链可变区分别通过连接肽(Fv连接肽)而连接。
以下就第1BsAb分别对第1靶抗原为免疫细胞激活受体的情况及上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体的情况进行说明。
(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体
上述免疫细胞激活受体例如是指：上述免疫细胞所表达的、且通过与配体的结合或多个免疫细胞激活受体的交联而能够激活上述表达免疫细胞激活受体的免疫细胞的受体。上述免疫细胞激活受体例如可以根据上述免疫细胞的种类进行适宜确定。作为具体例，上述免疫细胞为T细胞时，上述免疫细胞激活受体可列举出CD3等。上述CD3例如可列举出CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD3η或者它们的复合体。上述免疫细胞为NK细胞时，上述免疫细胞激活受体可列举出NK细胞的激活受体等。上述NK细胞的激活受体例如可列举出CD94/NKG2C、CD94/NKG2E、NKG2D/NKG2D等。上述免疫细胞为NKT细胞时，上述免疫细胞激活受体可列举出CD3、上述NK细胞的激活受体等。上述免疫细胞为B细胞时，上述免疫细胞激活受体例如可列举出CD19、CD79α、CD79β等。
上述第1靶抗原为上述免疫细胞激活受体时，上述第2靶抗原没有特别限制，例如可以援用上述CAR文库中的靶抗原的说明。
本发明的BsAb文库中，第1scFv例如包含第1重链可变区和第1轻链可变区。上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区具有与抗体分子中的重链可变区和轻链可变区同样的结构。通常，抗体分子的重链可变区和轻链可变区分别具有3个互补决定区(CDR：Complemetarity determining region)。CDR也称为高变区(hypervariable domain)。CDR也是上述重链和轻链的可变区中一级结构的突变性特别高的区域，在一级结构中通常分散在3个位置。本发明中，将重链可变区中的3个CDR从重链可变区的氨基酸序列中的氨基末端(N末端)侧起表示为重链CDR1(CDRH1)、重链CDR2(CDRH2)和重链CDR3(CDRH3)，将轻链可变区中的3个CDR从轻链可变区的氨基酸序列中的氨基末端侧起表示为轻链CDR1(CDRL1)、轻链CDR2(CDRL2)和轻链CDR3(CDRL3)。这些位点在立体结构的上彼此接近、并决定着针对所结合的抗原的特异性。
上述第1重链可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第1轻链可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。
上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、及上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3使用与CD3等免疫细胞激活受体结合的抗体或其抗原结合片段。上述抗体或其抗原结合片段的具体例例如可以援用上述的本发明的抗体等中的抗体和抗原结合片段的说明。
与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等例如可以根据上述免疫细胞激活受体的种类使用公知的抗体等。作为具体例，上述免疫细胞激活受体为CD3时，针对CD3ε的抗体例如可列举出OKT3抗体、UCHT1抗体、L2K抗体、HIT3a抗体、28F11抗体、27H5抗体等。上述免疫细胞激活受体为CD19时，针对CD19的抗体例如可列举出FMC63抗体、SJ25C1等。与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等例如也可以是通过免疫上述免疫细胞激活受体而得到的抗体。与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等例如也可以是通过后述的本发明的第2筛选方法而得到的scFv。上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第1重链可变区中，除CDRH1、CDRH2和CDRH3以外的区域、即框架区(FR)例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区的FR。上述FR在一级结构上通常分散在4个位置。本发明中，上述重链可变区中的4个FR从上述重链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起表示为重链FR1(FRH1)、重链FR2(FRH2)、重链FR3(FRH3)和重链FR4(FRH4)。需要说明的是，上述各CDRH与上述各FRH例如从上述重链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起依次配置有FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3和FRH4。上述第1重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与前免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”与上述各FRH的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第1重链可变区例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区。在此情况下，上述第1重链可变区例如可以是由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中，FR例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区的FR。上述FR在一级结构上通常分散在4个位置。本发明中，将上述轻链可变区中的4个FR从上述轻链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起表示为轻链FR1(FRL1)、轻链FR2(FRL2)、轻链FR3(FRL3)和轻链FR4(FRL4)。需要说明的是，上述各CDRL与上述各FRL例如从上述轻链可变区的氨基酸序列中的N末端侧起依次配置有FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3和FRL4。上述第1轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”与上述各FRL的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第1轻链可变区例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区。在此情况下，上述第1轻链可变区例如可以是由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1scFv中，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区例如通过第1连接肽(第1Fv连接肽)而连接。上述第1Fv连接肽例如优选不抑制上述第1scFv与上述免疫细胞激活受体的结合。上述第1Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述第1Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述第1Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。
本发明的BsAb文库中，第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区。上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区具有与抗体分子中的重链可变区和轻链可变区同样的结构，对于其结构，例如可以援用上述第1scFv的说明。
上述第2重链可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第2轻链可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足上述条件1或条件2。
上述条件1下，上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3使用与上述第2靶抗原结合的抗体等对于上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3筛选与上述第2靶抗原的结合。上述抗体或其抗原结合片段的具体例例如可以援用上述的本发明的抗体等中的抗体和抗原结合片段的说明。
与上述第2靶抗原结合的抗体等例如可以根据上述第2靶抗原使用公知的抗体等。作为具体例，作为针对HLA-A*02：01和NY-ESO-1157-165的复合体的抗体，例如可以使用3M4E5抗体。另外，作为针对人CD19的抗体，例如可以使用FMC63抗体。与上述第2靶抗原结合的抗体等例如可以是通过后述的本发明的第2筛选方法而得到的scFv，也可以是通过免疫上述第2靶抗原而得到的抗体。上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由与上述第2靶抗原结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第2靶抗原结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第2重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由与上述第2靶抗原结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第2靶抗原结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“与第2靶抗原结合的抗体等”与上述各FRH的说明中的“与第2靶抗原结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第2重链可变区例如可以包含与上述第2靶抗原结合的抗体等中的重链可变区。在此情况下，上述第2重链可变区例如可以是由与上述第2靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第2靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区例如由V基因片段和J基因片段重组VJ基因而形成的VJ基因片段编码。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是包含人工VJ基因片段所编码的多肽的B细胞受体，所述人工VJ基因片段是人工组合V基因片段和J基因片段而设计出的。另外，生物体内的B细胞例如表达VJ基因重组后的轻链可变区。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是源自分离的B细胞的B细胞受体。在此情况下，上述第1B细胞受体例如可列举出人源B细胞的B细胞受体，优选为人外周血B细胞来源的B细胞受体。本发明的BsAb文库中，从能够更容易地制备BsAb文库的方面考虑，上述第1B细胞受体优选为源自分离的B细胞的B细胞受体的轻链可变区。
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第1B细胞受体的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第1B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第1B细胞受体”与上述各FRL的说明中的“第1B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第2轻链可变区例如可以包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是分别由上述第1B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2scFv中，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区例如通过第2连接肽(第2Fv连接肽)而连接。上述第2Fv连接肽例如优选不阻碍上述第2scFv与上述第2靶抗原的结合。上述第2Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述第2Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述第2Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。上述第2Fv连接肽例如可以与上述第1Fv连接肽相同，也可以不同。
接着，上述条件2下，上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3源自与上述第2靶抗原结合的抗体等，且对上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3筛选与上述第2靶抗原的结合。
上述第2重链可变区例如由V基因片段、D基因片段和J基因片段重组VDJ基因而形成的VDJ基因片段编码。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是包含人工VDJ基因片段所编码的多肽的B细胞受体，所述人工VDJ基因片段是人工组合V基因片段、D基因片段和J基因片段设计而成的。另外，生物体内的B细胞例如表达VDJ基因重组后的重链可变区。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是源自分离的B细胞的B细胞受体。在此情况下，上述第1B细胞受体例如可列举出人源B细胞的B细胞受体，优选为人外周血B细胞来源的B细胞受体。本发明的BsAb文库中，从能够更容易地制备BsAb文库的方面考虑，上述第1B细胞受体优选为源自分离的B细胞的B细胞受体的重链可变区。
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第2重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第1B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第1B细胞受体”与上述各FRH的说明中的“第1B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第2重链可变区例如可以包含上述第1B细胞受体中的重链可变区。在此情况下，上述第2重链可变区例如可以是分别由上述第1B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中，与上述第2靶抗原结合的抗体等例如可以援用上述条件1中的与第2靶抗原结合的抗体等的说明。上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由与上述第2靶抗原结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第2靶抗原结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中，FR例如可以包含与上述第2靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的FR。上述第2轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由与上述第2靶抗原结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第2靶抗原结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“与第2靶抗原结合的抗体等”与上述各FRL的说明中的“与第2靶抗原结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第2轻链可变区例如可以包含与上述第2靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是由与上述第2靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第2靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2scFv中，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区例如通过第2连接肽(第2Fv连接肽)而连接。上述第2Fv连接肽例如优选不阻碍上述第2scFv与上述第2靶抗原的结合。上述第2Fv连接肽的说明例如可以援用上述第1Fv连接肽的说明。上述第2Fv连接肽例如可以与上述第1Fv连接肽相同，也可以不同。
上述第1scFv和上述第2scFv例如直接或间接地连接。上述第1scFv和上述第2scFv的连接例如可以根据上述第1BsAb的种类进行适宜设计。作为具体例，上述第1BsAb为串联scFv的情况下，上述第1scFv和上述第2scFv通过连接肽(Fv间连接肽)而连接。上述Fv间连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述Fv间连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述Fv间连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。
(2)第2靶抗原：免疫细胞激活受体
上述第1靶抗原没有特别限制，例如可以援用上述CAR文库中的靶抗原的说明。
上述第2靶抗原可以援用上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”中的第1靶抗原的说明。
本发明的BsAb文库中，第1scFv例如包含第1重链可变区和第1轻链可变区。上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区具有与抗体分子中的重链可变区和轻链可变区同样的结构，可以援用上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”中的第1scFv的说明。上述第1重链可变区例如具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第1轻链可变区例如具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。
上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、及上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3使用与上述第1靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。上述抗体或其抗原结合片段的具体例例如可以援用上述的本发明的抗体等中的抗体和抗原结合片段的说明。
与上述第1靶抗原结合的抗体等例如可以根据上述第1靶抗原的种类使用公知的与第1靶抗原结合的抗体等。另外，与上述第1靶抗原结合的抗体等例如也可以是通过免疫上述第1靶抗原而得到的抗体。与上述第1靶抗原结合的抗体等例如也可以是通过后述的本发明的第2筛选方法而得到的scFv。上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由与上述第1靶抗原结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第1靶抗原结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第1重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由与上述第1靶抗原结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第1靶抗原结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“与第1靶抗原结合的抗体等”与上述各FRH的说明中的“与第1靶抗原结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第1重链可变区例如可以包含与上述第1靶抗原结合的抗体等中的重链可变区。在此情况下，上述第1重链可变区例如可以是分别由与上述第1靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第1靶抗原结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由与上述第1靶抗原结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第1靶抗原结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第1轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由与上述第1靶抗原结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第1靶抗原结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“与第1靶抗原结合的抗体等”与上述各FRL的说明中的“与第1靶抗原结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第1轻链可变区例如可以包含与上述第1靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区。在此情况下，上述第1轻链可变区例如可以是由与上述第1靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述第1靶抗原结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1scFv中，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区例如通过第1连接肽(第1Fv连接肽)而连接。上述第1Fv连接肽例如优选不阻碍上述第1scFv与上述第1靶抗原的结合。上述第1Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述第1Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述第1Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。
本发明的BsAb文库中，第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区。上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区具有与抗体分子中的重链可变区和轻链可变区同样的结构，对于其结构，例如可以援用上述(1)中的第1scFv的说明。
上述第2重链可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第2轻链可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足上述条件1或条件2。
上述条件1下，上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3使用与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等对于上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3筛选与上述免疫细胞激活受体的结合。上述抗体或其抗原结合片段的具体例例如可以援用上述的本发明的抗体等中的抗体和抗原结合片段的说明。
与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等例如可以援用上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”中的与免疫细胞激活受体结合的抗体等的说明。上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第2重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”与上述各FRH的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第2重链可变区例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区。在此情况下，上述第2重链可变区例如可以是由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区例如由V基因片段和J基因片段重组VJ基因而形成的VJ基因片段编码。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是包含人工VJ基因片段所编码的多肽的B细胞受体，所述人工VJ基因片段是人工组合V基因片段和J基因片段设计而成的。另外，生物体内的B细胞例如表达VJ基因重组后的轻链可变区。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是源自分离的B细胞的B细胞受体。在此情况下，上述第1B细胞受体例如可列举出人源B细胞的B细胞受体，优选为人外周血B细胞来源的B细胞受体。本发明的BsAb文库中，从能够更容易地制备BsAb文库的方面考虑，上述第1B细胞受体优选为源自分离的B细胞的B细胞受体的轻链可变区。
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第1B细胞受体的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第1B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第1B细胞受体”与上述各FRL的说明中的“第1B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第2轻链可变区例如可以包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是分别由上述第1B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第1scFv中，上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区例如通过第1连接肽(第1Fv连接肽)而连接。上述第1Fv连接肽例如优选不阻碍上述第1scFv与上述第1靶抗原的结合。上述第1Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述第1Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述第1Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。
接着，上述条件2下，上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3源自与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等，且对上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3筛选与上述免疫细胞激活受体的结合。
上述第2重链可变区例如由V基因片段、D基因片段和J基因片段重组VDJ基因而形成的VDJ基因片段编码。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是包含人工VDJ基因片段所编码的多肽的B细胞受体，所述人工VDJ基因片段是人工组合V基因片段、D基因片段和J基因片段设计而成的。另外，生物体内的B细胞例如表达VDJ基因重组后的重链可变区。因此，上述第1B细胞受体例如也可以是源自分离的B细胞的B细胞受体。在此情况下，上述第1B细胞受体例如可列举出人源B细胞的B细胞受体，优选为人外周血B细胞来源的B细胞受体。本发明的BsAb文库中，从能够更容易地制备BsAb文库的方面考虑，上述第1B细胞受体优选为源自分离的B细胞的B细胞受体的重链可变区。
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第2重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第1B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第1B细胞受体”与上述各FRH的说明中的“第1B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第2重链可变区例如可以包含上述第1B细胞受体中的重链可变区。在此情况下，上述第2重链可变区例如可以是由上述第1B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中，与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等例如可以援用上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”中的与免疫细胞激活受体结合的抗体等的说明。上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第2轻链可变区中，FR例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区的FR。上述第2轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”与上述各FRL的说明中的“与免疫细胞激活受体结合的抗体等”优选为相同的抗体等。
上述第2轻链可变区例如可以包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是由与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含与上述免疫细胞激活受体结合的抗体等中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第2scFv中，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区例如通过第2连接肽(第2Fv连接肽)而连接。上述第2Fv连接肽例如优选不阻碍上述第2scFv与上述免疫细胞激活受体的结合。上述第2Fv连接肽的说明例如可以援用上述第1Fv连接肽的说明。上述第2Fv连接肽例如可以与上述第1Fv连接肽相同，也可以不同。
上述第1scFv和上述第2scFv例如可以直接或间接地连接，在上述第3scFv和上述第4scFv共存时，两者可以形成为缔合(结合)。上述第1scFv和上述第2scFv的连接例如可以根据上述第1BsAb的种类进行适宜设计。作为具体例，上述第1BsAb为串联scFv的情况下，上述第1scFv和上述第2scFv通过连接肽(Fv间连接肽)而连接。上述Fv间连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述Fv间连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。作为具体例，上述Fv间连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。上述缔合例如可以利用氨基酸侧链的电荷。作为具体例，上述缔合例如可以通过在一者的结合结构域上添加具有正电荷的氨基酸的结构域、在另一者的结合结构域上添加具有负电荷的氨基酸的结构域而诱导。另外，上述缔合例如也可以利用标签序列和识别标签序列的多肽的组合等。
本发明的BsAb文库中，上述第1BsAb中的上述第1scFv和上述第2scFv的配置顺序例如可以是从N末端侧起依次配置上述第1scFv和上述第2scFv，也可以是从N末端侧起依次配置上述第2scFv和上述第1scFv，但从能够更简便地制备第1BsAb文库的方面考虑，优选后者。
上述第1BsAb例如可列举出由下述式(3)(序列号158)所示的氨基酸序列组成的多肽。下述式(3)中，V1、V2、V3和V4例如可列举出下述(V1)～(V8)的组合。上述第2scFv满足上述条件1时，V1、V2、V3和V4优选下述(V7)或(V8)。另外，上述第2scFv满足上述条件2时，V1、V2、V3和V4优选下述(V5)或(V6)。下述式(3)中，V1与V2之间的氨基酸序列为第1Fv连接肽的氨基酸序列，V2与V3之间的氨基酸序列为Fv间连接肽的氨基酸序列，V3与V4之间的氨基酸序列为第2Fv连接肽的氨基酸序列。下述式(3)中，第1Fv连接肽和第2Fv连接肽为Fv连接肽1，但也可以各自独立地为Fv连接肽2。
[V1]-[GSTSGSGKPGSGEGSIKG]-[V2]-[SGSG]-[V3]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V4]…(3)
(V1)V1：VH1、V2：VL1、V3：VH2、V4：VL2
(V2)V1：VL1、V2：VH1、V3：VH2、V4：VL2
(V3)V1：VH1、V2：VL1、V3：VL2、V4：VH2
(V4)V1：VL1、V2：VH1、V3：VL2、V4：VH2
(V5)V1：VH2、V2：VL2、V3：VH1、V5：VL1
(V6)V1：VH2、V2：VL2、V3：VL1、V4：VH1
(V7)V1：VL2、V2：VH2、V3：VH1、V4：VL1
(V8)V1：VL2、V2：VH2、V3：VL1、V4：VH1
VH1：第1重链可变区
VL1：第1轻链可变区
VH2：第2重链可变区
VL2：第2轻链可变区
上述编码第1BsAb的核酸例如可列举出由下述式(4)(序列号159)所示的碱基序列组成的多核苷酸。下述式(4)中，N1、N2、N3、及N4例如可列举出下述(N1)～(N8)的组合。下述(N1)～(N8)分别为编码上述(V1)～(V8)的组合的第1BsAb的核酸。下述式(4)中，N1与N2之间的碱基序列为编码第1Fv连接肽的碱基序列，N2与N3之间的碱基序列为编码Fv间连接肽的碱基序列，N3与N4之间的碱基序列为编码第2Fv连接肽的碱基序列。下述式(4)中，编码第1Fv连接肽和第2Fv连接肽的碱基序列为编码Fv连接肽1的碱基序列，但也可以各自独立地为编码Fv连接肽2的碱基序列。
5’-[N1]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N2]-[AGCGGATCTGGC]-[N3]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N4]-3’…(4)
(N1)N1：NH1、N2：NL1、N3：NH2、N4：NL2
(N2)N1：NL1、N2：NH1、N3：NH2、N4：NL2
(N3)N1：NH1、N2：NL1、N3：NL2、N4：NH2
(N4)N1：NL1、N2：NH1、N3：NL2、N4：NH2
(N5)N1：NH2、N2：NL2、N3：NH1、N4：NL1
(N6)N1：NH2、N2：NL2、N3：NL1、N4：NH1
(N7)N1：NL2、N2：NH2、N3：NH1、N4：NL1
(N8)N1：NL2、N2：NH2、N3：NL1、N4：NH1
NH1：编码第1重链可变区的碱基序列
NL1：编码第1轻链可变区的碱基序列
NH2：编码第2重链可变区的碱基序列
NL2：编码第2轻链可变区的碱基序列
本发明的BsAb文库例如优选包含多种核酸。在此情况下，本发明的BsAb文库例如为多种核酸的混合物。上述多种核酸例如其一部分或全部优选编码不同的第1BsAb，优选编码不同的第2抗原结合结构域。多种核酸编码不同的第2抗原结合结构域时，上述第1BsAb中的除第2抗原结合结构域以外的区域例如为相同的或不同的氨基酸序列。本发明的BsAb文库中包含的上述核酸的种类例如为1×105～1×106种、1×106～5×106种，优选为约1×106种(例如，8×105～2×106种)。上述噬菌体展示法中，与上述靶抗原结合的scFv的筛选需要约1×108种核酸。另一方面，利用本发明的BsAb文库，例如，即使为约1×106种核酸，也能够筛选与上述第2靶抗原结合的scFv。因此，利用本发明的BsAb文库，例如与噬菌体展示法相比，能够以更少数量或种类的核酸筛选与上述第2靶抗原结合的scFv。
上述第1BsAb例如可以在N末端具有信号肽。上述信号肽例如可列举出成为向内质网的转运信号的信号肽。上述第1BsAb例如可以具有标签。上述标签例如可列举出肽标签、蛋白质标签。上述标签例如可列举出FLAG(注册商标)标签、HA标签、His标签、Myc标签、V5标签、切割型的神经生长因子受体(NGFR：nerve growth factor receptor)等。上述标签肽例如添加至上述第1BsAb的N末端和C末端的至少一者上。上述标签为切割型的NGFR的情况下，上述标签例如配置于上述第1BsAb的C末端侧。由此，本发明的BsAb文库例如可以以在1个细胞中导入1种编码第1BsAb的核酸的方式来调整核酸的导入效率。上述第1BsAb与上述标签也可以通过连接肽而连接。
本发明中，上述编码第1BsAb的核酸例如可以基于上述第1BsAb的氨基酸序列并利用常规方法制备。作为具体例，上述编码第1BsAb的核酸例如可以如下制备：在注册了上述的各结构域的氨基酸序列的数据库中，获得编码上述氨基酸序列的碱基序列，基于上述碱基序列，利用分子生物学方法和/或化学合成方法进行制备。上述核酸的碱基序列例如可以根据表达本发明的BsAb文库的细胞的来源进行密码子最优化。
上述编码第1BsAb的核酸例如可以导入表达载体中。上述表达载体例如可以通过使上述编码第1BsAb的核酸与连接用载体连接而制备。上述连接用载体的种类没有特别限制，例如可列举出致癌RNA病毒载体、慢病毒载体、假型载体等逆转录病毒载体；腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿肾病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒(EBV)载体、HSV载体等病毒载体。作为具体例，上述连接用载体例如可列举出pUC、pCMV、pMX、pELP等。上述连接用载体例如也可以根据导入上述表达载体的宿主进行适宜设定。上述宿主没有特别限制，例如可列举出CHO细胞、Jurkat细胞、Jurkat76细胞等源自哺乳类的培养细胞、免疫细胞等。上述免疫细胞例如可列举出淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞等。上述淋巴细胞例如可列举出T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞等。上述免疫细胞例如是从生物体中分离出的细胞、由多能干细胞等干细胞诱导的免疫细胞或源自免疫细胞的培养细胞。上述T细胞也可以是T细胞样的细胞。上述T细胞样的细胞例如可列举出源自T细胞的培养细胞等，作为具体例，可列举出Jurkat细胞、Jurkat76细胞等。
上述表达载体例如优选具有调控序列，所述调控序列对上述编码第1BsAb的核酸的表达和上述编码第1BsAb的核酸所编码的第1BsAb中的至少一者的表达进行调节。上述调控序列例如可列举出启动子、终止子、增强子、聚腺苷酸化信号序列、复制起点序列(ori)等。上述表达载体中，上述调控序列的配置没有特别限制。上述表达载体中，上述调控序列例如以能够在功能上调节上述编码第1BsAb的核酸的表达和其所编码的上述第1BsAb中的至少一者的表达的方式配置即可，可以基于公知的方法进行配置。上述调控序列例如可以利用上述连接载体所预先具备的序列，也可以进一步将上述调控序列插入上述连接载体中，也可以将上述连接载体所具备的调控序列置换为其它调控序列。
上述表达载体例如可以进一步具有选择标记的编码序列。上述选择标记例如可列举出抗药性标记、荧光蛋白标记、酶标记、细胞表面受体标记等。
<第2筛选方法>
本发明的第2scFv的筛选方法(以下也称为“第2筛选方法”)具备如下工序：
第1准备工序，由上述本发明的BsAb文库准备第1BsAb；
第1接触工序，
上述第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，
使上述第1BsAb与上述第2靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触，
上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，
使上述第1BsAb与上述第1靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触；及
第1选择工序，选择在上述第1接触工序中与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的第2scFv作为与上述第2靶抗原结合的第1候选scFv。
本发明的第2筛选方法的特征在于包括上述第1准备工序、上述第1接触工序和上述第1选择工序，上述第1准备工序使用上述本发明的BsAb文库，其它构成和条件没有特别限制。利用本发明的第2筛选方法，例如，与使用杂交瘤的方法和使用噬菌体展示的法相比，能够更简便地筛选与第2靶抗原结合的scFv。另外，利用本发明的第2筛选方法，例如能够对表达上述第1靶抗原或第2靶抗原的细胞筛选能诱导T细胞介导性细胞毒性等的BsAb。进而，基于与上述第2靶抗原结合的scFv的重链可变区和轻链可变区的各CDR的氨基酸序列，例如能够制作能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段。因此，上述第2筛选方法例如也可以称为与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段的筛选方法。本发明的第2筛选方法例如可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、第1抗体等、第2抗体等、基因、表达载体、转化体、第1嵌合抗原受体、第2嵌合抗原受体、核酸、细胞、细胞的制造方法、治疗药、治疗方法、BsAb文库等的说明。根据本发明的第2筛选方法，例如能够制造与靶抗原结合的新的scFv。因此，本发明的第2筛选方法例如也可以称为scFv的制造方法。
利用噬菌体展示法等制造与靶抗原结合的BsAb等时，制作约1×1010种的抗体文库，获得与靶抗原结合的抗体后，由上述抗体制备包含scFv的BsAb等。接着，使用免疫细胞等对上述BsAb等的有效性进行研究。另一方面，本发明的第2筛选方法中，由于使用上述本发明的BsAb文库和上述免疫细胞，因此能够同时实施例如对与上述靶抗原结合的scFv的筛选及由上述文库表达的BsAb在免疫细胞中的有效性的研究。因此，利用本发明的第2筛选方法，例如，与为了得到与靶抗原结合的抗体而使用的噬菌体展示法等相比，能够简便地筛选与靶抗原结合且在免疫细胞等中有效地发挥作用的BsAb中所使用的scFv。
上述第1准备工序是由上述本发明的BsAb文库准备第1BsAb的工序。上述第1BsAb的准备方法没有特别限制，例如可以利用由公知的核酸合成蛋白质的方法。作为具体例，上述第1准备工序中，例如，将上述本发明的BsAb文库(第1BsAb文库)导入宿主中。然后，在上述第1准备工序中，例如，通过培养导入了上述第1BsAb文库的宿主，从而使上述宿主表达上述BsAb。上述第1BsAb文库的导入方法没有特别限制，例如可以根据上述宿主的种类进行适宜确定。上述宿主为细胞时，上述导入方法例如可以利用公知的将核酸导入细胞中的方法，可以援用上述本发明的第1筛选方法的上述第1表达工序中的导入方法的说明。上述宿主的培养条件没有特别限制，例如可以根据上述宿主的种类进行适宜确定。作为具体例，上述宿主为细胞时，上述细胞的培养期没有特别限制，例如可列举出24小时～2周、24～48小时，1～2周。上述细胞的培养温度例如为28～37℃。
上述第1BsAb文库例如可以是上述编码第1BsAb的核酸，也可以是导入了上述编码第1BsAb的核酸的表达载体。上述宿主例如可以援用上述本发明的BsAb文库的说明。上述宿主优选为293细胞。从能够容易地构建文库的方面考虑，上述第1BsAb优选串联scFv。
接着，在上述第1接触工序中，使上述第1BsAb与上述靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触。具体而言，上述第1BsAb的第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，在上述第1接触工序中，使上述第1BsAb与上述第2靶抗原与上述免疫细胞接触。另一方面，上述第1BsAb的第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，在上述第1接触工序中，使上述第1BsAb与上述第1靶抗原与上述免疫细胞接触。使上述第1BsAb与上述靶抗原与上述免疫细胞的接触例如可以通过在上述第1BsAb与上述靶抗原与上述免疫细胞的共存下进行培养而实施。上述培养期例如为1～96小时、1～6小时、6～96小时。上述培养温度例如为28～37℃。上述免疫细胞与上述第1BsAb的分子数之比例如优选以相对于1×106个免疫细胞达到0.1pmol以上的第1BsAb的方式进行设定。
能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞可以是表达了上述免疫细胞激活受体的免疫细胞，也可以是在规定的条件下表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞。上述规定的条件例如可以根据上述免疫细胞的种类进行适宜设定。上述免疫细胞可以根据上述免疫细胞激活受体的种类进行适宜确定。上述免疫细胞激活受体为CD3时，上述免疫细胞例如可列举出T细胞、NKT细胞等。上述免疫细胞激活受体为NK细胞的激活受体时，上述免疫细胞可列举出NK细胞、NKT细胞。上述免疫细胞激活受体为CD19、CD79α或CD79β的情况下，上述免疫细胞可列举出B细胞。上述T细胞、NK细胞、NKT细胞、及B细胞也可以分别为上述的T细胞样的培养细胞、NK细胞样的培养细胞、NKT细胞样的培养细胞、及B细胞样的培养细胞。上述免疫细胞激活受体和免疫细胞优选分别为CD3和T细胞或T细胞样的培养细胞。由此，本发明的第2筛选方法能够筛选例如对表达上述第1靶抗原或第2靶抗原的细胞诱导T细胞介导性细胞毒性的可能性高的BsAb。
上述第1BsAb例如可以是1种，也可以是多种。后者的情况下，在上述第1接触工序中，例如，作为上述第1BsAb，使用氨基酸序列不同的多种第1BsAb的混合物。
上述第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，在上述第1接触工序中所接触的第2靶抗原例如可列举出上述第2靶抗原的单体、上述第2靶抗原的复合体、上述第2靶抗原的表达细胞等，优选为上述第2靶抗原的表达细胞。上述第2靶抗原的复合体例如可列举出上述第2靶抗原的多聚体(polymer)，作为具体例，可列举出上述靶抗原的二聚体、四聚体等。上述第2靶抗原的多聚体例如可以利用如下方法制备：通过抗体使添加了标签的靶抗原交联的方法、通过亲和素使经生物素化的靶抗原复合体化的方法等，从而制备。上述第2靶抗原的表达细胞例如可列举出内源性表达上述第2靶抗原的细胞、通过导入编码上述第2靶抗原的核酸而表达了上述第2靶抗原的细胞等。表达上述第2靶抗原的细胞例如可列举出293细胞、293T细胞、K562细胞等。表达上述第2靶抗原的细胞例如可以与上述宿主相同，也可以不同。
上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，在上述第1接触工序中所接触的第1靶抗原例如可列举出上述第1靶抗原的单体、上述第1靶抗原的复合体、上述第1靶抗原的表达细胞等，优选为上述第1靶抗原的表达细胞。上述第1靶抗原的复合体例如可列举出上述第1靶抗原的多聚体(polymer)，作为具体例，可列举出上述靶抗原的二聚体、四聚体等。上述第1靶抗原的多聚体例如可以利用如下方法制备：通过抗体使添加了标签的靶抗原交联的方法、通过亲和素使经生物素化的靶抗原复合体化的方法等，从而制备。上述第1靶抗原的表达细胞例如可列举出内源性表达上述第1靶抗原的细胞、通过导入编码上述第1靶抗原的核酸而表达了上述第2靶抗原的细胞等。表达上述第1靶抗原的细胞例如可列举出293细胞、293T细胞、K562细胞等培养细胞等。表达上述第1靶抗原的细胞例如可以与上述宿主相同，也可以不同。
此外，上述第1选择工序中，选择在上述第1接触工序中与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的第2scFv作为与上述第2靶抗原结合的第1候选scFv。上述第2靶抗原与上述第1BsAb的结合例如可以直接或间接地评价，但优选间接评价，这是由于能够筛选能对表达上述第1靶抗原或第2靶抗原的细胞诱导T细胞介导性细胞毒性等的BsAb。
上述直接评价方法例如可以通过表面等离子共振(SPR)、流式细胞仪等抗体与抗原的结合检测方法而实施。作为具体例，上述直接评价方法例如可以使用经标记的第1靶抗原或第2靶抗原的单体或多聚体来实施。在此情况下，上述第1选择工序中，例如，使上述第1BsAb与上述经标记的第1靶抗原或第2靶抗原与上述免疫细胞接触。上述第1BsAb与上述第2靶抗原结合时，上述第1BsAb与上述经标记的第1靶抗原或第2靶抗原与上述免疫细胞形成复合体。因此，上述第1选择工序中，例如，存在形成了包含上述标记的复合体的免疫细胞时，可以评价为上述第1BsAb与上述第2靶抗原结合。
另外，上述间接评价方法例如可以如下进行实施。与上述第2靶抗原结合的第1BsAb例如会使上述免疫细胞的免疫细胞激活受体交联。于是，上述免疫细胞激活受体发生了交联的免疫细胞例如被由上述免疫细胞激活受体产生的信号激活。因此，上述间接评价方法例如以上述免疫细胞的激活作为指标进行评价。作为具体例，上述第1BsAb与上述第2靶抗原结合时，例如，与存在未跟上述第2靶抗原结合的第1BsAb的情况相比，发生上述免疫细胞中的激活标记的表达上调、细胞因子和/或趋化因子的产生量增加、增殖等。作为具体例，上述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞时，上述各细胞中，例如发生下述激活标记的表达上调、下述细胞因子和/或趋化因子的产生量增加、增殖等。因此，上述第1选择工序中，例如，基于任意1个以上的指标，判定上述免疫细胞被激活时，可以评价为激活上述免疫细胞的第1BsAb与上述第2靶抗原结合。对于上述细胞因子和/或趋化因子的产生量的增加，例如还可以使用当上述细胞因子和/或趋化因子的表达被诱导时mRNA或蛋白质的表达量会增加的报道基因。上述报道基因例如可列举出荧光蛋白。
·T细胞
激活标记：CD69、CD107a等
细胞因子·趋化因子：IFN-γ、IL-12、IL-2、TNFα、MIP-1β等
·NK细胞
激活标记：CD69、CD107a等
细胞因子·趋化因子：INF-γ、IL-12等
·NKT细胞
激活标记：CD69、CD107a、CD25等
细胞因子·趋化因子：INF-γ、IL-2等
·B细胞
激活标记：CD28、CD69、CD80、CD138、B220等
细胞因子·趋化因子：CXCR4等
然后，选择与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的第2scFv作为与上述第2靶抗原结合的第1候选scFv。上述第1候选scFv的选择例如可以通过选择表达与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的宿主，并通过对编码所选择的宿主中的scFv或BsAb的碱基序列进行解码而实施。上述第1选择工序中，例如，可以进一步鉴定上述第1候选scFv中的、重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3和轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。各CDR的鉴定例如可以参照基因组信息并利用公知的方法而实施。
由此，能够筛选与上述第2靶抗原结合的新的scFv。另外，上述第1BsAb文库中的第1BsAb满足上述条件1时，根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与上述第2靶抗原结合的新的轻链可变区。上述第1BsAb文库中的第1BsAb满足上述条件2时，根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与上述第2靶抗原结合的新的重链可变区。
上述第1BsAb包含多种BsAb时，上述第1接触工序和上述第1选择工序可以为1次，也可以为多次，但优选实施多次。上述多次例如为2～5次、2～4次，优选为2～3次。在此情况下，优选将上述第1接触工序和上述第1选择工序作为一组，优选实施多次上述组。上述第1接触工序和上述第1选择工序实施多次时，实施第1次的第1接触工序和第1选择工序后，由表达与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的宿主例如准备新的第1BsAb。在此情况下，新的第1BsAb所包含的BsAb的种类数优选比上1次供于第1接触工序和第1选择工序的BsAb的种类数少。上述新的第1BsAb例如在回收表达第1BsAb的宿主后进行稀释。此外，以比回收时的细胞密度更低的密度再接种上述稀释后的宿主后进行培养，回收培养上清液，由此能够制备新的第1BsAb。此外，本发明的第2筛选方法中，例如，使用新的第1BsAb，实施上述第1接触工序和上述第1选择工序。此外，同样地重复实施接触和选择直至达到期望的次数为止，例如，对表达与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的宿主进行单克隆化。由此，本发明的第2筛选方法例如能够更可靠地鉴定与上述第2靶抗原结合的第1BsAb。
本发明的第2筛选方法例如也可以将上述第1候选scFv的新的重链可变区或轻链可变区分别作为上述第1BsAb文库的第2scFv中的与第2靶抗原结合的抗原等中的重链可变区或轻链可变区来实施另一区域的筛选。在此情况下，本发明的第2筛选方法例如进一步包括基于上述第1候选scFv来制备第2BsAb文库的制备工序。
上述第2CAR文库例如包含编码第2BsAb的核酸。另外，上述第2BsAb例如包含第3抗原结合结构域和第4抗原结合结构域。上述第3抗原结合结构域例如包含与上述第1靶抗原结合的第3scFv。另外，上述第4抗原结合结构域例如包含能筛选与上述第2靶抗原的结合的第4scFv。
上述编码第2BsAb的核酸例如是指编码第2BsAb的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)。
本发明的第2筛选方法中，上述第2BsAb例如可以具有与上述第1BsAb相同的结构，也可以具有不同的结构。从能够容易地构建文库的方面考虑，上述第2BsAb优选为串联scFv。
上述第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，第2BsAb中的上述第1靶抗原可以与上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”的第1BsAb中的上述第1靶抗原相同，也可以不同。后者的情况下，上述第2BsAb的第1靶抗原例如是与上述第1BsAb的第1靶抗原不同的亚单元或复合体。
上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，上述第2BsAb中的上述第1靶抗原与上述本发明的BsAb文库的“(2)第2靶抗原：免疫细胞激活受体”的第1BsAb中的上述第1靶抗原相同，可以援用其说明。
上述第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，上述第2BsAb中的上述第2靶抗原与上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”的第1BsAb中的上述第2靶抗原相同，可以援用其说明。
上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，上述第2BsAb中的上述第2靶抗原可以与上述本发明的BsAb文库的“(2)第2靶抗原：免疫细胞激活受体”的第1BsAb中的上述第2靶抗原相同，也可以不同。后者的情况下，上述第2BsAb的第2靶抗原例如是与上述第1BsAb的第1靶抗原不同的亚单元或复合体。
上述第3scFv例如可以在上述本发明的BsAb文库中的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”的第1scFv的说明中将“第1scFv”替换为“第3scFv”、将“第1重链可变区”替换为“第3重链可变区”、将“第1轻链可变区”替换为“第3轻链可变区”并援用其说明。上述第2BsAb中的第3scFv可以与上述第1BsAb中的第1scFv相同，也可以不同。
上述第3scFv中，上述第3重链可变区和上述第3轻链可变区例如通过第3连接肽(第3Fv连接肽)而连接。上述第3Fv连接肽例如优选不阻碍上述第3scFv与上述第2靶抗原的结合。上述第3Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述第3Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述第3Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。
上述第2BsAb中，第4scFv包含第4重链可变区和第4轻链可变区。上述第4重链可变区和上述第4轻链可变区具有与抗体分子中的重链可变区和轻链可变区同样的结构，对于其结构，例如可以援用上述第1scFv的说明。
上述第4重链可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第4轻链可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第4重链可变区和上述第4轻链可变区满足下述条件3或条件4。
条件3：
上述第1准备工序中的BsAb文库满足上述条件1时，
上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含上述第1候选BsAb中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件4：
上述第1准备工序中的BsAb文库满足上述条件2时，
上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含上述第1候选BsAb中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
上述条件3例如是使用利用满足上述条件1的第1BsAb文库所筛选的第1候选scFv来制备第2BsAb文库的情况。上述条件3中，例如，上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3使用上述第1候选scFv对于上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3筛选与上述第2靶抗原的结合。
上述第4重链可变区中的第2B细胞受体例如可以在上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”的条件2的第2重链可变区的说明中将“第1B细胞受体”替换为“第2B细胞受体”、将“第2重链可变区”替换为“第4重链可变区”并援用其说明。
上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第2B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第4重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第2B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第2B细胞受体”与上述各FRH的说明中的“第2B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第4重链可变区例如可以包含上述第2B细胞受体中的重链可变区。在此情况下，上述第4重链可变区例如可以是由上述第2B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第1候选scFv的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第4轻链可变区中，FR例如可以包含上述第1候选scFv中的轻链可变区的FR。上述第4轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第1候选scFv的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第1候选scFv”与上述各FRL的说明中的“第1候选scFv”优选为相同的scFv。
上述第4轻链可变区例如可以包含上述第1候选scFv中的轻链可变区。在此情况下，上述第4轻链可变区例如可以是由上述第1候选scFv中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
接着，上述条件4例如是使用利用满足上述条件2的第1BsAb文库所筛选的第1候选scFv来制备第2BsAb文库的情况。上述条件4中，例如，上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3使用上述第1候选scFv对于上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3筛选与上述第2靶抗原的结合。
上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3例如可以是分别由上述第1候选scFv的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的CDRH1、CDRH2和CDRH3的氨基酸序列的多肽。
上述第4重链可变区中的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4例如可以是分别由上述第1候选scFv的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRH的说明中的“第1候选scFv”与上述各FRH的说明中的“第1候选scFv”优选为相同的scFv。
上述第4重链可变区例如可以包含上述第1候选scFv中的重链可变区。在此情况下，上述第4重链可变区例如可以是由上述第1候选scFv中的重链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第1候选scFv中的重链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第4轻链可变区中的第2B细胞受体例如可以在上述本发明的BsAb文库的“(1)第1靶抗原：免疫细胞激活受体”的条件1的第2轻链可变区的说明中将“第1B细胞受体”替换为“第2B细胞受体”、将“第2轻链可变区”替换为“第4轻链可变区”并援用其说明。
上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3例如可以是分别由上述第2B细胞受体的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的CDRH1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的多肽。
上述第4轻链可变区中的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4例如可以是分别由上述第2B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4的氨基酸序列的多肽。上述各CDRL的说明中的“第2B细胞受体”与上述各FRL的说明中的“第2B细胞受体”优选为相同的B细胞受体。
上述第4轻链可变区例如可以包含上述第2B细胞受体中的轻链可变区。在此情况下，上述第2轻链可变区例如可以是由上述第2B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列组成的多肽，也可以是包含上述第2B细胞受体中的轻链可变区的氨基酸序列的多肽。
上述第4scFv中，上述第4重链可变区和上述第4轻链可变区例如通过第4连接肽(第4Fv连接肽)而连接。上述第4Fv连接肽例如优选不阻碍上述第4scFv与上述免疫细胞激活受体的结合。上述第4Fv连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述第4Fv连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。上述第4Fv连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。上述第4scFv中的第4Fv连接肽例如可以与上述第1scFv中的第1Fv连接肽相同，也可以不同。
