JP2021118704A - 親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびその使用の提供。【解決手段】親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用する単一の細胞特徴付けのための方法および組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート(例えば、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート)を利用する。このコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が特異的に結合する表面抗原にバーコード化されている抗原ID(AID)配列を含む。したがって、本明細書に記載される方法を使用すると、単一の細胞の抗原(例えば、表面タンパク質)が、フルオロフォアを必要とせずに分析できる。例えば、ディスプレイされる単一の細胞の表面タンパク質は、抗原ID配列から識別できる。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、2015年9月24日に出願された米国仮出願番号第62/232,209
号に基づく優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援
用される。
背景
内因的に発現されて細胞膜上に位置するタンパク質の特定のセットの存在量によって、
多くの細胞型を識別および分類することができる。この現象は、イムノフェノタイピング
として公知のプロセスを使用する細胞の研究を可能にし、このプロセスにおいて、細胞は
、細胞の既知の表面タンパク質に特異的な蛍光標識された抗体と共にインキュベートされ
、そしてこのような抗体と結合する。フローサイトメトリーは、各細胞に対して表面結合
した抗体のレベルを測定するために一般に使用されている。しかし、フローサイトメトリ
ーベースのアプローチは、同じ実験で同時に使用できるフルオロフォアの数によって制限
される。さらに、フローサイトメトリーベースのアプローチを使用して同じ実験で同時に
使用できるフルオロフォアの数は、スペクトルの重複によって制限される。さらに、フロ
ーサイトメトリーは、多くの生物学的に適切なアッセイおよび引き続くDNA配列決定に
なじまない。
要旨
したがって、これらの制限なしに単一の細胞を特徴付ける、例えばイムノフェノタイピ
ングする方法が必要とされている。フローサイトメトリーベースのアプローチとは異なり
、本明細書に記載される方法は、個々の細胞のタンパク質を分析するために配列読み出し
を使用し、同じ実験で同時に使用できるフルオロフォアの数によってもそれらのスペクト
ルの重複によっても制限されない。さらに、本明細書に記載される方法は、多くの生物学
的に適切なアッセイおよび引き続くDNA配列決定になじむ。本明細書に記載される方法
は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート(例えば、抗体−オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲート)を利用する。このコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、親和性−オリ
ゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が特異的に結合する表面抗原にバーコード化
されている抗原ID(AID)配列を含む。したがって、本明細書に記載される方法を使
用すると、単一の細胞の抗原(例えば、表面タンパク質)が、フルオロフォアを必要とせ
ずに分析できる。例えば、ディスプレイされる単一の細胞の表面タンパク質は、抗原ID
配列から識別できる。単一の細胞の表面タンパク質のうち1種または複数は、単一の細胞
の正体、特徴または関連性を規定するために使用され得る。
本明細書に記載される方法の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、緩徐な細
胞ソーティング、細胞ソーティングと関連する低減された標的収量、限定数の出力ストリ
ーム、および親和性などの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの定量された特性
に対応しない選択されたビン(bin)の問題を克服するために使用され得る。示された
例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ベッセル中の四量体結合の単一細
胞測定を用いて、ソーティングを置き換えまたは増強し得る。示された例示の親和性−オ
リゴヌクレオチドコンジュゲートは、TCRペア配列、クローン存在量および相対的四量
体親和性を同時に獲得するために、本明細書に記載される方法において使用され得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて、ベッセル(例えば、エマルジョ
ン)中の細胞を特徴付ける、例えばイムノフェノタイピングする方法が、本明細書に記載
される。一部の実施形態では、この方法は、エマルジョンベースの単一の細胞の分析と適
合性の様式で細胞サブセットを識別するために使用される。一部の実施形態では、この方
法は、エマルジョンベースの単一の細胞の分析と適合性の様式で、抗原に特異的な免疫細
胞を識別するために使用される。一部の実施形態では、細胞分析の前に、表面タンパク質
特異的抗体は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、オリ
ゴヌクレオチドは、コンジュゲート抗体の標的特異性に固有の配列モチーフを含むように
設計される。このオリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの
親和性部分(例えば、抗体)に、共有結合的または非共有結合的にコンジュゲートされ得
る(例えば、ビオチン−オリゴヌクレオチドをストレプトアビジン−抗体に)。
方法は、混合物または溶液中で、1つまたは複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジ
ュゲートと共に細胞をインキュベートすることを含み得る。細胞は、未結合の親和性−オ
リゴヌクレオチドコンジュゲートを除去するために洗浄され得る。次いで、細胞は、ベッ
セル、例えば、エマルジョン中にカプセル化される。細胞は、ベッセル1つ当たり単一の
細胞の密度でベッセル中に存在し得る。したがって、ベッセル、例えば液滴内の親和性−
オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、特異的抗体−表面タンパク質相互作用を
介して、細胞表面に結合される。この方法は、ベッセル特異的DNA配列(例えば、固有
のベッセルバーコード)を親和性−コンジュゲートオリゴヌクレオチドに付着させること
を含み得る。さらなる細胞DNAまたはmRNA分析、表現型測定、機能的試験、細胞ソ
ーティングまたは他の反応が、親和性−コンジュゲートオリゴヌクレオチドを(例えば、
DNAバーコードで)バーコード化する前に、それと同時にまたはその後で、実施され得
る。
方法は、例えば、エマルジョン実験に引き続いて、エマルジョンから核酸を抽出するこ
とを含み得る。抽出された核酸は、配列決定のために調製され得、(例えば、次世代シー
クエンシング技術を使用して)配列決定され得る。方法は、抗原ID配列および液滴特異
的バーコード配列の両方を含むベッセル由来のポリヌクレオチド分子を配列決定すること
を含み得る。抗原ID配列は、オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体によって結合され
た特異的細胞表面タンパク質を規定できる。抗原ID配列は、特定の細胞表面タンパク質
に結合するオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体の特異的抗体を規定できる。したがっ
て、抗原ID配列は、分析された細胞上のどの表面タンパク質が発現されるかを示し得る
。単一の細胞を宿すベッセル中で、共有された液滴特異的バーコード配列を含む全ての配
列が、単一の細胞と関連する。したがって、単一の細胞は、その正体、特徴または関連性
を規定するために使用され得る表面タンパク質のセットを提示すると分析され得る。
一態様では、複数のベッセル中で反応を実行することを含む方法が提供され、反応は、
ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、複数のベッセ
ルのうちの1つのベッセル中で、単離された単一の細胞の標的抗原に結合した親和性−オ
リゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることを含む。
一態様では、複数のベッセルのうちの1つのベッセル中で反応を実行することを含む方
法が本明細書で提供され、反応は、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化
ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド
部分に付着させることを含み、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、複数のベ
ッセルのうちのそのベッセル中で細胞によって発現される標的抗原に結合する。
一部の実施形態では、細胞は、ベッセル内に含まれる単一の細胞である。一部の実施形
態では、ベッセルは、複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッセルを含む
。一部の実施形態では、ベッセルは、複数のベッセルの各ベッセルを含む。一部の実施形
態では、反応は、複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッセル中で起こる
。一部の実施形態では、各ベッセル中の細胞は、同じ試料由来である。一部の実施形態で
は、2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第1の複数のベッセルのうちの1
つのベッセル中の細胞は、2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第2の複数
のベッセルのうちの1つのベッセル中の細胞と同じ試料由来である。一部の実施形態では
、このオリゴヌクレオチド部分は、抗原識別配列(AID)を含む。一部の実施形態では
、AIDは、標的抗原、または親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分
にバーコード化される。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的抗原、または親和性−オリゴヌクレ
オチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化された抗原識別配列(AID)をさら
に含む。一部の実施形態では、抗原識別配列(AID)は、既知の配列である。
一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセル中の鋳型ベ
ッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である。
一部の実施形態では、この方法は、配列情報を取得するために、オリゴヌクレオチドま
たはそのアンプリコンを配列決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、配列情報に基づいて、単一の細胞の特徴を決定する
ことをさらに含む。一部の実施形態では、配列情報は、抗原識別(AID)配列を含む。
一部の実施形態では、この方法は、配列情報に基づいて、単一の細胞の特徴を決定するこ
とをさらに含む。一部の実施形態では、特徴は、表現型である。一部の実施形態では、表
現型は、免疫表現型である。
一部の実施形態では、この方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、単
一の細胞を含む複数の細胞に接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、接触さ
せることは、ベッセル中で単一の細胞が単離される前である。一部の実施形態では、この
方法は、接触させることの後に、複数の細胞を洗浄することをさらに含む。
一部の実施形態では、ベッセルは、標的抗原に結合していない親和性−オリゴヌクレオ
チドコンジュゲートを含まない。
一部の実施形態では、この方法は、ベッセル中の単一の細胞を単離することをさらに含
む。一部の実施形態では、単一の細胞は、単離することの前に親和性−オリゴヌクレオチ
ドコンジュゲートに結合される。
一部の実施形態では、この方法は、単一の細胞を溶解させることをさらに含む。一部の
実施形態では、溶解させることは、ベッセル中で単一の細胞が単離された後である。
一部の実施形態では、複数の細胞は、複数のソーティングされていない細胞である。
一部の実施形態では、複数のベッセルのうちの第1のベッセル中のベッセルバーコード
化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンのベッセルバーコード配列は、複数のベッセ
ルのうちの第2のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプ
リコンのベッセルバーコード配列とは異なる。一部の実施形態では、複数のベッセルのう
ちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコ
ンのベッセルバーコード配列は、同じベッセルバーコード配列を含む。一部の実施形態で
は、複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌク
レオチドおよびそのアンプリコンのベッセルバーコード配列は、複数のベッセルのうちの
任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアン
プリコンのベッセルバーコード配列に対して固有である。
一部の実施形態では、この方法は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、単一の
細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含む。一部の実施形態では、
ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
のオリゴヌクレオチドに付着させることと、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、
単一の細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることとは、同時に実行される。
一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅するこ
とをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチドまたはその相
補体を増幅することをさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはその
相補体を増幅することと、細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅することとは、
同時に実行される。
一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドのベッセルバーコード配列とオリゴヌクレ
オチドのベッセルバーコード配列とは同じである。
一部の実施形態では、この方法は、複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くの
ベッセルから、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含
む。一部の実施形態では、この方法は、複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多く
のベッセルから、オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンおよび細胞ポリヌクレオチ
ドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含む。一部の実施形態では、プール
することは、配列決定することの前である。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、複数の異なる親
和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、複数の親和性−
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、
固有の抗原識別(AID)配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複
数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子のうちの単一の親和性−オリゴヌク
レオチドコンジュゲート分子にバーコード化される親和性分子バーコード(AMB)配列
を含む。一部の実施形態では、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の
各親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、固有の親和性分子バーコード(A
MB)配列を含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、融合配列を含み、そして付着させること
は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを融合配列に付着させることを含む。一部の
実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プライマー結合配列を含む。一部の実施形態では
、オリゴヌクレオチドは定常配列(constant sequence)を含む。
一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド、その相補体、その増幅された
産物、またはそれらの組合せを配列決定することであって、それによって、オリゴヌクレ
オチド配列読み取りを生成することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、1
つまたは複数の第1のオリゴヌクレオチド配列読み取りを、1つまたは複数の第2のオリ
ゴヌクレオチド配列読み取りと比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方
法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りを分析することをさらに含む。一部の実施形態で
は、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析する
ことをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取り
の抗原識別(AID)配列を分析することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法
は、オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード(AMB)配列を分析する
ことをさらに含む。一部の実施形態では、分析することは、1もしくは複数のベッセルバ
ーコード配列、1もしくは複数のAID配列、1もしくは複数の親和性分子バーコード(
AMB)配列、またはそれらの組合せの頻度を決定することを含む。一部の実施形態では
、分析することは、比較することを含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌク
レオチド配列読み取りの抗原識別(AID)配列を、オリゴヌクレオチド配列読み取りの
親和性分子バーコード(AMB)配列と比較することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド、その相補体、その増幅され
た産物、またはそれらの組合せを配列決定することであって、それによって、細胞ポリヌ
クレオチド配列読み取りを生成することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は
、オリゴヌクレオチド配列読み取りを、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りと比較するこ
とをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド配列読み取りの
ベッセルバーコード配列を、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配
列と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチ
ド配列読み取りを比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞ポ
リヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさらに含む。一
部の実施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配
列を分析することをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、分析することまたは比較することに基づいて、細胞
の特徴を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオ
チド配列読み取りに基づいて、抗体またはTCRを選択することをさらに含む。一部の実
施形態では、この方法は、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体またはT
CRを選択することを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌク
レオチドと、細胞ポリヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
とは、ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である。一部の
実施形態では、オリゴヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
は、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である。
一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌ
クレオチドは、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である。
一部の実施形態では、ベッセルは、固体支持体を含む。一部の実施形態では、ベッセル
は、固体支持体を含まない。一部の実施形態では、複数のベッセルの各ベッセルは、単一
の細胞を含む。一部の実施形態では、ベッセルは、ウェル、エマルジョンまたは液滴であ
る。一部の実施形態では、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、固体支持体に
結合していない。一部の実施形態では、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、
固体支持体に結合している。
一部の実施形態では、この方法は、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの
1つの分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコード配列を、細胞ポリヌクレオチ
ドに付着させることをさらに含み、分子バーコード配列は、単一の細胞ポリヌクレオチド
分子およびそのアンプリコンにバーコード化される。
一部の実施形態では、付着させることは、ベッセルポリヌクレオチドをオリゴヌクレオ
チドにライゲーションすることを含む。一部の実施形態では、付着させることは、酵素を
用いてベッセルポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに付着させることを含む。一部の
実施形態では、付着させることは、ベッセルポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドにハ
イブリダイズさせることを含む。一部の実施形態では、付着させることは、オリゴヌクレ
オチドを伸長させることをさらに含む。一部の実施形態では、付着させることは、鋳型ベ
ッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは二本鎖である。一部の実施形態では、オリ
ゴヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドはDNAであ
る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドはRNAである。
一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドは、可変領域配列を含む。一部の実施形態
では、この方法は、可変領域配列を含むネイティブ鎖配列を対合させることをさらに含む
。一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドはDNAである。一部の実施形態では、細
胞ポリヌクレオチドはRNAである。一部の実施形態では、RNAはmRNAである。
一部の実施形態では、単一の細胞はB細胞である。一部の実施形態では、単一の細胞は
T細胞である。
一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、単一
の細胞の細胞外抗原に結合する。一部の実施形態では、単一の細胞の細胞外抗原は、免疫
細胞に特異的な抗原である。一部の実施形態では、単一の細胞の細胞外抗原は、T細胞に
特異的な抗原である。一部の実施形態では、この細胞外抗原はCD4である。一部の実施
形態では、この細胞外抗原はCD8である。一部の実施形態では、単一の細胞の細胞外抗
原は、B細胞に特異的な抗原である。一部の実施形態では、この細胞外抗原は免疫グロブ
リンである。
一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、抗体
またはその断片である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲート
の親和性部分は、ペプチドである。一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコン
ジュゲートの親和性部分は、タンパク質である。一部の実施形態では、親和性オリゴヌク
レオチドコンジュゲートの親和性部分は、アプタマーである。一部の実施形態では、親和
性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、小分子である。一部の実施形態で
は、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、薬物である。一部の実施
形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞である。一部
の実施形態では、この細胞は抗原提示細胞(APC)である。一部の実施形態では、親和
性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、主要組織適合性複合体(MHC)
を含む。一部の実施形態では、MHCは、可溶性および/または多量体(例えば、四量体
)形態である。一部の実施形態では、MHCは、ペプチドに結合している。一部の実施形
態では、ペプチドは合成ペプチドである。一部の実施形態では、MHCは、例えば単一の
細胞の、T細胞受容体(TCR)および/またはTCR様結合分子、例えば、TCR様抗
体もしくは免疫グロブリンもしくはキメラ抗原受容体に結合する。
一部の実施形態では、親和性部分は、抗原認識分子および/あるいは免疫受容体、例え
ば、抗体もしくは免疫グロブリンまたはそれらの部分もしくは融合物、操作された免疫受
容体、キメラ抗原受容体(CAR)、あるいはTCRに特異的に結合する。一部のかかる
実施形態では、親和性部分は、抗体もしくは受容体、例えばCARによって認識される抗
原もしくはエピトープまたはそれらの部分を含む。一部の実施形態では、親和性部分は、
免疫受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の態様では、
抗体またはその抗原結合性断片は、受容体の可変性部分および/または抗原結合性部分、
例えば、イディオトープに特異的に結合する。一部の態様では、親和性分子は、抗イディ
オタイプ抗体またはその断片である。
一部の実施形態では、親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、主要
組織適合性複合体(MHC)またはその機能的部分もしくは結合性部分を含む。一部の実
施形態では、親和性部分は、MHCの多量体、任意選択で、MHCの四量体を含む。一部
の実施形態では、MHCは、可溶性形態である。一部の実施形態では、MHCは、MHC
の溝内で、ペプチドに結合しているかおよび/またはペプチドを含む。一部の実施形態で
は、ペプチドは合成ペプチドである。一部の実施形態では、MHCは、単一の細胞のT細
胞受容体(TCR)に結合する。一部の実施形態では、親和性部分は、抗体もしくはキメ
ラ抗原受容体(CAR)に結合するペプチドを含み、および/または標的は、抗体もしく
はCARである。一部の実施形態では、親和性部分は、抗体もしくはキメラ抗原受容体に
よって特異的に認識される抗原もしくはエピトープであるかまたはそれを含み、および/
あるいはそれに特異的に結合する抗体、任意選択で、その抗原結合性部分に特異的に結合
する抗イディオタイプ抗体を含む。
一態様では、複数の細胞を含む試料由来の単一の細胞、単一の細胞の標的抗原に結合し
た親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、およびベッセルバーコード配列を含むベ
ッセルバーコード化ポリヌクレオチドを各々が含む複数のベッセルを含む組成物が提供さ
れる。一部の実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体は
、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着される。
一態様では、複数の細胞を含む試料由来の単一の溶解細胞、および単一の溶解細胞の標
的抗原に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを各々が含む複数のベッセ
ルを含む組成物が提供され;親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレ
オチドは、ベッセルバーコード配列を含み、単一の溶解細胞由来の細胞ポリヌクレオチド
は、同じベッセルバーコード配列を含む。
一態様では、複数のベッセルを含む組成物が本明細書で提供され、複数のベッセルのう
ちの1つのベッセルは、複数の細胞を含む試料由来の単一の細胞、およびベッセルバーコ
ード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含み、ベッセルは、単一の細胞
の標的抗原に結合する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはそれ由来のオ
リゴヌクレオチド部分をさらに含む。
一部の実施形態では、反応は、複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッ
セル中で起こる。一部の実施形態では、ベッセルは、複数のベッセルの各ベッセルを構成
する。一部の実施形態では、複数のベッセルは、2またはそれよりも多くの複数のベッセ
ルを構成する。一部の実施形態では、各ベッセル中の細胞は、同じ試料由来である。一部
の実施形態では、2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第1の複数のベッセ
ルのうちの1つのベッセル中の細胞は、2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうち
の第2の複数のベッセルのうちの1つのベッセル中の細胞と同じ試料由来である。一部の
実施形態では、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体は、親和性−オ
リゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着される。一部の実施形態で
は、単一の細胞は溶解される。
一態様では、複数のベッセルを含む組成物が本明細書で提供され、複数のベッセルのう
ちの1つのベッセルは、複数の細胞を含む試料由来の単一の溶解細胞、および単一の溶解
細胞の標的抗原に結合する親和性部分を含む親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
、またはこの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分を含
み;親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、ベッセル
バーコード配列を含み、単一の溶解細胞由来の細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバ
ーコード配列を含む。
一態様では、第1の抗原識別(AID)配列を含む第1のオリゴヌクレオチドを含む第
1の容器であって、第1のAID配列が既知の配列である、第1の容器;第2の抗原識別
(AID)配列を含む第2のオリゴヌクレオチドを含む第2の容器であって、第2のAI
D配列が既知の配列であり、第1のAID配列とは異なる、第2の容器;第1のオリゴヌ
クレオチドを第1の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬と、第2のオリゴ
ヌクレオチドを第2の親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬とを含む、1つ
または複数の第3の容器;第1のオリゴヌクレオチドを第1の親和性分子にどのようにコ
ンジュゲートするか、および第2のオリゴヌクレオチドを第2の親和性分子にどのように
コンジュゲートするかを記載する、指示書のセットを含むキットが提供される。
一態様では、抗原識別(AID)配列を含むオリゴヌクレオチドを含む第1の容器であ
って、AID配列が既知の配列である、第1の容器;オリゴヌクレオチドを親和性分子に
コンジュゲートすることが可能な試薬を含む第2の容器;複数のベッセルバーコード化ポ
リヌクレオチドを含む第3の容器;および親和性分子にコンジュゲートされたときに、複
数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのうちの1つのベッセルバーコード化ポリヌ
クレオチドをオリゴヌクレオチドにどのように付着させるかを記載する、指示書のセット
を含むキットが提供される。
本明細書に開示される方法および組成物は、腫瘍プロファイリングに使用され得る。例
えば、これらの方法は、細胞表現型を患者試料中の免疫レパートリーとリンクさせて、腫
瘍反応性TCRを識別することを含み得る。本明細書に開示される方法および組成物は、
養子細胞療法に使用され得る。例えば、これらの方法は、ソーティングなしのT細胞の遺
伝子分析を含み得る。例えば、これらの方法は、産物の製造および処理の間に、T細胞ク
ローン情報(TCRを使用する)を遺伝子発現パターンと組み合わせることを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、養子細胞療法の前、その過程の間、
またはその後に、患者から取得された養子移入された細胞を追跡、特徴付け、モニタリン
グおよび/または評価するために使用され得る。本明細書に開示される方法および組成物
は、既知の標的に対するTCRを識別するために使用され得る。例えば、これらの方法は
、抗原に対して高度に応答してもよいがあまり増殖しない高親和性クローンを識別するこ
とを含み得る。本明細書に開示される方法および組成物は、細胞試料の多重化に使用され
得る。例えば、1つまたは複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと接触させ
たプールされた細胞試料を含むエマルジョンは、同時に複数の試料を処理しながら、オリ
ジナルの細胞試料を識別するために使用され得る。
参照による組込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許ま
たは特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで、
全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されている新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示されている。本
明細書に記載されている特徴および特徴の利点に関するより良好な理解は、本明細書に記
載されている特徴の原理が利用されている説明例が示されている以下の詳細な記載および
添付の図面を参照することにより得られ得る。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
複数のベッセルのうちの1つのベッセル中で反応を実行することを含む方法であって、
前記反応が、ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分に付着させること
を含み、前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、前記複数のベッセルのうち
の1つのベッセル中で細胞によって発現される標的抗原に結合する、方法。
(項目2)
前記細胞が、前記ベッセル内に含まれる単一の細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
反応が、前記複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッセル中で起こる、
項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記ベッセルが、前記複数のベッセルの各ベッセルを構成する、項目1から3のいずれ
か一項に記載の方法。
(項目5)
前記複数のベッセルが、2またはそれよりも多くの複数のベッセルを含む、項目1から
4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
各ベッセル中の前記細胞が、同じ試料由来である、項目4または5に記載の方法。
(項目7)
前記2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第1の複数のベッセルのうちの
1つのベッセル中の前記細胞が、前記2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの
第2の複数のベッセルのうちの1つのベッセル中の前記細胞と同じ試料由来である、項目
5に記載の方法。
(項目8)
前記オリゴヌクレオチド部分が、抗原識別配列(AID)を含む、項目1から7のいず
れか一項に記載の方法。
(項目9)
前記AIDが、前記標的抗原、または前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
の親和性部分にバーコード化される、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記抗原識別配列(AID)が既知の配列である、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、前記ベッセル中の鋳型ベッセルバーコ
ード化ポリヌクレオチド由来である、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
配列情報を取得するために、前記オリゴヌクレオチドまたはそのアンプリコンを配列決
定することをさらに含む、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記配列情報に基づいて、前記ベッセル中の前記細胞の特徴を決定することをさらに含
む、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記配列情報が、前記抗原識別(AID)配列もしくはその相補体を含み、および/ま
たは前記AID配列を有する分子のコピー数を含む、項目12または13に記載の方法。
(項目15)
前記配列情報に基づいて、前記単一の細胞の特徴を決定することをさらに含む、項目1
2から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記特徴が表現型である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記表現型が免疫表現型である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、単一の細胞を含む複数の細胞に接
触させることをさらに含む、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記接触させることが、前記ベッセル中で前記単一の細胞が単離される前である、項目
18に記載の方法。
(項目20)
前記接触させることの後に、前記複数の細胞を洗浄することをさらに含む、項目18ま
たは19に記載の方法。
(項目21)
前記ベッセルが、標的抗原に結合していない親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲー
トを含まない、項目1から20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記ベッセル中の前記単一の細胞を単離することをさらに含む、項目1から21のいず
れか一項に記載の方法。
(項目23)
前記単一の細胞が、前記単離することの前に前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュ
ゲートに結合される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記単一の細胞を溶解させることをさらに含む、項目1から23のいずれか一項に記載
の方法。
(項目25)
前記溶解させることが、前記ベッセル中で前記単一の細胞が単離された後である、項目
24に記載の方法。
(項目26)
前記複数の細胞が、複数のソーティングされていない細胞である、項目1から25のい
ずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記複数のベッセルのうちの第1のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチ
ドまたはそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセルのうち
の第2のベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの
前記ベッセルバーコード配列とは異なる、項目1から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記複数のベッセルのうちの単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオ
チドまたはそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列が、同じベッセルバーコード
配列を含む、項目1から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記複数のベッセルのうちの任意の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌ
クレオチドおよびそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列が、前記複数のベッセ
ルのうちの任意の他の単一のベッセル中の各ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドおよ
びそのアンプリコンの前記ベッセルバーコード配列に対して固有である、項目1から28
のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記ベッセルバーコードを含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、前記細胞由
来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含む、項目1から29のいずれか一
項に記載の方法。
(項目31)
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュ
ゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることと、前記ベッセルバーコード化ポリヌクレ
オチドを、前記単一の細胞由来の細胞ポリヌクレオチドに付着させることとが、同時に実
行される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅することをさらに含む、項目1から3
1のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体を増幅することをさらに含む、項目30か
ら32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記オリゴヌクレオチドまたはその相補体を増幅することと、前記細胞ポリヌクレオチ
ドまたはその相補体を増幅することとが、同時に実行される、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記細胞ポリヌクレオチドの前記ベッセルバーコード配列と前記オリゴヌクレオチドの
前記ベッセルバーコード配列とが同じである、項目30から34のいずれか一項に記載の
方法。
(項目36)
前記複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッセルから、オリゴヌクレオ
チドまたはそのアンプリコンをプールすることをさらに含む、項目1から35のいずれか
一項に記載の方法。
(項目37)
前記複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッセルから、オリゴヌクレオ
チドまたはそのアンプリコンおよび細胞ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンをプー
ルすることをさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記プールすることが、配列決定することの前である、項目36または37に記載の方
法。
(項目39)
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、複数の異なる親和性−オリゴヌク
レオチドコンジュゲートを含む、項目1から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各親和性−オリゴヌクレオチ
ドコンジュゲートが、固有の抗原識別(AID)配列を含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記オリゴヌクレオチドが、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の
うちの単一の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子にバーコード化される親和
性分子バーコード(AMB)配列を含む、項目1から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の各親和性−オリゴヌクレ
オチドコンジュゲート分子が、固有の親和性分子バーコード(AMB)配列を含む、項目
41に記載の方法。
(項目43)
前記オリゴヌクレオチドが、融合配列を含み、前記付着させることが、前記ベッセルバ
ーコード化ポリヌクレオチドを前記融合配列に付着させることを含む、項目1から42の
いずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記オリゴヌクレオチドが、プライマー結合配列を含む、項目1から43のいずれか一
項に記載の方法。
(項目45)
前記オリゴヌクレオチドが、定常配列を含む、項目1から44のいずれか一項に記載の
方法。
(項目46)
前記オリゴヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せを
配列決定することであって、それによって、オリゴヌクレオチド配列読み取りを生成する
ことをさらに含む、項目1から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
1つまたは複数の第1のオリゴヌクレオチド配列読み取りを、1つまたは複数の第2の
オリゴヌクレオチド配列読み取りと比較することをさらに含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りを分析することをさらに含む、項目46または4
7に記載の方法。
(項目49)
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさら
に含む、項目46から48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別(AID)配列を分析することをさら
に含む、項目46から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りの親和性分子バーコード(AMB)配列を分析す
ることをさらに含む、項目46から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記分析することが、1もしくは複数のベッセルバーコード配列、1もしくは複数のA
ID配列、1もしくは複数の親和性分子バーコード(AMB)配列、またはそれらの組合
せの頻度を決定することを含む、項目48から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記分析することが、比較することを含む、項目48から52のいずれか一項に記載の
方法。
(項目54)
オリゴヌクレオチド配列読み取りの抗原識別(AID)配列を、オリゴヌクレオチド配
列読み取りの親和性分子バーコード(AMB)配列と比較することをさらに含む、項目4
6から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記細胞ポリヌクレオチド、その相補体、その増幅された産物、またはそれらの組合せ
を配列決定することであって、それによって、細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを生成
することをさらに含む、項目30から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
オリゴヌクレオチド配列読み取りを、前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りと比較す
ることをさらに含む、項目55に記載の方法。
(項目57)
オリゴヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を、前記細胞ポリヌクレオ
チド配列読み取りのベッセルバーコード配列と比較することをさらに含む、項目55また
は56に記載の方法。
(項目58)
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りを比較することをさらに含む、項目55から5
4のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りのベッセルバーコード配列を分析することをさ
らに含む、項目55から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りの分子バーコード配列を分析することをさらに
含む、項目55から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記分析することまたは前記比較することに基づいて、細胞の特徴を決定することをさ
らに含む、項目46から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記オリゴヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体またはTCRを選択することを
さらに含む、項目46から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記細胞ポリヌクレオチド配列読み取りに基づいて、抗体またはTCRを選択すること
を含む、項目55から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記オリゴヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドと、
前記細胞ポリヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドとが
、前記ベッセル中の同じ鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド由来である、項目1
から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記オリゴヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、
鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、項目1から64のいずれ
か一項に記載の方法。
(項目66)
前記細胞ポリヌクレオチドに付着させた前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが
、前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物である、項目64または6
5に記載の方法。
(項目67)
前記ベッセルが、固体支持体を含む、項目1から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記ベッセルが、固体支持体を含まない、項目1から66のいずれか一項に記載の方法

(項目69)
前記複数のベッセルの各ベッセルが、単一の細胞を含む、項目1から68のいずれか一
項に記載の方法。
(項目70)
前記ベッセルが、ウェル、エマルジョンまたは液滴である、項目1から69のいずれか
一項に記載の方法。
(項目71)
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合していない、項
目1から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合している、項目
1から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの1つの分子バーコード化ポリヌクレ
オチドの分子バーコード配列を、前記細胞ポリヌクレオチドに付着させることをさらに含
み、前記分子バーコード配列が、単一の細胞ポリヌクレオチド分子およびそのアンプリコ
ンにバーコード化される、項目1から72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
前記付着させることが、前記ベッセルポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドにラ
イゲーションすることを含む、項目1から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記付着させることが、酵素を用いて前記ベッセルポリヌクレオチドを前記オリゴヌク
レオチドに付着させることを含む、項目1から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
前記付着させることが、前記ベッセルポリヌクレオチドを前記オリゴヌクレオチドにハ
イブリダイズさせることを含む、項目1から75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記付着させることが、前記オリゴヌクレオチドを伸長させることをさらに含む、項目
76に記載の方法。
(項目78)
前記付着させることが、鋳型ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを増幅することを
含む、項目1から77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、前記単一の細胞の細
胞外抗原に結合する、項目1から78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、免疫細胞に特異的な抗原である、項目1から79
のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、T細胞に特異的な抗原またはT細胞によって発現
される抗原である、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記細胞外抗原がCD4である、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記細胞外抗原がCD8である、項目81に記載の方法。
(項目84)
前記細胞外抗原が、CD154、CD4、CD8、CD137、CD40L、CD80
、CD86、CD11c、CD25、CD69、CD44、CD125、CD2、CD3
、CD5、CD14およびCD19からなる群から選択される、項目81に記載の方法。
(項目85)
前記単一の細胞の前記細胞外抗原が、B細胞に特異的な抗原またはB細胞によって発現
される抗原である、項目80に記載の方法。
(項目86)
前記細胞外抗原が免疫グロブリンである、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記オリゴヌクレオチドが二本鎖である、項目1から86のいずれか一項に記載の方法

(項目88)
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、項目1から86のいずれか一項に記載の方法

(項目89)
前記オリゴヌクレオチドがDNAである、項目1から88のいずれか一項に記載の方法

(項目90)
前記オリゴヌクレオチドがRNAである、項目1から88のいずれか一項に記載の方法

(項目91)
前記細胞ポリヌクレオチドが、可変領域配列を含む、項目1から90のいずれか一項に
記載の方法。
(項目92)
可変領域配列を含むネイティブ鎖配列を対合させることをさらに含む、項目1から91
のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
前記単一の細胞がT細胞である、項目1から84および87から92のいずれか一項に
記載の方法。
(項目94)
前記単一の細胞がB細胞である、1から80および85から92のいずれか一項に記載
の方法。
(項目95)
前記細胞ポリヌクレオチドがDNAである、項目30から94のいずれか一項に記載の
方法。
(項目96)
前記細胞ポリヌクレオチドがRNAである、項目30から94のいずれか一項に記載の
方法。
(項目97)
前記RNAがmRNAである、項目96に記載の方法。
(項目98)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、抗体またはその断片で
ある、項目1から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、ペプチドである、項目
1から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目100)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、タンパク質である、項
目1から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、アプタマーである、項
目1から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、小分子である、項目1
から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、薬物である、項目1か
ら97のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、細胞である、項目1か
ら97のいずれか一項に記載の方法。
(項目105)
前記細胞が抗原提示細胞(APC)である、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記親和性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分が、主要組織適合性複合体
(MHC)またはその機能的部分もしくは結合性部分を含む、項目1から97のいずれか
一項に記載の方法。
(項目107)
前記親和性部分が、前記MHCの多量体、任意選択で、前記MHCの四量体を含む、項
目106に記載の方法。
(項目108)
前記MHCが可溶性形態である、項目106または107に記載の方法。
(項目109)
前記MHCが、前記MHCの溝内で、ペプチドに結合しているか、そして/またはペプ
チドを含む、項目106から108のいずれか一項に記載の方法。
(項目110)
前記ペプチドが合成ペプチドである、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記MHCが、前記単一の細胞のT細胞受容体(TCR)に結合する、項目106から
110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
前記親和性部分が、抗体もしくはキメラ抗原受容体(CAR)に結合するペプチドを含
み、および/または前記標的が、抗体もしくはCARである、項目1から97のいずれか
一項に記載の方法。
(項目113)
前記親和性部分が、前記抗体もしくは前記キメラ抗原受容体によって特異的に認識され
る抗原もしくはエピトープであるかまたはそれを含み、そして/またはそれに特異的に結
合する抗体、任意選択で、その抗原結合性部分に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体
を含む、項目112に記載の方法。
(項目114)
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの1つのベッセルが

(a)複数の細胞を含む試料由来の単一の細胞、および
(b)ベッセルバーコード配列を含むベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
を含み、
前記ベッセルが、前記単一の細胞の標的抗原に結合する親和性−オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲート、またはそれ由来のオリゴヌクレオチド部分をさらに含む、組成物。
(項目115)
反応が、前記複数のベッセルのうちの2またはそれよりも多くのベッセル中で起こる、
項目114に記載の組成物。
(項目116)
前記ベッセルが、前記複数のベッセルの各ベッセルを構成する、項目114または11
5に記載の組成物。
(項目117)
前記複数のベッセルが、2またはそれよりも多くの複数のベッセルを含む、項目114
から116のいずれか一項に記載の組成物。
(項目118)
各ベッセル中の前記細胞が、同じ試料由来である、項目116または117に記載の組
成物。
(項目119)
前記2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの第1の複数のベッセルのうちの
1つのベッセル中の前記細胞が、前記2またはそれよりも多くの複数のベッセルのうちの
第2の複数のベッセルのうちの1つのベッセル中の前記細胞と同じ試料由来である、項目
117に記載の組成物。
(項目120)
前記ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドまたはその相補体が、前記親和性−オリゴ
ヌクレオチドコンジュゲートの前記オリゴヌクレオチドに付着される、項目114から1
19のいずれか一項に記載の組成物。
(項目121)
前記単一の細胞が溶解される、項目114から120のいずれか一項に記載の組成物。
(項目122)
複数のベッセルを含む組成物であって、前記複数のベッセルのうちの1つのベッセルが

(a)複数の細胞を含む試料由来の単一の溶解細胞、および
(b)前記単一の溶解細胞の標的抗原に結合する親和性部分を含む親和性−オリゴヌク
レオチドコンジュゲート、または前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリ
ゴヌクレオチド部分
を含み、
前記親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分が、ベッセ
ルバーコード配列を含み、前記単一の溶解細胞由来の細胞ポリヌクレオチドが、同じベッ
セルバーコード配列を含む、組成物。
(項目123)
(a)第1の抗原識別(AID)配列を含む第1のオリゴヌクレオチドを含む第1の容
器であって、前記第1のAID配列が既知の配列である、第1の容器;
(b)第2の抗原識別(AID)配列を含む第2のオリゴヌクレオチドを含む第2の容
器であって、前記第2のAID配列が既知の配列であり、前記第1のAID配列とは異な
る、第2の容器;
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドを第1の親和性分子にコンジュゲートすることが
可能な試薬と、前記第2のオリゴヌクレオチドを第2の親和性分子にコンジュゲートする
ことが可能な試薬とを含む、1つまたは複数の第3の容器;
(d)前記第1のオリゴヌクレオチドを前記第1の親和性分子にどのようにコンジュゲ
ートするか、および前記第2のオリゴヌクレオチドを前記第2の親和性分子にどのように
コンジュゲートするかを記載する、指示書のセット
を含む、キット。
(項目124)
(a)抗原識別(AID)配列を含むオリゴヌクレオチドを含む第1の容器であって、
前記AID配列が既知の配列である、第1の容器;
(b)前記オリゴヌクレオチドを親和性分子にコンジュゲートすることが可能な試薬を
含む第2の容器;
(c)複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含む第3の容器;および
(d)前記親和性分子にコンジュゲートされたときに、前記複数のベッセルバーコード
化ポリヌクレオチドのうちの1つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを前記オリゴ
ヌクレオチドにどのように付着させるかを記載する、指示書のセット
を含む、キット。
図1は、本明細書に記載されている方法のベッセルの例示の模式図を示す。
図2は、抗体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドタグの例示の設計を示す。各有色ブロックは、完全なオリゴヌクレオチド配列の部分を表わす。融合配列は、エマルジョン反応内での液滴特異的DNAバーコードの酵素的付着に使用される。配列の1つの考え得る配置のみが示されているが、他の配置も本記載の方法と適合する。
図3Aは、追加のmRNAおよびタンパク質標的を有する免疫受容体配列の例示の同時捕捉を示す。表面タンパク質標的は、エマルジョン配列決定の前に、細胞をDNA標識染色抗体と共に事前にインキュベートすることにより定量化される。
図3Bは、健常ヒトT細胞から生成された3,682個の液滴バーコードTCR Vα
Vβペアの、例示のCD4およびCD8 mRNAならびにタンパク質測定を示す。
図3Cは、mRNAとタンパク質測定との例示の合致を示す(各点は、TCR VαVβペアにリンクする液滴バーコードである)。
図3Dは、エマルジョン内でのソーティングされていないT細胞に由来するCD4およびCD8のmRNAおよびタンパク質の同時検出の例示の表を示す。30,000個のインプットT細胞から、3,682個のTCRペアが回収された。mRNA対タンパク質(分子計数、多数決原理に基づく)によりCD4またはCD8とみなされたTCRペアの頻度が、マトリックスで示されている。
図3Eは、CD4を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびCD8を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用した、45,870個の単一細胞TCRペアの例示の結果を示す。
図4は、CD4を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびCD8を標的とする親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが使用される例示の方法の模式図を示す。
図5は、エマルジョン内での単一免疫細胞バーコード付与方法の結果を例示する。
図5Aは、細胞および溶解/反応(LR)混合物を含有する2つの水性流動を油内に通
して、毎時800万液滴を超えて単分散エマルジョンを生成する例示の図である。
図5Bは、ベッセル内の細胞が溶解され、単一反応で分子特異的および液滴特異的バー
コード付与に供されることを示す例示の図である。
図5Cは、標的mRNAが逆転写され、ユニバーサルアダプター配列で鋳型スイッチタ
グ化されることを示す例示の図である。その後、初めに1液滴当たり約1分子に希釈され
た液滴バーコード鋳型のPCR増幅が起こる。増幅されたバーコードを、相補的オーバー
ラップ伸長法により、鋳型スイッチしたcDNAに追加する。エマルジョンから産物を回
収し、追加のライブラリー処理ステップおよびハイスループット配列決定の前に、RTプ
ライマーのビオチンを使用して精製する。
図5Dは、二重バーコード付与により、配列決定読み取りをそれらの由来分子および由
来液滴にクラスター化することが可能になり、配列決定エラーおよび増幅バイアスを最小
限に抑えつつ、ネイティブ受容体鎖対合が再構築されることを示す例示の図である。
図6は、単離された健常B細胞からBCRを回収するための方法の結果を例示する。
図6Aは、300万個のB細胞が0.2細胞/液滴でエマルジョン内を通過し、占領細
胞の約90%が単一細胞を含有する結果となった液滴の例示の図である。
図6Bは、V対合精度の例示の図である。エマルジョンバーコード付与および配
列決定後、データを、単一細胞液滴に由来するデータについて濃縮し、V対合精度
を、拡大クローン中のペア一貫性を使用して評価した。
図6Cは、液滴バーコードパーセント対Igアイソタイプの例示のグラフである。25
9,368個のフィルタリングされたVペアの重鎖アイソタイプ(各液滴内の最も
多量なアイソタイプ)および軽鎖遺伝子座使用率が示されている。
図6Dは、6つの独立エマルジョン画分の各々の、100個の最高頻度重鎖のクローン
のランク存在量の例示のグラフである。0.05%の全体頻度に印が付けられている。
図6Eは、各液滴バーコード内の捕捉mRNAの数により評価した、細胞内でのV
発現の例示のグラフである。アイソタイプ毎に、5,000個の点が示されている。
図6Fは、BCRペアのV対V突然変異相関性および各アイソタイプ内の密度分布
の例示のグラフである。
図7は、HIV広域中和抗体(bNAb)を発見するための方法の結果を例示する。
図7Aは、エマルジョンに入れられたHIV長期非進行者のB細胞に由来する38,6
20個の回収したVペアの重鎖アイソタイプ分布の例示のグラフである。先に知ら
れたbNAb(「PGT様」)と良好にアラインするIgG鎖の割合はわずかである。
図7Bは、既知のbNAb(黒色)+新たに回収されたもの(赤色、液滴バーコードで
標識されている)の完全なVDJアミノ酸配列の系統樹の例示の図である。重鎖(左)お
よび軽鎖(右)は別々にプロットされている。ミスマッチの可能性のある抗体PGT12
2およびPGT123は青色である。
図7Cは、PGT121の対照ストックと比較した、10株のHIVに対する、8つの
新たに発見されたPGT様バリアントの中和活性(IC50、μg/mL)の例示の図で
ある。
図8は、卵巣腫瘍に由来するTILを特徴付けるための方法の結果を例示する。
図8Aは、卵巣腫瘍に由来する400,000個のソーティングされていない分離され
た細胞がエマルジョンに入れられ、BCRペアおよびTCRペアが、エマルジョンバーコ
ード付与により同時に回収された液滴の例示の図である。
図8Bは、フィルタリング後に液滴バーコード内で観察された全てのV/Vおよび
Vα/Vβ組合せの数を示す、液滴バーコード対受容体鎖組合せの例示のグラフである。
図8Cは、回収したBCRペアの液滴バーコードパーセント対重鎖アイソタイプ分布の
例示のグラフである。
図8Dは、BCRペアについてのV対V突然変異相関性および各アイソタイプ内の
密度分布の例示のグラフである。
図8Eは、全体の(上段)TCRペアおよびBCRペアの、および異なるアイソタイプ
(下段)の捕捉mRNAの数の例示のグラフを示す。
図8Fは、6つの独立エマルジョン画分の各々における、30個の最高頻度のBCR重
鎖クローン(上段)および30個の最高頻度のTCRベータ鎖クローンのランク存在量を
示すクローン分析の例示のグラフを示す。1%および10%の全体頻度レベルが示されて
いる。
図9は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを使用してイムノフェノタイピング
するための方法を例示する。
図9Aは、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合されている単一細胞を各々が含有する2つのベッセルを示す例示の模式図を示す。(DB1−液滴バーコード1;DB2−液滴バーコード2;MB1−分子バーコード1;MB2−分子バーコード2;AID−抗原IDバーコード;AMB1−抗体分子バーコード1;AMB2−抗体分子バーコード2)。
図9Bは、図9Aのベッセルの溶解細胞に由来するRNA分子を各々が含有する2つのベッセルを示す例示の模式図を示す。RNA分子が逆転写され、逆転写により創出されたcDNA分子の末端に非鋳型ヌクレオチドが付加されている。逆転写により創出されたcDNA分子の末端に付加された非鋳型ヌクレオチドに、分子バーコードがハイブリダイズされている。
図9Cは、増幅され、図9BのベッセルのcDNAにハイブリダイゼーションにより付着されている、各々が鋳型バーコード化ポリヌクレオチドを含有する2つのベッセルを示す例示の模式図を示す。cDNAは、伸長されている(上段)。その後、伸長されたcDNAが増幅される(下段)。
図9Dは、同じ同一RNA配列に付着されている同じ分子バーコード(MB)を有するRNA−MB−DB種が、PCR複製の結果である可能性が高いことを示す例示の模式図を示す。同じ同一RNA配列に付着されている2つの異なるMBを有するRNA−MB−DB種(RNA1−MB1−DBおよびRNA1−MB2−DB)は、2つの当初の独立RNA分子であり、PCR複製由来ではない。
