CN114051534A - 单细胞染色质免疫沉淀测序测定 - Google Patents

Abstract

本文的公开内容包括用于标记细胞中核靶缔合的DNA的系统、方法、试剂盒和组合物。一些实施方案提供了包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂的消化组合物。一些实施方案提供了包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂的缀合物。转座体可以包含转座酶(例如Tn5转座酶)、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。方法可以包括使包含与dsDNA(诸如基因组DNA(gDNA))缔合的核靶的透化的细胞与本文提供的组合物接触以产生多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)，所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段各自包含一个或两个单链突出端。

Description

单细胞染色质免疫沉淀测序测定

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2019年7月22日提交的美国临时申请第62/876,922号的优先权以及2020年7月9日提交的美国临时申请第63/049,980号的优先权。这些申请的全部内容以此明确地通过引用以其整体并入本文。

序列表参考

本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为题为Sequence_Listing_68EB_298713_WO的文件，创建于2020年7月10日，大小是4千字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入本文。

背景

领域

本公开内容总体涉及分子生物学领域，例如标记单细胞中与DNA缔合的核靶。

对现有技术的描述

当前的技术允许在每个细胞与隔室(compartment)中的条形码化试剂珠共定位时通过使细胞特异性寡核苷酸条形码附接到来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模平行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。有对于用于标记单细胞中核靶缔合DNA的系统和方法的需要。

概述

本文的公开内容包括标记细胞中核靶缔合的DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化。dsDNA可以是基因组DNA(gDNA)。方法可以包括：使核靶与消化组合物接触以产生各自包含单链突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)，所述消化组合物包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中每种结合试剂包含含有针对所述结合试剂的独特标识符序列的结合试剂特异性寡核苷酸。方法可以包括：使用第一多于一种寡核苷酸条形码将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段各自包含与核靶缔合的dsDNA片段的至少一部分互补的序列，其中第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交的第一靶结合区。条形码化核靶缔合的DNA片段可以是，例如，单链的或双链的。方法可以包括：使用第二多于一种寡核苷酸条形码将结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化以产生多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与独特标识符序列的至少一部分互补的序列，其中第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的第二靶结合区。

在一些实施方案中，使核靶与消化组合物接触包括使消化组合物与透化的细胞接触。在一些实施方案中，使核靶与组合物接触包括使结合试剂和DNA消化酶进入透化的细胞并且结合试剂与核靶结合。在一些实施方案中，消化组合物包含含有结合试剂和消化酶的融合蛋白，任选地其中融合蛋白的尺寸被设置(sized)以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，消化组合物包含含有结合试剂和消化酶的缀合物，任选地其中缀合物的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，DNA消化酶包含能够与结合试剂特异性结合的结构域。在一些实施方案中，DNA消化酶的结构域包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种。在一些实施方案中，结合试剂和DNA消化酶在与透化的细胞接触时彼此分开，并且其中结合试剂和DNA消化酶分别地进入细胞。在一些实施方案中，DNA消化酶在细胞的核内与结合试剂结合。在一些实施方案中，DNA消化酶在进入细胞的核之前与结合试剂结合，并且其中与结合试剂结合的DNA消化酶的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，DNA消化酶在结合试剂与核靶结合前与结合试剂结合。在一些实施方案中，与结合试剂结合的缀合物、融合蛋白和/或DNA消化酶具有不多于120nm的直径。

在一些实施方案中，第一靶结合区与核靶缔合的dsDNA片段的单链突出端的至少一部分互补。在一些实施方案中，使核靶与消化组合物接触产生包含结合试剂、DNA消化酶和核靶缔合的dsDNA片段的复合物，并且其中将多于一种核靶缔合的dsDNA片段条形码化包括使所述复合物与第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码接触，任选地包括在条形码化后用蛋白酶消化复合物，进一步任选地蛋白酶包括蛋白酶K。在一些实施方案中，DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I(Mnase I)、转座酶、其功能片段或其任何组合，任选地转座酶包括Tn5转座酶，进一步任选地消化组合物包含具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子中的至少一种。在一些实施方案中，将结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化包括使与结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的第二多于一种寡核苷酸条形码延伸，任选地结合试剂寡核苷酸包含与第二靶结合区互补的序列。方法可以包括获得多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列数据，任选地其中获得多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。

本文的公开内容包括标记细胞中核靶缔合的DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化。dsDNA可以是基因组DNA(gDNA)。方法可以包括：使核靶与缀合物接触以产生各自包含第一5’突出端和第二5’突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段，所述缀合物包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及使用第一多于一种寡核苷酸条形码将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，其中第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交的第一靶结合区。条形码化核靶缔合的DNA片段可以是，例如，单链的或双链的。

在一些实施方案中，将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化包括将核靶缔合的dsDNA片段或其产物连接到第一多于一种寡核苷酸条形码。在一些实施方案中，将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化包括使杂交到多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的第一多于一种寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，第一衔接子包含第一条形码序列，并且第二衔接子包含第二条形码序列。在一些实施方案中，第一条形码序列和/或第二条形码序列标识核靶。在一些实施方案中，第一5’突出端和/或第二5’突出端包含多(dA)区、多(dT)区或其任何组合。在一些实施方案中，第一5’突出端和/或第二5’突出端包含与第一靶结合区互补的序列或其互补体。在一些实施方案中，第一靶结合区包含与核靶缔合的dsDNA片段的5’区、3’区或内部区的至少一部分互补的序列。在一些实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子包含转座子的DNA末端序列。

在一些实施方案中，透化包括化学透化或物理透化。在一些实施方案中，透化包括使细胞与去污剂和/或表面活性剂接触。在一些实施方案中，透化包括通过声处理使细胞透化。方法可以包括：使细胞中的核透化以产生透化的核。方法可以包括：在使核透化前固定包含核的细胞。

在一些实施方案中，核靶包括甲基化的核苷酸、DNA缔合的蛋白、染色质缔合的蛋白或其任何组合。在一些实施方案中，核靶包括ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol II Ser2P、RNAPol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂与表位特异性结合，所述表位包括选自由以下组成的组的甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(sumoylated)(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化或其任何组合。

在一些实施方案中，结合试剂包含四聚体、适配体、蛋白支架或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂包含抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体或其片段包括单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体(diabody)、三特异抗体(triabody)、四特异抗体(tetrabody)、多特异性抗体(multispecific antibody)、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体(nanobody)、适配体、亲和体(affibody)、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体(monobody)或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与转座体缀合。在一些实施方案中，缀合物通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。在一些实施方案中，缀合物通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。在一些实施方案中，缀合物通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。在一些实施方案中，结合试剂经由蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种与转座体缀合。在一些实施方案中，转座酶包括Tn5转座酶。在一些实施方案中，转座体包含与结合试剂特异性结合的结构域，其中结合试剂和转座体在与透化的细胞接触时彼此分开，并且分别进入细胞，并且其中转座体在细胞的核内与结合试剂结合。在一些实施方案中，转座体在进入透化的细胞前与结合试剂结合，并且其中与结合试剂结合的转座体的尺寸被设置以通过核孔进入细胞的核。在一些实施方案中，缀合物具有不多于120nm的直径。在一些实施方案中，结合试剂和转座体各自的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，透化的细胞包含含有染色质的完整的核，染色质在结合试剂与核靶结合时保持与基因组DNA缔合。在一些实施方案中，结合试剂与核靶的结合发生在透化的细胞的核中。

方法可以包括：获得多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物的序列数据。方法可以包括：基于获得的测序数据中的多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物的序列确定与gDNA相关的信息。在一些实施方案中，确定与gDNA相关的信息包括基于获得的测序数据中多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列确定gDNA的基因组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA缔合的核小体。在一些实施方案中，确定gDNA的基因组信息包括：通过使多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列与gDNA的参考序列比对来确定gDNA的至少一部分序列。在一些实施方案中，确定与gDNA相关的信息包括基于获得的测序数据中多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列确定gDNA的甲基化组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA缔合的核小体。方法可以包括：对多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一种转化的(例如亚硫酸氢盐转化的)核靶缔合的dsDNA片段。在一些实施方案中，将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化包括将多于一种转化的(例如亚硫酸氢盐转化的)核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化。化学转化可以包括亚硫酸氢盐处理，并且酶促转化可以包括APOBEC介导的转化。在一些实施方案中，确定甲基化组信息包括：确定测序数据中多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段具有胸腺嘧啶碱基的位置以及gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定gDNA中具有5-甲基胞嘧啶(5mC)碱基和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基的相应位置。方法可以包括：Hi-C、染色质构象捕获(3C)、环化染色质构象捕获(4C)、碳拷贝染色体构象捕获(5C)、染色质免疫沉淀(ChIP)、ChIP-Loop、组合3C-ChIP-克隆(6C)、捕获-C或其任何组合。方法可以包括Hi-C/ChiP-seq。方法可以包括ChiP-seq。