上述第3scFv和上述第4scFv例如可以直接或间接地连接，使上述第3scFv和上述第4scFv共存时，两者可以形成为缔合(结合)。上述第3scFv和上述第4scFv的连接例如可以根据上述第2BsAb的种类进行适宜设计。作为具体例，上述第2BsAb为串联scFv的情况下，上述第3scFv和上述第4scFv通过连接肽(Fv间连接肽)而连接。上述Fv间连接肽例如由1～40个、1～18个、1～15个、1～7个、1～3个、1个或2个氨基酸构成。上述Fv间连接肽例如由甘氨酸和丝氨酸等氨基酸构成，作为具体例，可列举出(GGGGS)n。上述n例如为1～6的整数。作为具体例，上述Fv间连接肽的氨基酸序列例如可列举出由上述序列号1或2的氨基酸序列组成的多肽。上述缔合例如可以利用氨基酸侧链的电荷。作为具体例，上述缔合例如可以通过在一者的结合结构域上添加具有正电荷的氨基酸的结构域、在另一者的结合结构域上添加具有负电荷的氨基酸的结构域而诱导。另外，上述缔合例如也可以利用标签序列和识别标签序列的多肽的组合等。
上述第2BsAb中，上述第3scFv和上述第4scFv的配置顺序例如从N末端侧起可以依次配置上述第3scFv和上述第4scFv，从N末端侧起可以依次配置上述第4scFv和上述第3scFv。
上述第2BsAb例如可列举出由下述式(5)(序列号160)所示的氨基酸序列组成的多肽。下述式(5)中，V5、V6、V7和V8例如可列举出下述(V9)～(V16)的组合。上述第4scFv满足上述条件3时，V5、V6、V7和V8优选满足下述(V13)或(V14)。上述第4scFv满足上述条件4时，V5、V6、V7和V8优选满足下述(V15)或(V16)。下述式(5)中，V5与V6之间的氨基酸序列为第1Fv连接肽的氨基酸序列，V6与V7之间的氨基酸序列为Fv间连接肽的氨基酸序列，V7与V8之间的氨基酸序列为第2Fv连接肽的氨基酸序列。下述式(4)中，第1Fv连接肽和第2Fv连接肽为Fv连接肽1，但也可以各自独立地为Fv连接肽2。
[V5]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V6]-[SGSG]-[V7]-[GSTSGSGKPGSGEGSTKG]-[V8]…(5)
(V9)V5：VH3、V6：VL3、V7：VH4、V8：VL4
(V10)V5：VL3、V6：VH3、V7：VH4、V8：VL4
(V11)V5：VH3、V6：VL3、V7：VL4、V8：VH4
(V12)V5：VL3、V6：VH3、V7：VL4、V8：VH4
(V13)V5：VH4、V6：VL4、V7：VH3、V8：VL3
(V14)V5：VH4、V6：VL4、V7：VL3、V8：VH3
(V15)V5：VL4、V6：VH4、V7：VH3、V8：VL3
(V16)V5：VL4、V6：VH4、V7：VL3、V8：VH3
VH3：第3重链可变区
VL3：第3轻链可变区
VH4：第4重链可变区
VL4：第4轻链可变区
上述编码第2BsAb的核酸例如可列举出由下述式(6)(序列号161)所示的碱基序列组成的多核苷酸。下述式(6)中，N5、N6、N7和N8例如可列举出下述(N9)～(N16)的组合。下述(N9)～(N16)分别为编码上述(V9)～(V16)的组合的第2BsAb的核酸。下述式(6)中，N5与N6之间的碱基序列为编码第1Fv连接肽的碱基序列，N6与N7之间的碱基序列为编码Fv间连接肽的碱基序列，N7与N8之间的碱基序列为编码第2Fv连接肽的碱基序列。下述式(6)中，编码第1Fv连接肽和第2Fv连接肽的碱基序列为编码Fv连接肽1的碱基序列，但也可以各自独立地为编码Fv连接肽2的碱基序列。
5’-[N5]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N6]-[AGCGGATCTGGC]-[N7]-[GGCTCTACAAGCGGCTCTGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGAAGCACCAAGGGC]-[N8]-3’…(6)
(N9)N5：NH3、N6：NL3、N7：NH4、N8：NL4
(N10)N5：NL3、N6：NH3、N7：NH4、N8：NL4
(N11)N5：NH3、N6：NL3、N7：NL4、N8：NH4
(N12)N5：NL3、N6：NH3、N7：NL4、N8：NH4
(N13)N5：NH4、N6：NL4、N7：NH3、N8：NL3
(N14)N5：NH4、N6：NL4、N7：NL3、N8：NH3
(N15)N5：NL4、N6：NH4、N7：NH3、N8：NL3
(N16)N5：NL4、N6：NH4、N7：NL3、N8：NH3
NH3：编码第3重链可变区的碱基序列
NL3：编码第3轻链可变区的碱基序列
NH4：编码第4重链可变区的碱基序列
NL4：编码第4轻链可变区的碱基序列
上述第2BsAb文库例如优选包含多种核酸。在此情况下，上述第2BsAb文库例如为多种核酸的混合物。上述多种核酸例如优选其一部分或全部编码不同的第2BsAb，优选编码不同的第4抗原结合结构域。多种核酸编码不同的第4抗原结合结构域时，上述第2BsAb中的除第4抗原结合结构域以外的区域例如为相同的或不同的氨基酸序列。上述第2BsAb文库中包含的上述核酸的种类例如为1×105～1×106种、1×106～5×106种，优选为约1×106种(例如，8×105～2×106种)。
上述第2BsAb例如可以在N末端具有信号肽。上述第2BsAb例如可以具有标签。上述信号肽和标签例如可以上述第1BsAb中的信号肽和标签的说明中将“第1BsAb”替换为“第2BsAb”并援用其说明。
本发明中，上述编码第2BsAb的核酸例如可以基于上述第2BsAb的氨基酸序列并利用常规方法制备。作为具体例，上述编码第2BsAb的核酸例如可以通过如下方式制备：在注册了上述的各结构域的氨基酸序列的数据库中，获得编码上述氨基酸序列的碱基序列，基于上述碱基序列，利用分子生物学方法和/或化学合成方法进行制备。上述核酸的碱基序列例如可以根据表达上述第2BsAb文库的细胞的来源进行密码子最优化。
上述编码第2BsAb的核酸例如可以导入表达载体中。上述表达载体例如可以援用上述本发明的BsAb文库中的表达载体的说明。
接着，本发明的第2筛选方法中，例如可以代替上述第1BsAb文库使用上述制备工序中制备的第2BsAb文库，除此以外同样地实施准备工序、接触工序、及选择工序。具体而言，本发明的第2筛选方法例如进一步包括如下工序：第2准备工序，由上述第2BsAb文库准备第2BsAb；第2接触工序，使上述第2BsAb与上述靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触；及第2选择工序，选择在上述第2接触工序中与上述第2靶抗原结合的第2BsAb的第4scFv作为与上述第2靶抗原结合的第2候选scFv。另外，上述第2BsAb的第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，上述第2接触工序中，例如，使上述第2BsAb与上述第2靶抗原与上述免疫细胞接触。另一方面，上述第2BsAb的第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，上述第2接触工序中，例如，使上述第2BsAb与上述第1靶抗原与上述免疫细胞接触。
上述第2准备工序例如可以在上述第1准备工序的说明中将“第1准备工序”替换为“第2准备工序”、将“第1BsAb文库”替换为“第2BsAb文库”、将“第1BsAb”替换为“第2BsAb”并援用其说明。
上述第2接触工序例如可以上述第1接触工序的说明中将“第1准备工序”替换为“第2准备工序”、将“第1接触工序”替换为“第2接触工序”并援用其说明。
上述第2选择工序例如可以上述第1选择工序的说明中将“第1接触工序”替换为“第2接触工序”、将“第1选择工序”替换为“第2选择工序”、将“第2scFv”替换为“第4scFv”、将“第1候选scFv”替换为“第2候选scFv”、将“第1BsAb”替换为“第2BsAb”并援用其说明。
由此，本发明的第2筛选方法例如能够筛选与上述第2靶抗原结合的具有新的重链可变区和轻链可变区的scFv。
<第3scFv的制造方法>
如前所述，本发明的scFv的制造方法包括如下工序：
第1给予工序，向动物给予第1嵌合抗原受体(CAR)文库的表达细胞；及
第1收集工序，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第1CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，
上述第1CAR文库包含编码第1CAR的核酸，
上述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，
上述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)，
上述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，
上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足下述条件1或条件2。
(条件1)
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(条件2)
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本发明的第3scFv的制造方法的特征在于包括如下工序：第1给予工序，向动物给予第1CAR文库表达细胞；及第1收集工序，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第1CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，其它工序和条件没有特别限制。本发明的第3scFv的制造方法可以援用上述本发明的CAR文库、第1筛选方法、及CAR文库细胞的说明。
CAR文库表达细胞中，表达具有与上述靶抗原结合的scFv的CAR的细胞在上述动物内中被上述靶抗原依赖性激活。然后，被激活的CAR文库表达细胞在上述动物中移动至表达上述靶抗原的位点并积累。因此，本发明的制造方法中，通过收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第1CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，从而能够制造在CAR-T细胞中能发挥作用、进而例如还能参与局部浸润的scFv。另外，由于上述细胞被上述靶抗原依赖性激活，因此可以说上述表达有靶抗原的组织中积累的CAR文库表达细胞中的scFv识别上述靶抗原的可能性高。因此可以说，本发明的制造方法例如能够制造与上述靶抗原结合、且能激活T细胞等免疫细胞的scFv。
进而，本发明的制造方法中使用的第1CAR文库中，上述第1CAR是包含上述第1抗原结合结构域、上述第1跨膜结构域、及上述第1细胞内信号转导结构域的蛋白质。上述第1CAR例如具有类似于包含与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的CAR的结构，与上述抗原结合的胞外结构域被变更为筛选与上述靶抗原的结合的第1抗原结合结构域。因此，根据本发明的制造方法，能够筛选与上述靶抗原结合且能激活T细胞等免疫细胞的新的scFv。
本发明的第3scFv的制造方法中，上述第1CAR文库表达细胞(以下也称为“第1表达细胞”)例如可以通过将包含编码上述第1CAR的核酸的第1CAR文库导入细胞中而制备。因此，本发明的第3scFv的制造方法可以包括在上述第1给予工序之前准备上述第1CAR文库的第1准备工序。另外，本发明的第3scFv的制造方法还可以包括：在上述第1给予工序之前将上述第1CAR文库导入细胞中来制备上述第1CAR文库表达细胞的第1制备工序。
上述第1准备工序中，准备上述第1CAR文库。如前所述，上述第1CAR文库包含编码第1CAR的核酸。上述编码第1CAR的核酸例如是指编码第1CAR的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)。上述第1CAR文库与上述本发明的CAR文库中的第1CAR文库同样，可以援用其说明。
上述第1scFv中，上述靶抗原例如可以援用上述本发明的CAR文库中的说明。
上述第1制备工序中，将上述第1CAR文库导入细胞中，制备上述第1CAR文库表达细胞。具体而言，上述第1制备工序中，例如，将上述第1CAR文库导入上述细胞中。然后，上述第1制备工序中，例如，通过培养导入了上述第1CAR文库的细胞，从而使上述细胞表达上述第1CAR文库。上述第1CAR文库的导入方法没有特别限制，例如可以利用公知的将核酸导入细胞中的方法。作为具体例，上述第1CAR文库的导入方法例如可列举出使用脂质体、阳离子脂质体等核酸导入试剂的方法；使用逆转录病毒、慢病毒等病毒的方法等。上述细胞的培养期没有特别限制，例如可列举出6小时～30天、6～96小时，1～30天。上述细胞的培养温度例如为28～37℃。
上述第1CAR文库例如可以是编码上述第1CAR的核酸，也可以是导入了上述编码第1CAR的核酸的表达载体。
上述细胞没有特别限制，例如可列举出CHO细胞、Jurkat细胞、Jurkat76细胞等源自哺乳类的培养细胞、免疫细胞等。上述免疫细胞没有特别限制，例如可列举出T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞等。上述免疫细胞例如可列举出从生物体中分离出的免疫细胞、由多能干细胞等干细胞诱导的免疫细胞或源自免疫细胞的培养细胞。上述分离的免疫细胞例如可以是免疫细胞样的培养细胞，作为具体例，可列举出T细胞样的培养细胞、NK细胞样的培养细胞、NKT细胞样的培养细胞、B细胞样的培养细胞等。上述免疫细胞例如是从生物体中分离出的免疫细胞，作为具体例可列举出人外周血来源的免疫细胞。上述T细胞样的培养细胞例如可列举出Jurkat细胞、Jurkat76细胞等。例如，从能够筛选在CAR-T细胞中发挥作用的可能性更高的scFv的方面考虑，上述细胞优选T细胞或T细胞样的培养细胞。
接着，上述第1给予工序中，向动物给予上述第1CAR文库表达细胞。上述第1给予工序中，优选给予多种第1CAR文库表达细胞。在此情况下，上述第1CAR文库表达细胞例如为多种表达细胞的混合物。上述多种表达细胞例如优选其一部分或全部编码不同的第1CAR，优选编码不同的第1抗原结合结构域。多种表达细胞编码不同的第1抗原结合结构域时，上述第1CAR中的除第1抗原结合结构域以外的区域例如为相同的或不同的氨基酸序列。上述第1CAR文库表达细胞的种类例如也可以称为上述第1CAR文库表达细胞中包含的上述第1CAR的种类。上述第1CAR文库表达细胞中包含的上述第1CAR的种类例如为1×105～1×107种、1×105～1×106种、1×106～5×106种，优选为约2×106种(例如，1×106～3×106种)。上述第1CAR的种类例如为相当于1×106个细胞的种类。上述第1CAR的种类例如也可以称为编码第1CAR的核酸的不均一性(heterogeneity)。如前所述，上述不均一性例如可以利用限制性内切酶作图、对各CDR和/或各FRH利用桑格测序法等测序等进行测定。
上述第1表达细胞的给药条件没有特别限制，例如可以根据上述靶抗原的种类和量、以及上述动物中的靶抗原的表达位置对给药方式、给药方法、给药时期、给药量等进行适宜设定。
上述动物(给药对象)例如可列举出人、除人以外的非人动物。上述非人动物例如可列举出小鼠、大鼠、狗、猴子、兔子、绵羊、马、猪等哺乳类等。
上述动物优选为免疫抑制动物。上述动物为小鼠时，上述免疫抑制小鼠可列举出裸鼠、重症综合性免疫缺陷(SCID：Severe combined immunodeficiency)小鼠、NOG(NOD/Shi-scid,IL-2RγKO)小鼠等。
上述给药方法没有特别限制，例如可以根据给药对象进行适宜确定。上述给药方法例如可列举出非经口给药、经口给药等。上述非经口给药例如可列举出局部给药、皮下给药、皮内给药、肌肉给药、腹腔内给药、静脉内给药、淋巴管内给药、肿瘤内给药等。上述给药方法优选为静脉内给药或淋巴管内给药。
上述第1表达细胞的给药条件没有特别限制。对于上述给药方法为静脉内给药的情况下上述第1表达细胞的给药条件，例如针对小鼠每1次的给药量(总计)例如为1×106～3×1010细胞，优选为1×106～1×108个细胞、1×106～1×107个细胞或为约5×106个细胞。上述第1表达细胞的给药次数例如每1～4周1次。
上述动物例如可以内源性表达上述靶抗原，也可以外源性表达。后者的情况下，上述动物例如可以通过导入编码上述靶抗原的核酸或表达载体而表达，也可以通过导入表达上述靶抗原的细胞而表达。
导入表达上述靶抗原的细胞时，本发明的第3scFv的制造方法可以包括第1形成工序：在上述第1给予工序之前将表达靶抗原的细胞导入上述动物中，形成表达上述靶抗原的组织。上述导入的细胞例如可以是表达靶抗原的细胞，也可以是在分化后或特定的条件下表达靶抗原的细胞。在上述特定的条件下表达靶抗原的细胞例如可列举出通过多西环素等诱导物质处理诱导靶抗原的表达的细胞等。由所导入的细胞形成的组织的种类没有特别限制，可以根据上述靶抗原进行适宜设定。上述组织可以是1种，也可以是2种以上。后者的情况下，也可以由所导入的细胞形成脏器。作为具体例，上述靶抗原为肿瘤抗原时，上述第1形成工序中，使表达上述靶抗原的肿瘤细胞在上述动物体内形成表达上述靶抗原的肿瘤组织。本发明中，上述“组织”例如是指细胞的集合体。上述集合体内的细胞的种类可以是1种，也可以是2种以上。
本发明的第3scFv的制造方法例如包括如下第1刺激工序：在上述第1给予工序后，向上述动物给予上述靶抗原。本发明的第3scFv的制造方法由于包括上述第1刺激工序，因此在上述第1表达细胞中，能够启动表达靶抗原特异性的CAR的细胞，由此，能够更有效地使表达靶抗原特异性的CAR的细胞积累于表达上述靶抗原的组织中。例如在上述第1给予工序后，在后述的第1收集工序中实施上述第1刺激工序。
上述第1刺激工序例如可以利用与使用了上述靶抗原的动物免疫同样的方法实施。具体而言，上述第1刺激工序中，可以通过向上述动物给予上述靶抗原、编码上述靶抗原的核酸分子、或表达上述靶抗原的细胞而实施。上述靶抗原的给予中，例如可以组合使用免疫活化剂(佐剂)。
接着，上述第1收集工序中，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第1CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。上述第1收集工序中，可以回收组织中积累的上述第1表达细胞，也可以收集积累了上述第1表达细胞的组织，从上述组织中回收上述第1表达细胞。如前所述，上述组织可以是1种，也可以是2种以上。后者的情况下，上述第1收集工序中，优选回收2种以上的组织中积累的上述第1表达细胞。在此情况下，上述第1收集工序中，也可以收集积累了上述第1表达细胞的2种以上的组织，从上述2种以上的组织中回收上述第1表达细胞。上述第1收集工序中，收集上述组织时，收集上述组织的一部分或全部。上述第1收集工序中，在收集上述第1表达细胞之前，也可以确认上述组织中是否积累了上述第1表达细胞。上述确认例如可以使用双光子激发显微镜等能实时成像的显微镜来实施。另外，实施上述确认时，上述第1表达细胞优选表达SLR等荧光素酶。另外，实施上述确认时，上述第1表达细胞例如可以在上述确认之前通过荧光蛋白等标记物进行标记。
上述第1收集工序可以在上述第1给予工序后的任意期间后而实施。在上述第1给予工序后到上述第1收集工序为止的期间例如可列举出8小时～1个月、1天～2周、1天～1周。在上述第1刺激工序后实施上述第1收集工序时，在上述第1给予工序后到上述第1收集工序为止的期间例如是直至表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞被激活和积累的时间，作为具体例，可列举出1天～2周、1天～1周。
本发明的第3scFv的制造方法优选包括如下第1再刺激工序：在上述第1收集工序后，用上述靶抗原再刺激表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。由此，上述第1再刺激工序中，能在表达上述靶抗原的组织中积累的第1CAR文库表达细胞中使表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞增殖。因此，本发明的第3scFv的制造方法由于包括上述第1再刺激工序，因此例如能够富集表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，能够容易地确定表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞中的第1重链可变区和第1轻链可变区的氨基酸序列和编码其的碱基序列。
上述第1再刺激工序中，利用上述靶抗原的再刺激方法没有特别限制，例如可以通过使从上述组织中收集的第1CAR文库表达细胞与上述靶抗原共存而实施。例如在上述共存下，上述靶抗原可以以单体的形式存在，也可以以二聚体、三聚体等多聚体的形式存在，以可以以细胞的形式存在。上述靶抗原以细胞的形式存在时，上述细胞为表达上述靶抗原的细胞。
本发明的第3scFv的制造方法例如可以包括如下第1测序工序：对上述第1收集工序中收集的第1表达细胞中的第1重链可变区和第1轻链可变区的氨基酸序列进行确定。上述第1重链可变区和第1轻链可变区的氨基酸序列例如通过对编码上述第1重链可变区和第1轻链可变区的氨基酸序列的碱基序列进行确定而实施。具体而言，上述第1测序工序中，从上述第1收集工序中收集的第1表达细胞中提取核酸，扩增上述核酸中的编码上述第1重链可变区和第1轻链可变区的碱基序列，对上述碱基序列进行确定，由此能够实施。由此，本发明的第3scFv的制造方法例如可以对上述第1B细胞受体来源的第1重链可变区或第1轻链可变区的氨基酸序列进行确定。
上述第1测序工序中，例如可以进一步鉴定上述第1重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、及上述第1轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。各CDR的鉴定例如可以参照基因组信息(例如，IMGT的主页<http://www.imgt.org/>)并利用公知的方法而实施。
本发明的第3scFv的制造方法中，例如可以将上述第1收集工序中收集的第1表达细胞中的第1B细胞受体来源的第1重链可变区或第1轻链可变区分别作为上述第1CAR文库中的与靶抗原结合的抗原等中的重链可变区或轻链可变区来实施另一区域的筛选。即，本发明的第3scFv的制造方法也可以使用利用第1CAR文库所筛选的第1scFv(上述第1收集工序中收集的第1表达细胞中的第1scFv)中新鉴定出的第1重链可变区或第1轻链可变区，来实施另一区域的筛选。在此情况下，本发明的第3scFv的制造方法例如进一步包括如下工序：可以基于上述第1收集工序中收集的第1表达细胞中的第1B细胞受体来源的第1重链可变区或第1轻链可变区，制备第2CAR文库表达细胞，实施与上述第1给予工序和第1收集工序同样的工序。在此情况下，本发明的第3scFv的制造方法例如包括如下工序：第2给予工序，向动物给予第2CAR文库的表达细胞；及第2收集工序，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第2CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。
上述第2CAR文库例如包含编码第2CAR的核酸。另外，上述第2CAR例如包含第2抗原结合结构域、第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域。另外，上述第2抗原结合结构域例如包含能筛选与上述靶抗原的结合的第2scFv。
上述编码第2CAR的核酸例如是指编码第2CAR的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)。
上述第2scFv中，上述靶抗原与上述第1scFv中的靶抗原相同。上述第2scFv例如具有与上述第1scFv相似的结构。
上述第2scFv例如包含第2重链可变区和第2轻链可变区。上述第2重链可变区例如具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第2轻链可变区例如具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区例如满足下述条件3或条件4。
(条件3)
上述第1CAR文库满足上述条件1时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞的scFv中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
(条件4)
上述第1CAR文库满足上述条件2时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞的scFv中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本发明的第3scFv的制造方法中，上述第2CAR文库的表达细胞(以下也称为“第2表达细胞”)例如可以通过将包含编码上述第2CAR的核酸的第2CAR文库导入细胞中而制备。因此，本发明的第3scFv的制造方法可以包括在上述第2给予工序之前准备上述第2CAR文库的第2准备工序。另外，本发明的第3scFv的制造方法可以包括在上述第2给予工序之前将上述第2CAR文库导入细胞中来制备上述第2CAR文库表达细胞的第2制备工序。
上述第2准备工序准备上述第2CAR文库。如前所述，上述第2CAR文库包含编码第2CAR的核酸。上述编码第2CAR的核酸例如是指编码第2CAR的氨基酸序列的核酸(多核苷酸)。上述第2CAR文库与上述本发明的CAR文库中的第2CAR文库同样，可以援用其说明。
如前所述，上述第2重链可变区具有CDRH1、CDRH2和CDRH3。上述第2轻链可变区具有CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足上述条件3或条件4。
上述条件3例如是使用利用满足上述条件1的第1CAR文库所筛选的第1轻链可变区来制备第2CAR文库的情况。上述条件3中，例如，对于上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3，使用上述利用第1CAR文库所筛选的第1轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3，对上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3进行与上述靶抗原的结合的筛选。
接着，上述条件4例如是使用利用满足上述条件2的第1CAR文库所筛选的重链可变区来制备第2CAR文库的情况。上述条件4中，例如，上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3使用上述利用第1CAR文库所筛选的重链可变区对于上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3筛选与上述靶抗原的结合。
接着，上述第2制备工序中，将上述第2CAR文库导入细胞中制备上述第2CAR文库的表达细胞。具体而言，上述第2制备工序中，例如，将上述第2CAR文库导入上述细胞中。此外，上述第2制备工序中，例如，通过培养导入了上述第2CAR文库的细胞，从而使上述细胞表达上述第2CAR文库。上述第2CAR文库的导入方法例如可以援用上述第1CAR文库的导入方法的说明。
上述第2CAR文库例如可以是编码上述第2CAR的核酸，也可以是导入了编码上述第2CAR的核酸的表达载体。
上述细胞没有特别限制，例如可以援用上述第1CAR文库中的导入对象的细胞的说明。
接着，上述第2给予工序中，向动物给予上述第2CAR文库的表达细胞。上述第2给予工序中，优选给予多种第2CAR文库表达细胞。在此情况下，上述第2CAR文库的表达细胞例如为多种表达细胞的混合物。上述多种表达细胞例如优选其一部分或全部编码不同的第2CAR，优选编码不同的第2抗原结合结构域。多种表达细胞编码不同的第2抗原结合结构域时，上述第2CAR中的除第2抗原结合结构域以外的区域例如为相同的或不同的氨基酸序列。上述第2CAR文库的表达细胞的种类例如也可以称为上述第2CAR文库的表达细胞中包含的上述第2CAR的种类。上述第2CAR文库的表达细胞中包含的上述第2CAR的种类例如为1×105～1×107种、1×105～1×106种、1×106～5×106种，优选为约2×106种(例如，1×106～3×106种)。上述第2CAR的种类例如也可以称为编码第2CAR的核酸的不均一性(heterogeneity)。如前所述，上述不均一性例如可以利用限制性内切酶作图、对各CDR和/或各FRH利用桑格测序法等测序等进行测定。
上述第2表达细胞的给予条件没有特别限制，例如可以援用上述第2表达细胞的给予条件的说明。
上述第2给予工序中，上述动物例如可以内源性表达上述靶抗原，也可以外源性表达。后者的情况下，上述动物例如可以通过导入上述编码靶抗原的核酸或表达载体而表达，也可以通过导入上述表达靶抗原的细胞而表达。
导入上述表达靶抗原的细胞时，本发明的第3scFv的制造方法可以包括如下第2形成工序：在上述第2给予工序之前，将表达靶抗原的细胞导入上述动物中，形成表达上述靶抗原的组织。上述导入的细胞例如可以是表达靶抗原的细胞，也可以是在分化后或特定的条件下表达靶抗原的细胞。在上述特定的条件下表达靶抗原的细胞例如可列举出通过多西环素等诱导物质处理诱导靶抗原的表达的细胞等。由所导入的细胞形成的组织的种类没有特别限制，可以根据上述靶抗原进行适宜设定。上述组织可以是1种，也可以是2种以上。后者的情况下，也可以由所导入的细胞形成脏器。作为具体例，上述靶抗原为肿瘤抗原时，上述第2形成工序中，使表达上述靶抗原的肿瘤细胞在上述动物体内形成表达上述靶抗原的肿瘤组织。
本发明的第3scFv的制造方法例如包括如下第2刺激工序：在上述第2给予工序后向上述动物给予上述靶抗原。本发明的第3scFv的制造方法由于包括上述第2刺激工序，因此在上述第2表达细胞中能够启动表达靶抗原特异性的CAR的细胞，由此，能够更有效地使表达靶抗原特异性的CAR的细胞积累于表达上述靶抗原的组织中。例如在上述第2给予工序后在后述的第2收集工序中实施上述第2刺激工序。
上述第2刺激工序例如可以利用与使用了上述靶抗原的动物免疫同样的方法实施。具体而言，上述第2刺激工序中，可以通过向上述动物给予上述靶抗原、编码上述靶抗原的核酸分子、或表达上述靶抗原的细胞而实施。上述靶抗原的给予中例如可以组合使用免疫活化剂(佐剂)。
接着，上述第2收集工序中，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第2CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。上述第2收集工序中，可以回收组织中积累的上述第2表达细胞，也可以收集积累了上述第2表达细胞的组织，从上述组织中回收上述第2表达细胞。如前所述，上述组织可以是1种，也可以是2种以上。后者的情况下，上述第2收集工序中，优选回收2种以上的组织中积累的上述第2表达细胞。在此情况下，上述第2收集工序中，也可以收集积累了上述第2表达细胞的2种以上的组织，从上述2种以上的组织中回收上述第2表达细胞。上述第2收集工序中，收集上述组织时，收集上述组织的一部分或全部。上述第2收集工序中，也可以在收集上述第2表达细胞之前确认在上述组织是否积累了上述第2表达细胞。上述确认例如可以使用双光子激发显微镜等能实时成像的显微镜而实施。另外，实施上述确认时，上述第1表达细胞优选表达SLR等荧光素酶。另外，实施上述确认时，上述第1表达细胞例如可以在上述确认之前通过荧光蛋白等标记物进行标记。
上述第2收集工序可以在上述第2给予工序后的任意期间后实施。上述第2给予工序后到上述第2收集工序为止的期间例如可列举出8小时～1个月、1天～2周、1天～1周。上述第2刺激工序后，实施上述第2收集工序时，上述第2给予工序后到上述第2收集工序为止的期间例如是直至表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞被激活和积累的时间，作为具体例，可列举出1天～2周、1天～1周。
本发明的第3scFv的制造方法优选包括如下第2再刺激工序：在上述第2收集工序后，用上述靶抗原再刺激表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。由此，上述第2再刺激工序中，能在表达上述靶抗原的组织中积累的第2CAR文库表达细胞中使表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞增殖。因此，本发明的第3scFv的制造方法由于包括上述第2再刺激工序，因此例如能够富集表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，能够容易地确定表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞中的第2重链可变区和第2轻链可变区的氨基酸序列和编码其的碱基序列。
上述第2再刺激工序中，基于上述靶抗原的再刺激方法没有特别限制，例如可以在上述第1再刺激工序的说明中将“第1CAR文库”替换为“第2CAR文库”并援用其说明。
本发明的第3scFv的制造方法例如可以包括如下第2测序工序：对上述第2收集工序中收集的第2表达细胞中的第2重链可变区和第2轻链可变区的氨基酸序列进行确定。上述第2重链可变区和第2轻链可变区的氨基酸序列例如可以通过对编码上述第2重链可变区和第2轻链可变区的氨基酸序列的碱基序列进行确定而实施。具体而言，上述第2测序工序中，从上述第2收集工序中收集的第2表达细胞提取核酸，扩增上述核酸中的编码上述第2重链可变区和第2轻链可变区的碱基序列，对上述碱基序列进行确定，由此能够实施。由此，本发明的第3scFv的制造方法例如能够确定上述第2B细胞受体来源的第2重链可变区或第2轻链可变区的氨基酸序列。
上述第2测序工序中，例如，可以进一步鉴定上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3、及上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。各CDR的鉴定例如可以参照基因组信息(例如，IMGT的主页<http://www.imgt.org/>)并利用公知的方法而实施。
实施例
接着，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不受下述实施例限制。只要没有特别声明，则市售的试剂基于它们的说明来使用。
[实施例1]
确认了：通过使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法，能够筛选与A2/NY-ESO-1157结合的scFv。
(1)3M4E5CAR的制备
使用A2/NY-ESO-1157特异性抗体(克隆：3M4E5)制备了3M4E5CAR。具体而言，通过用编码Fv连接肽(GSTSGSGKPGSGEGSTKG：序列号1)的核酸(序列号3)连接编码源自3M4E5的免疫球蛋白重链的重链可变区的核酸(序列号162)和编码源自3M4E5的免疫球蛋白轻链的轻链可变区的核酸(序列号163)，从而制备了编码3M4E5scFv的核酸。将依次连接了3M4E5的重链可变区、Fv连接肽、及3M4E5的轻链可变区而成的scFv称为3M4E5HL scFv。另外，将依次连接了3M4E5的轻链可变区、Fv连接肽、及3M4E5的重链可变区而成的scFv称为3M4E5LH scFv。
编码源自3M4E5的免疫球蛋白重链的重链可变区的核酸(序列号162)
编码源自3M4E5的免疫球蛋白轻链的轻链可变区的核酸(序列号163)
3M4E5HL scFv(序列号164)
编码3M4E5HL scFv的核酸(序列号165)
3M4E5LH scFv(序列号166)
编码3M4E5LH scFv的核酸(序列号167)
接着，在编码3M4E5HL scFv和3M4E5LH scFv的核酸的3’端，以从5’端侧起依次配置的方式分别连接编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域(序列号168)的核酸(序列号169)、及编码人CD3ζ的细胞内信号转导结构域的核酸。由此，制备了编码包含3M4E5HL scFv的3M4E5HL CAR的核酸和编码包含3M4E5LH scFv的3M4E5LH CAR的核酸。需要说明的是，编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸与编码人CD3ζ的细胞内信号转导结构域的核酸利用GeneArt(商标)(Thermo FisherScientific公司)人工基因合成服务而获得。另外，使用在编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸的5’端添加了NotI的限制性内切酶位点者。
人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域(序列号168)
编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸(序列号169)
人CD3ζ的细胞内信号转导结构域(序列号170)
编码人CD3ζ的细胞内信号转导结构域的核酸(序列号171)
进而，在编码3M4E5HL CAR的核酸和编码3M4E5LH CAR的核酸的3’末端，通过编码弗林蛋白酶(furin)切割位点(RAKR：序列号172)、间隔序列(SGSG：序列号173)和密码子最优化P2A序列(ATNFSLLKQAGDVEENPGP：序列号174)的核酸连接编码切割型的NGFR基因(ΔNGFR)的核酸。由此，制备了编码添加了标签的3M4E5HL CAR的核酸和编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸。将各核酸导入pMX表达载体中。
(2)第1CAR文库的制备
使用B细胞纯化试剂盒(CD19-positive selection kit、MACS(注册商标)beads、Miltenyi Biotec公司制)，从人外周血单核细胞中纯化了1～3×106细胞的人外周血B细胞。回收得到的CD19+B细胞后，使用cDNA合成试剂盒(SMARTer(商标)RACE cDNAamplification kit、Takara Bio公司制)提取RNA，进而，由上述RNA合成了cDNA。
使用上述cDNA与5’-RACE引物、3’IGHC引物和3’IGHM引物的混合物，通过PCR扩增了编码包含源自免疫球蛋白重链的重链可变区和恒定区的一部分的蛋白质的核酸。上述3’IGHC引物与人IgG的CH1区杂交。另外，3’IGHM引物与人IgM的CH1区杂交。
5’-RACE引物(序列号175)
3’IGHC引物(序列号176)
3’IGHM引物(序列号177)
接着，使用第1次的PCR产物与改变5’-RACE引物、3’IGHJ1引物、3’IGHJ2引物和3’IGHJ3引物的混合物，实施半巢式PCR，扩增了编码重链可变区的核酸。由此，制备了编码人外周血B细胞来源的重链可变区的核酸的文库。上述3’IGHJ1引物、3’IGHJ2引物和3’IGHJ3引物与重链的J区域(J基因片段)杂交。
改变5’-RACE引物(序列号178)
3’IGHJ1引物(序列号179)
3’IGHJ2引物(序列号180)
3’IGHJ3引物(序列号181)
接着，在第1次PCR中，代替3’IGHC引物和3’IGHM引物，使用3’IGKC引物和3’IGLC引物，在第2次的半巢式PCR中，代替3’IGHJ1引物、3’IGHJ2引物和3’IGHJ3引物，使用3’IGKJ1引物、3’IGKJ2引物、3’IGKJ3引物、3’IGKJ4引物、3’IGLJ1引物、3’IGLJ2引物、3’IGLJ4引物、3’IGLJ5引物、及3’IGLJ7引物，除此以外与上述编码重链可变区的核酸的扩增同样地扩增了编码免疫球蛋白轻链来源的轻链可变区的核酸。由此，制备了编码人外周血B细胞来源的轻链可变区的核酸的文库。3’IGKC引物和3’IGLC引物分别与κ链和λ链的CH1区杂交。另外，3’IGKJ1引物、3’IGKJ2引物、3’IGKJ3引物、3’IGKJ4引物、3’IGLJ1引物、3’IGLJ2引物、3’IGLJ4引物、3’IGLJ5引物、及3’IGLJ7引物分别与轻链的J区域(J基因片段)杂交。
3’IGKC引物(序列号182)
5’-AGGGTCAGAGGCCAAAGGATGG-3’
3’IGLC引物(序列号183)
5’-CTTGGAGCTCCTCAGAGGAG-3’
3’IGKJ1引物(序列号184)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’
3’IGKJ2引物(序列号185)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’
3’IGKJ3引物(序列号186)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’
3’IGKJ4引物(序列号187)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’
3’IGLJ1引物(序列号188)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’
3’IGLJ2引物(序列号189)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’
3’IGLJ4引物(序列号190)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAAAATGATCAGCTGGGTTCC-3’
3’IGLJ5引物(序列号191)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCTAGGACGGTCAGCTCGGTCCC-3’
3’IGLJ7引物(序列号192)
5’-CTTGCCAGAGCCGCTTGTAGAGCCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3’
通过用包含上述人外周血B细胞来源的重链可变区的核酸的文库置换上述(1)的编码3M4E5HL scFv的核酸的5’侧的重链可变区的核酸，从而制备了hH-3M4E4L scFv文库。接着，代替编码3M4E5HL scFv的核酸，使用hH-3M4E4L scFv文库，除此以外与上述(1)同样地制备添加了标签的hH-3M4E4LCAR文库。将添加了标签的hH-3M4E4L CAR文库导入pMX表达载体中，制备了hH-3M4E4L CAR文库的表达载体。需要说明的是，通过限制性内切酶作图和利用桑格测序法对各区域进行测序，从而确认了hH-3M4E4L CAR文库中的重链可变区的不均一性(heterogeneity)为约1×106种。
(3)表达第1CAR文库的T细胞(第1候选CAR-T)的制备
使用转染试剂(TransIT293、Takara Bio公司制)，将hH-3M4E4L CAR文库的表达载体导入Plat-A细胞(从国立大学法人东京大学医科学研究所北村俊雄先生惠赠)中，制备了包含亲嗜性逆转录病毒(Ecotropic retrovirus)的培养上清液。上述Plat-A细胞使用用含10％胎牛血清(FCS)、1μg/mL嘌呤霉素、10μg/mL杀稻瘟素的DMEM培养基维持的细胞。接着，通过添加上述包含亲嗜性逆转录病毒的培养上清液，从而将hH-3M4E4L CAR文库导入作为包装细胞的PG13细胞中，制备了包含hH-3M4E4L CAR文库的GaLV-假型逆转录病毒(GALV-pseudotyped retrovirus)。接着，通过使人外周血T细胞感染GaLV-假型逆转录病毒，从而制备了CAR-T。PG13细胞的培养基的组成为含10％FCS的DMEM培养基，培养条件设为37℃、5％CO2、湿润气氛下。以下只要没有特别声明则细胞的培养条件相同。
接着，从健康的人中分离出人外周血单核细胞。将得到的人外周血单核细胞在50ng/mL抗CD3抗体(克隆：OKT3)和100IU/mL人IL-2的存在下培养2天。上述人外周血单核细胞的培养基的组成为含有50μg/mL庆大霉素、10％人AB血清(Sigma公司制)的RPMI1640培养基。上述培养后，在GaLV-假型逆转录病毒的存在下，在1000×g、32℃的条件下进行1小时离心分离，由此使T细胞感染上述逆转录病毒，将hH-3M4E4L CAR文库导入T细胞中。进而实施5次(总计6次)同样的逆转录病毒的感染和hH-3M4E4L CAR文库的导入。对于得到的T细胞，用PE标记抗人NGFR mAb(克隆：ME20.4)染色后，使用流式细胞仪(Gallios flow cytometer、Beckman Coulter公司制)，对T细胞上的标签的表达进行确认，确认了以30％的导入效率在1个T细胞中表达了1个hH-3M4E4L CAR。流式细胞仪中得到的数据的解析中，使用解析软件(FlowJo Version 7.6.5 software、TreeStar公司制)(以下同样)。
使导入上述hH-3M4E4 CAR文库后的T细胞与上述PE标记抗人NGFR mAb反应。上述反应后，使用抗PE微珠(Miltenyi Biotec公司制)，将导入了hH-3M4E4 CAR文库的T细胞纯化，将其作为第1候选CAR-T。
(4)表达靶抗原的细胞的制备
使用逆转录病毒，将编码HLA-A*02:01的核酸及编码CD80、CD83、CD40和4-1BBL的核酸导入K562细胞(没有HLA和CD19的表达，从ATCC获得)中，作为抗原提呈细胞(APC、K562/A2)。
编码HLA-A*02:01的核酸(序列号193)
编码CD80的核酸(序列号194)
编码CD83的核酸(序列号195)
编码CD40的核酸(序列号196)
编码4-1BBL的核酸(序列号197)
(5)第1筛选方法(第1次)
使用上述(3)的第1候选CAR-T、及上述(4)中制备的APC，进行了筛选。具体而言，将2×106第1候选CAR-T和1×105APC接种在各孔(24孔板)中后，共培养7天。以20Gy对上述APC进行γ射线处理后，以1～10μg/mL施加NY-ESO-1157-165肽(NY-ESO-1157肽、SLLMWITQC：序列号206)脉冲，使用去除了在上述脉冲后未与HLA-A*02:01结合的肽的细胞。另外，上述第1候选CAR-T和APC的共培养中使用的培养基的组成为含有50μg/mL庆大霉素、10％人AB血清(Sigma公司制)、10IU/mL人IL-2(Roche公司制)、及10ng/mL人IL-15(PeproTech公司制)的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收第1候选CAR-T，在同样的条件下进而实施2次(总计3次)与APC的共培养。由此，富集了表达与A2/NY-ESO-1157结合的hH-3M4E4L CAR的第1候选CAR-T。
接着，回收富集后的第1候选CAR-T，用20μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体进行染色。上述PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体通过将生物素化HLA-A2/NY-ESO-1157的单体与PE标记链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific公司制)混合而制备。上述染色后，进而用PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、及V450标记抗人NGFRmAb(克隆：C40-1457)对上述T细胞进行染色。各抗体的浓度为约10μg/mL。然后，对于四聚体染色后的第1候选CAR-T，使用上述流式细胞仪，确认了表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T的存在(供体1)。使用源自不同的健康人的T细胞实施了同样的试验(供体2)。另外，阳性对照中，代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5HL CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用HLA-A*02:01和HIV Gag77-85肽(SLYNTVATL：序列号198)的复合体(A2/HIV-Gag77)的四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+、SSC+、NGFR+细胞设门的结果示于图1。
图1是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图1中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示A2四聚体的平均荧光强度。如图1所示，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体的T细胞(对照2)中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的T细胞。另外，表达3M4E5HLCAR的CAR-T(3M4E5-CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分(各点阵图的右上部分)，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，上述第1候选CAR-T(供体1和2)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时存在CD8+A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时不存在CD8+A2四聚体+级分。由该结果可知，在上述第1候选CAR-T中存在表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T。
接着，选择表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T，鉴定了上述第1候选CAR-T所表达的CAR。具体而言，与上述(5)同样地对上述第1候选CAR-T进行染色。接着，使用流式细胞仪(FACSAria(商标)、Becton Dickinson公司制)从上述第1候选CAR-T中进行细胞筛选，分选出NGFR+CD8+A2/NY-ESO-1157四聚体+级分、或NGFR+CD4+A2/NY-ESO-1157四聚体+级分作为表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T。使用总RNA提取试剂(TRIzol(注册商标)、Ambion公司制)，从得到的第1候选CAR-T中提取了总RNA。使用反转录酶(Superscript(注册商标)III、Thermo Fisher Scientific公司制)，由上述总RNA合成了cDNA。
使用得到的cDNA、及下述正向引物1和反向引物1的混合物，实施PCR，扩增了编码scFv的核酸。使用克隆试剂盒(Gibson Assembly Master Mix、New England Biolab公司制)，以编码scFv的核酸与人CD28的部分区域的5’端连接的方式将得到的编码scFv的核酸导入pMX/CAR表达载体中(pMX/scFv表达载体)。pMX/CAR表达载体通过如下方式制备：以从5’端侧起依次配置的方式将编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸(序列号169)、及编码人CD3ζ的细胞内信号转导结构域的核酸(序列号171)连接至pMX表达载体进行导入，从而制备。然后，对于得到的pMX/scFv表达载体，利用桑格测序法进行测序，由此鉴定了编码CAR的碱基序列(编码H1-3M4E5L CAR的多核苷酸(序列号138)和编码H73-3M4E5L CAR的多核苷酸(序列号157))。另外，基于上述碱基序列，鉴定了scFv的氨基酸序列(H1-3M4E5L(序列号98)和H73-3M4E5L(序列号117))。接着，基于scFv的氨基酸序列，鉴定了上述表1A所示的新的重链可变区(HA)和(HC)的CDRH1、CDRH2和CDRH3。另外，由上述pMX/scFv表达载体，制备了包含编码H1-3M4E5L的多核苷酸的pMX/H1-3M4E5L表达载体和包含编码H73-3M4E5L的多核苷酸的pMX/H73-3M4E5L表达载体。
正向引物1(序列号199)
反向引物1(序列号200)
(6)第1候选scFv的解析
代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用pMX/H1-3M4E5L表达载体或pMX/H73-3M4E5L表达载体，除此以外与上述(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，通过添加上述包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液，从而在Jurkat76细胞中导入pMX/H1-3M4E5L表达载体或pMX/H73-3M4E5L表达载体，表达了包含H1-3M4E5L或H73-3M4E5L作为scFv的CAR(H1-3M4E5L CAR或H73-3M4E5L CAR)。使表达上述CAR后的Jurkat76细胞与上述PE标记抗人NGFR mAb反应。上述反应后，使用上述抗PE微珠，将表达H1-3M4E5LCAR和H73-3M4E5L CAR的Jurkat76细胞(H1-3M4E5L CAR-T或H73-3M4E5L CAR T)纯化。对于H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR T，用5μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体染色后，用V450标记抗人NGFR mAb进行染色。对于上述染色后的H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CART，通过流式细胞仪进行解析。阳性对照中，代替pMX/H1-3M4E5L表达载体或pMX/H73-3M4E5L表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入pMX/H1-3M4E5L表达载体或pMX/H73-3M4E5L表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图2。
图2是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图2中，横轴表示用A2/NY-ESO-1157四聚体或A2/HIV-Gag77四聚体进行染色时的平均荧光强度，纵轴表示侧向散射光(SSC)的平均强度。如图2所示，未导入pMX/H1-3M4E5L表达载体或pMX/H73-3M4E5L表达载体的Jurkat76细胞(对照2)中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的细胞。另外，3M4E5HL CAR-T(3M4E5CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，几乎全部细胞为A2四聚体+；用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，由于为A2四聚体-，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，对于H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，几乎全部细胞为A2四聚体+，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，为A2四聚体-。由该结果可知，H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。即，可知根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与靶抗原结合的scFv。
(7)第1候选scFv的亲和性
接着，对于上述(6)中得到的H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T和表达3M4E5LH CAR的Jurkat76细胞(3M4E5LH CAR-T)，用规定浓度(0.0004194304、0.001048576、0.00262144、0.0065536、0.016384、0.04096、0.1024、0.256、0.64、1.6、4或10μg/mL)的PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体染色后，用V450标记抗人NGFR mAb进行染色，除此以外与上述(6)同样地通过流式细胞仪进行解析。然后，计算出A2/NY-ESO-1157四聚体的各浓度中的A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例。将该结果示于图3。
图3是示出A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例的图。图3中，横轴表示A2/NY-ESO-1157四聚体的浓度，纵轴表示A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例。如图3所示，各CAR-T中，A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例依赖于A2/NY-ESO-1157四聚体的浓度地增加。另外，对于H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR T，为了得到与3M4E5LH CAR-T相同程度的A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞，需要使A2/NY-ESO-1157四聚体成为更高浓度，因此可知这些CAR-T中的scFv对A2/NY-ESO-1157四聚体的亲和性不同。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选具有与靶抗原结合的亲和性不同的scFv。
(8)第1候选scFv的功能
接着，对H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T是否通过与上述靶抗原结合而被激活进行了研究。具体而言，将3×105个细胞的H1-3M4E5L CAR-T或H73-3M4E5L CAR-T和5×104个细胞的T2细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)使用以规定浓度(0.0005、0.0015、0.004、0.01、0.04、0.122、0.366、1.11、3.33或10μg/mL)施加了NY-ESO-1157肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5LCAR-T，用FITC标记抗人CD69mAb(克隆：FN50)和V450标记抗人NGFR mAb进行染色。对于上述染色后的H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T，使用上述流式细胞仪，对NGFR+细胞测定了CD69的平均荧光强度。阳性对照中，使用上述(6)中得到的3M4E5HL CAR-T，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替NY-ESO-1157肽，使用施加了HIV Gag77-85肽脉冲的T2细胞(T2+HIV Gag77)，除此以外同样地实施。对照2中，未导入pMX/H1-3M4E5L表达载体，除此以外同样地实施。此外，对于各肽的浓度，以对照2中的CD69的平均荧光强度作为基准，计算出各样品的CD69的表达上调的比例。将这些的结果示于图4和5。
图4是示出肽浓度为10μg/mL时的CD69的表达量的变化的图。图4中，横轴表示样品的种类，纵轴表示CD69的表达上调的比例。如图4所示，对照2中，未发生CD69的表达上调。另一方面，3M4E5HL CAR-T(阳性对照)中，用T2+ NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，CD69的表达上调，确认了与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。另外，对于H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T，用T2+ NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，CD69的表达上调，与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。进而，H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T与3M4E5HL CAR-T相比，以T2+ HIV Gag77刺激时的CD69的表达量的上升率为基准的、CD69的表达上调率高。因此，可知H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR-T与3M4E5HL CAR-T相比，针对A2/NY-ESO-1157的特异性高。另外，可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选在CAR-T细胞中发挥作用且特异性更高的scFv。
接着，将NY-ESO-1157肽系列稀释时的CD69的表达变化的结果示于图5。图5是示出CD69的表达量的变化的图。图5中，横轴表示NY-ESO-1157肽的浓度，纵轴表示CD69的表达上调的比例。如图5所示，各CAR-T中，CD69的表达依赖于NY-ESO-1157肽的浓度地上调。另外，可知H1-3M4E5L CAR-T和H73-3M4E5L CAR T与3M4E5LH CAR-T相比，CD69的表达上调更为急剧，针对A2/NY-ESO-1157的特异性高。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选在CAR-T细胞中发挥作用且特异性更高的scFv。
(9)第2CAR文库的制备
使用从第1CAR文库中筛选的重链可变区(HA)，制备了第2CAR文库。具体而言，对于导入了编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的pMX表达载体，用编码重链可变区(HA)的核酸置换了编码重链可变区(3M4E5H)的核酸(3M4E5L-H1表达载体)。接着，对于3M4E5L-H1表达载体，用上述(2)的编码轻链可变区的核酸的文库置换了编码轻链可变区(3M4E5L)的核酸。由此，制备了包含第2CAR文库的表达载体(hK-H1 CAR文库的表达载体)。需要说明的是，通过限制性内切酶作图和利用桑格测序法对各区域进行测序，从而确认了hK-H1 CAR文库中的重链可变区的不均一性(heterogeneity)为约1×106种。
(10)表达第2CAR文库的T细胞(第2候选CAR-T)的制备
代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用hK-H1 CAR文库的表达载体，除此以外与上述(3)同样地将导入了hK-H1 CAR文库的T细胞纯化，将其作为第2候选CAR-T。
(11)第1筛选方法(第2次)
接着，代替上述第1候选CAR-T，使用上述第2候选CAR-T，除此以外与上述(5)同样地确认了表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第2候选CAR-T的存在(供体1)。使用包含源自不同的健康人的人外周血B细胞来源的重链可变区的核酸的文库实施了同样的试验(供体2)。另外，阳性对照中，代替hK-H1CAR文库的表达载体，使用pMX/3M4E5L-H1表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E5L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图6。
图6是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图6中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示A2四聚体的平均荧光强度。如图6所示，未导入hK-H1CAR文库的表达载体的T细胞(对照2)中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的T细胞。另外，表达3M4E5L-H1 CAR的CAR-T(3M4E5L-H1 CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分(各点阵图的右上部分)，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分，因此再次确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，上述第2候选CAR-T(供体1和2)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分。由该结果可知，在上述第2候选CAR-T中存在表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第2候选CAR-T。