図9Eは、同じ液滴バーコード(DB)および抗原IDバーコード(AID)を有する配列に付着されている、同じ抗体分子バーコード(AMB)を有するDB−AMB−AID種が、PCR複製の結果である可能性が高いことを示す例示の模式図を示す。同じ液滴バーコード(DB)および抗原IDバーコード(AID)を有する配列に付着されている、2つの異なるAMBを有するDB1−AMB1−AID1およびDB1−AMB2−AID1種は、ベッセル内の同じ単一細胞に付着された同じ標的抗原に特異的に結合する抗体を各々が有する2つの独立抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に由来し、PCR複製由来ではない2つの独立オリゴヌクレオチド分子である。同じ液滴バーコード(DB)および同じまたは異なる抗体分子バーコード(AMB)を有する配列に付着されている、2つの異なるAIDを有するDB1−AMBn−AID1およびDB1−AMBn−AID2種は、ベッセル内の同じ単一細胞に付着されている2つの独立抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子に由来する2つの独立オリゴヌクレオチド分子であり、抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子の一方は、第1の標的抗原と特異的に結合する抗体を有し、他方の抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子は、第2の標的抗原と特異的に結合する抗体を有する。
図10Aは、本明細書に記載されている方法の例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの模式図を示す。
図10Bは、本明細書に記載されている方法の例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの模式図を示す。
図11Aは、TCRに結合する親和性部分を含む、本明細書に記載されている方法の2つの例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの結合シグナルの例示のグラフを示す。
図12Aは、本明細書に記載されている方法の例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合されているT細胞の例示の模式図を示す。
図12Bは、本明細書に記載されている方法の例示の親和性−オリゴヌクレオチドコン
ジュゲートに結合されている液滴内T細胞の例示の模式図を示す。液滴中の核酸は、液滴
識別用配列で印が付けられ、次世代シークエンシングライブラリーに組み込まれる。
図13は、例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート四量体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドタグの例示の模式図を示す。四量体IDは、四量体バッチに対応する短鎖の定常DNA配列であり、単一の実験にて、ペプチド−MHC標的等の異なる標的の多重化を可能にする。分子バーコードは、結合された四量体を定量化するための分子計数を可能にする縮重配列である。
図14は、DNA標識MHC四量体試薬から生成された例示の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの模式図を示す。一実施形態では、Cy5連結DNAオリゴヌクレオチドが合成され、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンにコンジュゲートされる。一実施形態では、非蛍光性DNAオリゴヌクレオチドが、APC−ストレプトアビジンにコンジュゲートされる。一実施形態では、非蛍光性DNAオリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンまたはニュートラアビジンの混合物が、活性化APCにコンジュゲートされる。
図15は、クリック化学を使用して、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするための例示の方法を示す。
図16は、例示の親和性−オリゴヌクレオチドを調製および特徴付けるための例示のワークフローの模式図を示す。
図17は、CD3、CD19、CD4、CD8、HLA−DR、およびCTLA−4を標的とする6つの異なる親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが使用する、本明細書に記載されている例示の方法の結果を示す。各点は、液滴バーコード/単一細胞である。細胞同一性は、回収した受容体ペアのタイプにより明らかにされた(TCR=T細胞;Ig=B細胞)。
詳細な説明
いくつかの態様が、例示のために、例となる適用に関連して、以下に記載される。多く
の具体的な詳細、関連性および方法が、本明細書に記載される特色の完全な理解を提供す
るために示されていることを理解すべきである。しかし、当業者は、本明細書に記載され
る特色が、具体的な詳細のうち1つもしくは複数を伴わずに、または他の方法を伴って実
施され得ることを容易に認識する。一部の行為は、他の行為もしくは事象とは異なる順序
でおよび/またはそれらと同時に生じ得るので、本明細書に記載される特色は、行為また
は事象の例示された順序付けによっては限定されない。さらに、全ての例示された行為ま
たは事象が、本明細書に記載される特色に従って方法論を実行するために必要とされるわ
けではない。
本明細書で使用される用語法は、特定の場合のみを記載することを目的としているので
あって、限定を意図するものではない。本明細書で使用する場合、単数形「1つの(a)
」、「1つの(an)」および「この(the)」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数
形も同様に含むことが意図される。さらに、用語「含む(including)」、「含む(inclu
des)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」、またはそれ
らの異形は、詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにお
いて、かかる用語は、用語「含む(comprising)」と類似の様式で包括的である意図であ
る。
用語「約」または「およそ」は、値がどのように測定または決定されるか、即ち、測定
系の限界に一部依存する、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範
囲内であることを意味し得る。例えば、「約」は、当技術分野の実務に従って、1または
1よりも大きい標準偏差以内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の
最大で20%、最大で10%、最大で5%または最大で1%の範囲を意味し得る。あるい
は、特に、生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、ある値の5倍以内、より好
ましくは2倍以内のオーダーの大きさ以内であることを意味し得る。特定の値が本出願お
よび特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、その特定の値についての許容さ
れる誤差範囲内であることを意味する用語「約」を前提とすべきである。
(例えば、エマルジョン中の)単一の細胞(免疫細胞)を親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲート(例えば、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲート)を使用してフェノ
タイピングするための方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。
定義
したがって、本明細書の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、これには、断片抗
原結合性(Fab)断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fv断片、組換えIgG
(rIgG)断片、単鎖可変断片(scFv)を含む単鎖抗体断片、および単一ドメイン
抗体(例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ)断片を含む、インタクトな抗体および
その機能的(抗原結合性)抗体断片を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体が含まれる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および/または他の
方法で改変された形態、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト
抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多特異性、例えば二特異性抗体、
ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデムジ−scFv、タンデムトリ
−scFvを包含する。特記しない限り、用語「抗体」は、その機能的抗体断片を包含す
ると理解すべきである。この用語は、IgGならびにそのサブクラス、IgM、IgE、
IgAおよびIgDを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトな
抗体または全長抗体もまた包含する。
「超可変領域」または「HVR」と同義の用語「相補性決定領域」および「CDR」は
、抗原特異性および/または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非隣接
配列を指すことが、当技術分野で公知である。一般に、各重鎖可変領域中の3つのCDR
(CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3)および各軽鎖可変領域中の3つのCDR
(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3)が存在する。「フレームワーク領域」お
よび「FR」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非CDR部分を指すことが、当技術分野で
公知である。一般に、各全長重鎖可変領域中の4つのFR(FR−H1、FR−H2、F
R−H3およびFR−H4)、および各全長軽鎖可変領域中の4つのFR(FR−L1、
FR−L2、FR−L3およびFR−L4)が存在する。
所与のCDRまたはFRの正確なアミノ酸配列境界は、Kabatら(1991年)、「Seq
uences of Proteins of Immunological Interest」、第5版 Public Health Ser
vice、National Institutes of Health、Bethesda、MD(「Kabat」番号付けスキ
ーム)、Al-Lazikaniら、(1997年)JMB 273巻、927〜948頁(「Chot
hia」番号付けスキーム)、MacCallumら、J. Mol. Biol. 262巻:732〜74
5頁(1996年)、「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and b
inding site topography」、J. Mol. Biol. 262巻、732〜745頁(「Co
ntact」番号付けスキーム)、Lefranc MPら、「IMGT unique numbering for i
mmunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily
V-like domains」、Dev Comp Immunol、2003年1月;27巻(1号):55〜7
7頁(「IMGT」番号付けスキーム)、ならびにHonegger AおよびPluckthun A、「Y
et another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an aut
omatic modeling and analysis tool」、J Mol Biol、2001年6月8日;30
9巻(3号):657〜70頁、(「Aho」番号付けスキーム)によって記載されるも
のを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。
所与のCDRまたはFRの境界は、識別に使用されるスキームに依存して変動し得る。
例えば、Kabatスキームは、構造アラインメントに基づくが、Chothiaスキー
ムは、構造情報に基づく。KabatスキームおよびChothiaスキームの両方につ
いての番号付けは、一部の抗体において現れる、挿入文字によって提供される挿入、例え
ば「30a」および欠失を伴う、最も一般的な抗体領域配列長に基づく。2つのスキーム
は、異なる位置においてある特定の挿入および欠失(「インデル」)を配置して、示差的
な番号付けを生じる。Contactスキームは、複合体の結晶構造の分析に基づき、C
hothia番号付けスキームに多くの点で類似している。
以下の表Aは、それぞれKabat、ChothiaおよびContactのスキーム
によって識別された場合の、CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3およびCDR−
H1、CDR−H2、CDR−H3の境界の例示の位置を列挙する。CDR−H1につい
ては、残基番号付けは、Kabat番号付けスキームおよびChothia番号付けスキ
ームの両方を使用して列挙されている。FRは、CDR間に位置する、例えば、FR−L
1は、CDR−L1とCDR−L2との間に位置する、など。示されたKabat番号付
けスキームは、H35AおよびH35Bに挿入を配置するので、示されたKabat番号
付け慣習を使用して番号付けした場合のChothia CDR−H1ループの末端は、
ループの長さに依存して、H32とH34との間で変動することに留意されたい。
Figure 2021118704
したがって、特記しない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域の「
CDR」または「相補性決定領域」、または個々の特定されたCDR(例えば、CDR−
H1、CDR−H2)は、上述のスキームのいずれかによって規定される、ある(または
特定の)相補性決定領域を包含すると理解すべきである。例えば、特定のCDR(例えば
、CDR−H3)が、所与のVHまたはVLアミノ酸配列中の対応するCDRのアミノ酸
配列を含むと述べられる場合、かかるCDRは、上述のスキームのいずれかによって規定
される、可変領域内の対応するCDR(例えば、CDR−H3)の配列を有すると理解さ
れる。一部の実施形態では、特定されたCDR配列が特定される。
同様に、特記しない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域のFRま
たは個々の識別されたFR(単数または複数)(例えば、FR−H1、FR−H2)は、
公知のスキームのいずれかによって規定される、ある(または特定の)フレームワーク領
域を包含すると理解すべきである。一部の例では、特定のCDR、FR、またはFR(複
数)もしくはCDR(複数)の識別のためのスキームは、Kabat、Chothiaま
たはContactの方法によって規定されるCDRのように、特定される。他の場合に
は、CDRまたはFRの特定のアミノ酸配列が与えられる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する、抗体
重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(そ
れぞれ、VHおよびVL)は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、4つの保存され
たフレームワーク領域(FR)および3つのCDRを含む(例えば、Kindtら Kuby Imm
unology、第6版、W.H. Freeman and Co.、91頁(2007年)を参照のこと)。単
一のVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに
、特定の抗原と結合する抗体は、それぞれ相補的VLまたはVHドメインのライブラリー
をスクリーニングするために、その抗原と結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを
使用して単離され得る。例えば、Portolanoら、J. Immunol. 150巻:880〜88
7頁(1993年);Clarksonら、Nature 352巻:624〜628頁(1991年)
を参照のこと。
提供される抗体の中でも特に、抗体断片が挙げられる。「抗体断片」とは、インタクト
な抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以
外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(a
b’)2;ダイアボディ;直鎖抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および抗体断
片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では
、これらの抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例え
ば、scFvである。
特記しない限り、用語「TCR」は、完全TCRならびにその抗原結合性部分または抗
原結合性断片(MHC−ペプチド結合性断片とも呼ばれる)を包含すると理解すべきであ
る。一部の実施形態では、TCRは、インタクトなまたは全長TCRである。一部の実施
形態では、TCRは、全長TCR未満であるが、MHC分子に結合した(即ち、MHC分
子との関連での)特異的抗原性ペプチド、即ち、MHC−ペプチド複合体に結合する、抗
原結合性部分である。一部の場合には、TCRの抗原結合性部分または断片は、全長また
はインタクトなTCRの構造ドメインの一部分だけを含み得るが、それでもなお完全TC
Rが結合するエピトープ(例えば、MHC−ペプチド複合体)と結合することが可能であ
る。一部の場合には、TCRの抗原結合性部分または断片は、特異的MHC−ペプチド複
合体への結合のための結合部位を形成するのに十分なTCRの可変ドメイン、例えば、T
CRの可変α鎖および可変β鎖を含み、ここで、例えば一般に、各鎖は3つの相補性決定
領域を含む。抗原結合性ドメインであるまたは抗原結合性ドメインと相同である結合性ド
メインを有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。相補性決定領域(CDR)移
植抗体およびTCRならびに他のヒト化抗体およびTCR(CDR改変およびフレームワ
ーク領域改変を含む)もまた、これらの用語によって企図される。免疫グロブリン鎖(例
えば、重鎖および軽鎖)のみに対して言及がなされ得るが、開示された発明は、複数の他
の異なる型の対合した配列、例えば、T細胞受容体鎖ペア(TCRα鎖およびTCRβ鎖
ならびにTCRγ鎖およびTCRδ鎖)に適用され得、免疫グロブリンに限定されないこ
とに留意すべきである。
種々のがんまたは感染性生物と関連する抗原を認識するT細胞の能力は、アルファ(α
)鎖およびベータ(β)鎖の両方またはガンマ(γ)およびデルタ(δ)鎖の両方から構
成されるそのTCRによって付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、TCRの
極めて大きい多様性を生成するために固有の機構を使用するDNAによってコードされる
。この多サブユニット免疫認識受容体は、CD3複合体と会合し、抗原提示細胞(APC
)の表面上のMHCクラスIおよびIIタンパク質によって提示されるペプチドと結合す
る。APC上の抗原性ペプチドへのTCRの結合は、T細胞活性化における中心的な事象
であり、これは、T細胞とAPCとの間の接触点の免疫シナプスにおいて生じる。
各TCRは、可変相補性決定領域(CDR)ならびにフレームワーク領域(FR)を含
む。αおよびβ鎖可変ドメインの第3の相補性決定領域(CDR3)ループのアミノ酸配
列は、それぞれ、β鎖遺伝子座における可変(Vβ)遺伝子セグメント、多様性(Dβ)
遺伝子セグメントおよび連結(Jβ)遺伝子セグメントの間での組換え、ならびにα鎖遺
伝子座における類似のVα遺伝子セグメントとJα遺伝子セグメントとの間での組換えか
ら生じる、αβT細胞の配列多様性を主に決定する。TCRのαおよびβ鎖遺伝子座にお
ける複数のかかる遺伝子セグメントの存在は、多数の別個のCDR3配列がコードされる
ことを可能にする。TCR遺伝子再配置のプロセスの間のVβ−Dβ、Dβ−Jβおよび
Vα−Jα接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、CDR3配列の多
様性をさらに増加させる。これに関して、免疫適格性は、TCRの多様性に反映される。
B細胞によって発現される免疫グロブリン(Ig)は、一部の態様では、H構造
を形成する4つのポリペプチド鎖、2つの重鎖(IgH)および2つの軽鎖(IgL)か
らなるタンパク質である。IgH鎖およびIgL鎖の各ペアは、VおよびV領域から
なる超可変ドメイン、ならびに定常ドメインを含む。IgのIgH鎖は、いくつかの型、
μ、δ、γ、αおよびβのものである。個体内のIgの多様性は、超可変ドメインによっ
て主に決定される。TCRと同様に、IgH鎖のVドメインは、V、DおよびJ
伝子セグメントのコンビナトリアル連結によって創出される。Ig遺伝子再配置のプロセ
スの間のV−D、D−JおよびV−J接合部におけるヌクレオチドの独立し
た付加および欠失は、超可変ドメイン配列の多様性をさらに増加させる。ここで、免疫適
格性は、Igの多様性に反映される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗原への抗体の結合に関与する、抗体
重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(そ
れぞれ、VHおよびVL)は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、4つの保存され
たフレームワーク領域(FR)および3つのCDRを含む(例えば、Kindtら Kuby Imm
unology、第6版、W.H. Freeman and Co.、91頁(2007年)を参照のこと)。単
一のVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに
、特定の抗原と結合する抗体は、それぞれ、相補的なVLまたはVHドメインのライブラ
リーをスクリーニングするために、抗原と結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを
使用して単離され得る。例えば、Portolanoら、J. Immunol. 150巻:880〜88
7頁(1993年);Clarksonら、Nature 352巻:624〜628頁(1991年)
を参照のこと。
「親和性部分」とは、標的抗原と相互作用する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲ
ートの部分を指す。例示の親和性部分には、抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマー、
小分子、薬物、細胞、MHCなどが含まれる。
「超可変領域」とは、抗原結合を担う、抗体またはTCRのアミノ酸残基を指す。この
超可変領域は、相補性決定領域またはCDR由来のアミノ酸残基を含む。フレームワーク
またはFR残基は、本明細書で定義されるように、超可変領域残基以外の可変ドメイン残
基である。
提供される抗体のなかでも特に、抗体断片が挙げられる。「抗体断片」とは、インタク
トな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体
以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(
ab’)2;ダイアボディ;直鎖抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および抗体
断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態で
は、抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む単鎖抗体断片、例えば、s
cFvである。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分、または抗体の軽
鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、
単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、ならびに組換え宿主細胞によ
る産生が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。一部の実施
形態では、これらの抗体は、組換え産生された断片、例えば、天然に存在しない配置を含
む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された2もしくは
それよりも多くの抗体領域もしくは鎖を有する断片、および/または天然に存在するイン
タクトな抗体の酵素消化によっては産生されない可能性がある断片である。一部の態様で
は、これらの抗体断片は、scFvである。
抗原結合性断片を含むTCR断片もまた提供される。一部の実施形態では、TCRは、
その抗原結合性部分、例えば、完全可溶性TCRと呼ばれ得る、その膜貫通および/また
は細胞質領域(単数または複数)を含まない全長TCRのバリアントである。一部の実施
形態では、TCRは、二量体TCR(dTCR)である。一部の実施形態では、TCRは
、単鎖TCR(scTCR)、例えば、PCT特許公開番号WO03/020763、W
O04/033685またはWO2011/044186に記載されるような構造を有す
るscTCRである。ある特定の実施形態では、TCRは、ベータ鎖可変領域に連結され
たアルファ鎖可変領域を含む単鎖TCR断片、例えば、scTvである。一部の実施形態
では、scTvは、scFvとも呼ばれる。
単鎖FvまたはscFvとは、一部の態様では、抗体の可変重鎖(V)および可変軽
鎖(V)ドメイン、またはTCRの可変アルファもしくはガンマ鎖(VαもしくはVγ
)および可変ベータもしくはデルタ鎖(VβもしくはVδ)ドメインを含む抗体またはT
CR断片を指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、F
vポリペプチドは、抗原結合のための所望の構造をsFvが形成するのを可能にするポリ
ペプチドリンカーを、VドメインとVドメインとの間、またはVαドメインとVβド
メインとの間、またはVγドメインとVδドメインとの間にさらに含む。
ダイアボディとは、一部の態様では、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体および/
またはTCR断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖(V−V)中のVに接
続されたV、または同じポリペプチド鎖(Vα−Vβ)中のVβに接続されたVα、ま
たは同じポリペプチド鎖(Vγ−Vδ)中のVδに接続されたVγを含む。同じ鎖上の2
つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、それ
らのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、2つの抗原結合部位を創出するよう
に強いられる。例示のダイアボディは、例えば、EP404097およびWO93111
161中により完全に記載されている。
二特異性抗体または二特異性TCRとは、一部の態様では、2つの異なる型の抗原に対
する特異性を示す抗体またはTCRを指す。これらの用語には、本明細書で使用する場合
、標的抗原に対する、および特定の組織への送達を促進する別の標的に対する結合特異性
を示す抗体およびTCRが具体的に含まれるがこれらに限定されない。同様に、多特異性
抗体およびTCRは、2またはそれよりも多くの結合特異性を有する。
直鎖抗体または直鎖TCRとは、一部の態様では、抗原結合性領域の対を形成するタン
デムFdセグメント(例えば、V−CH1−V−CH1またはVα−Cα−Vα−
Cα)の対を指す。直鎖抗体およびTCRは、例えば、Zapataら、Protein Eng. 8
巻(10号):1057〜1062頁(1995年)に記載されるように、二特異性また
は単一特異性であり得る。
抗原結合性ドメインとは、一部の態様では、抗原に特異的に結合する能力を保持する、
抗体またはTCRの1つまたは複数の断片を指す。かかる用語内に含まれる抗体断片の非
限定的な例には、(i)V、V、CおよびCH1ドメインからなる一価断片である
Fab断片;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのF
ab断片を含む二価断片であるF(ab’)断片;(iii)VおよびCH1ドメイ
ンからなるFd断片;(iv)scFvを含む、抗体の単一のアームのVおよびV
メインを含むFv断片、(v)Vドメインを含むdAb断片(Wardら、(1989年)
Nature 341巻:544 546頁);ならびに(vi)単離されたCDRが含まれる
がこれらに限定されない。さらに、単一の重鎖および単一の軽鎖を含む抗体、または単一
のアルファ鎖もしくは単一のベータ鎖を有するTCRが、この定義に含まれる。
「F(ab’)」および「Fab’」部分は、ペプシンおよびパパインなどのプロテ
アーゼでIgを処理することによって産生され得、これらには、2つの重鎖の各々中のヒ
ンジ領域間に存在するジスルフィド結合の近傍で免疫グロブリンを消化することによって
生成される抗体断片が含まれる。例えば、パパインは、2つの重鎖の各々中のヒンジ領域
間に存在するジスルフィド結合の上流でIgGを切断して、VおよびCから構成され
る軽鎖ならびにVおよびCHγ1(重鎖の定常領域中のγ1領域)から構成される重鎖
断片が、それらのC末端領域においてジスルフィド結合を介して接続される、2つの相同
な抗体断片を生成する。これら2つの相同な抗体断片の各々は、’Fab’と呼ばれる。
ペプシンもまた、2つの重鎖の各々中のヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流
でIgGを切断して、2つの上述の’Fab’がヒンジ領域において接続される断片より
も、わずかに大きい抗体断片を生成する。この抗体断片は、F(’ab’)と呼ばれる
。Fab断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(C1)を
含む。’Fab’断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステイン(単数また
は複数)を含む重鎖C1ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加により
、Fab断片とは異なる。Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基(単数また
は複数)が遊離チオール基を有するFab’についての本明細書での命名である。F(a
b’)抗体断片は元々、それらの間にヒンジシステインを有するFab’断片の対とし
て産生される。
Fvとは、一部の態様では、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む抗体またはTC
R断片を指す。この領域は、緊密に非共有結合的に会合した、1つの重鎖および1つの軽
鎖可変ドメインまたは1つのTCRα鎖および1つのTCRβ鎖または1つのTCRγ鎖
および1つのTCRδ鎖の二量体からなる。この構成では、各可変ドメインの3つのCD
Rが相互作用して、V−V二量体またはVα−Vβ二量体またはVγ−Vδ二量体の
表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、VおよびV鎖またはVα−Vβ鎖また
はVγ−Vδ鎖の各々由来のCDRのうち1つまたは複数の組合せは、抗体またはTCR
に抗原結合特異性を付与する。例えば、CDRH3およびCDRL3は、レシピエントの
選択された抗体、TCRまたはそれらの抗原結合性断片のVおよびV鎖またはVαお
よびVβ鎖またはVγ−Vδ鎖に移入された場合に、抗体またはTCRに抗原結合特異性
を付与するのに十分であり得、CDRのこの組合せは、結合、親和性などについて試験さ
れ得ることが理解される。単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみ
を含むFvの半分)であっても、抗原を認識し抗原と結合する能力を有するが、第2の可
変ドメインと組み合わせた場合よりも低い親和性である可能性が高い。さらに、Fv断片
の2つのドメイン(VおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδ)は、別
々の遺伝子によってコードされるが、これらは、VおよびVまたはVαおよびVβま
たはVγおよびVδ鎖領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖(単鎖Fv
(scFv)として公知;Birdら(1988年)Science 242巻:423〜426頁
;Hustonら(1988年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85巻:5879〜588
3頁;およびOsbournら(1998年)Nat. Biotechnol. 16巻:778頁)としてそ
れらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用して連結さ
れ得る。かかるscFvもまた、抗体の用語「抗原結合性部分」内に包含される意図であ
る。特異的scFvの任意のVおよびV配列は、完全なIg(例えば、IgG)分子
または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、Fc領域のcDN
Aまたはゲノム配列に連結され得る。VおよびVは、タンパク質化学または組換えD
NA技術のいずれかを使用する、Fab、FvまたはIgの他の断片の生成においても使
用され得る。
抗原結合性ポリペプチドには、例えば、ラクダ科動物およびサメ由来の抗体などの、重
鎖二量体もまた含まれ得る。ラクダ科動物抗体およびサメ抗体は、V様およびC様ドメイ
ンの2つの鎖のホモ二量体対を含む(どちらも軽鎖を有さない)。ラクダ科動物における
重鎖二量体IgGのV領域は、軽鎖と疎水性相互作用しないので、軽鎖と通常接触する
重鎖中の領域は、ラクダ科動物では親水性アミノ酸残基に変化される。重鎖二量体IgG
のVドメインは、VHHドメインと呼ばれる。サメIg−NARは、1つの可変ドメイ
ン(V−NARドメインと呼ばれる)および5つのC様定常ドメイン(C−NARドメイ
ン)のホモ二量体を含む。ラクダ科動物では、抗体レパートリーの多様性は、Vまたは
HH領域中のCDR1、2および3によって決定される。ラクダVHH領域中のCDR
3は、平均16アミノ酸の、その比較的長い長さを特徴とする(Muyldermansら、199
4年、Protein Engineering 7巻(9号):1129頁)。
「ヒト化」抗体は、全てまたは実質的に全てのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由
来し、全てまたは実質的に全てのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒ
ト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得
る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しつつ
、ヒトに対する免疫原性を典型的には低減させるためにヒト化を受けた非ヒト抗体のバリ
アントを指す。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のFR残基は、例えば、抗体の
特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体(例えば、CDR残基が由
来する抗体)由来の対応する残基で置換される。
提供される抗体のなかでも特に、ヒト抗体が挙げられる。「ヒト抗体」は、ヒトもしく
はヒト細胞、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体ライブラリーなどの他のヒト
抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源によって産生される抗体のアミノ酸配列に
対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、非ヒト抗原結合性領域を含む非
ヒト抗体のヒト化形態、例えば、全てまたは実質的に全てのCDRが非ヒトであるものを
排除する。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体、またはヒト可変領域を
有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を
投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン
遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中にランダムに
組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含む。かかるトランス
ジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活化されている。ヒト
抗体はまた、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含む、ファージディスプレイ
ライブラリーおよび無細胞ライブラリーを含むヒト抗体ライブラリーに由来し得る。
提供される抗体のなかでも特に、モノクローナル抗体断片を含むモノクローナル抗体が
挙げられる。用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、実質的に均一
な抗体の集団に由来する抗体またはかかる集団内の抗体を指す、即ち、集団を構成する個
々の抗体は、天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生
じる可能なバリアントを除いて同一であり、かかるバリアントは一般に、微量で存在する
。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは
対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエ
ピトープに対するものである。この用語は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要と
すると解釈すべきではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマからの生成、組換え
DNA法、ファージディスプレイおよび他の抗体ディスプレイ法が含まれるがこれらに限
定されない種々の技術によって作製され得る。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために
相互交換可能に使用され、最小の長さに制限されない。提供される抗体および抗体鎖なら
びに他のペプチド、例えばリンカーおよび結合性ペプチドを含むポリペプチドは、天然お
よび/または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。これらの用語は、ポ
リペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、リン酸化
などもまた含む。一部の態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する
限り、ネイティブまたは天然の配列に対する改変を含んでもよい。これらの改変は、部位
特異的変異誘発などを介して計画的であり得、またはタンパク質を産生する宿主の変異も
しくはPCR増幅に起因したエラーなどを介して偶発的であり得る。
「生殖系列配列」とは、生殖系列(一倍体配偶子およびそれらが形成される二倍体細胞
)由来の遺伝子配列を指す。生殖系列DNAは、単一のIg重鎖もしくは軽鎖、または単
一のTCRαもしくはTCRβ鎖、または単一のTCRγもしくはTCRδ鎖をコードす
る複数の遺伝子セグメントを含む。これらの遺伝子セグメントは、生殖細胞中に保有され
るが、機能的遺伝子へと配置されるまで、転写および翻訳することができない。骨髄にお
けるB細胞およびT細胞の分化の間に、これらの遺伝子セグメントは、10よりも大き
い特異性を生じることが可能なダイナミックな遺伝子系によってランダムにシャッフルさ
れる。これらの遺伝子セグメントのほとんどは、生殖系列データベースによって公開およ
び収集されている。
親和性とは、2つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、Kとして表される
。リガンドに対する結合性タンパク質の親和性、例えば、エピトープに対する抗体の親和
性、または例えば、MCH−ペプチド複合体に対するTCRの親和性は、例えば、約10
0ナノモル濃度(nM)〜約0.1nM、約100nM〜約1ピコモル濃度(pM)、ま
たは約100nM〜約1フェムトモル濃度(fM)であり得る。用語「アビディティー」
とは、希釈後の解離に対する、2またはそれよりも多くの薬剤の複合体の抵抗性を指す。
エピトープとは、一部の態様では、抗体またはTCRの可変領域結合ポケットとの結合
相互作用を形成することが可能な、抗原または他の高分子の一部分を指す。かかる結合相
互作用は、1つまたは複数のCDRの1つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触とし
て顕在化され得る。抗原結合には、例えば、CDR3、CDR3対、または一部の例では
、VおよびV鎖の最大で6つ全てのCDRの相互作用が関与し得る。エピトープは、
直鎖ペプチド配列であり得る(即ち、「連続的」)、または非隣接アミノ酸配列から構成
され得る(即ち、「コンフォメーション」または「不連続的」)。抗体またはTCRは、
1つまたは複数のアミノ酸配列を認識できる;したがって、エピトープは、1つよりも多
くの別個のアミノ酸配列を規定できる。一部の態様では、TCRは、MHCとの関連で1
つまたは複数のアミノ酸配列またはエピトープを認識できる。抗体およびTCRによって
認識されるエピトープは、当業者に周知のペプチドマッピングおよび配列分析技術によっ
て決定され得る。結合相互作用は、CDRの1つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接
触として顕在化される。
一部の実施形態では、特異的結合を有する抗体またはTCRに対する言及は、ある抗体
またはTCRが、抗体またはTCRによって認識されるエピトープを含む抗原以外の分子
に対するいずれの顕著な結合も示さない状況を指す。この用語は、例えば、抗原結合性ド
メインが、いくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも
適用可能であり、この場合、選択された抗体、TCR、または抗原結合性ドメインを保有
するそれらの抗原結合性断片は、エピトープを保有する種々の抗原に結合できる。用語「
優先的に結合する」または「特異的に結合する」とは、抗体、TCRまたはそれらの断片
が、無関係のアミノ酸配列に結合する場合よりも高い親和性でエピトープに結合し、この
エピトープを含む他のポリペプチドと交差反応性である場合には、ヒト使用への投与のた
めに製剤化されるレベルにおいてそれらが毒性でないことを意味する。一態様では、かか
る親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体、TCRまたはそれらの断片の親和性よ
りも、少なくとも1倍大きい、少なくとも2倍大きい、少なくとも3倍大きい、少なくと
も4倍大きい、少なくとも5倍大きい、少なくとも6倍大きい、少なくとも7倍大きい、
少なくとも8倍大きい、少なくとも9倍大きい、10倍大きい、少なくとも20倍大きい
、少なくとも30倍大きい、少なくとも40倍大きい、少なくとも50倍大きい、少なく
とも60倍大きい、少なくとも70倍大きい、少なくとも80倍大きい、少なくとも90
倍大きい、少なくとも100倍大きい、または少なくとも1000倍大きい。用語「結合
」とは、例えば、生理的条件下での共有結合、静電、疎水性、ならびにイオン性および/
または水素結合相互作用に起因する2つの分子間の直接的会合を指し、これには、相互作
用、例えば、塩架橋および水架橋、ならびに結合の任意の他の従来の手段が含まれる。
用語「結合」とは、例えば、生理的条件下での共有結合、静電、疎水性、ならびにイオ
ン性および/または水素結合相互作用に起因する2つの分子間の直接的会合を指し、これ
には、相互作用、例えば、塩架橋および水架橋、ならびに結合の任意の他の従来の手段が
含まれる。
「薬学的に許容される」とは、生理的に容認可能であり、ヒトに投与した場合にアレル
ギー反応または類似の有害な反応、例えば、胃の異常亢進、眩暈などを典型的には生じな
い、分子実体および組成物を指す。
「予防(prevention)」とは、予防(prophylaxis)、症状の発症の予防(prevention
)、過剰なレベルのタンパク質と関連するまたはタンパク質活性と相関する疾患または障
害の進行の予防(prevention)を指す。
「阻害」、「処置」および「処置すること」は、相互交換可能に使用され、例えば、症
状の停滞、生存の延長、症状の部分的または完全な寛解、および過剰なレベルのタンパク
質と関連するまたはタンパク質活性と相関する状態、疾患または障害の部分的または完全
な根絶を指す。例えば、がんの処置には、がん性成長または腫瘍の停滞、部分的または完
全な排除が含まれるがこれらに限定されない。処置または部分的排除には、例えば、成長
または腫瘍のサイズおよび/もしくは体積における所定倍率の低減、例えば、約2倍、約
3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、またはそれらの間の任意の倍率
の低減が含まれる。同様に、処置または部分的排除には、成長または腫瘍のサイズおよび
/もしくは体積における、約1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、
40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれらの間の任意の百
分率の低減の、パーセント低減が含まれ得る。
中和抗体または中和TCRとは、一部の態様では、中和が達成される機構に関わりなく
、ウイルスまたは細菌などの病原体の複製を阻害する任意の抗体またはTCRを指す。
抗体レパートリーまたはTCRレパートリーとは、抗体、TCRまたはそれらの断片の
収集を指す。抗体レパートリーは、例えば、特定の抗体を選択するため、または特定の特
性、例えば、結合能、結合特異性、胃腸輸送の能力、安定性、親和性などについてスクリ
ーニングするために使用され得る。この用語は、例えば、ナイーブ、合成および半合成ラ
イブラリーを含む、任意の供給源由来の単鎖Fv(scFv)およびFab抗体ファージ
ディスプレイライブラリーが限定なしに含まれる抗体ファージディスプレイライブラリー
などのコンビナトリアルライブラリーの全ての形態を含む、抗体およびTCRライブラリ
ーを具体的に含む。
「標的核酸分子」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド分子」とは、
目的の任意の核酸を指す。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とは、二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖の同時プライ
マー伸長によるポリヌクレオチド配列のin vitro増幅反応を指す。PCR反応は
、プライマー結合部位が隣接する鋳型ポリヌクレオチドのコピーを生成する。2つのプラ
イマーを用いた結果は、各サイクルによって両方の鎖が複製されることによる、各サイク
ルによる両方の鎖の鋳型ポリヌクレオチドコピー数における指数関数的増加である。ポリ
ヌクレオチド二重鎖は、使用されるプライマーの末端に対応する末端を有する。PCRは
、鋳型ポリヌクレオチドを変性させること、プライマーをプライマー結合部位にアニーリ
ングさせること、およびヌクレオチドの存在下でDNAまたはRNAポリメラーゼによっ
てプライマーを伸長させることの、1または複数回の反復を含み得る。特定の温度、各ス
テップにおける持続時間、およびステップ間の変化の速度は、当業者に周知の多くの因子
に依存する(McPhersonら、IRL Press、Oxford(1991年および1995年))。例
えば、Taq DNAポリメラーゼを使用する従来のPCRでは、二本鎖鋳型ポリヌクレ
オチドは、>90℃の温度で変性され得、プライマーは、50〜75℃の範囲の温度でア
ニーリングされ得、プライマーは、72〜78℃の範囲の温度で伸長され得る。一部の実
施形態では、PCRは、逆転写PCR(RT−PCR)、リアルタイムPCR、ネステッ
ドPCR、定量的PCR、多重PCRなどを含む。一部の実施形態では、PCRは、RT
−PCRを含まない(米国特許第5,168,038号、同第5,210,015号、同
第6,174,670号、同第6,569,627号および同第5,925,517号;
Mackayら、Nucleic Acids Research、30巻:1292〜1305頁(2002年))
。RT−PCRは、逆転写反応が先行するPCR反応を含み、得られたcDNAが増幅さ
れ、ネステッドPCRは、第1のセットのプライマーを使用する第1のPCR反応のアン
プリコンが、それらのうち少なくとも一方が第1のPCR反応のアンプリコンの内部位置
に結合する第2のプライマーセットを使用する第2のPCR反応のための試料になる、二
段階PCRを含む。多重PCRは、複数のポリヌクレオチド配列が同じ反応混合物中で同
時にPCRに供されるPCR反応を含む。PCR反応体積は、0.2pL〜1000μL
の間のいずれかであり得る。定量的PCRは、試料中の1つまたは複数の配列の絶対量も
しくは相対量、存在量、または濃度を測定するために設計されたPCR反応を含む。定量
的測定は、1つまたは複数の参照配列または標準を目的のポリヌクレオチド配列と比較す
ることを含み得る(Freemanら、Biotechniques、26巻:112〜126頁(1999年
);Becker-Andreら、Nucleic Acids Research、17巻:9437〜9447頁(19
89年);Zimmermanら、Biotechniques、21巻:268〜279頁(1996年);Di
viaccoら、Gene、122巻:3013〜3020頁(1992年);Becker-Andreら、Nu
cleic Acids Research、17巻:9437〜9446頁(1989年))。
「ヌクレオチド」、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド残基」および「ヌクレオシド残
基」とは、本明細書で使用する場合、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチ
ド残基、または増幅反応(例えば、PCR反応)における使用に適切なプライマーの成分
として機能することが可能な他の類似のヌクレオシドアナログを意味し得る。かかるヌク
レオシドおよびその誘導体は、特記した場合を除き、本明細書に記載されるプライマーの
構成要素として使用され得る。化学的改変が、必要に応じて、ポリメラーゼによる、デオ
キシグアニン、デオキシシトシン、デオキシチミジンまたはデオキシアデニンとしてのそ
れらの認識を妨害しないことを条件として、増幅反応におけるそれらの安定性または有用
性を増強するために化学改変されたヌクレオシド誘導体または塩基の利用を妨げることを
意味するものは、本出願中には存在しない。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログ
は、ハイブリッド形成を安定化し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、
ハイブリッド形成を不安定化し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ハ
イブリダイゼーションの特異性を増強し得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナロ
グは、ハイブリダイゼーションの特異性を低減させ得る。
「核酸」または文法的等価物とは、単一のヌクレオチド、または共有結合によって一緒
に連結された少なくとも2つのヌクレオチドのいずれかを指す。
「ポリヌクレオチド」または文法的等価物とは、共有結合によって一緒に連結された少
なくとも2つのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、2またはそれよりも多くのヌ
クレオチドを含む分子を含む。ポリヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン塩基、また
は他の天然のヌクレオチド塩基、化学的に改変されたもしくは生化学的に改変された非天
然のヌクレオチド塩基、またはヌクレオチド塩基の誘導体を含む、リボヌクレオチド、デ
オキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸(PNA)のいずれかの、任意の長さのヌク
レオチドのポリマー形態を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基、または
改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌク
レオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌク
レオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、他
の分子、例えば、別のハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチ
ドは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、またはその両方の配列を含む
。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、
遺伝子間DNA(ヘテロクロマチンDNAが限定なしに含まれる)、メッセンジャーRN
A(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、低分子干渉R
NA(siRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プ
ラスミド、ベクター、ある配列の単離されたDNA、ある配列の単離されたRNA、核酸
プローブおよびプライマーが含まれる。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から単離され
た、組換えの、または人工的に合成されたものであり得る。
ポリヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドアナログまたは改変
ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリッド形
成を安定化し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリッド形成を不
安定化し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの
特異性を増強し得る。一部の実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーシ
ョンの特異性を低減させ得る。非標準ヌクレオチド改変の例には、2’O−Me、2’O
−アリル、2’O−プロパルギル、2’O−アルキル、2’フルオロ、2’アラビノ、2
’キシロ、2’フルオロアラビノ、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホ
ロアミデート(phosphoroamidate)、2’アミノ、5−アルキル置換ピリミジン、3’デ
オキシグアノシン、5−ハロ置換ピリミジン、アルキル置換プリン、ハロ置換プリン、二
環式ヌクレオチド、2’MOE、PNA分子、LNA−分子、LNA様分子、ジアミノプ
リン、S2T、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−
ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン(xantine)、4−アセチルシトシン、5
−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2
−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベー
タ−D−ガラクトシルキューオシン(beta-D-galactosylqueosine)、イノシン、N6−
イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチル
グアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチル
シトシン、N−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5
−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルキューオシン(be
ta-D-mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウ
ラシル、2−メチルチオ−D46−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸
(v)、ウブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、キューオシン(queosine
)、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウ
ラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5
−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−N−2−
カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、2,6−ジアミノプリン、およびそれ
らの誘導体が含まれる。
「対象」、「個体」、「宿主」または「患者」とは、哺乳動物などの生きた生物を指す
。対象および宿主の例には、ウマ、雌ウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、
ウサギ、モルモット、ラット、マウス(例えば、ヒト化マウス)、スナネズミ、非ヒト霊
長類(例えば、マカク)、ヒトなど、例えば、非哺乳動物脊椎動物、例えば、鳥類(例え
ば、ニワトリまたはアヒル)、魚類(例えば、サメ)またはカエル(例えば、Xenop
us)、および非哺乳動物無脊椎動物を含む非哺乳動物、ならびにそれらのトランスジェ
ニック種が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の態様では、対象とは、単一の生
物(例えば、ヒト)を指す。ある特定の態様では、あるいは、研究のための共通の免疫因
子および/もしくは疾患を有する小さいコホート、ならびに/または疾患を有さない個体
のコホート(例えば、陰性/正常対照)を構成する個体の群が提供される。試料が取得さ
れる対象は、疾患および/または障害(例えば、1つまたは複数のアレルギー、感染、が
んまたは自己免疫障害など)に苦しみ得、疾患に罹患していない陰性対照対象に対して比
較され得る。
「キット」とは、本明細書に開示される方法を実行するために材料または試薬を送達す
るための送達系を指す。一部の実施形態では、キットには、反応試薬(例えば、適切な容
器中のプローブ、酵素など)および/または支持材料(例えば、アッセイを実行するため
の緩衝液、書面の指示書など)の貯蔵、1つの位置から別の位置へのそれらの輸送または
送達を可能にする系が含まれる。例えば、キットは、適切な反応試薬および/または支持
材料を含む1つまたは複数のエンクロージャー(例えば、箱)を含む。かかる内容物は、
意図したレシピエントに一緒にまたは別々に送達され得る。例えば、第1の容器は、アッ
セイにおける使用のための酵素を含み得るが、第2の容器は、複数のプライマーを含む。
ポリペプチドとは、一部の態様では、少なくとも2つのアミノ酸を含む分子を指す。一
部の実施形態では、ポリペプチドは、単一のペプチドからなる。一部の実施形態では、ポ
リペプチドは、2またはそれよりも多くのペプチドを含む。例えば、ポリペプチドは、少
なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、1
6、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、2
00、300、400、500、600、700、800、900または1000のペプ
チドまたはアミノ酸を含み得る。ポリペプチドの例には、アミノ酸鎖、タンパク質、ペプ
チド、ホルモン、ポリペプチド、サッカライド、脂質、糖脂質、リン脂質、抗体、酵素、
キナーゼ、受容体、転写因子およびリガンドが含まれるがこれらに限定されない。
試料とは、一部の態様では、生物学的、環境的、医学的な、対象の、もしくは患者の試
料、または標的ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含む試料を指す。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、親和性分子部分(例えば、抗体または
MHC−ペプチド複合体)およびオリゴヌクレオチド部分を含む。親和性−オリゴヌクレ
オチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの抗原識別配列は、親和性−オリゴヌクレオ
チドコンジュゲートが特異的に相互作用する1種または複数の抗原を識別するために使用
され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲートの親和性部分に
共有結合的に付着される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コンジュゲート
の親和性部分に非共有結合的に付着される。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、単一の親和性部
分を含む。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、多価親
和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートである。例えば、多価親和性−オリゴヌクレオ
チドコンジュゲートは、1つまたは複数のオリゴヌクレオチド(単数または複数)にコン
ジュゲートされた少なくとも2つの親和性分子の抗原結合性ドメインを含み得る。例えば
、多価親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、1つまたは複数のオリゴヌクレオ
チドにコンジュゲートされた少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20
、50、100、200、500または1,000の親和性分子の抗原結合性ドメインを
含み得る。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、単一のオリゴヌ
クレオチドを含む。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは
、2またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドを含む。例えば、親和性−オリゴヌクレ
オチドコンジュゲートは、1つまたは複数の親和性分子(例えば、抗体またはMHC−ペ
プチド複合体)にコンジュゲートされた少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、
10、20、50、100、200、500または1,000のオリゴヌクレオチドを含
み得る。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、同じ抗原
ID(AID)配列を含む2またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドを含む。例えば
、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、同じAID配列を含む少なくとも約2
、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500または1,
000のオリゴヌクレオチドを含み得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分(またはドメイン)は、標的
抗原に結合する親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの領域、分子、ドメイン、部
分(portion)、断片または部分(moiety)を含む。したがって、親和性部分は、所与の
標的抗原、例えば、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインに結合するまたは特異的に結合
する能力を付与する。一部の実施形態では、親和性部分は、異なる抗原ID配列を含む別
の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの抗原とは実質的に相互作用しない。一部
の実施形態では、親和性部分は、核酸を含み得る分子、または標的抗原への親和性部分の
結合を実質的に消失させることなくオリゴヌクレオチドが付着され得る分子である。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、核酸分子であり得る、ま
たはタンパク質性であり得る。親和性部分には、RNA、DNA、RNA−DNAハイブ
リッド、小分子(例えば、薬物)、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、抗体および
その断片、TCRおよびその断片、ウイルス、ウイルス粒子、細胞、それらの断片、なら
びにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない(例えば、Fredrikssonら、(2
002年)Nat Biotech 20巻:473〜77頁;Gullbergら、(2004年)PNAS、
101巻:8420〜24頁を参照のこと)。例えば、親和性部分は、一本鎖RNA、二
本鎖RNA、一本鎖DNA、二本鎖DNA、1もしくは複数の二本鎖領域および1もしく
は複数の一本鎖領域を含むDNAもしくはRNA、RNA−DNAハイブリッド、小分子
、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、TCR、TCR断片、MH
C、MHC−ペプチド複合体、ウイルス粒子、細胞、またはそれらの任意の組合せであり
得る。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細
胞を標的化する。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、
T細胞またはB細胞を標的化し得る。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲートの親和性部分は、特定の細胞型または細胞サブセットを標的化する。例え
ば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、CD4T細胞または
CD8T細胞を標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの
親和性部分は、特定の抗原を特異的に認識するTCRを含むT細胞を標的化し得る。例え
ば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定のMHC−ペプチ
ド複合体を特異的に認識するTCRを含むT細胞を標的化し得る。
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細
胞の標的の細胞外ドメインを標的化する。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュ
ゲートの親和性部分は、細胞の受容体、例えば、T細胞受容体の細胞外ドメインを標的化
し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞の受
容体の細胞外ドメインのグリコシル化された領域を標的化し得る。例えば、親和性−オリ
ゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細胞の受容体の細胞外ドメインのリガン
ド結合性領域を標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親
和性部分は、リガンドに結合しない細胞の受容体の細胞外ドメインの領域を標的化し得る
タンパク質
一部の実施形態では、親和性部分は、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意
の断片である。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和
性部分は、タンパク質である。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジ
ュゲートの親和性部分は、ペプチドである。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジ
ュゲートの親和性部分は、抗体、例えば、抗体の結合性ドメインであり得る。例えば、親
和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、MHC−ペプチド複合体であ
り得る。例えば、親和性部分は、精製されたポリペプチド、単離されたポリペプチド、融
合タグ化ポリペプチド、細胞またはウイルスもしくはビリオンの膜に付着させたポリペプ
チド、あるいはそれらにまたがるポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、
細胞外タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ヘリカーゼ、プロテアー
ゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアー
ゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外マトリックスタンパク質、リガーゼ、イオン
トランスポーター、チャネル、ポア、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病
原性タンパク質、異常に発現されるタンパク質、転写因子、転写調節因子、翻訳タンパク
質、シャペロン、分泌型タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、
核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、シグナル伝達因子、抗体、膜タンパク質、膜内在
性タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、線維状タンパ
ク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、それらの任意の断片、または
それらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、親和性部分は、異種ポリペプチ
ドである。一部の実施形態では、親和性部分は、トランスフェクションなどの分子技術を
使用して細胞において過剰発現されるタンパク質である。一部の実施形態では、親和性部
分は、組換えポリペプチドである。例えば、親和性部分は、細菌(例えば、E.coli
)、酵母、哺乳動物または昆虫細胞において産生される試料(例えば、生物によって過剰
発現されるタンパク質)を含み得る。一部の実施形態では、親和性部分は、変異、挿入、
欠失または多型を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、抗原、
例えば、生物を免疫化するため、または生物において免疫応答を生成するため、例えば、
抗体産生のために使用されるポリペプチドである。
抗体
一部の実施形態では、親和性部分は、抗体、例えば、抗体の結合性断片である。抗体は
、別の分子の特定の空間的および極性機構に特異的に結合し得る。例えば、抗体は、精製
された抗体、単離された抗体、抗体の断片、または融合タグ化抗体であり得る。一部の実
施形態では、抗体は、トランスフェクションなどの分子技術を使用して細胞において過剰
発現される。一部の実施形態では、抗体は、組換え抗体である。抗体は、細胞表面分子な
どの別の分子の特定の空間的および極性機構に特異的に結合し得る。抗体は、モノクロー
ナル、ポリクローナルまたは組換え抗体であり得、当技術分野で周知の技術、例えば、宿
主の免疫化および血清(ポリクローナル)の収集によって、または連続的ハイブリッド細
胞株を調製し、分泌されたタンパク質(モノクローナル)を収集することによって、また
は天然の抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配
列もしくはその変異誘発バージョンをクローニングし発現させることによって、調製され
得る。さらに、凝集物、ポリマー、および免疫グロブリンまたはそれらの断片のコンジュ
ゲートは、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、必要に応じて使用され得る
。抗体断片の例には、V、V、CおよびCH1ドメインからなる一価断片であるF
ab断片;ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を
含む二価断片であるF(ab)断片;VおよびCH1ドメインからなるFd断片;抗
体の単一のアームのVおよびVドメインからなるFv断片;Vドメインからなる単
一ドメイン抗体(dAb)断片(Wardら、(1989年)Nature 341巻:544〜4
6頁);ならびに単離されたCDR、ならびにV領域およびV領域が対合して一価分
子を形成する単鎖断片(scFv)(単鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Birdら
、(1988年)Science 242巻:423〜26頁;およびHustonら、(1988年
)PNAS 85巻:5879〜83頁を参照のこと)が含まれる。したがって、抗体断片に
は、Fab、F(ab)、scFv、Fv、dAbなどが含まれる。2つのドメインV
およびVは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、単一のタンパク質鎖
としてそれらが作製されることを可能にする人工ペプチドリンカーによって、組換え方法
を使用して連結され得る。かかる単鎖抗体は、1つまたは複数の抗原結合性部分を含む。
これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して取得され得、断片は、インタク
トな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされ得る。抗体は、ヒト、ヒト化
、キメラ、単離された、イヌ、ネコ、ロバ、ヒツジ、任意の植物、動物または哺乳動物で
あり得る。
MHC
一部の場合における細胞性免疫系による抗原構造の認識は、表面発現される主要組織適
合性複合体(MHC)によって媒介される。細胞、例えば、抗原提示細胞(APC)は、
一部の態様では、MHC分子の特異的ペプチド結合フォールド中に存在し得る、したがっ
て、一部の態様ではT細胞によって認識され得る短いペプチドへと、抗原などのタンパク