在一些实施方案中，细胞包含核酸靶的拷贝。方法可以包括：使第二多于一种寡核苷酸条形码与核酸靶的拷贝接触进行杂交；使与核酸靶的拷贝杂交的第二多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化核酸分子，所述多于一种条形码化核酸分子各自包含与核酸靶的至少一部分互补的序列和分子标记；以及获得多于一种条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定细胞中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，使第一多于一种寡核苷酸条形码和/或第二多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使多于一种寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，DNA聚合酶包括Klenow片段。在一些实施方案中，逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地其中病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。在一些实施方案中，核酸靶包括核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞成分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。在一些实施方案中，第一靶结合区和/或第二靶结合区包含多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。

在一些实施方案中，获得多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物。在一些实施方案中，获得多于一种条形码化核酸分子的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一种条形码化核酸分子或其产物。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列，并且其中第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第二通用序列。在一些实施方案中，第一通用序列和第二通用序列是相同的。在一些实施方案中，第一通用序列和第二通用序列是不同的。在一些实施方案中，第一通用序列和/或第二通用序列包含以下的结合位点：测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码各自包含分子标记。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的每种分子标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码与固体支持物缔合。在一些实施方案中，与相同的固体支持物缔合的第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码各自包含相同的样品标记。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的每种样品标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的每种细胞标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，与相同的固体支持物缔合的第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记。在一些实施方案中，与不同的固体支持物缔合的第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。

在一些实施方案中，固体支持物包括合成颗粒、平坦表面，或其组合。方法可以包括：使包含第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的合成颗粒与细胞缔合。方法可以包括：在使合成颗粒与细胞缔合后将细胞裂解，任选地将细胞裂解包括加热细胞、使细胞与去污剂接触、改变细胞的pH，或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒和单细胞在同一分区(partition)中，并且任选地该分区是孔或液滴。一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码是固定或部分地固定在合成颗粒上的，或者第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码是包封或部分地包封在合成颗粒中的。在一些实施方案中，合成颗粒是可破坏的，任选地是可破坏的水凝胶颗粒。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠，任选地珠包括琼脂糖凝胶珠(sepharose bead)、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠(agarose bead)、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，以及其任何组合。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含接头官能团。在一些实施方案中，合成颗粒包含固体支持物官能团。在一些实施方案中，支持物官能团和接头官能团彼此缔合，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。

本文的公开内容包括试剂盒。试剂盒可以包含消化组合物，所述消化组合物包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中结合试剂包含结合试剂特异性寡核苷酸，该结合试剂特异性寡核苷酸包含针对结合试剂的独特标识符序列。

在一些实施方案中，DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I、转座酶、其功能片段或其任何组合，任选地，转座酶包括Tn5转座酶，进一步任选地消化组合物包含具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子中的至少一种。在一些实施方案中，消化组合物包含含有结合试剂和消化酶的融合蛋白，任选地其中融合蛋白的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，消化组合物包含含有结合试剂和消化酶的缀合物，任选地其中缀合物的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，DNA消化酶包含能够与结合试剂特异性结合的结构域，任选地DNA消化酶的结构域包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种，进一步任选地与结合试剂结合的DNA消化酶的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。试剂盒可以包含：蛋白酶(例如蛋白酶K)。

本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：缀合物，所述缀合物包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。试剂盒可以包含：缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶包括Klenow片段。试剂盒可以包含：逆转录酶，任选地其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，并且任选地病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。试剂盒可以包含：连接酶。试剂盒可以包含：去污剂和/或表面活性剂。试剂盒可以包含：缓冲液、筒(cartridge)或两者。试剂盒可以包含：一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。

在一些实施方案中，核靶包括DNA缔合的蛋白或染色质缔合的蛋白。在一些实施方案中，核靶包括甲基化的核苷酸。在一些实施方案中，核靶包括ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol IISer2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂与表位特异性结合，所述表位包括选自由以下组成的组的甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂包含四聚体、适配体、蛋白支架或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂包含抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体或其片段包括单克隆抗体。在一些实施方案中，其中抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与转座体缀合。

在一些实施方案中，缀合物通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。在一些实施方案中，缀合物通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。在一些实施方案中，缀合物通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。在一些实施方案中，结合试剂经由蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种与转座体缀合。在一些实施方案中，转座酶包括Tn5转座酶。在一些实施方案中，缀合物具有不多于120nm的直径。在一些实施方案中，结合试剂和转座体各自的尺寸被设置以通过核孔扩散。

试剂盒可以包含：多于一种寡核苷酸条形码。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的每一种包含分子标记和靶结合区。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。第一多于一种寡核苷酸条形码和/或第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码可以包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交(例如互补)的靶结合区(例如第一靶结合区)，诸如5’突出端和/或3’突出端(例如第一衔接子的5’突出端、第二衔接子的5’突出端)。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码包含相同的样品标记和/或相同的细胞标记。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种样品标记和/或细胞标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种分子标记包含至少6个核苷酸。

在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种是部分地固定在合成颗粒上的。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种是固定或部分地固定在合成颗粒上的；和/或多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种是包封或部分地包封在合成颗粒中的。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠。在一些实施方案中，珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，以及其任何组合。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码中的每一种包含接头官能团。在一些实施方案中，合成颗粒包含固体支持物官能团。在一些实施方案中，支持物官能团和接头官能团彼此缔合。在一些实施方案中，接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白珠、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。

在一些实施方案中，描述了一种试剂盒。试剂盒可以包含结合试剂(例如，蛋白结合试剂)，所述结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与包含用于蛋白结合试剂的独特标识符的试剂寡核苷酸缔合，其中蛋白结合试剂与靶蛋白特异性结合。试剂盒可以包含含有DNA消化酶的融合蛋白，其中(i)融合蛋白包含与蛋白结合试剂特异性结合的结构域，或者(ii)融合蛋白与蛋白结合试剂结合。试剂盒可以包含含有第一靶结合区和样品标识符序列的第一寡核苷酸探针，其中第一靶结合区和与蛋白结合试剂缔合的试剂寡核苷酸的至少一部分互补。试剂盒可以包含含有第二靶结合区和样品标识符序列的第二寡核苷酸探针，其中第二靶结合区与DNA的至少一部分互补。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，靶蛋白包括DNA缔合的蛋白或染色质缔合的蛋白。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，靶蛋白选自由以下组成的组：ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol II Ser2P、RNA Pol II Ser5P、RNA PolII Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1、H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化，或者所列项目中的两项或更多项的组合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针包含相同的样品标识符序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针固定在基底上。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，基底是固体表面、珠、微阵列、板、管或孔。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，试剂盒还包含含有用于产生核酸文库的试试的组合物，其中试剂包含DNA限制性酶、核酸酶(诸如微球菌核酸酶)、溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶、Klenow聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7衔接子序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子中的至少一种。