接着，选择表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第2候选CAR-T，鉴定了上述第2候选CAR-T所表达的CAR。具体而言，使用A2/NY-ESO-1157四聚体对上述第2候选CAR-T进行染色。接着，使用流式细胞仪从上述第2候选CAR-T中进行细胞筛选，由此分选出NGFR+CD8+A2/NY-ESO-1157四聚体+级分、或NGFR+CD4+A2/NY-ESO-1157四聚体+级分作为表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第2候选CAR-T。代替表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T，使用表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第2候选CAR-T，除此以外与上述(5)同样地制备scFv，导入pMX/CAR表达载体中。此外，对于得到的导入了scFv的pMX/CAR表达载体，利用桑格测序法进行测序，由此鉴定了编码CAR的碱基序列(编码K52-H1 CAR的多核苷酸(序列号139)、编码K73-H1 CAR的多核苷酸(序列号140)、编码K121-H1 CAR的多核苷酸(序列号141)、编码K124-H1 CAR的多核苷酸(序列号142)、编码K125-H1 CAR的多核苷酸(序列号143)、编码K131-H1 CAR的多核苷酸(序列号144)、编码K145-H1CAR的多核苷酸(序列号145)、编码K151-H1 CAR的多核苷酸(序列号146)、编码K160-H1 CAR的多核苷酸(序列号147)、编码K173-H1 CAR的多核苷酸(序列号148))。另外，基于上述碱基序列，鉴定了scFv的氨基酸序列(K52-H1(序列号99)、K73-H1(序列号100)、K121-H1(序列号101)、K124-H1(序列号102)、K125-H1(序列号103)、K131-H1(序列号104)、K145-H1(序列号105)、K151-H1(序列号106)、K160-H1(序列号107)、K173-H1(序列号108))。此外，基于scFv的氨基酸序列，鉴定了上述表1B中记载的新的轻链可变区(LB)～(LJ)的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
(12)第2候选scFv的解析
使用导入了编码上述(11)的各scFv的多核苷酸代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体的编码scFv的多核苷酸而成的pMX/CAR表达载体，除此以外与上述(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，通过添加上述包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液，从而将导入了编码各scFv的多核苷酸的pMX/CAR表达载体导入Jurkat76细胞中，表达了包含K52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1或K173-H1作为scFv的CAR。使表达上述CAR后的Jurkat76细胞与上述PE标记抗人NGFRmAb反应。上述反应后，使用上述抗PE微珠，将表达各CAR的Jurkat76细胞纯化。对于经纯化的表达各CAR的Jurkat76细胞，用5μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体染色后，用V450标记抗人NGFRmAb进行染色。对于上述染色后的表达各CAR的Jurkat76细胞，通过流式细胞仪进行解析。另外，代替导入了各scFv的pMX/CAR表达载体，使用pMX/H1-3M4E5L表达载体，除此以外同样地实施。阳性对照中，代替导入了各scFv的pMX/CAR表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入已导入各scFv的pMX/CAR表达载体，除此以外同样地实施。将对NGFR+细胞设门的结果示于图7(A)和图7(B)。
图7(A)和图7(B)是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图7(A)和图7(B)中，横轴表示A2四聚体的平均荧光强度，纵轴表示侧向散射光(SSC)的平均强度。如图7(A)和图7(B)所示，未导入导入了各scFv的pMX/CAR表达载体的Jurkat76细胞(对照2)中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的细胞。另外，3M4E5LH CAR-T(3M4E5-CAR阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，几乎全部细胞存在A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在A2四聚体+级分，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，对于表达包含H1-3M4E5L、K52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1或K173-H1的CAR的T细胞，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，几乎全部或一部分细胞存在于A2四聚体+级分中，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在A2四聚体+级分。由该结果可知，包含H1-3M4E5L、K52-H1、K73-H1、K121-H1、K124-H1、K125-H1、K131-H1、K145-H1、K151-H1、K160-H1或K173-H1的CAR与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选包含与靶抗原结合的新的重链可变区和轻链可变区的scFv。另外，由于存在用A2/NY-ESO-1157四聚体的染色程度不同的表达CAR的T细胞，因此可知能够筛选包含对靶抗原具有不同的亲和性的重链可变区和轻链可变区的scFv。
[实施例2]
确认了：通过使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法，能够筛选与A2/NY-ESO-1157结合的scFv。
(1)第1CAR文库的制备
通过用包含上述人外周血B细胞来源的轻链可变区的核酸的文库置换编码上述实施例1的(1)的3M4E5LH scFv的核酸的5’侧的编码轻链可变区的核酸，从而制备了hL-3M4E4H scFv文库。然后，代替编码3M4E5LH scFv的核酸，使用hL-3M4E4H scFv文库，除此以外与上述实施例1的(1)同样地制备添加了标签的hL-3M4E4H CAR文库。将添加了标签的hL-3M4E4H CAR文库导入pMX表达载体中，制备了hL-3M4E4H CAR文库的表达载体。需要说明的是，hL-3M4E4H CAR文库的重链可变区的不均一性通过限制性内切酶作图和利用桑格测序法对各区域进行测序而确认。
(2)表达第1CAR文库的T细胞(第1候选CAR-T)的制备
代替上述hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用hL-3M4E4H CAR文库的表达载体，除此以外与上述实施例1的(3)同样地将导入了hL-3M4E4H CAR文库的T细胞纯化，将其作为第1候选CAR-T。
(3)第1筛选方法
代替上述实施例1的(3)的第1候选CAR-T，使用上述实施例2的(2)的第1候选CAR-T，除此以外与上述实施例1的(5)同样地确认了，表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T的存在(供体1)。使用包含源自不同的健康人的人外周血B细胞来源的重链可变区的核酸的文库实施了同样的试验(供体2)。另外，阳性对照中，代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hL-3M4E4H CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图8。
图8是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图8中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示A2四聚体的平均荧光强度。如图8所示，未导入hL-3M4E4H CAR文库的表达载体的T细胞(对照2)中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的T细胞。另外，表达3M4E5LHCAR的CAR-T(3M4E5-CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分(各点阵图的右上部分)，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，上述第1候选CAR-T(供体1和2)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分。由该结果可知，在上述第1候选CAR-T中存在表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T。
接着，选择表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T，鉴定了上述第1候选CAR-T所表达的CAR。具体而言，与上述实施例2的(3)同样地对上述第1候选CAR-T进行染色。接着，使用流式细胞仪从上述第1候选CAR-T中进行细胞筛选，分选出NGFR+CD8+A2/NY-ESO-1157四聚体+级分、或NGFR+CD4+A2/NY-ESO-1157四聚体+级分作为表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T。代替上述实施例1的(5)的表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T，使用新分选出的表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的第1候选CAR-T，除此以外与上述实施例1的(5)同样地制备scFv，导入pMX/CAR表达载体中。然后，通过利用桑格测序法对得到的导入了scFv的pMX/CAR表达载体进行测序，由此鉴定了编码CAR的碱基序列(编码L1-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号149)、编码L66-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号151)、编码L73-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号152)、编码L80-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号153)、编码L88-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号154)、编码L102-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号155)、及编码L124-3M4E5CAR的多核苷酸(序列号156))。另外，基于上述碱基序列，鉴定了scFv的氨基酸序列(L1-3M4E5(序列号109)、L66-3M4E5(序列号111)、L73-3M4E5(序列号112)、L80-3M4E5(序列号113)、L88-3M4E5(序列号114)、L102-3M4E5(序列号115)、及L124-3M4E5(序列号116))。此外，基于scFv的氨基酸序列，鉴定了上述表1B中记载的新的轻链可变区(LK)～(LQ)的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
(4)第1候选scFv的解析
使用导入了编码上述实施例2的(3)的各scFv的多核苷酸代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体的编码scFv的多核苷酸而成的pMX/CAR表达载体，除此以外与上述实施例1的(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，通过添加上述包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液，从而将导入了编码各scFv的多核苷酸的pMX/CAR表达载体导入Jurkat76细胞中，表达了包含L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5作为scFv的CAR。使表达上述CAR后的Jurkat76细胞与上述PE标记抗人NGFR mAb反应。上述反应后，使用上述抗PE微珠，将表达各CAR的Jurkat76细胞纯化。对于经纯化的表达各CAR的Jurkat76细胞，用5μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体染色后，用V450标记抗人NGFR mAb进行染色。对于上述染色后的表达各CAR的Jurkat76细胞，通过流式细胞仪进行解析。阳性对照中，代替导入了各scFv的pMX/CAR表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入已导入各scFv的pMX/CAR表达载体，除此以外同样地实施。将对NGFR+细胞设门的结果示于图9。
图9是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图9中，横轴表示A2四聚体的平均荧光强度，纵轴表示侧向散射光(SSC)的平均强度。如图9所示，导入了各scFv的pMX/CAR表达载体未被导入的Jurkat76细胞(对照2)中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的细胞。另外，3M4E5LH CAR-T(3M4E5CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，几乎全部细胞存在A2四聚体+级分；用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在A2四聚体+级分，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，对于表达包含L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5的CAR的T细胞，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，几乎全部或一部分细胞存在A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在A2四聚体+级分。由该结果可知，包含L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5的CAR与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选包含与靶抗原结合的新的重链可变区和轻链可变区的scFv。另外可知，由于存在用A2/NY-ESO-1157四聚体的染色程度不同的表达CAR的T细胞，因此可知能够筛选包含对靶抗原具有不同的亲和性的重链可变区和轻链可变区的scFv。
(5)第1候选scFv的亲和性
接着，对于上述实施例2的(4)中得到的表达包含L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5的CAR的Jurkat76细胞、以及3M4E5LH CAR-T，用规定浓度(0.0004194304、0.001048576、0.00262144、0.0065536、0.016384、0.04096、0.1024、0.256、0.64、1.6、4或10μg/mL)的PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体染色后，用V450标记抗人NGFR mAb进行染色，除此以外与上述(6)同样地通过流式细胞仪进行解析。然后，计算出A2/NY-ESO-1157四聚体的各浓度中的、A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例。将该结果示于图10。
图10是示出A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例的图。图10中，横轴表示A2/NY-ESO-1157四聚体的浓度，纵轴表示A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例。如图10所示，各CAR-T中，A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞的比例依赖于A2/NY-ESO-1157四聚体的浓度地增加。另外，对于表达包含L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5的CAR的T细胞，为了得到与3M4E5LH CAR-T相同程度的A2/NY-ESO-1157四聚体阳性细胞，需要使A2/NY-ESO-1157四聚体成为更高浓度，因此可知这些CAR-T中的scFv对A2/NY-ESO-1157四聚体的亲和性不同。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与靶抗原结合的具有不同亲和性的scFv。
(6)第1候选scFv的功能
接着，对表达L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5作为scFv的CAR-T是否通过与上述靶抗原的结合而被激活进行了研究。具体而言，将3×105个细胞的各CAR-T和5×104个细胞的T2细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)使用以规定浓度(0.0005、0.0015、0.004、0.01、0.04、0.122、0.366、1.11、3.33或10μg/mL)施加了NY-ESO-1157-165肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收各CAR-T，用FITC标记抗人CD69mAb(克隆：FN50)和V450标记抗人NGFR mAb进行染色。对于上述染色后的各CAR-T，使用上述流式细胞仪，对NGFR+细胞测定了CD69的平均荧光强度。阳性对照中，代替pMX/H1-3M4E5L表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5LHCAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替NY-ESO-1157-165肽，使用施加了HIV Gag77-85肽脉冲的T2细胞(T2+HIV Gag77)，除此以外同样地实施。对照2中，未导入上述表达载体，除此以外同样地实施。然后，以对照2中的CD69的平均荧光强度作为基准，计算出各样品的CD69的表达上调的比例。将这些结果示于图11。
图11是示出肽浓度为10μg/mL时的CD69的表达量的变化的图。图11中，横轴表示样品的种类，纵轴表示CD69的表达上调的比例。如图11所示，对照2中，未发生CD69的表达上调。另一方面，确认了3M4E5LH CAR-T(阳性对照)中，用T2+ NY-ESO-1157刺激时，与用T2+HIV Gag77刺激时相比，CD69的表达上调，与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。另外，对于表达L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L80-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5或L124-3M4E5作为scFv的CAR-T，用T2+ NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，CD69的表达上调，与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。另外，可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选在CAR-T细胞中发挥作用且特异性更高的scFv。
接着，将NY-ESO-1157肽的系列稀释时的CD69的表达变化的结果示于图12。图12是示出CD69的表达量的变化的图。图12中，横轴表示NY-ESO-1157肽的浓度，纵轴表示CD69的表达上调的比例。如图12所示，各CAR-T中，CD69的表达依赖于NY-ESO-1157肽的浓度地上调。另外，可知：表达L1-3M4E5或L102-3M4E5作为scFv的CAR-T与3M4E5LH CAR-T相比，CD69的表达上调更为急剧，针对A2/NY-ESO-1157的特异性高。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选在CAR-T细胞中发挥作用且特异性更高的scFv。
[实施例3]
确认了通过使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法，能够筛选与CD19结合的scFv。
(1)FMC63CAR的制备
代替上述A2/NY-ESO-1157特异性抗体的重链可变区和轻链可变区，使用人CD19特异性抗体(克隆：FMC63)的重链可变区和轻链可变区，除此以外与上述实施例1的(1)同样地制备编码FMC63HL scFv或FMC63LH scFv的核酸，获得了在3’末端添加了标签的添加了标签的FMC63HL CAR的核酸和编码添加了标签的FMC63LH CAR的核酸。将各核酸导入pMX表达载体中。
FMC63HL scFv(序列号201)
编码FMC63HL scFv的核酸(序列号202)
FMC63LH scFv(序列号203)
编码FMC63LH scFv的核酸(序列号204)
(2)第1CAR文库的制备
通过用包含上述人外周血B细胞来源的重链可变区的核酸的文库置换编码上述实施例3(1)的FMC63HL scFv的核酸的5’侧的编码重链可变区的核酸，由此制备了hH-FMC63LscFv文库。然后，代替编码3M4E5LH scFv的核酸，使用hH-FMC63L scFv文库，除此以外与上述实施例1的(1)同样地制备添加了标签的hH-FMC63L CAR文库。将添加了标签的hH-FMC63LCAR文库导入pMX表达载体中，制备了hH-FMC63L CAR文库的表达载体。需要说明的是，通过限制性内切酶作图和利用桑格测序法对各区域进行测序，从而确认了hH-FMC63L CAR文库的重链可变区的不均一性为约1×106种。
(3)表达第1CAR文库的T细胞(第1候选CAR-T)的制备
代替上述hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用hH-FMC63L CAR文库的表达载体，除此以外与上述实施例1的(3)同样地将导入了hH-FMC63L CAR文库的T细胞纯化，将其作为第1候选CAR-T。
(4)靶抗原的表达细胞的制备
使用逆转录病毒，将编码人CD19的核酸导入K562细胞中，作为抗原提呈细胞(APC-CD19)。
编码人CD19的核酸(序列号205)
(5)第1筛选方法
使用上述实施例3的(3)的第1候选CAR-T、及上述实施例3的(4)中制备的APC-CD19，进行了筛选。具体而言，将2×106第1候选CAR-T和1×105APC-CD19接种在各孔(24孔板)中后，共培养7天。上述APC-CD19使用以20Gy进行了γ射线处理的细胞。另外，上述第1候选CAR-T和APC-CD19的共培养中使用的培养基的组成为含有50μg/mL庆大霉素、10％人AB血清(Sigma公司制)、10IU/mL人IL-2(Roche公司制)、及10ng/mL人IL-15(PeproTech公司制)的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收第1候选CAR-T，在同样的条件下进而实施2次(总计3次)与APC-C19的共培养。由此，富集了表达与人CD19结合的hH-FMC63L CAR的第1候选CAR-T。
接着，回收富集后的第1候选CAR-T，用20μg/mL PE标记CD19二聚体进行染色。上述PE标记CD19二聚体使用通过SGSG连接体在人CD19的胞外结构域的C末端添加了His标签的溶解型CD19而制备。具体而言，上述PE标记CD19二聚体通过以摩尔数成为2：1的方式混合上述溶解型CD19与PE标记抗His mAb(克隆：GG11-8F3.5.1)而制备。上述染色后，进而用PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、及V450标记抗人NGFRmAb(克隆：C40-1457)对上述T细胞进行染色。然后，对于二聚体染色后的第1候选CAR-T，使用上述流式细胞仪，确认了表达与CD19结合的CAR的第1候选CAR-T的存在。另外，阳性对照中，代替hH-FMC63L CAR文库的表达载体，使用包含编码添加了标签的FMC63HL CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。需要说明的是，在使用包含编码添加了标签的FMC63LHCAR的核酸的表达载体的情况下，也得到了与使用包含编码添加了标签的FMC63HL CAR的核酸的表达载体的情况同样的结果。另外，对照1中，未用CD19二聚体进行染色，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-FMC63L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图13。
图13是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图13中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示CD19二聚体的平均荧光强度。如图13所示，未导入hH-FMC63CAR文库的表达载体的T细胞(对照2)中，不存在与CD19二聚体结合的T细胞。另外，表达FMC63CAR的CAR-T(FMC63-CAR、阳性对照)中，用CD19二聚体染色时，存在CD8+CD19二聚体+级分(各点阵图的右上部分)，未用CD19二聚体进行染色时，不存在CD8+CD19二聚体+级分，因此确认了与CD19二聚体结合。此外，对于上述第1候选CAR-T，用CD19二聚体染色时，存在CD8+CD19二聚体+级分，未用CD19二聚体进行染色时，不存在CD8+CD19二聚体+级分。由该结果可知，在上述第1候选CAR-T中、存在表达与CD19二聚体结合的CAR的第1候选CAR-T。由这些结果可知，根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与靶抗原结合的scFv。需要说明的是，虽未示出数据，但CD8+CD19二聚体+级分的细胞与CD19二聚体-级分的细胞相比，CD69的表达上调，确认了CD8+CD19二聚体+级分的细胞中表达的CAR具有T细胞的激活功能。
[实施例4]
确认了：利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR对靶抗原具有高特异性。
代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用导入了编码L1-3M4E5H或H73-3M4E5L作为scFv(抗原结合结构域)的多核苷酸的pMX/CAR表达载体(分别为L1-3M4E5H表达载体和H73-3M4E5L表达载体)，除此以外与上述实施例1的(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，使用得到的GaLV-假型逆转录病毒，除此以外与上述实施例1的(3)同样地使T细胞感染上述逆转录病毒，将L1-3M4E5H表达载体或H73-3M4E5L表达载体导入T细胞中。进而实施了5次(总计6次)同样的逆转录病毒的感染和L1-3M4E5H表达载体或H73-3M4E5L表达载体的导入。对于得到的T细胞，用20μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体进行染色。上述染色后，进而用PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、及V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)对上述T细胞进行染色。各抗体的浓度为约10μg/mL。然后，对于四聚体染色后的T细胞，使用上述流式细胞仪，确认了表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的T细胞的存在。另外，阳性对照中，代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5HL CAR或添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图14。
图14是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图14中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示A2四聚体的平均荧光强度。如图14所示，对照2中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的T细胞。另外，表达3M4E5HL CAR或3M4E5LH CAR的CAR-T(3M4E5HL CAR或3M4E5LH CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分(各点阵图的右上部分)；用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，对于L1-3M4E5H CAR-T或H73-3M4E5LCAR-T，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分。
接着，对上述逆转录病毒感染后的各T细胞是否通过与上述靶抗原的结合被激活而产生细胞因子进行了研究。具体而言，对于上述6次的逆转录病毒感染后的T细胞(CAR-T)，将3×105个细胞的T细胞和5×104个细胞的T2细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)使用以10μg/mL施加了NY-ESO-1157肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收T细胞，用多聚甲醛固定后，进行透明处理，用APC标记抗人IL-2mAb(克隆：MQ1-17H12)、PE标记抗人TNFαmAb(克隆：Mab11)、PC7标记抗人IFN-γmAb(克隆：B27)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、及V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)进行染色。对于上述染色后的CAR-T，使用上述流式细胞仪，测定了CAR-T(NGFR阳性级分)中的CD8阳性细胞或CD4阳性细胞的TNF-α、IFN-γ、及IL-2产生量。阳性对照中，使用包含编码作为scFv的3M4E5HL或3M4E5LH的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替NY-ESO-1157肽，使用A2/HIV-Gag77肽，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。此外，以对照2中的细胞因子的产生量作为基准，计算出各样品的细胞因子产量增加的比例。将这些结果示于图15。
图15是细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。图15中，横轴表示样品(CAR)的种类，纵轴表示细胞因子产量增加的比例。如图15所示，对照2中，细胞因子的产量未增加。另一方面，3M4E5LH CAR-T或3M4E5HL CAR-T(阳性对照)中，用T2+NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，细胞因子的产生量增加，确认了与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。另外，用T2+ NY-ESO-1157刺激3M4E5HL CAR-T或3M4E5LH CAR-T时，与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，细胞因子的产量增加，与A2/NY-ESO-1157结合而被激活，产生了细胞因子。进而，将3M4E5HL CAR-T或3M4E5LH CAR-T用T2+ HIVGag77刺激时的细胞因子的产量为对照2的同等以下，且低于阳性对照。由以上结果可知，利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR对靶抗原具有高特异性。
[实施例5]
确认了：利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR，显示出与筛选中使用的、与靶抗原结合的抗体不同的抗原识别性。
与上述实施例4同样地制作了表达L1-3M4E5H CAR的CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞。接着，将3×105个细胞的T细胞和5×104个细胞的T2细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)使用以10μg/mL施加了NY-ESO-1157肽或NY-ESO-1157肽的突变肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)。上述突变肽是在NY-ESO-1157肽的氨基酸序列中、将各氨基酸逐个用丙氨酸置换而得到的肽。上述共培养后，回收培养上清液，与上述实施例4同样地测定了CAR-T中的IFN-γ的浓度。对照中，使用表达3M4E5LH CAR的CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157肽，使用A2/HIV-Gag77肽，除此以外同样地实施。对照2中，使用未导入表达载体的CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞，除此以外同样地实施。此外，以对照2中的细胞因子的产生量作为基准，计算出各样品的细胞因子产量增加的比例。将这些结果示于图16。
图16是细胞因子产生量的变化的图，(A)示出表达3M4E5LH CAR的T细胞的结果，(B)示出表达L1-3M4E5H CAR的T细胞的结果。图16(A)和图16(B)中，横轴表示肽的种类，纵轴表示细胞因子产生量的变化。如图16(A)所示，3M4E5LH CAR识别NY-ESO-1157肽的160～162位的氨基酸，而如图16(B)所示，L1-3M4E5H CAR识别NY-ESO-1157肽的158和160～162位的氨基酸。由这些结果可知，利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR显示出与筛选中使用的、与靶抗原结合的抗体不同的抗原识别性。
[实施例6]
对于利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR，确认了：即使变换重链可变区与轻链可变区的顺序，也维持抗原识别性。
通过在上述L1-3M4E5H表达载体中颠倒编码重链可变区的多核苷酸与编码轻链可变区的多核苷酸的顺序，从而制作了3M4E5H-L1表达载体。
代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用3M4E5H-L1表达载体，除此以外与上述实施例1的(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，使用得到的GaLV-假型逆转录病毒，除此以外与上述实施例1的(3)同样地使T细胞感染上述逆转录病毒，将3M4E5H-L1表达载体导入T细胞中。进而实施了5次(总计6次)同样的逆转录病毒的感染和3M4E5H-L1表达载体的导入。对于得到的T细胞，用20μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体进行染色。上述染色后，进而用PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、及V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)对上述T细胞进行染色。各抗体的浓度为约10μg/mL。然后，对于四聚体染色后的T细胞，使用上述流式细胞仪，确认了表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的T细胞的存在。另外，阳性对照中，代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用包含编码添加了标签的3M4E5LH CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+、SSC+、NGFR+细胞设门的结果示于图17。
图17是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图17中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示A2四聚体的平均荧光强度。如图17所示，对照2中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的T细胞。另外，表达3M4E5LH CAR的CAR-T(3M4E5LH CAR、阳性对照)中，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分(各点阵图的右上部分)；用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分，因此确认了与A2/NY-ESO-1157结合而不与A2/HIV-Gag77结合。此外，对于表达3M4E5H-L1的CAR-T，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分。
接着，对上述逆转录病毒感染后的各T细胞是否通过与上述靶抗原的结合被激活而产生细胞因子进行了研究。具体而言，对于上述6次的逆转录病毒感染后的T细胞(CAR-T)，将3×105个细胞的T细胞和5×104个细胞的T2细胞或上述实施例1的(4)中制备的APC接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)和APC使用以10μg/mL施加了NY-ESO-1157肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)或APC(K562/A2/NY-ESO-1)。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收T细胞，用多聚甲醛固定后，进行透明处理，用APC标记抗人IL-2mAb(克隆：MQ1-17H12)、PE标记抗人TNFαmAb(克隆：Mab11)、PC7标记抗人IFN-γ抗体(克隆：B27)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、PC5标记抗人CD8amAb(克隆：B9.11)、及V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)进行染色。对于上述染色后的CAR-T，使用上述流式细胞仪，测定了CAR-T(NGFR阳性级分)中的CD8阳性细胞或CD4阳性细胞的TNF-α、IFN-γ、及IL-2产生量。阳性对照中，使用包含编码作为scFv的3M4E5LH的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，上述T2细胞中，对照1中，代替NY-ESO-1157肽，使用HIV-Gag77肽，除此以外同样地实施。上述APC(K562/A2/NY-ESO-1)中，对照1中，使用未导入NY-ESO-1的K562/A2，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。此外，以对照2中的细胞因子的产生量作为基准，计算出各样品的细胞因子产量增加的比例。将这些结果示于图18和图19。
将使用了T2细胞的结果示于图18。图18是示出细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。图18中，横轴表示样品(CAR)的种类，纵轴表示细胞因子产量增加的比例。如图18所示，对照2中，细胞因子的产量未增加。另一方面，3M4E5LH CAR-T(阳性对照)中，用T2+ NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，细胞因子的产生量增加，确认了与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。另外，对于3M4E5H-L1 CAR-T，用T2+ NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIV Gag77刺激时相比，细胞因子的产量增加，与A2/NY-ESO-1157结合而被激活，产生了细胞因子。进而，3M4E5H-L1 CAR-T用T2+ HIV Gag77刺激时的细胞因子的产量与对照2为同等以下，且低于阳性对照。
将使用了APC的结果示于图19。图19是示出细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。图19中，横轴表示样品(CAR)的种类，纵轴表示细胞因子产量增加的比例。如图19所示，对照2中，细胞因子的产量未增加。另一方面，3M4E5LH CAR-T(阳性对照)中，用K562/A2/NY-ESO-1刺激时与用K562/A2刺激时相比，细胞因子的产生量增加，确认了与K562/A2/NY-ESO-1结合而被激活。另外，对于3M4E5H-L1CAR-T，用K562/A2/NY-ESO-1刺激时与用K562/A2刺激时相比，细胞因子的产量增加，与K562/A2/NY-ESO-1结合而被激活，产生了细胞因子。进而，对于3M4E5H-L1 CAR-T，用K562/A2刺激时的细胞因子的产量与对照2为同等，低于阳性对照。由以上结果可知，对于利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR，即使变换重链可变区与轻链可变区的顺序，也能够维持抗原识别性。
[实施例7]
确认了：利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR显示出与筛选中使用的与靶抗原结合的抗体不同的抗原识别性、及能够控制CAR中的scFv的交叉反应性的同时进行筛选。
(1)抗原识别性
与上述实施例6同样地制作了表达3M4E5H-L1 CAR的CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞。接着，将3×105个细胞的T细胞和5×104个细胞的T2细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)使用以10μg/mL施加了NY-ESO-1157肽或NY-ESO-1157肽的突变肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)。上述突变肽是在NY-ESO-1157肽的氨基酸序列中、将各氨基酸逐个用丙氨酸置换而得到的肽。上述共培养后，回收培养上清液，与上述实施例4同样地测定了CAR-T中的IL-2的产生量。对照中，使用表达3M4E5LH CAR的CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞，除此以外同样地实施。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157肽使用A2/HIV-Gag77肽，除此以外同样地实施。对照2中，使用未导入表达载体的CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞，除此以外同样地实施。此外，以对照2中的细胞因子的产生量作为基准，计算出各样品的细胞因子产量增加的比例。将这些结果示于图20。
图20是示出细胞因子产生量的变化的图，(A)示出表达3M4E5LH CAR的T细胞的结果，(B)示出表达3M4E5H-L1 CAR的T细胞的结果。图20(A)和图20(B)中，横轴表示肽的种类，纵轴表示细胞因子产生量的变化。如图20(A)所示，3M4E5LH CAR主要识别NY-ESO-1157肽的160～162位的氨基酸，而如图20(B)所示，3M4E5H-L1 CAR识别NY-ESO-1157肽的158、160～162、及164位的氨基酸。由这些结果可知，利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR显示出与筛选中使用的与靶抗原结合的抗体不同的抗原识别性。
(2)交叉反应性
如上述实施例7(1)所示，3M4E5LH CAR识别NY-ESO-1157肽的160～162位的氨基酸，而3M4E5H-L1 CAR识别NY-ESO-1157肽的158和160～162位、第164位的氨基酸。为了研究3M4E5LH CAR和3M4E5H-L1 CAR对其它肽的交叉反应性，使用算法(netMHC4.0、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)预测了与HLA-A*02：01结合且包含可与3M4E5LH CAR和3M4E5H-L1 CAR交叉反应的肽的人类蛋白质。作为蛋白质的数据库，使用uniprotKB/swissprot。另外，得到的蛋白质中的肽中，使用算法(ScanProsit、https://prosite.expasy.org/scanprosite/)缩小了与NY-ESO-1157肽同源性高的同源肽(homologous peptide)。其结果，检测出包含可进行交叉反应的肽(序列号207：GLRMWIKQV)的溶血磷脂酶样蛋白1(Lysophospholipase-like protein 1：LYPLAL1)。因此，使K562细胞表达LYPLAL1蛋白，研究了3M4E5LH CAR和3M4E5H-L1 CAR的交叉反应性。
使用逆转录病毒，将编码HLA-A*02:01的核酸、及编码隔着上述弗林蛋白酶切割位点、上述间隔序列和上述密码子最优化P2A序列添加了ΔNGFR的LYPLAL1(序列号208)或NY-ESO-1(序列号209)的核酸导入K562细胞(没有HLA和CD19的表达)中，作为抗原提呈细胞(K562/A2/NY-ESO-1或K562/A2/LYPLAL1)。另外，未导入编码添加了ΔNGFR的NY-ESO-1或LYPLAL1的核酸，除此以外同样地制备了抗原提呈细胞(K562/A2)。与上述实施例6同样地制备3M4E5LH CAR-T和3M4E5H-L1 CAR-T，将3×105个细胞的CAR-T细胞和5×104个细胞的抗原提呈细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收CAR-T，用多聚甲醛固定后，进行透明处理，用APC标记抗人IL-2mAb(克隆：MQ1-17H12)、PE标记抗人TNFαmAb(克隆：Mab11)、PC7标记抗人IFN-γ抗体(克隆：B27)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)和V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)进行染色。对于上述染色后的CAR-T，使用上述流式细胞仪，测定了CAR-T(NGFR阳性级分)中的CD8阳性细胞或CD4阳性细胞的TNF-α、IFN-γ、及IL-2的产生量。上述APC中，对照1中，使用未导入NY-ESO-1的K562/A2。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。此外，以对照2中的细胞因子的产生量作为基准，计算出各样品的细胞因子产量增加的比例。将这些结果示于图21。
编码LYPLAL1的核酸分子(序列号208)
编码NY-ESO-1的核酸分子(序列号209)
图21是示出细胞因子产生细胞的比例的图。图21中，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。图21中，各图的横轴表示样品(CAR)的种类，纵轴表示TNF-α、IFN-γ或IL-2阳性细胞的比例。如图21(A)和图21(B)所示，对照1(Control)中，细胞因子的产量未增加。另一方面，阳性对照(K562/A2/NY-ESO-1)中，表达3M4E5H-L1 CAR或3M4E5LH CAR的T细胞产生了TNF-α、IFN-γ、及IL-2。另外，如图21(A)和(B)所示，与提呈LYPLAL1的抗原提呈细胞(K562/A2/LYPLAL1)共培养时，表达3M4E5LH CAR和3M4E5H-L1 CAR的T细胞中的细胞因子产生细胞的比例与作为背景的对照2(K562/A2)为相同程度，未显示出交叉反应性。由这些结果可知，通过使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法，能够控制CAR所包含的scFv的交叉反应性。
[实施例8]
对于利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR，确认了：通过变换重链可变区与轻链可变区的顺序，从而抗原特异性发生变化。
代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用3M4E5H-L1表达载体或L1-3M4E5H表达载体，除此以外与上述实施例1的(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，使用得到的GaLV-假型逆转录病毒，除此以外与上述实施例1的(3)同样地使T细胞感染上述逆转录病毒，将3M4E5H-L1表达载体或L1-3M4E5H表达载体导入T细胞中。进而实施了5次(总计6次)同样的逆转录病毒的感染和3M4E5H-L1表达载体或L1-3M4E5H表达载体的导入。对于得到的T细胞，用20μg/mL PE标记A2/NY-ESO-1157四聚体进行染色。上述染色后，进而用PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、及V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)对上述T细胞进行染色。各抗体的浓度为约10μg/mL。此外，对于四聚体染色后的T细胞，使用上述流式细胞仪，确认了表达与A2/NY-ESO-1157结合的CAR的T细胞的存在。另外，对照1中，代替A2/NY-ESO-1157四聚体，使用A2/HIV-Gag77四聚体，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+、SSC+、NGFR+细胞设门的结果示于图22。
图22是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图22中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示A2四聚体的平均荧光强度。如图22所示，对照2中，不存在与A2/NY-ESO-1157或A2/HIV-Gag77结合的T细胞。另外，对于表达L1-3M4E5H或3M4E5H-L1的CAR-T，用A2/NY-ESO-1157四聚体染色时，存在CD8+A2四聚体+级分，用A2/HIV-Gag77四聚体染色时，不存在CD8+A2四聚体+级分。进而，对于表达L1-3M4E5H或3M4E5H-L1的CAR-T，对CD8-或CD8+的A2四聚体+级分进行比较时，无论是CD8-A2四聚体+级分还是CD8+A2四聚体+级分，与L1-3M4E5H CAR-T相比，3M4E5H-L1 CAR-T均与A2/NY-ESO-1157强烈地结合，且抗原特异性不同。
接着，对上述逆转录病毒感染后的各T细胞是否通过与上述靶抗原的结合被激活而产生细胞因子进行了研究。具体而言，对于上述6次的逆转录病毒感染后的T细胞(CAR-T)，将3×105个细胞的T细胞和5×104个细胞的T2细胞或上述实施例1的(4)中制备的APC接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述T2细胞(HLA-A*02:01表达细胞)和APC使用以10μg/mL施加了NY-ESO-1157肽脉冲的细胞(T2+ NY-ESO-1157)或APC(K562/A2/NY-ESO-1)。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收T细胞，用多聚甲醛固定后，进行透明处理，用APC标记抗人IL-2mAb(克隆：MQ1-17H12)、PE标记抗人TNFαmAb(克隆：Mab11)、PC7标记抗人IFN-γ抗体(克隆：B27)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)和V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)进行染色。对于上述染色后的CAR-T，使用上述流式细胞仪，测定了CAR-T(NGFR阳性级分)中的CD8阳性细胞或CD4阳性细胞的TNF-α、IFN-γ、及IL-2的产生量。另外，上述T2细胞中，对照1中，代替NY-ESO-1157肽而使用HIV-Gag77肽，除此以外同样地实施。上述APC(K562/A2/NY-ESO-1)中，对照1中，使用未导入NY-ESO-1的K562/A2。对照2中，未导入hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，除此以外同样地实施。此外，以对照2中的细胞因子的产生量作为基准，计算出各样品的细胞因子产量增加的比例。将这些结果示于图23和24。
将使用了T2细胞的结果示于图23。图23是示出细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。图23中，横轴表示样品(CAR)的种类，纵轴表示细胞因子产量增加的比例。如图23所示，对照2中，细胞因子的产量未增加。另一方面，对于L1-3M4E5H CAR-T或3M4E5H-L1 CAR-T，用T2+ NY-ESO-1157刺激时与用T2+ HIVGag77刺激时相比，细胞因子的产生量增加，确认了与A2/NY-ESO-1157结合而被激活。另外，用T2+ NY-ESO-1157刺激时，3M4E5H-L1 CAR-T与L1-3M4E5H CAR-T相比，产生了大量的细胞因子。
将使用了APC的结果示于图24。图24是示出细胞因子产生量的变化的图，(A)示出CD8阳性T细胞的结果，(B)示出CD4阳性T细胞的结果。图24中，横轴表示样品(CAR)的种类，纵轴表示细胞因子产量增加的比例。如图24所示，对照2中，细胞因子的产量未增加。另一方面，对于L1-3M4E5H CAR-T或3M4E5H-L1 CAR-T，用K562/A2/NY-ESO-1刺激时与用K562/A2刺激时相比，细胞因子的产生量增加，确认了与K562/A2/NY-ESO-1结合而被激活。另外，用K562/A2/NY-ESO-1刺激时，3M4E5H-L1 CAR-T与L1-3M4E5H CAR-T相比，产生了大量的细胞因子。可知：对于利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR，通过变换重链可变区与轻链可变区的顺序，从而抗原特异性发生变化。另外可知，对于利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的CAR，通过变换重链可变区和轻链可变区的顺序，从而存在能够改善对靶抗原的特异性的可能性。
[实施例9]
确认了：利用本发明的第1筛选方法，能够筛选靶抗原中的识别位点不同的scFv。
首先，与上述实施例1的(9)～(12)和上述实施例2的(1)～(3)同样地鉴定第2候选CAR-T所表达的CAR和第1候选CAR-T所表达的CAR，获得了新的CAR(L52-3M4E5H CAR和K156-H1 CAR)。下述氨基酸序列和碱基序列中，下划线所示的序列是L52或L156的CDRL1、CDRL2、及CDR3L的氨基酸序列或碱基序列。
L52-3M4E5H CAR(序列号210)
编码L52-3M4E5H CAR的多核苷酸(序列号211)
K156-H1 CAR(序列号212)
编码K156-H1 CAR的多核苷酸(序列号213)
使用导入了编码L52-3M4E5H CAR或K156-H1 CAR的多核苷酸代替hH-3M4E4L CAR文库的表达载体的编码scFv的多核苷酸的CAR表达载体，除此以外与上述实施例1的(6)和(8)同样地通过流式细胞仪对与A2/NY-ESO-1157四聚体和A2/HIV-Gag77四聚体的结合性和CD69的表达上调的比例进行解析。CD69的表达上调的比例的解析中，对照1中，未添加CAR-T，除此以外同样地实施。另外，对照2中，未施加NY-ESO-1157肽或HIV Gag77-85肽脉冲，除此以外同样地实施。将这些结果示于图25和图26。
图25是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图25中，横轴表示用A2/NY-ESO-1157四聚体或A2/HIV-Gag77四聚体进行染色时的平均荧光强度，纵轴表示侧向散射光(SSC)的平均强度。如图25所示，L52-3M4E5H CAR-T和K156-H1 CAR-T具有被A2/NY-ESO-1157四聚体染色的级分，且具有被A2/HIV-Gag77四聚体染色的级分。即，L52-3M4E5H CAR和K156-H1 CAR与A2/NY-ESO-1157和A2/HIV-Gag77结合。可推测出这是由于，L52-3M4E5H CAR和K156-H1 CAR的scFv与L1-3M4E5H CAR的scFv等相比，识别并结合到肽和HLA分子的复合体中更靠近HLA分子的位点。
图26是示出肽浓度为10μg/mL时的CD69的表达量的变化的图。图26中，横轴表示样品的种类，纵轴表示CD69的表达上调的比例。如图26所示，对照1中，未发生CD69的表达上调。另一方面，对于L52-3M4E5H CAR-T和K156-H1 CAR-T，用未施加肽脉冲的抗原提呈细胞(对照2、T2)、及以A2/NY-ESO-1157(T2+NY-ESO-1157)或A2/HIV-Gag77(T2+HIV Gag57)施加脉冲的抗原提呈细胞刺激时，CD69的表达上调。对照2中也出现了CD69的表达，因此证实了：L52-3M4E5H CAR和K156-H1 CAR的scFv与L1-3M4E5H CAR的scFv等相比，识别并结合到肽和HLA分子的复合体中更靠近HLA分子的位点。
由以上结果可知，利用本发明的第1筛选方法，能够筛选靶抗原中的识别位点不同的scFv，即可知：能够筛选对靶抗原中的不同位点具有结合性的scFv。
[实施例10]
确认了：通过使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法，能够筛选与CD19结合的scFv。
(1)克隆18CAR的制备
代替作为人CD19特异性抗体的FMC63的重链可变区和轻链可变区，使用人CD19特异性抗体(克隆18(参照国际公开第2016/033570号))的重链可变区和轻链可变区，除此以外与上述实施例3的(1)同样地制备了克隆18scFv或编码克隆18scFv的核酸。将各核酸导入pMX表达载体中。需要说明的是，用下划线表示各scFv中的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
克隆18LH scFv(序列号214)
编码克隆18LH scFv的核酸(序列号215)
(2)第1CAR文库的制备
通过用包含上述人外周血B细胞来源的轻链可变区的核酸的文库置换编码上述实施例10的(1)的克隆18LH scFv的核酸的5’侧的编码轻链可变区的核酸，从而制备了hK-克隆18H scFv文库和hL-克隆18H scFv文库。然后，代替编码3M4E5LH scFv的核酸，使用hK-克隆18H scFv文库和hL-克隆18H scFv文库，除此以外与上述实施例1的(2)同样地制备了hK-克隆18H scFv文库和hL-克隆18H scFv文库。接着，以在各文库的3’端侧依次配置实施例1的(1)的编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸、及编码人CD3ζ的细胞内信号转导结构域的核酸的方式，将hK-克隆18H scFv文库和hL-克隆18H scFv文库导入pMX表达载体中，制备了hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的表达载体。需要说明的是，通过限制性内切酶作图和利用桑格测序法对各区域进行测序，从而确认了hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR的轻链可变区的不均一性为约1×106种。
(3)表达第1CAR文库的T细胞(第1候选CAR-T)的制备
代替上述hH-3M4E4L CAR文库的表达载体，使用hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的表达载体，除此以外与上述实施例1的(3)同样地将导入了hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的T细胞纯化，将其作为第1候选CAR-T。
(4)靶抗原的表达细胞的制备
与上述实施例3的(4)同样地，使用逆转录病毒，将编码人CD19的核酸导入K562细胞中，作为抗原提呈细胞(APC-CD19)。
(5)第1筛选方法
使用上述实施例10的(3)的第1候选CAR-T、及上述实施例10的(4)中制备的APC-CD19，除此以外与上述实施例3的(5)同样地富集了与人CD19结合的表达hK-克隆18H CAR或hL-克隆18H的CAR的第1候选CAR-T。
接着，回收富集后的第1候选CAR-T，用40μg/mL PE标记CD19二聚体进行染色。上述PE标记CD19二聚体使用通过SGSG连接体在人CD19的胞外结构域的C末端添加了His标签的溶解型CD19而制备。具体而言，上述PE标记CD19二聚体通过以摩尔数成为2：1的方式将上述溶解型CD19与PE标记抗His mAb(克隆：GG11-8F3.5.1)混合而制备。上述染色后，进而用PC5标记抗人CD8a mAb(克隆：B9.11)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、及V450标记抗人NGFRmAb(克隆：C40-1457)对上述T细胞进行染色。此外，对于二聚体染色后的第1候选CAR-T，使用上述流式细胞仪，确认了表达与CD19结合的CAR的第1候选CAR-T的存在。另外，阳性对照中，代替hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的表达载体，使用包含编码克隆18LHCAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，未用CD19二聚体进行染色，除此以外同样地实施。对照2中，未导入hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H文库的表达载体，除此以外同样地实施。使用包含源自不同的健康人的外周血B细胞来源的轻链可变区的核酸的文库实施了同样的试验(供体2)。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图27。
图27是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图27中，横轴表示CD8a的平均荧光强度，纵轴表示CD19二聚体的平均荧光强度。如图27所示，未导入hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的表达载体的T细胞(对照2)中，不存在与CD19二聚体结合的T细胞。另外，表达克隆18LH CAR的CAR-T(克隆18LH、阳性对照)中，用CD19二聚体染色时存在CD19二聚体+级分(各点阵图的右上部分)，未用CD19二聚体进行染色时不存在CD19二聚体+级分，因此确认了与CD19二聚体结合。此外，对于上述第1候选CAR-T，在未导入hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的表达载体的任意群体中，用CD19二聚体染色时均存在CD19二聚体+级分，未用CD19二聚体进行染色时均不存在CD19二聚体+级分。由该结果可知，在上述第1候选CAR-T中存在表达与CD19二聚体结合的CAR的第1候选CAR-T。由这些结果可知，根据本发明的第1筛选方法，即使使用不同的抗体也能够筛选与靶抗原结合的scFv。