質をプロセシングする。T細胞受容体(TCR)によるエピトープ(ペプチド断片)の特
異的認識は一般に、MHC分子との同時相互作用を必要とする。安定な多量体複合体は、
結合したペプチドを含むMHCタンパク質サブユニットを用いて調製され得る。MHC−
抗原複合体は、それらの抗原受容体を介して複合体を認識するT細胞と共に安定な構造を
形成し得、それによって、抗原を特異的に認識するT細胞への結合を可能にする。親和性
−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、T細胞を標的化し得る。親和性−
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、T細胞を特異的に標的化し得る。親
和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、T細胞受容体またはTCR様
分子、例えば、TCR様CARを標的化し得る。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲ
ートの親和性部分は、T細胞受容体を特異的に標的化し得る。例えば、親和性−オリゴヌ
クレオチドコンジュゲートの親和性部分は、MHC分子を含み得る。例えば、親和性−オ
リゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、MHC−ペプチド複合体(MHC−p
)を含み得る。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、式(A−B
−P)を有し得、式中、Aは、MHCクラスIまたはMHCクラスIIタンパク質のα
鎖であり、Bは、クラスII MHCタンパク質のβ鎖またはMHCクラスIタンパク質
についてはβミクログロブリンであり、Pはペプチドである。一部の実施形態では、n
は1である。一部の実施形態では、nは、2よりも大きいか2に等しい。MHCタンパク
質サブユニットは、可溶性形態であり得る。例えば、可溶性MHCタンパク質サブユニッ
トは、膜貫通ドメインまたはその部分の欠失によって、ネイティブMHCタンパク質サブ
ユニットから誘導され得る。一部の実施形態では、MHCタンパク質サブユニットは、細
胞質ドメインを含まない。一部の実施形態では、MHCタンパク質サブユニットは、膜貫
通ドメインを含まない。
ペプチド(P)は、クラスI MHCタンパク質との複合体については約6〜12アミ
ノ酸長、例えば、約8〜10アミノ酸であり得る。ペプチドは、クラスII MHCタン
パク質との複合体については約6〜20アミノ酸長、例えば、約10〜18アミノ酸であ
り得る。ペプチドは、広範な種々のタンパク質に由来する配列を有し得る。ペプチドは、
T細胞エピトープであり得る。いくつかの抗原由来のエピトープ配列が、当技術分野で公
知である。あるいは、エピトープ配列は、ネイティブMHCタンパク質に結合したペプチ
ドを単離し、配列決定することによって、標的配列からの一連のペプチドの合成、次いで
、異なるペプチドに対して反応性のT細胞についてアッセイすることによって、または異
なるペプチドを用いて一連の結合性複合体を生成し、T細胞結合を定量することによって
、実験的に決定され得る。断片の調製、配列を識別すること、および最小配列を識別する
ことは、米国特許第5,019,384号およびそこで引用される参考文献に記載されて
いる。ペプチドは、種々の方法で調製され得る。簡便には、これらは、自動合成器を使用
する従来技術によって合成され得、または手動で合成され得る。あるいは、特定のペプチ
ドをコードするDNA配列が調製され得、所望のペプチドを提供するためにクローニング
および発現され得る。この場合、メチオニンが最初のアミノ酸であり得る。さらに、ペプ
チドは、親和性試薬による融合タンパク質の精製を可能にする、特異的結合対のうちの1
つであるタンパク質への融合などの組換え方法と、その後の、通常は操作された部位にお
けるタンパク質分解性切断とによって生成されて、所望のペプチドを生じ得る(例えば、
Driscollら(1993年)J. Mol. Bio. 232巻:342〜350頁を参照のこと)
。ペプチドはまた、天然の供給源から単離され得、例えば、イオン交換材料上でのクロマ
トグラフィー、サイズによる分離、免疫親和性クロマトグラフィーおよび電気泳動が含ま
れる公知の技術によって精製され得る。
一部の実施形態では、α−サブユニットおよびβ−サブユニットは、別々に産生され、
安定なヘテロ二重鎖複合体を形成するようにin vitroで会合される(例えば、Al
tmanら(1993年)またはGarbocziら(1992年)を参照のこと)。一部の実施形態
では、α−サブユニットおよびβ−サブユニットは、単一の細胞において一緒に発現され
る。一部の実施形態では、α−サブユニットおよびβ−サブユニットを有する単一の分子
が使用される。例えば、単鎖ヘテロ二量体は、短いペプチドリンカー、例えば、15〜2
5アミノ酸のペプチドまたはリンカーを使用して、2つのサブユニットを一緒に融合させ
ることによって創出され得る(例えば、Bedzykら(1990年)J. Biol. Chem. 26
5巻:18615頁を参照のこと)。可溶性ヘテロ二量体は、可溶性産物を産生するため
に、ネイティブヘテロ二量体の単離、およびプロテアーゼ、例えばパパインによる切断に
よっても産生され得る。
可溶性サブユニットは、トランケート型タンパク質をコードするDNA構築物から独立
して発現され得る。発現のために、DNA配列は、適切な発現ベクター中に挿入され得、
このとき、ネイティブ転写開始領域が使用され得、または外因性転写開始領域、例えば、
通常存在する染色体中の遺伝子と関連するプロモーター以外のプロモーターが使用され得
る。プロモーターは、in vitroで組換え方法によって、または染色体中への配列
の相同組込みの結果として、導入され得る。転写開始領域は、広範な種々の発現宿主につ
いて公知である。発現宿主は、原核生物または真核生物、特に、E.coli、B.su
btilis、哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、サル腎臓細胞、リンパ
系細胞、ヒト細胞株などを含み得る。
サブユニットは、適切な宿主細胞において発現され得、必要に応じて可溶化され得る。
2つのサブユニットは、ペプチドと組み合わされ得、鎖内ジスルフィド結合したドメイン
を有する安定なヘテロ二量体複合体を形成するためにin vitroでフォールドする
ことが可能であり得る。ペプチドは、最初のフォールディング反応に含まれ得、または後
のステップで空のヘテロ二量体に付加され得る。MHC結合部位は、このペプチドの付加
の前には、ペプチドなしであり得る。例外は、天然のペプチド−MHC複合体、例えば、
自己免疫攻撃の標的である細胞の表面上に存在し得るものなどによってT細胞を標識する
ことが所望される場合である。MHCヘテロ二量体は、クラスIについてはα2およびα
1、またはクラスIIについてはα1およびβ1のいずれかの2つの膜遠位ドメインによ
って形成される溝中でペプチドに結合する。サブユニットおよびペプチドのフォールディ
ングおよび会合を許容する条件は、当技術分野で公知である(例えば、Altmanら(199
3年)およびGarbocziら(1992年)を参照のこと)。許容的条件の一例として、大ま
かに等モル量の可溶化されたαサブユニットおよびβサブユニットが、尿素の溶液中で混
合される。再フォールディングは、尿素なしの緩衝溶液中への希釈または透析によって開
始される。ペプチドは、約1〜3日間にわたって約pH5〜5.5で空のクラスIIヘテ
ロ二量体中に負荷され、その後、中和、濃縮および緩衝液交換される。しかし、具体的な
フォールディング条件は本発明の実施にとって重要でないことは、当業者によって容易に
理解される。
一部の実施形態では、単量体複合体(α−β−P)は、多量体化され得る。例えば、多
量体は、αサブユニットまたはβサブユニット上の特定の付着部位を介して、単量体を多
価の実体に結合させることによって形成され得る。一部の実施形態では、多量体は、単量
体の化学的架橋結合によって形成される。タンパク質を架橋結合させることが可能ないく
つかの試薬が、当技術分野で公知であり、これには、アジドベンゾイルヒドラジド、N−
[4−(p−アジドサリチルアミノ)ブチル]−3’−[2’−ピリジルジチオ]プロピ
オンアミド)、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、アジプイミド酸ジメチル、酒
石酸ジスクシンイミジル、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、
N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−4−アジドベンゾエート、N−スクシンイミジ
ル[4−アジドフェニル]−1,3’−ジチオプロピオネート、N−スクシンイミジル[
4−ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよ
びスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレー
トが含まれるがこれらに限定されない。多価実体への結合のための付着部位は、天然に存
在してもよく、または遺伝子操作を介して導入されてもよい。部位は、特異的結合対のメ
ンバー、または特異的結合対のメンバーを提供するように改変されたものであり得、ここ
で、相補的対は、多様な特異的結合部位を有する。相補的結合メンバーへの結合は、化学
反応、エピトープ−受容体結合またはハプテン−受容体結合であり得、ここで、ハプテン
は、サブユニット鎖に連結される。好ましい実施形態では、これらのサブユニットのうち
1つは、改変酵素のための認識部位を提供するアミノ酸配列に融合される。この認識配列
は通常、抗原性ペプチド結合部位における潜在的な妨害を回避するために、これらのサブ
ユニットのうち1つのカルボキシ末端の近位に融合される。簡便には、発現カセットは、
認識部位をコードする配列を含む。
目的の改変酵素には、BirA、種々のグリコシラーゼ、ファルネシルタンパク質トラ
ンスフェラーゼ、タンパク質キナーゼなどが含まれる。サブユニットは、任意の都合のよ
い時、通常は単量体の形成後に、改変酵素と反応され得る。改変酵素によって導入される
基、例えば、ビオチン、糖、リン酸、ファルネシルなどは、相補的結合対のメンバー、ま
たは相補的結合対のメンバーを提供するさらなる改変、例えば、化学的架橋結合、ビオチ
ン化などに固有の部位を提供する。代替的戦略は、対合していないシステイン残基をサブ
ユニットに導入し、それによって、結合に固有の化学的に反応性の部位を導入することで
ある。付着部位はまた、天然に存在するまたは導入されたエピトープであり得、多価結合
パートナーは、抗体、例えば、IgG、IgMなどである。任意の改変は、結合を干渉し
ない部位、例えば、C末端近位においてである。多量体形成の例示は、タンパク質基質の
ビオチン化を触媒する酵素BirAのための認識配列の導入である。次いで、ビオチン化
サブユニットを有する単量体が、多価結合パートナー、例えば、極端に高い親和性でビオ
チンが結合するストレプトアビジンまたはアビジンに結合される。ストレプトアビジンは
、4の価数を有して、(α−β−P)の多量体を提供する。多価結合パートナーは、溶
液中で遊離であり得る、または不溶性支持体に付着され得る。適切な不溶性支持体の例に
は、ビーズ、例えば、磁性ビーズ、メンブレンおよびマイクロタイタープレートが含まれ
る。これらは、典型的には、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、ポリサッ
カライド、ナイロンまたはニトロセルロース製である。不溶性支持体への付着は、結合性
複合体がT細胞の分離に使用される場合に有用である。
細胞
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、細
胞である。例えば、親和性部分は、インタクトな細胞、化合物(例えば、薬物)で処理さ
れた細胞、固定された細胞、溶解細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の
実施形態では、親和性部分は、単一の細胞である。例えば、親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲートの親和性部分は、T細胞またはB細胞であり得る。一部の実施形態では、
親和性部分は、複数の細胞である。一部の実施形態では、親和性部分は、T細胞である。
一部の実施形態では、親和性部分は、B細胞である。一部の実施形態では、親和性部分は
、抗原提示細胞(APC)である。一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲートの親和性部分は、特定の細胞型または細胞サブセットである。例えば、親和
性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、CD4T細胞またはCD8
T細胞であり得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は
、特定の抗原を特異的に認識するTCRを含むT細胞であり得る。例えば、親和性−オリ
ゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、特定のMHC−ペプチド複合体を特異的
に認識するTCRを含むT細胞であり得る。一部の実施形態では、親和性部分は、細胞で
ある。
小分子
一部の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分は、薬
物などの小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬物または化学化合物
であり得る。一部の実施形態では、小分子は、5つ以下の水素結合ドナーを含む。一部の
実施形態では、小分子は、10個以下の水素結合アクセプターを含む。一部の実施形態で
は、小分子は、500ダルトンまたはそれ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、
小分子は、約180〜500ダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、小分子は
、5以下のオクタノール−水分配係数log Pを含む。一部の実施形態では、小分子は
、−0.4〜5.6の分配係数log Pを有する。一部の実施形態では、小分子は、4
0〜130のモル屈折率を有する。一部の実施形態では、小分子は、約20〜約70個の
原子を含む。一部の実施形態では、小分子は、140オングストロームまたはそれ未満
の極性表面積を有する。
核酸
一部の実施形態では、親和性部分は、リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌ
クレオチド(アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン)のポリマー形態、例えば、D
NAまたはRNA(例えば、mRNA)である。DNAには、直鎖DNA分子(例えば、
制限断片)、ウイルス、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖DNAが含ま
れる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド親和性部分は、一本鎖、二本鎖、低分子干
渉RNA(siRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(
tRNA)、染色体、遺伝子、非コードゲノム配列、ゲノムDNA(例えば、断片化され
たゲノムDNA)、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチド、ハイブ
リダイズしたポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアDNA、リボソーム
RNA、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成されたポリヌクレ
オチド、ライゲーションされたポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、核酸アナロ
グを含むポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、
それらの任意の断片、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、親和性
部分は、二本鎖領域と二本鎖ではない末端(例えば、5’または3’オーバーハング領域
)とを含むポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、組換えポリヌ
クレオチドである。一部の実施形態では、親和性部分は、異種ポリヌクレオチドである。
例えば、親和性部分は、細菌(例えば、E.coli)、酵母、哺乳動物または昆虫細胞
において産生されるポリヌクレオチド(例えば、生物にとって異種のポリヌクレオチド)
を含み得る。一部の実施形態では、親和性部分は、変異、挿入、欠失または多型を含むポ
リヌクレオチドである。
一部の実施形態では、親和性部分は、アプタマーである。アプタマーは、タンパク質な
どの標的分析物に高い特異性および親和性で結合する単離された核酸分子である。アプタ
マーは、その所与の標的を特異的に結合するための化学的接触を提供するある特定のコン
フォメーション(単数または複数)で維持された三次元構造である。アプタマーは、核酸
ベースの分子であるが、アプタマーと遺伝子およびmRNAなどの他の核酸分子との間に
は根本的な差異が存在する。後者では、核酸構造は、その直鎖塩基配列を介して情報をコ
ードし、したがって、この配列は、情報記憶の機能にとって重要なものである。完全に対
照的に、標的分子の特異的結合に基づくアプタマー機能は、保存された直鎖塩基配列(非
コード配列)に完全に依存するわけではなく、むしろ特定の二次/三次/四次構造に依存
する。アプタマーが有し得る任意のコード潜在力は、完全に偶然であり、その同族標的へ
のアプタマーの結合においていかなる役割も果たさない。アプタマーはまた、ある特定の
タンパク質に結合する天然に存在する核酸配列から鑑別されなくてはならない。これら後
者の配列は、天然に存在する核酸の転写、翻訳および運搬に関与するタンパク質の特殊化
した下位群(例えば、核酸結合性タンパク質)に結合する、生物のゲノム内に埋め込まれ
た天然に存在する配列である。他方で、アプタマーは、短い単離された天然に存在しない
核酸分子である。核酸結合性タンパク質と結合するアプタマーが識別され得るが、ほとん
どの場合、かかるアプタマーは、核酸結合性タンパク質によって実際に認識される配列に
対する配列同一性をほとんどまたは全く有さない。より重要なことに、アプタマーは、事
実上任意のタンパク質(核酸結合性タンパク質にとどまらない)ならびに、小分子、炭水
化物、ペプチドなどを含む目的のほぼ任意の標的と結合し得る。ほとんどの標的について
、タンパク質であっても、それが結合する天然に存在する核酸配列は存在しない。かかる
配列を有する標的、例えば、核酸結合性タンパク質について、かかる配列は、緊密に結合
するアプタマーと比較して、実際に使用される比較的低い結合親和性の結果として、アプ
タマーとは異なる。アプタマーは、選択された標的に特異的に結合し、標的活性または結
合相互作用をモジュレートすることが可能であり、例えば、結合を介して、アプタマーは
、それらの標的が機能する能力を遮断し得る。標的への特異的結合の機能的特性は、アプ
タマーの固有の特性である。典型的なアプタマーは、サイズが6〜35kDa(20〜1
00ヌクレオチド)であり、マイクロモル濃度からナノモル濃度未満の親和性でその標的
と結合し、密接に関連する標的を判別し得る(例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミ
リー由来の関連タンパク質を選択的に結合し得る)。アプタマーは、特異的標的と結合す
るために、一般に見られる分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相補性、疎水性接触
および立体排除を使用することが可能である。アプタマーは、高い特異性および親和性、
低い免疫原性、生物学的効力ならびに優れた薬物動態学的特性を含む、治療剤および診断
剤としての使用のためのいくつかの所望の特徴を有する。アプタマーは、共有結合的に連
結された相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子ステムお
よびループ構造(例えば、ヘアピンループ構造)を含み得る。ステムは、ハイブリダイズ
したポリヌクレオチドを含み、ループは、2つの相補的ポリヌクレオチドを共有結合的に
連結する領域である。
一部の実施形態では、親和性部分は、複数の親和性部分、例えば、親和性部分の混合物
またはライブラリーである。一部の実施形態では、親和性部分は、複数の異なる親和性部
分である。例えば、親和性部分は、複数の少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9
、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、5
00、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7
,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13
,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、
19,000、20,000、25,000または30,000の親和性部分を含み得る

親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は、その親和性
−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされた核酸である。一
部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に直接的にカップリングされる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に間接的にカップリングされる
。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に非共有結合的にカップリン
グされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分に共有結合的にカッ
プリングされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、合成されたオリゴヌクレ
オチドである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、親和性部分の標的分析物
と直接的には、実質的に相互作用しない。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴ
ヌクレオチドは、1つまたは複数のバーコード配列を含み得る。例えば、親和性−オリゴ
ヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴヌクレオチドは、
抗原ID(AID)配列および抗原分子バーコード(AMB)配列を含み得る。オリゴヌ
クレオチドは、抗原ID(AID)配列、融合配列、プライマー部位、分子バーコード配
列、定常配列、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
オリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分への
コンジュゲーションを可能にするための化学的改変(例えば、アミン、チオールまたはビ
オチン)を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドを構成し得る。複数のオリゴヌクレ
オチドは、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートによって構成され得る。例
えば、オリゴヌクレオチドは、複数の少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500
、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,0
00、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,0
00、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19
,000、20,000、25,000または30,000のオリゴヌクレオチドを構成
し得る。例えば、複数の少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、2
0、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1,000
、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,0
00、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,
000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、2
0,000、25,000または30,000のオリゴヌクレオチドは、複数の少なくと
も約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、7
0、80、90、100、200、500、1,000、2,000、3,000、4,
000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000
、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,0
00、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000または
30,000の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートによって構成され得る。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチド融合
配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、オリゴヌクレオチド定常配列、またはそ
れらの任意の組合せを含み得る。
オリゴヌクレオチド抗原ID(AID)配列
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列またはその相補体を含
み得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、このオリゴヌクレオチド抗原バーコード
を含む親和性−オリゴヌクレオチド複合体の識別を可能にし得る。オリゴヌクレオチド抗
原バーコードは、このオリゴヌクレオチド抗原バーコードが付着される親和性部分の識別
を可能にし得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、異なる標的分析物に結合する複
数の異なる親和性部分由来の親和性部分を識別するために使用され得る。オリゴヌクレオ
チド抗原バーコードは、親和性−オリゴヌクレオチド複合体に排他的にバーコード化され
得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、親和性部分に排他的にバーコード化され得
る。したがって、オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、特異的親和性部分にバーコ
ード化され得る。
オリゴヌクレオチド抗原バーコードは、固有のバーコード配列であり得る。例えば、複
数のオリゴヌクレオチド抗原バーコードのうちの任意の1つのオリゴヌクレオチド抗原バ
ーコードは、固有のバーコード配列であり得る。理論的に可能な異なる抗原バーコード配
列の数は、バーコード配列の長さに直接的に依存し得る。例えば、ランダムにアセンブル
されたアデニン、チミジン、グアノシンおよびシチジンヌクレオチドを有するDNAバー
コードが使用できる場合、可能なバーコード配列の理論的最大数は、10ヌクレオチドの
長さについては1,048,576であり得、15ヌクレオチドの長さについては1,0
73,741,824であり得る。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、少なくと
も3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、1
8、19、20、25、30、40、45、または50もしくはそれよりも多く連続する
ヌクレオチドの配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、2もしくはそれよりも多くのオ
リゴヌクレオチド抗原バーコード配列またはそれらの相補体を含み得る。オリゴヌクレオ
チド抗原バーコード配列は、ヌクレオチドのランダムにアセンブルされた配列を含み得る
。オリゴヌクレオチド抗原バーコード配列は、ディジェネレート配列であり得る。オリゴ
ヌクレオチド抗原バーコード配列は、既知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド抗原バ
ーコード配列は、予め規定された配列であり得る。好ましい実施形態では、オリゴヌクレ
オチド抗原バーコード配列は、異なる標的分析物と相互作用する複数の異なる親和性部分
のうちの1つの親和性部分を識別するためにオリゴヌクレオチド抗原バーコードまたはそ
の相補体を含むシグナル(例えば、配列読み取り)が使用できるようにそれがカップリン
グされる親和性部分にバーコード化される既知の固有の配列である。
例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされ
たオリゴヌクレオチドは、抗原ID(AID)配列であるバーコードを含み得る。AID
配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にバーコード化され得
る。AID配列は、親和性部分が標的化する抗原にバーコード化され得る。AID配列は
、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分および/または親和性部分が
標的化する抗原を識別するために使用され得る。例えば、AID配列は、抗体−オリゴヌ
クレオチドコンジュゲートの抗体にバーコード化され得る。例えば、AID配列は、抗体
−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの抗体が標的化する抗原にバーコード化され得る。
例えば、AID配列は、細胞をイムノフェノタイピングするために使用され得る。例えば
、AID配列は、MHC−ペプチド複合体のペプチドにバーコード化され得る。
AID配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分によって標的
化される各抗原に固有であり得る。AID配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュ
ゲートの親和性部分に固有であり得る。例えば、AID配列は、細胞の異なる標的抗原に
特異的に結合する各抗体に固有であり得る。一部の実施形態では、AID配列は、規定さ
れた配列である。一部の実施形態では、AID配列は、既知の配列である。各オリゴヌク
レオチドについてのAID配列は、例えば、次世代シークエンシングによって、オリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドの増幅産物を配列決定することによって決定され得
る。
オリゴヌクレオチド分子バーコード配列
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド分子バーコード配列またはその相補体を含
み得る。オリゴヌクレオチドバーコードは、このオリゴヌクレオチドバーコードを含む親
和性−オリゴヌクレオチド複合体の分子の識別を可能にし得る。オリゴヌクレオチド分子
バーコードは、親和性−オリゴヌクレオチド複合体の分子に排他的にバーコード化され得
る。オリゴヌクレオチド分子バーコードは、親和性部分の分子に排他的にバーコード化さ
れ得る。したがって、オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、親和性部分の特異的分
子にバーコード化され得る。
オリゴヌクレオチド分子バーコードは、固有のバーコード配列であり得る。例えば、複
数のオリゴヌクレオチド分子バーコードのうちの任意の1つのオリゴヌクレオチド分子バ
ーコードは、固有のバーコード配列であり得る。理論的に可能な異なる分子バーコード配
列の数は、バーコード配列の長さに直接的に依存し得る。例えば、ランダムにアセンブル
されたアデニン、チミジン、グアノシンおよびシチジンヌクレオチドを有するDNAバー
コードが使用できる場合、可能なバーコード配列の理論的最大数は、10ヌクレオチドの
長さについては1,048,576であり得、15ヌクレオチドの長さについては1,0
73,741,824であり得る。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、少なくと
も3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、1
8、19、20、25、30、40、45、または50もしくはそれよりも多く連続する
ヌクレオチドの配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、2もしくはそれよりも多くのオ
リゴヌクレオチド分子バーコード配列またはそれらの相補体を含み得る。オリゴヌクレオ
チド分子バーコード配列は、ヌクレオチドのランダムにアセンブルされた配列を含み得る
。オリゴヌクレオチド分子バーコード配列は、ディジェネレート配列であり得る。オリゴ
ヌクレオチド分子バーコード配列は、既知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド分子バ
ーコード配列は、予め規定された配列であり得る。好ましい実施形態では、オリゴヌクレ
オチド分子バーコード配列は、固有の配列であり、標的分析物と相互作用する複数の親和
性部分分子のうちの1つの親和性部分分子を識別するために使用され得る。
例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされ
たオリゴヌクレオチドは、抗原分子バーコード(AMB)配列であるバーコードを含み得
る。抗原分子バーコード(AMB)配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
の各オリゴヌクレオチド分子に固有であり得る。AMB配列は、ベッセル、例えば、エマ
ルジョン液滴中の個々の細胞の抗原などの抗原に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲートのオリゴヌクレオチド分子の数の計数を可能にし得る。各オリゴヌクレオチ
ドについてのAMB配列は、例えば、次世代シークエンシングによって、オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチドの増幅産物を配列決定することによって決定され得る。
オリゴヌクレオチド融合配列
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴ
ヌクレオチドは、融合配列を含み得る。融合配列は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジ
ュゲート、例えば、細胞表面結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリ
ゴヌクレオチド上への液滴特異的バーコード配列のPCR伸長を可能にし得る。複数のオ
リゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドの融合配列は、同一であり得る。融合配列は、
液滴バーコードの配列に対して相補的な配列を含み得る。一部の実施形態では、融合配列
は、オリゴヌクレオチドの末端に位置する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの
末端の融合配列は、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分に直接的には
コンジュゲートされない。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端の融合配列は
、遊離末端を含む。
融合配列は、3’タギングポリヌクレオチド、例えば、ベッセルバーコードを含むポリ
ヌクレオチドの領域に対して相補的な領域を含み得る。融合配列は、ポリヌクレオチド、
例えば、ベッセルバーコードを含むポリヌクレオチドの領域の相補体に対して相補的な領
域を含み得る。例えば、融合配列は、ベッセルバーコードなどのバーコードを含む3’タ
ギングポリヌクレオチドまたはその相補体に対して相補的な3’領域、例えば、3’末端
領域を含み得る。
3’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリ
ゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの3’末端に核酸を付加するために使用され
るポリヌクレオチドであり得る。3’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌク
レオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの3’末端に
核酸を付加するために鋳型として使用されるポリヌクレオチドであり得る。3’タギング
ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド
などの標的ポリヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドであり得
る。3’タギングポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオ
リゴヌクレオチドなどの標的ポリヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズする3’領域
、例えば3’末端領域を含むポリヌクレオチドであり得る。
一部の実施形態では、3’タギングポリヌクレオチドは、ベッセルバーコード化ポリヌ
クレオチドである。ベッセルバーコードは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
のオリゴヌクレオチドに付加され得る。例えば、ベッセルバーコードは、親和性−オリゴ
ヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。ベッセル
バーコード化ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴ
ヌクレオチドの3’末端にハイブリダイズする3’領域、例えば3’末端領域を含み得る
一部の実施形態では、3’タギングポリヌクレオチドは、増幅された産物である。一部
の実施形態では、3’タギングポリヌクレオチドは、単一の分子に起源する増幅された産
物である。一部の実施形態では、3’タギングポリヌクレオチドは、ベッセルバーコード
化ポリヌクレオチドの増幅された産物である。一部の実施形態では、3’タギングポリヌ
クレオチドは、単一のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドに起源する増幅された産物
である。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの3’末端に
ハイブリダイズする3’領域に対して5’側の領域は、プライマーまたはその相補体に対
して相補的な領域を含み得る。親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌク
レオチドの3’末端にハイブリダイズする3’領域に対して5’側の領域は、親和性−オ
リゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドを増幅するために使用され得るプ
ライマーに対して相補的な領域を含み得る。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジ
ュゲートのオリゴヌクレオチドまたはその相補体の3’末端にハイブリダイズする3’領
域に対して5’側の領域に対して相補的な第1のプライマーと、親和性−オリゴヌクレオ
チドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドのプライマー部位に対して相補的な第2のプラ
イマーとを含むプライマーセットが、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリ
ゴヌクレオチドを増幅するために使用され得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドの3’末端にハイブ
リダイズする3’領域に対して5’側の領域は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
を増幅するために使用したプライマーまたはその相補体に対して相補的な領域を含み得る
オリゴヌクレオチド融合配列は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、3
5、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、10
0またはそれよりも多く連続するヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチド融合配列
は、既知の長さの配列であり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、既知の配列であり得
る。オリゴヌクレオチド融合配列は、予め規定された配列であり得る。オリゴヌクレオチ
ド融合配列は、既知の長さの未知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド融合配列は、既
知の長さの既知の配列であり得る。
オリゴヌクレオチド定常配列
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴ
ヌクレオチドは、定常配列を含み得る。この定常配列は、任意選択である。複数の親和性
−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの各オリゴヌクレオチドの定常配列は、同一であり
得る。
オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドの長さを増加させるため、または
オリゴヌクレオチドバーコード、オリゴヌクレオチド融合およびオリゴヌクレオチドプラ
イマー結合部位のうち1つもしくは複数を互いから分離するために、使用され得る。一部
の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド定常配列を含まない。例え
ば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマー結合部位を含むオリゴヌクレ
オチドの末端において親和性部分にカップリングされ得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常配列は、親和性−オリゴヌクレオチド複
合体の親和性部分に付着される。一部の実施形態では、定常オリゴヌクレオチドは、オリ
ゴヌクレオチドプライマー結合配列の上流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常
配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列に対して5’側に位置し得る。一部の実
施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列の下流
に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結
合配列に対して3’側に位置し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、
オリゴヌクレオチドバーコードの上流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列
は、オリゴヌクレオチドバーコードに対して5’側に位置し得る。一部の実施形態では、
オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチドバーコードの下流に位置する。例えば、
オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドバーコードに対して3’側に位置し
得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴヌクレオチド融合配列の
上流に位置する。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチド融合配列
に対して5’側に位置し得る。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常配列は、親和性−オリゴヌクレオチド複
合体のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と親和性部分との間に挟まれる。例えば、
オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列に対して5’側
に位置し得、オリゴヌクレオチドの親和性部分に付着され得る。一部の実施形態では、オ
リゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列とオリゴヌクレオ
チドバーコードとの間に挟まれる。例えば、オリゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌク
レオチドプライマー結合配列に対して3’側に位置し得、オリゴヌクレオチドバーコード
に対して5’側に位置し得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド定常は、オリゴ
ヌクレオチド融合配列とオリゴヌクレオチドバーコードとの間に挟まれる。例えば、オリ
ゴヌクレオチド定常配列は、オリゴヌクレオチドバーコードに対して3’側に位置し得、
オリゴヌクレオチド融合配列に対して5’側に位置し得る。
オリゴヌクレオチド定常配列は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35
、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100
、200、250、300、400、500またはそれよりも多く連続するヌクレオチド
であり得る。オリゴヌクレオチド定常配列は、ヌクレオチドの非ランダム配列を含み得る
。オリゴヌクレオチド定常配列は、既知の長さの配列であり得る。オリゴヌクレオチド定
常配列は、既知の配列であり得る。オリゴヌクレオチド定常配列は、予め規定された配列
であり得る。オリゴヌクレオチド定常配列は、既知の長さの未知の配列であり得る。オリ
ゴヌクレオチド定常配列は、既知の長さの既知の配列であり得る。
オリゴヌクレオチドプライマー結合部位
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性部分にカップリングされたオリゴ
ヌクレオチドは、プライマー部位を含み得る。プライマー部位は、増幅プライマーなどの
プライマーに対して相補的な配列を含み得る。オリゴヌクレオチドプライマー結合配列は
、増幅または配列決定などの反応のためのプライマー結合部位として使用され得る。オリ
ゴヌクレオチドプライマー結合配列は、増幅または配列決定などの反応のために使用され
るプライマーの対のための第1のプライマー結合配列であり得る。例えば、オリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列は、フォワードプライマー結合部位であり得る。例えば、オリ
ゴヌクレオチドプライマー結合部位は、リバースプライマー結合部位であり得る。例えば
、オリゴヌクレオチドプライマー結合部位は、フォワードプライマー結合部位であり得、
オリゴヌクレオチドに付着させたベッセルバーコード化ポリヌクレオチドのプライマー結
合配列は、リバースプライマー結合配列であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列は、ユニバーサルプライマー結合配列である。
オリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、オリゴヌクレオチドに付着させたポリヌク
レオチドの(例えば、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの)プライマー結合配列と
は、6、5、4、3、2または1セルシウス度以下異なる融解温度を含み得る。オリゴヌ
クレオチドプライマー結合配列のヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドに付着させた
ポリヌクレオチドのプライマー結合配列のヌクレオチド配列とは、オリゴヌクレオチドプ
ライマー結合配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに付着
させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列にハイブリダイズしないように、異なり得
る。オリゴヌクレオチドプライマー結合配列のヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチド
に付着させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列のヌクレオチド配列とは、オリゴヌ
クレオチドに付着させたポリヌクレオチドのプライマー結合配列にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列にハイブリダイズしないよう
に、異なり得る。
オリゴヌクレオチドエレメントの配置
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド融合配列が、オリゴヌクレオチドの一方の
末端に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド
融合配列の上流にオリゴヌクレオチドバーコードを含むような順序で配置され得る。オリ
ゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドバーコードの上流にオリゴヌクレオチドプライマ
ー結合配列を含むような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ
ド定常配列が、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列の上流または下流に位置するよう
な順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド定常配列がオリゴヌ
クレオチドバーコード配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオ
チドは、オリゴヌクレオチド定常配列が、オリゴヌクレオチドの一方の末端、例えば、オ
リゴヌクレオチド融合配列を含まないオリゴヌクレオチドの末端に位置するような順序で
配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌ
クレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、およびオリゴヌク
レオチド定常配列の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、親和性部分か
らに向かってまたは親和性部分から進んで、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレ
オチドバーコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、およびオリゴヌクレオ
チド定常配列の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、5’末端から3’
末端へまたは3’末端から5’末端へ、オリゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチ
ドバーコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー結合配列、およびオリゴヌクレオチド
定常配列の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、5’末端オリゴヌクレ
オチド融合配列、固有のオリゴヌクレオチドバーコード配列、リバースオリゴヌクレオチ
ドプライマー結合配列、および親和性部分に(例えば、3’末端に付着させた一級アミン
基を介して)付着させた3’オリゴヌクレオチド定常配列を、その順序で含み得る。例え
ば、親和性部分に付着させたオリゴヌクレオチドは、親和性部分に向かって伝わる、オリ
ゴヌクレオチド融合配列、オリゴヌクレオチドバーコード配列、オリゴヌクレオチド定常
配列、およびオリゴヌクレオチドプライマー結合部位配列の順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列がオリゴヌクレオチドの一方の末端に位置するような
順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列がAID配列の下流に位置するよ
うな順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列がAMB配列の下流に位置す
るような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列が定常配列の下流に位置
するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列がプライマー部位の下
流に位置するような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、プライマー部位がオリゴヌクレオチドの一方の末端に位置する
ような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位がAID配列の上流
に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位がAMB
配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー部
位が定常配列の上流に位置するような順序で配置され得る。オリゴヌクレオチドは、プラ
イマー部位が融合配列の上流に位置するような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列の上流にAID配列を含むような順序で配置され得る
。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位の下流にAID配列を含むような順序で配置さ
れ得る。AID配列は、AMB配列の上流または下流に位置し得る。AID配列は、定常
配列の上流または下流に位置し得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列とプライマー部位
との間にAID配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列の上流にAMB配列を含むような順序で配置され得る
。オリゴヌクレオチドは、プライマー部位の下流にAMB配列を含むような順序で配置さ
れ得る。AMB配列は、AID配列の上流または下流に位置し得る。AMB配列は、定常
配列の上流または下流に位置し得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列とプライマー部位
との間にAMB配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、融合配列の上流に定常配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、プライマー部位の下流に定常配列を含むような順序で配置され得
る。定常配列は、AID配列の上流または下流に位置し得る。定常配列は、AMB配列の
上流または下流に位置し得る。オリゴヌクレオチドは、融合配列とプライマー部位との間
に定常配列を含むような順序で配置され得る。
オリゴヌクレオチドは、AMB配列および/またはAID配列が、オリゴヌクレオチド
の一方の末端、例えば、融合配列またはプライマー部位を含むオリゴヌクレオチドの末端
に位置しないような順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、A
ID配列、AMB配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌク
レオチドは、融合配列、AMB配列、AID配列およびプライマー部位の順序で配置され
得る。
例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、AID配列、AMB配列、定常配列および
プライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、AM
B配列、AID配列、定常配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オ
リゴヌクレオチドは、融合配列、定常配列、AID配列、AMB配列およびプライマー部
位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、定常配列、AMB
配列、AID配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオ
チドは、融合配列、AID配列、定常配列、AMB配列およびプライマー部位の順序で配
置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、融合配列、AMB配列、定常配列、AID
配列およびプライマー部位の順序で配置され得る。
例えば、オリゴヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和性
部分に向かって伝わる、融合配列、AID配列、AMB配列、定常配列およびプライマー
部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’
末端から3’末端へと、融合配列、AID配列、AMB配列、定常配列およびプライマー
部位の順序で配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、5’末端融合配列、AID
配列、AMB配列、定常配列、および親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの親和
性部分に(例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端に付着させた抗体の一級アミン基を介
して)付着させた3’プライマー部位を、その順序で含み得る。
親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート調製
本明細書に記載される方法および組成物において使用される親和性−オリゴヌクレオチ
ドコンジュゲートは、任意の簡便な方法を使用して調製され得る。親和性部分は、オリゴ
ヌクレオチドに直接的または間接的(例えば、リンカーを介して)にカップリングされ得
る。親和性部分は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に(例えば、化学的架橋結合を介し
て)または非共有結合的に(例えば、ストレプトアビジン−ビオチンを介して)カップリ
ングされ得る。使用され得る種々の異なる親和性部分、近接ライゲーションアッセイのた
めのオリゴヌクレオチドの設計、および親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形
成するための親和性部分へのかかるオリゴヌクレオチドのカップリングを含む、親和性−
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの設計および調製は、当技術分野で広く記載されてい
る。当技術分野で記載される詳細および原理は、本発明の方法における使用のための親和
性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの設計に適用され得る(例えば、WO20071
07743、ならびに米国特許第7,306,904号および同第6,878,515号
を参照のこと)。
オリゴヌクレオチドと親和性部分との間での直接的カップリング反応は、例えば、各々
が、他方上の官能基と反応することが可能な官能基(例えば、置換基または化学的ハンド
ル(chemical handle))を有する場合に、利用され得る。官能基は、オリゴヌクレオチ
ドもしくは親和性部分上に存在し得る、またはこれらの成分上に(例えば、酸化反応、還
元反応、切断反応などを介して)導入され得る。核酸/ポリペプチドコンジュゲートを産
生するための方法は、記載されている(例えば、米国特許第5,733,523号を参照
のこと)。
オリゴヌクレオチドへのカップリングに使用され得る抗体またはポリペプチドの官能基
には、炭水化物、アミノ酸のチオール基(HS−)、アミノ酸のアミン基(HN−)、
およびアミノ酸のカルボキシ基が含まれるがこれらに限定されない。例えば、炭水化物構
造は、アルデヒドへと酸化され、HNNH基含有化合物と反応させられて、官能基−C
=NH−NH−を形成し得る。例えば、チオール基は、チオール反応性基と反応させられ
て、チオエーテルまたはジスルフィドを形成し得る。例えば、タンパク質の遊離チオール
基は、ネイティブシステイン残基中のジスルフィドのチオール化または開裂によって、タ
ンパク質中に導入され得る。例えば、アミノ基(例えば、アミノ末端、またはリシン残基
のオメガアミノ基の)は、求電子基(例えば、活性化カルボキシ基)と反応させられて、
アミド基を形成し得る。例えば、カルボキシ基(例えば、カルボキシ末端、または二酸性
(diacidic)アルファアミノ酸のカルボキシ基)は、活性化され、アミノ基と接触させれ
られて、アミド基を形成し得る。他の例示の官能基には、例えば、SPDP、カルボジイ
ミド、グルタルアルデヒドなどが含まれる。
例示の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、市販のキット(「All−in−One
Antibody−Oligonucleotide Conjugation Ki
t」;Solulink,Inc.)を使用して、親和性部分に共有結合的にカップリン
グされる。例えば、第1に、3’−アミノ−オリゴヌクレオチドが、スルホ−S−4FB
を用いて誘導体化され得る。第2に、親和性部分が、S−HyNic基を用いて改変され
得る。第3に、HyNic改変された親和性部分は、4FB改変されたオリゴヌクレオチ
ドと反応させられて、ビス−アリールヒドラゾン媒介された親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲートを得ることができる。過剰な4FB改変されたオリゴヌクレオチドは、磁
性親和性マトリックスを介してさらに除去され得る。全体的な親和性部分の回収は、Hy
Nic改変された親和性部分および4FB改変されたオリゴヌクレオチドを、少なくとも
約95%、96%、97%、98%、99%または100%含まない。ビス−アリールヒ
ドラゾン結合は、熱(例えば、94℃)およびpH(例えば、3〜10)の両方に対して
安定であり得る。
連結基が使用される場合、かかるリンカーは、この連結基を介した親和性部分とオリゴ
ヌクレオチドとの共有結合付着または非共有結合付着を提供するために選択され得る。種
々の適切なリンカーは、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、このリンカーは
、少なくとも約50または100ダルトン100ダルトンである。一部の実施形態では、
このリンカーは、多くて約300;500;1,000;10,000または100,0
00ダルトンである。リンカーは、いずれかの末端において、オリゴヌクレオチドに結合
することが可能な反応性官能性を有する官能基を含み得る。リンカーは、いずれかの末端
において、親和性部分に結合することが可能な反応性官能性を有する官能基を含み得る。
官能基は、オリゴヌクレオチド、親和性部分および/もしくはリンカー上に存在し得、ま
たはこれらの成分上に(例えば、酸化反応、還元反応、切断反応などを介して)導入され
得る。
例示のリンカーには、ポリマー、脂肪族炭化水素鎖、不飽和炭化水素鎖、ポリペプチド
、ポリヌクレオチド、環式リンカー、非環式リンカー、炭水化物、エーテル、ポリアミン
、および当技術分野で公知の他のものが含まれる。リンカーの例示の官能基には、求核性
官能基(例えば、アミン、アミノ基、ヒドロキシ基、スルフヒドリル基、アミノ基、アル
コール、チオールおよびヒドラジド)、求電子官能基(例えば、アルデヒド、エステル、
ビニルケトン、エポキシド、イソシアネートおよびマレイミド)、および環化付加反応が
可能な、ジスルフィド結合を形成することが可能な、または金属に結合することが可能な
官能基が含まれる。例えば、リンカーの官能基は、一級アミン、二級アミン、ヒドロキサ
ム酸、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N−ヒドロキシスクシンイミジルカー
ボネート、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチ
ルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、マレイミド、アジドベンゾイルヒド
ラジド、N−[4−(p−アジドサリチルアミノ)ブチル]−3’−[2’−ピリジルジ
チオ]プロピオンアミド(N-[4-(p-azidosalicylamino)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio]pr
opionamid))、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、アジプイミド酸ジメチル、酒
石酸ジスクシンイミジル、N−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、N−
ヒドロキシスルホスクシンイミジル−4−アジドベンゾエート、N−スクシンイミジル[
4−アジドフェニル]−1,3’−ジチオプロピオネート、N−スクシンイミジル[4−
ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、およびスクシンイミジル−
4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート、3−(2−ピリ
ジルジチオ)プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP)、4−(
N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボン酸N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル(SMCC)などであり得る。
他の実施形態では、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、親和性部分をコー
ドするベクターからin vitroで親和性部分を産生するなどの、親和性−オリゴヌ
クレオチドコンジュゲートを生じるin vitroプロトコールを使用して産生され得
る。目的のかかるin vitroプロトコールの例には、以下が含まれる:RepAベ
ースのプロトコール(例えば、Fitzgeraldら、Drug Discov Today(2000年)5巻
:253〜58頁およびWO9837186を参照のこと)、リボソームディスプレイベ
ースのプロトコール(例えば、Hanesら、PNAS(1997年)94巻:4937〜42頁
;Robertsら、Curr Opin Chem Biol(1999年)6月;3巻:268〜73頁;Sch
affitzelら、J Immunol Methods(1999年)12月10日;231巻:119〜3
5頁;およびWO9854312を参照のこと)など。
核酸分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野で周知である(例えば
、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer
Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeldら編、Alan R
. Liss, Inc.、1985年);Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、
Controlled Drug Delivery (Robinsonら編、Marcel Deiker, Inc.、第2版 19
87年);Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Thera
py: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Appli
cations(Pincheraら編、1985年);「Analysis, Results, and Future Prospec
tive of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy
」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwinら編、A
cademic Press、1985年);およびThorpeら、1982年、Immunol. Rev. 62巻
:119〜58頁を参照のこと。例えば、PCT公開WO89/12624もまた参照の
こと)。例えば、核酸分子は、例えば、それぞれN−ヒドロキシスクシンイミドエステル
またはマレイミド官能性を介して、抗体上のリシンまたはシステインに共有結合的に付着
され得る。
標的抗原
親和性部分の標的抗原は、核酸分子であり得る、またはタンパク質性、例えば、標的タ
ンパク質もしくはペプチドであり得る。標的抗原は、試料中の細胞上に存在する化合物ま
たは組成物であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、特に、ヒトなどの哺乳動物に
おいて、細胞媒介性免疫応答(即ち、適応免疫応答)を惹起することが可能な化合物また
は組成物であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、MHC分子との関連でT細胞に
よって認識され得る。標的抗原には、細胞、組織抽出物、組織または細胞溶解物、タンパ
ク質、個々にまたは混合物としての、複数のタンパク質、ペプチド、ペプチドの混合物、
脂質、炭水化物、糖などが含まれるがこれらに限定されない。標的抗原は、感染性疾患、
自己免疫疾患またはがんなどの疾患の特徴であり得る。標的抗原は、例えば、ウイルス抗
原、細菌抗原、がん抗原などであり得る。
一部の実施形態では、標的抗原は、ウイルス抗原である。ウイルス抗原には、例えば、
ウイルスコートタンパク質、インフルエンザウイルス抗原、HIV抗原、B型肝炎抗原ま
たはC型肝炎抗原が含まれる。
一部の実施形態では、標的抗原は、抗原が腫瘍またはがんと関連するように、腫瘍細胞
またはがん細胞によって専らまたは優勢に発現または過剰発現されるがん抗原(例えば、
タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物など)である。がん抗原は、がん抗原が、1つだ
けの型のがんまたは腫瘍と関連するまたはその特徴であるように、1つだけの型のがんま
たは腫瘍のがん抗原であり得る。あるいは、がん抗原は、1つよりも多くの型のがんまた
は腫瘍のがん抗原であり得る(例えば、その特徴であり得る)。例えば、がん抗原は、乳
房がん細胞および前立腺がん細胞の両方によって発現され得、正常、非腫瘍もしくは非が
ん細胞によっては全く発現されない、または最小限にのみ発現される。がん抗原は、黒色
腫がん抗原または乳房がん抗原であり得る。例示のがん抗原には、gp100、MART
−1、NY−ESO−1、MAGEファミリーのタンパク質のメンバー、例えば、MAG
E−A1、メソテリン、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、PMSA、Her−2
およびp53からなる群のものが含まれる。
標的抗原は、天然に、人工的に、合成によりまたは組換えにより産生され得る。したが
って、標的抗原は、合成、組換え、単離されたおよび/または精製されたタンパク質、ポ
リペプチドまたはペプチドであり得る。かかる抗原を作製または取得する方法は、当技術
分野で公知である。例えば、ポリペプチドおよびタンパク質(例えば、抗原性ポリペプチ
ドおよびタンパク質)をde novo合成する適切な方法は、Chanら、Fmoc Solid P
hase Peptide Synthesis、Oxford University Press、Oxford、United Kingdom、2
005年;Peptide and Protein Drug Analysis、Reid, R.編、Marcel Dekker, I
nc.、2000年;Epitope Mapping、Westwoodら編、Oxford University Press、Oxfo
rd、United Kingdom、2000年;および米国特許第5,449,752号に記載され
ている。また、ポリペプチドおよびタンパク質(例えば、抗原性ポリペプチドおよびタン
パク質)は、標準的な組換え方法を使用して、そのポリペプチドまたはタンパク質をコー
ドする核酸を使用して組換え産生され得る。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、第3版 Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harb
or、N.Y. 2001年;およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biolog
y、Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons、NY、1994年を参
照のこと。多くの抗原のヌクレオチド配列は、当技術分野で公知であり、Nationa
l Center for Biotechnology Information(N
CBI)ウェブサイトのGenBankデータベースから入手可能である。さらに、抗原
は、供給源、例えば、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、例えば、ラット、ヒトなどから単離
および/または精製され得る。単離および精製の方法は、当技術分野で周知である。
抗原は、遊離抗原、例えば、未結合の抗原性ペプチド(例えば、遊離ペプチド)であり
得る、または結合した抗原、例えば、ペプチドでパルスした担体細胞によって提示される
MHC−ペプチド四量体または抗原性ペプチドであり得る。
一部の実施形態では、標的分析物は、膜結合型タンパク質である。一実施形態では、こ
の膜結合型タンパク質は、単一の膜貫通(TM)ドメインを有する古典的I型膜タンパク
質CD4である(Carrら、(1989年)J. Biol. Chem. 264巻:21286〜9
5頁)。別の実施形態では、この膜結合型タンパク質は、複数回膜貫通Gタンパク質共役
受容体(GPCR)膜タンパク質GPR77である(CainおよびMonk、(2002年)J.