在一些实施方案中，描述了标记单细胞的靶蛋白缔合DNA的方法。方法可以包括使包含靶蛋白的细胞透化。方法可以包括使透化的细胞与消化组合物接触，消化组合物包含与试剂寡核苷酸缔合的结合试剂(例如，蛋白结合试剂)，所述试剂寡核苷酸包含用于蛋白结合试剂的独特标识符，其中蛋白结合试剂与靶蛋白特异性结合。消化组合物可以包含DNA消化酶和能够与核靶(例如，核蛋白)特异性结合的结合试剂。组合物还可以包含含有DNA消化酶的融合蛋白，其中(i)融合蛋白还包含与蛋白结合试剂特异性结合的结构域，或者(ii)融合蛋白与蛋白结合试剂结合。蛋白结合试剂和融合蛋白可以进入透化的细胞。方法可以包括使透化的细胞的靶蛋白与蛋白结合试剂和结合到蛋白结合试剂的融合蛋白接触。方法可以包括使结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与细胞中的靶蛋白结合，其中细胞的DNA与靶蛋白缔合。方法可以包括用融合蛋白的DNA消化酶消化与靶蛋白缔合的DNA，消化的DNA包含单链突出端，从而形成复合物，复合物包含：蛋白结合试剂；融合蛋白；和消化的DNA。方法可以包括使复合物与第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针接触，所述第一寡核苷酸探针包含第一靶结合区和样品标识符序列，其中第一靶结合区与试剂寡核苷酸的至少一部分互补；第二寡核苷酸探针包含第二靶结合区和样品标识符序列。第二靶结合区可以与DNA的单链突出端的至少一部分互补。第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针可以包含相同的样品标识符序列。方法可以包括使寡核苷酸探针延伸以产生多于一种标记的核酸，标记的核酸包含样品标识符序列和试剂寡核苷酸的至少一部分或DNA的至少一部分的反向互补体。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，(i)融合蛋白包含与蛋白结合试剂特异性结合的结构域，其中蛋白结合试剂和融合蛋白在与透化的细胞接触时彼此分开，并分别进入细胞，并且其中融合蛋白在细胞的核内与蛋白结合试剂结合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，融合蛋白的结构域包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，(ii)融合蛋白与蛋白结合试剂结合，并且与蛋白结合试剂结合的融合蛋白的尺寸被设置以通过核孔进入细胞的核。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括多重构建，所述多重构建包括使用两种或更多种不同的蛋白结合试剂，所述蛋白结合试剂各自对不同的靶蛋白具有特异性。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，与蛋白结合试剂结合的融合蛋白具有不多于120nm的直径。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，蛋白结合试剂和融合蛋白各自的尺寸被设置以扩散通过细胞的核孔。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针固定在基底上。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，基底包括珠、微阵列、板、管或孔中的至少一种。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括在基底上捕获复合物。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，第一寡核苷酸探针包含第一条形码序列，并且第二寡核苷酸探针包含第二条形码序列。第一条形码序列和第二条形码序列各自可以来自一组各异的独特条形码序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，透化的细胞包含完整的核，所述核包含在蛋白结合试剂与靶蛋白结合时保持与基因组DNA缔合的染色质。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，蛋白结合试剂包含与靶蛋白特异性结合的抗体。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，使蛋白结合试剂与靶蛋白结合并消化与靶蛋白缔合的DNA发生在细胞的核中。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，靶蛋白选自由以下组成的组：ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol IISer2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60和UTF1，或者所列项目中的两项或更多项的组合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，蛋白结合试剂与表位特异性结合，所述表位包含选自由以下组成的组的、基本上由选自由以下组成的组的、或由选自由以下组成的组的磷酸化的(ph)、甲基化的(me)、泛酰化的(ub)、苏酰化的(su)、生物素化的(bi)或乙酰化的(ac)组蛋白残基组成：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n端尾泛素化，或者所列项目中的两项或更多项的组合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，透化包括化学透化或物理透化。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括通过使细胞与去污剂或表面活性剂(诸如盐酸胍、Triton X、毛地黄皂苷或其组合)接触使细胞透化。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括通过声处理使细胞透化。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I或转座酶(例如Tn5转座酶)或其功能片段。转座酶可以是Tn转座酶(例如，Tn3、Tn5、Tn7、Tn10、Tn552、Tn903)、MuA座酶、Vibhar转座酶(例如，来自哈维氏弧菌(Vibrio harveyi))、Ac-Ds、Ascot-1、Bs1、Cin4、Copia、En/Spm、F元件、hobo、Hsmar1、Hsmar2、IN(HIV)、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS6、IS10、IS21、IS30、IS50、IS51、IS150、IS256、IS407、IS427、IS630、IS903、IS911、IS982、IS1031、ISL2、L1、Mariner、P元件、Tam3、Tc1、Tc3、Tel、THE-1、Tn/O、TnA、Tn3、Tn5、Tn7、Tn10、Tn552、Tn903、Tol1、Tol2、Tn10、Ty1、任何原核转座酶，或者任何有涉及或来源于以上所列的那些的转座酶。在一些实施方案中，涉及和/或来源于自亲本转座酶的转座酶可以包含与亲本转座酶的相应肽片段具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％氨基酸序列同源性的肽片段。肽片段的长度可以是至少约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约400个或约500个氨基酸。例如，来源于Tn5的转座酶可以包含长度为50个氨基酸并且与亲本Tn5转座酶中的相应片段约80％同源的肽片段。在一些情况下，可以通过添加一种或更多种阳离子来促进和/或触发插入。阳离子可以是二价阳离子，例如Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，消化DNA在透化的细胞的核中进行。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，第一寡核苷酸探针的第一靶结合区包含多T序列，并且试剂寡核苷酸包含多T序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，第一寡核苷酸探针的第一靶结合区不包含五个连续的胸苷，并且试剂寡核苷酸包含与第一寡核苷酸探针的第一靶结合区互补的序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，第二寡核苷酸探针的第二靶结合区包含与DNA的5’区、3’区或内部区的至少一部分互补的序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括将第二靶结合区连接到消化的DNA。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括例如如果试剂寡核苷酸包括单链DNA或RNA，使用逆转录酶产生靶-条形码缀合物。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括产生包含多于一种的标记的核酸的核酸文库。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，产生核酸文库包括与包含酶、化学物质或引物的试剂接触。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，试剂包括以下中的至少一种：DNA限制性酶、核酸酶(诸如微球菌核酸酶)、溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶、Klenow聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7衔接子序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括在所述延伸后用蛋白酶消化蛋白结合试剂、融合蛋白和靶蛋白。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，蛋白酶包括蛋白酶K。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括将双链DNA(dsDNA)模板连接到第二寡核苷酸探针。dsDNA模板可以包含模板链和互补链。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，模板链包含模板转换寡核苷酸和独特的捕获序列，并且互补链包含与独特的捕获序列互补的序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，独特的捕获序列包含长度不多于40个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，dsDNA模板还包含随机体(randomer)。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括使dsDNA模板变性，并去除模板链，其中互补链保持与第二寡核苷酸探针连接。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，dsDNA模板附接到生物素，并且去除模板链包括与链霉抗生物素蛋白接触。

在一些实施方案中，描述了一种使寡核苷酸探针附加有靶结合区的方法。方法可以包括提供寡核苷酸探针，其中寡核苷酸探针包括样品标识符序列和杂交结构域。方法可以包括使寡核苷酸探针与包含模板链和互补链的部分双链DNA(dsDNA)模板接触。模板链可以包括与杂交结构域的至少一部分互补的单链互补杂交结构域、与靶结合区互补的序列。互补链可以包含含有靶结合区的互补链，其中互补链的靶结合区杂交到与模板链的靶结合区互补的序列。方法可以包括将dsDNA模板连接到寡核苷酸探针。方法可以包括使dsDNA模板变性。方法可以包括去除模板链。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，寡核苷酸探针与基底缔合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，基底包括珠、微阵列、板、管或孔中的至少一种。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，模板链与生物素缔合，并且其中去除模板链包括使生物素与链霉抗生物素蛋白接触。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，寡核苷酸探针的杂交结构域包含多T序列，并且其中互补杂交结构域包含多A序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，靶结合区不包含多T序列。在一些实施方案中，对于本文描述的任何方法，方法还包括根据本文描述的方法使第一寡核苷酸探针附加有第一靶结合区和/或使第二寡核苷酸探针附加有第二靶结合区。

在一些实施方案中，描述了一种试剂盒。试剂盒可以包含含有样品标识符序列和杂交结构域的寡核苷酸探针。试剂盒可以包含DNA模板，DNA模板包含模板链和互补链。模板链可以包含单链互补杂交结构域(与杂交结构域的至少一部分互补)、与靶结合区互补的序列。互补链可以包含靶结合区。任选地，在试剂盒中，靶结合区与靶结合区互补的序列杂交，使得模板链与互补链杂交。因此，模板链和互补链可以与单链的杂交结构域的至少一部分形成部分双链的DNA。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，模板链序列与生物素缔合，并且其中试剂盒还包含含有链霉抗生物素蛋白的组合物。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，寡核苷酸探针与基底缔合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，基底包括珠、微阵列、板、管或孔中的至少一种。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，试剂盒还包含变性剂。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒，变性剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、胍、丙二醇、盐、氢氧化钠、水杨酸钠或尿素。在一些实施方案中，本段中描述的任何试剂盒进一步包括本文所述的任何试剂盒。在一些实施方案中，对于本文描述的任何试剂盒或方法或组合物，蛋白结合试剂包含抗体。

在一些实施方案中，描述了组合物。组合物可以包含含有与DNA缔合的靶蛋白的细胞。组合物可以包含与靶蛋白结合的复合物。复合物可以包含与试剂寡核苷酸缔合的蛋白结合试剂，所述试剂寡核苷酸包含用于蛋白结合试剂的独特标识符。蛋白结合试剂可以与感兴趣的蛋白特异性结合。复合物可以包含含有与蛋白结合试剂结合的DNA消化酶的融合蛋白。在一些实施方案中，对于本文描述的任何组合物，融合蛋白包含与蛋白结合试剂特异性结合的结构域。在一些实施方案中，对于本文描述的任何组合物，复合物在细胞的核内与靶蛋白结合。在一些实施方案中，对于本文描述的任何组合物，DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I或Tn5转座酶或其功能片段。

附图简述

图1是图示了根据本文的一些实施方案结合包含DNA消化酶的融合蛋白的结合试剂(例如，蛋白结合试剂)的示意图。

图2是图示了根据本文的一些实施方案使透化的细胞与图1的结合融合蛋白的结合试剂(例如，蛋白结合试剂)接触使得结合融合蛋白的蛋白结合试剂结合到细胞核中的与DNA缔合的靶蛋白的示意图。

图3是图示了用DNA消化酶消化DNA从而产生包含图1的结合融合蛋白的结合试剂(例如，蛋白结合试剂)和消化的DNA的复合物的示意图。根据本文的一些实施方案，复合物可以从细胞分离(例如，取出)。