接着，选择表达与CD19结合的CAR的第1候选CAR-T，鉴定了上述第1候选CAR-T所表达的CAR。具体而言，与上述实施例10的(5)同样地对上述第1候选CAR-T进行染色。接着，使用流式细胞仪(FACSAria(商标)、Becton Dickinson公司制)从上述第1候选CAR-T中进行细胞筛选，分选出NGFR+CD8+CD19二聚体+级分、或NGFR+CD4+CD19二聚体+级分作为表达与CD19结合的CAR的第1候选CAR-T。使用总RNA提取试剂(TRIzol(注册商标)、Ambion公司制)，从得到的第1候选CAR-T中提取了总RNA。使用反转录酶(Superscript(注册商标)III、ThermoFisher Scientific公司制)，由上述总RNA合成了cDNA。
使用得到的cDNA与上述正向引物1(序列号199)和上述反向引物1(序列号200)的混合物，实施PCR，扩增了编码scFv的核酸。使用克隆试剂盒(Gibson Assembly MasterMix、New England Biolab公司制)，以编码scFv的核酸与人CD28的部分区域的5’端连接的方式将得到的编码scFv的核酸导入pMX/CAR表达载体中(pMX/scFv表达载体)。pMX/CAR表达载体通过如下方式制备：以从5’端侧起依次配置的方式将编码人CD28的部分区域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域的核酸(序列号169)、及编码人CD3ζ的细胞内信号转导结构域的核酸(序列号171)连接、并导入至pMX表达载体中，从而制备。然后，对于得到的pMX/scFv表达载体，利用桑格测序法进行测序，由此鉴定了编码CAR的碱基序列(编码L4-18HCAR的多核苷酸(序列号298)、编码L7-18H CAR的多核苷酸(序列号299)、编码L9-18H CAR的多核苷酸(序列号300)、编码L13-18H CAR的多核苷酸(序列号301)、编码L14-18H CAR的多核苷酸(序列号302)、编码L16-18H CAR的多核苷酸(序列号303)、编码L17-18H CAR的多核苷酸(序列号304)、编码L22-18H CAR的多核苷酸(序列号305)、编码K4-18H CAR的多核苷酸(序列号306)、编码K5-18H CAR的多核苷酸(序列号307)、编码K6-18H CAR的多核苷酸(序列号308)、编码K9-18H CAR的多核苷酸(序列号309)、编码K10-18H CAR的多核苷酸(序列号310))。另外，基于上述碱基序列，鉴定了scFv的氨基酸序列(L4-18H(序列号272)、L7-18H(序列号273)、L9-18H(序列号274)、L13-18H(序列号275)、L14-18H(序列号276)、L16-18H(序列号277)、L17-18H(序列号278)、L22-18H(序列号279)、K4-18H(序列号280)、K5-18H(序列号281)、K6-18H(序列号282)、K9-18H(序列号283)、K10-18H(序列号284))。然后，基于scFv的氨基酸序列，鉴定了上述表3B所示的新的轻链可变区(LA)～(LM)的CDRL1、CDRL2和CDRL3。另外，由上述pMX/scFv表达载体，制备了包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体(pMX/L4-18H表达载体、pMX/L7-18H表达载体、pMX/L9-18H表达载体、pMX/L13-18H表达载体、pMX/L14-18H表达载体、pMX/L16-18H表达载体、pMX/L17-18H表达载体、pMX/L22-18H表达载体、pMX/K4-18H表达载体、pMX/K5-18H表达载体、pMX/K6-18H表达载体、pMX/K9-18H表达载体、pMX/K10-18H表达载体)。
(6)第1候选scFv的解析
代替hK-克隆18H CAR文库和hL-克隆18H CAR文库的表达载体，使用包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体，除此以外与上述实施例10的(3)同样地制备了包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液。接着，通过添加上述包含GaLV-假型逆转录病毒的培养上清液，从而将包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体导入Jurkat76细胞中，表达了包含L4-18H、L7-18H、L9-18H、L13-18H、L14-18H、L16-18H、L17-18H、L22-18H、K4-18H、K5-18H、K6-18H、K9-18H或K10-18H作为scFv的各CAR(L4-18H CAR、L7-18H CAR、L9-18H CAR、L13-18H CAR、L14-18H CAR、L16-18H CAR、L17-18H CAR、L22-18H CAR、K4-18H CAR、K5-18H CAR、K6-18HCAR、K9-18H CAR或K10-18H CAR)。使表达上述CAR后的Jurkat76细胞与上述PE标记抗人NGFR mAb反应。上述反应后，使用上述抗PE微珠，将表达各CAR的Jurkat76细胞(L4-18HCAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18HCAR-T或K10-18H CAR-T)纯化。对于表达各CAR的Jurkat76细胞，与上述实施例10的(5)同样地进行染色。对于上述染色后的表达各CAR的Jurkat76细胞，通过流式细胞仪进行解析。阳性对照中，代替包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体，使用包含编码添加了标签的克隆18LH CAR或克隆18HL CAR的核酸的表达载体，除此以外同样地实施。另外，对照1中，未用CD19二聚体进行染色，除此以外同样地实施。对照2中，未导入包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体，除此以外同样地实施。将对FSC+SSC+NGFR+细胞设门的结果示于图28和图29。
图28和图29是示出流式细胞仪的结果的点阵图。图28和图29中，横轴表示用CD19二聚体进行染色时的平均荧光强度，纵轴表示侧向散射光(SSC)的平均强度。如图28和图29所示，未导入包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体的Jurkat76细胞(对照2)中，不存在与CD19结合的细胞。另外，克隆18LH CAR-T和克隆18HL CAR-T(克隆18LH CAR或克隆18HLCAR、阳性对照)中，用CD19二聚体染色时几乎全部细胞为CD19二聚体+，未用CD19二聚体染色时为CD19二聚体-，因此确认了与CD19结合。此外，对于L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18HCAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T或K10-18H CAR-T，用CD19二聚体染色时为CD19二聚体+，未用CD19二聚体染色时为CD19二聚体-。由该结果可知，L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18HCAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、K9-18H CAR-T或K10-18H CAR-T与CD19二聚体结合。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与靶抗原结合的scFv。
(7)第1候选scFv的功能
接着，对上述实施例10的(6)中得到的各CAR-T是否通过与上述靶抗原的结合而被激活进行了研究。具体而言，将2×105个细胞的各CAR-T和5×104个细胞的抗原提呈细胞(APC-CD19或Raji细胞)接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述抗原提呈细胞(APC-CD19)与上述实施例10的(4)同样地进行制备。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述共培养后，回收各CAR-T，用FITC标记抗人CD69mAb(克隆：FN50)和V450标记抗人NGFR mAb进行染色。对于上述染色后的各CAR-T，使用上述流式细胞仪，对NGFR+细胞测定了CD69的平均荧光强度。阳性对照中，使用上述实施例10的(6)中得到的克隆18LH CAR-T和克隆18HL CAR-T，除此以外同样地实施。另外，对照1中，使用未导入编码CD19的核酸的K562细胞，除此以外同样地实施。对照2中，未导入包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体，除此以外同样地实施。此外，以共培养前的CD69的平均荧光强度作为基准，计算出各样品的CD69的表达上调的比例。将这些结果示于图30。
图30是示出CD69的表达量的变化的图。图30中，横轴表示样品的种类，纵轴表示CD69的表达上调的比例。如图30所示，对照2中，几乎未出现CD69的表达上调。另一方面，对于clon19LH CAR-T和clon19HL CAR-T(阳性对照)，用APC-CD19(K562/CD19)或Raji细胞(Raji)刺激时，与用对照1(K562)刺激时相比，CD69的表达上调，确认了与CD19结合而被激活。另外，对于L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L9-18H CAR-T、L13-18H CAR-T、L14-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、L22-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18HCAR-T、K9-18H CAR-T或K10-18H CAR-T，用APC-CD19(K562/CD19)或Raji细胞(Raji)刺激时，与用对照1(K562)刺激时相比，CD69的表达上调，与CD19结合而被激活。另外，由于各CAR-T的CD69的表达上调率显著不同，因此可知能够筛选针对CD19的特异性不同的scFv。
(8)第1候选scFv的亲和性
接着，对上述实施例10的(6)中得到的L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18HCAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、及K9-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T与上述靶抗原的亲和性差异进行了研究。对于各CAR-T，用规定浓度(1.25、2.5、5、10、20或40μg/mL)的PE标记CD19二聚体染色后，用V450标记抗人NGFR mAb进行染色，除此以外与上述实施例10的(6)同样地通过流式细胞仪进行解析。然后，计算出CD19二聚体阳性细胞在CD19二聚体的各浓度中的比例后，以用40μg/mL的CD19二聚体染色时的CD19二聚体阳性细胞的比例作为基准，计算出用各CD19二聚体染色时的CD19二聚体阳性细胞的相对比例。将该结果示于图31。
图31是示出CD19二聚体阳性细胞的相对比例的图。图31中，横轴表示CD19二聚体的浓度，纵轴表示CD19二聚体阳性细胞的相对比例。如图31所示，各CAR-T中，CD69阳性细胞的比例依赖于CD19二聚体的浓度地增加。另外，由于各CAR-T中显示出各种染色强度，因此可知这些CAR-T中的scFv对CD19二聚体的亲和性不同。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与靶抗原结合的具有不同亲和性的scFv。
(9)第1候选scFv的应答性
接着，研究了上述(6)中得到的L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18H CAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、及K9-18H CAR-T和克隆18LHCAR-T对表达上述靶抗原的细胞的应答性的差异。具体而言，将2×105个细胞的各CAR-T和5×104个细胞的抗原提呈细胞(APC-CD19)和K562细胞的混合细胞接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述混合细胞中的APC-CD19(A)与K562(K)的比率(A：K)为规定比率(0：100、6.25：93.75、12.5：87.5、50：50、100：0)。上述共培养后，回收各CAR-T，用FITC标记抗人CD69mAb(克隆：FN50)和V450标记抗人NGFR mAb进行染色。对于上述染色后的各CAR-T，使用上述流式细胞仪，对于NGFR+细胞，测定了CD69阳性细胞的比例。以比率(A：K)＝100：0中的CD69阳性细胞的比例作为基准，计算出以各比率(A：K)培养时的CD69阳性细胞的相对比例(％最大响应(Maximal responses))。另外，将这些结果示于图32。
图32是示出CD69阳性细胞的相对比例的图。图32中，横轴表示比率(A：K)，纵轴表示CD69阳性细胞的相对比例(％最大响应)。如图32所示，各CAR-T中，与APC-CD19(A)的比率成比例地、CD69阳性细胞的比例增加。另外，各CAR-T对APC-CD19显示出各种反应性，因此可知这些CAR-T中的scFv对靶细胞的亲和性不同。即可知：根据本发明的第1筛选方法，能够筛选与靶抗原结合的具有不同亲和性的scFv。
(10)第1候选scFv的功能
接着，对上述(6)中得到的L4-18H CAR-T、L7-18H CAR-T、L16-18H CAR-T、L17-18HCAR-T、K4-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、K6-18H CAR-T、及K9-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T是否通过与上述靶抗原的结合而产生细胞因子进行了研究。具体而言，将3×105个细胞的各CAR-T和5×104个细胞的抗原提呈细胞(APC-CD19或Raji细胞)接种在各孔(96孔板)中后，共培养5小时。上述抗原提呈细胞(APC-CD19)与上述实施例10的(4)同样地进行了制备。另外，上述共培养的培养液为含有10％FCS的RPMI1640培养基。上述培养后，以成为5μmol/L的方式添加BFA，进而培养5小时。然后，用1％PFA固定培养后的细胞后，进行细胞膜的透明处理。进而，用APC标记抗人IL-2mAb(克隆：MQ1-17H12)、PE标记抗人TNFαmAb(克隆：Mab11)、PC7标记抗人IFN-γmAb(克隆：B27)、FITC标记抗人CD4mAb(克隆：OKT4)、PC5标记抗人CD8amAb(克隆：B9.11)、及V450标记抗人NGFR mAb(克隆：C40-1457)进行染色。对于上述染色后的细胞，使用上述流式细胞仪进行测定。此外，计算出细胞因子表达的比例。阳性对照中，使用上述实施例10的(6)中得到的克隆18LH CAR-T，除此以外同样地实施。对照1中，使用未导入编码CD19的核酸的K562细胞，除此以外同样地实施。对照2中，未导入包含编码各CAR的多核苷酸的表达载体，除此以外同样地实施。将这些结果示于图33。
图33是示出细胞因子产生细胞的比例的图。图33中，横轴表示CAR-T的种类，纵轴表示各细胞因子的产生细胞的比例。另外，图33中，上半部分示出CD8阳性CAR-T的结果，下半部分示出CD4阳性CAR-T的结果。如图33所示，存在表达作为靶抗原的CD19的APC-CD19或Raji细胞时，与未表达靶抗原的对照1(K562)或对照2相比，各CAR-T的产生TNF-α、IFN-γ和IL-2的细胞比例上升，可知各CAR-T被激活。由这些结果可知，根据本发明的筛选方法，能够筛选与CD19结合且在CAR-T中能诱导效应子功能的scF。
[实施例11]
确认了：包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体内(in vivo)发挥抗肿瘤效果。
与上述实施例10同样地制备了L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T。
对于表达SLR的Raji细胞(Raji/SLR细胞)，代替K562细胞使用Raji细胞，代替编码人CD19的多核苷酸使用编码SLR的多核苷酸，除此以外与上述实施例1的(4)同样地进行制备。需要说明的是，SLR为细胞内蛋白质，因此将编码切割型的NGFR基因(ΔNGFR)的核酸隔着弗林蛋白酶(furin)切割位点(RAKR：序列号172)、间隔序列(SGSG：序列号173)和密码子最优化P2A序列(ATNFSLLKQAGDVEENPGP：序列号174)的多核苷酸连接至编码SLR的多核苷酸。
SLR蛋白质(SLR/弗林蛋白酶-sgsg-p2a/dNGFR、序列号311)
编码SLR的多核苷酸(序列号312)
对5周龄的NOG小鼠(NOD/Shi-scid,IL-2RγKO·Jic小鼠、从In-Vivo Science公司购入)照射1.5Gy的γ射线。接着，如图34(A)所示，向上述NOG小鼠静脉给予5×105个Raji/SLR细胞进行移植。将上述移植后作为第0天，在第5天，静脉给予2×106个各CAR-T。然后，利用图像分析仪(AEQUORIA-2D/8600生物荧光成像分析仪(bioluminescence imagingassays)、Hamamatsu Photonics公司制)测定了在上述移植后第6天、第9天、第13天和第17天的肿瘤大小。对照给予了未导入上述CAR的T细胞，除此以外同样地进行测定。需要说明的是，各组用3只来实施。将这些结果示于图34。
图34是关于生物体中的抗肿瘤活性的图。图34中，(A)示出方案，(B)示出用图像分析仪测定的照片，(C)是示出肿瘤大小的图。图34(B)中，用白线包围的区域是存在肿瘤的区域。如图34(B)和(C)所示，上述CAR-T给药组与对照相比，肿瘤尺寸缩小。另外，上述L17-18HCAR-T或K5-18H CAR-T给药组与上述克隆18LH CAR-T给药组相比，肿瘤显著缩小。由这些结果可知，包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体内(in vivo)发挥抗肿瘤效果。另外，可知：根据本发明的筛选方法，能够筛选与作为模板的scFv相比能在体内(in vivo)诱导优异的效应子功能的scFv。
[实施例12]
已确认：使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法的第1选择工序和第2选择工序中，通过基于间接评价方法的选择、即基于通过靶抗原与CAR的结合而产生的候选免疫细胞的激活指标的评价的选择，能够筛选包含能功能性激活CA-T细胞的scFv的CAR。
对于L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、L124-3M4E5、H73-3M4E5、H1-3M4E5或3M4E5LH CAR-T，由实施例2的(5)和(7)的结果，计算出四聚体阳性细胞的比例成为阳性细胞的最大比例的一半的四聚体浓度(EC50)作为结构亲和性指标值。上述结构亲和性也可以称为CAR(scFv)对靶抗原的特异性。另外，对于L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、L124-3M4E5、H73-3M4E5、H1-3M4E5或3M4E5LH CAR-T，由实施例2的(6)和(8)的结果，计算出CD69的表达上调率成为CD69的最大表达上调率的一半的四聚体浓度(EC)作为功能亲和性指标值。上述功能亲和性是指：在与靶抗原结合时，CAR激活T细胞的能力。此外，对于L1-3M4E5、L66-3M4E5、L73-3M4E5、L88-3M4E5、L102-3M4E5、L124-3M4E5、H73-3M4E5、H1-3M4E5或3M4E5LH CAR-T，研究了结构亲和性指标值与功能亲和性指标值的相关性。将该结果示于图35。
图35是示出结构亲和性指标值与功能亲和性指标值的相关性的图。图35中，横轴表示结构亲和性指标值(Structural avidity)，纵轴表示功能亲和性指标值(Functionalavidity)。如图35所示，在结构亲和性指标值和功能亲和性指标值高的区域，虽然观察到正相关性，但结构亲和性指标值变低时，未观察到结构亲和性指标值与功能亲和性指标值的相关性。由这些结果可知，基于由靶抗原与CAR的结合而产生的候选免疫细胞的激活指标的评价来选择候选scFv时，与通过靶抗原与CAR的结合来选择候选scFv的情况相比，能够筛选包含能功能性激活CAR-T细胞的scFv的CAR。
[实施例13]
确认了：包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体外(in vitro)发挥细胞毒活性。
与上述实施例10同样地制备了L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T。
接着，对于5.0×103个作为靶细胞的APC-CD19(K562/CD19)或Raji细胞(Raji)，在铬51(51Cr)的存在下培养1.5小时，由此用铬51进行了标记。接着，对于上述L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T或克隆18LH CAR-T(E)及上述用铬51进行了标记的靶细胞(T)，以E：T成为20：1、10：1、5：1或2.5：1的方式在培养了上述靶细胞的孔中添加各CAR-T细胞。然后，培养5～6小时后，回收上清液，使用AccuFLEXg7010(HITACHI公司制)测定了每分钟的辐射线的计数率(CPM：count per minute)。另外，对照1中，代替CAR-T细胞使用导入了NGFR的表达载体的T细胞，除此以外同样地进行，对照2中，作为上述靶细胞使用K562细胞，除此以外同样地进行测定。此外，基于下述式(1)，测定了细胞毒性(特异性裂解的比例)。将这些结果示于图36。
K＝(LE-LS)/(LMax-LS)×100(％)…(1)
K：细胞毒性
LE：CPM的测定值
LS：仅有靶细胞时的CPM的测定值
LMax：在仅有靶细胞的孔中添加了含有0.2％Triton-X的PBS时的CPM的测定值
图36是示出细胞毒性的图。图36中，横轴表示E/T比，纵轴表示细胞毒性。如图36所示，使用未表达作为靶抗原的CD19的K562作为靶细胞时(对照2)，未产生特异性细胞毒性，各组中的细胞毒性为同等。另外，使用了未表达CD19特异性CAR的T细胞时(对照1)，对任意的靶细胞均未产生特异性细胞毒性。另一方面，使用表达作为靶抗原的CD19的K562和Raji细胞作为靶细胞时，L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T或克隆18LH CAR-T添加组中，细胞毒性依赖于效应子的量比地增大。另外，L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T、及克隆18LH CAR-T添加组中，细胞毒性未出现较大差异。由这些结果可知，包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体外(in vitro)发挥细胞毒活性，且L17-18H CAR-T和K5-18H CAR-T显示出与克隆18LH CAR-T同等的细胞毒活性。
[实施例14]
确认了：包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体内(in vivo)发挥抗肿瘤效果。
与上述实施例10同样地制备了L17-18H CAR-T、K5-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T。接着，与实施例11同样地制备了表达SLR的Raji细胞。
对5周龄的NOG小鼠(NOD/Shi-scid,IL-2RγKO·Jic小鼠、从In-Vivo Science公司购入)照射1.5Gy的γ射线。接着，如图37(A)和图38(A)所示，向上述NOG小鼠静脉给予5×105个Raji/SLR细胞进行移植。将上述移植后作为第0天，在第5天或第7天静脉给予2×106个各CAR-T。上述移植后，利用上述图像分析仪经时地测定了肿瘤大小，且测定了小鼠的存活率。需要说明的是，各组以5只来实施。对照中，代替CAR-T细胞，使用导入了NGFR的表达载体的T细胞，除此以外同样地实施。将这些结果示于图37和图38。
图37和图38是关于生物体的总存活率的图。图37和图38中，(A)示出方案，(B)是示出总存活率的Kaplan-Meier曲线。如图37(B)所示，在肿瘤小的时期、即早期癌症的状态下，L17-18H CAR-T或K5-18H CAR-T的给药组与克隆18LH CAR-T的给药组之间的总存活率没有较大差异，抗肿瘤效果几乎为同等。另外，虽未在图中示出，但基于图像分析仪的图像分析中也得到了同样的结果。另一方面，如图38(B)所示，在肿瘤充分浸润的时期、即肿瘤进展的状态下，与克隆18LH CAR-T的给药组相比，L17-18H CAR-T或K5-18H CAR-T的给药组的总存活率大幅改善，L17-18H CAR-T给药组为100％的存活率。另外，虽未在图中示出，但基于图像分析仪的图像分析中也得到了同样的结果。
由这些结果可知，包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体内(in vivo)发挥抗肿瘤效果。另外，可知：包含利用使用了本发明的CAR文库的本发明的筛选方法而得到的scFv的CAR在体内(in vivo)在进展的肿瘤模型中也发挥充分的治疗效果。
[实施例15]
对根据本发明的筛选方法能够获得在体内(in vivo)的抗肿瘤效果优异的scFv的机理进行了研究。
(1)细胞增殖能力的比较
与上述实施例10同样地制备了L17-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T。接着，对于以20Gy照射了γ射线的APC-CD19(K562/CD19)或Raji细胞(Raji)(T)和L17-18H CAR-T或克隆18LH CAR-T(E)，以E：T成为1：1或10：1的方式在培养了上述CAR-T细胞的孔中添加靶细胞。以上述靶细胞添加时作为基准，培养5天。上述培养中，将10U/mL的IL-2和10ng/mL的IL-15添加至培养基中。进而，在培养第5天，在与培养开始时相同的条件下对各CAR-T细胞进行再刺激。此外，计数从培养开始时开始至规定时间(0天、3天、5天、7天或10天)的细胞数，计算出将培养开始时的细胞数设为1时的细胞数比作为增殖比。将这些结果示于图39。
图39是示出细胞的增殖比的图。图39中，横轴表示从培养开始时起的时间，纵轴表示增殖比。如图39所示，在任意的E：T比下，利用本发明的筛选方法得到的CAR的T细胞的增殖诱导能力均高。另外，即使在E：T＝1：1时，L17-18H CAR-T与克隆18LH CAR-T相比，也显示出优异的增殖比，因此可知即使在靶抗原多的环境、例如肿瘤进展、肿瘤细胞多的状态下，L17-18H CAR-T的增殖性也优异。
(2)细胞因子产生能力的比较
对上述实施例15的(1)的培养第10天的L17-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T的细胞因子产生能力进行了研究。具体而言，将3.0×105细胞的CAR-T细胞与5.0×104个靶细胞(K562细胞、Raji细胞、APC-CD19(K562/CD19)共培养。培养2小时后，以成为5μg/mL的方式添加布雷菲德菌素A(BFA)，进而，培养14～18小时。然后，回收CAR-T细胞后，用1％多聚甲醛(PFA)进行固定后，进行细胞膜的透明处理，用PE标记抗人TNF-α抗体(克隆MAb11)、APC标记抗人IL-2抗体(克隆MQ1-17H12)和PC7标记抗人IFN-γ抗体(克隆B27)、及PC5标记抗人CD8抗体(克隆B9.11)、FITC标记抗CD4抗体(克隆OKT4)和V450标记抗人NGFR(克隆：C40-1457)进行染色。对于上述染色后的CAR-T细胞，用上述流式细胞仪进行测定，计算出产生了各细胞因子的细胞的比例。将这些结果示于图40。
图40是示出细胞因子产生能力的图。图40中，横轴表示CAR-T细胞的种类，纵轴表示细胞因子产生细胞的比例，图的上半部分示出直至第10天为止的培养条件。如图40所示，可知：L17-18H CAR-T与克隆18LH CAR-T相比，对于任意的细胞因子，细胞因子产生细胞的比例均稍微低，即细胞因子产生能力稍微弱。
(3)细胞毒活性的比较
对上述实施例15的(1)的培养第10天的L17-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T的细胞毒活性进行了研究。接着，对于5.0×103个作为靶细胞的APC-CD19(K562/CD19)或Raji细胞(Raji)和K562细胞，在铬51(51Cr)的存在下培养1.5小时，由此用铬51进行了标记。
接着，对于上述L17-18H CAR-T或克隆18LH CAR-T(E)和上述用铬51标记的靶细胞(T)，以E：T成为10：1、5：1或2.5：1的方式在培养上述靶细胞的孔中添加各CAR-T细胞。此外，培养5～6小时后，回收上清液，使用AccuFLEXg7010测定了每分钟的辐射线的计数率(CPM：count per minute)。此外，基于上述式(1)，测定了细胞毒性(特异性裂解的比例)。将这些结果示于图41。
图41是示出细胞毒活性的图。图41中，横轴表示E：T比，纵轴表示细胞毒活性，图的上半部分示出直至第10天为止的培养条件。如图41所示，可知L17-18H CAR-T显示出与克隆18LH CAR-T同等的细胞毒活性。
(4)T细胞的疲劳的比较
使用4个不同的供体(人)来源的T细胞，除此以外与上述实施例10同样地制备了L17-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T。对于得到的CAR-T细胞，在包含0.5μmol/L CFSE的PBS内在37℃下进行15分钟孵育，用CFSE标记了CAR-T细胞。接着，对于以20Gy照射了γ射线的Raji细胞(Raji)(T)和L17-18H CAR-T或克隆18LH CAR-T(E)，以E：T成为1：1或5：1的方式分别添加至孔中。以上述靶细胞添加时作为基准，培养3天。
上述培养后，回收CAR-T细胞，用PE标记抗PD-1抗体(克隆EH12.2H7)、APC标记CD45RA抗体(克隆HI100)、PC7标记CCR7抗体(克隆G043H7)、BV421标记CD62L抗体(克隆DREG-56)、PC5标记CD8抗体(克隆B9.11)、APC-Cy7标记CD4抗体(克隆RPA-T4)染色后，利用流式细胞仪测定了荧光强度。由得到的CFSE的荧光强度的MFI，基于下述式(2)，计算出裂解的CAR-T细胞的比例。另外，图42示出共培养前后的CD8阳性CAR-T细胞和CD4阳性CAR-T细胞中的CD45RA/CD62L阳性细胞的分布。进而，图43示出：各CAR-T细胞的裂解比例、共培养前后的CD45RA阳性CD62L阳性CCR7阳性细胞的比例、CD45RA阴性CD62L阳性CCR7阳性、及CD45RA阳性CD62L阴性PD1阳性细胞的比例。
增殖(％)＝(对照MFI-样品MFI)/对照MFI×100…(2)
对照MFI：与K562细胞株以E：T＝1:1的条件共培养的CAR-T细胞的MFI样品MFI：各CAR-T细胞的MFI
图42是示出共培养前后的CD8阳性CAR-T细胞和CD4阳性CAR-T细胞中的CD45RA/CD62L阳性细胞的分布的点阵图。另外，图43是示出各CAR-T细胞的裂解比例、共培养前后的CD45RA阳性CD62L阳性CCR7阳性细胞的比例、及CD45RA阴性CD62L阳性CCR7阳性与CD45RA阳性CD62L阴性PD1阳性细胞的比例的图。如图42和图43所示，共培养前的L17-18H CAR-T和克隆18LH CAR-T的性状大致相同。另一方面，在被认为模仿了体内(in vivo)环境的肿瘤较多的环境下(Raji/CAR-T E/T 1:1)进行刺激时，L17-18H CAR-T与克隆18LH CAR-T相比，具有再现性且显示出优异的扩增性。进而明确了，在同样的环境下，L17-18H CAR-T与克隆18LHCAR-T相比，CD45RA+CD62L+CCR7+较年轻的T细胞形质容易得到保持；CD45RA-CD62L+CCR7+的中央记忆T细胞的比例增加；同时CD45RA+CD62L-PD1+疲劳的T细胞的比例降低。
由以上结果可知可推测，本发明的第1筛选方法通过以下那样的机理能够获得在体内(in vivo)的抗肿瘤效果优异的scFv。需要说明的是，本发明不受上述推测的任何限制。本发明的筛选方法中，如图44所示，导入了CAR文库的T细胞等免疫细胞(CAR文库细胞)在第1接触工序或第2接触工序中与靶抗原接触。由此，上述CAR文库细胞中，表达靶抗原特异性CAR的细胞增殖。其中，在上述第1接触工序和第2接触工序中，从每个scFv的氨基酸序列不同的CAR文库细胞来看，E/T比(ratio)处于极低的状态(图44步骤1)。其结果，L17-18HCAR-T那样具有在较低的E/T比下也容易扩增的特征的CAR文库细胞在上述第1接触工序和第2接触工序中最终被浓缩(图44步骤2)。此外，在富集了具有这种特征的CAR文库细胞的状态下，实施上述第1选择工序和第2选择工序，因此选择出具有在相对较低的E/T比下也容易扩增、且即使持续增殖也不易疲劳的特征的CAR文库细胞来源的scFv(图44步骤3)。另一方面，如L17-18H CAR-T所示，在较低的E/T比下也能扩增的CAR文库细胞显示出通常的细胞毒活性。因此，根据本发明的筛选方法，选择出显示优异的增殖能力、且具备显示细胞毒活性的scFv的CAR文库细胞，因此推测出能够筛选具备在体内(in vivo)也能赋予高抗肿瘤活性的scFv的CAR。需要说明的是，即使CAR的基本骨架发生变化也同样地发生上述机理，因此推测出即使使用具有除CD28和CD3ζ以外的细胞内结构域等的CAR进行筛选，也同样地能够获得在体内(in vivo)的抗肿瘤效果优异的scFv。
以上参照实施方式对本发明进行了说明，但本发明不限定于上述实施方式。可以在本发明的保护范围内对本发明的构成、详情进行本领域技术人员能理解的各种变更。
该申请主张以2019年2月4日申请的日本申请特愿2019-018269、2019年5月18日申请的日本申请特愿2019-094188、2019年7月30日申请的日本申请特愿2019-140121、及2019年10月4日申请的日本申请特愿2019-184071为基础的优先权，其公开的全部内容引入其中。
<附录>
如以下的附录所示，记载了上述的实施方式和实施例的一部分或全部，但不限定于以下内容。
(附录1)
一种CAR文库，其包含编码第1嵌合抗原受体(CAR)的核酸，
上述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，
上述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)，
上述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，
上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足下述条件1或条件2。
条件1：
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件2：
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(附录2)
根据附录1所述的CAR文库，其中，上述第1细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的细胞内信号转导结构域。
(附录3)
根据附录1或2所述的CAR文库，其中，上述第1跨膜结构域包含CD28的跨膜结构域。
(附录4)
根据附录1～3中任一项所述的CAR文库，其中，上述第1B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
(附录5)
一种scFv的制造方法(筛选方法)，其包括如下工序：
第1表达工序，使免疫细胞表达附录1～4中任一项所述的CAR文库；
第1接触工序，使上述第1表达工序中得到的免疫细胞与上述靶抗原接触；
第1选择工序，选择上述第1接触工序中与上述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第1scFv作为能与上述靶抗原结合的第1候选scFv。
(附录6)
根据附录5所述的制造方法(筛选方法)，其包括基于上述第1候选scFv来制备第2CAR文库的制备工序；
上述第2CAR文库包含编码第2CAR的核酸，
上述第2CAR包含第2抗原结合结构域、第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域，
上述第2抗原结合结构域包含能筛选与上述靶抗原的结合的第2scFv，
上述第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区，
上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足下述条件3或条件4，
所述制造方法(筛选方法)还包括如下工序：
第2表达工序，使免疫细胞表达上述第2CAR文库；
第2接触工序，使上述第2表达工序中得到的免疫细胞与上述靶抗原接触；及
第2选择工序，选择上述第2接触工序中与上述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第2scFv作为能与上述靶抗原结合的第2候选scFv，
条件3：
上述第1表达工序中的CAR文库满足上述条件1时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含上述第1候选scFv中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件4：
上述第1表达工序中的CAR文库满足上述条件2时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含上述第1候选scFv中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(附录7)
根据附录6所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其实施多次上述第2接触工序。
(附录8)
根据附录6或7所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述第2选择工序中，使用上述靶抗原的单体或多聚体检测能与上述靶抗原结合的免疫细胞，
选择检测出的免疫细胞所表达的scFv作为上述第2候选scFv。
(附录9)
根据附录6～8中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述第2B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
(附录10)
根据附录5～9中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其实施多次上述第1接触工序。
(附录11)
根据附录5～10中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，
上述第1选择工序中，使用上述靶抗原的单体或多聚体检测能与上述靶抗原结合的免疫细胞，
选择检测出的免疫细胞所表达的scFv作为上述第1候选scFv。
(附录12)
根据附录5～11中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述免疫细胞为T细胞。
(附录13)
一种针对HLA-A*02：01和NY-ESO-1157-165的复合体的抗体或其抗原结合片段，其包含下述(H)的重链可变区和下述(L)的轻链可变区，
(H)包含重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3的重链可变区
CDRH1是包含下述(H1)的氨基酸序列的多肽
CDRH2是包含下述(H2)的氨基酸序列的多肽
CDRH3是包含下述(H3)的氨基酸序列的多肽
(H1)下述(H1-1)、(H1-2)或(H1-3)的氨基酸序列
(H1-1)上述表1A的CDRH1中任意的氨基酸序列
(H1-2)相对于(H1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-3)在(H1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2)下述(H2-1)、(H2-2)或(H2-3)的氨基酸序列
(H2-1)上述表1A的CDRH2中任意的氨基酸序列
(H2-2)相对于(H2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-3)在(H2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3)下述(H3-1)、(H3-2)或(H3-3)的氨基酸序列
(H3-1)上述表1A的CDRH3中任意的氨基酸序列
(H3-2)相对于(H3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-3)在(H3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L)包含轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区
CDRL1是包含下述(L1)的氨基酸序列的多肽
CDRL2是包含下述(L2)的氨基酸序列的多肽
CDRL3是包含下述(L3)的氨基酸序列的多肽
(L1)下述(L1-1)、(L1-2)或(L1-3)的氨基酸序列
(L1-1)上述表1B的CDRL1中任意的氨基酸序列
(L1-2)相对于(L1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-3)在(L1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2)下述(L2-1)、(L2-2)或(L2-3)的氨基酸序列
(L2-1)上述表1B的CDRL2中任意的氨基酸序列
(L2-2)相对于(L2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-3)在(L2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3)下述(L3-1)、(L3-2)或(L3-3)的氨基酸序列
(L3-1)上述表1B的CDRL3中任意的氨基酸序列
(L3-2)相对于(L3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-3)在(L3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
(附录14)
根据附录13所述的抗体或其抗原结合片段，其中，上述重链可变区和上述轻链可变区的组合为上述表2中任意的组合。
(附录15)
一种嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域，
上述抗原结合结构域包含附录13或14所述的抗体或其抗原结合片段。
(附录16)
根据附录15所述的嵌合抗原受体，其中，上述抗原结合片段为单链抗体。
(附录17)
一种核酸，其编码附录15或16所述的嵌合抗原受体。
(附录18)
一种细胞，其包含附录15或16所述的嵌合抗原受体。
(附录19)
根据附录18所述的细胞，其中，上述细胞包含T细胞。
(附录20)
一种细胞的制造方法，其包括将附录17所述的核酸导入细胞中的导入工序。
(附录21)
根据附录20所述的细胞的制造方法，其中，上述细胞包含T细胞。
(附录22)
一种BsAb文库，其包含编码第1双特异性抗体(BsAb)的核酸，
上述第1BsAb包含第1抗原结合结构域和第2抗原结合结构域，
上述第1抗原结合结构域包含与第1靶抗原结合的第1单链抗体(scFv)，
上述第2抗原结合结构域包含能筛选与第2靶抗原的结合的第2scFv，
上述第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区，
上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足下述条件1或条件2，
上述第1靶抗原或上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体，
条件1：
上述第2重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述第2靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件2：
上述第2重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述第2靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(附录23)
根据附录22所述的BsAb文库，其中，上述第1B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
(附录24)
根据附录22或23所述的BsAb文库，其中，上述免疫细胞激活受体为CD3。
(附录25)
一种scFv的制造方法(筛选方法)，其包括如下工序：
第1准备工序，由附录22～24中任一项所述的BsAb文库准备第1BsAb；
第1接触工序，
上述第1靶抗原为免疫细胞激活受体时，
使上述第1BsAb与上述第2靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触，
上述第2靶抗原为免疫细胞激活受体时，
使上述第1BsAb与上述第1靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触；及
第1选择工序，选择在上述第1接触工序中与上述第2靶抗原结合的第1BsAb的第2scFv作为与上述第2靶抗原结合的第1候选scFv。
(附录26)
根据附录25所述的scFv制造方法(筛选方法)，其包括基于上述第1候选scFv制备第2BsAb文库的制备工序，
上述第2BsAb文库包含编码上述第2BsAb的核酸，
上述第2BsAb包含第3抗原结合结构域和第4抗原结合结构域，
上述第3抗原结合结构域包含与上述第1靶抗原结合的第3scFv，
上述第4抗原结合结构域包含能筛选与上述第2靶抗原的结合的第4scFv，
上述第4scFv包含第4重链可变区和第4轻链可变区，
上述第4重链可变区和上述第4轻链可变区满足下述条件3或条件4，
所述制造方法(筛选方法)还包括如下工序：
第2准备工序，由上述第2BsAb文库准备第2BsAb；及
第2接触工序，
上述第1靶抗原为上述免疫细胞激活受体时，
使上述第2BsAb与上述第2靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触，
上述第2靶抗原为上述免疫细胞激活受体时，
使上述第2BsAb与上述第1靶抗原与能表达上述免疫细胞激活受体的免疫细胞接触，
第2选择工序，选择在上述第2接触工序中与上述第2靶抗原结合的第2BsAb的第4scFv作为与上述第2靶抗原结合的第2候选scFv；
条件3：
上述第1准备工序中的BsAb文库满足上述条件1时，
上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含上述第1候选BsAb中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件4：
上述第1准备工序中的BsAb文库满足上述条件2时，
上述第4重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含上述第1候选BsAb中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第4轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(附录27)
根据附录26所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，将上述第2接触工序和上述第2选择工序作为一组，实施多次上述组。
(附录28)
根据附录26或27所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述第2选择工序中，对上述免疫细胞的激活分子的表达进行检测，
选择诱导了上述免疫细胞的激活分子的第2BsAb作为上述第2候选BsAb。
(附录29)
根据附录25～28中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述第2B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
(附录30)
根据附录25～29中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，将上述第1接触工序和上述第1选择工序作为一组，实施多次上述组。
(附录31)
根据附录25～30中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述第1选择工序中，对上述免疫细胞的激活分子的表达进行检测，
选择诱导了上述免疫细胞的激活分子的第1BsAb作为上述第1候选BsAb。
(附录32)
根据附录25～31中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述免疫细胞激活受体为CD3。
(附录33)
根据附录25～32中任一项所述的scFv的制造方法(筛选方法)，其中，上述免疫细胞为T细胞。
(附录34)
一种针对CD19的抗体或其抗原结合片段，其包含下述(H)的重链可变区和下述(L)的轻链可变区，
(H)包含重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3的重链可变区
CDRH1是包含下述(H1)的氨基酸序列的多肽
CDRH2是包含下述(H2)的氨基酸序列的多肽
CDRH3是包含下述(H3)的氨基酸序列的多肽
(H1)下述(H1-1)、(H1-2)或(H1-3)的氨基酸序列
(H1-1)上述表3A的CDRH1中任意的氨基酸序列
(H1-2)相对于(H1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H1-3)在(H1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H2)下述(H2-1)、(H2-2)或(H2-3)的氨基酸序列
(H2-1)上述表3A的CDRH2中任意的氨基酸序列
(H2-2)相对于(H2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H2-3)在(H2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(H3)下述(H3-1)、(H3-2)或(H3-3)的氨基酸序列
(H3-1)上述表3A的CDRH3中任意的氨基酸序列
(H3-2)相对于(H3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(H3-3)在(H3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L)包含轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区
CDRL1是包含下述(L1)的氨基酸序列的多肽
CDRL2是包含下述(L2)的氨基酸序列的多肽
CDRL3是包含下述(L3)的氨基酸序列的多肽
(L1)下述(L1-1)、(L1-2)或(L1-3)的氨基酸序列
(L1-1)上述表3B的CDRL1中任意的氨基酸序列
(L1-2)相对于(L1-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L1-3)在(L1-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L2)下述(L2-1)、(L2-2)或(L2-3)的氨基酸序列
(L2-1)上述表3B的CDRL2中任意的氨基酸序列
(L2-2)相对于(L2-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L2-3)在(L2-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列
(L3)下述(L3-1)、(L3-2)或(L3-3)的氨基酸序列
(L3-1)上述表3B的CDRL3中任意的氨基酸序列
(L3-2)相对于(L3-1)的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列
(L3-3)在(L3-1)的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。
(附录35)
根据附录34所述的抗体或其抗原结合片段，其中，上述重链可变区和上述轻链可变区的组合为上述表2中任意的组合。
(附录36)
一种嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导结构域，
上述抗原结合结构域包含附录34或35所述的抗体或其抗原结合片段。
(附录37)
根据附录36所述的嵌合抗原受体，其中，上述抗原结合片段为单链抗体。
(附录38)
一种核酸，其编码附录36或37所述的嵌合抗原受体。
(附录39)
一种细胞，其包含附录36或37所述的嵌合抗原受体。
(附录40)
根据附录39所述的细胞，其中，上述细胞包含T细胞。
(附录41)
一种细胞的制造方法，其包括将附录38所述的核酸导入细胞中的导入工序。
(附录42)
根据附录41所述的细胞的制造方法，其中，上述细胞包含T细胞。
(附录43)
一种scFv的制造方法，其包括如下工序：
第1给予工序，向动物给予第1嵌合抗原受体(CAR)文库的表达细胞；及
第1收集工序，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第1CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，
上述第1CAR文库包含编码第1CAR的核酸，
上述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，
上述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原结合的第1单链抗体(scFv)，
上述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，
上述第1重链可变区和上述第1轻链可变区满足下述条件1或条件2：
(条件1)
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
(条件2)
上述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与上述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(附录44)
根据附录43所述的制造方法，其中，上述第1给予工序中，给予多种第1CAR文库表达细胞。
(附录45)
根据附录43或44所述的制造方法，其包括如下第1刺激工序：在上述第1给予工序后，向上述动物给予上述靶抗原。
(附录46)
根据附录43～45中任一项所述的制造方法，其包括如下第1再刺激工序：用上述靶抗原对表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞进行再刺激。
(附录47)
根据附录43～46中任一项所述的制造方法，其包括如下第1形成工序：在上述第1给予工序之前，将表达靶抗原的细胞导入上述动物中并形成表达上述靶抗原的组织。
(附录48)
根据附录43～47中任一项所述的制造方法，其中，收集所表达的组织中积累的上述第1CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。
(附录49)
根据附录43～48中任一项所述的制造方法，其中，上述第1B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
(附录50)
根据附录43～49中任一项所述的制造方法，其包括如下工序：
第2给予工序，向动物给予第2CAR文库的表达细胞；及
第2收集工序，收集在上述动物中的表达靶抗原的组织中积累的上述第2CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞，
上述第2CAR文库包含编码第2CAR的核酸，
上述第2CAR包含第2抗原结合结构域、第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域，
上述第2抗原结合结构域包含能筛选与上述靶抗原的结合的第2scFv，
上述第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区，
上述第2重链可变区和上述第2轻链可变区满足下述条件3或条件4：
(条件3)
上述第1CAR文库满足上述条件1时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞的scFv中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
(条件4)
上述第1CAR文库满足上述条件2时，
上述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞的scFv中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
上述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
(附录51)
根据附录50所述的制造方法，其中，上述第2给予工序中，给予多种第2CAR文库表达细胞。
(附录52)
根据附录50或51所述的制造方法，其包括如下第2刺激工序：在上述第2给予工序后向上述动物给予上述靶抗原。
(附录53)
根据附录50～52中任一项所述的制造方法，其包括如下第1再刺激工序：用上述靶抗原对表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞进行再刺激。
(附录54)
根据附录50～53中任一项所述的制造方法，其包括如下第2形成工序：在上述第2给予工序之前，将表达靶抗原的细胞导入上述动物中并形成表达上述靶抗原的组织。
(附录55)
根据附录50～54中任一项所述的制造方法，其中，在上述第2收集工序中，收集表达上述靶抗原的组织，收集表达上述靶抗原的组织中积累的上述第2CAR文库表达细胞作为表达上述靶抗原特异性的CAR的细胞。
(附录56)
根据附录50～55中任一项所述的制造方法，其中，上述第2B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
(附录57)
根据附录43～56中任一项所述的制造方法，其中，上述表达细胞为T细胞。
(附录58)
根据附录43～57中任一项所述的制造方法，其中，上述靶抗原为肿瘤抗原。
(附录59)
根据附录43～58中任一项所述的制造方法，其中，上述动物为非人动物。
(附录60)
根据附录43～59中任一项所述的制造方法，其中，上述动物为免疫抑制动物。
产业上的可利用性
如以上说明所述，根据本发明，可以提供用于筛选能在CAR-T细胞中发挥作用的scFv的CAR文库、及使用了其的scFv的筛选方法。因此，可以说本发明在药物领域等中是极其有用的。
序列表
<110> 国立大学法人爱媛大学（Ehime University）
<120> CAR文库和scFv的制造方法
<130> TF17216WO
<150> JP2019-018269
<151> 2019-02-04
<150> JP2019-094188
<151> 2019-05-18
<150> JP2019-140121
<151> 2019-07-30
<150> JP2019-184071
<151> 2019-10-04
<160> 324
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FV连接子1
<400> 1
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FV连接子2
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FV连接子1
<400> 3
ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga tctggcgagg gaagcaccaa gggc 54
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FV连接子2
<400> 4
ggtggaggag gctcaggagg aggtggctct ggtggtggag gctcg 45
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
ttctgggtgc tggtggtcgt gggcggagtg ctggcctgtt atagcctgct cgtgaccgtg 60
gccttcatca tcttttgggt g 81
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
atcgaagtga tgtacccccc tccctacctg gacaacgaga agtccaacgg caccattatc 60
cacgtgaagg gaaagcacct gtgccccagc cctctgttcc ctggccctag caagcctttc 120
tgggtgctgg tggtcgtggg cggagtgctg gcctgttata gcctgctcgt gaccgtggcc 180
ttcatcatct tttgggtgcg cagcaagcgg agccggctgc tgcacagcga ctacatgaac 240
atgaccccca gacggcccgg acccaccaga aagcactacc agccttacgc ccctcccaga 300
gacttcgccg cctacagatc t 321
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Arg Val Lys Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
1 5 10 15
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
20 25 30
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
35 40 45
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
50 55 60
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 10
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
cgagtgaaga gcagaagcgc cgacgcccct gcctatcagc agggccagaa ccagctgtac 60
aacgagctga acctgggcag acgggaagag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggcagg 120
gaccctgaga tgggcggcaa gcccagaaga aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa 180
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggaga 240
agaggcaagg gccacgatgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctat 300
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 333