Biol. Chem. 277巻:7165〜69頁)。
さらなる例示の膜結合型タンパク質には、GPCR(例えば、アドレナリン受容体、ア
ンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、
ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドパミン受容体、オピオイド受容体、セロト
ニン(erotonin)受容体、ソマトスタチン受容体など)、イオンチャネル(例えば、ニコ
チン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど)、受容体チ
ロシンキナーゼ、受容体セリン/スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、増
殖因子およびホルモン受容体(例えば、上皮増殖因子(EGF)受容体)などが含まれる
がこれらに限定されない。膜結合型タンパク質の変異体または改変されたバリアントもま
た使用され得る。例えば、GPCRの一部の単一または複数の点変異は、機能を保持し、
疾患に関与する(例えば、Stadelら、(1997年)Trends in Pharmacological Rev
iew 18巻:430〜37頁を参照のこと)。
単一の細胞の特徴付け、細胞ポリヌクレオチドバーコード化、および鎖の対合
本明細書に記載される方法は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを利用して
細胞を特徴付けることを含み得る。複数の細胞は、1つまたは複数の親和性−オリゴヌク
レオチドコンジュゲートに接触させられ得る。細胞は、未結合のコンジュゲートを除去す
るために洗浄され得る。細胞は、ベッセル中で単一の細胞として単離され得る。単離され
た細胞に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、ベッセルバー
コード化ポリヌクレオチドを、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドに付着させることに
よって、ベッセルバーコード配列を含むように改変され得る。
ベッセルバーコードを有するポリヌクレオチドは、ベッセルの形成の間にも導入され得
る。これらのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベッセルバーコードを含む各オ
リゴヌクレオチドが、それらが存在するベッセルに対応する固有の正体コードを含むよう
に、ディジェネレートバーコードを保有し得る。
オリゴヌクレオチドは、増幅され得、反応の増幅された産物は、ベッセルから回収され
得る。増幅された産物は、次世代シークエンシング(NGS)タグを付加するためにPC
R富化され得る。ライブラリーは、ハイスループット配列決定プラットフォームを使用し
て配列決定され得、その後、ベッセルバーコード配列および/またはAID配列および/
またはAMB配列が分析され得る。各単一の細胞は、そのそれぞれのベッセル中で単離さ
れるので、2回観察された各ベッセルバーコードについて、配列決定された増幅されたオ
リゴヌクレオチド産物は、同じベッセルに起源し、したがって、固有の単一の細胞に起源
した。オリゴヌクレオチドの各AIDは、それが付着される親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲートの親和性部分にバーコード化され、各単一の細胞は、そのそれぞれのベッ
セル中で単離されるので、同じベッセルバーコードを含む配列について観察された各AI
Dについて、配列決定された増幅されたオリゴヌクレオチド産物は、同じベッセル中の単
一の細胞に結合した特定の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに起源した。同じ
ベッセルバーコードを全てが含む配列のセットの中で個々に観察された各異なるAMBに
ついて、配列決定されたセット中のAMBを有する増幅されたオリゴヌクレオチド産物は
、同じベッセル中の細胞に結合した、例えば、単一細胞ベッセルが使用される場合にはベ
ッセル中の単一の細胞に結合した単一の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート分子
の(他の個々のAMBと比較して)異なる単一のオリゴヌクレオチド部分に起源した。観
察された各単一のAMBについて、同じベッセルバーコードを含む配列を有する全ての増
幅されたオリゴヌクレオチド産物は、単一の(同じ)親和性−オリゴヌクレオチドコンジ
ュゲート分子のオリゴヌクレオチド部分に起源した(例えば、PCR重複またはアンプリ
コンを示す)。したがって、特定のAMBおよび特定のベッセルバーコードの所与の組合
せを用いて観察された各オリゴヌクレオチドは、単一の細胞に結合した親和性−オリゴヌ
クレオチドコンジュゲートの単一の分子を示す;したがって、かかるAMB/ベッセルバ
ーコード組合せを有する配列決定された複数のオリゴヌクレオチドの所与の数(例えば、
2、3、4またはそれよりも多い)の検出は、例えば、アッセイした細胞集団または試料
内の単一の細胞に結合した親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの数(例えば、2
、3、4またはそれよりも多い)を示す。したがって、かかる数は、親和性−オリゴヌク
レオチドコンジュゲートの所与の親和性部分が結合するように設計される、細胞上の分子
の数、例えば、単一の細胞上または単一の細胞中で発現されたコピーの数を示し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞に由来するポリヌクレオチド
、および/またはベッセル中の、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートとは別個で
あり、その部分もしくはコピーとは別個のポリヌクレオチドをバーコード化することをさ
らに含む。例えば、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合するまたは結合し
た、ベッセル中にカプセル化された単一の細胞は、溶解され得、さらなるポリヌクレオチ
ド、例えば、単一の細胞由来のまたは単一の細胞内のポリヌクレオチドが、バーコード化
され得る。一部の実施形態では、ベッセル中の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲー
トのオリゴヌクレオチド部分、例えば、ベッセル中の単一の細胞に結合するもしくは結合
されたオリゴヌクレオチド部分、および/またはそのコピーもしくは増幅された産物は、
ベッセルバーコード配列を用いてバーコード化され得る。一部の実施形態では、単一の細
胞由来の1つまたは複数の細胞ポリヌクレオチドは、同じベッセルバーコード化配列を用
いてバーコード化され得;かかるさらなる1つまたは複数の細胞ポリヌクレオチドは、一
部の実施形態では、分子バーコードを用いてさらにバーコード化される。
T細胞受容体鎖ペアおよび抗体免疫グロブリン鎖ペアは、免疫受容体の両方の型である
。一部の実施形態では、細胞ポリヌクレオチドは、抗体免疫グロブリン鎖(または部分)
コードポリヌクレオチドであり;一部の実施形態では、これは、TCR(または部分)コ
ードポリヌクレオチドである、またはそれを含む。一部の実施形態では、親和性−オリゴ
ヌクレオチドコンジュゲートによって結合される抗原は、TCRもしくは抗体またはその
鎖もしくは部分である。一態様では、本明細書に記載される方法は、ハイスループット配
列決定および診断学のためのポリヌクレオチドライブラリーを生成することをさらに含む
。一態様では、本明細書に記載される方法は、特定の共通の性状を有する患者またはコホ
ートからの抗体および/またはTCR発見のためのヒト由来のライブラリーパネルを開発
することをさらに含む。開示された発明は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
を使用する単一の細胞の特徴付けと一緒に、複数の異なる型の対合した可変配列、例えば
、T細胞受容体鎖ペアおよび抗体免疫グロブリン鎖ペアに適用され得る。例えば、細胞ポ
リヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド、例えば、重鎖および/もしくは軽鎖
、例えば、Vおよび/もしくはV抗体鎖ならびに/またはアルファおよび/もしくは
ベータおよび/もしくはガンマおよび/もしくはデルタ鎖、例えば、Vα/VβおよびV
γ/VδT細胞受容体(TCR)鎖(例えば、そのフレームワーク部分に由来するもの)
は、ベッセルの形成の間に導入され得る(または、ベッセル内に含まれ得る)。ベッセル
バーコードを有するポリヌクレオチドもまた、ベッセルの形成の間に導入され得る(また
は、ベッセル内に含まれ得る)。これらのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドは、ベ
ッセルバーコードを含む各細胞ポリヌクレオチドが、反応(単数または複数)の間に、そ
れが存在するベッセルに対応する固有の正体コードを含むように、ディジェネレートバー
コードを保有し得る。したがって、一部のかかる実施形態では、同じ固有の正体コードを
有する複数のポリヌクレオチドは、同じベッセルに起源していると考えられ、したがって
、一部の態様では、単一の細胞に起源していると考えられる。分子バーコードを有する複
数のポリヌクレオチドもまた、ベッセルの形成の間に導入され得る、または、ベッセル中
に含まれ得る。これらの分子バーコード化ポリヌクレオチドは、分子バーコードを含む各
細胞ポリヌクレオチド分子が、それらが由来する単一の細胞ポリヌクレオチド分子に対応
する固有の正体コードを含むように、ディジェネレートバーコードを保有し得る。数百万
の単一の免疫細胞が、エマルジョンの内側で溶解され得、細胞転写物、例えば、Vおよ
びVならびに/またはVα/Vβおよび/もしくはVγ/Vδ鎖転写物は、プライマー
を使用して逆転写またはコピーされ得、その後、ベッセルバーコードおよび分子バーコー
ドでタグ化され得、バーコード化ポリヌクレオチドがPCR増幅され得る。単一の免疫細
胞(例えば、B細胞またはT細胞)から生じる各VおよびVならびに/またはVα/
Vβおよび/もしくはVγ/Vδ鎖は事実上、同じベッセルバーコード正体を有して、互
いに連結され得る。
次いで、VおよびVならびに/またはVα/Vβおよび/もしくはVγ/Vδ鎖は
、次世代シークエンシング(NGS)タグを付加するために、ベッセルから回収され得、
PCR富化され得る。ライブラリーは、ハイスループット配列決定プラットフォームを使
用して配列決定され得、その後、レパートリー多様性の分析、抗体頻度、CDR3特徴付
け、体細胞超変異系統発生分析などがなされ得る。正確にマッチさせたVおよびV
らびに/またはVα/Vβおよび/もしくはVγ/Vδペアのデータベースは、ベッセル
および分子バーコード配列をデコンボリューションすることによって生成され得る。各単
一の免疫細胞は、そのそれぞれのベッセル中で単離されるので、2回観察された各ベッセ
ルバーコードについて、配列決定された転写物は、同じエマルジョン液滴に起源し、した
がって、固有の単一の細胞に起源した。同じベッセルバーコードを含む配列について、観
察された各異なる分子バーコードについて、配列決定された転写物は、単一の細胞由来の
異なる転写物分子に起源した。同じベッセルバーコードを含む配列について、観察された
各同じ分子バーコードについて、配列決定された転写物は、単一の細胞由来の同じ転写物
分子(例えば、PCR重複)に起源した。
配列決定と並行して、ベッセルから回収されたVおよびVならびに/またはVα/
Vβおよび/もしくはVγ/Vδ鎖のライブラリーは、抗体発現ベクター中にクローニン
グされ得、酵母ディスプレイスクリーニングのために共トランスフェクトされ得る。この
同一のライブラリープールをクローニングすることは、開始時に生物学的試料を分割する
ことと比較して好ましい方法であるが、それは、一部の稀な免疫細胞が、一方のアッセイ
または他方のアッセイのみにおいて捕捉されるからである。ヒト由来のVおよびV
らびに/またはVαおよびVβならびに/またはVγおよびVδ鎖のライブラリーは、古
典的なディスプレイアッセイと同様、対のマッチングが正確か不正確かに関わらず発現さ
れ得る。次いで、酵母ディスプレイが、潜在的抗体候補について富化するために、1つま
たは複数の抗原標的に対して実行され得る。
酵母ディスプレイなどのディスプレイ技術から出現する陽性候補抗体は、配列決定され
得、マッチさせた対のバーコードデータベースに対して問い合わせされ得る。各酵母ディ
スプレイされたVおよび/またはVαおよび/またはVγ鎖は、それぞれ、そのそれぞ
れのVまたはVβまたはVδ鎖に再びマッチされ得、各酵母が提示したVおよび/ま
たはVβおよび/またはVδ鎖は、それぞれ、そのそれぞれのVまたはVαまたはVγ
鎖に再びマッチされ得る。これらの正確に対合した候補は、哺乳動物細胞株において合成
および発現され、目的の標的に対して機能的に検証される遺伝子であり得る。これらの候
補は、完全ヒト抗体および/またはTCRであり得る。
試料
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含有する任意の試料を、本明細書に記載の方
法で使用することができる。一般的に、細胞を含有する任意の試料を、本明細書に記載の
方法で使用することができる。例えば、試料は、対象に由来する生物学的試料であっても
よく、または対象に由来し、RNAもしくはDNAを含有する試料であってもよい。ポリ
ヌクレオチドは、生物学的試料から抽出してもよく、または試料は、ポリヌクレオチドを
抽出または精製せずに、本方法に直接供してもよい。試料は、抽出または単離されたDN
AまたはRNAであってもよい。また、試料は、生物学的検体から抽出された全RNAも
しくはDNA、cDNAライブラリー、ウイルス、またはゲノムDNAであってもよい。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸等の様々な
他の成分を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、
真菌、または任意の他の細胞性生物から得られる任意の細胞性物質から得ることができる
。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単一細胞から得られる。ポリヌクレオ
チドは、直接的に生物から、または生物から得られる生物学的試料から得ることができる
。任意の組織または体液検体を、本発明で使用される核酸の供給源として使用することが
できる。また、ポリヌクレオチドは、初代細胞培養または細胞株等の培養細胞から単離し
てもよい。鋳型核酸がそこから得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病
原体に感染していてもよい。
ある特定の実施形態では、抗体またはTCR産出免疫細胞を、免疫されているか、また
は感染症、がん、自己免疫状態、もしくは任意の他の疾患を罹患しているヒトまたは他の
動物等の、ヒトまたは他の動物等の対象または宿主の血液または他の生物学的試料から単
離して、臨床的に重要である可能性がある、病原体特異的、腫瘍特異的、および/または
疾患特異的な抗体またはTCRを識別することができる。例えば、ヒトは、疾患を有する
と診察されていてもよく、疾患の症状を示しているが、疾患を有すると診察されていなく
てもよく、または疾患の症状を示していなくてもよい。例えば、ヒトは、感染因子(例え
ば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等)、抗原、もしくは疾患に曝されたヒト、お
よび/または感染因子(例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等)、抗原、もし
くは疾患に対する有用な抗体またはTCRを作ることができるヒトであってもよい。例え
ば、動物は、感染因子(例えば、ウイルス、細菌、寄生動物、プリオン等)、抗原、もし
くは疾患に曝された動物、および/または感染因子(例えば、ウイルス、細菌、寄生動物
、プリオン等)、抗原、もしくは疾患に対する有用な抗体またはTCRを作ることができ
る動物であってもよい。免疫された宿主に由来するある特定の免疫細胞は、問題となって
いる1つもしくは複数の標的抗原および/または1つもしくは複数の未知抗原に対する抗
体またはTCRを作る。本発明では、リンパ球プールは、抗体鎖が配列決定されるか、抗
体が作られるか、または発現ライブラリーが作られる前に、蛍光活性化細胞ソーティング
(FACS)、磁気活性化細胞ソーティング(MACS)を使用した細胞のスクリーニン
グおよびソーティング、パニング法、または免疫細胞ライブラリー等の、試料に由来する
複数の免疫細胞を生成するための他のスクリーニング方法等の、任意の好適な方法により
所望の免疫細胞を濃縮することができる。異なる抗体を発現する免疫細胞のほんの少数の
サブセット、したがって可変ドメインのほんの少数の天然由来の組合せを提供するに過ぎ
ない従来技術の濃縮方法とは対照的に、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体ま
たはTCRを発現する個々の免疫細胞の少なくとも2つのサブセットを含有する。例えば
、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体またはTCRを発現する個々の免疫細胞
の、少なくとも5、10、100、250、500、750、1000、2500、50
00、10000、25000、50000、75000、10000、250000、
500000、750000、1000000、2500000、5000000、75
00000、または10000000個のサブセットを含有していてもよい。本発明の方
法は、免疫細胞回収を最大化し、非常に高度な多様性をもたらす。
T細胞は、末梢血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、腸管関連
リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍
を含む、いくつかの供給源から得ることができる。T細胞は、T細胞株から、および自己
由来または同種異系の供給源から得ることができる。T細胞は、単一の個体または個体の
集団、例えば、全てが、がんまたは感染症等の同じ疾患を罹患している個体の集団から得
てもよい。一部の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞が、アフェレーシスまた
は白血球アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、
単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、および血小板を含む、リンパ
球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスにより収集
した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その後の処理ことに適切な緩衝液また
は培地に配置してもよい。本発明の一実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で
細胞を洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠如しており、マグ
ネシウムを欠如していてもよく、または全てではないが、多くの2価カチオンを欠如して
いてもよい。当業者であれば直ちに理解するように、洗浄ステップは、半自動「フロース
ルー」遠心分離機を使用すること等の、当業者に公知の方法により達成することができる
。洗浄後、細胞を、例えば、Ca++/Mg++を含まないPBS等の、様々な生体適合
性緩衝液に再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去
し、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。他の実施形態では、T細胞は、赤血球細胞
を溶解し、PERCOLL(商標)勾配で遠心分離することにより、末梢血リンパ球から
単離される。CD28、CD4、CD8、CD45RA、およびCD45RO
T細胞等のT細胞の特定の部分集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技法により、さ
らに単離してもよい。例えば、CD3、CD28T細胞は、CD3/CD28コンジ
ュゲート磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M−450 CD3/C
D28 T Cell Expander)を使用して、ポジティブ選択することができ
る。一部の実施形態では、ネガティブ選択によるT細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択さ
れた細胞に固有な表面マーカーに対する抗体を組み合わせて達成することができる。1つ
のそのような方法は、ネガティブ選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモ
ノクローナル抗体のカクテルが使用されるネガティブ磁気免疫接着またはフローサイトメ
トリーによる細胞ソーティングおよび/またはセル選択法である。例えば、ネガティブ選
択によりCD4細胞を濃縮するため、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、C
D14、CD20、CD11b、CD16、HLA−DR、およびCD8に対する抗体を
含む。刺激用のT細胞を調製するための別の方法は、洗浄ステップ後に細胞を凍結するこ
とであり、これには、単球除去ステップが必要とされない。理論に束縛されることは望ま
ないが、凍結およびその後の解凍ステップは、細胞集団中の顆粒球およびある程度までは
単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗
浄ステップの後、細胞を、凍結用溶液に懸濁してもよい。多くの凍結用溶液およびパラメ
ータが当技術分野で公知であり、それらは、本状況で有用となるだろうが、1つの方法は
、20%DMSOおよび8%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBSまたは他の
好適な細胞凍結用培地を使用することを含む。その後、これを、DMSOおよびHSAの
終濃度がそれぞれ10%および4%となるように培地で1:1に希釈する。その後、細胞
を、毎分1℃で−80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保管する。
一部の実施形態では、非免疫ヒトドナーまたは非ヒトドナーに由来する免疫細胞が利用
される。動物のナイーブレパートリー(抗原負荷前のレパートリー)は、中程度の親和性
(約1×10−6〜1×10−7MのK)で本質的にあらゆる非自己分子に結合するこ
とができる抗体またはTCRを動物に提供する。抗体またはTCR結合部位の配列多様性
は、生殖系列に直接にはコードされていないが、V遺伝子セグメントからコンビナトリア
ル様式でアセンブルされる。免疫処置は、上述のような、免疫原に結合して増殖し(クロ
ーン拡大)、対応する抗体を分泌するV−VまたはVα−VβまたはVγ−Vδ組合
せを作る任意の免疫細胞を誘発する。しかしながら、免疫されていない対象に由来する脾
臓細胞および/または免疫細胞もしくは他の末梢血リンパ球(PBL)を使用することに
より、考え得る抗体またはTCRレパートリーのより良好な提示を提供することができ、
また、その後、任意の動物種を使用してB細胞またはT細胞抗体またはTCRライブラリ
ーを構築することを可能にする。
一部の場合では、試験に十分な核酸を得るため、少なくとも0.001、0.005、
0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、20、25、30、
35、40、45、または50mLの血液容積を採取する。
一部の場合では、出発物質は末梢血である。末梢血細胞は、特定の細胞タイプ(例えば
、単核細胞、赤血球細胞、CD4細胞、CD8細胞、免疫細胞、T細胞、またはNK
細胞等)を濃縮することができる。また、末梢血細胞は、特定の細胞タイプ(例えば、単
核細胞、赤血球細胞、CD4細胞、CD8細胞、免疫細胞、T細胞、またはNK細胞
等)を選択的に枯渇させることができる。
一部の場合では、出発物質は、固形組織を含む組織試料であってもよく、非限定的な例
としては、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節(扁桃腺を含む)、甲状
腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、および胃が挙げられる。他の場合では、出発
物質は、核酸を含有する細胞、免疫細胞、および特にB細胞またはT細胞であってもよい
。一部の場合では、出発物質は、遺伝物質を得ることができる、任意の生物に由来する、
核酸を含有する試料であってもよい。一部の場合では、試料は、流体、例えば、血液、唾
液、リンパ液、または尿である。
試料は、ある状態を有する対象から採取することができる。一部の場合では、試料が採
取される対象は、患者、例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者であって
もよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、雄または雌であってもよい。一
部の場合では、雌は妊娠している。試料は、腫瘍生検であってもよい。生検は、例えば、
医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、脊椎指圧師、医療補助員、皮膚科医、がん専門
医、胃腸科専門医、または外科医を含む医療従事者により実施されてもよい。
一部の場合では、非核酸物質を、酵素処理(プロテアーゼ消化等)を使用して出発物質
から除去してもよい。
一部の場合では、EDTAを含むがそれに限定されないマグネシウムキレート剤を含有
する装置内に血液を収集し、4℃で保管する。任意選択で、EGTAを含むがそれに限定
されないカルシウムキレート剤を添加してもよい。別の場合では、これらに限定されない
が、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤
、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加または
ジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤
、または切断可能架橋剤を含む、細胞溶解阻害剤を血液に添加する。
一部の場合では、抽出された物質が、一本鎖RNA、二本鎖RNA、またはDNA−R
NAハイブリッドを含む場合、これら分子は、本分野で公知の技法を使用して二本鎖DN
Aに変換することができる。例えば、逆転写酵素を用いて、RNA分子からDNAを合成
してもよい。一部の場合では、RNAのDNAへの変換は、リンカー断片をRNAにライ
ゲーションさせる事前ライゲーションステップを必要とする場合があり、ユニバーサルプ
ライマーを使用することにより、逆転写の開始が可能になる。他の場合では、例えば、m
RNA分子のポリAテールを使用して、逆転写を開始させることができる。DNAへの変
換後、一部の場合では、本明細書に詳述されている方法を使用して、所望の配列をさらに
捕捉、選択、タグ化、または単離することができる。
核酸分子としては、デオキシリボ核酸(DNA)および/またはリボ核酸(RNA)が
挙げられる。核酸分子は、合成であってもよく、または天然由来の供給源に由来していて
もよい。一実施形態では、核酸分子は、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸等の様々な
他の成分を含有する生物学的試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、
真菌、または任意の他の細胞性生物から得される任意の細胞性物質から得ることができる
。ある特定の実施形態では、核酸分子は、単一細胞から得られる。本発明で使用される生
物学的試料としては、ウイルス粒子または調製物が挙げられる。核酸分子は、直接的に生
物から、または生物から得られる生物学的試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾
液、痰、糞便、および組織から得ることができる。任意の組織または体液検体を、本発明
で使用される核酸の供給源として使用することができる。また、核酸分子は、初代細胞培
養または細胞株等の培養細胞から単離してもよい。鋳型核酸がそこから得られる細胞また
は組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染していてもよい。
また、試料は、生物学的検体から抽出される全RNA、cDNAライブラリー、ウイル
ス、またはゲノムDNAであってもよい。ある特定の実施形態では、核酸分子は、タンパ
ク質、酵素、基質、抗体、結合材、ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子等
の他の標的分子に結合されている。一般的に、核酸は、SambrookおよびRussell、Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor、N.Y.(200
1年)に記載されているもの等の様々な技法により生物学的試料から抽出することができ
る。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖(例えば、ステムお
よびループ構造)であってもよい。
DNA抽出法は、当技術分野で周知である。古典的なDNA単離プロトコールは、フェ
ノールおよびクロロホルムの混合物等の有機溶媒を使用して抽出し、その後エタノールで
析出させることに基づく(J. Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual」、1989年、第2版、Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York
、N.Y.)。他の方法としては、以下のものが挙げられる:塩析DNA抽出法(P. Sunnuc
ksら、Genetics、1996年、144巻:747〜756頁;S. M. Aljanabiら、Nucl
. Acids Res.、1997年、25巻:4692〜4693頁)、トリメチルアンモニウ
ム臭化物塩DNA抽出法(S. Gustincichら、BioTechniques、1991年、11巻:2
98〜302頁)、およびグアニジウムチオシアネートDNA抽出法(J. B. W. Hamm
ondら、Biochemistry、1996年、240巻:298〜300頁)。生物学的試料から
DNAを抽出するための様々なキットが、商業的に入手可能である(例えば、BD Bi
osciences Clontech(パロアルト、カリフォルニア州):Epice
ntre Technologies(マディソン、ウィスコンシン州);Gentra
Systems,Inc.(ミネアポリス、ミネソタ州);MicroProbe C
orp.(ボセル、ワシントン州);Organon Teknika(ダーラム、ノー
スカロライナ州);およびQiagen Inc.(バレンシア、カリフォルニア州))
また、RNA抽出法は、当技術分野で周知であり(例えば、J. Sambrookら、「Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual」、1989年、第211版、Cold Spring Ha
rbour Laboratory Press: New York)、および体液からRNAを抽出するためのキッ
トは、商業的に入手可能である(例えば、Ambion,Inc.(オースティン、テキ
サス州);Amersham Biosciences(ピスカタウエイ、ニュージャー
ジー州);BD Biosciences Clontech(パロアルト、カリフォル
ニア州);BioRad Laboratories(ハーキュリーズ、カリフォルニア
州);Dynal Biotech Inc.(レークサクセス、ニューヨーク州);E
picentre Technologies(マディソン、ウィスコンシン州);Ge
ntra Systems,Inc.(ミネアポリス、ミネソタ州);GIBCO BR
L(ゲイサーズバーグ、メリーランド州);Invitrogen Life Tech
nologies(カールズバッド、カリフォルニア州);MicroProbe Co
rp.(ボセル、ワシントン州);Organon Teknika(ダーラム、ノース
カロライナ州);Promega,Inc.(マディソン、ウィスコンシン州);および
Qiagen Inc.(バレンシア、カリフォルニア州))。
1つまたは複数の試料は、1つまたは複数の供給源に由来していてもよい。1つまたは
複数の試料は、2つまたはそれよりも多くの供給源に由来していてもよい。1つまたは複
数の試料は、1つまたは複数の対象に由来していてもよい。1つまたは複数の試料は、2
つまたはそれよりも多くの対象に由来していてもよい。1つまたは複数の試料は、同じ対
象に由来していてもよい。1つまたは複数の対象は、同じ種に由来していてもよい。1つ
または複数の対象は、異なる種に由来していてもよい。1つまたは複数の対象は、健常で
あってもよい。1つまたは複数の対象は、疾患、障害、または状態により影響を受けてい
てもよい。
一部の実施形態では、試料は、血液、唾液、リンパ液、尿、脳脊髄液、精液、痰、糞便
、または組織ホモジネート等の流体である。
試料は、ある状態を有する対象から採取されてもよい。一部の実施形態では、試料が採
取される対象は、患者、例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者であって
もよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、雄または雌であってもよい。一
部の実施形態では、雌は妊娠している。試料は、腫瘍生検であってもよい。生検は、例え
ば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、脊椎指圧師、医療補助員、皮膚科医、がん
専門医、胃腸科専門医、または外科医を含む医療従事者により実施されてもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質、酵素、基質、抗体、結合材、
ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子等の他の標的分子に結合されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合されていない。核酸は、様
々な技法により生物学的試料から抽出することができる(Sambrookら、Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor、N.Y.(2001年))。
一部の実施形態では、試料は唾液である。一部の実施形態では、試料は全血である。一
部の場合では、試験に十分な量のポリヌクレオチドを得るため、少なくとも約0.001
、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、20
、25、30、35、40、45、または50mLの血液容積を採取する。一部の実施形
態では、血液は、EDTAを含むがそれに限定されないマグネシウムキレート剤を含有す
る装置内に収集することができ、4℃で保管される。任意選択で、EGTAを含むがそれ
に限定されないカルシウムキレート剤を添加してもよい。
一部の実施形態では、これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド
誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋
剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒド
リル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤
、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、または切断可能架橋剤を含む、細胞溶解
阻害剤を血液に添加する。一部の実施形態では、非核酸物質を、酵素処理(プロテアーゼ
消化等)を使用して出発物質から除去してもよい。
複数の試料は、少なくとも2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、7
0、80、90、または100個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。複
数の試料は、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、
800、900、または1000個、またはそれよりも多くの試料を含んでいてもよい。
複数の試料は、少なくとも約1000、2000、3000、4000、5000、60
00、7000、8000個の試料、9000、または10,000個の試料、または1
00,000個の試料、または1,000,000個、またはそれよりも多くの試料を含
んでいてもよい。複数の試料は、少なくとも約10,000個の試料を含んでいてもよい
第1の試料中の1つまたは複数のポリヌクレオチドは、第2の試料中の1つまたは複数
のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。第1の試料中の1つまたは複数のポリヌクレ
オチドは、複数の試料中の1つまたは複数のポリヌクレオチドと異なっていてもよい。試
料中の1つまたは複数のポリヌクレオチドは、少なくとも約80%、85%、90%、9
5%、96%、97%、98%、99%、または100%配列同一性を含んでいてもよい
。一部の実施形態では、試料中の1つまたは複数のポリヌクレオチドは、約100、90
、80、70、60、50、40、30、25、20、25、10、9、8、7、6、5
、4、3、2、または1つ未満のヌクレオチドまたは塩基対が異なっていてもよい。複数
の試料の1つまたは複数の試料中の複数のポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多
くの同一配列を含んでいてもよい。複数の試料の1つまたは複数中の総ポリヌクレオチド
の少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15
%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65
%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、また
は100%が、同じ配列を含んでいてもよい。複数の試料の1つまたは複数の試料中の複
数のポリヌクレオチドは、少なくとも2つの異なる配列を含んでいてもよい。複数の試料
の1つまたは複数中の総ポリヌクレオチドの少なくとも約5%、10%、15%、20%
、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%
、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%
、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
、99%、または100%が、少なくとも2つの異なる配列を含んでいてもよい。一部の
実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、互いのバリアントである。例えば
、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、遺伝子多型または他のタイプの突然変異を含有
していてもよい。別の例では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、スプライスバリア
ントである。
第1の試料は、1つまたは複数の細胞を含んでいてもよく、第2の試料は、1つまたは
複数の細胞を含んでいてもよい。第1の試料の1つまたは複数の細胞は、第2の試料の1
つまたは複数の細胞と同じ細胞タイプであってもよい。第1の試料の1つまたは複数の細
胞は、複数の試料の1つまたは複数の異なる細胞と異なる細胞タイプであってもよい。
複数の試料は、同時的に得てもよい。複数の試料は、同時に得ることができる。複数の
試料は、順次得ることができる。複数の試料は、1つまたは複数の異なる試料を得てから
年単位の経過にわたって、例えば、100年、10年、5年、4年、3年、2年、または
1年にわたって得ることができる。1つまたは複数の試料は、1つまたは複数の異なる試
料を得てから約1年以内に得ることができる。1つまたは複数の試料は、1つまたは複数
の異なる試料を得てから12か月、11か月、10か月、9か月、8か月、7か月、6か
月、4か月、3か月、2か月、または1か月以内に得ることができる。1つまたは複数の
試料は、1つまたは複数の異なる試料を得てから30日、28日、26日、24日、21
日、20日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10
日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日、または1日以内に得ることがで
きる。1つまたは複数の試料は、1つまたは複数の異なる試料を得てから約24時間、2
2時間、20時間、18時間、16時間、14時間、12時間、10時間、8時間、6時
間、4時間、2時間、または1時間以内に得ることができる。1つまたは複数の試料は、
1つまたは複数の異なる試料を得てから約60秒、45秒、30秒、20秒、10秒、5
秒、2秒、または1秒以内に得ることができる。1つまたは複数の試料は、1つまたは複
数の異なる試料を得てから1秒未満以内に得ることができる。
試料の異なるポリヌクレオチドは、異なる濃度または量(例えば、異なる数の分子)で
試料中に存在していてもよい。例えば、1つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料
中の別のポリヌクレオチドの濃度または量よりも多くてもよい。一部の実施形態では、試
料中の少なくとも1つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の少なくとも1つの
他のポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約1.5、2、3、4、5、6
、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、
45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、60
0、700、800、900、1000倍、またはそれよりも大きな倍率で多くてもよい
。別の例では、1つのポリヌクレオチドの濃度または量は、試料中の別のポリヌクレオチ
ドの濃度または量よりも少なくてもよい。試料中の少なくとも1つのポリヌクレオチドの
濃度または量は、試料中の少なくとも1つの他のポリヌクレオチドの濃度または量よりも
、少なくとも約1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1
4、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、10
0、200、300、400、500、600、700、800、900、1000分の
1、またはそれよりも大きな倍率で少なくてもよい。
一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多くの試料は、異なる量または濃度のポリ
ヌクレオチドを含有していてもよい。一部の実施形態では、1つの試料中の1つのポリヌ
クレオチドの濃度または量は、異なる試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量より
も多くてもよい。例えば、血液試料は、尿試料よりも多くの量の特定のポリヌクレオチド
を含有する場合がある。あるいは、単一の試料は、2つまたはそれよりも多くのサブ試料
に分けることができる。サブ試料は、異なる量または濃度の同じポリヌクレオチドを含有
していてもよい。1つの試料中の少なくとも1つのポリヌクレオチドの濃度または量は、
別の試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約1.5、2、3
、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、
35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、
500、600、700、800、900、1000倍、またはそれよりも大きな倍率で
多くてもよい。あるいは、1つの試料中の1つのポリヌクレオチドの濃度または量は、異
なる試料中の同じポリヌクレオチドの濃度または量よりも少なくてもよい。例えば、1つ
の試料中の少なくとも1つのポリヌクレオチドの濃度または量は、別の試料中の同じポリ
ヌクレオチドの濃度または量よりも、少なくとも約1.5、2、3、4、5、6、7、8
、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、5
0、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、70
0、800、900、1000分の1、またはそれよりも大きな倍率で少なくてもよい。
標的ポリヌクレオチド
一部の場合では、本明細書で提供されている方法は、細胞に由来するポリヌクレオチド
分子、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド、またはそれら
のアンプリコン等の標的ポリヌクレオチド分子を増幅および配列決定することに関する。
一部の場合では、本明細書で提供されている方法は、標的ポリヌクレオチド分子の少なく
とも1つの領域を増幅および配列決定することに関する。一部の場合では、本明細書で提
供されている方法は、少なくとも1つの標的ポリヌクレオチド分子を増幅および配列決定
することに関する。一態様では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲートのオリゴヌクレオチドである。一態様では、標的ポリヌクレオチドは、R
NAである。一部の実施形態では、標的RNAポリヌクレオチドは、mRNAである。一
部の実施形態では、標的RNAポリヌクレオチドは、ポリアデニル化されている。一部の
実施形態では、RNAポリヌクレオチドは、ポリアデニル化されていない。一部の実施形
態では、標的ポリヌクレオチドは、DNAポリヌクレオチドである。例えば、標的ポリヌ
クレオチドは、cDNAを含む。DNAポリヌクレオチドは、ゲノムDNAであってもよ
い。DNAポリヌクレオチドは、エクソン、イントロン、非翻訳領域、またはそれらの任
意の組合せを含んでいてもよい。
一態様では、標的ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸である。特定の生物の染色体中の遺
伝物質に由来するDNAは、ゲノムDNAであってもよい。一部の実施形態では、標的ポ
リヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体またはTCRの可変領域を含む配列を
含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体の
重鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫
細胞により産生された抗体の軽鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標
的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されたTCRのアルファ鎖の可変領域を含む
配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された
TCRのベータ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオ
チドは、免疫細胞により産生されたTCRのガンマ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部
の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されたTCRのデルタ鎖
の可変領域を含む配列を含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプラ
イマー伸長反応の産物を生成するために使用されるポリヌクレオチド鋳型を含んでいても
よく、また、逆転写反応またはプライマー伸長反応産物自体を含んでいてもよい。例えば
、標的ポリヌクレオチドは、逆転写反応またはプライマー伸長反応に供することができる
目的のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュ
ゲートのオリゴヌクレオチドのAIDを含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリ
ヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドのA
MDを含む配列を含む。例えば、標的ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAを含む。
例えば、標的ポリヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドを含む。例えば、標的ポリヌ
クレオチドは、AIDおよび/またはAMBを含有するオリゴヌクレオチドを含む。
標的ポリヌクレオチドは、事実上任意の供給源から得ることができ、当技術分野で公知
の方法を使用して調製することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、生物または
細胞(例えば、免疫細胞)からゲノムDNAの断片またはmRNAを抽出して、標的ポリ
ヌクレオチドを得ることを含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の方法を使用し
て、増幅せずに直接単離してもよい。また、標的ポリヌクレオチドは、RNA(mRNA
等)から逆転写PCRにより生成されるcDNAを包含することができる。一部の場合で
は、標的ポリヌクレオチドは、RNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチ
ドは、mRNA分子またはそのmRNA分子から産生されるcDNAである。一部の場合
では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来するmRNA分子またはそのmR
NA分子から産生されるcDNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは
、個々の免疫細胞に由来するmRNA分子またはそれらmRNA分子から産生されるcD
NA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する
、抗体配列をコードするmRNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは
、個々の免疫細胞に由来する、重鎖抗体配列をコードするmRNA分子である。一部の場
合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、重鎖抗体配列をコードす
るmRNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由
来する、軽鎖抗体配列をコードするmRNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌク
レオチドは、単一の免疫細胞に由来する、軽鎖抗体配列をコードするmRNA分子である
。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、抗体可変配列
をコードするmRNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免
疫細胞に由来する、可変抗体配列をコードするmRNA分子である。一部の場合では、標
的ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変軽鎖抗体配列をコードするmR
NA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する
、可変軽鎖抗体配列をコードするmRNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレ
オチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変重鎖抗体配列をコードするmRNA分子であ
る。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞に由来する、可変重鎖抗
体配列をコードするmRNA分子である。一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、無
細胞性の核酸、例えばDNAまたはRNAであってもよい。一部の場合では、標的ポリヌ
クレオチドは、個々の免疫細胞に由来する、可変アルファ、ベータ、ガンマ、および/ま
たはデルタ鎖TCR配列をコードするmRNA分子である。
本明細書に記載されている方法を使用して、1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドか
ら、配列決定用のポリヌクレオチドのライブラリーを生成することができる。一部の実施
形態では、ライブラリーは、標的ポリヌクレオチドの2つまたはそれよりも多くの領域か
ら生成されてもよい。一部の実施形態では、方法ライブラリーは、2つまたはそれよりも
多くの標的ポリヌクレオチドから生成されてもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌク
レオチドは、染色体に由来するゲノム核酸またはDNAである。一部の実施形態では、標
的ポリヌクレオチドは、遺伝子多型または突然変異等のバリアントを含む配列を含む。一
部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、DNAを含むが、RNAを含まない。一部
の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、RNAを含むが、DNAを含まない。一部の
実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、DNAおよびRNAを含む。一部の実施形態で
は、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標
的ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリ
ヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖である。
標的ポリヌクレオチドは、任意の生物学的試料から合成または得ることができ、当技術
分野で公知の方法を使用して調製することができる。一部の実施形態では、標的ポリヌク
レオチドは、増幅せずに直接単離される。直接単離するための方法は、当技術分野で公知
である。非限定的な例としては、生物学的試料、生物、または細胞からゲノムDNAまた
はmRNAを抽出することが挙げられる。一部の実施形態では、1つまたは複数の標的ポ
リヌクレオチドは、生物学的試料から精製される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレ
オチドは、それが含有されている生物学的試料から精製されていない。一部の実施形態で
は、標的ポリヌクレオチドは、生物学的試料から単離される。一部の実施形態では、標的
ポリヌクレオチドは、それが含有されている生物学的試料から単離されていない。一部の
実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、無細胞性の核酸であってもよい。一部の実施形
態では、標的ポリヌクレオチドは、断片化核酸であってもよい。一部の実施形態では、標
的ポリヌクレオチドは、転写された核酸であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリ
ヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオ
チドは、非修飾ポリヌクレオチドである。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュ
ゲートに由来するオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌク
レオチドは、複数の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する複数のオリゴ
ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、複数の親和
性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、2
50、300、350、400、450、500、550、600、650、700、7
50、800、850、900、または1000個、またはそれよりも多くのオリゴヌク
レオチドを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、2、3、4、5
、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、
150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、
650、700、750、800、850、900、または1000個、またはそれより
も多くの親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する複数のオリゴヌクレオチ
ドを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150
、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650
、700、750、800、850、900、または1000個、またはそれよりも多く
の親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに由来する、2、3、4、5、6、7、8
、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、20
0、250、300、350、400、450、500、550、600、650、70
0、750、800、850、900、または1000個、またはそれよりも多くのオリ
ゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、AID配列を含む。一部の実施形態で
は、複数の標的ポリヌクレオチドは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、3
0、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、
350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、
850、900、または1000個、またはそれよりも多くのAID配列を含む。一部の
実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、AMB配列を含む。一部の実施形態では、複数
の標的ポリヌクレオチドは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、8
0、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500
、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、15
00、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、90
00、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15
,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、
25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,00
0、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、20
0,000、300,000、400,000、500,000、600,000、70
0,000、800,000、900,000、1×10、2×10、3×10
4×10、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×10
、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×
10、9×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10
6×10、7×10、8×10、9×10、1×10、2×10、3×10
、4×10、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×
1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010
7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×10
、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1
11、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6
×1012、7×1012、8×1012、または9×1012個、またはそれよりも多
くのAMB配列を含む。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、単一細胞に由来するポリヌクレオチド
である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、個々の細胞に由来する。一部の
実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、複数の細胞を含有する試料に由来するポリヌク
レオチドである。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、バイオマーカー配列をコードする。一
部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くのバイオマーカ
ー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、バイオマー
カー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、2つまた
はそれよりも多くのバイオマーカー配列をコードする。一部の実施形態では、複数の標的
ポリヌクレオチドは、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、6
0、70、80、90、または100個、またはそれよりも多くのバイオマーカー配列を
コードする。
一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列のパネ
ルを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン配列の
パネルを含む。一部の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは、TCR配列のパネ
ルを含む。例えば、免疫グロブリン配列のパネルは、Vおよび/またはV配列であっ
てもよい。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはTCR配列のパネルは、1、2、
3、4、5、6、7、8、9、または10個の免疫グロブリンまたはTCR配列を含有す
る。一部の実施形態では、免疫グロブリンまたはTCR配列のパネルは、少なくとも約1
0、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、25
0、300、350、400、450、500、550、600、650、700、75
0、800、850、900、1000、1500、2000、3000、4000、5
000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12
,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、
18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、35,00
0、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,
000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,0
00、500,000、600,000、700,000、800,000、900,0
00、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10、7
×10、8×10、9×10、1×10、2×10、3×10、4×10
、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×10、2×1
、3×10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×10、9
×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10
、7×10、8×10、9×10、1×1010、2×1010、3×1010
4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×10
、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1
11、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3
×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012
、または9×1012個の免疫グロブリンまたはTCR配列を含有する。一部の実施形態
では、免疫グロブリンまたはTCR配列のパネルは、多くとも約10、20、30、40
、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、
400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、
900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7
000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,00
0、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,
000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、4
5,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000
、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000
、600,000、700,000、800,000、900,000、1×10、2
×10、3×10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×10
、9×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、6×1
、7×10、8×10、9×10、1×10、2×10、3×10、4
×10、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×10
、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×1
、9×10、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1
10、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2
×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011
、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×10
12、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、または9×1012
個の免疫グロブリンまたはTCR配列を含有する。一部の実施形態では、免疫グロブリン
またはTCR配列のパネルは、約10〜20、10〜30、10〜40、10〜30、1
0〜40、10〜50、10〜60、10〜70、10〜80、10〜90、10〜10
0、50〜60、50〜70、50〜80、50〜90、50〜100、100〜200
、100〜300、100〜400、100〜300、100〜400、100〜500
、100〜600、100〜700、100〜800、100〜900、100〜100
0、500〜600、500〜700、500〜800、500〜900、500〜10
00、1000〜2000、1000〜3000、1000〜4000、1000〜30
00、1000〜4000、1000〜5000、1000〜6000、1000〜70
00、1000〜8000、1000〜9000、1000〜10000、5000〜6
000、5000〜7000、5000〜8000、5000〜9000、5000〜1
0000、1〜1×10、1〜2×10、1〜3×10、1〜4×10、1〜5
×10、1〜6×10、1〜7×10、1〜8×10、9×10、1〜1×1
、1〜2×10、1〜3×10、1〜4×10、1〜5×10、1〜6×1
、1〜7×10、1〜8×10、9×10、1×10、1〜2×10、1
〜3×10、1〜4×10、1〜5×10、1〜6×10、1〜7×10、1
〜8×10、1〜9×10、1〜1×10、1〜2×10、1〜3×10、1
〜4×10、1〜5×10、1〜6×10、1〜7×10、1〜8×10、1
〜9×10、1〜1×10、1〜2×10、1〜3×10、1〜4×10、1
〜5×10、1〜6×10、1〜7×10、1〜8×10、1〜9×10、1
〜1×1010、1〜2×1010、1〜3×1010、1〜4×1010、1〜5×1
10、1〜6×1010、1〜7×1010、1〜8×1010、1〜9×1010
1〜1×1011、1〜2×1011、1〜3×1011、1〜4×1011、1〜5×
1011、1〜6×1011、1〜7×1011、1〜8×1011、1〜9×1011
、1〜1×1012、1〜2×1012、1〜3×1012、1〜4×1012、1〜5
×1012、1〜6×1012、1〜7×1012、1〜8×1012、または1〜9×
1012個の免疫グロブリンまたはTCR配列を含有する。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、約10、20、30、40、
50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、4
00、450、500、550、600、650、700、750、800、850、9
00、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、70
00、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000
、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,0
00、または20,000塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌク
レオチドは、長さが、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、
90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、5
50、600、650、700、750、800、850、900、1000、1500
、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000