图4是图示了根据本文的一些实施方案的包含固定在基底上的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针的基底(例如，珠)的示意图。

图5A-5D是图示了捕获和处理来自单细胞的DNA的示意图。图5A是图示了根据本文的一些实施方案用图4的基底(例如，珠)捕获图3的复合物的示意图。图5B是图示了根据本文的一些实施方案的图5A的捕获的复合物的寡核苷酸的连接和逆转录的示意图。图5C图示了根据本文的一些实施方案的蛋白结合试剂、融合蛋白和靶蛋白的消化以产生仅与寡核苷酸缔合的珠。图5D图示了根据本文的一些实施方案的变性、随机引发(random priming)和延伸以及聚合酶链式反应以产生文库。

图6是图示了根据本文的一些实施方案的靶蛋白缔合的DNA的文库产生的示意图。产生文库可以包括提供结合基底的寡核苷酸的组成部分。

图7A-7C是根据本文的一些实施方案用靶结合区核酸序列标记寡核苷酸探针的示意性图示。图7A图示了根据本文的一些实施方案的带有具有多T杂交结构域的寡核苷酸探针的珠。图7B图示了根据本文的一些实施方案的具有模板链序列(包含多A杂交结构域和靶核酸序列)和互补链序列(包含与靶核酸序列互补的靶结合区)的双链DNA(dsDNA)，其中dsDNA附接到生物素。图7C图示了根据本文的一些实施方案图7A的寡核苷酸探针与图7B的dsDNA的杂交。

图8示意性地图示了根据本文的一些实施方案，在将dsDNA的互补链序列连接到寡核苷酸探针后使dsDNA变性并通过生物素与链霉抗生物素蛋白的结合去除模板链序列。

图9示意性地图示了根据本文的一些实施方案，如图8所示的具有互补靶链序列的寡核苷酸探针与靶核酸序列的结合。

图10A-B是本文提供的用于标记来自单细胞的核靶缔合的DNA的缀合物的非限制性示意性图示。

图11图示了非限制性示例性条形码。

图12示出条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。

图13是示出用于从多于一种靶产生在3’末端条形码化的靶的索引文库的非限制性示例性过程的示意性图示。

详述

以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文提供的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。容易理解的是，如本文一般描述的以及图中说明的本公开内容的方面可以以各种各样不同的配置来布置、替换、组合、分开和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本文公开内容的一部分。

本文引用的涉及的相关技术的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank以及其他数据库的序列通过引用以其整体并入。

对小数目的核酸(例如信使核糖核酸(mRNA)分子)进行定量对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数目也可以是非常具有挑战性的，特别是当分子数目非常小时。确定样品中分子的绝对数目的一种方法是数字聚合酶链式反应(PCR)。理想地，PCR在每个循环中产生分子的相同拷贝。然而，PCR可具有缺点使得每个分子复制具有随机概率，且此概率根据PCR循环和基因序列而变化，这导致扩增偏差和不准确的基因表达测量。具有独特的分子标记(molecular labels，也称为分子索引(molecular indexes，MI))的随机条形码可以用于计数分子数目和校正扩增偏倚。随机条形码化诸如Precise^TM测定(CellularResearch,Inc.(Palo Alto,CA))和Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinson and Company(Franklin Lakes,NJ))，可以通过使用分子标记(ML)在逆转录(RT)期间标记mRNA来校正由PCR和文库制备步骤诱导的偏倚。

Precise^TM测定可以利用具有大量(例如，6561种至65536种)多(T)寡核苷酸上的独特的分子标记序列的随机条形码的非耗尽性池，所述多(T)寡核苷酸在RT步骤期间与样品中的所有多(A)mRNA杂交。随机条形码可以包含通用PCR引发位点。在RT期间，靶基因分子与随机条形码随机反应。每种靶分子可以与随机条形码杂交，导致产生随机条形码化的互补核糖核苷酸(cDNA)分子。在标记后，可以将来自微孔板微孔的随机条形码化cDNA分子汇集到单个管中用于PCR扩增和测序。可以分析原始测序数据以产生读段的数目、具有独特的分子标记序列的随机条形码的数目以及mRNA分子的数目。

根据本文的一些实施方案，描述了用于标记来自单细胞的靶蛋白缔合的DNA的方法、试剂盒和组合物。在一些实施方案的方法、试剂盒和组合物中，第一组合物包含结合试剂(例如，蛋白结合试剂)、基本上由结合试剂(例如，蛋白结合试剂)组成、或由结合试剂(例如，蛋白结合试剂)组成，该结合试剂特异性结合到与细胞中的DNA缔合的靶蛋白(例如染色质)，从而形成复合物。结合试剂(例如，蛋白结合试剂)可以还包含独特标识符诸如核酸条形码。第二组合物可以包含与蛋白结合试剂结合的融合蛋白、基本上由与蛋白结合试剂结合的融合蛋白组成、或由与蛋白结合试剂结合的融合蛋白组成。融合蛋白可以包含消化与靶蛋白缔合的DNA的DNA消化酶，产生包含含有独特标识符的蛋白结合试剂、融合蛋白和消化的DNA的复合物。然后可以进行条形码化从而标记与蛋白结合试剂的特定的独特标识符缔合的特定的消化的DNA。因此，可以以单细胞和单分子水平鉴定与特定的靶蛋白缔合的特定DNA序列。例如，包含条形码的珠可以与蛋白结合试剂接触，该条形码各自共享共同的样品标识符序列，该蛋白结合试剂与消化的DNA复合，使得消化的DNA和独特标识符可以各自与相同的样品标识符序列缔合。此外，为了确定细胞中分子间相互作用的准确描述，复合物可以在透化的细胞或细胞核中原位形成(并且DNA可以被消化)。不受理论限制，考虑了复合物的原位形成可以避免标记细胞提取物或其级分可能产生的伪影(artifactual)和假阳性相互作用。任选地，可以进行多重分析以鉴定与同一样品中(例如，在同一单细胞中)两种或更多种不同类型的靶蛋白缔合的DNA。本文描述的一些实施方案涉及使用本文描述的试剂盒和/或组合物在单细胞中进行靶蛋白缔合的DNA标记的方法。本文描述的一些实施方案涉及试剂盒和/或组合物。

标记靶蛋白缔合的DNA的常规方法可以包括诸如将靶蛋白交联到缔合的DNA、DNA片段化、免疫沉淀、DNA分离和测序的方法。这样的方法通常涉及数千或数百万细胞的分析以标记和分析靶蛋白缔合的DNA。因此，这样的方法不适于分析单细胞中的靶蛋白缔合的DNA。本文描述的一些实施方案的试剂盒、方法和组合物在单细胞中产生对靶蛋白缔合的DNA的准确和可重复的鉴定和分析。在一些实施方案中，可以原位(例如，在细胞的核内)鉴定与单细胞中的DNA缔合的靶蛋白，从而鉴定靶蛋白-DNA相互作用，该相互作用准确地描述了细胞本身中发生的相互作用。

本文的公开内容包括标记细胞中核靶缔合的DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化。dsDNA可以是基因组DNA(gDNA)。方法可以包括：使核靶与缀合物接触以产生各自包含第一5’突出端和第二5’突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)，所述缀合物包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及使用第一多于一种寡核苷酸条形码将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，其中第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交的第一靶结合区。条形码化核靶缔合的DNA片段可以是单链的或双链的。

本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：缀合物，所述缀合物包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。试剂盒可以包含：缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶，任选地其中DNA聚合酶包括Klenow片段。试剂盒可以包含：逆转录酶，任选地其中逆转录酶包括病毒逆转录酶，并且任选地病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。试剂盒可以包含：连接酶。试剂盒可以包含：去污剂和/或表面活性剂。试剂盒可以包含：缓冲液、筒或两者。试剂盒可以包含：一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。

本文的公开内容包括标记细胞中核靶缔合的DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化，其中任选地dsDNA是基因组DNA(gDNA)。方法可以包括：使核靶与消化组合物接触以产生各自包含单链突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如核靶缔合的gDNA片段)，所述消化组合物包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中每种结合试剂包含含有针对所述结合试剂的独特标识符序列的结合试剂特异性寡核苷酸。方法可以包括：使用第一多于一种寡核苷酸条形码将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段各自包含与核靶缔合的dsDNA片段的至少一部分互补的序列，其中第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交的第一靶结合区。条形码化核靶缔合的DNA片段可以是单链的或双链的。方法可以包括：使用第二多于一种寡核苷酸条形码将结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化以产生多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与独特标识符序列的至少一部分互补的序列，其中第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的第二靶结合区。

本文的公开内容包括试剂盒。试剂盒可以包含含有DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂的消化组合物，其中结合试剂包含结合试剂特异性寡核苷酸，该结合试剂特异性寡核苷酸包含针对结合试剂的独特标识符序列。