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<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
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<211> 123
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
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ggacccacca gaaagcacta ccagccttac gcccctccca gagacttcgc cgcctacaga 120
tct 123
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
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35
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<213> 智人(Homo sapiens)
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cacgtgaagg gaaagcacct gtgccccagc cctctgttcc ctggccctag caagcct 117
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<222> (1)..(1)
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<220>
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tgctggtggt cgtgggcgga gtgctggcct gttatagcct gctcgtgacc gtggccttca 240
tcatcttttg ggtgcgcagc aagcggagcc ggctgctgca cagcgactac atgaacatga 300
cccccagacg gcccggaccc accagaaagc actaccagcc ttacgcccct cccagagact 360
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
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Thr Val Thr Val Ser Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asp Val Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
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Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
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Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Ala Ala Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
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1 5
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Val Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Glu Phe
1 5
<210> 75
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
Asp Val Ile
1
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Val
1 5 10
<210> 77
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Glu Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Val Ile Glu Arg Pro Phe Gly Val Ser Tyr Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Gly Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
Gly Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 79
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
Asp Val Ser
1
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
Ser Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Trp Val
1 5 10
<210> 81
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Ile Ile Arg Asp Val Ser Val Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Gly Ser
85 90 95
Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu
1 5
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
Asp Val Ser
1
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Phe Ala Val
1 5 10
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Tyr Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Phe Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 87
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Asp Val Ser
1
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Cys Ser Tyr Ala Gly Gly Tyr Tyr Val
1 5
<210> 89
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
Gln Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Gly
85 90 95
Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 91
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
Asp Val Ser
1
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Pro Phe Val
1 5 10
<210> 93
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Thr Pro Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 95
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Asp Val Ser
1
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Cys Ser Tyr Ala Gly Arg Arg Tyr Val
1 5
<210> 97
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Arg Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ala Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Arg
85 90 95
Arg Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 98
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg
180 185 190
Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
225 230 235 240
Asp Val Thr Val Leu
245
<210> 99
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 100
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Arg Arg
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 101
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 102
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 102
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 103
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro
85 90 95
Cys Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp
145 150 155 160
Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His
165 170 175
Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
180 185 190
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
195 200 205
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu
210 215 220
Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 104
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr
180 185 190
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser
195 200 205
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 105
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 106
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val Ser
165 170 175
Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr
180 185 190
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser
195 200 205
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 107
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 108
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 109
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 109
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Val Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Ser Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gln
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 110
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 110
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro
130 135 140
Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr
145 150 155 160
Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Phe Val Ser Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln His Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Asp Val Asn Asn
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Ser Val Phe Gly Thr Gly
225 230 235 240
Thr Lys Val Thr Val Leu
245
<210> 111
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 111
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Glu Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Asp Val Ile Glu Arg Pro Phe Gly Val Ser Tyr Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Gly Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
145 150 155 160
Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 112
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 112
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Ile Ile Arg Asp Val Ser Val Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Gly Ser
85 90 95
Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
145 150 155 160
Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 113
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 113
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Tyr Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Phe Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 114
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 114
Gln Ser Ala Leu Pro Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Gly
85 90 95
Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gln
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 115
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 115
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Thr Pro Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
130 135 140
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
145 150 155 160
Thr Tyr Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 116
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 116
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Arg Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ala Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Arg
85 90 95
Arg Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gln
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 117
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原结合结构域
<400> 117
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Cys Pro Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg
180 185 190
Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
225 230 235 240
Asp Val Thr Val Leu
245
<210> 118
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 118
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg
180 185 190
Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
225 230 235 240
Asp Val Thr Val Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro
245 250 255
Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
260 265 270
Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
<210> 119
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
245 250 255
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
260 265 270
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
275 280 285
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
290 295 300
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
305 310 315 320
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
325 330 335
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
340 345 350
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 120
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 120
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
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Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
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Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
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Arg
465
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<211> 465
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 126
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
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Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
245 250 255
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
260 265 270
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
275 280 285
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
290 295 300
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355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
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Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
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<400> 128
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
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Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Trp Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Val
165 170 175
Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val
180 185 190
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
195 200 205
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
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Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
260 265 270
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
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Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
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Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
305 310 315 320
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Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
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Arg
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<220>
<223> 嵌合抗原受体
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
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Leu Pro Pro Arg
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 136
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Arg Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ala Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Arg
85 90 95
Arg Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gln
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro
245 250 255
Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys
260 265 270
Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 137
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 137
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Cys Pro Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg
180 185 190
Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
225 230 235 240
Asp Val Thr Val Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro
245 250 255
Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
260 265 270
Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
<210> 138
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 138
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggatac cctgtccctc 60
acctgtcttg tctctggtgg ctccatcagt agtaattact ggagctggat ccggcaggcc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggacat gtctcctaca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt taccatatca gtagacacgt ctaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgactgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagtcctac 300
tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggctct 360
acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc gagggaagca ccaagggcca gagcgagctg 420
acacagccta gatccgtgtc tggcagccct ggccagagcg tgaccatcag ctgtaccggc 480
accagcagag atgtgggcgg ctacaactac gtgtcctggt atcagcagca tcccggcaag 540
gcccccaagc tgatcatcca cgacgtgatc gagcggagca gcggcgtgcc cgatagattc 600
agcggcagca agagcggcaa caccgccagc ctgacaatca gcggactgca ggccgaggac 660
gaggccgact actactgttg gagcttcgcc ggcagctact acgtgttcgg caccggcacc 720
gatgtgaccg tgctggcggc cgcaatcgaa gtgatgtacc cccctcccta cctggacaac 780
gagaagtcca acggcaccat tatccacgtg aagggaaagc acctgtgccc cagccctctg 840
ttccctggcc ctagcaagcc tttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt 900
tatagcctgc tcgtgaccgt ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa gcggagccgg 960
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc cccagacggc ccggacccac cagaaagcac 1020
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctaca gatctcgagt gaagttcagc 1080
agaagcgccg acgcccctgc ctatcagcag ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1140
ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggcaggga ccctgagatg 1200
ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1260
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggagaag aggcaagggc 1320
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctatga cgccctgcac 1380
atgcaggccc tgccccccag a 1401
<210> 139
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 139
gacatccaga tgacccagtc tccatctgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcagcaa tattatagta ctcctcaaac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 420
gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
tggatccggc aggccccagg gaagggactg gagtggattg gacatgtctc ctacagtggg 540
agcaccaact acaacccctc cctcaagagt cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag 600
aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg actgccgcgg acacggccgt gtattactgt 660
gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga aagcacctgt gccccagccc tctgttccct 840
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gacccccaga cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag 1020
ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc 1080
gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1140
agacgggaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gggaccctga gatgggcggc 1200
aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1260
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat 1320
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct atgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc ccaga 1395
<210> 140
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 140
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaagca 120
gggaaagccc ctaagcttct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct 240
gaagatgttg caacctatta ctgccaacag tatgaaagtt atcgaaggtc gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 420
gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
tggatccggc aggccccagg gaagggactg gagtggattg gacatgtctc ctacagtggg 540
agcaccaact acaacccctc cctcaagagt cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag 600
aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg actgccgcgg acacggccgt gtattactgt 660
gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga aagcacctgt gccccagccc tctgttccct 840
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gacccccaga cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag 1020
ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc 1080
gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1140
agacgggaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gggaccctga gatgggcggc 1200
aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1260
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat 1320
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct atgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc ccaga 1395
<210> 141
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 141
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcccggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 420
gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
tggatccggc aggccccagg gaagggactg gagtggattg gacatgtctc ctacagtggg 540
agcaccaact acaacccctc cctcaagagt cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag 600
aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg actgccgcgg acacggccgt gtattactgt 660
gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga aagcacctgt gccccagccc tctgttccct 840
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gacccccaga cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag 1020
ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc 1080
gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1140
agacgggaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gggaccctga gatgggcggc 1200
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gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat 1320
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct atgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc ccaga 1395
<210> 142
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 142
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagat tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcccggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 420
gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
tggatccggc aggccccagg gaagggactg gagtggattg gacatgtctc ctacagtggg 540
agcaccaact acaacccctc cctcaagagt cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag 600
aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg actgccgcgg acacggccgt gtattactgt 660
gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga aagcacctgt gccccagccc tctgttccct 840
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gacccccaga cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag 1020
ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc 1080
gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1140
agacgggaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gggaccctga gatgggcggc 1200
aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1260
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat 1320
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct atgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc ccaga 1395
<210> 143
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 143
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gctctatgct gcatccagat tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctccgtg cactttcggc 300
cctgggacca aagtggatat caaaggctct acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc 360
gagggaagca ccaagggcca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 420
tcggataccc tgtccctcac ctgtcttgtc tctggtggct ccatcagtag taattactgg 480
agctggatcc ggcaggcccc agggaaggga ctggagtgga ttggacatgt ctcctacagt 540
gggagcacca actacaaccc ctccctcaag agtcgagtta ccatatcagt agacacgtct 600
aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgactgccg cggacacggc cgtgtattac 660
tgtgcgagag agtcctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 720
accgtctcct cagcggccgc aatcgaagtg atgtaccccc ctccctacct ggacaacgag 780
aagtccaacg gcaccattat ccacgtgaag ggaaagcacc tgtgccccag ccctctgttc 840
cctggcccta gcaagccttt ctgggtgctg gtggtcgtgg gcggagtgct ggcctgttat 900
agcctgctcg tgaccgtggc cttcatcatc ttttgggtgc gcagcaagcg gagccggctg 960
ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc agacggcccg gacccaccag aaagcactac 1020
cagccttacg cccctcccag agacttcgcc gcctacagat ctcgagtgaa gttcagcaga 1080
agcgccgacg cccctgccta tcagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1140
ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac aagcggagag gcagggaccc tgagatgggc 1200
ggcaagccca gaagaaagaa cccccaggaa ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag 1260
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc ggagaagagg caagggccac 1320
gatggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc cctgcacatg 1380
caggccctgc cccccaga 1398
<210> 144
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 144
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtctcc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacattagc aggtatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gctctatgct gcatccagat tggaaagtgg ggtcccatcc 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcaccag cctgcagcct 240
gatgactttg caacttatta ctgccaacag tatgataatc tgatcacctt cggccaaggg 300
acacgactgg agattaaagg ctctacaagc ggctctggca agcctggatc tggcgaggga 360
agcaccaagg gccaggtgca gctgcaggag tcgggcccag gactggtgaa gccttcggat 420
accctgtccc tcacctgtct tgtctctggt ggctccatca gtagtaatta ctggagctgg 480
atccggcagg ccccagggaa gggactggag tggattggac atgtctccta cagtgggagc 540
accaactaca acccctccct caagagtcga gttaccatat cagtagacac gtctaagaac 600
cagttctccc tgaagctgag ctctgtgact gccgcggaca cggccgtgta ttactgtgcg 660
agagagtcct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720
tcctcagcgg ccgcaatcga agtgatgtac ccccctccct acctggacaa cgagaagtcc 780
aacggcacca ttatccacgt gaagggaaag cacctgtgcc ccagccctct gttccctggc 840
cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtc gtgggcggag tgctggcctg ttatagcctg 900
ctcgtgaccg tggccttcat catcttttgg gtgcgcagca agcggagccg gctgctgcac 960
agcgactaca tgaacatgac ccccagacgg cccggaccca ccagaaagca ctaccagcct 1020
tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac agatctcgag tgaagttcag cagaagcgcc 1080
gacgcccctg cctatcagca gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1140
cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggcaggg accctgagat gggcggcaag 1200
cccagaagaa agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1260
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggagaa gaggcaaggg ccacgatggc 1320
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctatg acgccctgca catgcaggcc 1380
ctgcccccca ga 1392
<210> 145
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 145
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtctcc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacattagc aggtatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gctctatgct gcatccagat tggaaagtgg ggtcccatcc 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcaccag cctgcagcct 240
gatgactttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attcccggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 420
gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
tggatccggc aggccccagg gaagggactg gagtggattg gacatgtctc ctacagtggg 540
agcaccaact acaacccctc cctcaagagt cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag 600
aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg actgccgcgg acacggccgt gtattactgt 660
gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga aagcacctgt gccccagccc tctgttccct 840
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gacccccaga cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag 1020
ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc 1080
gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1140
agacgggaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gggaccctga gatgggcggc 1200
aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1260
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat 1320
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct atgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc ccaga 1395
<210> 146
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 146
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcaccag cctgcagcct 240
gatgactttg caacttatta ctgccaacag tatgataatc tgatcacctt cggccaaggg 300
acacgactgg agattaaagg ctctacaagc ggctctggca agcctggatc tggcgaggga 360
agcaccaagg gccaggtgca gctgcaggag tcgggcccag gactggtgaa gccttcggat 420
accctgtccc tcacctgtct tgtctctggt ggctccatca gtagtaatta ctggagctgg 480
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accaactaca acccctccct caagagtcga gttaccatat cagtagacac gtctaagaac 600
cagttctccc tgaagctgag ctctgtgact gccgcggaca cggccgtgta ttactgtgcg 660
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tcctcagcgg ccgcaatcga agtgatgtac ccccctccct acctggacaa cgagaagtcc 780
aacggcacca ttatccacgt gaagggaaag cacctgtgcc ccagccctct gttccctggc 840
cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtc gtgggcggag tgctggcctg ttatagcctg 900
ctcgtgaccg tggccttcat catcttttgg gtgcgcagca agcggagccg gctgctgcac 960
agcgactaca tgaacatgac ccccagacgg cccggaccca ccagaaagca ctaccagcct 1020
tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac agatctcgag tgaagttcag cagaagcgcc 1080
gacgcccctg cctatcagca gggccagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1140
cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggcaggg accctgagat gggcggcaag 1200
cccagaagaa agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1260
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ctgcccccca ga 1392
<210> 147
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 147
gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
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gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
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gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
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ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
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gccctgcccc ccaga 1395
<210> 148
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 148
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaagca 120
gggaaagccc ctaagcttct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctg cctgcagtct 240
gaagatgttg caacctatta ctgccaacag tatgaaagtt attcccggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 420
gataccctgt ccctcacctg tcttgtctct ggtggctcca tcagtagtaa ttactggagc 480
tggatccggc aggccccagg gaagggactg gagtggattg gacatgtctc ctacagtggg 540
agcaccaact acaacccctc cctcaagagt cgagttacca tatcagtaga cacgtctaag 600
aaccagttct ccctgaagct gagctctgtg actgccgcgg acacggccgt gtattactgt 660
gcgagagagt cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 720
gtctcctcag cggccgcaat cgaagtgatg tacccccctc cctacctgga caacgagaag 780
tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga aagcacctgt gccccagccc tctgttccct 840
ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc 900
ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gacccccaga cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag 1020
ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc 1080
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agacgggaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gggaccctga gatgggcggc 1200
aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1260
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ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct atgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc ccaga 1395
<210> 149
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 149
cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttatgact ttgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggcg aagcccccaa actcctcgtt tatgatgtca ataaccggcc ctcaggggtt 180
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caggctgagg acgagggtga ctattactgc agctcatatg caggcagcaa cagcgtcttc 300
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cctggcggat ctctgagact gagctgtgcc gccagcggct tcaccttcag cacctaccag 480
atgagctggg tgcgccaggc ccctggcaaa ggactggaat gggtgtccgg catcgtgtcc 540
agcggcggct ctacagccta cgccgatagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 600
aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactattgtg ccggggagct gctgccctac tacggcatgg atgtgtgggg ccagggcacc 720
accgtgacag tgtcctcagc ggccgcaatc gaagtgatgt acccccctcc ctacctggac 780
aacgagaagt ccaacggcac cattatccac gtgaagggaa agcacctgtg ccccagccct 840