、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,0
00、16,000、17,000、18,000、19,000、または20,000
塩基または塩基対である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、多く
とも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、20
0、250、300、350、400、450、500、550、600、650、70
0、750、800、850、900、1000、1500、2000、3000、40
00、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,00
0、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,
000、18,000、19,000、または20,000塩基または塩基対である。一
部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、長さが、約10〜20、10〜30、10
〜40、10〜30、10〜40、10〜50、10〜60、10〜70、10〜80、
10〜90、10〜100、50〜60、50〜70、50〜80、50〜90、50〜
100、100〜200、100〜300、100〜400、100〜300、100〜
400、100〜500、100〜600、100〜700、100〜800、100〜
900、100〜1000、500〜600、500〜700、500〜800、500
〜900、500〜1000、1000〜2000、1000〜3000、1000〜4
000、1000〜3000、1000〜4000、1000〜5000、1000〜6
000、1000〜7000、1000〜8000、1000〜9000、1000〜1
0000、5000〜6000、5000〜7000、5000〜8000、5000〜
9000、または5000〜10000塩基または塩基対である。一部の実施形態では、
標的ポリヌクレオチドまたはそれらの断片の平均の長さは、約100、200、300、
400、500、もしくは800塩基対未満であってもよく、または約5、10、20、
30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140
、150、160、170、180、190、もしくは200ヌクレオチド未満であって
もよく、または約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90
、100キロベース未満であってもよい。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを
含有する試料等の、相対的に短い鋳型に由来する標的配列は、約40、45、50、55
、60、65、70、75、80、85、90、95、または100塩基である。ある特
定の実施形態では、配列決定データは、疾患または状態に関連する配列または免疫グロブ
リンもしくはTCR配列を含有するデータベースを使用して、既知のまたは予想される配
列に対してアラインされる。
一部の実施形態では、方法は、第1の細胞ポリヌクレオチド、第2の細胞ポリヌクレオ
チド、または両方の生殖系列配列を決定することをさらに含み、第1の細胞ポリヌクレオ
チドは、IgHまたはV配列を含み、第2の細胞ポリヌクレオチドは、IgLまたはV
配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、生殖系列の
IgL IgH、V、V、またはそれらの任意の組合せの配列からの、IgL Ig
H、V、V、またはそれらの任意の組合せの配列の相違を決定することをさらに含む
。一部の実施形態では、方法は、固有のIgH配列の総数、固有のIgL配列の総数;固
有のIgHおよびIgL配列の総数;固有の対合したIgLおよびIgH配列の総数;1
つまたは複数の他の配列に対する、IgH配列もしくはIgL配列の頻度、またはIgH
配列およびIgL配列の組合せの頻度の少なくとも1つを決定することをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、第1の細胞ポリヌクレオチド、第2の細胞ポリヌクレオ
チド、または両方の生殖系列配列を決定することをさらに含み、第1の細胞ポリヌクレオ
チドは、TCRαまたはVα配列を含み、第2の細胞ポリヌクレオチドは、TCRβまた
はVβ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、生殖系
列のTCRα、TCRβ、Vα、Vβ、またはそれらの任意の組合せの配列からの、TC
Rα、TCRβ、Vα、Vβ、またはそれらの任意の組合せの配列の相違を決定すること
をさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、固有のTCRα配列の総数、固有のTCRβ配列の総数
;固有のTCRαおよびTCRβ配列の総数;固有の対合したTCRβおよびTCRα配
列の総数;1つまたは複数の他の配列に対する、TCRα配列もしくはTCRβ配列の頻
度、またはTCRα配列およびTCRβ配列の組合せの頻度の少なくとも1つを決定する
ことをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第1の細胞ポリヌクレオチド、第2の
細胞ポリヌクレオチド、または両方の生殖系列配列を決定することをさらに含み、第1の
細胞ポリヌクレオチドは、TCRγまたはVγ配列を含み、第2の細胞ポリヌクレオチド
は、TCRδまたはVδ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では
、方法は、生殖系列のTCRγ、TCRδ、Vγ、Vδ、またはそれらの任意の組合せの
配列からの、TCRγ、TCRδ、Vγ、Vδ、またはそれらの任意の組合せの配列の相
違を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、固有のTCRγ配列の総
数、固有のTCRδ配列の総数;固有のTCRγおよびTCRδ配列の総数;固有の対合
したTCRδおよびTCRγ配列の総数;1つまたは複数の他の配列に対する、TCRγ
配列もしくはTCRδ配列の頻度、またはTCRγ配列およびTCRδ配列の組合せの頻
度の少なくとも1つを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第1の
遺伝子に由来する配列の総数;第2の遺伝子に由来する配列の総数;第1の遺伝子に由来
する固有の配列の総数;第2の遺伝子に由来する固有の配列の総数;または第1の遺伝子
に由来する配列もしくは第2の遺伝子に由来する配列の頻度の少なくとも1つを決定する
ことをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、個々の対合したIgLおよびIgH配列、またはTCR
αおよびTCRβ配列、またはTCRγおよびTCRδ配列の1つまたは複数の対、なら
びに生殖系列からの相違の合計量に基づき、抗体またはTCRを選択することをさらに含
む。一部の実施形態では、方法は、1つもしくは複数のIgLもしくはIgH配列、TC
RαおよびTCRβ配列、またはTCRγおよびTCRδ配列、ならびに生殖系列からの
相違に基づき、抗体またはTCRを選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方
法は、配列パターン、相違の分析、動力学、または頻度の1つまたは複数に基づき抗体ま
たはTCRを選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、頻度に基づき抗
体またはTCRを選択することをさらに含む。
抗体およびTCRのクローニングおよび発現
「抗体発現ライブラリー」または「TCR発現ライブラリー」または「発現ライブラリ
ー」は、本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質レベルのいずれかでの分子の
コレクション(つまり2つまたはそれよりも多くの分子)を指す場合がある。したがって
、この用語は、複数の抗体またはTCR分子をコードする発現ベクターのコレクション(
つまり、核酸レベル)を指していてもよく、またはそれらが適切な発現系で発現された後
の抗体またはTCR分子のコレクション(つまり、タンパク質レベル)を指していてもよ
い。あるいは、発現ベクター/発現ライブラリーは、それらが発現され得る好適な宿主細
胞に含有されていてもよい。本発明の発現ライブラリー中のコードまたは発現されている
抗体分子は、任意の適切な形式であってもよく、例えば、抗体またはTCR分子全体であ
ってもよく、抗体またはTCR断片、例えば単鎖抗体(例えばscFv抗体)、Fv抗体
、Fab’抗体、(Fab’)断片、ダイアボディ等であってもよい。用語「コードす
る(encoding)」および「コードする(coding for)」、例えば、特定の酵素を「コー
ドする」/「コードする」核酸配列、または特定の酵素のDNAコード配列、または特定
の酵素を「コードする」/「コードする」ヌクレオチド配列など、ならびに他の同義的な
用語は、適切な調節配列の制御下に置かれると酵素に転写および翻訳されるDNA配列を
指す。「プロモーター配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼに結合可能であり、下流(
3’方向)コード配列の転写を開始可能であるDNA調節領域である。プロモーターは、
DNA配列の一部である。この配列領域は、その3’末端に開始コドンを有する。プロモ
ーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必
要なエレメントを有する最小数の塩基を含む。しかしながら、RNAポリメラーゼがこの
配列に結合し、転写が開始コドン(プロモーターを有する3’末端)から開始されると、
転写は、3’方向の下流に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位(ヌクレア
ーゼS1でマッピングすることにより便利に規定される)ならびにRNAポリメラーゼの
結合をもたらすタンパク結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出されることになる。
本発明の抗体またはTCR発現ライブラリーにより特定される、に由来する、から選択
される、またはから得ることができる抗体またはTCR分子は、本発明のまたさらなる態
様を形成する。この場合も、これら抗体またはTCR分子は、抗体またはTCR分子をコ
ードするタンパク質または核酸であってもよく、次いで、核酸は、適切な発現ベクターに
組み込まれてもよく、および/または好適な宿主細胞に含有されてもよい。
cDNAプールは、抗体遺伝子の重鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド、および抗体またはTCR遺伝子のVまたはVαまたはVγ鎖領域の5’末端にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドと共にPCR反応に供してもよい。cDNAプールは、
抗体またはTCR遺伝子の重鎖またはアルファもしくはガンマ鎖の定常領域にハイブリダ
イズするポリヌクレオチド、および抗体またはTCR配列を含むバーコード化ポリヌクレ
オチドのVまたはVαまたはVγ鎖領域の領域5’〜5’末端にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドと共にPCR反応に供してもよい。また、PCR反応は、例えばカッパお
よびラムダクラスのVまたはVβまたはVδ鎖プールを増幅するように設定してもよい
。cDNAプールは、抗体遺伝子の軽鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド、および抗体またはTCR遺伝子のVまたはVβまたはVδ鎖領域の5’末端にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドと共にPCR反応に供してもよい。cDNAプールは、
抗体遺伝子の軽鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体または
TCR配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのVまたはVβまたはVδ鎖領域の領
域5’〜5’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドと共にPCR反応に供してもよ
い。そのようなオリゴヌクレオチドまたはプライマーは、既知であり公的に入手可能な免
疫グロブリンまたはTCR遺伝子配列データベース情報に基づいて設計することができる
一部の実施形態では、VおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδ配列
は、重鎖または軽鎖遺伝子に、特にVおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよ
びVδポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的ではない1つまたは複数の
プライマーを使用したPCR増幅により産生されるVおよびVまたはVαおよびVβ
またはVγおよびVδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態
では、VおよびV配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な
プライマーを使用したPCR増幅により産生されるVおよびVまたはVαおよびVβ
またはVγおよびVδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態
では、VおよびV配列は、C遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはC遺伝子特異
的プライマーを使用したPCR増幅により産生されるVおよびVまたはVαおよびV
βまたはVγおよびVδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形
態では、VおよびV配列は、ベッセルバーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的
な第1のプライマー、およびC遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはC遺伝子特異的
プライマーである第2のプライマーまたは複数の第2のプライマーを有するプライマーセ
ットを使用したPCR増幅により産生されるVおよびVまたはVαおよびVβまたは
VγおよびVδ配列のライブラリーから便利に得ることができる。一部の実施形態では、
およびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδ配列は、ベッセルバーコード
化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第1のプライマーおよびユニバーサル配列に特異的
な第2のプライマーを有するプライマーセットを使用したPCR増幅により産生されるV
およびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδ配列のライブラリーから便利に
得ることができる。
一部の実施形態では、逆転写時に、得られたcDNA配列を、免疫グロブリン遺伝子に
特異的な、特にVおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδポリヌクレオ
チドの末端領域の一方または両方に特異的な1つまたは複数のプライマーを使用して、P
CRにより増幅してもよい。一部の実施形態では、VおよびV配列は、V遺伝子ファ
ミリー特異的プライマーまたはV遺伝子特異的プライマーを使用したPCR増幅により産
生されるVおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδ配列のライブラリー
から得ることができ(Nichollsら、J. Immunol. Meth.、1993年、165巻:81
頁;WO93/12227)、または入手可能な情報に基づき、標準的な当技術分野で公
知の方法に従って設計される。(VおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよび
Vδ配列を、通常は介在スペーサー配列(例えば、インフレーム可撓性ペプチドスペーサ
ーをコードする)とライゲーションさせて、単鎖抗体をコードするカセットを形成するこ
とができる)。V領域配列は、免疫グロブリン発現細胞のcDNAまたはPCR増幅産物
として便利にクローニングすることができる。VおよびVまたはVαおよびVβまた
はVγおよびVδ領域は、任意選択で、本明細書に記載されている方法で、特に、言及さ
れているある特定のステップ後(例えば、単一細胞PCR後、哺乳動物または他の細胞表
面ディスプレイ後、およびFACSスクリーニング後等)に配列決定される。他の理由の
中でも、多様性のレベルが許容可能なレベルにあることを確認するために、配列決定を使
用してもよい。配列決定は、ハイスループット配列決定、ディープシーケンシング(複数
の個々の試料に由来する同じ遺伝子を配列決定して、配列の差異を識別する)、またはこ
の2つの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、天然のVおよびV
またはVαおよびVβまたはVγおよびVδ組合せを、物理的に連結することは必要と
されない。一部の実施形態では、cDNA、バーコード化ポリヌクレオチド、またはPC
R増幅バーコード化cDNAは、物理的に連結されていない。一部の実施形態では、cD
NA、バーコード化ポリヌクレオチド、またはPCR増幅バーコード化cDNAは、同じ
反応またはベッセルでは、物理的に連結されていない。
一部の実施形態では、天然のVおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびV
δ組合せは、cDNAプライマーに加えて、VまたはVαまたはVγ遺伝子の5’末端
に対する1つのプライマーまたは複数のプライマー、およびVまたはVβまたはVδ遺
伝子の5’末端に対する別のプライマーまたは複数のプライマーを使用して、物理的に連
結される。また、これらプライマーは、VおよびVまたはVαおよびVβまたはVγ
およびVδ遺伝子の自己集合を可能にするための追加的な配列である相補的尾部を含有す
る。増幅および連結反応は各細胞内で実施されたため、PCR増幅および連結後に、混合
産物、言い換えれば混合可変領域を得る可能性は最小限である。混合のリスクは、V領域
cDNA対が細胞区画の外に出て相互混合せず、PCR増幅および連結のために細胞内に
残留することを更に保証するために、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド等の嵩高い試薬を
利用することによりさらに低減させることができる。増幅された配列は、相補的末端配列
のハイブリダイゼーションにより連結される。連結後、配列は、本明細書に記載のさらな
る方法ステップで使用される細胞から回収することができる。例えば、回収されたDNA
は、必要に応じて末端プライマーを使用してPCR増幅し、下記に詳述されているような
、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルスベクター、またはそれらの
組合せであってもよいベクターにクローニングすることができる。ハイブリダイズされた
配列に便利な制限酵素部位を組み込んで、クローニングを容易にしてもよい。また、こう
したベクターは、後に使用するための、連結された可変領域のライブラリーとして保存し
てもよい。
追加のVおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδの組合せを提供する
ために、発現系を選択することができる。例えば、バクテリオファージ発現系では、重鎖
および軽鎖配列のランダム組換えが可能である。他の好適な発現系が当業者に公知である
非ヒトに由来するVおよびVまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδ配列の場
合、一部の実施形態では、これら配列を完全ヒトFcとキメラ化することが好ましい場合
があることが留意されるべきである。本明細書で使用される場合、「キメラ化」は、重鎖
および軽鎖可変領域またはVαおよびVβまたはVγおよびVδ領域がヒト由来ではなく
、重鎖および軽鎖またはVαおよびVβまたはVγおよびVδ鎖の定常領域がヒト由来で
ある免疫グロブリンまたはTCRを指す。これは、可変ドメインをヒトFcに増幅および
クローニングすることにより達成される。ヒトFcは、ベクターの一部であってもよく、
または別々の分子にあってもよく、Fcのライブラリーを使用することもできる。好まし
い実施形態では、キメラ化分子をCHO細胞等の哺乳動物細胞で成長させ、FACSで2
回スクリーニングして、細胞集団を、目的の抗体を発現する細胞について濃縮する。キメ
ラ化抗体またはTCRは、配列決定してから機能的に特徴付けるか、または直接的な機能
特徴付けもしくは動力学のいずれかにより特徴付けられる。成長、スクリーニング、およ
び特徴付けは、下記に詳細に記載されている。
上述のPCR反応は、IgG形態の抗体をクローニングするために記載されていること
に留意することが重要である。IgG形態の抗体は、一般的により成熟した免疫応答と関
連しており、一般的にIgM抗体よりも高い親和性を示し、ある特定の治療または診断応
用により望ましいため、好ましい。しかしながら、明らかに、所望であるかまたは適切で
ある場合、免疫グロブリン分子の他の形態、例えば、IgM、IgA、IgE、およびI
gDの1つまたは複数のクローニングを可能にすることになるポリヌクレオチドを設計す
ることができる。
細胞に含有されている遺伝物質の完全性を維持することができ、それにより後日ライブ
ラリーを作ることが可能である場合、抗体またはTCRを識別し、細胞の適切な集団を、
適切な時点で単離し、任意選択で上述のように濃縮した後、抗体またはTCR発現ライブ
ラリーを直ちに生成する必要はない。したがって、例えば、細胞、細胞溶解物、または核
酸、例えばRNAまたはそれに由来するDNAは、適切な方法、例えば凍結により後日ま
で保管し、後日に所望となった時点で、発現ライブラリーを生成してもよい。
発現ベクターのライブラリーが生成されたら、コードされた抗体分子を、適切な発現系
で発現し、周知であり当技術分野で記録されている適切な技法を使用してスクリーニング
することができる。したがって、上記で規定されている本発明の方法は、適切な発現系で
発現ベクターのライブラリーを発現すること、および発現されたライブラリーを所望の特
性を有する抗体についてスクリーニングすることをさらに含んでいてもよい。
本明細書に示されているように、抗体またはTCR配列をコードするポリヌクレオチド
を含む、本開示の方法により調製されるポリヌクレオチドとしては、これらに限定されな
いが、それ自体が抗体またはTCR断片のアミノ酸配列をコードするもの、抗体もしくは
TCR全体またはその部分の非コード配列、抗体またはTCR、断片または部分のコード
配列、ならびに上述の追加のコード配列を有するまたは有していない、少なくとも1つの
シグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列等の、非コード5’および3’配列を
含むがこれらに限定されない追加の非コード配列を共に有する、少なくとも1つのイント
ロン等の、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル(例えば、リボソーム結合およ
びmRNAの安定性)を含む、転写、mRNAプロセシングに役割を果たす転写された未
翻訳配列等の、追加の配列;追加の機能性を提供するもの等の、追加のアミノ酸をコード
する追加のコード配列が挙げられる。したがって、抗体をコードする配列は、抗体または
TCR断片または部分を含む融合抗体またはTCRの精製を容易にするペプチドをコード
する配列等のマーカー配列に融合されていてもよい。
その後、任意選択で、一次PCR産物を、抗体またはTCR可変ドメインV、V
ッパおよびVラムダまたはVαおよびVβまたはVγおよびVδの5’および3’末端
にハイブリダイズする新しいポリヌクレオチドセットが用いられる二次PCR反応に供し
てもよい(適宜、新しいポリヌクレオチドセットが使用される一次PCR反応が、重鎖ま
たは軽鎖抗体遺伝子またはVαもしくはVβ TCR遺伝子またはVγもしくはVδ T
CR遺伝子の部分を増幅するように設計されていたか否かに応じて)。これらポリヌクレ
オチドは、後にクローニングするための規定セットの制限酵素に特異的なDNA配列(つ
まり、制限酵素部位)を含むことが有利である。選択された制限酵素は、ヒト抗体または
TCR V遺伝子セグメント内で切断が起こらないように選択しなければならない。その
ようなポリヌクレオチドは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリンまたはTCR遺
伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。しかしなが
ら、含まれる好ましい制限酵素部位は、NcoI、HindIII、MluI、およびN
otIである。そのような二次PCR反応の産物は、種々のV重鎖、V軽鎖カッパ、およ
びV軽鎖ラムダ抗体断片/ドメインのレパートリーである。したがって、目的の発現ライ
ブラリー形式が、scFvまたはFv形式であり、抗体またはTCRのVおよびV
たはVαおよびVβまたはVγおよびVδドメインのみが存在する場合、一般的に、この
タイプの二次PCR反応が実施される。
また、PCR産物は、バーコード化ポリヌクレオチドの5’および3’末端にハイブリ
ダイズする新しいプライマーセットを用いたPCR反応に供してもよい。これらポリヌク
レオチドは、有利には、後にクローニングするための、規定セットの制限酵素に特異的な
DNA配列(つまり、制限酵素部位)を含むことができる。選択された制限酵素は、ヒト
抗体またはTCR V遺伝子セグメント内で切断が起こらないように選択しなければなら
ない。そのようなポリヌクレオチドは、公知であり公的に入手可能な免疫グロブリンまた
はTCR遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。
しかしながら、導入される好ましい制限酵素部位は、NcoI、HindIII、Mlu
I、およびNotIである。そのような二次PCR反応の産物は、種々のV、Vカッ
パ、およびVラムダ抗体断片/ドメイン、またはVαおよびVβもしくはVγおよびV
δ TCR断片/ドメインのレパートリーである。
また、重鎖もしくは軽鎖またはVαもしくはVβ鎖またはVγもしくはVδ鎖Fvもし
くはFab断片または単鎖抗体もしくはTCRを、この系と共に使用することができる。
重鎖もしくは軽鎖またはVαもしくはVβ鎖またはVγもしくはVδ鎖に突然変異を誘発
させ、その後、相補鎖を溶液に添加してもよい。その後、2つの鎖を組み合わせて、機能
性抗体断片を形成することが可能である。ランダムで非特異的な軽鎖もしくは重鎖または
VαもしくはVβ鎖またはVγもしくはVδ鎖配列を添加することにより、多様なメンバ
ーのライブラリーを生成するためのコンビナトリアル系を産生することが可能になる。
本明細書で規定されている免疫負荷宿主のBまたはTリンパ球に由来する抗体またはT
CR遺伝子の可変重鎖もしくはVα鎖もしくはVγ鎖領域またはそれらの断片、および/
あるいは可変軽鎖もしくはVβ鎖もしくはVδ鎖領域またはそれらの断片を含む、クロー
ニングされた断片のそのようなレパートリーのライブラリーは、本発明のさらなる態様を
形成する。クローニングされた可変領域を含むこうしたライブラリーを、任意選択で発現
ベクターに挿入して、発現ライブラリーを形成してもよい。
一部の実施形態では、PCR反応は、単離された免疫細胞集団に含有されている種々の
抗体またはTCR鎖の定常領域の全体または一部を保持するように設定することができる
。これは、発現ライブラリー形式がFab形式であり、重鎖またはアルファ鎖またはガン
マ鎖成分が、VまたはVαまたはVγおよびCまたはCαまたはCγドメインを含み
、軽鎖またはVβ鎖またはVδ鎖成分が、VまたはVβまたはVδ鎖およびCまたは
CβまたはCδドメインを含む場合に望ましい。この場合も、抗体またはTCR鎖の定常
領域の全体または一部を含むそのようなクローニングされた断片のライブラリーは、本発
明のさらなる態様を形成する。
こうした核酸は、本発明のポリヌクレオチドの他の配列を含むことができるため便利で
ある。例えば、1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む多重クローニング部
位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を支援することができる。また、翻訳可能
な配列を挿入して、翻訳された本発明のポリヌクレオチドの単離を支援することができる
。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利
な手段を提供する。任意選択で、コード配列を除く本発明の核酸は、本発明のポリヌクレ
オチドをクローニングおよび/または発現するためのベクター、アダプター、またはリン
カーである。
追加の配列を、そのようなクローニングおよび/または発現配列に付加して、クローニ
ングおよび/または発現時のそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離を支援し
、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させることができる。クローニングベク
ター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当技術分野で周知である。
(例えば、Ausubel、上記;またはSambrook、上記を参照)。
本明細書で開示されているライブラリーは、様々な用途で使用することができる。本明
細書で使用される場合、ライブラリーは、複数の分子を含む。一部の実施形態では、ライ
ブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、複
数のプライマーを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、1つまたは複数のポリヌ
クレオチド、アンプリコン、またはアンプリコンセットに由来する複数の配列読み取りを
含む。ライブラリーは、保管し、分析用の試料を生成するために複数回使用することがで
きる。一部の用途としては、例えば、遺伝子多型を遺伝子型決定すること、RNAプロセ
シングを研究すること、および本明細書で提供されている方法により配列決定するための
代表的クローンを選択することが挙げられる。配列決定または増幅のためのプライマーま
たはライブラリー等の複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーを生成することができ
、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、7
0、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7
000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,00
0、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,
000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、7
0,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,
000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,
000、900,000、1,000,000、50,000,000、100,000
,000個、またはそれよりも多くの分子バーコードまたはベッセルバーコードを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の少なくとも約2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、3
5、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、5
00、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4
000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,0
00、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17
,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、
50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,0
00、200,000、300,000、400,000、500,000、600,0
00、700,000、800,000、900,000、1,000,000、50,
000,000、100,000,000個、またはそれよりも多くの固有のポリヌクレ
オチドを含み、各固有のポリヌクレオチドは、1つまたは複数の分子バーコードおよびベ
ッセルバーコードを含む。
バーコード
抗原分子バーコード等の分子バーコードは、親和性−オリゴヌクレオチド複合体の単一
のオリゴヌクレオチドまたは単一細胞または単一ベッセルに由来するポリヌクレオチド分
子等の、単一細胞に固有な情報を含む。ベッセルバーコードは、異なる単一細胞に由来す
るかまたは異なる単一ベッセル中に存在するポリヌクレオチドと比較して、単一細胞に由
来するかまたは単一ベッセル中に存在するポリヌクレオチドに固有な情報を含む。一部の
実施形態では、固有情報は、ヌクレオチドの固有の配列を含む。例えば、分子バーコード
またはベッセルバーコードの配列は、分子バーコードまたはベッセルバーコードを含むヌ
クレオチドの固有のまたはランダム配列の同一性および順序を決定することにより決定す
ることができる。一部の実施形態では、固有情報を使用して、標的ポリヌクレオチドの配
列を識別することはできない。例えば、分子バーコードは、1つの標的ポリヌクレオチド
に付着されていてもよいが、分子バーコードを使用して、付着されている標的ポリヌクレ
オチドを決定することはできない。一部の実施形態では、固有情報は、標的ポリヌクレオ
チドの配列を識別するために連結されている公知の配列ではない。例えば、ベッセルバー
コード、1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドに付着されていてもよいが、ベッセルバ
ーコードを使用して、それが1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドのどれに付着されて
いるかを決定することはできない。一部の実施形態では、固有情報は、ヌクレオチドのラ
ンダム配列を含む。一部の実施形態では、固有情報は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド
の1つまたは複数の固有の配列を含む。一部の実施形態では、固有情報は、ディジェネレ
ートヌクレオチド配列またはディジェネレートバーコードを含む。ディジェネレートバー
コードは、可変ヌクレオチド塩基組成または配列を含んでいてもよい。例えば、ディジェ
ネレートバーコードは、ランダム配列であってもよい。一部の実施形態では、分子バーコ
ードまたはベッセルバーコードの相補体配列も、分子バーコードまたはベッセルバーコー
ド配列である。
バーコードは、任意の長さのヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記
載のバーコードはいずれも、2から36個までのヌクレオチドの、4から36個までのヌ
クレオチドの、または6から30個までのヌクレオチドの、または8から20個までのヌ
クレオチドの、2から20個までのヌクレオチドの、4から20個までのヌクレオチドの
、または6から20個までのヌクレオチドの範囲内の長さを有していてもよい。ある特定
の態様では、セット内のバーコードの融解温度は、互いに10℃以内、互いに5℃以内、
または互いに2℃以内である。ある特定の態様では、セット内のバーコードの融解温度は
、互いに10℃以内、互いに5℃以内、または互いに2℃以内ではない。一部の態様では
、バーコードは、クロスハイブリダイゼーションが最小限であるセットのメンバーである
。例えば、そのようなセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、メンバーがストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下で任意の他のメンバーの相補体と安定二本鎖を形
成することができないように、そのセットの全ての他のメンバーのヌクレオチド配列と十
分に異なっていてもよい。一部の実施形態では、クロスハイブリダイゼーションが最小限
であるセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、少なくとも2つのヌクレオチドが全て
の他の配列と異なる。バーコード技術は、Winzelerら(1999年)Science、285巻
:901頁;Brenner(2000年)Genome Biol.、1巻:1頁 Kumarら(2001年
)Nature Rev.、2巻:302頁;Giaeverら(2004年)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、101巻:793頁;Easonら(2004年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA、
101巻:11046頁;およびBrenner(2004年)Genome Biol.、5巻:240頁
に記載されている。
例えば、バーコードは、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、2
5、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38
、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、
70、80、90、100、200、500、または1000個のヌクレオチドを含んで
いてもよい。例えば、バーコードは、多くとも約5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70
、80、90、100、200、500、または1000個のヌクレオチドを含んでいて
もよい。一部の実施形態では、バーコードは、特定の長さのヌクレオチドを有する。例え
ば、バーコードは、長さが、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、1
3、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26
、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、
40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、8
0、90、100、200、500、または1000個のヌクレオチドであってもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコード中の各バーコードは、少なくとも約2つのヌク
レオチドを有する。例えば、複数のバーコード中の各バーコードは、長さが、少なくとも
約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、4
4、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、200、
500、または1000個のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、複数の
バーコード中の各バーコードは、多くとも約1000個のヌクレオチドを有する。例えば
、複数のバーコード中の各バーコードは、長さが、多くとも約5、6、7、8、9、10
、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、3
7、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50
、60、70、80、90、100、200、500、または1000個のヌクレオチド
であってもよい。
分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対して過剰
であってもよい。ベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子
の総数に対して過剰であってもよい。例えば、分子バーコードまたはベッセルバーコード
の数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数の、少なくとも約2、3、4、
5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、
または100倍であってもよい。
異なる分子バーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数に対し
て過剰であってもよい。一部の実施形態では、異なる分子バーコードの数は、複数のベッ
セル中の標識しようとする分子の総数の、少なくとも約1、1.5、2、2.5、3、3
.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、
70、80、90、または100倍である。
単一ベッセル中の異なる分子バーコードの数は、単一ベッセル中の標識しようとする異
なる分子の数に対して過剰であってもよい。一部の実施形態では、単一ベッセル中の異な
る分子バーコードの数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、少なく
とも約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、
15、20、30、40、50、60、70、80、90、または100倍である。
異なるベッセルバーコードの数は、複数のベッセル中の標識しようとする分子の総数よ
りも少なくてもよい。一部の実施形態では、異なるベッセルバーコードの数は、複数のベ
ッセル中の標識しようとする分子の総数の、多くとも約1、1.5、2、2.5、3、3
.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、
70、80、90、または100分の1である。
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子に由来する増幅産物分子
の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数に対して過剰であってもよい
。一部の実施形態では、単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子に
由来する増幅産物分子の数は、単一ベッセル中の標識しようとする異なる分子の数の、少
なくとも約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、1
0、15、20、30、40、50、60、70、80、90、または100倍である。
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、単一ベッセル中
の標識しようとする異なる分子の数よりも少なくてもよい。一部の実施形態では、単一ベ
ッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、単一ベッセル中の標識し
ようとする異なる分子の数の、多くとも約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4
.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、
90、または100分の1である。
単一ベッセル中のベッセルバーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、1つの分子であ
ってもよい。単一ベッセル中の増幅されていないベッセルバーコード化ポリヌクレオチド
分子の数は、1つの分子であってもよい。
一部の実施形態では、異なる分子バーコードの少なくとも約1%、2%、3%、4%、
5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、4
0%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、97%、または100%は、同じ濃度を有する。一部の実施形態では、異
なるベッセルバーコードの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8
%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%
、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%
、または100%は、同じ濃度を有する。
一部の実施形態では、異なる分子バーコードの少なくとも約1%、2%、3%、4%、
5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、4
0%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、97%、または100%は、異なる濃度を有する。一部の実施形態では、
異なるベッセルバーコードの少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、
8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50
%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97
%、または100%は、異なる濃度を有する。
分子バーコードまたはベッセルバーコードの集団中の分子バーコードまたはベッセルバ
ーコードは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60
、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、80
0、900、1000個、またはそれよりも多くの異なる配列を有していてもよい。例え
ば、集団中の分子バーコードまたはベッセルバーコードは、少なくとも2,000、3,
000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、
10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,00
0、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,
000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,0
00、500,000、600,000、700,000、800,000、900,0
00、1,000,000個、またはそれよりも多くの異なる配列を有していてもよい。
したがって、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、標的ポリヌク
レオチド等の1つまたは複数のポリヌクレオチドから、少なくとも10、15、20、2
5、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300
、400、500、600、700、800、900、1000個、またはそれよりも多
くの異なる配列を生成することができる。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセル
バーコードを使用して、標的ポリヌクレオチド等の1つまたは複数のポリヌクレオチドか
ら、少なくとも2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,0
00、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,0
00、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60
,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,00
0、300,000、400,000、500,000、600,000、700,00
0、800,000、900,000、1×10、2×10、3×10、4×10
、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×10、2×
10、3×10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×10
9×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10
、7×10、8×10、9×10、1×10、2×10、3×10、4×
10、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×1010
、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×10
10、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×
1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011
1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×10
、7×1012、8×1012、9×1012個、またはそれよりも多くの異なる配列
を生成することができる。例えば、複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使
用して、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、
70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800
、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30
,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、
70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300
,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800
,000、900,000、1×10、2×10、3×10、4×10、5×1
、6×10、7×10、8×10、9×10、1×10、2×10、3
×10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10
、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10、7×1
、8×10、9×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5
×10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×1010、2×10
10、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×
1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011
5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×10
、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1
12、8×1012、9×1012個、またはそれよりも多くの標的ポリヌクレオチド
から、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、7
0、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、
900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8
000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,
000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、7
0,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,
000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,
000、900,000、1×10、2×10、3×10、4×10、5×10
、6×10、7×10、8×10、9×10、1×10、2×10、3×
10、4×10、5×10、6×10、7×10、8×10、9×10
1×10、2×10、3×10、4×10、5×10、6×10、7×10
、8×10、9×10、1×10、2×10、3×10、4×10、5×
10、6×10、7×10、8×10、9×10、1×1010、2×10
、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1
10、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5
×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012
、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×10
12、8×1012、9×1012個、またはそれよりも多くの異なる配列を生成するこ
とができる。
一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグループ化
またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードを使用
して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じ分子バーコ
ードを含有する。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードまたはベッセル
バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は
、アンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードを
使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を
含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオ
チド分子に由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグルー
プ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコー
ドを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベ
ッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコー
ドを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、1つま
たは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセル
バーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は
複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまた
は単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子に由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列を使用して、配列をグループ化また
はビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列を使用して、配
列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じAID配列を含有す
る。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列を使用して、配列をグループ化ま
たはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、1つまたは複数のアンプリコンセットを含
む。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列を使用して、配列をグループ化ま
たはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成さ
れたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまたは単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子
に由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数のAMB配列を使用して、配列をグループ化また
はビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数のAMB配列を使用して、配
列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じAMB配列を含有す
る。一部の実施形態では、1つまたは複数のAMB配列を使用して、配列をグループ化ま
たはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、1つまたは複数のアンプリコンセットを含
む。一部の実施形態では、1つまたは複数のAMB配列を使用して、配列をグループ化ま
たはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成さ
れたポリヌクレオチドは、単一ベッセルまたは単一細胞に由来するポリヌクレオチド分子
に由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列およびAMB配列を使用して、配列
をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配
列およびAMB配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおけ
る配列は、同じAID配列を含有する。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配
列およびAMB配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおけ
る配列は、同じAID配列および異なるAMB配列を含有する。一部の実施形態では、1
つまたは複数のAID配列およびAMB配列を使用して、配列をグループ化またはビンに
振り分け、各ビンにおける配列は、同じAID配列および同じAMB配列を含有する。一
部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列およびAMB配列を使用して、配列をグ
ループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、1つまたは複数のアンプリコン
セットを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列およびAMB配列を使
用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含
み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチ
ドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードおよびAMB配列を使用し
て、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数の
ベッセルバーコードおよびAMB配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分
け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、
1つまたは複数のベッセルバーコードおよびAMB配列を使用して、配列をグループ化ま
たはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、同じベッセルバーコードおよび異なるAM
B配列を含有する。一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードおよびA
MB配列を使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、
同じベッセルバーコードおよび同じAMB配列を含有する。一部の実施形態では、1つま
たは複数のベッセルバーコードおよびAMB配列を使用して、配列をグループ化またはビ
ンに振り分け、各ビンにおける配列は、1つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一
部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードおよびAMB配列を使用して、
配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記
複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来
し、単一細胞またはベッセルに由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列およびベッセルバーコードを使用し
て、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複数の
AID配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分
け、各ビンにおける配列は、同じAID配列を含有する。一部の実施形態では、1つまた
は複数のAID配列およびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビン
に振り分け、各ビンにおける配列は、同じAID配列および同じベッセルバーコードを含
有する。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列およびベッセルバーコードを
使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、1つまたは
複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のAID配列お
よびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンに
おける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅
反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来していた。
一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使
用して、配列をグループ化またはビンに振り分ける。一部の実施形態では、1つまたは複
数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビン
に振り分け、各ビンにおける配列は、同じ分子バーコードおよび同じベッセルバーコード
を含有する。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバー
コードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、各ビンにおける配列は、1
つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子
バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分
け、各ビンにおける配列は複数の配列を含み、上記複数の配列が生成されたポリヌクレオ
チドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチドに由来し、単一細胞またはベッセルに由来し
ていた。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコー
ドを使用せずに、配列をアラインする。
一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードを使用せずに、配列をアライン
する。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をアライ
ンする。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードを使用して、配列をグル
ープ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。一部の実
施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードを使用せずに、配列をアラインする。
一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をアライン
する。一部の実施形態では、1つまたは複数のベッセルバーコードを使用して、配列をグ
ループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を使用して配列をアラインする。一部の
実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードおよびベッセルバーコードを使用して、
配列をアラインする。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードおよびベッ
セルバーコードを使用して、配列をグループ化またはビンに振り分け、標的特異的領域を
使用して配列をアラインする。
一部の実施形態では、アラインされた配列は、同じAIDを含有する。一部の実施形態
では、アラインされた配列は、同じAMBを含有する。一部の実施形態では、アラインさ
れた配列は、同じAIDおよびAMBを含有する。一部の実施形態では、アラインされた
配列は、同じAIDおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、アライ
ンされた配列は、同じAMBおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では
、アラインされた配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の実施形態では、アライ
ンされた配列は、同じベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態では、アラインさ
れた配列は、同じ分子バーコードおよびベッセルバーコードを含有する。一部の実施形態
では、1つまたは複数の分子バーコードまたはベッセルバーコードを使用して、配列をア
ラインし、アラインされた配列は、アンプリコンセットに由来する2つまたはそれよりも
多くの配列を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードまたはベッセ
ルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は複数の配列を含み、
上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、増幅反応中の同じポリヌクレオチド分
子に由来していた。一部の実施形態では、1つまたは複数の分子バーコードまたはベッセ
ルバーコードを使用して、配列をアラインし、アラインされた配列は複数の配列を含み、
上記複数の配列が生成されたポリヌクレオチドは、単一細胞または単一ベッセルに由来し
ていた。
液滴生成
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または
個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用する
ことにより、バイオマーカー配列等の配列のレパートリーのハイスループット配列決定が
可能になり得る。
複数の細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の細胞の個々の細胞からの、または
個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併用する
ことにより、生物のトランスクリプトームのパーセントを表す配列等の配列のレパートリ
ーのハイスループット配列決定が可能になり得る。例えば、配列のレパートリーは、生物
のトランスクリプトームの少なくとも約0.00001%、0.00005%、0.00
010%、0.00050%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、
0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、
6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、30%、35%、40%、45、5
0%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、9
8%、99%、または100%である複数の配列を含んでいてもよい。
免疫細胞の試料を小さな反応容積に分割し、複数の免疫細胞の個々の免疫細胞からの、
または個々の細胞に由来するポリヌクレオチドの分子およびベッセルバーコード付与と併
用することにより、重鎖および軽鎖配列のレパートリーのハイスループット配列決定が可
能になり得る。また、こうした方法は、バーコード化配列に基づいて配列決定した後、重
鎖および軽鎖の対合を可能にし得る。また、本明細書に記載のように試料を小さな反応容
積に分割することは、試薬使用量を低減し、それにより分析の材料費の削減を可能にし得
る。
一部の場合では、逆転写反応および/または増幅反応(例えば、PCR)は、液滴デジ
タルPCR等のように、液滴中で実施される。ある特定の態様では、本発明は、標的物質
の全体または部分を含有する流体区画を提供する。一部の実施形態では、区画は、液滴で
ある。明細書の全体にわたって「液滴」が参照されているが、この用語は、別様の指定が
ない限り、流体区画および流体分配と同義的に使用される。別様の指定がある場合を除き
、便宜的に「液滴」を使用し、任意の流体分配または区画を使用することができる。本明
細書で使用される液滴は、米国特許第7,622,280号に記載のもの等の、エマルジ
ョン組成物(または、2つまたはそれよりも多くの不混和性流体の混合物)を含んでいて
もよい。液滴は、WO2010/036352に記載のデバイスにより生成することがで
きる。用語「エマルジョン」は、本明細書で使用される場合、不混和性液体(油および水
等の)の混合物を指す場合がある。油相および/または油中水型エマルジョンは、水性液
滴内での反応混合物の区画化を可能にする。エマルジョンは、連続油相内に水性液滴を含
むことができる。本明細書で提供されるエマルジョンは、液滴が連続水相内の油液滴であ
る水中油型エマルジョンであってもよい。本明細書で提供される液滴は、区画間の混合を
防止し、各区画が、その内容物を、蒸発および他の区画の内容物との凝集から保護するよ
うに設計される。
本明細書に記載されている混合物またはエマルジョンは、安定であってもよく、または
不安定であってもよい。エマルジョンは、比較的安定しており、凝集は最小限である。小
液滴が組み合わさって次第により大きな液滴を形成する場合、凝集が生じたという。一部
の場合では、液滴生成装置から生成された液滴の0.00001%、0.00005%、
0.00010%、0.00050%、0.001%、0.005%、0.01%、0.