定义

除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。

如本文使用的，术语“衔接子”可以意指促进缔合的核酸的扩增或测序的序列。缔合的核酸可以包括靶核酸。缔合的核酸可以包括一种或更多种空间标记、靶标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一种或更多种衔接子可以位于核酸的5’端或3’端。当衔接子在5’端和3’端包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’端和/或3’端的衔接子可以能够与固定在表面上的一种或更多种寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两种或更多种核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两种或更多种核酸分子也可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用的核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用的序列。可以存在于多于一种核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单种通用引物复制或扩增多于一种不同序列。类似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一种、两种(例如，一对)或更多种通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一种、两种(例如，一对)或更多种单一通用引物复制或扩增多于一种不同序列。因此，通用引物包含可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰携带靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)与不同靶核酸序列的一端或两端附接。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以彼此相同或不同。

如本文使用的，术语“缔合”或“与...缔合”可以意指两个或更多个物质可以被鉴定为在某个时间点处共定位。缔合可以意指两个或更多个物质在或曾经在相似的容器内。缔合可以是信息学缔合。例如，关于两个或更多个物质的数字信息可以被存储并且可以用于确定一种或更多种物质在某个时间点处共定位。缔合也可以是物理缔合。在一些实施方案中，两个或更多个缔合的物质彼此“拴系”、“附接”或“固定”或与共同的固体或半固体表面“拴系”、“附接”或“固定”。缔合可以指用于将标记与固体或半固体支持物(诸如珠)附接的共价或非共价方式。缔合可以是靶与标记之间的共价键。缔合可以包括两个分子(诸如靶分子和标记)之间的杂交。

如本文使用的，术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸的给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，则这两个核酸被认为在该位置处彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中核苷酸中仅一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以将第一核苷酸序列称为第二序列的“互补体”。如果第一核苷酸序列与第二序列的相反序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则可以将第一核苷酸序列称为第二序列的“反向互补体”。如本文使用的，“互补”序列可以指序列的“互补体”或“反向互补体”。从本公开内容理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以是与其所杂交的分子互补或部分互补的。

如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶缔合的独特标记的数目的步骤。这种方法(其本质上可以是随机的)将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。

如本文使用的，术语“一种标记(label)”或“多于一种标记(labels)”可以指与样品中的靶缔合的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的接点，例如天然和非天然序列的接点。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在各种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。

如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”可以指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的条形码，使得当非耗尽性储库与靶池缔合时，每种靶可能与独特的条形码缔合。每种标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与标记的多样性相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的标记的靶分子的集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，并且然后对检测到的条形码的数目的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数目与独特的条形码的数目的比率低时，标记的靶分子是高度独特的(即，多于一种靶分子被给定标记标记的概率非常低)。

根据本文的一些实施方案描述了各种核酸。例如，寡核苷酸、样品和/或靶可以包括核酸。

如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核酸碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁核酸(locked nucleic acid)、乙二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。

如本文使用的，“核苷”具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义，并且可以包括天然核苷，诸如2′-脱氧和2′-羟基形式。关于核苷的“类似物”可以包括含有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分等的合成核苷。类似物可以能够杂交。类似物可以包括被设计以增强结合特性、降低复杂性、增加特异性等的合成核苷。类似物的示例性类型可以包括寡核苷酸磷酰胺酯(本文称为“酰胺酯”)、肽核酸(本文称为“PNA”)、寡-2′-O-烷基核糖核苷酸、含有C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸和锁核酸(LNA)。

如本文使用的，“上游”(以及该根术语的变体)具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义，并且指核酸上相对5’的位置(例如，与参考位置相比5’)。如本文使用的，“下游”(以及该根术语的变体)具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义，并且指核酸上相对3’的位置(例如，与参考位置相比3’)。

核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸中，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以指形成核酸的核苷间骨架。键(linkage)或骨架可以是3’到5’磷酸二酯键。

核酸可以包括修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可以包括那些在骨架中保留磷原子的骨架和那些在骨架中没有磷原子的骨架。合适的其中含磷原子的修饰的核酸骨架可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯诸如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3’-5’连接、2’-5’连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3’至3’、5’至5’或2’至2’连接)。

核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间键，混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些可以包括具有吗啉代连接的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混合的N、O、S和CH₂组分部分的其他的那些。

核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含酰胺的骨架替代，特别是被氨基乙基甘氨酸骨架替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的骨架可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得PNA具有含酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。

核酸可以包括吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间键可以替代磷酸二酯键。

核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是非离子核酸模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以指环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡腺苷酸酯可以与核酸互补体形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-C,4’-C-氧亚甲基连接，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH₂-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对3’-外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。

核酸还可以包括核酸碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核酸碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))、以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。修饰的核酸碱基可以包括其他合成的和天然的核酸碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核酸碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳(G-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。

如本文使用的，术语“样品”可以指包括靶的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。在一些实施方案中，样品包括原始或未处理的样品，例如全细胞、全细胞群体或全组织。在一些实施方案中，样品包括分离的细胞或细胞提取物，或其含核酸的级分，例如分离的核酸，或包含富集的或分离的核酸的组合物。在一些实施方案中，样品包括固定的组织、细胞或其含核酸的级分。在一些实施方案中，样品包括冷冻组织、细胞或其含核酸的级分。在一些实施方案中，样品包含含有核酸的溶液。在一些实施方案中，样品包含含有核酸的溶液。在一些实施方案中，样品包括固体形式的核酸，例如冻干的核酸等。在一些实施方案中，样品标识符序列是能够向用户提供与样品相关的信息(诸如鉴定特定样品或区分一个样品与另一个样品)的序列。样品标识符序列可以是来自独特的一组各异的序列的具有20个或更少的碱基对(诸如20个、18个、15个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或3个碱基对)的独特的核酸序列。

如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取一部分样品和/或将所述部分放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片格栅和/或超薄切片机。

如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多于一种条形码(例如，随机条形码)的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座(bearing)、圆柱体或其他类似配置，包含塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。

如本文使用的，术语“随机条形码”可以指本公开内容的包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶缔合后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。

如本文使用的，术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶缔合后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。

如本文使用的，术语“随机条形码化”可以指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来缔合并对与靶缔合的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。

如本文使用的，术语“靶”可以指可与条形码(例如，随机条形码)缔合的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白、肽或多肽。在一些实施方案中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“物质(species)”互换使用。

如本文使用的，术语“逆转录酶”指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒(retroplasmid)逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II型内含子衍生的逆转录酶，及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II型内含子逆转录酶。II型内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LI.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，尤其是逆转录子、II型内含子、以及多样性产生型逆转录元件)。

术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换地使用，以指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列可以例如是在本公开内容的方法中使用的遍及所有条形码通用的已知序列。例如，当使用本文公开的方法标记多于一种靶时，每种靶特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，多于一种通用衔接子序列可以用于本文公开的方法中。例如，当使用本文公开的方法标记多于一种靶时，至少两种靶特异性序列连接到不同的通用衔接子序列。通用衔接子引物及其互补序列可以被包括在两种寡核苷酸中，其中的一种寡核苷酸包含靶特异性序列且另一种寡核苷酸包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是包含靶特异性序列的寡核苷酸的一部分以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可与核苷酸序列杂交并产生靶特异性条形码(例如，靶特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物具有与本公开内容的方法中使用的通用PCR引物不同的序列。

如本文使用的，术语“细胞”具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义。它可以指一个或更多个细胞。在一些实施方案中，细胞是正常细胞，例如，处于不同发育阶段的人类细胞，或来自不同器官或组织类型的人类细胞。在一些实施方案中，细胞是非人类细胞，例如，其他类型的哺乳动物细胞(例如，小鼠、大鼠、猪、狗、奶牛和马)。在一些实施方案中，细胞是其他类型的动物或植物细胞。在其他实施方案中，细胞可以是任何原核或真核细胞。透化的细胞是包含细胞膜中的开口以及足够尺寸的核酸酶的细胞，该尺寸使蛋白结合试剂和融合蛋白(分别地，或任选地，彼此缔合的)通过开口扩散以进入核。

条形码

条形码化，诸如随机条形码化，已经在例如，Fu等人,Proc Natl Acad SciU.S.A.,2011May 31,108(22):9026-31；美国专利申请公布第US2011/0160078号；Fan等人,Science,2015February 6,347(6222):1258367；美国专利申请公布第US2015/0299784号；和PCT申请公布第WO2015/031691号中描述；这些中的每项的内容，包括任何支持或补充信息或材料，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可以用于对靶随机标记(例如，条形码，标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在这些值的任何两个之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。

条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图11示出了具有空间标记的示例性条形码1104。条形码1104可以包括可以使条形码与珠1108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以变化。例如，如图11中所示，通用标记可以是最5’侧的标记(5’-most label)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3’-most label)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记是处于任何顺序的。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸隔开。

标记(例如，细胞标记)可以包含一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每种七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数目)，其可被设计成提供错误校正能力。可以设计包含七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组错误校正子序列可被设计成展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的错误校正序列的审查(在下文更详细地描述)可允许人们检测或校正扩增错误或测序错误。在一些实施方案中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。