ctgttccctg gccctagcaa gcctttctgg gtgctggtgg tcgtgggcgg agtgctggcc 900
tgttatagcc tgctcgtgac cgtggccttc atcatctttt gggtgcgcag caagcggagc 960
cggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagac ggcccggacc caccagaaag 1020
cactaccagc cttacgcccc tcccagagac ttcgccgcct acagatctcg agtgaagttc 1080
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cacatgcagg ccctgccccc caga 1404
<210> 150
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 150
gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctaccaga tgagctgggt gcgccaggcc 120
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ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cggggagctg 300
ctgccctact acggcatgga tgtgtggggc cagggcacca ccgtgacagt gtcctcaggc 360
tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct ggcgagggaa gcaccaaggg ccagtctgcc 420
ctgactcagc ctccctccgc gtccgggtct cctggacagt cagtcaccat ctcctgcact 480
ggaaccagca gtgacgttgg tggttatgac tttgtctcct ggtaccaaca gcacccaggc 540
gaagccccca aactcctcgt ttatgatgtc aataaccggc cctcaggggt ttctaatcgc 600
ttctctggct ccaagtctgg caacacggcc tccctgacca tctctgggct ccaggctgag 660
gacgagggtg actattactg cagctcatat gcaggcagca acagcgtctt cggaactggg 720
accaaggtca ccgtcctagc ggccgcaatc gaagtgatgt acccccctcc ctacctggac 780
aacgagaagt ccaacggcac cattatccac gtgaagggaa agcacctgtg ccccagccct 840
ctgttccctg gccctagcaa gcctttctgg gtgctggtgg tcgtgggcgg agtgctggcc 900
tgttatagcc tgctcgtgac cgtggccttc atcatctttt gggtgcgcag caagcggagc 960
cggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagac ggcccggacc caccagaaag 1020
cactaccagc cttacgcccc tcccagagac ttcgccgcct acagatctcg agtgaagttc 1080
agcagaagcg ccgacgcccc tgcctatcag cagggccaga accagctgta caacgagctg 1140
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gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcggag aagaggcaag 1320
ggccacgatg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta tgacgccctg 1380
cacatgcagg ccctgccccc caga 1404
<210> 151
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 151
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg ggaccagcag tgacgttggt ggttatgaat ttgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca gcgcccccaa actcattatt tatgacgtaa tagagcgtcc cttcggtgtc 180
tcctatcggt tctctgcctc caagtcaggc aacacggcct ccctgacgat ctctgggctc 240
cagggtgaag acgaggctga ttacttctgc agctcatata caagcagcag cacttatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga 360
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cagcctggcg gatctctgag actgagctgt gccgccagcg gcttcacctt cagcacctac 480
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gacaacgaga agtccaacgg caccattatc cacgtgaagg gaaagcacct gtgccccagc 840
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ctgcacatgc aggccctgcc ccccaga 1407
<210> 152
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 152
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccggcag tgacgttggt gcttatgact atgtctcctg gtaccaacat 120
cacccaggca gagcccccag actcatcatt cgtgatgtca gtgtgcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc tcctcatatt caggcagcag cacttgggtg 300
ttcggcgggg ggaccaagct gaccgtccta ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga 360
tctggcgagg gaagcaccaa gggcgaagtg cagctgctgg aatctggcgg cggactggtg 420
cagcctggcg gatctctgag actgagctgt gccgccagcg gcttcacctt cagcacctac 480
cagatgagct gggtgcgcca ggcccctggc aaaggactgg aatgggtgtc cggcatcgtg 540
tccagcggcg gctctacagc ctacgccgat agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg 600
gacaacagca agaacaccct gtacctgcag atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc 660
gtgtactatt gtgccgggga gctgctgccc tactacggca tggatgtgtg gggccagggc 720
accaccgtga cagtgtcctc agcggccgca atcgaagtga tgtacccccc tccctacctg 780
gacaacgaga agtccaacgg caccattatc cacgtgaagg gaaagcacct gtgccccagc 840
cctctgttcc ctggccctag caagcctttc tgggtgctgg tggtcgtggg cggagtgctg 900
gcctgttata gcctgctcgt gaccgtggcc ttcatcatct tttgggtgcg cagcaagcgg 960
agccggctgc tgcacagcga ctacatgaac atgaccccca gacggcccgg acccaccaga 1020
aagcactacc agccttacgc ccctcccaga gacttcgccg cctacagatc tcgagtgaag 1080
ttcagcagaa gcgccgacgc ccctgcctat cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag 1140
ctgaacctgg gcagacggga agagtacgac gtgctggaca agcggagagg cagggaccct 1200
gagatgggcg gcaagcccag aagaaagaac ccccaggaag gcctgtataa cgaactgcag 1260
aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagcg gagaagaggc 1320
aagggccacg atggcctgta ccagggcctg agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgcc 1380
ctgcacatgc aggccctgcc ccccaga 1407
<210> 153
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 153
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggg agttataacc ttgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tcttatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactttcgcg 300
gtgttcggcg gagggaccca gctgaccgtc ctcggctcta caagcggctc tggcaagcct 360
ggatctggcg agggaagcac caagggcgaa gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg 420
gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc 480
taccagatga gctgggtgcg ccaggcccct ggcaaaggac tggaatgggt gtccggcatc 540
gtgtccagcg gcggctctac agcctacgcc gatagcgtga agggccggtt caccatcagc 600
cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc 660
gccgtgtact attgtgccgg ggagctgctg ccctactacg gcatggatgt gtggggccag 720
ggcaccaccg tgacagtgtc ctcagcggcc gcaatcgaag tgatgtaccc ccctccctac 780
ctggacaacg agaagtccaa cggcaccatt atccacgtga agggaaagca cctgtgcccc 840
agccctctgt tccctggccc tagcaagcct ttctgggtgc tggtggtcgt gggcggagtg 900
ctggcctgtt atagcctgct cgtgaccgtg gccttcatca tcttttgggt gcgcagcaag 960
cggagccggc tgctgcacag cgactacatg aacatgaccc ccagacggcc cggacccacc 1020
agaaagcact accagcctta cgcccctccc agagacttcg ccgcctacag atctcgagtg 1080
aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc tatcagcagg gccagaacca gctgtacaac 1140
gagctgaacc tgggcagacg ggaagagtac gacgtgctgg acaagcggag aggcagggac 1200
cctgagatgg gcggcaagcc cagaagaaag aacccccagg aaggcctgta taacgaactg 1260
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggagaaga 1320
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gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga 1410
<210> 154
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 154
caatctgccc tgcctcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggttc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttatttctgc tgttcgtatg caggcggcta ttatgtcttc 300
ggaactggga ccaagctgac cgtcctaggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgcag ctgctggaat ctggcggcgg actggtgcag 420
cctggcggat ctctgagact gagctgtgcc gccagcggct tcaccttcag cacctaccag 480
atgagctggg tgcgccaggc ccctggcaaa ggactggaat gggtgtccgg catcgtgtcc 540
agcggcggct ctacagccta cgccgatagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 600
aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactattgtg ccggggagct gctgccctac tacggcatgg atgtgtgggg ccagggcacc 720
accgtgacag tgtcctcagc ggccgcaatc gaagtgatgt acccccctcc ctacctggac 780
aacgagaagt ccaacggcac cattatccac gtgaagggaa agcacctgtg ccccagccct 840
ctgttccctg gccctagcaa gcctttctgg gtgctggtgg tcgtgggcgg agtgctggcc 900
tgttatagcc tgctcgtgac cgtggccttc atcatctttt gggtgcgcag caagcggagc 960
cggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagac ggcccggacc caccagaaag 1020
cactaccagc cttacgcccc tcccagagac ttcgccgcct acagatctcg agtgaagttc 1080
agcagaagcg ccgacgcccc tgcctatcag cagggccaga accagctgta caacgagctg 1140
aacctgggca gacgggaaga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggcag ggaccctgag 1200
atgggcggca agcccagaag aaagaacccc caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa 1260
gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcggag aagaggcaag 1320
ggccacgatg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta tgacgccctg 1380
cacatgcagg ccctgccccc caga 1404
<210> 155
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 155
cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
cagactgagg acgaggctga ttactattgc agctcatatg caggcagcgg cagcaccccc 300
tttgtcttcg gaactgggac caagctgacc gtcctaggct ctacaagcgg ctctggcaag 360
cctggatctg gcgagggaag caccaagggc gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga 420
ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc 480
acctaccaga tgagctgggt gcgccaggcc cctggcaaag gactggaatg ggtgtccggc 540
atcgtgtcca gcggcggctc tacagcctac gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc 600
agccgggaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgag agccgaggac 660
accgccgtgt actattgtgc cggggagctg ctgccctact acggcatgga tgtgtggggc 720
cagggcacca ccgtgacagt gtcctcagcg gccgcaatcg aagtgatgta cccccctccc 780
tacctggaca acgagaagtc caacggcacc attatccacg tgaagggaaa gcacctgtgc 840
cccagccctc tgttccctgg ccctagcaag cctttctggg tgctggtggt cgtgggcgga 900
gtgctggcct gttatagcct gctcgtgacc gtggccttca tcatcttttg ggtgcgcagc 960
aagcggagcc ggctgctgca cagcgactac atgaacatga cccccagacg gcccggaccc 1020
accagaaagc actaccagcc ttacgcccct cccagagact tcgccgccta cagatctcga 1080
gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct gcctatcagc agggccagaa ccagctgtac 1140
aacgagctga acctgggcag acgggaagag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggcagg 1200
gaccctgaga tgggcggcaa gcccagaaga aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa 1260
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggaga 1320
agaggcaagg gccacgatgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctat 1380
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1413
<210> 156
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 156
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaagggtc 180
cctgatcgct tcgctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgaag acgaggctga ttattactgc tgctcatatg ccggcagacg ttatgtgttc 300
ggaactggga ccaagctgac cgtcctaggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgcag ctgctggaat ctggcggcgg actggtgcag 420
cctggcggat ctctgagact gagctgtgcc gccagcggct tcaccttcag cacctaccag 480
atgagctggg tgcgccaggc ccctggcaaa ggactggaat gggtgtccgg catcgtgtcc 540
agcggcggct ctacagccta cgccgatagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 600
aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactattgtg ccggggagct gctgccctac tacggcatgg atgtgtgggg ccagggcacc 720
accgtgacag tgtcctcagc ggccgcaatc gaagtgatgt acccccctcc ctacctggac 780
aacgagaagt ccaacggcac cattatccac gtgaagggaa agcacctgtg ccccagccct 840
ctgttccctg gccctagcaa gcctttctgg gtgctggtgg tcgtgggcgg agtgctggcc 900
tgttatagcc tgctcgtgac cgtggccttc atcatctttt gggtgcgcag caagcggagc 960
cggctgctgc acagcgacta catgaacatg acccccagac ggcccggacc caccagaaag 1020
cactaccagc cttacgcccc tcccagagac ttcgccgcct acagatctcg agtgaagttc 1080
agcagaagcg ccgacgcccc tgcctatcag cagggccaga accagctgta caacgagctg 1140
aacctgggca gacgggaaga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggcag ggaccctgag 1200
atgggcggca agcccagaag aaagaacccc caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa 1260
gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcggag aagaggcaag 1320
ggccacgatg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta tgacgccctg 1380
cacatgcagg ccctgccccc caga 1404
<210> 157
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体的核苷酸
<400> 157
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ctaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgactgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gtgccctatc 300
tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggctct 360
acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc gagggaagca ccaagggcca gagcgagctg 420
acacagccta gatccgtgtc tggcagccct ggccagagcg tgaccatcag ctgtaccggc 480
accagcagag atgtgggcgg ctacaactac gtgtcctggt atcagcagca tcccggcaag 540
gcccccaagc tgatcatcca cgacgtgatc gagcggagca gcggcgtgcc cgatagattc 600
agcggcagca agagcggcaa caccgccagc ctgacaatca gcggactgca ggccgaggac 660
gaggccgact actactgttg gagcttcgcc ggcagctact acgtgttcgg caccggcacc 720
gatgtgaccg tgctggcggc cgcaatcgaa gtgatgtacc cccctcccta cctggacaac 780
gagaagtcca acggcaccat tatccacgtg aagggaaagc acctgtgccc cagccctctg 840
ttccctggcc ctagcaagcc tttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt 900
tatagcctgc tcgtgaccgt ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa gcggagccgg 960
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc cccagacggc ccggacccac cagaaagcac 1020
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctaca gatctcgagt gaagttcagc 1080
agaagcgccg acgcccctgc ctatcagcag ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1140
ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggcaggga ccctgagatg 1200
ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1260
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggagaag aggcaagggc 1320
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctatga cgccctgcac 1380
atgcaggccc tgccccccag a 1401
<210> 158
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<400> 158
Xaa Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Lys Gly Xaa Ser Gly Ser Gly Xaa Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Xaa
35 40
<210> 159
<211> 124
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(124)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<400> 159
nggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag ggaagcacca agggcnagcg 60
gatctggcng gctctacaag cggctctggc aagcctggat ctggcgaggg aagcaccaag 120
ggcn 124
<210> 160
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X是重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列
<400> 160
Xaa Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
Thr Lys Gly Xaa Ser Gly Ser Gly Xaa Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Xaa
35 40
<210> 161
<211> 124
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(124)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> n是编码重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列
<400> 161
nggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag ggaagcacca agggcnagcg 60
gatctggcng gctctacaag cggctctggc aagcctggat ctggcgaggg aagcaccaag 120
ggcn 124
<210> 162
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3M4E5重链的核苷酸
<400> 162
gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctaccaga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtgtccggc atcgtgtcca gcggcggctc tacagcctac 180
gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cggggagctg 300
ctgccctact acggcatgga tgtgtggggc cagggcacca ccgtgacagt gtcctca 357
<210> 163
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3M4E5轻链的核苷酸
<400> 163
cagagcgagc tgacacagcc tagatccgtg tctggcagcc ctggccagag cgtgaccatc 60
agctgtaccg gcaccagcag agatgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 120
catcccggca aggcccccaa gctgatcatc cacgacgtga tcgagcggag cagcggcgtg 180
cccgatagat tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgacaat cagcggactg 240
caggccgagg acgaggccga ctactactgt tggagcttcg ccggcagcta ctacgtgttc 300
ggcaccggca ccgatgtgac cgtgctg 327
<210> 164
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3M4E5HL scFv
<400> 164
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro
130 135 140
Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr
145 150 155 160
Gly Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu
180 185 190
Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly
225 230 235 240
Thr Asp Val Thr Val Leu
245
<210> 165
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3M4E5HL scFv 的核苷酸
<400> 165
gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc acctaccaga tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggcaaag gactggaatg ggtgtccggc atcgtgtcca gcggcggctc tacagcctac 180
gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cggggagctg 300
ctgccctact acggcatgga tgtgtggggc cagggcacca ccgtgacagt gtcctcaggc 360
tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct ggcgagggaa gcaccaaggg ccagagcgag 420
ctgacacagc ctagatccgt gtctggcagc cctggccaga gcgtgaccat cagctgtacc 480
ggcaccagca gagatgtggg cggctacaac tacgtgtcct ggtatcagca gcatcccggc 540
aaggccccca agctgatcat ccacgacgtg atcgagcgga gcagcggcgt gcccgataga 600
ttcagcggca gcaagagcgg caacaccgcc agcctgacaa tcagcggact gcaggccgag 660
gacgaggccg actactactg ttggagcttc gccggcagct actacgtgtt cggcaccggc 720
accgatgtga ccgtgctg 738
<210> 166
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3M4E5LH scFv
<400> 166
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Arg Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Trp Ser Phe Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Asp Val Thr Val Leu Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gln
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 167
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3M4E5LH scFv 的核苷酸
<400> 167
cagagcgagc tgacacagcc tagatccgtg tctggcagcc ctggccagag cgtgaccatc 60
agctgtaccg gcaccagcag agatgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 120
catcccggca aggcccccaa gctgatcatc cacgacgtga tcgagcggag cagcggcgtg 180
cccgatagat tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgacaat cagcggactg 240
caggccgagg acgaggccga ctactactgt tggagcttcg ccggcagcta ctacgtgttc 300
ggcaccggca ccgatgtgac cgtgctgggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgcag ctgctggaat ctggcggcgg actggtgcag 420
cctggcggat ctctgagact gagctgtgcc gccagcggct tcaccttcag cacctaccag 480
atgagctggg tgcgccaggc ccctggcaaa ggactggaat gggtgtccgg catcgtgtcc 540
agcggcggct ctacagccta cgccgatagc gtgaagggcc ggttcaccat cagccgggac 600
aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactattgtg ccggggagct gctgccctac tacggcatgg atgtgtgggg ccagggcacc 720
accgtgacag tgtcctca 738
<210> 168
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
35 40 45
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
50 55 60
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
85 90 95
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105 110
<210> 169
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 169
gcggccgcaa tcgaagtgat gtacccccct ccctacctgg acaacgagaa gtccaacggc 60
accattatcc acgtgaaggg aaagcacctg tgccccagcc ctctgttccc tggccctagc 120
aagcctttct gggtgctggt ggtcgtgggc ggagtgctgg cctgttatag cctgctcgtg 180
accgtggcct tcatcatctt ttgggtgcgc agcaagcgga gccggctgct gcacagcgac 240
tacatgaaca tgacccccag acggcccgga cccaccagaa agcactacca gccttacgcc 300
cctcccagag acttcgccgc ctacagatct 330
<210> 170
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 171
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 171
cgagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctatc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
agggaccctg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
agaagaggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 336
<210> 172
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 弗林蛋白酶裂解位点
<400> 172
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 173
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 间隔序列
<400> 173
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 174
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 密码子优化的P2A序列
<400> 174
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 175
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5'-RACE引物
<400> 175
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGHC引物
<400> 176
tgagttccac gacaccgtca c 21
<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGHM引物
<400> 177
tccaggacaa agtgatggag tc 22
<210> 178
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 改变5'-RACE引物
<400> 178
gtgtggtggt acgggaattc aagcagtggt atcaacgcag agt 43
<210> 179
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGHJ1引物
<400> 179
cttgccagag ccgcttgtag agcctgagga gacggtgacc aggg 44
<210> 180
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGHJ2引物
<400> 180
cttgccagag ccgcttgtag agcctgaaga gacggtgacc attgtc 46
<210> 181
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGHJ3引物
<400> 181
cttgccagag ccgcttgtag agcctgagga gacggtgacc gtggtc 46
<210> 182
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGKC引物
<400> 182
agggtcagag gccaaaggat gg 22
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGLC引物
<400> 183
cttggagctc ctcagaggag 20
<210> 184
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGKJ1引物
<400> 184
cttgccagag ccgcttgtag agcctttgat ttccaccttg gtccc 45
<210> 185
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGKJ2引物
<400> 185
cttgccagag ccgcttgtag agcctttgat ctccagcttg gtccc 45
<210> 186
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGKJ3引物
<400> 186
cttgccagag ccgcttgtag agcctttgat atccactttg gtccc 45
<210> 187
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGKJ4引物
<400> 187
cttgccagag ccgcttgtag agcctttaat ctccagtcgt gtccc 45
<210> 188
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGLJ1引物
<400> 188
cttgccagag ccgcttgtag agcctaggac ggtgaccttg gtccc 45
<210> 189
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGLJ2引物
<400> 189
cttgccagag ccgcttgtag agcctaggac ggtcagcttg gtccc 45
<210> 190
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGLJ4引物
<400> 190
cttgccagag ccgcttgtag agcctaaaat gatcagctgg gttcc 45
<210> 191
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGLJ5引物
<400> 191
cttgccagag ccgcttgtag agcctaggac ggtcagctcg gtccc 45
<210> 192
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3'IGLJ7引物
<400> 192
cttgccagag ccgcttgtag agccgaggac ggtcagctgg gtgcc 45
<210> 193
<211> 1095
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 193
atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggctct ggccctgacc 60
cagacctggg cgggctctca ctccatgagg tatttcttca catccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgcagtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggt 240
ccggagtatt gggacgggga gacacggaaa gtgaaggccc actcacagac tcaccgagtg 300
gacctgggga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccgtccag 360
aggatgtatg gctgcgacgt ggggtcggac tggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420
gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480
gacatggcag ctcagaccac caagcacaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagttg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600
gagacgctgc agcgcacgga cgcccccaaa acgcatatga ctcaccacgc tgtctctgac 660
catgaagcca ccctgaggtg ctgggccctg agcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 840
tacacctgcc atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg 900
tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ctttggagct 960
gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 1020
ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080
acagcttgta aagtg 1095
<210> 194
<211> 864
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 194
atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60
cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120
gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180
caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240
atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300
attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360
tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420
gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480
atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540
gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600
agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660
ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720
gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780
tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840
agaagggaaa gtgtacgccc tgta 864
<210> 195
<211> 615
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 195
atgtcgcgcg gcctccagct tctgctcctg agctgcgcct acagcctggc tcccgcgacg 60
ccggaggtga aggtggcttg ctccgaagat gtggacttgc cctgcaccgc cccctgggat 120
ccgcaggttc cctacacggt ctcctgggtc aagttattgg agggtggtga agagaggatg 180
gagacacccc aggaagacca cctcagggga cagcactatc atcagaaggg gcaaaatggt 240
tctttcgacg cccccaatga aaggccctat tccctgaaga tccgaaacac taccagctgc 300
aactcgggga catacaggtg cactctgcag gacccggatg ggcagagaaa cctaagtggc 360
aaggtgatct tgagagtgac aggatgccct gcacagcgta aagaagagac ttttaagaaa 420
tacagagcgg agattgtcct gctgctggct ctggttattt tctacttaac actcatcatt 480
ttcacttgta agtttgcacg gctacagagt atcttcccag atttttctaa agctggcatg 540
gaacgagctt ttctcccagt tacctcccca aataagcatt tagggctagt gactcctcac 600
aagacagaac tggta 615
<210> 196
<211> 831
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 196
atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca 60
gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg 120
tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt 180
ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc tggaacagag agacacactg ccaccagcac 240
aaatactgcg accccaacct agggcttcgg gtccagcaga agggcacctc agaaacagac 300
accatctgca cctgtgaaga aggctggcac tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc 360
ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat 420
accatctgcg agccctgccc agtcggcttc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 480
tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac 540
aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat cggctgagag ccctggtggt gatccccatc 600
atcttcggga tcctgtttgc catcctcttg gtgctggtct ttatcaaaaa ggtggccaag 660
aagccaacca ataaggcccc ccaccccaag caggaacccc aggagatcaa ttttcccgac 720
gatcttcctg gctccaacac tgctgctcca gtgcaggaga ctttacatgg atgccaaccg 780
gtcacccagg aggatggcaa agagagtcgc atctcagtgc aggagagaca g 831
<210> 197
<211> 762
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 197
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aa 762
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 198
Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu
1 5
<210> 199
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F引物 1
<400> 199
atcccagtgt ggtggtacgg g 21
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R引物 1
<400> 200
gggtacatca cttcgattgc 20
<210> 201
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 201
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
180 185 190
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
210 215 220
Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Thr
245
<210> 202
<211> 735
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 202
gaagtgaaac tgcaagagtc tggccctgga ctggtggccc catctcagtc tctgagcgtg 60
acctgtacag tcagcggagt gtccctgcct gattacggcg tgtcctggat cagacagcct 120
cctcggaaag gcctggaatg gctgggagtg atctggggca gcgagacaac ctactacaac 180
agcgccctga agtcccggct gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca ggtgttcctg 240
aagatgaaca gcctgcagac cgacgacacc gccatctact attgcgccaa gcactactac 300
tacggcggca gctacgctat ggactattgg ggccagggca ccagcgttac agtgtcctcg 360
ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga tctggcgagg gaagcaccaa gggcgatatc 420
cagatgaccc agacaacaag cagcctgagc gccagcctgg gcgatagagt gaccatcagc 480
tgtagagcca gccaggacat cagcaagtac ctgaactggt atcagcagaa acccgacggc 540
accgtgaagc tgctgatcta ccacaccagc agactgcaca gcggcgtgcc aagcagattt 600
tctggcagcg gctctggcac cgactacagc ctgaccatct ccaacctgga acaagaggat 660
atcgctacct acttctgcca gcaaggcaac accctgcctt acacctttgg cggaggcacc 720
aagctggaaa tcaca 735
<210> 203
<211> 245
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 203
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 204
<211> 735
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
gatatccaga tgacccagac aacaagcagc ctgagcgcca gcctgggcga tagagtgacc 60
atcagctgta gagccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaaaccc 120
gacggcaccg tgaagctgct gatctaccac accagcagac tgcacagcgg cgtgccaagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacaa 240
gaggatatcg ctacctactt ctgccagcaa ggcaacaccc tgccttacac ctttggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcac aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggcgaagt gaaactgcaa gagtctggcc ctggactggt ggccccatct 420
cagtctctga gcgtgacctg tacagtcagc ggagtgtccc tgcctgatta cggcgtgtcc 480
tggatcagac agcctcctcg gaaaggcctg gaatggctgg gagtgatctg gggcagcgag 540
acaacctact acaacagcgc cctgaagtcc cggctgacca tcatcaagga caactccaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactattgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gctatggact attggggcca gggcaccagc 720
gttacagtgt cctcg 735
<210> 205
<211> 1668
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020
ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080
ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140
ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200
ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260
tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320
aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380
tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440
cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggggtc ccagtcctat 1500
gaggatatga gaggaatcct gtatgcagcc ccccagctcc gctccattcg gggccagcct 1560
ggacccaatc atgaggaaga tgcagactct tatgagaaca tggataatcc cgatgggcca 1620
gacccagcct ggggaggagg gggccgcatg ggcacctgga gcaccagg 1668
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽
<400> 207
Gly Leu Arg Met Trp Ile Lys Gln Val
1 5
<210> 208
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 208
atggcggctg catctggaag cgtgctgcag agatgtatcg tgtccccagc cggcagacat 60
agcgccagcc tgatttttct gcacggcagc ggcgattctg gccagggact gagaatgtgg 120
atcaaacagg tgctgaacca ggacctgacc ttccagcaca tcaagatcat ctaccccacc 180