05%、0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%
、5%、6%、7%、8%、9%、または10%未満が、他の液滴と凝集する。また、エ
マルジョンは、フロキュレーションが限定的であってもよく、フロキュレーションとは、
分散相が懸濁液からフレーク状に沈殿するプロセスである。
約0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、30、40、50
、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、20
0、300、400、もしくは500ミクロンの、または約0.001、0.01、0.
05、0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、1
20、130、140、150、160、180、200、300、400、もしくは5
00ミクロン未満の、または約0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10
、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、15
0、160、180、200、300、400、もしくは500ミクロンよりも大きな、
または少なくとも約0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、3
0、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160
、180、200、300、400、もしくは500ミクロンの平均直径を有する液滴を
生成することができる。液滴は、約0.001〜約500、約0.01〜約500、約0
.1〜約500、約0.1〜約100、約0.01〜約100、または約1〜約100ミ
クロンの平均直径を有していてもよい。マイクロチャネルクロスフローフォーカシング(
microchannel cross-flow focusing)または物理的な撹拌を使用して、単分散または多
分散エマルジョンのいずれかが生成される、エマルジョン液滴を生成するためのマイクロ
流体法が既知である。液滴は、単分散液滴であってもよい。液滴は、液滴のサイズが、液
滴の平均サイズのプラスまたはマイナス5%を超えて変動しないように生成することがで
きる。一部の場合では、液滴は、液滴のサイズが、液滴の平均サイズのプラスまたはマイ
ナス2%を超えて変動しないように生成される。液滴生成装置は、単一試料から液滴の集
団を生成することができ、液滴はいずれも、液滴の全集団の平均サイズのプラスまたはマ
イナス約0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%
、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%
、9.5%、または10%を超えてサイズが変動しない。
より高い機械的安定性は、マイクロ流体の操作、およびより高剪断での流体処理(例え
ば、マイクロ流体毛細管での、または流体経路中のバルブ等の90度屈曲による)に有用
であり得る。熱処理前または熱処理後の液滴またはカプセルは、標準的ピペット操作およ
び遠心分離に対して機械的に安定であり得る。
液滴は、油相を水性試料に通して流動させることにより形成することができる。水相は
、細胞、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子バーコード化ポリヌクレオチド、ベッ
セルバーコード化ポリヌクレオチド、プライマー、鋳型核酸、ならびにDNAポリメラー
ゼ、RNAポリメラーゼ、および/または逆転写酵素等の酵素を含む、増幅反応を実施す
るための緩衝溶液および試薬を含んでいてもよい。
水相は、ビーズ等の固体表面を用いてまたは用いずに増幅反応を実施するための緩衝溶
液および試薬を含んでいてもよい。緩衝溶液は、約1、5、10、15、20、30、5
0、100、もしくは200mMの、約1、5、10、15、20、30、50、100
、もしくは200mMよりも多くの、または約1、5、10、15、20、30、50、
100、もしくは200mM未満のTrisを含んでいてもよい。一部の場合では、塩化
カリウムの濃度は、約10、20、30、40、50、60、80、100、200mM
であるか、約10、20、30、40、50、60、80、100、200mMよりも高
いか、または約10、20、30、40、50、60、80、100、200mM未満で
あってもよい。緩衝溶液は、約15mM Trisおよび50mM KClを含んでいて
もよい。ヌクレオチドは、濃度が、各々、約50、100、200、300、400、5
00、600、もしくは700μmの、約50、100、200、300、400、50
0、600、もしくは700μmよりも高い、または約50、100、200、300、
400、500、600、もしくは700μm未満のdATP、dCTP、dGTP、お
よびdTTPを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を含んでいてもよい。一部の
場合では、dUTPは、約50、100、200、300、400、500、600、も
しくは700、800、900、もしくは1000μmの、約50、100、200、3
00、400、500、600、もしくは700、800、900、もしくは1000μ
mよりも高い、または約50、100、200、300、400、500、600、もし
くは700、800、900、もしくは1000μm未満の濃度になるように水相内に添
加される。一部の場合では、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム(MgCl)は
、約1.0、2.0、3.0、4.0、もしくは5.0mMの、約1.0、2.0、3.
0、4.0、もしくは5.0mMよりも高い、または約1.0、2.0、3.0、4.0
、もしくは5.0mM未満の濃度で水相に添加される。MgClの濃度は、約3.2m
Mであってもよい。一部の場合では、酢酸マグネシウムまたはマグネシウムが使用される
。一部の場合では、硫酸マグネシウムが使用される。
BSAまたはウシ皮膚に由来するゼラチン等の非特異的ブロッキング剤を使用すること
ができ、ゼラチンまたはBSAは、およそ0.1〜0.9%w/vの濃度範囲で存在する
。他の考え得るブロッキング剤としては、ベータラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、ま
たは他の一般的のブロッキング剤を挙げることができる。一部の場合では、BSAおよび
ゼラチンの好ましい濃度は、約0.1%w/vである。
水相内の増幅用プライマーは、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5
、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、もしくは2.0
μmの、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.
8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、もしくは2.0μmよりも高い、または
約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.
9、1.0、1.2、1.5、1.7、もしくは2.0μm未満の濃度を有していてもよ
い。水相内のプライマー濃度は、約0.05〜約2、約0.1〜約1.0、約0.2〜約
1.0、約0.3〜約1.0、約0.4〜約1.0、または約0.5〜約1.0μmであ
ってもよい。プライマーの濃度は、約0.5μmであってもよい。PCRにおける標的核
酸濃度の許容範囲は、限定されないが、約1pg〜約500ngの間が挙げられる。
また、一部の場合では、水相は、添加剤を含んでいてもよく、添加剤としては、これら
に限定されないが、非特異的バックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子D
NA)、バイオプリザバティブ(biopreservative)(例えば、アジ化ナトリウム)、P
CRエンハンサー(例えば、ベタイン、トレハロース等)、および阻害剤(例えば、RN
Ase阻害剤)が挙げられる。他の添加剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド(D
MSO)、グリセロール、ベタイン(一)水和物(N,N,N−トリメチルグリシン=[
カルボキシ(caroxy)−メチル]トリメチルアンモニウム、トレハロース、7−デアザ−
2’−デオキシグアノシン三リン酸(dC7GTPまたは7−デアザ−2’−dGTP)
、BSA(ウシ血清アルブミン)、ホルムアミド(メタンアミド)、テトラメチルアンモ
ニウムクロリド(TMAC)、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体(例えば、テトラ
エチルアンモニウムクロリド(tetraethyammonium chloride)(TEA−Cl)および
テトラプロピルアンモニウムクロリド(TPrA−Cl))、非イオン性洗剤(例えば、
Triton X−100、Tween 20、Nonidet P−40(NP−40
))、またはPREXCEL−Qを挙げることができる。一部の場合では、水相は、0、
1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種の異なる添加剤を含んでいてもよい
。他の場合では、水相は、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または
10種の異なる添加剤を含んでいてもよい。
一部の場合では、非イオン性エチレンオキシド/プロピレンオキシドブロックコポリマ
ーを、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0
.8%、0.9%、または1.0%の濃度で水相に添加してもよい。一般的なバイオサー
ファクタント(biosurfactant)としては、Pluronic F−68、Tetron
ics、およびZonyl FSN等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。Pluro
nic F−68は、約0.5%w/vの濃度で存在していてもよい。
一部の場合では、塩化マグネシウムの代わりに、硫酸マグネシウムを同様の濃度で用い
ることができる。種々の供給業者から市販されている広範な一般的PCR緩衝液を、緩衝
溶液の代わりに用いることができる。
エマルジョンは、加熱することにより固体様界面フィルムを有するマイクロカプセルへ
と変換することができる液体様界面フィルムを有する高度に単分散性の液滴を生成するよ
うに調合することができる。そのようなマイクロカプセルは、PCR増幅等の反応プロセ
ス中にわたって内容物を保持することが可能なバイオリアクターとして働くことができる
。マイクロカプセル形態への変換は、加熱時に生じてもよい。例えば、そのような変換は
、約50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、または95℃よりも高い温度で生じても
よい。一部の場合では、この加熱は、サーモサイクラーを使用して生じる。加熱プロセス
中、流体または鉱油オーバーレイを使用して、蒸発を防止してもよい。過剰な連続相油は
、加熱前に除去してもよく、または除去しなくてもよい。生体適合性カプセルは、幅広い
熱的および機械的処理で凝集および/またはフロキュレーションに耐性であってもよい。
変換後、カプセルは、約3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、
20℃、25℃、30℃、35℃、もしくは40℃で、約3℃、4℃、5℃、6℃、7℃
、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、もしくは40℃より
も高い温度で、または約3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、
20℃、25℃、30℃、35℃、もしくは40℃未満で保管することができる。こうし
たカプセルは、巨大分子、特に、核酸またはタンパク質または両方一緒の混合物を含有す
る水性生物学的流体の安定デジタル化封入;薬物およびワクチン送達;生体分子ライブラ
リー;および臨床イメージング用途等の、生物医学的用途に有用であり得る。
マイクロカプセルは、1つまたは複数のポリヌクレオチドを含有していてもよく、特に
高温で凝集に耐性であってもよい。したがって、PCR増幅反応は、非常に高い密度(例
えば、1単位容積当たりの反応数)で生じてもよい。一部の場合では、1ml当たり10
0,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,
000、2,500,000、5,000,000、または10,000,000よりも
多くの別個の反応が生じてもよい。一部の場合では、反応は、単一のウェルにて、例えば
、マイクロタイタープレートのウェルにて、反応容積間で相互混合を生じさせずに生じる
。また、マイクロカプセルは、逆転写、プライマー伸長、および/またはPCR反応が生
じることを可能にするために必要な他の成分、例えばプライマー、プローブ、dNTP、
DNAまたはRNAポリメラーゼ等を含有していてもよい。こうしたカプセルは、幅広い
熱的および機械的処理で凝集およびフロキュレーションに耐性を示す。
一部の場合では、増幅ステップは、マイクロ流体に基づくデジタルPCRまたは液滴デ
ジタルPCR等のデジタルPCRを実施することにより行われる。
液滴は、マイクロ流体システムまたはデバイスを使用して生成することができる。本明
細書で使用される場合、「マイクロ」という接頭辞(例えば、「マイクロチャネル」また
は「マイクロ流体」の)は、一般的に、約1mm未満の、一部の場合では、約100ミク
ロン(マイクロメートル)未満の幅または直径を有する要素または物品を指す。一部の場
合では、要素または物品は、流体が流動し得るチャネルを含む。加えて、「マイクロ流体
」は、本明細書で使用される場合、少なくとも1つのマイクロスケールチャネルを含むデ
バイス、装置、またはシステムを指す。
マイクロ流体システムおよびデバイスは、様々な状況で、典型的には小型実験室(例え
ば、臨床)分析の状況で記載されている。他の使用も同様に記載されている。例えば、国
際特許出願公開番号WO01/89788、WO2006/040551、WO2006
/040554、WO2004/002627、WO2008/063227、WO20
04/091763、WO2005/021151、WO2006/096571、WO
2007/089541、WO2007/081385、およびWO2008/0632
27。
液滴は、一般的に、第2のキャリア流体内に、ある量の第1の試料流体を含む。当技術
分野で既知の、液滴を形成するための任意の技法を、本発明の方法と共に使用することが
できる。例示の方法は、標的物質(例えば、免疫細胞)を含有する試料流体の流動を、流
動中のキャリア流体の2つの対向流動と交差するように流動させることを含む。キャリア
流体は、試料流体と不混和性である。試料流体を、流動中のキャリア流体の2つの対向流
動と交差させることにより、標的物質を含有する個々の試料液滴内への試料流体の分配が
もたらされる。
キャリア流体は、試料流体と不混和性である任意の流体であってもよい。例示のキャリ
ア流体は、油である。ある特定の実施形態では、キャリア流体は界面活性剤を含む。
同じ方法を適用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、多重鎖置換増幅等の非PCR
系増幅反応、または当業者に既知の他の方法等の増幅反応用の試薬等の他の試薬を含有す
る個々の液滴を創出することができる。PCRに基づく増幅反応の実施に好適な試薬は当
業者に既知であり、これらに限定されないが、DNAポリメラーゼ、フォワードおよびリ
バースプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、ならびに1つまた
は複数の緩衝液が挙げられる。
ある特定の実施形態では、流体区画は、標的物質(例えば、免疫細胞および/またはビ
ーズ等の固体支持体)を含む第1の流体分配(例えば、液滴)および第2の流体(例えば
、流体流動として、または液滴内)を提供することにより形成される。第1および第2の
流体を合流させて、液滴を形成する。合流は、2つの流体に電場をかけることにより達成
してもよい。ある特定の実施形態では、第2の流体は、ポリメラーゼ連鎖反応または増幅
反応等の増幅反応を実施するための試薬を含有する。
ある特定の態様では、本発明は、固有にバーコード化された重鎖および軽鎖抗体配列な
らびに/またはアルファおよびベータ鎖TCR配列ならびに/またはガンマおよびデルタ
鎖TCR配列のライブラリーを作製するための方法であって、各構築物が固有のN量体お
よび機能性N量体を含む複数の核酸構築物を得ることを含む方法を提供する。機能性N量
体は、ランダムN量体、PCRプライマー、ユニバーサルプライマー、抗体、粘着末端、
または任意の他の配列であってもよい。上記方法は、各々が固有の構築物の1つまたは複
数のコピーを含有するN数の流体区画のM個のセットを作製することを含んでいてもよい
。上記方法は、追加の構築物をセット内の各区画に添加し、これを各セットについて繰り
返して、各々が固有な1対の構築物を含有するN×M個の区画を生成することにより、よ
り高度な複雑さを有するバーコードライブラリーを創出することができる。これらの対を
ハイブリダイズまたはライゲーションして、新しい構築物を生成してもよい。バーコード
ライブラリー内の各構築物では、各固有N量体は、配列決定、プローブハイブリダイゼー
ション、他の方法、または方法の組合せにより識別するのに適していてもよい。
液滴ライブラリー
一般的に、液滴ライブラリーは、単一コレクション内に共にプールされているいくつか
のライブラリー要素で構成される。ライブラリーは、複雑さが、単一のライブラリー要素
から1×1015個またはそれよりも多くのライブラリー要素まで、様々であってもよい
。各ライブラリー要素は、一定濃度の1つまたは複数の所与の成分である。要素は、これ
らに限定されないが、細胞、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリ
ヌクレオチド、または小分子化合物であってもよい。要素は、分子バーコード、ベッセル
バーコード、または両方等の識別子を含有していてもよい。
細胞ライブラリー要素としては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ、B細胞、
T細胞、初代細胞、培養細胞株、がん細胞、幹細胞、または任意の他の細胞タイプを挙げ
ることができる。細胞ライブラリー要素は、1個から数万個までの数の細胞を個々の液滴
に封入することにより調製される。封入細胞の数は、通常、細胞の数密度および液滴の容
積からポアソン統計により求められる。しかしながら、一部の場合では、個数は、Eddら
、Lab Chip、8巻(8号):1262〜1264頁、2008年に記載されているよう
にポアソン統計から逸脱する。細胞は性質が分散性であるため、ライブラリーを、全てが
単一の開始培地に存在する、各々が1つの抗体またはTCRを産生する免疫細胞等の複数
の細胞バリアントを有する集団に調製することが可能であり、その後、その培地を、多く
とも1つの細胞を含有する個々の液滴カプセルに分ける。その後、個々の液滴カプセル内
の細胞を溶解し、溶解細胞に由来する重鎖および軽鎖ポリヌクレオチドならびに/または
アルファおよびベータ鎖ポリヌクレオチドならびに/またはガンマおよびデルタ鎖ポリヌ
クレオチドを、分子バーコードおよびベッセルでバーコード化し、増幅し、その後組み合
わせ、またはプールして、重鎖および軽鎖ならびに/またはアルファおよびベータ鎖なら
びに/またはガンマおよびデルタ鎖ライブラリー要素で構成されるライブラリーを形成す
る。
ビーズに基づくライブラリー要素は、1つまたは複数のビーズを含有し、また、抗体、
酵素、または他のタンパク質等の他の試薬を含んでいてもよい。全てのライブラリー要素
が異なるタイプのビーズを含有するが、周囲媒体が同じである場合、ライブラリー要素は
全て、単一の開始流体から調製されていてもよく、または様々な開始流体を有していても
よい。バリアントのコレクションから集団に調製する細胞のライブラリーの場合、ライブ
ラリー要素は、様々な開始流体から調製されることになる。複数の細胞から開始する場合
、1液滴当たり正確に1つの細胞を有しており、1つよりも多くの細胞を含有する液滴が
極少数であることが望ましい。一部の場合では、1液滴当たり正確に1つの細胞を含有す
る液滴がより多くなり、空の液滴または1つよりも多くの細胞を含有する液滴が少数の例
外になるように、ポアソン統計からの変動を実現して、液滴の積み込み強化を提供するこ
とができる。
一部の実施形態では、複数のベッセルバーコード化ポリヌクレオチドから開始する場合
、1液滴当たり正確に1つのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを有しており、1つ
よりも多くのベッセルバーコード化ポリヌクレオチドを含有する液滴が極少数であること
が望ましい。一部の場合では、1液滴当たり正確に1つのベッセルバーコード化ポリヌク
レオチドを有する液滴がより多くなり、空の液滴または1つよりも多くのベッセルバーコ
ード化ポリヌクレオチドを含む液滴が少数の例外になるように、ポアソン統計からの変動
を実現して、液滴の積み込み強化を提供することができる。
液滴ライブラリーの例は、ビーズ、細胞、小分子、DNA、プライマー、抗体、および
バーコード化ポリヌクレオチド等の様々な異なる内容物を有する液滴のコレクションであ
る。液滴のサイズは、直径が、およそ0.5ミクロンから500ミクロンまでの範囲であ
り、これは、約1ピコリットル〜1ナノリットルに対応する。しかしながら、液滴は、5
ミクロンと小さくてもよく、500ミクロンと大きくてもよい。好ましくは、液滴は、直
径が、100ミクロン未満、約1ミクロン〜約100ミクロンである。最も好ましいサイ
ズは、直径が、約20〜40ミクロン(10〜100ピコリットル)である。液滴ライブ
ラリーの検討される好ましい特性としては、浸透圧バランス、均一なサイズ、およびサイ
ズ範囲が挙げられる。
本発明により提供される液滴ライブラリー内に含まれる液滴は、サイズが、好ましくは
均一である。すなわち、ライブラリー内の任意の液滴の直径は、同じライブラリー内の他
の液滴の直径と比較して、5%、4%、3%、2%、1%、または0.5%未満しか変動
しないだろう。ライブラリーの液滴のサイズが均一であることは、液滴の安定性および完
全性を保つために重要である場合があり、また、後に、本明細書に記載されている種々の
生物学的および化学的アッセイのために、ライブラリー内の液滴を使用するために不可欠
である場合がある。
本発明は、不混和性流体内に複数の水性液滴を含み、各液滴が、好ましくはサイズが実
質的に均一であり、異なるライブラリー要素を含む液滴ライブラリーを提供する。本発明
は、液滴ライブラリーを形成するための方法であって、異なるライブラリー要素を含む単
一の水性流体を準備すること、各ライブラリー要素を不混和性流体内の水性液滴内に封入
することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、異なるタイプの要素(例えば、細胞またはビーズ)を、同じ
培地に含有される単一供給源にプールする。初期プールを行った後、要素を液滴に封入し
て、液滴のライブラリーを生成し、異なるタイプのビーズまたは細胞を有する各液滴は、
異なるライブラリー要素である。初期溶液を希釈することにより、封入プロセスが可能に
なる。一部の実施形態では、形成される液滴は、単一の要素を含有することになるか、ま
たは何も含有しないことになる、つまり空になるかのいずれかである。他の実施形態では
、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数コピーを含有することになる。封入されて
いる要素は、一般的に、あるタイプのバリアントである。一例では、要素は、血液試料の
免疫細胞であり、各免疫細胞は、免疫細胞内の抗体のヌクレオチド配列を増幅およびバー
コード化するために封入される。
例えば、1つのタイプのエマルジョンライブラリーには、異なる粒子、つまり異なる培
地内の細胞またはバーコード化ポリヌクレオチドを有し、プールする前に封入されている
ライブラリー要素が存在する。一例では、指定数のライブラリー要素、つまりn数の異な
る細胞またはバーコード化ポリヌクレオチドが、異なる培地内に含有されている。ライブ
ラリー要素の各々は、別々に乳化およびプールされ、その地点で、n数のプールされた異
なるライブラリー要素の各々が組み合わされ、単一プールにプールされる。その結果とし
て得られるプールは、各々が異なるタイプの粒子を含有する複数の油中水型エマルジョン
液滴を含有する。
一部の実施形態では、形成される液滴は、単一のライブラリー要素を含有することにな
るか、または何も含有しないことになる、つまり空になるかのいずれかである。他の実施
形態では、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数コピーを含有することになる。ビ
ーズの内容物は、ポアソン分布に従い、事象が既知の平均率で生じ、その直前の事象と時
間的に独立している場合、ある一定期間にいくつかの事象が生じる確率を表す離散確率分
布が存在する。ライブラリーを創出するために使用される油および界面活性剤は、ライブ
ラリーの内容物が液滴間で交換されることを防止する。
プライマー
一般的に、1対または複数対のプライマーを増幅反応に使用することができる。プライ
マー対の1つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライマー対の1
つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。
一部の場合では、第1の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第1の対
の1つのプライマーは、第1の標的ポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプ
ライマーであってもよく、第1の対の1つのプライマーは、リバースプライマーであって
もよく、第1の標的ポリヌクレオチド分子の第2の配列と相補的であってもよく、第1の
標的遺伝子座は、第1の配列と第2の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態
では、第1の標的遺伝子座は、VまたはVαまたはVγ配列を含む。一部の実施形態で
は、第1の標的遺伝子座は、AID配列および/またはAMB配列を含む。
一部の場合では、第2の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第2の対
の1つのプライマーは、第2の標的ポリヌクレオチド分子の第1の配列に相補的なフォワ
ードプライマーであってもよく、第2の対の1つのプライマーは、第2の標的ポリヌクレ
オチド分子の第2の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第2の標的遺伝
子座は、第1の配列と第2の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第
2の標的遺伝子座は、VまたはVβまたはVδ配列を含む。
一部の場合では、第3の対のプライマーを増幅反応に使用することができる。第3の対
の1つのプライマーは、第3の標的ポリヌクレオチド分子の第1の配列に相補的なフォワ
ードプライマーであってもよく、第3の対の1つのプライマーは、第3の標的ポリヌクレ
オチド分子の第2の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第3の標的遺伝
子座は、第1の配列と第2の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第
3の標的遺伝子座は、分子バーコードまたはベッセルバーコード等のバーコードを含む。
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さは、標的ポリヌクレオチドおよ
び標的遺伝子座の配列に依存していてもよい。例えば、フォワードプライマーおよびリバ
ースプライマーの長さおよび/またはTは、最適化することができる。一部の場合では
、プライマーは、長さが、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、3
2、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45
、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、もしくは60個の、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、3
2、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45
、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、もしくは60個よりも多くの、または約10、11、12、13、14、15、1
6、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29
、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、5
6、57、58、59、もしくは60個未満のヌクレオチドであってもよい。一部の場合
では、プライマーは、長さが、約15〜約20、約15〜約25、約15〜約30、約1
5〜約40、約15〜約45、約15〜約50、約15〜約55、約15〜約60、約2
0〜約25、約20〜約30、約20〜約35、約20〜約40、約20〜約45、約2
0〜約50、約20〜約55、約20〜約60個のヌクレオチドである。
プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドと結合する前は、一本鎖DNAであってもよい。
一部の場合では、プライマーは、初期には二本鎖配列を含む。プライマーの適切な長さは
、プライマーの使用目的に依存していてもよいが、約6から約50個までのヌクレオチド
、または約15から約35個までのヌクレオチドの範囲であってもよい。短いプライマー
分子の場合、一般的には、鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するために
は、より低い温度が必要とされる場合ある。一部の実施形態では、プライマーは、鋳型核
酸の正確な配列を反映する必要はなく、鋳型とのハイブリダイズに十分な程度に相補的で
あればよい。一部の場合では、プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドと結合する前は、部
分的に二本鎖であってもよい。二本鎖配列を有するプライマーは、約3、4、5、6、7
、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは2
0個の、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、もしくは20個よりも多くの、または約3、4、5、6、7、8、9
、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20個未満
の塩基のヘアピンループを有していてもよい。プライマーの二本鎖部分は、約3、4、5
、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33
、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49、もしくは50個の、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、1
2、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25
、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個
よりも多くの、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、2
9、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42
、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個未満の、または少なくと
も約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、3
1、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44
、45、46、47、48、49、もしくは50個の塩基対であってもよい。所与の標的
配列を増幅するための好適なプライマーの設計は、当技術分野で周知である。
プライマーには、プライマーの検出または固定化を可能にするが、プライマーの基本的
な特性(例えば、DNA合成開始地点として作用すること)を変更しない追加の特徴を組
み込むことができる。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、クロ
ーニングまたはさらなる増幅または増幅産物の配列決定を容易にする追加の核酸配列を5
’末端に含有していてもよい。例えば、追加の配列は、ユニバーサルプライマー結合部位
等のプライマー結合部位を含んでいてもよい。鋳型とハイブリダイズするのに十分な相補
性を有するプライマーの領域は、本明細書では、ハイブリダイズ領域と呼ばれる場合があ
る。
別の場合では、本明細書に記載されている方法および組成物に利用されるプライマーは
、1つまたは複数のユニバーサルヌクレオシドを含んでいてもよい。ユニバーサルヌクレ
オシドの非限定的な例は、米国特許出願公開第2009/0325169号および第20
10/0167353号に記載されている5−ニトロインドールおよびイノシンである。
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパ
ラメータに従って設計することができる。異なるプライマー対は、ほぼ同じ温度で、例え
ば、別のプライマー対の1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、また
は10℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の場合では、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100
、200、500、1000、5000、10,000個、またはそれよりも多くのプラ
イマーが、初期に使用される。そのようなプライマーは、本明細書に記載の標的ポリヌク
レオチドとハイブリダイズすることができる。
プライマーは、これらに限定されないが、適切な配列のクローニング、および当技術分
野で周知の方法を使用した直接的化学合成を含む様々な方法により調製することができる
(Narangら、Methods Enzymol.、68巻:90頁(1979年);Brownら、Methods E
nzymol.、68巻:109頁(1979年))。また、プライマーは、商業的供給源から
得ることができる。プライマーは、同一の融解温度を有していてもよい。プライマーは、
非同一の融解温度を有していてもよい。プライマーの長さを、5’末端または3’末端で
伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プラ
イマー対のプライマーの一方は、他方のプライマーよりも長くてもよい。プライマー対内
の、プライマーの3’アニーリング長は、異なっていてもよい。また、各プライマー対の
アニーリング位置は、プライマー対の配列および長さが、所望の融解温度をもたらすよう
に設計することができる。25塩基対よりも短いプライマーの融解温度を決定するための
式は、ウォーレスのルール(T=2(A+T)+4(G+C))である。また、コンピ
ュータプログラムを使用して、プライマーを設計してもよい。各プライマーのT(融解
温度またはアニーリング温度)は、ソフトウェアプログラムを使用して算出することがで
きる。プライマーのアニーリング温度は、これらに限定されないが、1、2、3、4、5
サイクル目、6〜10サイクル目、10〜15サイクル目、15〜20サイクル目、20
〜25サイクル目、25〜30サイクル目、30〜35サイクル目、または35〜40サ
イクル目を含む、任意の増幅サイクル後に再計算し、増加させてもよい。最初の増幅サイ
クル後、プライマーの5’側半分を、各目的遺伝子座に由来する産物に組み込んでもよく
、したがって、Tは、各プライマーの5’側半分および3’側半分の両配列に基づいて
再計算してもよい。
プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズする鋳型の領域を含む。一部の実施形
態では、プライマーは、鋳型指向核酸合成の開始点として作用することが可能である。例
えば、プライマーは、4つの異なるヌクレオチド、およびDNAもしくはRNAポリメラ
ーゼまたは逆転写酵素等の重合剤または酵素が存在する場合、鋳型指向核酸合成を開始さ
せることができる。プライマー対は2つのプライマー:鋳型配列の5’末端とハイブリダ
イズする5’上流領域を有する第1のプライマー、および鋳型配列の3’末端の相補体と
ハイブリダイズする3’下流領域を有する第2のプライマーを含む。プライマーセットは
、2つまたはそれよりも多くのプライマー:鋳型配列または複数の鋳型配列の5’末端と
ハイブリダイズする5’上流領域を有する第1のプライマーまたは第1の複数のプライマ
ー、および鋳型配列または複数の鋳型配列の3’末端の相補体とハイブリダイズする3’
下流領域を有する第2のプライマーまたは第2の複数のプライマーを含む。一部の実施形
態では、プライマーは、標的特異的配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、試
料バーコード配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ユニバーサルプライミン
グ配列を含む。一部の実施形態では、プライマーは、PCRプライミング配列を含む。一
部の実施形態では、プライマーは、ポリヌクレオチドの増幅を開始させるために使用され
るPCRプライミング配列を含む。(Dieffenbach, PCR Primer: A Laboratory Man
ual、第2版(Cold Spring Harbor Press、New York(2003年))。ユニバーサ
ルプライマー結合部位または配列は、ポリヌクレオチドおよび/またはアンプリコンへの
ユニバーサルプライマーの付着を可能にする。ユニバーサルプライマーは当技術分野で周
知であり、これらに限定されないが、−47F(M13F)、アルファMF、AOX3’
、AOX5’、BGHr、CMV−30、CMV−50、CVMf、LACrmt、ラム
ダgt10F、ラムダgt10R、ラムダgt11F、ラムダgt11R、M13リバー
ス、M13フォワード(−20)、M13リバース、メール(male)、p10SEQPp
QE、pA−120、pet4、pGAPフォワード、pGLRVpr3、pGLpr2
R、pKLAC14、pQEFS、pQERS、pucU1、pucU2、リバースA、
seqIREStam、seqIRESzpet、seqori、seqPCR、seq
pIRES−、seqpIRES+、seqpSecTag、seqpSecTag+、
seqretro+PSI、SP6、T3−prom、T7−prom、およびT7−t
ermInvが挙げられる。本明細書で使用される場合、付着は、共有結合による相互作
用および非共有結合による相互作用の両方またはいずれかを指すことができる。ユニバー
サルプライマー結合部位へのユニバーサルプライマーの付着を、ポリヌクレオチドおよび
/またはアンプリコンの増幅、検出、および/または配列決定に使用してもよい。ユニバ
ーサルプライマー結合部位は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、
60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、
800、900、または1000個のヌクレオチドまたは塩基対を含んでいてもよい。別
の例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約1500、2000、25
00、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、65
00、7000、7500、8000、8500、9000、9500、または1000
0個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマー
結合部位は、1〜10、10〜20、10〜30、または10〜100個のヌクレオチド
または塩基対を含む。一部の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、約1〜
90、1〜80、1〜70、1〜60、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜
10、2〜90、2〜80、2〜70、2〜60、2〜50、2〜40、2〜30、2〜
20、2〜10、1〜900、1〜800、1〜700、1〜600、1〜500、1〜
400、1〜300、1〜200、1〜100、2〜900、2〜800、2〜700、
2〜600、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、5〜90
、5〜80、5〜70、5〜60、5〜50、5〜40、5〜30、5〜20、5〜10
、10〜90、10〜80、10〜70、10〜60、10〜50、10〜40、10〜
30、10〜20、10〜10、5〜900、5〜800、5〜700、5〜600、5
〜500、5〜400、5〜300、5〜200、5〜100、10〜900、10〜8
00、10〜700、10〜600、10〜500、10〜400、10〜300、10
〜200、10〜100、25〜900、25〜800、25〜700、25〜600、
25〜500、25〜400、25〜300、25〜200、25〜100、100〜1
000、100〜900、100〜800、100〜700、100〜600、100〜
500、100〜400、100〜300、100〜200、200〜1000、200
〜900、200〜800、200〜700、200〜600、200〜500、200
〜400、200〜300、300〜1000、300〜900、300〜800、30
0〜700、300〜600、300〜500、300〜400、400〜1000、4
00〜900、400〜800、400〜700、400〜600、400〜500、5
00〜1000、500〜900、500〜800、500〜700、500〜600、
600〜1000、600〜900、600〜800、600〜700、700〜100
0、700〜900、700〜800、800〜1000、800〜900、または90
0〜1000個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。
プライマーは、プライマー伸長産物の合成におけるその使用と適合する長さを有してい
てもよい。プライマーは、長さが8〜200個のヌクレオチドであるポリヌクレオチドで
あってもよい。プライマーの長さは、鋳型ポリヌクレオチドおよび鋳型遺伝子座の配列に
依存していてもよい。例えば、プライマーまたはプライマーセットの長さおよび/または
融解温度(T)は最適化することができる。一部の場合では、プライマーは、長さが、
約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、3
6、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49
、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、もしくは60個の、
約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、3
6、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49
、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、もしくは60個より
も多くの、または約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33
、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、も
しくは60個未満のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、プライマーは、
長さが約8〜100個のヌクレオチド、例えば、長さが10〜75、15〜60、15〜
40、18〜30、20〜40、21〜50、22〜45、25〜40、7〜9、12〜
15、15〜20、15〜25、15〜30、15〜45、15〜50、15〜55、1
5〜60、20〜25、20〜30、20〜35、20〜45、20〜50、20〜55
、または20〜60個の、およびそれら間の任意の長さのヌクレオチドである。一部の実
施形態では、プライマーは、長さが、多くとも約10、12、15、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、6
0、65、70、75、80、85、90、95、または100個のヌクレオチドである
一般的に、1対または複数対のプライマーを指数関数的増幅反応に使用することができ
る。プライマー対の1つのプライマーは、フォワードプライマーであってもよく、プライ
マー対の1つのプライマーは、リバースプライマーであってもよい。一部の実施形態では
、第1の対のプライマーを指数関数的増幅反応に使用することができる。第1の対の1つ
のプライマーは、第1の鋳型ポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプライマ
ーであってもよく、第1の対の1つのプライマーは、第1の鋳型ポリヌクレオチド分子の
第2の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、第1の鋳型遺伝子座は、第1
の配列と第2の配列との間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第2の対のプラ
イマーを増幅反応に使用することができる。第2の対の1つのプライマーは、第2の標的
ポリヌクレオチド分子の第1の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、第
2の対の1つのプライマーは、第2の標的ポリヌクレオチド分子の第2の配列と相補的な
リバースプライマーであってもよく、第2の標的遺伝子座は、第1の配列と第2の配列と
の間に存在していてもよい。一部の実施形態では、第2の標的遺伝子座は、可変軽鎖抗体
配列を含む。一部の実施形態では、第3の対のプライマーを増幅反応に使用することがで
きる。第3の対の1つのプライマーは、第3の鋳型ポリヌクレオチド分子の第1の配列に
相補的なフォワードプライマーであってもよく、第3の対の1つのプライマーは、第3の
鋳型ポリヌクレオチド分子の第2の配列と相補的なリバースプライマーであってもよく、
第3の鋳型遺伝子座は、第1の配列と第2の配列との間に存在していてもよい。
1つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも部分にアニ
ーリングすることができる。1つまたは複数のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチ
ドの3’末端および/または5’末端にアニーリングすることができる。1つまたは複数
のプライマーは、複数の鋳型ポリヌクレオチドの内部領域にアニーリングすることができ
る。内部領域は、複数の鋳型ポリヌクレオチドの3’末端または5’末端から、少なくと
も約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22
、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、4
9、50、100、150、200、220、230、240、250、260、270
、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370
、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470
、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570
、580、590、600、650、700、750、800、850、900、または
1000個のヌクレオチドであってもよい。1つまたは複数のプライマーは、一定のパネ
ルのプライマーを含んでいてもよい。1つまたは複数のプライマーは、少なくとも1つま
たは複数の特注プライマーを含んでいてもよい。1つまたは複数のプライマーは、少なく
とも1つまたは複数の対照プライマーを含んでいてもよい。1つまたは複数のプライマー
は、少なくとも1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含んでいてもよい
。1つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバ
ーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニーリングすることができる
。一部の実施形態では、1つまたは複数の特注プライマーは、SBC、標的特異的領域、
それらの相補体、またはそれらの任意の組合せにアニーリングする。1つまたは複数のプ
ライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。1つまたは複数のプライマー
は、プライマー伸長、逆転写、線形伸長、非指数関数的増幅、指数関数的増幅、PCR、
または1つもしくは複数の標的もしくは鋳型ポリヌクレオチドの任意の他の増幅法を増幅
または実施するように設計することができる。
標的特異的領域は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、2
5、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38
、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100
、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290
、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390
、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490
、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590
、600、650、700、750、800、850、900、または1000個のヌク
レオチドまたは塩基対を含んでいてもよい。別の例では、標的特異的領域は、少なくとも
約1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000
、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000
、9500、または10000個のヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の実施形態で
は、標的特異的領域は、約5〜10、10〜15、10〜20、10〜30、15〜30
、10〜75、15〜60、15〜40、18〜30、20〜40、21〜50、22〜
45、25〜40、7〜9、12〜15、15〜20、15〜25、15〜30、15〜
45、15〜50、15〜55、15〜60、20〜25、20〜30、20〜35、2
0〜45、20〜50、20〜55、20〜60、2〜900、2〜800、2〜700
、2〜600、2〜500、2〜400、2〜300、2〜200、2〜100、25〜
900、25〜800、25〜700、25〜600、25〜500、25〜400、2
5〜300、25〜200、25〜100、100〜1000、100〜900、100
〜800、100〜700、100〜600、100〜500、100〜400、100
〜300、100〜200、200〜1000、200〜900、200〜800、20
0〜700、200〜600、200〜500、200〜400、200〜300、30
0〜1000、300〜900、300〜800、300〜700、300〜600、3
00〜500、300〜400、400〜1000、400〜900、400〜800、
400〜700、400〜600、400〜500、500〜1000、500〜900
、500〜800、500〜700、500〜600、600〜1000、600〜90
0、600〜800、600〜700、700〜1000、700〜900、700〜8
00、800〜1000、800〜900、または900〜1000個のヌクレオチドま
たは塩基対を含む。
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための既知のパ
ラメータに従って設計することができる。一部の実施形態では、異なるプライマー対は、
ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマー対の1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7
℃、8℃、9℃、または10℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の実施形
態では、複数のプライマーの1つまたは複数のプライマーは、ほぼ同じ温度で、例えば、
複数のプライマー中の別のプライマー対の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または
10℃以内でアニーリングおよび融解してもよい。一部の実施形態では、複数中の1つま
たは複数のプライマーは、複数のプライマー中の別のプライマーとは異なる温度でアニー
リングおよび融解してもよい。
本明細書に記載されている方法の1つまたは複数のステッブのための複数のプライマー
は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、1
6、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、2
00、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500
、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000
、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,0
00、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30
,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、
90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、5
00,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1
,000,000、50,000,000、100,000,000個の、多くとも約1
、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、3
00、400、500、600、700、800、900、1000、1500、200
0、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,
000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、1
6,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000
、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,0
00、100,000、200,000、300,000、400,000、500,0
00、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000
,000、50,000,000、100,000,000個の、または少なくとも約1