条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是以下或包括以下：核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有多(A)尾的RNA或其任何组合。在一些实施方案中，多于一种靶可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施方案中，靶结合区可以包括可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。条形码的一种或更多种标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔区(spacer)与条形码的另一种或两种剩余标记隔开。间隔区可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有标记被间隔物隔开。

通用标记

条形码可以包含一种或更多种通用标记。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记可以是对于附接至给定固体支持物的条形码组中的所有条形码相同的。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记可以是对于附接至多于一个珠的所有条形码相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可以用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可以用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。

维度标记

条形码可以包含一种或更多种维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于靶被条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间相关联。维度标记可以在标记的时间处被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以将细胞的群体条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码对细胞再次进行脉冲处理，等等。每个脉冲(例如，细胞周期的每个时期)的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物阶段。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一种实例中，样品(例如，细胞、细胞的群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的响应。

维度标记可以是可激活的。可激活的维度标记可以在特定时间点被激活。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，连接另一种分子，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光囚禁(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将维度标记激活。

在一些实施方案中，维度标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。

多于一个固体支持物(例如，珠)可以呈现多达10⁶种或更多种独特的维度标记序列。维度标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

空间标记

条形码可以包含一种或更多种空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码缔合的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标相关联。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以相对于基底固定。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标(landmark)固定。界标可在空间中被鉴定。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(诸如色码、条形码、磁特性(magneticproperty)、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)相关联。在一些实施方案中，将多于一种空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。

空间标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，包含相同空间标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，包含相同空间标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是至少或是至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。

多于一个固体支持物(例如，珠)可以呈现多达10⁶种或更多种独特的空间标记序列。空间标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。空间标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

细胞标记

条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含提供用于确定哪种靶核酸来源于哪种细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，包含相同细胞标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，包含相同细胞标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一种实例，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。

多于一个固体支持物(例如，珠)可以呈现多达10⁶种或更多种独特的细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一种实例，细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一种实例，细胞标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

条形码序列

条形码可以包含一种或更多种条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器(例如，提供粗略近似)的核酸序列。

在一些实施方案中，将一组各异的条形码序列附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以存在以下或存在约以下：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹种独特分子标记序列或在这些值的任何两个之间的数字或范围的独特分子标记序列。例如，多于一种条形码可以包括约6561种具有不同序列的条形码序列。作为另一种实例，多于一种条形码可以包括约65536种具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以存在至少以下或至多以下：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹种独特的条形码序列。独特分子标记序列可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，独特分子标记序列被颗粒(例如水凝胶珠)部分或全部包含。

在不同实施方式中，条形码的长度可以是不同的。例如，条形码的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。作为另一种实例，条形码的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。

分子标记

条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种分子标记。分子标记可以包含条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器的核酸序列。

在一些实施方案中，将一组各异的分子标记附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以存在或存在约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹种或在这些值的任何两个之间的数字或范围的独特分子标记序列。例如，多于一种条形码可以包括约6561种具有不同序列的分子标记。作为另一种实例，多于一种条形码可以包括约65536种具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以存在至少或至多10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹种独特分子标记序列。具有独特分子标记序列的条形码可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。

对于使用多于一种随机条形码的条形码化(例如，随机条形码化)，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现的数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在这些值的任何两个之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现的数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。

分子标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。

靶结合区

条形码可以包含一个或更多个靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如，与特定基因序列特异性杂交)的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含能够与限制性酶位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。

在一些实施方案中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指可以独立于靶核酸的特定序列结合多于一种靶核酸的序列。例如，靶结合区可以包含随机多聚体序列、多(dA)序列、多(dT)序列、多(dG)序列、多(dC)序列或其组合。例如，靶结合区可以是与mRNA分子上的多(A)尾杂交的寡(dT)序列。随机多聚体序列可以是，例如，随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的所有条形码，靶结合区是相同的。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的多于一种条形码，靶结合区可以包括两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸、或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。例如，可以使用逆转录酶(诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)来逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括带有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换为条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子含有在cDNA分子3’末端上的条形码的序列(诸如分子标记)。

在一些实施方案中，靶结合区可以包含寡(dT)，所述寡(dT)可以与包含聚腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个、30个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5个-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，条形码在本文中可以称为基因特异性条形码。

定向特性(Orientation Property)

随机条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种可以用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包含不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定向成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码激活时可以自组装成特定的定向(例如，核酸纳米结构)。

亲和特性(Affinity Property)

条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的化学部分和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对于样品上的特定部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或特定细胞类型或分子附近的靶可以被标记(例如，被随机标记)。在一些实施方案中，亲和特性可以提供空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。

抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合性)部分(像抗体片段)。

抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同的抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、与细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)结合的抗体和治疗性抗体。

通用衔接子引物

条形码可以包含一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(诸如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指遍及所有条形码的通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个、30个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少以下或是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5个-30个核苷酸。

接头

当条形码包含多于一种类型的标记(例如，多于一种细胞标记或多于一种条形码序列，诸如一种分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)码。

固体支持物

在一些实施方案中，本文公开的条形码(诸如随机条形码)可以与固体支持物缔合。固体支持物可以是例如合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一种条形码(例如，第一多于一种条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)相差至少一个核苷酸。相同固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，第一固体支持物上的第一多于一种条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一种条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多于一种条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一种条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记可以是例如约5个-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5个-20个核苷酸长。合成颗粒可以是例如珠。

珠可以是例如硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。珠可以包括材料诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。

在一些实施方案中，珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合物珠(例如可变形珠或凝胶珠)(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。

在一些实施方案中，颗粒可以是可破坏的(例如，可溶解的、可降解的)。例如，聚合物珠可以例如在期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可以导致聚合物珠以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶珠可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。

例如，分析物和/或试剂(诸如寡核苷酸条形码)可以偶联/固定至凝胶珠的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)和/或凝胶珠的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，本文描述的试剂与凝胶珠或任何其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定型部分(例如，经由化学交联剂，包括本文描述的化学交联剂)。在施加刺激后，不稳定型部分可以被裂解并释放所固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定型部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定至凝胶珠的情况下，使二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定型部分可以作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分和/或作为试剂或分析物的一部分被包括。在一些实施方案中，多于一种条形码的至少一种条形码可以被固定在颗粒上、被部分固定在颗粒上、被包封在颗粒中、被部分包封在颗粒中或其任何组合。

在一些实施方案中，凝胶珠可以包括宽范围的不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(poly(pyrolle)，PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PPA)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。

许多化学刺激可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例可以包括但不限于pH介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁分解、珠壁的触发解聚和珠壁转换反应。批量(bulk)改变也可以用于触发珠的破坏。

通过各种刺激对微胶囊的批量或物理改变在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理改变，其中珠破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化或珠壁的孔隙率的改变。

生物刺激也可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可以包含具有对特定蛋白酶的裂解敏感的肽交联的聚合物。更特别地，一种实例可以包括包含GFLGK肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳壁的肽交联被裂解并且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一种实例中，珠包括包含纤维素的壳壁。壳聚糖水解酶的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚及其内部内容物释放的生物触发物。

还可以在施加热刺激后诱导珠释放其内容物。温度的改变可以引起珠的各种改变。热量的变化可以引起珠熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可以增加珠内部组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。在又其他的情况下，热量可以使珠转化成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。

将磁性纳米珠包括在微胶囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及将珠引导成阵列。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁珠。在一种实例中，将Fe₃O₄纳米颗粒掺入含聚电解质的珠中，在振荡磁场刺激的存在下触发破裂。

珠也可以由于电刺激的结果被破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒类似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对齐、电导率或氧化还原反应。在一种实例中，含电敏材料的珠在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。

也可以使用光刺激来破坏珠。许多光触发是可能的，并且可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。涂覆有SiO₂的聚电解质胶囊的UV照射可以导致珠壁的崩解。在又另一种实例中，可以将可光切换材料(诸如偶氮苯基团)掺入珠壁中。在施加UV或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式至反式异构化。在此方面，光子开关(photon switch)的掺入产生在施加光触发后可以崩解或变得更多孔的珠壁。

例如，在图12中示出的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框1208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔上之后，在框1212处可以将珠引入微孔阵列的多于一个微孔上。每个微孔可以包含一个珠。珠可以包含多于一种条形码。条形码可以包含附接至珠的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或其任何组合。

本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)缔合(例如，附接)。与固体支持物缔合的条形码可各自包含选自以下组的条形码序列，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物缔合的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，与固体支持物缔合的条形码的一定百分比包含相同的细胞标记。例如，百分比可以是以下或是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。作为另一种实例，百分比可以是至少以下或是至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物缔合的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物缔合的条形码可以具有选自下组的不同的细胞标记，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的细胞标记。