gctccacctc ggagctacac acctatgaag ggcggcatca gcaacgtttg gttcgaccgg 240
ttcaagatca ccaacgactg ccccgagcac ctggaatcca tcgacgtgat gtgtcaggtg 300
ctcaccgacc tgatcgacga ggaagtgaag tccggcatca agaagaacag aatcctgatc 360
ggcggcttca gcatgggcgg ctgtatggcc attcacctgg cctacagaaa ccaccaggat 420
gtggctggcg tgttcgccct gagcagcttt ctgaacaaag ccagcgccgt gtatcaggcc 480
ctgcagaaat ctaacggcgt gctgcctgag ctgttccagt gtcatggcac agccgatgag 540
ctggtgctgc actcttgggc cgaagagaca aatagcatgc tgaaaagcct gggcgtgacc 600
accaagttcc acagcttccc caacgtgtac cacgagctga gcaagaccga gctggacatc 660
ctgaaactgt ggattctgac caagctgccc ggcgagatgg aaaagcagaa g 711
<210> 209
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 209
atgcaggccg aaggccgggg cacagggggt tcgacgggcg atgctgatgg cccaggaggc 60
cctggcattc ctgatggccc agggggcaat gctggcggcc caggagaggc gggtgccacg 120
ggcggcagag gtccccgggg cgcaggggca gcaagggcct cggggccggg aggaggcgcc 180
ccgcggggtc cgcatggcgg cgcggcttca gggctgaatg gatgctgcag atgcggggcc 240
agggggccgg agagccgcct gcttgagttc tacctcgcca tgcctttcgc gacacccatg 300
gaagcagagc tggcccgcag gagcctggcc caggatgccc caccgcttcc cgtgccaggg 360
gtgcttctga aggagttcac tgtgtccggc aacatactga ctatccgact gactgctgca 420
gaccaccgcc aactgcagct ctccatcagc tcctgtctcc agcagctttc cctgttgatg 480
tggatcacgc agtgctttct gcccgtgttt ttggctcagc ctccctcagg gcagaggcgc 540
<210> 210
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 210
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ser Thr Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ala Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr
245 250 255
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
260 265 270
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
275 280 285
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
290 295 300
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
305 310 315 320
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
325 330 335
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
340 345 350
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
355 360 365
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
370 375 380
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
385 390 395 400
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
420 425 430
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
450 455 460
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 211
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 211
cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacctcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtagca ccactcggcc ctcagggatt 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acgtcagcca ccctgggcat caccggactc 240
cagactgggg acgaggccga ttattactgc ggaacatggg atagcagcct gagtgctggg 300
gtgttcggcg gaggcaccca gctgaccgtc ctcggctcta caagcggctc tggcaagcct 360
ggatctggcg agggaagcac caagggcgaa gtgcagctgc tggaatctgg cggcggactg 420
gtgcagcctg gcggatctct gagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcacc 480
taccagatga gctgggtgcg ccaggcccct ggcaaaggac tggaatgggt gtccggcatc 540
gtgtccagcg gcggctctac agcctacgcc gatagcgtga agggccggtt caccatcagc 600
cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc 660
gccgtgtact attgtgccgg ggagctgctg ccctactacg gcatggatgt gtggggccag 720
ggcaccaccg tgacagtgtc ctcagcggcc gcaatcgaag tgatgtaccc ccctccctac 780
ctggacaacg agaagtccaa cggcaccatt atccacgtga agggaaagca cctgtgcccc 840
agccctctgt tccctggccc tagcaagcct ttctgggtgc tggtggtcgt gggcggagtg 900
ctggcctgtt atagcctgct cgtgaccgtg gccttcatca tcttttgggt gcgcagcaag 960
cggagccggc tgctgcacag cgactacatg aacatgaccc ccagacggcc cggacccacc 1020
agaaagcact accagcctta cgcccctccc agagacttcg ccgcctacag atctcgagtg 1080
aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc tatcagcagg gccagaacca gctgtacaac 1140
gagctgaacc tgggcagacg ggaagagtac gacgtgctgg acaagcggag aggcagggac 1200
cctgagatgg gcggcaagcc cagaagaaag aacccccagg aaggcctgta taacgaactg 1260
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggagaaga 1320
ggcaagggcc acgatggcct gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1380
gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga 1410
<210> 212
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 212
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Lys Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Leu Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Tyr
145 150 155 160
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
His Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro
245 250 255
Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly
260 265 270
Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
355 360 365
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
370 375 380
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
<210> 213
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 213
gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgaa attcactttc 300
ggccctggga ccaaagtgga tatcagaggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg ccaggtgcag ctgcaggagt cgggcccagg actggtgaag 420
ccttcggata ccctgtccct cacctgtctt gtctctggtg gctccatcag tagtaattac 480
tggagctgga tccggcaggc cccagggaag ggactggagt ggattggaca tgtctcctac 540
agtgggagca ccaactacaa cccctccctc aagagtcgag ttaccatatc agtagacacg 600
tctaagaacc agttctccct gaagctgagc tctgtgactg ccgcggacac ggccgtgtat 660
tactgtgcga gagagtccta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 720
gtcaccgtct cctcagcggc cgcaatcgaa gtgatgtacc cccctcccta cctggacaac 780
gagaagtcca acggcaccat tatccacgtg aagggaaagc acctgtgccc cagccctctg 840
ttccctggcc ctagcaagcc tttctgggtg ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt 900
tatagcctgc tcgtgaccgt ggccttcatc atcttttggg tgcgcagcaa gcggagccgg 960
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc cccagacggc ccggacccac cagaaagcac 1020
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctaca gatctcgagt gaagttcagc 1080
agaagcgccg acgcccctgc ctatcagcag ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1140
ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggcaggga ccctgagatg 1200
ggcggcaagc ccagaagaaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1260
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggagaag aggcaagggc 1320
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctatga cgccctgcac 1380
atgcaggccc tgccccccag a 1401
<210> 214
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 单链Fv
<400> 214
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Thr Ser Asp Asp Val Ser Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Met Leu Tyr Asp Val
35 40 45
Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro His Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
50 55 60
Gly Arg Ala Ala Ser Leu Ile Ile Ser Gly Leu Gln Thr Glu Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Arg Tyr Asn Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln
210 215 220
Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 215
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 215
caatctgctc tgacacagcc tagaagcgtg tccggctttc ctggccagag cgtgaccatc 60
agctgtaccg gcaccacctc cgatgacgtg tcctggtatc agcagcatcc tggcaaagcc 120
cctcagctga tgctgtacga cgtgtccaaa agacctagcg gcgtgcccca cagattcagc 180
ggatctagaa gtggcagagc cgccagcctg atcatctctg gactgcagac agaggacgag 240
gccgactact tctgctgtag ctacgccggc agatacaaca gcgtgctgtt tggcggcgga 300
acaaagctga cagtgctggg ctctacaagc ggctctggca agcctggatc tggcgaggga 360
agcaccaagg gcgaagtgca gcttgtggaa tctggcggag gactggtgca gcctggaaga 420
agcctgagac tgtcttgtgc cgccagcggc ttcaccttcg acgattatgc catgcactgg 480
gtccgacagg cccctggaaa aggccttgaa tgggtgtccg gcatctcttg gaacagcggc 540
agaatcggct acgccgactc tgtgaagggc agattcacca tcagccggga caacgccaag 600
aacagcctgt tcctgcagat gaactccctg agagccgagg acaccgccgt gtactactgt 660
gccagagatc agggctacca ctactacgac tctgccgagc acgccttcga tatctggggc 720
cagggaacag tggtcaccgt tagttct 747
<210> 216
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 217
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 217
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile
1 5
<210> 218
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
1 5 10 15
Asp Ile
<210> 219
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 220
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
Lys Leu Gly Asp Lys Tyr
1 5
<210> 221
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 221
Gln Asp Ser
1
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 222
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr His Val Val
1 5 10
<210> 223
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 223
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 225
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 225
Asp Val Ser
1
<210> 226
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 226
Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu Thr Ala Val Val
1 5 10
<210> 227
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 227
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser
85 90 95
Leu Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 228
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 228
Trp Ser Asn Ile Gly Asp Asp His
1 5
<210> 229
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 229
Asp Thr Ser
1
<210> 230
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 230
Gly Thr Trp Glu Ser Ser Leu Ser Gly Val Val
1 5 10
<210> 231
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 231
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Trp Ser Asn Ile Gly Asp Asp
20 25 30
His Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Pro Ser Arg Val Ala Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Glu Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 232
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 233
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 233
Asp Val Thr
1
<210> 234
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 234
Ser Ser Tyr Thr Thr Ser Thr Thr Trp Val
1 5 10
<210> 235
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 235
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser
85 90 95
Leu Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 236
Thr Ser Asp Val Gly Thr Thr Asn Tyr
1 5
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 237
Asp Val Thr
1
<210> 238
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 238
Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Thr Phe Val Val
1 5 10
<210> 239
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 239
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr Thr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 240
<211> 9
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 240
Ser Ser Asp Val Gly Val Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 241
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 241
Asp Val Ser
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 242
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val
1 5 10
<210> 243
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 243
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Val Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 244
Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr
1 5
<210> 245
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 245
Asp Asn Val
1
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 246
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Ile
1 5 10
<210> 247
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 247
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Cys Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 248
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 249
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 249
Asp Val Ser
1
<210> 250
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 250
His Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser His Val
1 5 10
<210> 251
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 251
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser His Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 252
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 252
Gln Ser Val Ser Ser Asn
1 5
<210> 253
<211> 3
<212> PRT
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<400> 253
Gly Ala Ser
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 254
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Leu Tyr Thr
1 5 10
<210> 255
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 255
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 256
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 257
Asp Ala Ser
1
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 258
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu Tyr Thr
1 5 10
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 259
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 260
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 260
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 261
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 261
Asp Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 262
Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 263
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 263
Glu Ile Val Leu Thr Arg Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Ser Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 264
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 264
Gln Thr Ile Ser Ala Ser Ser
1 5
<210> 265
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 265
Gly Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 266
Gln Gln Phe Asn Glu Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 267
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 267
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Pro Ser Gln Thr Ile Ser Ala Ser
20 25 30
Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Glu Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 268
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 268
Gln Ser Val Ser Ser Asn
1 5
<210> 269
<211> 3
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 269
Gly Ala Ser
1
<210> 270
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 270
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asp Ile Phe Thr
1 5 10
<210> 271
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 271
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asp
85 90 95
Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 272
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L4-18H的抗原结合结构域
<400> 272
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 273
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L7-18H的抗原结合结构域
<400> 273
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser
85 90 95
Leu Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala
225 230 235 240
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 274
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L9-18H的抗原结合结构域
<400> 274
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Trp Ser Asn Ile Gly Asp Asp
20 25 30
His Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Pro Ser Arg Val Ala Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Glu Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
225 230 235 240
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 275
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L13-18H的抗原结合结构域
<400> 275
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Leu Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser
85 90 95
Thr Thr Trp Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
225 230 235 240
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 276
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L14-18H的抗原结合结构域
<400> 276
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr Thr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala
225 230 235 240
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 277
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L16-18H的抗原结合结构域
<400> 277
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Val Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala
225 230 235 240
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 278
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L17-18H的抗原结合结构域
<400> 278
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Cys Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Val Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 279
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L22-18H的抗原结合结构域
<400> 279
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser His Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
225 230 235 240
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 280
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K4-18H的抗原结合结构域
<400> 280
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 281
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K5-18H的抗原结合结构域
<400> 281
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly
165 170 175
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 282
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K6-18H的抗原结合结构域
<400> 282
Glu Ile Val Leu Thr Arg Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Ser Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 283
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K9-18H的抗原结合结构域
<400> 283
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Pro Ser Gln Thr Ile Ser Ala Ser
20 25 30
Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Glu Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly
165 170 175
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 284
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K10-18H的抗原结合结构域
<400> 284
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asp
85 90 95
Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Ser Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 285
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L4-18H CAR
<400> 285
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val
245 250 255
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
275 280 285
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
290 295 300
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
305 310 315 320
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
325 330 335
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
340 345 350
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
355 360 365
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
370 375 380
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
385 390 395 400
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
405 410 415
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
420 425 430
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
435 440 445
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
450 455 460
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 286
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L7-18H CAR
<400> 286
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser
85 90 95
Leu Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala
225 230 235 240
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
245 250 255
Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
260 265 270
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
275 280 285
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
290 295 300
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
305 310 315 320
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
325 330 335
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
340 345 350
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
355 360 365
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
385 390 395 400
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
405 410 415
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
420 425 430
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
435 440 445
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
450 455 460
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 287
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L9-18H CAR
<400> 287
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Trp Ser Asn Ile Gly Asp Asp
20 25 30
His Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Pro Ser Arg Val Ala Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Glu Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
225 230 235 240
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
245 250 255
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
260 265 270
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
275 280 285
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
290 295 300
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
305 310 315 320
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
325 330 335
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
340 345 350
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
355 360 365
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
370 375 380
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
385 390 395 400
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
405 410 415
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
420 425 430
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
435 440 445
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
450 455 460
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 288
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L13-18H CAR
<400> 288
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Leu Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Ile Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Ser
85 90 95
Thr Thr Trp Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe
225 230 235 240
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
245 250 255
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
260 265 270
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
275 280 285
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
290 295 300
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
305 310 315 320
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
325 330 335
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
340 345 350
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
355 360 365
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
370 375 380
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
385 390 395 400
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
405 410 415
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
420 425 430
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
435 440 445
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
450 455 460
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 289
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L14-18H CAR
<400> 289
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr Thr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp
145 150 155 160
Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
145 150 155 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Asp Gln Gly Tyr His Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile
245 250 255
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
260 265 270
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
275 280 285
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
290 295 300
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
305 310 315 320
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
325 330 335
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
340 345 350
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg
355 360 365
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
385 390 395 400
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
405 410 415
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
420 425 430
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
435 440 445
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
450 455 460
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 298
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L4-18H CAR的多聚核苷酸
<400> 298
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttgct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat agcaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca cacatgtggt attcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggcgaagt gcagcttgtg gaatctggcg gaggactggt gcagcctgga 420
agaagcctga gactgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tcgacgatta tgccatgcac 480
tgggtccgac aggcccctgg aaaaggcctt gaatgggtgt ccggcatctc ttggaacagc 540
ggcagaatcg gctacgccga ctctgtgaag ggcagattca ccatcagccg ggacaacgcc 600
aagaacagcc tgttcctgca gatgaactcc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 660
tgtgccagag atcagggcta ccactactac gactctgccg agcacgcctt cgatatctgg 720
ggccagggaa cagtggtcac cgttagttct gcggccgcaa tcgaagtgat gtacccccct 780
ccctacctgg acaacgagaa gtccaacggc accattatcc acgtgaaggg aaagcacctg 840
tgccccagcc ctctgttccc tggccctagc aagcctttct gggtgctggt ggtcgtgggc 900
ggagtgctgg cctgttatag cctgctcgtg accgtggcct tcatcatctt ttgggtgcgc 960
agcaagcgga gccggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag acggcccgga 1020
cccaccagaa agcactacca gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc ctacagatct 1080
cgagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctatc agcagggcca gaaccagctg 1140
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1200
agggaccctg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc cccaggaagg cctgtataac 1260
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1320
agaagaggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1380
tatgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1416
<210> 299
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L7-18H CAR的多核苷酸
<400> 299
cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
cagactgggg acgaggccga ttattactgc ggaacatggg ataccagcct gactgctgtg 300
gtattcggcg gagggaccga gctgaccgtc ctcggctcta caagcggctc tggcaagcct 360
ggatctggcg agggaagcac caagggcgaa gtgcagcttg tggaatctgg cggaggactg 420
gtgcagcctg gaagaagcct gagactgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcgacgat 480
tatgccatgc actgggtccg acaggcccct ggaaaaggcc ttgaatgggt gtccggcatc 540
tcttggaaca gcggcagaat cggctacgcc gactctgtga agggcagatt caccatcagc 600
cgggacaacg ccaagaacag cctgttcctg cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc 660
gccgtgtact actgtgccag agatcagggc taccactact acgactctgc cgagcacgcc 720
ttcgatatct ggggccaggg aacagtggtc accgttagtt ctgcggccgc aatcgaagtg 780
atgtaccccc ctccctacct ggacaacgag aagtccaacg gcaccattat ccacgtgaag 840
ggaaagcacc tgtgccccag ccctctgttc cctggcccta gcaagccttt ctgggtgctg 900
gtggtcgtgg gcggagtgct ggcctgttat agcctgctcg tgaccgtggc cttcatcatc 960
ttttgggtgc gcagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc 1020
agacggcccg gacccaccag aaagcactac cagccttacg cccctcccag agacttcgcc 1080
gcctacagat ctcgagtgaa gttcagcaga agcgccgacg cccctgccta tcagcagggc 1140
cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac 1200
aagcggagag gcagggaccc tgagatgggc ggcaagccca gaagaaagaa cccccaggaa 1260
ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggcatg 1320
aagggcgagc ggagaagagg caagggccac gatggcctgt accagggcct gagcaccgcc 1380
accaaggaca cctatgacgc cctgcacatg caggccctgc cccccaga 1428
<210> 300
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L9-18H CAR的多核苷酸
<400> 300
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagctggtc caacattgga gatgatcatg tctcctggta ccagcagttc 120
ccaggagcag cccccaaact cctcatttat gacacttcta agcgaccctc acgcgttgct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcgcg tcagccaccc tggccatcac tggactccag 240
gctggggacg aggccgacta ttattgcgga acatgggaaa gcagcctgag tggtgtggtt 300
ttcggcggag ggaccgagct gaccgtccta ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga 360
tctggcgagg gaagcaccaa gggcgaagtg cagcttgtgg aatctggcgg aggactggtg 420
cagcctggaa gaagcctgag actgtcttgt gccgccagcg gcttcacctt cgacgattat 480
gccatgcact gggtccgaca ggcccctgga aaaggccttg aatgggtgtc cggcatctct 540
tggaacagcg gcagaatcgg ctacgccgac tctgtgaagg gcagattcac catcagccgg 600
gacaacgcca agaacagcct gttcctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 660
gtgtactact gtgccagaga tcagggctac cactactacg actctgccga gcacgccttc 720
gatatctggg gccagggaac agtggtcacc gttagttctg cggccgcaat cgaagtgatg 780
tacccccctc cctacctgga caacgagaag tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga 840
aagcacctgt gccccagccc tctgttccct ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg 900
gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt 960
tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg cacagcgact acatgaacat gacccccaga 1020
cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc 1080
tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag 1140
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgacgt gctggacaag 1200
cggagaggca gggaccctga gatgggcggc aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc 1260
ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1320
ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1380
aaggacacct atgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ccaga 1425
<210> 301
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L13-18H CAR的多核苷酸
<400> 301