、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、3
00、400、500、600、700、800、900、1000、1500、200
0、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,
000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、1
6,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000
、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,0
00、100,000、200,000、300,000、400,000、500,0
00、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000
,000、50,000,000、100,000,000個の異なるプライマーを含む
複数のプライマーを含んでいてもよい。例えば、複数のプライマーの各プライマーは、異
なる標的または鋳型特異的領域または配列を含んでいてもよい。
逆転写
一部の場合では、標的ポリヌクレオチドは、逆転写によりRNAから調製される。一部
の場合では、標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ等を使用して、プライマー伸長によ
りDNAから調製される。
本明細書に記載されている方法は、逆転写−PCR併用法(coupled reverse transc
ription-PCR)(逆転写−PCR)で使用することができる。例えば、逆転写およびPC
Rは、2つの個別ステップで実施してもよい。最初に、ポリヌクレオチドdTプライマー
、配列特異的プライマー、ユニバーサルプライマー、または本明細書に記載の任意のプラ
イマーのいずれかを使用して、試料mRNAのcDNAコピーを合成してもよい。
逆転写およびPCRは、単一の閉鎖ベッセル反応で実施してもよい。例えば、1つは逆
転写用、2つはPCR用の3つのプライマーを用いてもよい。逆転写用のプライマーは、
PCRアンプリコンの位置に対して3’側でmRNAと結合してもよい。必須ではないが
、逆転写プライマーは、RNA残基、またはmRNAにハイブリダイズしてもRNase
Hの基質を形成することがない2’−OメチルRNA塩基等の修飾類似体を含んでいても
よい。
逆転写反応を実施する温度は、使用されている逆転写酵素に依存する。一部の場合では
、熱安定性逆転写酵素が使用され、逆転写反応は、約37℃〜約75℃で、約37℃〜約
50℃で、約37℃〜約55℃で、約37℃〜約60℃で、約55℃〜約75℃で、約5
5℃〜約60℃で、または約37℃〜約60℃で実施される。一部の場合では、3つまた
はそれよりも多くの非鋳型末端ヌクレオチドを転写産物の末端に移動させる逆転写酵素が
使用される。
本明細書に記載の逆転写反応およびPCR反応は、チューブ、マイクロタイタープレー
ト、マイクロ流体デバイス、または好ましくは液滴内等の、当技術分野で公知の種々の形
式で実施することができる。
逆転写反応は、5μLから100μLまでの範囲の容積で、または10μL〜20μL
の反応容積で実施することができる。液滴の場合、反応容積は、1pLから100nLま
で、または10pL〜1nLの範囲であってもよい。一部の場合では、逆転写反応は、約
1nLまたはそれ未満の容積を有する液滴中で実施される。一部の場合では、PCR反応
は、1pLから100nLまで、好ましくは10pL〜1nLの反応容積範囲を有する液
滴中である。一部の場合では、PCR反応は、約1nLまたはそれ未満の容積を有する液
滴中で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびPCR反応は、1pLから100
nLまでの、または10pL〜1nLの反応容積範囲を有する同じ液滴内で実施される。
一部の場合では、逆転写反応およびPCR反応は、約1nLもしくはそれ未満の容積、ま
たは約1pLもしくはそれ未満の容積を有する液滴内で実施される。一部の場合では、逆
転写反応およびPCR反応は、異なる液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応
およびPCR反応は、各々が、1pLから100nLまでの、または10pL〜1nLの
反応容積範囲を有する複数の液滴内で実施される。一部の場合では、逆転写反応およびP
CR反応は、各々が約1nLまたはそれ未満の容積を有する複数の液滴内で実施される。
一部の場合では、第1のPCR反応は、1pLから100nLまでの、好ましくは10
pL〜1nLの範囲の反応容積を有する第1に液滴内であり、第2のPCR反応は、1p
Lから100nLまでの、好ましくは10pL〜1nLの範囲の反応容積を有する第2の
液滴内である。一部の場合では、第1のPCR反応は、約1nLまたはそれ未満の容積を
有する第1の液滴内であり、第2のPCR反応は、約1nLまたはそれ未満の容積を有す
る第2の液滴内である。
一部の場合では、第1のPCR反応および第2のPCR反応は、各々が、1pLから1
00nLまでの、または10pLから1nLの反応容積範囲を有する複数の液滴内で実施
される。一部の場合では、第1のPCR反応および第2のPCR反応は、各々が約1nL
またはそれ未満の容積を有する複数の液滴内で実施される。
RNA等の標的ポリヌクレオチドを、1つまたは複数の逆転写プライマーを使用してc
DNAへと逆転写してもよい。1つまたは複数の逆転写プライマーは、定常領域等の、R
NAの領域に相補的な領域(例えば、mRNAの重鎖もしくは軽鎖定常領域またはポリA
テール)を含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、第1のRNA
の定常領域に相補的な領域を有する第1の逆転写プライマー、および第2のRNAの定常
領域に相補的な領域を有する第2の逆転写プライマーを含んでいてもよい。一部の実施形
態では、逆転写プライマーは、それぞれ、第1のRNAの定常領域に相補的な領域を有す
る第1の逆転写プライマー、および1つまたは複数のRNAの定常領域に相補的な領域を
有する1つまたは複数の逆転写プライマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、逆転写プライマーは、バーコードを含まない。
逆転写プライマーは、RNAの領域に相補的でない領域をさらに含んでいてもよい。一
部の実施形態では、RNAの領域に相補的でない領域は、RNAに相補的なプライマーの
領域に対して5’側である。一部の実施形態では、RNAの領域に相補的でない領域は、
RNAに相補的なプライマーの領域に対して3’側である。一部の実施形態では、RNA
の領域に相補的でない領域は、5’突出領域である。一部の実施形態では、RNAの領域
に相補的でない領域は、増幅および/または配列決定反応用のプライミング部位を含む。
本明細書に記載の1つまたは複数のプライマーを使用し、当技術分野で公知の好適な試薬
を使用して、RNA分子を逆転写する。
RNA分子の逆転写反応を実施した後、得られたcDNA分子を、分子バーコードおよ
びベッセルバーコードでバーコード化し、第1および/または第2のPCR反応等の、1
つまたは複数のPCR反応により増幅してもよい。第1および/または第2のPCR反応
には、1対のプライマーまたは複数のプライマー対を利用してもよい。第1および/また
は第2のPCR反応には、複数のフォワード/リバースプライマーおよびリバースプライ
マーを利用してもよい。第1および/または第2のPCR反応には、複数のフォワード/
リバースプライマーおよびフォワードプライマーを利用してもよい。複数のフォワード/
リバースプライマーの第1および/または第2のプライマーは、cDNA分子またはバー
コード化cDNA分子に相補的な領域を含有するフォワード/リバースプライマーであっ
てもよい。複数のフォワード/リバースプライマーの第1および/または第2のプライマ
ーは、バーコード化cDNA分子に相補的な領域を含有するフォワード/リバースプライ
マーであってもよい。
一部の実施形態では、複数のフォワード/リバースプライマーは、1つまたは複数のフ
ォワード/リバースプライマーを含み、複数のフォワード/リバースプライマーのフォワ
ード/リバースプライマーの各々は、cDNAまたはバーコード化cDNAのVセグメン
トの1つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワ
ード/リバースプライマーは、cDNAまたはバーコード化cDNAのVセグメントの上
流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード/リバースプライマー、およびcDN
Aまたはバーコード化cDNAのVセグメントの1つまたは複数の他の上流または下流領
域に相補的な領域を含む1つまたは複数の他のフォワード/リバースプライマーを含む。
例えば、複数のフォワード/リバースプライマーは、cDNAまたはバーコード化cDN
AのVセグメントの第1および/または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む
第1および/または第2のフォワード/リバースプライマー、およびcDNAまたはバー
コード化cDNAのVセグメントの第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第2
のフォワード/リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード/リバースプライ
マーは、cDNAまたはバーコード化cDNAのVセグメントの第1および/または第2
の上流または下流領域に相補的な領域を含む第1および/または第2のフォワード/リバ
ースプライマー、cDNAまたはバーコード化cDNAのVセグメントの第2の上流また
は下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード/リバースプライマー、およびcDN
Aまたはバーコード化cDNAのVセグメントの第3の上流または下流領域に相補的な領
域を含む第3のフォワード/リバースプライマー等を含む。複数のフォワード/リバース
プライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫B細胞またはT細胞等の細胞により
発現されるあらゆるVセグメントのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリング
することができる。
一部の実施形態では、複数のフォワード/リバースプライマーは、1つまたは複数のフ
ォワード/リバースプライマーを含み、複数のフォワード/リバースプライマー中のフォ
ワード/リバースプライマーの各々は、cDNAまたはバーコード化cDNAのCセグメ
ントの1つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォ
ワード/リバースプライマーは、cDNAまたはバーコード化cDNAのCセグメントの
上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード/リバースプライマー、およびcD
NAまたはバーコード化cDNAのCセグメントの1つまたは複数の他の上流または下流
領域に相補的な領域を含む1つまたは複数の他のフォワード/リバースプライマーを含む
。例えば、複数のフォワード/リバースプライマーは、cDNAまたはバーコード化cD
NAのCセグメントの第1および/または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含
む第1および/または第2のフォワード/リバースプライマー、およびcDNAまたはバ
ーコード化cDNAのCセグメントの第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第
2のフォワード/リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード/リバースプラ
イマーは、cDNAまたはバーコード化cDNAのCセグメントの第1および/または第
2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第1および/または第2のフォワード/リ
バースプライマー、cDNAまたはバーコード化cDNAのCセグメントの第2の上流ま
たは下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード/リバースプライマー、およびcD
NAまたはバーコード化cDNAのCセグメントの第3の上流または下流領域に相補的な
領域を含む第3のフォワード/リバースプライマー等を含む。複数のフォワード/リバー
スプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫B細胞またはT細胞等の細胞によ
り発現されるあらゆるCセグメントのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリン
グすることができる。
一部の実施形態では、複数のフォワード/リバースプライマーは、1つまたは複数のフ
ォワード/リバースプライマーを含み、複数のフォワード/リバースプライマー中のフォ
ワード/リバースプライマーの各々は、バーコード化cDNAの分子バーコードの1つま
たは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード/リバ
ースプライマーは、バーコード化cDNAの分子バーコードの上流または下流領域に相補
的な領域を含むフォワード/リバースプライマー、およびバーコード化cDNAの分子バ
ーコードの1つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む1つまたは複
数の他のフォワード/リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワード/リバース
プライマーは、バーコード化cDNAの分子バーコードの第1および/または第2の上流
または下流領域に相補的な領域を含む第1および/または第2のフォワード/リバースプ
ライマー、およびバーコード化cDNAの分子バーコードの第2の上流または下流領域に
相補的な領域を含む第2のフォワード/リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォ
ワード/リバースプライマーは、バーコード化cDNAの分子バーコードの第1および/
または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第1および/または第2のフォワ
ード/リバースプライマー、バーコード化cDNAの分子バーコードの第2の上流または
下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード/リバースプライマー、およびバーコー
ド化cDNAの分子バーコードの第3の上流または下流領域に相補的な領域を含む第3の
フォワード/リバースプライマー等を含む。複数のフォワード/リバースプライマーを使
用して、試料中の免疫B細胞またはT細胞等の細胞により発現されるあらゆる分子バーコ
ードのあらゆる考え得る上流または下流領域にアニーリングすることができる。
一部の実施形態では、複数のフォワード/リバースプライマーは、1つまたは複数のフ
ォワード/リバースプライマーを含み、複数のフォワード/リバースプライマー中のフォ
ワード/リバースプライマーの各々は、バーコード化cDNAのベッセルバーコードの1
つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード/
リバースプライマーは、バーコード化cDNAのベッセルバーコードの上流または下流領
域に相補的な領域を含むフォワード/リバースプライマー、およびバーコード化cDNA
のベッセルバーコードの1つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む
1つまたは複数の他のフォワード/リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワー
ド/リバースプライマーは、バーコード化cDNAのベッセルバーコードの第1および/
または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第1および/または第2のフォワ
ード/リバースプライマー、およびバーコード化cDNAのベッセルバーコードの第2の
上流または下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード/リバースプライマーを含む
。例えば、複数のフォワード/リバースプライマーは、バーコード化cDNAのベッセル
バーコードの第1および/または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第1お
よび/または第2のフォワード/リバースプライマー、バーコード化cDNAのベッセル
バーコードの第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード/リバー
スプライマー、およびバーコード化cDNAのベッセルバーコードの第3の上流または下
流領域に相補的な領域を含む第3のフォワード/リバースプライマー等を含む。複数のフ
ォワード/リバースプライマー中のプライマーを使用して、試料中の免疫B細胞またはT
細胞等の細胞により発現されるあらゆるベッセルバーコードのあらゆる考え得る上流また
は下流領域にアニーリングすることができる。
複数のフォワード/リバースプライマー中のフォワード/リバースプライマーは、RN
Aの領域に相補的でない領域をさらに含む。一部の実施形態では、RNAの領域に相補的
でない領域は、RNAに相補的なフォワード/リバースプライマーの領域に対して5’側
である(つまり、Vセグメントの上流または下流領域)。一部の実施形態では、RNAの
領域に相補的でない領域は、RNAに相補的なフォワード/リバースプライマーの領域に
対して3’側である。一部の実施形態では、RNAの領域に相補的でない領域は、5’突
出領域である。一部の実施形態では、RNAの領域に相補的でない領域は、増幅および/
または第2の配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、RNAの
領域に相補的でない領域は、増幅および/または第3の配列決定反応用のプライミング部
位を含む。一部の実施形態では、RNAの領域に相補的でない領域は、第2および第3の
配列決定反応用のプライミング部位を含む。一部の実施形態では、第2および第3の配列
決定反応用のプライミング部位の配列は、同じである。本明細書に記載の1つまたは複数
のフォワード/リバースプライマーおよびリバースプライマーを使用し、当技術分野で公
知の好適な試薬を使用して、cDNA分子を増幅する。一部の実施形態では、領域は、m
RNAの定常領域またはポリAテール等のRNAの領域に相補的である。
一部の実施形態では、複数のフォワード/リバースプライマーは、1つまたは複数のフ
ォワード/リバースプライマーを含み、複数のフォワード/リバースプライマー中のフォ
ワード/リバースプライマーの各々は、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバ
ーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコードの1つまたは複数の上流または下流
領域に相補的な領域を含む。一部の実施形態では、複数のフォワード/リバースプライマ
ーは、1つまたは複数のフォワード/リバースプライマーを含み、複数のフォワード/リ
バースプライマー中のフォワード/リバースプライマーの各々は、親和性−オリゴヌクレ
オチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのAIDの1つまたは複数の上
流または下流領域に相補的な領域を含む。一部の実施形態では、複数のフォワード/リバ
ースプライマーは、1つまたは複数のフォワード/リバースプライマーを含み、複数のフ
ォワード/リバースプライマー中のフォワード/リバースプライマーの各々は、親和性−
オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのAMBの1つま
たは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード/リバ
ースプライマーは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌ
クレオチドのベッセルバーコード、AID、および/またはAMBの上流または下流領域
に相補的な領域を含むフォワード/リバースプライマー、および親和性−オリゴヌクレオ
チドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、AID、
および/またはAMBの1つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む
1つまたは複数の他のフォワード/リバースプライマーを含む。例えば、複数のフォワー
ド/リバースプライマーは、親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード化
オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、AID、および/またはAMBの第1および
/または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第1および/または第2のフォ
ワード/リバースプライマー、および親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバー
コード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、AID、および/またはAMBの第
2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード/リバースプライマーを
含む。例えば、複数のフォワード/リバースプライマーは、親和性−オリゴヌクレオチド
コンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、AID、およ
び/またはAMBの第1および/または第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む
第1および/または第2のフォワード/リバースプライマー、親和性−オリゴヌクレオチ
ドコンジュゲートのバーコード化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、AID、お
よび/またはAMBの第2の上流または下流領域に相補的な領域を含む第2のフォワード
/リバースプライマー、および親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのバーコード
化オリゴヌクレオチドのベッセルバーコード、AID、および/またはAMBの第3の上
流または下流領域に相補的な領域を含む第3のフォワード/リバースプライマー等を含む
増幅
ベッセルバーコードを標的ポリヌクレオチドに付加した後、標的ポリヌクレオチドを増
幅してもよい。例えば、ベッセルバーコードを親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲー
トのオリゴヌクレオチドに付加した後、オリゴヌクレオチドを増幅してもよい。例えば、
ベッセルバーコードを細胞ポリヌクレオチドに付加した後、ベッセルバーコード化細胞ポ
リヌクレオチドを増幅してもよい。
増幅反応は、1つまたは複数の添加剤を含んでいてもよい。一部の場合では、1つまた
は複数の添加剤は、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、ベタイン(一)
水和物(N,N,N−トリメチルグリシン=カルボキシ−メチル]トリメチルアンモニウ
ム、トレハロース、7−デアザ−2’−デオキシグアノシン三リン酸(dC7GTPまた
は7−デアザ−2’−dGTP)、BSA(ウシ血清アルブミン)、ホルムアミド(メタ
ンアミド)、テトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)、他のテトラアルキルアン
モニウム誘導体(例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド(TEA−Cl)およびテ
トラプロピルアンモニウムクロリド(TPrA−Cl))、非イオン性洗剤(例えば、T
riton X−100、Tween 20、Nonidet P−40(NP−40)
)、またはPREXCEL−Qである。一部の場合では、増幅反応は、0、1、2、3、
4、5、6、7、8、9、または10種の異なる添加剤を含む。他の場合では、増幅反応
は、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種の異なる添加剤
を含む。
反応容積(例えば、液滴)に含有されている試料に対して、熱サイクル反応を実施する
ことができる。液滴は、多分散であってもよく、または好ましくは単分散であってもよく
、当業者であれば、撹拌、超音波処理、またはマイクロ流体的にT型チャネル接合部を通
過させること、または他の手段により生成することができる。密度は、20,000液滴
/40ul(1nL液滴)、200,000液滴/40ul(100pL液滴)を超えて
いてもよい。液滴は、熱サイクル中、完全性を保つことができる。液滴は、約10,00
0液滴/μL、100,000液滴/μL、200,000液滴/μL、300,000
液滴/μL、400,000液滴/μL、500,000液滴/μL、600,000液
滴/μL、700,000液滴/μL、800,000液滴/μL、900,000液滴
/μL、または1,000,000液滴/μLを超える密度で、熱サイクル中に完全性を
保つことができる。他の場合では、2つまたはそれよりも多くの液滴が、熱サイクル中に
凝集しない。他の場合では、100個よりも多くのまたは1,000個よりも多くの液滴
が、熱サイクル中に凝集しない。
これらに限定されないが、E.coli DNAポリメラーゼ、E.coli DNA
ポリメラーゼ1のクレノー断片、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ
、Taqポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、
バクテリオファージ29、REDTaq(商標)、ゲノムDNAポリメラーゼ、またはシ
ーケナーゼを含む、プライマー伸長を触媒する任意のDNAポリメラーゼを使用すること
ができる。一部の場合では、熱安定性DNAポリメラーゼが使用される。また、ポリメラ
ーゼを添加する前に反応を2分間95℃に加熱するか、または1サイクル目の最初の加熱
ステップまでポリメラーゼを不活性にしておくことができるホットスタートPCRを実施
してもよい。ホットスタートPCRを使用すると、非特異的増幅を最小限に抑えることが
できる。任意の回数のPCRサイクル、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9
、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、3
6、37、38、39、40、41、42、43、44、もしくは45回のサイクル、約
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、1
7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30
、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、もしくは45回よりも多くのサイクル、または約1、2、3、4、5、6、7、8
、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、2
2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35
、36、37、38、39、40、41、42、43、44、もしくは45回未満のサイ
クルを使用してDNAを増幅することができる。増幅サイクルの回数は、約1〜45、1
0〜45、20〜45、30〜45、35〜45、10〜40、10〜30、10〜25
、10〜20、10〜15、20〜35、25〜35、30〜35、または35〜40で
あってもよい。
標的核酸の増幅は、当技術分野で公知の任意の手段により実施することができる。標的
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または等温DNA増幅により増幅してもよい。
使用することができるPCR技法の例としては、これらに限定されないが、定量PCR、
定量蛍光PCR(QF−PCR)、マルチプレックス蛍光PCR(MF−PCR)、リア
ルタイムPCR(逆転写−PCR)、単一細胞PCR、制限断片長多型PCR(PCR−
RFLP)、PCR−RFLP/逆転写−PCR−RFLP、ホットスタートPCR、ネ
ステッドPCR、in situポロニーPCR、in situローリングサークル増
幅(RCA)、デジタルPCR(dPCR)、液滴デジタルPCR(ddPCR)、ブリ
ッジPCR、ピコリットルPCR、およびエマルジョンPCRが挙げられる。他の好適な
増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応法(LCR)、転写増幅法、分子反転プローブ(M
IP)PCR法、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅法、コン
センサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応法(CP−PCR;consensus sequence
primed polymerase chain reaction)、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応法(
AP−PCR;arbitrarily primed polymerase chain reaction)、ディジェネレー
トポリヌクレオチドプライムドPCR法(DOP−PCR;degenerate polynucleotide
-primed PCR)、および核酸に基づく配列増幅法(NABSA;nucleic acid based
sequence amplification)挙げられる。本明細書で使用することができる他の増幅方法
としては、米国特許第5,242,794号、第5,494,810号、第4,988,
617号、および第6,582,938号に記載されているもの、ならびにQベータレプ
リカーゼ媒介性RNA増幅法が挙げられる。増幅は、等温増幅、例えば等温線形増幅であ
ってもよい。
一部の実施形態では、増幅は、固体支持体では生じない。一部の実施形態では、増幅は
、液滴内の固体支持体では生じない。一部の実施形態では、増幅が液滴内でない場合、増
幅は、固体支持体で生じる。
配列決定
本明細書に記載されている方法または方法ステップの1つまたは複数を実施した後、生
成されたポリヌクレオチドのライブラリーを配列決定してもよい。
配列決定は、当技術分野で公知の任意の配列決定法により実施することができる。一部
の実施形態では、配列決定は、ハイスループットで実施することができる。好適な次世代
シークエンシング技術としては、454ライフサイエンスプラットフォーム(Roche
、ブランフォード、コネティカット州)(Marguliesら、Nature、437巻、376〜3
80頁(2005年));Illuminaのゲノムアナライザー、GoldenGat
eメチル化アッセイ、またはInfiniumメチル化アッセイ、つまりInfiniu
m HumanMethylation 27K BeadArray、またはVera
Code GoldenGateメチル化アレイ(Illumina、サンディエゴ、カ
リフォルニア州、Bibkovaら、Genome Res.、16巻、383〜393頁(2006年)
、および米国特許第6,306,597号、第7,598,035号、第7,232,6
56号)、またはライゲーションによるDNA配列決定、SOLiDシステム(Appl
ied Biosystems/Life Technologies、米国特許第6,
797,470号、第7,083,917号、第7,166,434号、第7,320,
865号、第7,332,285号、第7,364,858号、および第7,429,4
53号);またはHelicos True Single Molecule DNA
配列決定技術(Harrisら、Science、320巻、106〜109頁(2008年);およ
び米国特許第7,037,687号、第7,645,596号、第7,169,560号
、および第7,769,400号)、Pacific Biosciencesの一分子
リアルタイム(SMRTTm)技術および配列決定法(Soniら、Clin. Chem.、53巻、
1996〜2001頁(2007年))が挙げられる。こうしたシステムは、試料から単
離された多数のポリヌクレオチドのマルチプレックス並列配列決定を可能にする(Dear、
Brief Funct. Genomic Proteomic、1巻(4号)、397〜416頁(2003年)
、およびMcCaughanら、J. Pathol.、220巻、297〜306頁(2010年))。一
部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、色素修飾プローブのライゲーションによる配列
決定法、ピロシーケンス法、または一分子配列決定法により配列決定される。ポリヌクレ
オチドの配列の決定は、Helioscope(商標)一分子配列決定法、ナノポアDN
A配列決定法、Lynx Therapeuticsの大規模並列シグネチャー配列決定
法(MPSS)、454ピロシーケンス法、一分子リアルタイム(RNAP)配列決定法
、Illumina(Solexa)配列決定法、SOLiD配列決定法、Ion To
rrent(商標)、イオン半導体配列決定法、一分子SMRT(商標)配列決定法、ポ
ロニー配列決定法、DNAナノボール配列決定法、およびVisiGen Biotec
hnologies手法等の配列決定法により実施することができる。あるいは、ポリヌ
クレオチドの配列の決定には、これらに限定されないが、Illuminaが提供するゲ
ノムアナライザーIIx、HiSeq、およびMiSeq;Pacific Biosc
iences(カリフォルニア)が提供するPacBio RSシステムおよびSole
xaシーケンサー等の一分子リアルタイム(SMRT(商標))技術;Helicos
Inc.(ケンブリッジ、マサチューセッツ州)が提供するHeliScope(商標)
等のTrue Single Molecule Sequencing(tSMS(商
標))技術を含む配列決定プラットフォームを使用してもよい。配列決定は、MiSeq
配列決定を含んでいてもよい。配列決定は、HiSeq配列決定を含んでいてもよい。一
部の実施形態では、ポリヌクレオチドの配列の決定は、ペアエンド配列決定法、ナノポア
配列決定法、ハイスループット配列決定法、ショットガン配列決定法、色素ターミネータ
ー配列決定法、多重プライマーDNA配列決定法、プライマーウォーキング法、サンガー
式ジデオキシ配列決定法、マクシム−ギルバート配列決定法、ピロシーケンス法、tru
e single molecule配列決定法、またはそれらの任意の組合せを含む。
あるいは、ポリヌクレオチドの配列は、電子顕微鏡または化学感応性電界効果トランジス
ター(chemFET)アレイにより決定してもよい。
方法は、ライブラリー中の1つまたは複数のポリヌクレオチドを配列決定することをさ
らに含んでいてもよい。方法は、ライブラリー中の1つまたは複数のポリヌクレオチド配
列、配列読み取り、アンプリコン配列、またはアンプリコンセット配列を互いにアライン
することをさらに含んでいてもよい。
アラインメントは、配列読み取り等の試験配列を、1つまたは複数の他の試験配列、参
照配列、またはそれらの組合せと比較することを含んでいてもよい。一部の実施形態では
、アラインメントを使用して、複数の配列またはアラインされた配列からコンセンサス配
列を決定してもよい。一部の実施形態では、アラインメントは、各々が同一の分子バーコ
ードまたはベッセルバーコードを有する複数の配列からコンセンサス配列を決定すること
を含む。一部の実施形態では、比較目的でアラインされる配列の長さは、参照配列の長さ
の少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なく
とも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%である。2
つまたはそれよりも多くの配列の実際の比較は、周知の方法により、例えば数学的アルゴ
リズムを使用して達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例
は、Karlin, S.およびAltschul, S.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻−58
73〜5877頁(1993年)に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Altsch
ul, S.ら、Nucleic Acids Res.、25巻:3389〜3402頁(1997年)に記
載されているNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込
まれている。BLASTおよびギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それ
ぞれのプログラム(例えば、NBLAST)の任意の関連パラメータを使用してもよい。
例えば、配列比較のパラメータは、スコア=100、ワード長=12に設定してもよく、
または様々であってもよい(例えば、W=5またはW=20)。他の例としては、Myers
およびMiller、CABIOS(1989年)のアルゴリズム、ADVANCE、ADAM、BL
AT、およびFASTAが挙げられる。一部の実施形態では、2つのアミノ酸配列間のパ
ーセント同一性は、例えば、GCGソフトウェアパッケージ(Accelrys、ケンブ
リッジ、英国)のGAPプログラムを使用して達成することができる。
配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約10、20、30、40、50、60、
70、80、90、100個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列
決定することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、配列決定は、ポリヌクレオチド
の少なくとも約200、300、400、500、600、700、800、900、1
000個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む
。他の場合では、配列決定は、ポリヌクレオチドの少なくとも約1500、2000、3
000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000
個、またはそれよりも多くのヌクレオチドまたは塩基対を配列決定することを含む。
配列決定は、1実行当たり、少なくとも約200、300、400、500、600、
700、800、900、1000個、またはそれよりも多くの配列決定読み取りを含ん
でいてもよい。本明細書で使用される場合、配列読み取りは、配列決定技法により生成さ
れるデータの配列またはストリームから決定されるヌクレオチドの配列を含む。一部の実
施形態では、配列決定は、1実行当たり、少なくとも約1500、2000、3000、
4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000個、また
はそれよりも多くの配列決定読み取りを含む。配列決定は、1実行当たり、約1,000
,000,000個よりも多くの、約1,000,000,000個未満の、または約1
,000,000,000個に等しい配列決定読み取りを含んでいてもよい。配列決定は
、1実行当たり、約200,000,000個よりも多くの、約200,000,000
個未満の、または約200,000,000個に等しい配列決定読み取りを含んでいても
よい。
酵素
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の酵素を含んでいても
よい。酵素の例としては、これらに限定されないが、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラー
ゼ、および制限ヌクレアーゼが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドに対するアダプターの付着は、1つまたは複数
のリガーゼを使用することを含む。リガーゼの例としては、これらに限定されないが、D
NAリガーゼI、DNAリガーゼIII、DNAリガーゼIV、およびT4 DNAリガ
ーゼ等のDNAリガーゼ;ならびにT4 RNAリガーゼIおよびT4 RNAリガーゼ
II等のRNAリガーゼが挙げられる。
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の逆転写酵素を使用す
ることをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、逆転写酵素は、HIV−1逆転
写酵素、M−MLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、およびテロメラーゼ逆転写酵素であ
る。一部の実施形態では、逆転写酵素は、M−MLV逆転写酵素である。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数
のプロテアーゼを使用することを含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数
のポリメラーゼを使用することを含む。ポリメラーゼの例としては、これらに限定されな
いが、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼが挙げられる。一部の実施形態では
、DNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼII、DNAポリ
メラーゼIIIホロ酵素、およびDNAポリメラーゼIVである。商業的に入手可能なD
NAポリメラーゼとしては、これらに限定されないが、Bst2.0 DNAポリメラー
ゼ、Bst2.0WarmStart(商標)DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリ
メラーゼ、スルフォロブスDNAポリメラーゼIV、Taq DNAポリメラーゼ、9°
N(商標)mDNAポリメラーゼ、Deep VentR(商標)(エキソ)DNAポリ
メラーゼ、Deep VentR(商標)DNAポリメラーゼ、Hemo KlenTa
q(商標)、LongAmp(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ、OneTaq(
登録商標)DNAポリメラーゼ、Phusion(登録商標)DNAポリメラーゼ、Q5
(商標)高フィデリティーDNAポリメラーゼ、Therminator(商標)γDN
Aポリメラーゼ、Therminator(商標)DNAポリメラーゼ、Thermin
ator(商標)II DNAポリメラーゼ、Therminator(商標)III
DNAポリメラーゼ、VentR(登録商標)DNAポリメラーゼ、VentR(登録商
標)(エキソ)DNAポリメラーゼ、Bsu DNAポリメラーゼ、phi29 DNA
ポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、ターミナルトラ
ンスフェラーゼ、Titanium(登録商標)Taqポリメラーゼ、KAPA Taq
DNAポリメラーゼ、およびKAPA TaqホットスタートDNAポリメラーゼが挙
げられる。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼI
I、RNAポリメラーゼIII、E.coliポリ(A)ポリメラーゼ、phi6 RN
Aポリメラーゼ(RdRP)、ポリ(U)ポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼ、お
よびT7 RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼである。
追加の試薬
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の試薬を使用すること
を含んでいてもよい。試薬の例としては、これらに限定されないが、PCR試薬、ライゲ
ーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、親
和性捕捉試薬、ビーズ等の固体支持体、ならびに核酸精製および/または単離用の試薬が
挙げられる。
他の実施形態では、本明細書で開示されている方法、キット、および組成物は、支持体
を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法、キット、お
よび組成物は、支持体を含まない。典型的には、固体支持体は、1つまたは複数の剛性ま
たは半剛性表面を含む1つまたは複数の材料を含む。一部の実施形態では、支持体は非固
体支持体である。支持体または基材は、膜、紙、プラスチック、被覆表面、平坦表面、ガ
ラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施
形態では、支持体の1つまたは複数の表面は実質的に平坦であるが、一部の実施形態では
、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、またはエッチングされた溝等を有する、様々な化合
物のための合成領域が物理的に分離されていることが望ましい場合がある。一部の実施形
態では、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、または他の幾何学的構成
を含む。あるいは、固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、
およびアレイを含んでいてもよい。固体支持体は、マイクロウェルでの自己集合可能なビ
ーズの使用を含んでいてもよい。例えば、固体支持体は、IlluminaのBeadA
rray技術を含む。あるいは、固体支持体は、Abbott MolecularのB
ead Array技術、およびApplied MicroarrayのFlexiP
lex(商標)システムを含む。他の例では、固体支持体は、プレートである。プレート
の例としては、これらに限定されないが、MSDマルチアレイプレート、MSD Mul
ti−Spot(登録商標)プレート、マイクロプレート、ProteOnマイクロプレ
ート、AlphaPlate、DELFIAプレート、IsoPlate、およびLum
aPlateが挙げられる。一部の実施形態では、支持体は、複数のビーズを含んでいて
もよい。一部の実施形態では、支持体は、アレイを含んでいてもよい。一部の実施形態で
は、支持体は、ガラススライドを含んでいてもよい。ポリマーに適用可能な方法、基材、
および技法(米国特許第5,744,305号、5,143,854号、第5,242,
974号、第5,252,743号、第5,324,633号、第5,384,261号
、第5,405,783号、第5,424,186号、第5,451,683号、第5,
482,867号、第5,491,074号、第5,527,681号、第5,550,
215号、第5,571,639号、第5,578,832号、第5,593,839号
、第5,599,695号、第5,624,711号、第5,631,734号、第5,
795,716号、第5,831,070号、第5,837,832号、第5,856,
101号、第5,858,659号、第5,936,324号、第5,968,740号
、第5,974,164号、第5,981,185号、第5,981,956号、第6,
025,601号、第6,033,860号、第6,040,193号、第6,090,
555号、第6,136,269号、第6,269,846号、および第6,428,7
52号;米国特許出願公開第20090149340号、第20080038559号、
第20050074787;ならびにPCT公開番号WO00/58516、WO99/
36760、およびWO01/58593)。支持体へのポリヌクレオチドの付着は、ア
ミン−チオール架橋、マレイミド架橋、N−ヒドロキシスクシンイミド、またはN−ヒド
ロキシスルホスクシンイミド、Zenon、またはSiteClickを含んでいてもよ
い。支持体への標識核酸の付着は、ビオチンを複数のポリヌクレオチドに付着させること
、および1つまたは複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングすることを含んで
いてもよい。一部の実施形態では、支持体はビーズである。ビーズの例としては、これら
に限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Dyn
abeads(登録商標)、MACS(登録商標)マイクロビーズ、抗体コンジュゲート
ビーズ(例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ)、プロテインAコンジュゲートビー
ズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロ
テインLコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチドdTコンジュゲートビーズ、シリカビ
ーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、および
BcMag(商標)カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられる。ビーズの直径は、約5μm
、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、または5
0μmであってもよい。固体支持体は、アレイまたはマイクロアレイであってもよい。固
体支持体は、個別の領域を含んでいてもよい。固体支持体は、アレイ、例えばアドレス可
能なアレイであってもよい。
固体支持体は、事実上あらゆる不溶性または固体材料を含むことができ、水に不溶性で
ある固体支持体組成物が選択されることが多い。例えば、固体支持体は、シリカゲル、ガ
ラス(例えば、細孔制御ガラス(CPG))、ナイロン、Sephadex(登録商標)
、Sepharose(登録商標)、セルロース、金属表面(例えば、鋼、金、銀、アル
ミニウム、ケイ素、および銅)、磁性材料、プラスチック材料(例えば、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、およびポリビニリデンジフルオリド(PV
DF))等を含んでいてもよく、またはこれらから本質的になっていてもよい。本実施形
態により使用されるビーズの例としては、ビーズと核酸分子との相互作用を可能にする親
和性部分を挙げることができる。固相(例えば、ビーズ)は、結合対のメンバー(例えば
、アビジン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体)を含んでいてもよい。例えば
、ビーズは、ストレプトアビジンがコーティングされたビーズであってもよく、ビーズに
固定する核酸分子は、ビオチン部分を含んでいてもよい。一部の場合では、各ポリヌクレ
オチド分子は、ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ビオチン等の2つの親和性
部分を含んでいてもよい。ビーズは、核酸の固定に使用するための、または下流でのスク
リーニングまたは選択プロセスで使用することができる追加の特徴を含んでいてもよい。
例えば、ビーズは、親和性部分、蛍光標識、または蛍光クエンチャーを含んでいてもよい
。一部の場合では、ビーズは、磁性であってもよい。一部の例では、支持体はビーズであ
る。ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロ
ースビーズ、磁気ビーズ、Dynabeads(登録商標)、MACS(登録商標)マイ
クロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ(例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ)、
プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA
/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチドdT
コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗
蛍光色素マイクロビーズ、およびBcMag(商標)カルボキシ末端磁気ビーズが挙げら
れる。ビーズまたは粒子は、膨潤可能であってもよく(例えば、Wang樹脂等のポリマ
ー性ビーズ)、または膨潤不能であってもよい(例えば、CPG)。一部の実施形態では
、固相は、実質的に親水性である。一部の実施形態では、固相(例えば、ビーズ)は、実
質的に疎水性である。一部の実施形態では、固相は、結合対のメンバー(例えば、アビジ
ン、ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体)を含み、実質的に疎水性または実質的
に親水性である。一部の実施形態では、固相は、結合対のメンバー(例えば、アビジン、
ストレプトアビジン、またはそれらの誘導体)を含み、固体支持体1mg当たり約135
0ピコモルの遊離捕捉剤(例えば、遊離ビオチン)よりも高い結合能を有する。一部の実
施形態では、結合対のメンバーを含む固相の結合能は、固体支持体1mg当たり、800
、900、1000、1100、1200、1250、1300、1350、1400、
1450、1500、1600、1800、2000ピコモルの遊離捕捉剤よりも高い。
本発明に好適なビーズの他の例は、金コロイド、またはポリスチレンビーズもしくはシリ
カビーズ等のビーズである。実質的に任意のビーズ半径を使用することができる。ビーズ
の例としては、150ナノメートルから10ミクロンまでの範囲の半径を有するビーズを
挙げることができる。他のサイズも使用することができる。
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の緩衝液を使用するこ
とを含んでいてもよい。緩衝液の例としては、これらに限定されないが、洗浄緩衝液、ラ
イゲーション緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、増幅緩衝液、および逆転写緩衝液
が挙げられる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、TMAC Hy
b溶液、SSPEハイブリダイゼーション溶液、およびECONO(商標)ハイブリダイ
ゼーション緩衝液等の商業的に入手可能な緩衝液である。本明細書で開示されている緩衝
液は、1つまたは複数の洗剤を含んでいてもよい。
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の担体を使用すること
を含んでいてもよい。担体は、本明細書で開示されている1つまたは複数の反応(例えば
、ライゲーション反応、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション)の効率を増強または向
上させることができる。担体は、分子またはそれらの任意の産物(例えば、ポリヌクレオ
チドおよび/またはアンプリコン)の非特異性の喪失を減少または防止することができる
。例えば、担体は、表面への吸収によるポリヌクレオチドの非特異性の喪失を減少させる
ことができる。担体は、表面または基材(例えば、容器、Eppendorfチューブ、
ピペットチップ)へのポリヌクレオチドの親和性を減少させることができる。あるいは、
担体は、表面または基材(例えば、ビーズ、アレイ、ガラス、スライド、チップ)へのポ
リヌクレオチドの親和性を増加させることができる。担体は、ポリヌクレオチドの分解を
防止することができる。例えば、担体は、リボヌクレアーゼからRNA分子を保護するこ
とができる。あるいは、担体は、DNaseからDNA分子を保護することができる。担
体の例としては、これらに限定されないが、DNAおよび/またはRNA等のポリヌクレ
オチド、またはポリペプチドが挙げられる。DNA担体の例としては、プラスミド、ベク
ター、ポリアデニル化DNA、およびDNAポリヌクレオチドが挙げられる。RNA担体
の例としては、ポリアデニル化RNA、ファージRNA、ファージMS2 RNA、E.