本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)缔合(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一种条形码缔合的多于一种合成颗粒的固体支持物将样品中的多于一种靶条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可以包括与多于一种条形码缔合的多于一个合成颗粒。不同固体支持物上的多于一种条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。固体支持物可以例如在二维或三维包括多于一种条形码。合成颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。固体支持物可以包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可以包埋到半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物缔合。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可以与基底缔合。

如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价方式。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于原位固相合成条形码。

在一些实施方案中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他类似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。珠可以由例如塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任何组合构成。珠可以是或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形的。

珠可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe₃O₄；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁性材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任何组合。

在一些实施方案中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包括水凝胶。

本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。每个颗粒可以包含多于一种寡核苷酸(例如，条形码)。多于一种寡核苷酸中的每一种可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，寡(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。多于一种寡核苷酸的每一种的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、在这些值的任何两个之间的数字或范围或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是至少以下或是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹。在一些实施方案中，多于一个颗粒中不多于1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或更多种包含具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包含具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒中全都不具有相同的细胞标记序列。

在每个颗粒上的多于一种寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是至少以下或是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹。例如，多于一种寡核苷酸中的至少100种包含不同的条形码序列。作为另一种实例，在单个颗粒中，多于一种寡核苷酸中的至少100种、500种、1000种、5000种、10000种、15000种、20000种、50000种、这些值的任何两个之间的数字或范围或更多种包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多于一种包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数目)的比例可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更高。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸的每一种还包含样品标记、通用标记或两者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微米颗粒。

珠的尺寸可以不同。例如，珠的直径范围可以为从0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是以下或可以是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或在这些值的任何两个之间的数字或范围。

珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短或者可以比孔的直径长或短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞的直径相关(例如，被基底的孔捕获的单细胞)。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠的直径可以与细胞的直径相关(例如，被基底的孔捕获的单细胞)。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短或者可以比细胞的直径长或短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。

珠可以附接至基底和/或包埋到基底中。珠可以附接至凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质和/或包埋到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用珠上的条形码上存在的空间标记来鉴定，该空间标记可以用作位置地址。

珠的实例可以包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、

微珠、抗体缀合的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合的珠、蛋白G缀合的珠、蛋白A/G缀合的珠、蛋白L缀合的珠、寡(dT)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMag^TM羧基封端磁珠。

珠可以与量子点或荧光染料缔合(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多于一个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬缔合，使其成为顺磁性或铁磁性。珠可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠成像。珠可以具有与珠缔合的可检测代码。例如，珠可以包含条形码。珠可以改变尺寸，例如由于在有机溶液或无机溶液中溶胀。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。

固体支持物(例如，珠)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如，珠)可以蚀刻有标识符(例如，数字)。标识符可以通过对珠成像来可视化。

固体支持物可以包括可溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、构建模块(building block)或其他与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这种与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以以溶液中游离，诸如在微量滴定孔中的形式；以流通形式，诸如在柱中；或以浸量尺(dipstick)使用。

固体支持物可以包括膜、纸(paper)、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何配置的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或珠，平坦表面诸如晶片(例如，硅晶片)的凹陷或纳升孔阵列，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。

固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送到整个循环系统。

基底和微孔阵列

如本文使用的，基底可以指固体支持物类型。基底可以指可以包含本公开内容的条形码或随机条形码的固体支持物。基底可以例如包括多于一个微孔。基底可以例如是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括定义体积的小的反应室。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔捕获单细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包含本公开内容的条形码试剂。

条形码化的方法

本公开内容提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中的不同位置处的不同靶的数目的方法。该方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)非常靠近样品放置，裂解样品，将不同的靶与条形码缔合，对靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。该方法还可以包括对从条形码上的空间标记获得的信息进行分析和/或可视化。在一些实施方案中，方法包括使样品中的多于一种靶可视化。将多于一种靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在将样品中的多于一种靶条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后产生二维映射图和三维映射图。将样品中的多于一种靶可视化可以包括将多于一种靶映射到样品的映射图上。将多于一种靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在将样品中的多于一种靶条形码化之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在一些实施方案中，二维映射图和三维映射图可以在裂解样品之前或之后产生。在产生二维映射图或三维映射图之前或之后裂解样品可以包括加热样品、使样品与去污剂接触、改变样品的pH或其任何组合。

在一些实施方案中，将多于一种靶条形码化包括将多于一种条形码与多于一种靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化的靶)。将多于一种靶条形码化可以包括产生条形码化靶的索引文库。产生条形码化靶的索引文库可以用包含多于一种条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来进行。

使样品和条形码接触

本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。细胞可以例如通过重力流来接触，其中可以使细胞沉淀并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片放置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。可以使样品(例如，细胞)分散遍及基底，例如，通过在基底上生长/培养细胞。

当条形码紧密靠近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比例接触，使得每种不同的靶可以与本公开内容的不同条形码缔合。为了确保靶与条形码之间的有效缔合，可以将靶与条形码交联。

细胞裂解

在细胞和条形码的分布之后，可以将细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)或消化酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶与条形码的缔合，可以通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。

在一些实施方案中，可以使用滤纸来裂解样品。可以用滤纸上部的裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸用压力施加至样品，这可以促进样品的裂解以及样品的靶与底物的杂交。

在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加至底物来进行。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至少约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH是约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1M、0.5M或1M或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1M、0.5M或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、tween、NP-40)。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的去污剂浓度是约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于所使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的螯合剂浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的还原剂浓度是约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M TrisHCl，约pH7.5，约0.5M LiCl，约1％十二烷基硫酸锂，约10mM EDTA和约5mM DTT。

裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或20分钟或更多分钟。裂解的细胞可以包含至少约100000种、200000种、300000种、400000种、500000种、600000种或700000种或更多种靶核酸分子。裂解的细胞可以包含至多约100000种、200000种、300000种、400000种、500000种、600000种或700000种或更多种靶核酸分子。

将条形码附接至靶核酸分子

在细胞裂解和核酸分子从其释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的条形码随机缔合。缔合可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡(dT)可以与靶的多(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施方案中，可以将从裂解的细胞释放的核酸分子与基底上的多于一种探针缔合(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡(dT)时，可以将mRNA分子与探针杂交并且逆转录。寡核苷酸的寡(dT)部分可以充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，在图12中框1216处示出的条形码化的非限制性实例中，mRNA分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。

附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够与限制性位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如，EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。在本文提供的一些实施方案中，测定程序可以包括用转座酶(例如，Tn5)处理靶核酸以产生标签片段化产物。标签片段化产物可以包含突出端。标签片段化产物可以被本文提供的寡核苷酸条形码捕获(例如，通过结合所述突出端)。标签片段化产品可以包含空位。在连接反应前可以采用DNA聚合酶(例如，Klenow)来填充所述空位。

例如，在图12中框1220处示出的条形码化的非限制性实例中，随后可以将来自多于一个细胞(或多于一个样品)的标记的靶(例如，靶条形码分子)汇集至例如管中。标记的靶可以通过例如回收(retrieving)条形码和/或附接靶条形码分子的珠来汇集。

可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现附接的靶条形码分子的基于固体支持物的集合的回收。汇集靶条形码分子后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不先汇集来自多于一种细胞的标记的靶核酸分子。

逆转录或核酸延伸

本公开内容提供了使用逆转录(例如，在图12的框1224处)或核酸延伸来产生靶-条形码缀合物的方法。靶条形码缀合物可以包含条形码以及靶核酸的全部或一部分的互补序列(即，条形码化的cDNA分子，诸如随机条形码化的cDNA分子)。缔合的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡(dT)引物的长度可以是12-18个核苷酸或可以是约12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。

在一些实施方案中，mRNA分子向标记的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡(dT)引物的长度是12个-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。

在一些实施方案中，靶是cDNA分子。例如，使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶可以逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换为条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子含有在cDNA分子3’末端上的条形码序列(诸如分子标记)。

逆转录可以重复地发生以产生多于一个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。方法可以包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。

扩增

可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图12的框1228处)以产生标记的靶核酸分子的多于一个拷贝。扩增可以以多重方式进行，其中多于一种靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在的话)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一种核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或在这些值的任何两个之间的范围或数字。方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。

在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和装配PCR。

标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环至环扩增(circle-to-circle amplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。

扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。非天然核苷酸的添加可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包含例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包含少于12个-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的靶的3’端或5’端。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的靶的内部区域。内部区域可以距多于一种标记的靶的3’端至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。

一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或其任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以设计成扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总的标记的靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一种或更多种基因。

可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至珠的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物变成Illumina测序文库。使用150bp×2测序的测序可以揭示读段1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。

在一些实施方案中，可以使用化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或修饰的碱基可以用于促进将核酸从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性内切核酸酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含dUTP或ddUTP的核酸可以将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如，无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)内切核酸酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、Ig蛋白A、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。

当探针是基因特异性时，可以将分子与探针杂交，并且逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，可以将其扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多于一种靶核酸序列同时进行扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。