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gactcagcag tgacgttggt ggttatgact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca tagcccccaa actcatgatt tatgatgtca ctaatcggcc ctcaggggtt 180
tctagtcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccagcac gacttgggtc 300
ttcggagctg ggaccaagct gaccgtccta ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga 360
tctggcgagg gaagcaccaa gggcgaagtg cagcttgtgg aatctggcgg aggactggtg 420
cagcctggaa gaagcctgag actgtcttgt gccgccagcg gcttcacctt cgacgattat 480
gccatgcact gggtccgaca ggcccctgga aaaggccttg aatgggtgtc cggcatctct 540
tggaacagcg gcagaatcgg ctacgccgac tctgtgaagg gcagattcac catcagccgg 600
gacaacgcca agaacagcct gttcctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 660
gtgtactact gtgccagaga tcagggctac cactactacg actctgccga gcacgccttc 720
gatatctggg gccagggaac agtggtcacc gttagttctg cggccgcaat cgaagtgatg 780
tacccccctc cctacctgga caacgagaag tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga 840
aagcacctgt gccccagccc tctgttccct ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg 900
gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt 960
tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg cacagcgact acatgaacat gacccccaga 1020
cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc 1080
tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag 1140
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgacgt gctggacaag 1200
cggagaggca gggaccctga gatgggcggc aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc 1260
ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1320
ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1380
aaggacacct atgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ccaga 1425
<210> 302
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L14-18H CAR的多核苷酸
<400> 302
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccaccag tgacgttggt actactaatt atgtctcctg gtaccagcaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcctaatt tatgatgtca ctaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctgcc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggcagcta caccttcgtg 300
gtattcggcg gagggaccga gctgaccgtc ctaggctcta caagcggctc tggcaagcct 360
ggatctggcg agggaagcac caagggcgaa gtgcagcttg tggaatctgg cggaggactg 420
gtgcagcctg gaagaagcct gagactgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcgacgat 480
tatgccatgc actgggtccg acaggcccct ggaaaaggcc ttgaatgggt gtccggcatc 540
tcttggaaca gcggcagaat cggctacgcc gactctgtga agggcagatt caccatcagc 600
cgggacaacg ccaagaacag cctgttcctg cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc 660
gccgtgtact actgtgccag agatcagggc taccactact acgactctgc cgagcacgcc 720
ttcgatatct ggggccaggg aacagtggtc accgttagtt ctgcggccgc aatcgaagtg 780
atgtaccccc ctccctacct ggacaacgag aagtccaacg gcaccattat ccacgtgaag 840
ggaaagcacc tgtgccccag ccctctgttc cctggcccta gcaagccttt ctgggtgctg 900
gtggtcgtgg gcggagtgct ggcctgttat agcctgctcg tgaccgtggc cttcatcatc 960
ttttgggtgc gcagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc 1020
agacggcccg gacccaccag aaagcactac cagccttacg cccctcccag agacttcgcc 1080
gcctacagat ctcgagtgaa gttcagcaga agcgccgacg cccctgccta tcagcagggc 1140
cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac 1200
aagcggagag gcagggaccc tgagatgggc ggcaagccca gaagaaagaa cccccaggaa 1260
ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggcatg 1320
aagggcgagc ggagaagagg caagggccac gatggcctgt accagggcct gagcaccgcc 1380
accaaggaca cctatgacgc cctgcacatg caggccctgc cccccaga 1428
<210> 303
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L16-18H CAR的多核苷酸
<400> 303
cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gtttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctgcc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gaatggtgtg 300
gtattcggcg gaggcaccca gctgaccgtc ctcggctcta caagcggctc tggcaagcct 360
ggatctggcg agggaagcac caagggcgaa gtgcagcttg tggaatctgg cggaggactg 420
gtgcagcctg gaagaagcct gagactgtct tgtgccgcca gcggcttcac cttcgacgat 480
tatgccatgc actgggtccg acaggcccct ggaaaaggcc ttgaatgggt gtccggcatc 540
tcttggaaca gcggcagaat cggctacgcc gactctgtga agggcagatt caccatcagc 600
cgggacaacg ccaagaacag cctgttcctg cagatgaact ccctgagagc cgaggacacc 660
gccgtgtact actgtgccag agatcagggc taccactact acgactctgc cgagcacgcc 720
ttcgatatct ggggccaggg aacagtggtc accgttagtt ctgcggccgc aatcgaagtg 780
atgtaccccc ctccctacct ggacaacgag aagtccaacg gcaccattat ccacgtgaag 840
ggaaagcacc tgtgccccag ccctctgttc cctggcccta gcaagccttt ctgggtgctg 900
gtggtcgtgg gcggagtgct ggcctgttat agcctgctcg tgaccgtggc cttcatcatc 960
ttttgggtgc gcagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc 1020
agacggcccg gacccaccag aaagcactac cagccttacg cccctcccag agacttcgcc 1080
gcctacagat ctcgagtgaa gttcagcaga agcgccgacg cccctgccta tcagcagggc 1140
cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac 1200
aagcggagag gcagggaccc tgagatgggc ggcaagccca gaagaaagaa cccccaggaa 1260
ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg cctacagcga gatcggcatg 1320
aagggcgagc ggagaagagg caagggccac gatggcctgt accagggcct gagcaccgcc 1380
accaaggaca cctatgacgc cctgcacatg caggccctgc cccccaga 1428
<210> 304
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L17-18H CAR的多核苷酸
<400> 304
cagtctgtac tgactcaacc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgctctg gcagcagctc caacatcgga aataattatg tatgctggta ccaacacctc 120
ccaggaacgg cccccaaact tctcatttat gacaatgtta agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tgccatattc 300
ggcggaggga ccgagctgac cgtcctaggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgcag cttgtggaat ctggcggagg actggtgcag 420
cctggaagaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttcga cgattatgcc 480
atgcactggg tccgacaggc ccctggaaaa ggccttgaat gggtgtccgg catctcttgg 540
aacagcggca gaatcggcta cgccgactct gtgaagggca gattcaccat cagccgggac 600
aacgccaaga acagcctgtt cctgcagatg aactccctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactactgtg ccagagatca gggctaccac tactacgact ctgccgagca cgccttcgat 720
atctggggcc agggaacagt ggtcaccgtt agttctgcgg ccgcaatcga agtgatgtac 780
ccccctccct acctggacaa cgagaagtcc aacggcacca ttatccacgt gaagggaaag 840
cacctgtgcc ccagccctct gttccctggc cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtc 900
gtgggcggag tgctggcctg ttatagcctg ctcgtgaccg tggccttcat catcttttgg 960
gtgcgcagca agcggagccg gctgctgcac agcgactaca tgaacatgac ccccagacgg 1020
cccggaccca ccagaaagca ctaccagcct tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac 1080
agatctcgag tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg cctatcagca gggccagaac 1140
cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg 1200
agaggcaggg accctgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccccca ggaaggcctg 1260
tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 1320
gagcggagaa gaggcaaggg ccacgatggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1380
gacacctatg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca ga 1422
<210> 305
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码L22-18H CAR的多核苷酸
<400> 305
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240
cagtctgagg atgaggctga ttattactgc cactcctatg acagcagcct gagtcatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggctctacaa gcggctctgg caagcctgga 360
tctggcgagg gaagcaccaa gggcgaagtg cagcttgtgg aatctggcgg aggactggtg 420
cagcctggaa gaagcctgag actgtcttgt gccgccagcg gcttcacctt cgacgattat 480
gccatgcact gggtccgaca ggcccctgga aaaggccttg aatgggtgtc cggcatctct 540
tggaacagcg gcagaatcgg ctacgccgac tctgtgaagg gcagattcac catcagccgg 600
gacaacgcca agaacagcct gttcctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 660
gtgtactact gtgccagaga tcagggctac cactactacg actctgccga gcacgccttc 720
gatatctggg gccagggaac agtggtcacc gttagttctg cggccgcaat cgaagtgatg 780
tacccccctc cctacctgga caacgagaag tccaacggca ccattatcca cgtgaaggga 840
aagcacctgt gccccagccc tctgttccct ggccctagca agcctttctg ggtgctggtg 900
gtcgtgggcg gagtgctggc ctgttatagc ctgctcgtga ccgtggcctt catcatcttt 960
tgggtgcgca gcaagcggag ccggctgctg cacagcgact acatgaacat gacccccaga 1020
cggcccggac ccaccagaaa gcactaccag ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc 1080
tacagatctc gagtgaagtt cagcagaagc gccgacgccc ctgcctatca gcagggccag 1140
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgacgt gctggacaag 1200
cggagaggca gggaccctga gatgggcggc aagcccagaa gaaagaaccc ccaggaaggc 1260
ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1320
ggcgagcgga gaagaggcaa gggccacgat ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1380
aaggacacct atgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ccaga 1425
<210> 306
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码K4-18H CAR的多核苷酸
<400> 306
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccctt gtacactttt 300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaaggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgcag cttgtggaat ctggcggagg actggtgcag 420
cctggaagaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttcga cgattatgcc 480
atgcactggg tccgacaggc ccctggaaaa ggccttgaat gggtgtccgg catctcttgg 540
aacagcggca gaatcggcta cgccgactct gtgaagggca gattcaccat cagccgggac 600
aacgccaaga acagcctgtt cctgcagatg aactccctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactactgtg ccagagatca gggctaccac tactacgact ctgccgagca cgccttcgat 720
atctggggcc agggaacagt ggtcaccgtt agttctgcgg ccgcaatcga agtgatgtac 780
ccccctccct acctggacaa cgagaagtcc aacggcacca ttatccacgt gaagggaaag 840
cacctgtgcc ccagccctct gttccctggc cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtc 900
gtgggcggag tgctggcctg ttatagcctg ctcgtgaccg tggccttcat catcttttgg 960
gtgcgcagca agcggagccg gctgctgcac agcgactaca tgaacatgac ccccagacgg 1020
cccggaccca ccagaaagca ctaccagcct tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac 1080
agatctcgag tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg cctatcagca gggccagaac 1140
cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg 1200
agaggcaggg accctgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccccca ggaaggcctg 1260
tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 1320
gagcggagaa gaggcaaggg ccacgatggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1380
gacacctatg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca ga 1422
<210> 307
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码K5-18H CAR的多核苷酸
<400> 307
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccttttgta cacttttggc 300
caggggacca agctggagat caaaggctct acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc 360
gagggaagca ccaagggcga agtgcagctt gtggaatctg gcggaggact ggtgcagcct 420
ggaagaagcc tgagactgtc ttgtgccgcc agcggcttca ccttcgacga ttatgccatg 480
cactgggtcc gacaggcccc tggaaaaggc cttgaatggg tgtccggcat ctcttggaac 540
agcggcagaa tcggctacgc cgactctgtg aagggcagat tcaccatcag ccgggacaac 600
gccaagaaca gcctgttcct gcagatgaac tccctgagag ccgaggacac cgccgtgtac 660
tactgtgcca gagatcaggg ctaccactac tacgactctg ccgagcacgc cttcgatatc 720
tggggccagg gaacagtggt caccgttagt tctgcggccg caatcgaagt gatgtacccc 780
cctccctacc tggacaacga gaagtccaac ggcaccatta tccacgtgaa gggaaagcac 840
ctgtgcccca gccctctgtt ccctggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtcgtg 900
ggcggagtgc tggcctgtta tagcctgctc gtgaccgtgg ccttcatcat cttttgggtg 960
cgcagcaagc ggagccggct gctgcacagc gactacatga acatgacccc cagacggccc 1020
ggacccacca gaaagcacta ccagccttac gcccctccca gagacttcgc cgcctacaga 1080
tctcgagtga agttcagcag aagcgccgac gcccctgcct atcagcaggg ccagaaccag 1140
ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg gaagagtacg acgtgctgga caagcggaga 1200
ggcagggacc ctgagatggg cggcaagccc agaagaaaga acccccagga aggcctgtat 1260
aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1320
cggagaagag gcaagggcca cgatggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac 1380
acctatgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccccaga 1419
<210> 308
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码K6-18H CAR的多核苷酸
<400> 308
gaaattgtgt tgacacggtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcctccaaca gggccactgg tatttcagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgatagtc tcccactcac tttcggcgga 300
gggaccaagc tggagatcaa aggctctaca agcggctctg gcaagcctgg atctggcgag 360
ggaagcacca agggcgaagt gcagcttgtg gaatctggcg gaggactggt gcagcctgga 420
agaagcctga gactgtcttg tgccgccagc ggcttcacct tcgacgatta tgccatgcac 480
tgggtccgac aggcccctgg aaaaggcctt gaatgggtgt ccggcatctc ttggaacagc 540
ggcagaatcg gctacgccga ctctgtgaag ggcagattca ccatcagccg ggacaacgcc 600
aagaacagcc tgttcctgca gatgaactcc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 660
tgtgccagag atcagggcta ccactactac gactctgccg agcacgcctt cgatatctgg 720
ggccagggaa cagtggtcac cgttagttct gcggccgcaa tcgaagtgat gtacccccct 780
ccctacctgg acaacgagaa gtccaacggc accattatcc acgtgaaggg aaagcacctg 840
tgccccagcc ctctgttccc tggccctagc aagcctttct gggtgctggt ggtcgtgggc 900
ggagtgctgg cctgttatag cctgctcgtg accgtggcct tcatcatctt ttgggtgcgc 960
agcaagcgga gccggctgct gcacagcgac tacatgaaca tgacccccag acggcccgga 1020
cccaccagaa agcactacca gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc ctacagatct 1080
cgagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctatc agcagggcca gaaccagctg 1140
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1200
agggaccctg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc cccaggaagg cctgtataac 1260
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1320
agaagaggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1380
tatgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1416
<210> 309
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码K9-18H CAR的多核苷酸
<400> 309
gaaatagtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
gtctcctgta ggcccagtca gaccattagt gccagttccg tagcctggta tcagcagaaa 120
gctggccagg ctccacggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caatttaatg aatggcctct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggaaat caaaggctct acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc 360
gagggaagca ccaagggcga agtgcagctt gtggaatctg gcggaggact ggtgcagcct 420
ggaagaagcc tgagactgtc ttgtgccgcc agcggcttca ccttcgacga ttatgccatg 480
cactgggtcc gacaggcccc tggaaaaggc cttgaatggg tgtccggcat ctcttggaac 540
agcggcagaa tcggctacgc cgactctgtg aagggcagat tcaccatcag ccgggacaac 600
gccaagaaca gcctgttcct gcagatgaac tccctgagag ccgaggacac cgccgtgtac 660
tactgtgcca gagatcaggg ctaccactac tacgactctg ccgagcacgc cttcgatatc 720
tggggccagg gaacagtggt caccgttagt tctgcggccg caatcgaagt gatgtacccc 780
cctccctacc tggacaacga gaagtccaac ggcaccatta tccacgtgaa gggaaagcac 840
ctgtgcccca gccctctgtt ccctggccct agcaagcctt tctgggtgct ggtggtcgtg 900
ggcggagtgc tggcctgtta tagcctgctc gtgaccgtgg ccttcatcat cttttgggtg 960
cgcagcaagc ggagccggct gctgcacagc gactacatga acatgacccc cagacggccc 1020
ggacccacca gaaagcacta ccagccttac gcccctccca gagacttcgc cgcctacaga 1080
tctcgagtga agttcagcag aagcgccgac gcccctgcct atcagcaggg ccagaaccag 1140
ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg gaagagtacg acgtgctgga caagcggaga 1200
ggcagggacc ctgagatggg cggcaagccc agaagaaaga acccccagga aggcctgtat 1260
aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1320
cggagaagag gcaagggcca cgatggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac 1380
acctatgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccccaga 1419
<210> 310
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码K10-18H CAR的多核苷酸
<400> 310
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcaaaaactt 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtagct cacccgatat attcactttc 300
ggccctggga ccaaagtgga tatcaaaggc tctacaagcg gctctggcaa gcctggatct 360
ggcgagggaa gcaccaaggg cgaagtgcag cttgtggaat ctggcggagg actggtgcag 420
cctggaagaa gcctgagact gtcttgtgcc gccagcggct tcaccttcga cgattatgcc 480
atgcactggg tccgacaggc ccctggaaaa ggccttgaat gggtgtccgg catctcttgg 540
aacagcggca gaatcggcta cgccgactct gtgaagggca gattcaccat cagccgggac 600
aacgccaaga acagcctgtt cctgcagatg aactccctga gagccgagga caccgccgtg 660
tactactgtg ccagagatca gggctaccac tactacgact ctgccgagca cgccttcgat 720
atctggggcc agggaacagt ggtcaccgtt agttctgcgg ccgcaatcga agtgatgtac 780
ccccctccct acctggacaa cgagaagtcc aacggcacca ttatccacgt gaagggaaag 840
cacctgtgcc ccagccctct gttccctggc cctagcaagc ctttctgggt gctggtggtc 900
gtgggcggag tgctggcctg ttatagcctg ctcgtgaccg tggccttcat catcttttgg 960
gtgcgcagca agcggagccg gctgctgcac agcgactaca tgaacatgac ccccagacgg 1020
cccggaccca ccagaaagca ctaccagcct tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac 1080
agatctcgag tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg cctatcagca gggccagaac 1140
cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg 1200
agaggcaggg accctgagat gggcggcaag cccagaagaa agaaccccca ggaaggcctg 1260
tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 1320
gagcggagaa gaggcaaggg ccacgatggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag 1380
gacacctatg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca ga 1422
<210> 311
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLR蛋白
<400> 311
Met Glu Glu Glu Asn Ile Val Asn Gly Asp Arg Pro Arg Asp Leu Val
1 5 10 15
Phe Pro Gly Thr Ala Gly Leu Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Tyr Ile Thr Asp Gly Ile Ile Asp Ala His Thr Asn Glu Val Ile
35 40 45
Ser Tyr Ala Gln Ile Phe Glu Thr Ser Cys Arg Leu Ala Val Ser Leu
50 55 60
Glu Lys Tyr Gly Leu Asp His Asn Asn Val Val Ala Ile Cys Ser Glu
65 70 75 80
Asn Asn Ile His Phe Phe Gly Pro Leu Ile Ala Ala Leu Tyr Gln Gly
85 90 95
Ile Pro Met Ala Thr Ser Asn Asp Met Tyr Thr Glu Arg Glu Met Ile
100 105 110
Gly His Leu Asn Ile Ser Lys Pro Cys Leu Met Phe Cys Ser Lys Lys
115 120 125
Ser Leu Pro Phe Ile Leu Lys Val Gln Lys His Leu Asp Phe Leu Lys
130 135 140
Lys Val Ile Val Ile Asp Ser Met Tyr Asp Ile Asn Gly Val Glu Cys
145 150 155 160
Val Phe Ser Phe Val Ser Arg Tyr Thr Asp His Ala Phe Asp Pro Val
165 170 175
Lys Phe Asn Pro Lys Glu Phe Asp Pro Leu Glu Arg Thr Ala Leu Ile
180 185 190
Met Thr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Val Ile Ser
195 200 205
His Arg Ser Ile Thr Ile Arg Phe Val His Ser Ser Asp Pro Ile Tyr
210 215 220
Gly Thr Arg Ile Ala Pro Asp Thr Ser Ile Leu Ala Ile Ala Pro Phe
225 230 235 240
His His Ala Phe Gly Leu Phe Thr Ala Leu Ala Tyr Phe Pro Val Gly
245 250 255
Leu Lys Ile Val Met Val Lys Lys Phe Glu Gly Glu Phe Phe Leu Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Asn Tyr Lys Ile Ala Ser Ile Val Val Pro Pro Pro Ile
275 280 285
Met Val Tyr Leu Ala Lys Ser Pro Leu Val Asp Glu Tyr Asn Leu Ser
290 295 300
Ser Leu Thr Glu Ile Ala Cys Gly Gly Ser Pro Leu Gly Arg Asp Ile
305 310 315 320
Ala Asp Lys Val Ala Lys Arg Leu Lys Val His Gly Ile Leu Gln Gly
325 330 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Cys Ser Ala Leu Ile Leu Ser Pro Asn Asp
340 345 350
Arg Glu Leu Lys Lys Gly Ala Ile Gly Thr Pro Met Pro Tyr Val Gln
355 360 365
Val Lys Val Ile Asp Ile Asn Thr Gly Lys Ala Leu Gly Pro Arg Glu
370 375 380
Lys Gly Glu Ile Cys Phe Lys Ser Gln Met Leu Met Lys Gly Tyr His
385 390 395 400
Asn Asn Pro Gln Ala Thr Arg Asp Ala Leu Asp Lys Asp Gly Trp Leu
405 410 415
His Thr Gly Asp Leu Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Arg Phe Ile Tyr Val
420 425 430
Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala
435 440 445
Pro Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Ser Asp
450 455 460
Ala Gly Val Ile Gly Ile Pro Asp Glu Phe Ala Gly Gln Leu Pro Ser
465 470 475 480
Ala Cys Val Val Leu Glu Pro Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Val
485 490 495
Gln Asp Tyr Ile Ala Glu Leu Val Thr Thr Thr Lys His Leu Arg Gly
500 505 510
Gly Val Val Phe Ile Asp Ser Ile Pro Lys Gly Pro Thr Gly Lys Leu
515 520 525
Met Arg Asn Glu Leu Arg Ala Ile Phe Ala Arg Glu Gln Ala Lys Ser
530 535 540
Lys Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
545 550 555 560
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Gly
565 570 575
Pro Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala
580 585 590
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
595 600 605
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
610 615 620
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
625 630 635 640
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
645 650 655
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
660 665 670
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
675 680 685
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
690 695 700
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
705 710 715 720
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
725 730 735
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
740 745 750
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
755 760 765
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
770 775 780
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
785 790 795 800
Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile
805 810 815
Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala
820 825 830
Tyr Ile Ala Phe Lys Arg Trp Asn Ser
835 840
<210> 312
<211> 2526
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SLR蛋白的多核苷酸
<400> 312
atggaagaag agaacatcgt gaatggcgat cgccctcggg atctggtgtt ccctggcaca 60
gccggcctgc agctgtatca gtccctgtat aaatactctt acatcaccga cggaatcatc 120
gacgcccaca ccaacgaggt gatctcctat gcccagattt tcgaaacaag ttgccgcctg 180
gccgtgagcc tggagaagta tggcctggat cacaacaacg tggtggccat ttgcagcgag 240
aacaacatcc acttcttcgg ccctctgatc gctgccctat accaggggat tccaatggcc 300
acatccaacg atatgtacac cgagagggag atgatcggcc acctgaacat ctccaagcca 360
tgtctgatgt tctgttccaa gaagtccctg ccattcatcc tgaaggtgca gaagcacctg 420
gactttctca agaaggtgat cgtgatcgac agcatgtacg acatcaacgg cgtggagtgc 480
gtgttcagtt tcgtgtcccg gtacaccgat catgcgttcg atccagtgaa gttcaaccct 540
aaagagtttg atcccctgga gagaaccgcg ctgatcatga catcctctgg aacaaccggc 600
ctgcctaagg gcgtggtgat cagccacagg agcatcacca tcagattcgt ccacagcagc 660
gatcccatct acggcacccg catcgcccca gatacatcca tcctggccat cgcccctttc 720
caccacgcct tcggactgtt taccgccctg gcttactttc cagtgggcct gaagatcgtg 780
atggtgaaaa agtttgaggg cgagttcttc ctgaagacca tccagaacta caagatcgct 840
tctatcgtgg tgcctcctcc aatcatggtg tatctggcca agagccctct ggtggatgag 900
tacaatctgt ccagcctgac agagatcgcc tgtggcggct cccctctggg cagagacatc 960
gccgacaagg tggccaagag actgaaggtc cacggcatcc tgcagggcta tggcctgacc 1020
gagacctgta gcgccctgat cctgagcccc aacgatagag agctgaagaa gggcgccatc 1080
ggcaccccta tgccctatgt ccaggtgaag gtgattgaca tcaacaccgg caaagccctg 1140
ggaccaagag agaagggcga gatttgcttc aagagccaga tgctgatgaa gggctaccac 1200
aacaacccac aggccaccag ggatgccctg gacaaggacg ggtggctgca caccggcgat 1260
ctgggctact acgacgagga cagattcatc tatgtggtgg atcggctgaa agaactcatc 1320
aagtacaagg gctaccaggt ggcccctgcc gagctggaga acttgcttct gcagcaccct 1380
aacatctctg atgccggcgt catcggcatc ccagacgagt ttgccggcca gctgccttcc 1440
gcctgtgtcg tgctggagcc tggcaagacc atgaccgaga aggaggtgca ggattatatc 1500
gccgagctgg tgaccaccac caagcacctg cggggcggcg tggtgttcat cgacagcatt 1560
ccgaaaggcc caacaggcaa gctgatgaga aacgagctga gggccatctt tgcccgcgag 1620
caggccaagt ccaagctgag ggccaagcgg tccggatccg gagccaccaa cttcagcctg 1680
ctgaagcagg ccggcgacgt ggaggagaac cccggcccca tggacgggcc gcgcctgctg 1740
ctgttgctgc ttctgggggt gtcccttgga ggtgccaagg aggcatgccc cacaggcctg 1800
tacacacaca gcggtgagtg ctgcaaagcc tgcaacctgg gcgagggtgt ggcccagcct 1860
tgtggagcca accagaccgt gtgtgagccc tgcctggaca gcgtgacgtt ctccgacgtg 1920
gtgagcgcga ccgagccgtg caagccgtgc accgagtgcg tggggctcca gagcatgtcg 1980
gcgccatgcg tggaggccga cgacgccgtg tgccgctgcg cctacggcta ctaccaggat 2040
gagacgactg ggcgctgcga ggcgtgccgc gtgtgcgagg cgggctcggg cctcgtgttc 2100
tcctgccagg acaagcagaa caccgtgtgc gaggagtgcc ccgacggcac gtattccgac 2160
gaggccaacc acgtggaccc gtgcctgccc tgcaccgtgt gcgaggacac cgagcgccag 2220
ctccgcgagt gcacacgctg ggccgacgcc gagtgcgagg agatccctgg ccgttggatt 2280
acacggtcca cacccccaga gggctcggac agcacagccc ccagcaccca ggagcctgag 2340
gcacctccag aacaagacct catagccagc acggtggcag gtgtggtgac cacagtgatg 2400
ggcagctccc agcccgtggt gacccgaggc accaccgaca acctcatccc tgtctattgc 2460
tccatcctgg ctgctgtggt tgtgggtctt gtggcctaca tagccttcaa gaggtggaac 2520
agctga 2526
<210> 313
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗 NY-ESO1 157-165抗体的CDRL1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 313
Gln Xaa Xaa Ser Xaa Xaa
1 5
<210> 314
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗NY-ESO1 157-165抗体的CDRL3
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(10)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 314
Gln Gln Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 315
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗 NY-ESO1 157-165 抗体的 CDRL1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 315
Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Tyr Xaa Xaa
1 5
<210> 316
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗NY-ESO1 157-165抗体的CDRL3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(11)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 316
Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val
1 5 10
<210> 317
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19抗体的CDRL1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 317
Xaa Ser Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Asn Tyr
1 5
<210> 318
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19抗体的CDRL2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 318
Asp Xaa Xaa
1
<210> 319
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19抗体的CDRL3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(11)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 319
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 320
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19抗体的CDRL1
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 320
Gln Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 321
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19抗体的CDRL3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 321
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Thr
1 5 10
<210> 322
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗NY-ESO1 157-165抗体的CDRH1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(4)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(8)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 322
Gly Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 323
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗NY-ESO1 157-165抗体的CDRH2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 323
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly Ser Thr
1 5
<210> 324
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗NY-ESO1 157-165抗体的CDRH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(6)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 324
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Met Asp Val
1 5 10
Claims (12)
1.一种CAR文库，其包含编码第1嵌合抗原受体(CAR)的核酸，
所述第1CAR包含第1抗原结合结构域、第1跨膜结构域、及第1细胞内信号转导结构域，
所述第1抗原结合结构域包含能筛选与靶抗原的结合的第1单链抗体(scFv)，
所述第1scFv包含第1重链可变区和第1轻链可变区，
所述第1重链可变区和所述第1轻链可变区满足下述条件1或条件2，
条件1：
所述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含能与所述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
所述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含第1B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件2：
所述第1重链可变区中的重链互补决定区(CDRH)1、CDRH2和CDRH3分别包含第1B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
所述第1轻链可变区中的轻链互补决定区(CDRL)1、CDRL2和CDRL3分别包含能与所述靶抗原结合的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
2.根据权利要求1所述的CAR文库，其中，所述第1细胞内信号转导结构域包含CD3ζ的细胞内信号转导结构域。
3.根据权利要求1或2所述的CAR文库，其中，所述第1跨膜结构域包含CD28的跨膜结构域。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的CAR文库，其中，所述第1B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
5.一种scFv的制造方法，其包括如下工序：
第1表达工序，使免疫细胞表达权利要求1～4中任一项所述的CAR文库；
第1接触工序，使所述第1表达工序中得到的免疫细胞与所述靶抗原接触；及
第1选择工序，选择所述第1接触工序中与所述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第1scFv作为能与所述靶抗原结合的第1候选scFv。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其包括基于所述第1候选scFv来制备第2CAR文库的制备工序，
所述第2CAR文库包含编码第2CAR的核酸，
所述第2CAR包含第2抗原结合结构域、第2跨膜结构域和第2细胞内信号转导结构域，
所述第2抗原结合结构域包含能筛选与所述靶抗原的结合的第2scFv，
所述第2scFv包含第2重链可变区和第2轻链可变区，
所述第2重链可变区和所述第2轻链可变区满足下述条件3或条件4，
所述制造方法还包括如下工序：
第2表达工序，使免疫细胞表达所述第2CAR文库；
第2接触工序，使所述第2表达工序中得到的免疫细胞与所述靶抗原接触；及
第2选择工序，选择所述第2接触工序中与所述靶抗原结合的免疫细胞所表达的CAR的第2scFv作为能与所述靶抗原结合的第2候选scFv，
条件3：
所述第1表达工序中的CAR文库满足所述条件1时，
所述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含第2B细胞受体的重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
所述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含所述第1候选scFv中的轻链可变区的CDRL1、CDRL2和CDRL3；
条件4：
所述第1表达工序中的CAR文库满足所述条件2时，
所述第2重链可变区中的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含所述第1候选scFv中的重链可变区的CDRH1、CDRH2和CDRH3，
所述第2轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含第2B细胞受体的轻链可变区中的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
7.根据权利要求6所述的scFv的制造方法，其实施多次所述第2接触工序。
8.根据权利要求6或7所述的scFv的制造方法，其中，所述第2选择工序中，使用所述靶抗原的单体或多聚体检测能与所述靶抗原结合的免疫细胞，
选择检测出的免疫细胞所表达的scFv作为所述第2候选scFv。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的scFv的制造方法，其中，所述第2B细胞受体为人源B细胞的B细胞受体。
10.根据权利要求5～9中任一项所述的scFv的制造方法，其实施多次所述第1接触工序。
11.根据权利要求5～10中任一项所述的scFv的制造方法，其中，所述第1选择工序中，使用所述靶抗原的单体或多聚体检测能与所述靶抗原结合的免疫细胞，
选择检测出的免疫细胞所表达的scFv作为所述第1候选scFv。
12.根据权利要求5～11中任一项所述的scFv的制造方法，其中，所述免疫细胞为T细胞。
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