coli RNA、酵母RNA、酵母tRNA、哺乳動物RNA、哺乳動物tRNA、短
鎖ポリアデニル化合成リボヌクレオチド、およびRNAポリヌクレオチドが挙げられる。
RNA担体は、ポリアデニル化RNAであってもよい。あるいは、RNA担体は、非ポリ
アデニル化RNAであってもよい。一部の実施形態では、担体は、細菌、酵母、またはウ
イルスに由来する。例えば、担体は、細菌、酵母、またはウイルスに由来するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドであってもよい。例えば、担体は、Bacillus sub
tilisに由来するタンパク質である。別の例では、担体は、Escherichia
coliに由来するポリヌクレオチドである。あるいは、担体は、哺乳動物(例えば、
ヒト、マウス、ヤギ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、またはウサギ)、トリ、両生
類、または爬虫類に由来するポリヌクレオチドまたはペプチドである。
本明細書で開示されている方法およびキットは、1つまたは複数の対照物質を使用する
ことを含んでいてもよい。対照物質としては、対照ポリヌクレオチド、不活性酵素、非特
異的競合物質を挙げることができる。あるいは、対照物質は、ブライトハイブリダイゼー
ション(bright hybridization)、ブライトプローブ対照、核酸鋳型、スパイクイン対
照、PCR増幅対照を含む。PCR増幅対照は、陽性対照であってもよい。他の例では、
PCR増幅対照は、陰性対照である。核酸鋳型対照は、既知の濃度であってもよい。対照
物質は、1つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
スパイクイン対照は、反応または試料に添加される鋳型であってもよい。例えば、スパ
イクイン鋳型を、増幅反応に添加してもよい。スパイクイン鋳型は、最初の増幅サイクル
後の任意の時点で増幅反応に添加してもよい。一部の実施形態では、スパイクイン鋳型は
、サイクル数が2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、20、25、30、35、40、45、または50回に達した後で、増幅反応に添加さ
れる。スパイクイン鋳型は、最後の増幅サイクル前の任意の時点で増幅反応に添加しても
よい。スパイクイン鋳型は、1つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基対を含んでい
てもよい。スパイクイン鋳型は、DNA、RNA、またはそれらの任意の組合せを含んで
いてもよい。スパイクイン鋳型は、1つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
本明細書で開示されているものは、本明細書で開示されている方法および組成物に使用
することができる、方法および組成物と共に使用することができる、方法および組成物を
調製するために使用することができる、分枝、材料、組成物および成分であり、または方
法および組成物の産物である。これら物質の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等
が開示されている場合、これら分子および化合物の様々な個々のおよび集合的な組合せお
よび順列に対する具体的な参照を明示的に開示することができない場合でも、各々は、本
明細書にて具体的に企図および記載されていることが理解される。例えば、ヌクレオチド
または核酸が開示および考察され、そのヌクレオチドまたは核酸を含むいくつかの分子に
なすことができるいくつかの修飾が考察されている場合、特に別様の指示がない限り、ヌ
クレオチドまたは核酸のありとあらゆる組合せおよび順列ならびに考え得る修飾が、具体
的に企図されている。この概念は、本開示の方法および組成物を作製および使用するため
の方法のことを含むがそれらに限定されない、本出願の全ての態様に当てはまる。したが
って、実施することができる様々な追加ステップが存在する場合、そうした追加ステップ
の各々は、本開示の方法の任意の特定の実施形態でまたは実施形態を組み合わせて実施す
ることができ、各々のそのような組合せは、具体的に企図され、開示されているとみなさ
れるべきであることが理解される。
本明細書に記載されている一部の実施形態が、本明細書に表示および記載されているが
、そのような実施形態は、例示のために提供されているに過ぎない。今や、当業者であれ
ば、本明細書で提供されている開示から逸脱せずに、多数の変異、変更、および置換を起
想するだろう。本明細書に記載されている実施形態の種々の代替を、本明細書に記載され
ている方法の実行に用いることができることが理解されるべきである。
別様に説明されていない限り、本明細書で使用されている技術的および科学的用語は全
て、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する
。以下の参考文献は、本明細書で使用することができる方法および組成物の実施形態を含
む:The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第18版、Merck Research
Laboratoriesから出版、2006年(ISBN0−9119102);Benjamin Lewin
、Genes IX、Jones & Bartlett Publishingから出版、2007年(ISBN−13
:9780763740634);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Mol. Bi
ology、Blackwell Science Ltd.から出版、1994年(ISBN0−632−021
82−9);およびRobert A. Meyers(編)、Mol. Biology and Biotechnology:
a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.から出版、1995年(
ISBN1−56081−569−8)。
本開示の標準的手順は、以下に記載されている:例えば、Maniatisら、Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spr
ing Harbor、N.Y.、USA(1982年);Sambrookら、Molecular Cloning: A Labora
tory Manual(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring H
arbor、N.Y.、USA(1989年);Davisら、Basic Methods in Molecular Biology
、Elsevier Science Publishing, Inc.、New York、USA(1986年);またはMeth
ods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques、152巻、S. L
. BergerおよびA. R. Kimmerl(編)、Academic Press Inc.、San Diego、USA(1
987年)。Current Protocols in Molecular Biology (CPMB)(Fred M. Ausube
lら編、John Wiley and Sons, Inc.)、Current Protocols in Protein Science
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cols in Immunology (CPI)(John E. Coliganら編、John Wiley and Sons, Inc
.),Current Protocols in Cell Biology (CPCB)(Juan S. Bonifacinoら編、Jo
hn Wiley and Sons, Inc.)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
Technique 、R. Ian Freshney著、出版社:Wiley-Liss;第5版(2005年)、お
よびAnimal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology、57巻、Jennie
P. MatherおよびDavid Barnes編、Academic Press、第1版、1998年)。
(実施例1)
T細胞集団中の単一Tリンパ球のイムノタイピング
本明細書に記載されているイムノフェノタイピング法を、ヒトTリンパ球におけるCD
4およびCD8のmRNAならびに表面タンパク質発現の両方を分析することにより検証
した(図1)。通常、成熟T細胞は、CD4サブタイプまたはCD8サブタイプのいずれ
かであると予想される。CD4サブタイプは、CD4 mRNAおよびCD4タンパク質
を共に発現するはずであるが、CD8 mRNAまたはCD8タンパク質のいずれかを発
現するはずである。CD8サブタイプは、CD8 mRNAおよびCD8タンパク質を共
に発現するはずであるが、CD4 mRNAまたはCD4タンパク質のいずれかを発現す
るはずである。
30,000個のT細胞を、CD4抗原ID配列を含むCD4特異的抗体−オリゴヌク
レオチド、およびCD8抗原ID配列を含むCD8特異的抗体−オリゴヌクレオチドの両
方と共にインキュベートした。また、T細胞のCD4、CD8、およびTCRのmRNA
含有量を、単一細胞エマルジョン実験で分析した。T細胞受容体アルファ、T細胞受容体
ベータ、CD4、およびCD8のmRNAを、cDNAへと逆転写し、液滴特異的バーコ
ード配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAおよび抗体コンジュゲートオリゴヌク
レオチドの両方に融合した。このDNAを、エマルジョンから抽出し、次世代シークエン
シング法で分析した。
ほとんど全ての液滴バーコード(単一細胞に関連付けられる)は、CD4特異的抗原I
DまたはCD8特異的抗原IDのいずれかに関連付けられた。mRNAと表面タンパク質
に基づく帰属との間に実質的な一致が見出された(図3)。
(実施例2)
免疫レパートリーの配列決定は、基礎免疫学、自己免疫、感染症、および腫瘍学におい
て幅広い応用を有する。多くの研究では、循環血液中のBCRおよびTCR多様性が調査
されているが、TILの免疫受容体に対する関心が高まっている。その機能は、がん成長
または退縮に高度に関連しているが、その程度は様々であり、特徴付けされていないこと
が多い。TILのより良好な理解に向かって重要なことは、新しい腫瘍関連抗原の識別を
可能にし得るため、TILのBCRおよびTCRの回収および機能的な特徴付けである。
腫瘍抗原は、がんワクチンを開発するために、チェックポイント阻害剤の役割を理解する
ために、および固形腫瘍のキメラ抗原受容体T細胞(CAR−T)療法を進歩させるため
に、非常に必要とされている。しかしながら、免疫配列決定における数十年に及ぶ技術的
進歩にも関わらず、全長のネイティブに対合したBCR(重鎖および軽鎖)およびTCR
(アルファおよびベータ鎖)を、観察されるレパートリーを制限および偏向するin v
itro培養または細胞ソーティングを行わずに、腫瘍等の不均質試料から回収した研究
はない。初代未培養免疫細胞は、in vitro刺激細胞の100分の1未満の受容体
RNAを含み得るため、技術的な困難性が非常に高い。複雑な不均質試料に由来するネイ
ティブに対合したBCRおよびTCRの包括的な分析を可能にするため、多数の単一細胞
を並列単離およびDNAバーコード付与するためのマイクロ流体エマルジョンに基づく方
法を開発した。毎時最大100万個の細胞が、個々の約65ピコリットルエマルジョン液
滴中で単離される。液滴内で細胞を溶解し、標的特異的プライマーを用いて標的mRNA
を逆転写し、二段階DNAバーコード付与プロセスにより、分子特異的および液滴特異的
バーコードをcDNAに付着する。その後の回収および次世代シークエンシングの後、こ
の二重バーコード付与戦略は、配列読み取りを、それらの当初の分子および細胞の両方に
クラスター化することを可能にする。これより、エラーおよび増幅バイアスの広範な矯正
、mRNAおよび細胞の両レベルでのクローン計数、重鎖アイソタイプの決定、ならびに
、重要なことには、BCRおよびTCRの全長のネイティブに対合したV(D)J配列を
超ハイスループットで同時に回収することが可能になる。
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、抗がん免疫応答に重要であるが、それらの存在量、表
現型、および機能は予測不能であるため、研究は困難である。本発明者らは、細胞ソーテ
ィング、刺激、または培養を行う必要なく、TILを高深度で特徴付けるための方法を開
発した。エマルジョンに基づく単一細胞バーコード付与法により、数百万個のインプット
細胞中のリンパ球の中から、ネイティブに対合したB細胞およびT細胞受容体(BCRお
よびTCR)配列が捕捉される。以前の手法とは対照的に、回収される可変領域は全長で
あり、さらなるmRNAおよびタンパク質標的が付随し得る。卵巣腺癌に由来する400
,000個のソーティングされていない細胞を処理し、11,000個を超えるTILか
ら対合したBCRおよびTCRを回収する前に、健常ヒト血液に由来する300万個のB
細胞およびHIV患者に由来する350,000個のB細胞で本方法を検証した。本発明
者らの結果は、任意の対合したBCRまたはTCRレパートリーの最も高深度のサンプリ
ングであると共に、エマルジョン中での単一細胞の同時RNA配列決定およびタンパク質
測定を最初に実証するものである。
(実施例3)
健常血液試料からのB細胞Vペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常
ボランティアの末梢血から単離された300万個のB細胞でアセスメントした。エマルジ
ョンを6つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかっ
た。エマルジョンを、1液滴当たり0.2細胞になるように装填した。これは、占有液滴
の約90%が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観
察と一致していた(図5A)。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップ
を行った後、Illumina MiSeqを用いて、ペアエンド325+300bp配
列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使
用して、元々の各mRNA分子からPCR複製読み取りを収集し、各mRNAについてコ
ンセンサスを決定して、少なくとも2つの読み取りから組み立てられたmRNA配列のみ
を維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、5’UTR、完全V(
D)J配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。IM
GT High−VQuestおよび/またはIgBLASTを用いて、再配置された免
疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
得られたデータセットは、少なくとも1つの重鎖(V)および1つの軽鎖(V)m
RNAと関連していた324,988個の液滴バーコードを含有し、重鎖クラスター分析
で評価して229,869個の異なるVクローン系列が存在していた。この生セットは
、複数細胞ならびに単一細胞液滴に由来するデータを含むため、非一致の重鎖または軽鎖
V(D)J配列に関連した液滴バーコードをフィルタリングして取り除くことにより、単
一細胞液滴に由来するデータを濃縮した(図5B)。このことを実施することが可能であ
るのは、典型的な免疫レパートリーの多様性が高いためであり、2つのランダム細胞に由
来するVまたはV mRNAがマッチングすることは、ほとんど全くないだろう。得
られた濃縮データセットは、259,368個のV液滴バーコードを含み、182
,745個のVのクローン系列を含有していた。これは、現在までで最も高深度の対合
した免疫レパートリーのサンプリングであることをほぼ間違いなく示す。クローン的に関
連する細胞は、それらのV対合が一貫しているはずであるため、クローン拡大の発
生を識別することにより、V対合の精度を直接的に評価した。1つよりも多くのエ
マルジョン画分で、クローン的に拡大した細胞であることが高い信頼性で観察された2,
604個のVクローンが識別された。これらVクローンと対合したV配列は、画分
間の一貫性が非常に高く、96.1%の対合精度を示した。これにより、259,368
個のVペアのフィルタリングされたデータセット全体に高い信頼性が与えられた。
交差画分VおよびV配列は、各画分にて異なる液滴および分子バーコードと関連する
ことが常であり、したがってライブラリー交差汚染を示さなかった。一部のB細胞は複数
の軽鎖を発現することが公知であるため、分析は、対合精度を過小評価する場合がある。
259,368個のフィルタリングされたV液滴バーコードまたは「Vペア
」の75.0%は、IgMおよび/またはIgDを含有していた(図5C)。これは、未
感作ナイーブB細胞は典型的にはIgMIgD表現型であることを考慮すると、予想
通り一緒に観察されることが多かった。より少ないがかなりの割合のIgA(18.3%
)およびIgG(6.6%)Vペアも見出された。Vアイソタイプは全て、約3
:2の比率でIgκまたはIgλのいずれかと対合した。182,745個のVクロー
ン系列中のクローン拡大を2つの方法でアセスメントした:クローンに関連する液滴バー
コードの数;およびエマルジョン画分にわたるそのクローンの観察。複数の液滴バーコー
ドでクローンが見られることは、クローン拡大を反映する場合もあり、または複数バーコ
ード液滴を反映する場合もある。初期λ=1であったこと、つまり液滴内へのバーコード
の分散がポアソン分散であったことを考慮すると、液滴の約37%で複数バーコード液滴
が予想された。しかしながら、>8つの液滴バーコードにより表わされるクローンは全て
、間違いなく拡大性である可能性が高い(単一液滴中のポアソン確率は、<10−6)。
全体でクローンの6.0%が1つよりも多くの画分で見られたが、8つよりも多くの液滴
バーコードで見られたクローン(全体で0.7%)の場合、それらの99%は、1つより
も多くの画分で見られた。100個の最も高頻度のクローン(各々30〜137個の液滴
バーコード、図5D)は全て、6つの画分の少なくとも5つで見られた。したがって、バ
ーコード計数および独立した画分分析を組み合わせると、非増殖クローンの厖大なバック
グラウンドの中から、希少な拡大系列を検出することが可能になる。しかしながら、最も
多量の拡大したクローンでさえ、1000個に1個未満の細胞にしか存在していなかった
ことは注目すべきことであり、ヒト末梢免疫レパートリーの多様性が非常に高いことを例
示している。
発現レベルの推定としての、ペア内の各VおよびV鎖の捕捉mRNAの数(図5E
)。概して、1液滴バーコード当たり10個未満の重鎖(平均2.0)および軽鎖(平均
4.0)mRNAが捕捉され、1細胞当たり、数ダース〜数百個の捕捉重鎖および軽鎖m
RNAを有する液滴バーコードの小集団が、ほとんど排他的にIgGおよびIgA発現細
胞から観察された。興味深いことには、ペア内のVおよびV突然変異の程度は、各ア
イソタイプ(例えば、IgGの場合は、V対V)内、およびアイソタイプ間(例えば
、IgG対IgM)の両方で、強い相関性を示した(図2F)。さらに、IgGおよびI
gA対はほとんど全てが、VおよびV鎖の両方にかなりの突然変異を示したが、Ig
MおよびIgDペアはほとんどが、VまたはV突然変異をほとんど示さなかった。こ
うした結果は、B細胞活性化の機序と一致し、IgMおよびIgDからIgGまたはIg
Aへのクラススイッチ、免疫グロブリン発現の増加、ならびに細胞の重鎖および軽鎖遺伝
子座の両方に影響を及ぼす体細胞超変異に至る。高度に突然変異を起こしたV鎖は、高
度に突然変異を起こしたV鎖と対合する傾向があるというこの観察に加えて、本方法は
、休止ヒトB細胞レパートリーに由来する多数の全長のネイティブに対合したBCRを生
成することが可能である。
(実施例4)
HIV長期非進行者からの公既知の低頻度V対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な(10,0
00個の細胞中、<1個の細胞)ネイティブV対合が既に既知である試料を処理し
た。HIV長期非進行患者から末梢B細胞を得た。この患者のメモリB細胞は、HIV中
和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。350,000個のB細胞を処理して、
合計38,620個のフィルタリングされたVペアを生成した。興味深いことには
、この個体は、以前の健常試料(図3A)または典型的な健常末梢B細胞レパートリーよ
りも高い割合のIgGを示した。このデータセットに由来するV配列を、PGT121
を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体(bNAb)と比較し、
8つの類似または同一のV配列を見出した。これは、bNAbのこのファミリーが循環
B細胞の0.03%未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全て
の軽鎖は、予想される同様に希少のbNAb系列のものであり、以前に報告されているよ
うに、同じIgλ−V3−21/J3再配置および特徴的な3コドン挿入を示し、本発明
者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、
全ての既知の新らたに生成されたPGT121様Vペアの系統樹(図3B)では、
およびVツリーは、鏡像様位置を占める対合したVおよびV配列と非常に類似
したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可
能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味
深いことには、2つの発表されている抗体PGT122およびPGT123は、例外であ
ると考えられ、これら2つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、
PGT122V:PGT123V様のおよびPGT123V:PGT122V
のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。8
つの新規なPGT様Vペアの完全なV(D)J領域をコードするDNAを合成し、
抗体を完全IgGとして発現させ、複数のHIV擬似系統を中和する能力を試験した(図
6C)。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連す
る生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明
者らの手法の有用性が実証された。
(実施例5)
腫瘍浸潤リンパ球に由来するB細胞およびT細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検
証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離され
た切除卵巣腺癌試料を得、400,000個のソーティングされていない細胞をエマルジ
ョンに入れた。別々の等量の試料をCD3/CD19染色することにより、かなりの数の
浸潤性B(約5%)およびT細胞(約20%)が物質中に存在することが示唆された。エ
マルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細
胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴
内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった(図7A)。
T細胞受容体アルファおよびベータ鎖の定常領域を共に標的とするプライマーを、以前
に使用されたBCRプライマーと共に使用し、配列決定およびストリンジェントなフィル
タリング後に、BCRまたはTCR産物にリンクする数千個の液滴バーコードを回収した
。単一細胞精度をアセスメントするため、液滴バーコード内の4つの標的遺伝子座(V
、V、Vα、Vβ)のあらゆる考え得る組合せを計数した(図7B)。1つよりも多く
の標的鎖を有する液滴バーコードの大部分(97.9%)は、生物学的に予想されるBC
R V またはTCR VαVβの対合を含有し、混合BCR−TCR組合せは
2.1%しか含有されていなかった。産物のバーコード付与は、標的鎖に関して偏りがな
いため、この結果は、得られた6,056個のBCR Vおよび5,217個のT
CR VαVβペアの信頼性を高度化することが可能である。BCRでは、他のアイソタ
イプと比較して、IgG(>80%)が著しく優勢であったが(図7C)、全てが存在し
た(IgE<0.05%のみ)ことが示された。カッパおよびラムダ軽鎖は、末梢血デー
タセットと同様の比率で存在した。
末梢血と同様に、BCRアイソタイプとVおよびV鎖の両方の突然変異レベルとの
間に相関性が観察され、IgGおよびIgAペアは、IgDおよびIgMよりも大きなV
およびV突然変異、ならびに各アイソタイプ内でのVおよびV間の突然変異の一
般的相関性を示した(図7D)。興味深いことには、IgD、IgM、およびIgAペア
は、腫瘍と末梢血データセットとの間で非常に類似した突然変異分布を示した(図5F)
。また、腫瘍IgG画分は、末梢血では観察されなかった、ほとんど突然変異していない
かまたは全く突然変異してない配列をかなりの割合で含有していた。TCRの場合、およ
びIgDを含有するBCRの場合、1液滴バーコード当たり、末梢血のBCR結果と同様
の数の捕捉mRNAが観察された(図7、ほとんどが1液滴バーコード当たり<10)。
極めて対照的だが、腫瘍由来のIgM、IgA、およびIgGペアは、10〜100倍の
平均発現レベル増加を示し、液滴バーコードの多くには数百または数千個の標的mRNA
が捕捉された。その後、捕捉TIL−TCRおよびBCRレパートリーの多様性をアセス
メントした(図7F)。5,217個の合計TCRペアの中で、2,423個の異なるT
CRベータクローンが観察された。7つのクローンが、>1%の頻度で存在し、上位クロ
ーンは、全ての液滴バーコードの16.9%に相当した。6,056個の合計BCRペア
中で、1,518個の異なる重鎖クローンが観察され、15個のクローンが>1%の頻度
であったが、>5%の頻度のものはなかった。これは、多様性が、健常末梢BCRレパー
トリーよりも実質的により制限されていることを表わしているが(0.06%を超える頻
度で存在するクローンはなかった)、クラス転換し、突然変異を起こし、高度に発現され
たクローンが、腫瘍試料中に非常に多く存在することは、TILを特徴付けるためには、
高深度で高感度のサンプリング手法が必要であることを示す。本方法は、規定されたTI
L集団を事前にソーティングまたは外因的活性化する必要なく、BおよびT細胞の両方か
ら同時に、多数のTIL免疫受容体ペアを迅速に回収することを可能にする。
(実施例6)
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的
の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、CD4およびCD8集団に入る健
常T細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの20,000個の細胞を別々のエ
マルジョンに入れ、TCRアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにCD
4およびCD8のmRNAを用いて実験を行った。配列決定後、CD4単離細胞に由来
するTCR VαおよびVβ(「TCRペア」)を含有する3,861個の液滴バーコー
ドの47.0%は、CD4 mRNAに関連していたが、CD8 mRNAに関連したも
のは0.3%に過ぎなかった。反対に、CD8単離細胞に由来する2,235個のTC
Rペアの50.6%が、CD8 mRNAにリンクしていたが、CD4 mRNAにリン
クしていたものは0.6%に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を
決定するためのmRNAに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。
対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードmRNAよりも非常
に大きな数(1細胞当たり1,000〜100,000個)で存在し、検出がより容易で
ある可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞
での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドDNA標識を、抗ヒ
トCD4およびCD8抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、30,000個の細胞をエ
マルジョンに入力する前に、CD4およびCD8 T細胞の未分離混合物と共にイン
キュベートした(図8A)。DNA標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコ
ード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、mRNAでの実施と同
様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。DNA標識、な
らびにTCR、CD4、およびCD8 mRNAを、同時に標的とした。配列決定および
フィルタリング後、3,682個の液滴バーコードを、高い信頼性でTCR VαVβペ
アであると識別した。以前の実験と一致して、TCRペアのおよそ半分(52%)を、m
RNAに基づいてCD4またはCD8ステータスに帰属させることができた(図8B)。
しかしながら、液滴バーコードの95%超は、タンパク質ステータスに基づいてCD4ま
たはCD8に帰属させることができ、1液滴当たりの平均分子計数は、CD4/8タンパ
ク質(平均20.5)が、CD4/8 mRNA(平均1.0)よりもかなり高かった。
mRNAおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、mRNAとタ
ンパク質シグナルとの間の合致率は高く(図8C)、液滴の96.0%だった。一部の希
少な例では、CD4およびCD8タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が、2つ
またはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョンバー
コード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のmRNAおよびタンパク質マーカーと
、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗PD−1お
よび抗CTLA−4等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、この手法
をTILに応用することは、保証されている。
(実施例7)
ヒト試料
健常レパートリー検証用の血液試料を、Personal Genome Proje
ctの承認に基づいて収集した。HIV bNAb実験用のPBMCを、IAVIプロト
コールGコホートのHIV−1感染ドナーであるドナー17から得た。ヒトHIV試料は
全て、ルワンダ共和国国立倫理委員会、エモリー大学内治験審査委員会、ザンビア大学研
究倫理委員会、チャリングクロス研究倫理委員会、UVRI科学および倫理委員会、ニュ
ーサウスウェールズ大学研究倫理委員会、聖ビンセント病院および東シドニー地区ヘルス
サービス、ケニヤッタ国立病院倫理調査委員会、ケープタウン大学倫理委員会、国際施設
内治験審査委員会、マヒドン大学倫理委員会、ウォルターリード陸軍研究所(WRAIR
)施設内治験審査委員会、およびコートジボアール委員会「National d’Et
hique des Sciences de la Vie et de la Sa
nte」(CNESVS)により承認された臨床試験プロトコールに基づいて書面による
インフォームドコンセントを得たうえで収集した。凍結保存され、解離され、切除された
、単一ドナーに由来する卵巣腺癌を、IRB承認プロトコールに基づいて、書面によるイ
ンフォームドコンセントを得たうえで、Conversant Biologicsから
得た。
(実施例8)
細胞調製
300万個の健常B細胞に関する研究では、ヘパリンナトリウム(BD)を有するVa
cutainer CPT細胞調製チューブに50mLの血液を採取し、1800×gで
20分間遠心分離し、細胞調製緩衝液(2%ウシ胎仔血清および2mM EDTAで補填
された1×PBS)で2回洗浄し、200×gのスピンを使用して血小板を除去し、得ら
れたPBMCを、RPMI−1640培地(Life Technologies)+2
0%ウシ胎仔血清+10%DMSOに、必要になるまで−80℃で凍結保存した。エマル
ジョン生成の前に、PBMCを解凍し、細胞調製緩衝液で2回洗浄し、計数した。ネガテ
ィブ選択に基づくヒトB細胞濃縮キット(Stem Cell Technologie
s)を製造業者の説明書に従って使用して、B細胞を単離した。20μm細胞ストレーナ
ーに細胞を通し、細胞調製緩衝液で6.2×10細胞/mL(300万個のB細胞での
実験)または3.1×10細胞/mL(PGTドナーおよび卵巣腫瘍での実験)に希釈
した。
(実施例9)
エマルジョン内での免疫受容体バーコード付与
エマルジョン生成プラットフォームは、親フッ素性にコーティングされた石英Dolo
mite小型2試薬チップ内への、2つの水相および1つの親フッ素性油連続相のコンピ
ュータ制御流動が可能になるように、単一の空気圧縮機により駆動され、各々がMito
s流速センサを有する3つのMitos Pポンプ(Dolomite Microfl
uidics)を備えていた。1つの水性インプットチャネルは、所望の1液滴当たりの
細胞占有レベルをもたらすように、必要とされる密度の細胞を含有し、第2の水性のチャ
ネルは、AbPair(商標)反応緩衝液およびオリゴヌクレオチド(www.abvi
tro.com/catalog AV2070−1SおよびAV2080−1S)、5
単位/μLのMuMLVに基づく逆転写酵素(Thermo Scientific)、
および0.1単位/μLのHerculase II PCRポリメラーゼを含む溶解お
よび反応混合物を含有していた。100μLのHamilton Microliter
シリンジを使用して、100μL内部径PEEKチューブ試料ループに、各々約100μ
LのLRミックスを2回のインジェクションで負荷した。100μLのHamilton
Gastightシリンジを使用して、約100μLの0.2mm内部径FEPチュー
ブループに、約110μLの細胞懸濁液を負荷した。エマルジョンは、チップの2つの油
チャネルから油を同時に流動させた2試薬チップに、水相を同一の流速で集中流噴射する
ことにより形成した。チップ出口チャネルを出るエマルジョンを、冷却ブロックに配置し
た0.2mLのPCRストリップチューブ(Eppendorf)内に滴下させ、その後
、過剰な油を、ピペットでチューブの底部から取り除き、40μLのオーバーレイ溶液(
25mM Na−EDTA、pH8.0)を添加し、チューブを、転写タグ化反応のため
に標準的サーモサイクラーに移した。45分間の逆転写(RT)ステップ中、標的特異的
RTプライマーを用いて、ランダム化分子バーコードを含有するユニバーサルアダプター
配列の鋳型スイッチに基づく付加により、RNAを42℃で逆転写した。RT後、エマル
ジョンを、40サイクルの熱サイクル(各サイクル:82℃で10秒間、65℃で25秒
間)にかけて、液滴バーコード鋳型のPCR増幅を実施し、それを、初期溶解および反応
混合物中で30,000cp/μLに希釈し、15,000cp/μLまたは約65pl
液滴当たり約1個の最終混合物中での濃度を生成した。液滴バーコードの一方の末端は、
Illumina読み取り2(「P7」)プライマー部位を含み、他方の末端は、ユニバ
ーサルアダプターオリゴヌクレオチドの共通配列とマッチングする。したがって、PCR
中、鋳型スイッチしたcDNAは、増幅された液滴バーコード鎖にアニーリングし、オー
バーラップ伸長によりスプライスされて、標的、分子バーコード、および液滴バーコード
配列を含有する全長産物を産生することができる。
(実施例10)
エマルジョン破壊、クリーンアップ、下流PCR、プール化、および配列決定
熱サイクル後、オーバーレイ溶液を、ピペットで取り除き、40μLエマルジョン破壊
溶液(1:1 FC−40:パーフルオロオクタノール)を、15μL溶解物クリアリン
グ溶液(12.5μL Qiagenプロテアーゼ、2.5μLの0.5M Na−ED
TA、pH8.0)と共に添加した。10回反転させてエマルジョンを破壊した後、混合
物を50℃で15分間、および95℃で3分間インキュベートして、プロテアーゼを不活
化した。15,000×gで1分間遠心分離して水相を単離した後、回収した物質を徹底
的に精製して、オリゴヌクレオチド、試薬、および過剰な液滴バーコードPCR産物を除
去した。全長産物は、RTプライマーの5’ビオチン化によりビオチンを含有するため、
ストレプトアビジンビーズをクリーンアップすることにより、それらは、過剰な液滴バー
コードPCR産物から効率的に分離することができ、したがって、オーバーラップ伸長法
に共通の問題である下流PCR組換えアーティファクトが最小限に抑えられる。まず、製
造業者の説明書を使用して1:1比のAMPure XPビーズ(Agencourt)
を使用し、その後、この場合も製造業者の説明書を使用してストレプトアビジンビーズ(
New England Biolabs)を使用してクリーンアップし、その後、95
℃の脱イオン水で溶出させ、その後1:1比のAMPure XPビーズで第2のクリー
ンアップを行うことにより、産物を精製した。その後、産物を、標的濃縮PCRに入れ、
BまたはT細胞受容体標的の定常領域に特異的なプライマーを、液滴バーコード配列のユ
ニバーサル末端に特異的なプライマーと共に使用した。このリバースプライマーは、製造
業者の説明書に従ってMiSeq機器でマルチプレックス配列決定するための6塩基イン
デックスバーコードも含んでいた。したがって、このステップでは、全長液滴バーコード
化標的配列のみが増幅される。まず、反応開始時に2分間の98℃ポリメラーゼ活性化ス
テップを含む製造業者の推奨条件下で、Q5ホットスタートポリメラーゼ(New En
gland Biolabs)を使用して、全ての標的を、98℃で10秒間;64℃で
20秒間;72℃で15秒間の7サイクルで一緒に増幅した。この後、1.5:1のビー
ズ:PCR比でAMPure XPクリーンアップを行った。その後、同じ熱サイクル条
件を以前と同様に使用して、各鎖(V、V、Vα、Vβ)を別々に標的とする第2の
7サイクルを実施し、その後、AMPure XPクリーンアップを行った。その後、同
じ熱サイクル条件および5〜15サイクル(qPCRにより判断される収量に応じて)で
、全長Illumina配列決定アダプターを付加し、TapeStation D10
00(Agilent)定量化に十分な物質を生成する最終PCRを実施した。その後、
ライブラリーをプールし、V3 2×300bp MiSeqプラットフォーム(Ill
umina)で配列決定した。
(実施例11)
MiSeqプラットフォームの改変
BCRまたはTCRの完全な可変V(D)J領域の再構成には、2つのペアエンドIl
lumina読み取りを繋ぎ合わせることが必要である。このプロセスを向上させるため
、2×300bpキットのフォワード読み取りを325bpに延長した。免疫受容体ライ
ブラリーは、定常領域プライマー部位の多様性を制限するため、10%phiXスパイク
インを使用して、ライブラリー多様性の制限という問題を軽減した。
(実施例12)
読み取りのバイオインフォマティクス処理の概要
pRESTOパッケージ(バージョン0.4)の周辺に組み立てた特注パイプラインを
使用して、Illumina MiSeq読み取りを処理して、各液滴からmRNA分子
の全長コンセンサス配列を生成し、IgBLASTおよび/またはIMGT/HighV
−QUESTで注釈を付け、特注スクリプトおよびChange−Oパッケージを用いて
、さらにアラインし、フィルタリングし、および処理して、統計情報を生成した。
(実施例13)
読み取り処理および注釈、アイソタイプ帰属。
生読み取り処理、V(D)J注釈、およびクローンの帰属は、pRESTOおよびCh
ange−Oパッケージを利用して特注パイプラインで実施した。手短に言えば、生Il
luminaペアエンド325+300bp読み取りを品質管理し、プライマートリミン
グし、液滴特異的(DB)および分子特異的バーコード(MB)を、プライマー部位のフ
ァジーマッチングにより識別した。まとめると、DBおよびMBにより由来分子が固有に
識別され、この固有な分子識別子(UMI)を使用して、同じ分子から生じる一致PCR
複製読み取り(最小で2つ)をグループ化し、各mRNA配列のコンセンサスを生成する
。アイソタイプ特異的プライミングは、プライマートリミングされた配列内の既知のアイ
ソタイプ特異的定常領域のファジーマッチングにより確認した。V(D)J生殖系列セグ
メントおよび再配置構造を、IgBLASTを使用して決定し、IMGT/HighV−
QUESTで確認し、適切な場合は、Change−Oおよび特注スクリプトで解析した
マッチングするIGHV遺伝子、IGHJ遺伝子、および接合部長を有する機能性V(
D)J配列を、Change−Oに実装されているように、グループ内で単一連鎖クラス
ター化することにより、クローンを帰属させた。300万個の循環細胞データセットでは
、対称化トランジション/トランスバージョンモデルを使用して、4.0の重みが加えら
れたクローン内距離を、クローン内の最近傍距離カットオフとして使用した。
(実施例14)
液滴免疫受容体含有フィルタリングおよび対合フィデリティー算出
液滴からB細胞配列を回収する精度は、本バーコード付与法により2つのやり方:液滴
内mRNA配列一致および交差画分対合一致を使用してアセスメントすることができる。
各液滴内では、1遺伝子座当たり複数のmRNAが捕捉され、1つの細胞に由来する発現
V(D)J配列は、一致するはずである。配列一致を規定する、複数のアラインされたV
(D)Jセグメントの2%配列多様性(平均のペアを成すヌクレオチド差pi55<0.
02)のカットオフを使用して、1液滴当たり1つよりも多くの生産的VDJおよび1つ
の生産的VJ配列の存在を、推定免疫受容体含有または複数細胞占有として、バイオイン
フォマティクス的に目印を付ける。対立遺伝子排除的な液滴毎に重鎖および軽鎖コンセン
サス配列を組み立て、クローン規定および交差画分対合分析に使用した。300万個の循
環B細胞データセットでは、各V系列は、データセット中の>20,000個の軽鎖ク
ローンの1つ(理想的な場合)と関連している。Vペアを有する259,368個
の免疫遺伝子座排除的な液滴中、10,870個のVDJ重鎖遺伝子座再配置クラスター
が、少なくとも6つの物理的に分離されたエマルジョン画分の2つに存在していた。これ
らクラスターは、増殖系列であるか、または同じVJエクソンの、独立しているが類似の
再配置であるかのいずれかを表わす。VDJ再配置が、2つの複製で一貫したVJ再配置
と対合している場合、両実験は、独立して真の陽性をもたらした(より希少な再配置を有
する2,604個のクローンの35,922個の考え得るペアを成す比較のうち33,1
57個)。したがって、各複製の精度は、96.1%(0.923^0.5)である。
(実施例15)
HIV bNAb候補配列の発見
本発明者らの38,620個のVペアを、tblastx、MUSCLE、およ
びPhyMLを使用して文献から選別した既知のbNAb HCDR3、VDJ配列、お
よびドナー17系列との類似性について探索することにより、HIVの新しいネイティブ
に対合した広域中和抗体(BNAb)を発見し、その後、完全なV(D)Jアミノ酸配列
の系統樹を手作業で検査して、既知のbNAb配列で分散されている抗体候補を選択した
(実施例16)
HIV bNAbタンパク質発現および精製
抗体配列を合成し、以前に記載されている重鎖および軽鎖ベクターにクローニングした
。重鎖および軽鎖プラスミドを、製造業者のプロトコールに従って293fectin(
Invitrogen)を使用して、293FreeStyle細胞に同時トランスフェ
クトした(1:1比)。抗体上清を、トランスフェクトの4日後に採集し、プロテインA
親和性クロマトグラフィーで精製した。精製した抗体を、さらなるアッセイで使用する前
にPBSで緩衝液交換した。
(実施例17)
擬似ウイルス産生および中和アッセイ
HIV−1 Env発現プラスミドおよびEnv欠損ゲノムバックボーンプラスミド(
pSG3ΔEnv)を293T細胞にトランスフェクトすることにより、擬似ウイルスを
生成した。トランスフェクション72時間後に、擬似ウイルスを、中和アッセイで使用す
るために採集した。単一ラウンドの複製擬似ウイルスアッセイおよびTZM−Bl標的細
胞を使用して、中和活性をアセスメントした。手短に言えば、TZM−Bl細胞を、96
ウェル平底プレートに播種した。このプレートに、擬似ウイルスを添加し、それを、抗体
の系列希釈物と共に37℃で1時間、事前にインキュベートした。感染72時間後に溶解
し、Bright−Gloルシフェラーゼ基質(Promega)を添加して、ルシフェ
ラーゼレポーター遺伝子発現を定量化した。IC50値を決定するために、用量反応曲線
を非線形回帰法でフィッティングした。
(実施例18)
卵巣腫瘍標的鎖の同定識別
エマルジョン中の卵巣解離腫瘍組織からBCRおよびTCRを同時に捕捉した後、以前
に記載されるように分子および液滴バーコードを使用して読み取りをフィルタリングした
が、その後、4つの考え得る標的鎖タイプ(BCR V、BCR V、TCR Vα
、TCR Vβ)の各々の存在を探した。各々が少なくとも2つの配列決定読み取りを有
する少なくとも2つのmRNAにより支持されていた場合、標的鎖を保持した。BCR
またはTCR VαVβペアのみを含有する全ての液滴バーコードを、さらに分
析した。BCR重鎖およびTCRベータ鎖クローンを、個別のCDR3アミノ酸配列に基
づいてコールした。
(実施例19)
DNA標識抗体染色によるエマルジョン内のタンパク質検出
一本鎖200bp DNAオリゴヌクレオチドを、固有の5bp抗原ID配列を含有す
るように設計し、5’アミノ基で修飾した(Integrated DNA Techn
ologies)。マウスモノクローナル抗ヒトCD4(BioLegend、#300
516)およびCD8a(BioLegend、#301018)抗体を、製造業者のプ
ロトコールに従ってThunder−Linkキット(Innova Bioscien
ces)を使用して、DNAオリゴヌクレオチドタグにコンジュゲートした。エマルジョ
ン前の細胞標識化では、末梢血に由来する200万個のネガティブ選択されたT細胞を、
400μL細胞緩衝液+2mM EDTA+0.05%アジ化ナトリウムで希釈した。一
本鎖サケ精子DNAを、200μg/mLの最終濃度で細胞に添加し、細胞を室温で5分
間回転させた。CD4およびCD8a DNA標識抗体の混合物(各々、5nMの最終濃
度)を細胞に添加し、30分間室温でインキュベートした。細胞を、細胞緩衝液+2mM
EDTA+0.05%アジ化ナトリウム+200μg/mL一本鎖サケ精子DNAで3
回洗浄した。エマルジョン分析に入る前に、細胞を、細胞緩衝液+0.05%アジ化ナト
リウムに再懸濁した。30,000個の細胞を、エマルジョン配列決定に使用した。
(実施例1)
T細胞集団中の単一Tリンパ球のイムノタイピング
本明細書に記載されているイムノフェノタイピング法を、ヒトTリンパ球におけるCD
4およびCD8のmRNAならびに表面タンパク質発現の両方を分析することにより検証
た。通常、成熟T細胞は、CD4サブタイプまたはCD8サブタイプのいずれかである
と予想される。CD4サブタイプは、CD4 mRNAおよびCD4タンパク質を共に発
現するはずであるが、CD8 mRNAまたはCD8タンパク質のいずれかを発現するは
ずである。CD8サブタイプは、CD8 mRNAおよびCD8タンパク質を共に発現す
るはずであるが、CD4 mRNAまたはCD4タンパク質のいずれかを発現するはずで
ある。

(実施例3)
健常血液試料からのB細胞Vペア対の大規模回収
最初に、本技術を開発し、対合能力およびスループットを、陰性ビーズ濃縮により健常
ボランティアの末梢血から単離された300万個のB細胞でアセスメントした。エマルジ
ョンを6つの別々の画分に分割し、それらを並列で処理し、配列決定前に再混合しなかっ
た。エマルジョンを、1液滴当たり0.2細胞になるように装填した。これは、占有液滴
の約90%が単一細胞を含有するというポアソン期待値をもたらし、エマルジョン液滴観
察と一致していた(図A)。エマルジョン破壊および追加のライブラリー処理ステップ
を行った後、Illumina MiSeqを用いて、ペアエンド325+300bp配
列決定を実施した。配列決定データを処理するため、液滴および分子バーコードを共に使
用して、元々の各mRNA分子からPCR複製読み取りを収集し、各mRNAについてコ
ンセンサスを決定して、少なくとも2つの読み取りから組み立てられたmRNA配列のみ
を維持した。フォワードおよびリバース読み取りを繋ぎ合わせて、5’UTR、完全V(
D)J配列、およびアイソタイプ決定に十分な定常領域を含む全長産物を生成した。IM
GT High−VQuestおよび/またはIgBLASTを用いて、再配置された免
疫グロブリン重鎖および軽鎖配列に注釈を付けた。
得られたデータセットは、少なくとも1つの重鎖(V)および1つの軽鎖(V)m
RNAと関連していた324,988個の液滴バーコードを含有し、重鎖クラスター分析
で評価して229,869個の異なるVクローン系列が存在していた。この生セットは
、複数細胞ならびに単一細胞液滴に由来するデータを含むため、非一致の重鎖または軽鎖
V(D)J配列に関連した液滴バーコードをフィルタリングして取り除くことにより、単
一細胞液滴に由来するデータを濃縮した(図B)。このことを実施することが可能であ
るのは、典型的な免疫レパートリーの多様性が高いためであり、2つのランダム細胞に由
来するVまたはV mRNAがマッチングすることは、ほとんど全くないだろう。得
られた濃縮データセットは、259,368個のV液滴バーコードを含み、182
,745個のVのクローン系列を含有していた。これは、現在までで最も高深度の対合
した免疫レパートリーのサンプリングであることをほぼ間違いなく示す。クローン的に関
連する細胞は、それらのV対合が一貫しているはずであるため、クローン拡大の発
生を識別することにより、V対合の精度を直接的に評価した。1つよりも多くのエ
マルジョン画分で、クローン的に拡大した細胞であることが高い信頼性で観察された2,
604個のVクローンが識別された。これらVクローンと対合したV配列は、画分
間の一貫性が非常に高く、96.1%の対合精度を示した。これにより、259,368
個のVペアのフィルタリングされたデータセット全体に高い信頼性が与えられた。
交差画分VおよびV配列は、各画分にて異なる液滴および分子バーコードと関連する
ことが常であり、したがってライブラリー交差汚染を示さなかった。一部のB細胞は複数
の軽鎖を発現することが公知であるため、分析は、対合精度を過小評価する場合がある。
259,368個のフィルタリングされたV液滴バーコードまたは「Vペア
」の75.0%は、IgMおよび/またはIgDを含有していた(図C)。これは、未
感作ナイーブB細胞は典型的にはIgMIgD表現型であることを考慮すると、予想
通り一緒に観察されることが多かった。より少ないがかなりの割合のIgA(18.3%
)およびIgG(6.6%)Vペアも見出された。Vアイソタイプは全て、約3
:2の比率でIgκまたはIgλのいずれかと対合した。182,745個のVクロー
ン系列中のクローン拡大を2つの方法でアセスメントした:クローンに関連する液滴バー
コードの数;およびエマルジョン画分にわたるそのクローンの観察。複数の液滴バーコー
ドでクローンが見られることは、クローン拡大を反映する場合もあり、または複数バーコ
ード液滴を反映する場合もある。初期λ=1であったこと、つまり液滴内へのバーコード
の分散がポアソン分散であったことを考慮すると、液滴の約37%で複数バーコード液滴
が予想された。しかしながら、>8つの液滴バーコードにより表わされるクローンは全て
、間違いなく拡大性である可能性が高い(単一液滴中のポアソン確率は、<10−6)。
全体でクローンの6.0%が1つよりも多くの画分で見られたが、8つよりも多くの液滴
バーコードで見られたクローン(全体で0.7%)の場合、それらの99%は、1つより
も多くの画分で見られた。100個の最も高頻度のクローン(各々30〜137個の液滴
バーコード、図D)は全て、6つの画分の少なくとも5つで見られた。したがって、バ
ーコード計数および独立した画分分析を組み合わせると、非増殖クローンの厖大なバック
グラウンドの中から、希少な拡大系列を検出することが可能になる。しかしながら、最も
多量の拡大したクローンでさえ、1000個に1個未満の細胞にしか存在していなかった
ことは注目すべきことであり、ヒト末梢免疫レパートリーの多様性が非常に高いことを例
示している。
発現レベルの推定としての、ペア内の各VおよびV鎖の捕捉mRNAの数(図
)。概して、1液滴バーコード当たり10個未満の重鎖(平均2.0)および軽鎖(平均
4.0)mRNAが捕捉され、1細胞当たり、数ダース〜数百個の捕捉重鎖および軽鎖m
RNAを有する液滴バーコードの小集団が、ほとんど排他的にIgGおよびIgA発現細
胞から観察された。興味深いことには、ペア内のVおよびV突然変異の程度は、各ア
イソタイプ(例えば、IgGの場合は、V対V)内、およびアイソタイプ間(例えば
、IgG対IgM)の両方で、強い相関性を示した(図F)。さらに、IgGおよびI
gA対はほとんど全てが、VおよびV鎖の両方にかなりの突然変異を示したが、Ig
MおよびIgDペアはほとんどが、VまたはV突然変異をほとんど示さなかった。こ
うした結果は、B細胞活性化の機序と一致し、IgMおよびIgDからIgGまたはIg
Aへのクラススイッチ、免疫グロブリン発現の増加、ならびに細胞の重鎖および軽鎖遺伝
子座の両方に影響を及ぼす体細胞超変異に至る。高度に突然変異を起こしたV鎖は、高
度に突然変異を起こしたV鎖と対合する傾向があるというこの観察に加えて、本方法は
、休止ヒトB細胞レパートリーに由来する多数の全長のネイティブに対合したBCRを生
成することが可能である。
(実施例4)
HIV長期非進行者からの公既知の低頻度V対ペアの回収。
アッセイの対合感度および正確性のさらなる検証として、いくつかの希少な(10,0
00個の細胞中、<1個の細胞)ネイティブV対合が既に既知である試料を処理し
た。HIV長期非進行患者から末梢B細胞を得た。この患者のメモリB細胞は、HIV中
和活性を示す抗体が近年詳細に探索されている。350,000個のB細胞を処理して、
合計38,620個のフィルタリングされたVペアを生成した。興味深いことには
、この個体は、以前の健常試料(図A)または典型的な健常末梢B細胞レパートリーよ
りも高い割合のIgGを示した。このデータセットに由来するV配列を、PGT121
を含む、この個体に由来する全ての報告されている広域中和抗体(bNAb)と比較し、
8つの類似または同一のV配列を見出した。これは、bNAbのこのファミリーが循環
B細胞の0.03%未満であることを示す。重要なことには、これら重鎖と対合した全て
の軽鎖は、予想される同様に希少のbNAb系列のものであり、以前に報告されているよ
うに、同じIgλ−V3−21/J3再配置および特徴的な3コドン挿入を示し、本発明
者らの方法の正確性および感度が高いことが支持された。さらに、この個体に由来する、
全ての既知の新らたに生成されたPGT121様Vペアの系統樹(図B)では、
およびVツリーは、鏡像様位置を占める対合したVおよびV配列と非常に類似
したトポロジーを示しており、これは、系統発生史が共通していることを反映している可
能性が高い。ここで発見されたバリアントペアは、このルールに良好に当てはまる。興味
深いことには、2つの発表されている抗体PGT122およびPGT123は、例外であ
ると考えられ、これら2つの対合を支持するものは見出されなかったが、その代わりに、
PGT122V:PGT123V様のおよびPGT123V:PGT122V
のペアが見出された。これは、元々の報告書では確認されていない対合を示している。8
つの新規なPGT様Vペアの完全なV(D)J領域をコードするDNAを合成し、
抗体を完全IgGとして発現させ、複数のHIV擬似系統を中和する能力を試験した(図
C)。抗体は良好に発現され、全てがウイルスに対する強力な中和活性を示し、関連す
る生物学的試料からネイティブに対合した機能性抗体バリアントを迅速に生成する本発明
者らの手法の有用性が実証された。
(実施例5)
腫瘍浸潤リンパ球に由来するB細胞およびT細胞受容体対ペア
対合した受容体をハイスループットで回収するためにエマルジョンバーコード付与が検
証されたことを受けて、免疫受容体を、腫瘍から直接回収した。プロテアーゼで分離され
た切除卵巣腺癌試料を得、400,000個のソーティングされていない細胞をエマルジ
ョンに入れた。別々の等量の試料をCD3/CD19染色することにより、かなりの数の
浸潤性B(約5%)およびT細胞(約20%)が物質中に存在することが示唆された。エ
マルジョン中の単一細胞分散系は、いくつかの限定的な塊が視認されたとはいえ、精製細
胞と類似しており、試料の細胞タイプが不均質であったことを考慮すると予想通りに液滴
内の細胞サイズおよび形状に広範なばらつきがあった(図A)。
T細胞受容体アルファおよびベータ鎖の定常領域を共に標的とするプライマーを、以前
に使用されたBCRプライマーと共に使用し、配列決定およびストリンジェントなフィル
タリング後に、BCRまたはTCR産物にリンクする数千個の液滴バーコードを回収した
。単一細胞精度をアセスメントするため、液滴バーコード内の4つの標的遺伝子座(V
、V、Vα、Vβ)のあらゆる考え得る組合せを計数した(図B)。1つよりも多く
の標的鎖を有する液滴バーコードの大部分(97.9%)は、生物学的に予想されるBC
R V またはTCR VαVβの対合を含有し、混合BCR−TCR組合せは
2.1%しか含有されていなかった。産物のバーコード付与は、標的鎖に関して偏りがな
いため、この結果は、得られた6,056個のBCR Vおよび5,217個のT
CR VαVβペアの信頼性を高度化することが可能である。BCRでは、他のアイソタ
イプと比較して、IgG(>80%)が著しく優勢であったが(図C)、全てが存在し
た(IgE<0.05%のみ)ことが示された。カッパおよびラムダ軽鎖は、末梢血デー
タセットと同様の比率で存在した。
末梢血と同様に、BCRアイソタイプとVおよびV鎖の両方の突然変異レベルとの
間に相関性が観察され、IgGおよびIgAペアは、IgDおよびIgMよりも大きなV
およびV突然変異、ならびに各アイソタイプ内でのVおよびV間の突然変異の一
般的相関性を示した(図D)。興味深いことには、IgD、IgM、およびIgAペア
は、腫瘍と末梢血データセットとの間で非常に類似した突然変異分布を示した。また、腫
瘍IgG画分は、末梢血では観察されなかった、ほとんど突然変異していないかまたは全
く突然変異してない配列をかなりの割合で含有していた。TCRの場合、およびIgDを
含有するBCRの場合、1液滴バーコード当たり、末梢血のBCR結果と同様の数の捕捉
mRNAが観察された(図8E、ほとんどが1液滴バーコード当たり<10)。極めて対
照的だが、腫瘍由来のIgM、IgA、およびIgGペアは、10〜100倍の平均発現
レベル増加を示し、液滴バーコードの多くには数百または数千個の標的mRNAが捕捉さ
れた。その後、捕捉TIL−TCRおよびBCRレパートリーの多様性をアセスメントし
た(図F)。5,217個の合計TCRペアの中で、2,423個の異なるTCRベー
タクローンが観察された。7つのクローンが、>1%の頻度で存在し、上位クローンは、
全ての液滴バーコードの16.9%に相当した。6,056個の合計BCRペア中で、1
,518個の異なる重鎖クローンが観察され、15個のクローンが>1%の頻度であった
が、>5%の頻度のものはなかった。これは、多様性が、健常末梢BCRレパートリーよ
りも実質的により制限されていることを表わしているが(0.06%を超える頻度で存在
するクローンはなかった)、クラス転換し、突然変異を起こし、高度に発現されたクロー
ンが、腫瘍試料中に非常に多く存在することは、TILを特徴付けるためには、高深度で
高感度のサンプリング手法が必要であることを示す。本方法は、規定されたTIL集団を
事前にソーティングまたは外因的活性化する必要なく、BおよびT細胞の両方から同時に
、多数のTIL免疫受容体ペアを迅速に回収することを可能にする。
(実施例6)
追加の目的の表現型マーカーの捕捉
液滴バーコード付与による受容体鎖の対合は、潜在的に、免疫受容体の他に追加の標的
の捕捉を可能にする。この可能性を調査するため、CD4およびCD8集団に入る健
常T細胞を、磁気ビーズ濃縮により分離し、各タイプの20,000個の細胞を別々のエ
マルジョンに入れ、TCRアルファおよびベータ鎖を標的とするプライマーならびにCD
4およびCD8のmRNAを用いて実験を行った。配列決定後、CD4単離細胞に由来
するTCR VαおよびVβ(「TCRペア」)を含有する3,861個の液滴バーコー
ドの47.0%は、CD4 mRNAに関連していたが、CD8 mRNAに関連したも
のは0.3%に過ぎなかった。反対に、CD8単離細胞に由来する2,235個のTC
Rペアの50.6%が、CD8 mRNAにリンクしていたが、CD4 mRNAにリン
クしていたものは0.6%に過ぎなかった。これは、以前の報告と同様に、細胞表現型を
決定するためのmRNAに基づく手法は、高特異性だが、感度に制限があることを示す。
対照的に、細胞表面受容体等のタンパク質は、通常、それらのコードmRNAよりも非常
に大きな数(1細胞当たり1,000〜100,000個)で存在し、検出がより容易で
ある可能性が高いだけでなく、より直接的に細胞表現型と関連する可能性が高い。各細胞
での標的タンパク質レベルを測定するため、特注オリゴヌクレオチドDNA標識を、抗ヒ
トCD4およびCD8抗体にコンジュゲートし、標識抗体を、30,000個の細胞をエ
マルジョンに入力する前に、CD4およびCD8 T細胞の未分離混合物と共にイン
キュベートした(図A)。DNA標識は、抗体特異的配列タグだけでなく、分子バーコ
ード、および増幅された液滴バーコードに相補的な配列を担持し、mRNAでの実施と同
様に、エマルジョン液滴バーコード付与、および分子計数を可能にする。DNA標識、な
らびにTCR、CD4、およびCD8 mRNAを、同時に標的とした。配列決定および
フィルタリング後、3,682個の液滴バーコードを、高い信頼性でTCR VαVβペ
アであると識別した。以前の実験と一致して、TCRペアのおよそ半分(52%)を、m
RNAに基づいてCD4またはCD8ステータスに帰属させることができた(図3B〜3
)。しかしながら、液滴バーコードの95%超は、タンパク質ステータスに基づいてC
D4またはCD8に帰属させることができ、1液滴当たりの平均分子計数は、CD4/8
タンパク質(平均20.5)が、CD4/8 mRNA(平均1.0)よりもかなり高か
った。mRNAおよびタンパク質決定が両方とも合致していたことを考慮すると、mRN
Aとタンパク質シグナルとの間の合致率は高く(図3D)、液滴の96.0%だった。一
部の希少な例では、CD4およびCD8タンパク質の両方が検出された。これは、液滴が
、2つまたはそれよりも多くの細胞を含有していた結果であると考えられた。エマルジョ
ンバーコード付与により、単一細胞免疫受容体を、目的のmRNAおよびタンパク質マー
カーと、全てハイスループットで直接的に関連付けることが初めて可能になった。抗PD
−1および抗CTLA−4等の拡大された免疫腫瘍学的関連マーカーセットを用いて、こ
の手法をTILに応用することは、保証されている。

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  1. 明細書に記載の発明。
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