在一些实施方案中，可以例如用桥接扩增在基底上进行扩增。cDNA可以加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡(dT)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延伸以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子，并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补DNA链。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥接，通过共价键连接(secure to)第一引物并通过杂交连接第二引物。在延伸阶段，在同一反应混合物中通过添加核苷酸，第二引物可以按相反方向延伸，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两种单链核酸分子，每种单链核酸分子的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每种单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链可以与同一的颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延伸从而将两个新的桥转换成双链桥。

扩增反应可以包括扩增多于一种核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。

标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的指数式扩增。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及装配PCR。

在一些实施方案中，标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环至环扩增(circle-to-circleamplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可选地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。

在一些实施方案中，方法包括重复扩增标记的核酸以产生多于一种扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。可选地，方法包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。

扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至一种或更多种包含多于一种核酸的样品中。扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至多于一种核酸中。对照核酸可以包含对照标记。

扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定型和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。非天然核苷酸的添加可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含至少约7个-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含少于12个-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的核酸的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的核酸的3’端和/或5’端。一种或更多种引物可以退火至多于一种标记的核酸的内部区域。内部区域可以距多于一种标记的核酸的3’端至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种管家基因引物。一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或它们的产物。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是与本公开内容的阵列附接的探针。

在一些实施方案中，将样品中的多于一种靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或靶的条形码化片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化靶的索引文库包括从样品中的多于一种靶产生多于一种索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以相差以下、相差约以下、相差至少以下或相差至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，产生条形码化靶的索引文库包括使多于一种靶(例如mRNA分子)与包含多(T)区和标记区的多于一种寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子(每种包含cDNA区和标记区)，其中多于一种靶包括至少两种不同序列的mRNA分子，且多于一种寡核苷酸包括至少两种不同序列的寡核苷酸。产生条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。

条形码化(例如，随机条形码化)可以包括使用核酸条形码或标签以标记单种核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，其包括从mRNA产生cDNA分子时将DNA条形码或标签添加至cDNA分子。可以进行巢式PCR以使PCR扩增偏倚最小化。可以添加用于测序(例如下一代测序(NGS))使用的衔接子。例如在图12的框1232处，可以使用测序结果来确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、分子标记和核苷酸片段的序列。

图13是示出了产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库，诸如条形码化的mRNA或其片段的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以用独特分子标记序列、细胞标记序列和通用PCR位点对每种mRNA分子进行编码。具体地，通过将一组条形码(例如，随机条形码)1310与RNA分子1302的多(A)尾区1308杂交(例如，随机杂交)，可以将RNA分子1302逆转录以产生标记的cDNA分子1304(包括cDNA区1306)。条形码1310中的每一个可以包括靶结合区，例如多(dT)区1312、标记区1314(例如，条形码序列或分子)和通用PCR区1316。

在一些实施方案中，细胞标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一种随机条形码中的每一种还包括通用标记和细胞标记中的一种或更多种，其中通用标记对于固体支持物上的多于一种随机条形码是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一种随机条形码是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包含3个至20个核苷酸。

在一些实施方案中，标记区1314可以包含条形码序列或分子标记1318和细胞标记1320。在一些实施方案中，标记区1314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一种或更多种。条形码序列或分子标记1318的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记1320的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。通用标记可以是对于固体支持物上的多于一种随机条形码相同的，并且细胞标记是对于固体支持物上的多于一种随机条形码相同的。维度标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。

在一些实施方案中，标记区1314可以包括以下、包括约以下、包括至少以下或包括至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个不同标记或在这些值的任何之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记1318和细胞标记1320。每种标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码1310可以包括以下、包括约以下、包括至少以下或可以是至多以下：10个、20个、40个、50个、70个、80个、90个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10²⁰个条形码或随机条形码1310或在这些值的任何之间的数字或范围的条形码或随机条形码1310。并且条形码或随机条形码1310的组可以例如，各自包含独特标记区1314。标记的cDNA分子1304可以进行纯化以去除过量的条形码或随机条形码1310。纯化可以包括Ampure珠纯化。

如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集到1个管中，且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。因为独特标记区1314，汇集是可能的。特别地，可以将标记的cDNA分子1304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子1322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括以单一反应体积用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用以下、利用约以下、利用至少以下或利用至多以下：10、20、40、50、70、80、90、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10²⁰种多重引物或在这些值的任何之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括使用第1PCR引物池1324，所述第1PCR引物池1324包括靶向特定基因的定制引物1326A-C和通用引物1328。定制引物1326可以与标记的cDNA分子1304的cDNA部分1306’内的区域杂交。通用引物1328可以与标记的cDNA分子1304的通用PCR区域1316杂交。

如图13的步骤3中示出的，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物扩增。巢式PCR可以使PCR扩增偏倚最小化。特别地，巢式PCR标记的扩增子1322可通过巢式PCR进行进一步扩增。巢式PCR可以包括在单一反应体积中用巢式PCR引物1332a-c的巢式PCR引物池1330和第2通用PCR引物1328’进行的多重PCR。巢式PCR引物池1328可以包含以下、包含约以下、包含至少以下或包含至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种不同的巢式PCR引物1330或在这些值的任何之间的数字或范围的不同的巢式PCR引物1330。巢式PCR引物1332可以包含衔接子1334，并与标记的扩增子1322的cDNA部分1306”内的区域杂交。通用引物1328’可以包含衔接子1336，并与标记的扩增子1322的通用PCR区域1316杂交。由此，步骤3产生衔接子标记的扩增子1338。在一些实施方案中，巢式PCR引物1332和第2通用PCR引物1328’可以不包含衔接子1334和衔接子1336。相反，衔接子1334和衔接子1336可以连接至巢式PCR的产物以产生衔接子标记的扩增子1338。

如步骤4中示出的，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的PCR产物进行PCR扩增用于测序。特别地，可以使用衔接子1334和衔接子1336对衔接子标记的扩增子1338进行一个或更多个另外的测定。衔接子1334和衔接子1336可以与引物1340和引物1342杂交。一种或更多种引物1340和引物1342可以是PCR扩增引物。一种或更多种引物1340和引物1342可以是测序引物。一种或更多种衔接子1334和衔接子1336可以用于衔接子标记的扩增子1338的进一步扩增。一种或更多种衔接子1334和衔接子1336可以用于对衔接子标记的扩增子1338测序。引物1342可以包含板索引1344，使得使用同一组条形码或随机条形码1310产生的扩增子可以使用下一代测序(NGS)在一个测序反应中测序。

结合试剂

本文公开的结合试剂包括蛋白结合试剂。如本文使用的，“蛋白结合试剂”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指与蛋白特异性结合的试剂。举例来说，蛋白结合试剂可以包含抗体或其片段。合适的蛋白结合试剂的实例包括在美国专利公布第2018/0088112号或第2018/0346970号(其每项都通过引用并关于本文引用的具体公开内容以其整体并入)中描述的任何蛋白结合试剂。在一些实施方案中，结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与靶蛋白特异性结合。在一些实施方案中，蛋白结合试剂包括与靶蛋白特异性结合的抗体。如本文使用的，术语“抗体”具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义，并且指单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体。抗体可以包括全长抗体或其结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fab’-SH、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)，或包含V_L或V_H结构域的片段。抗体或其结合片段可以与靶蛋白特异性结合。

适于如本文描述的方法、试剂盒和组合物的示例结合试剂(例如，蛋白结合试剂)可以包括，例如，特异性结合到以下的抗体：CTCF(诸如通过Millipore目录#07-729可获得的抗体)、H3K27me3(诸如通过Millipore目录#07-449、EpiGentek目录#A4039或CellSignaling目录#9733可获得的抗体)、c-Myc(诸如通过Cell Signaling目录#D3N8F可获得的抗体)、Max(诸如通过Santa Cruz目录#sc-197可获得的抗体)、Pol II(8WG16；诸如通过Abcam目录#ab817可获得的抗体)、H3K4me1(诸如通过Abcam目录#ab8895或EpiGentek目录#A4031可获得的抗体)、H3K4me2(诸如通过Upstate目录#07-330或EpiGentek目录#A4032可获得的抗体)、H3K4me3(诸如通过Millipore目录#05-745、EpiGentek目录#A4033或#68393或者Active Motif目录#39159可获得的抗体)、H3K27ac(诸如通过Abcam目录#ab4729、EpiGentek目录#A4708或Millipore目录#MABE647可获得的抗体)、Oct4(诸如通过Thermo目录#701756可获得的抗体)、Sox2(诸如通过Active Motif目录#39843或Abcam目录#ab92494可获得的抗体)、Nanog(诸如通过Active Motif目录#61419可获得的抗体)、Brg1(诸如通过Bethyl Laboratories目录#A300-813可获得的抗体)、Suz12(诸如通过BethylLaboratories目录#A302-407A可获得的抗体)、IgG(诸如通过Millipore目录#06-371可获得的小鼠IgG)、RNA Pol II Ser2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol IISer7P(诸如通过Cell Signaling目录#54020可获得的抗体)、NPAT(诸如通过Thermo目录#PA5-66839可获得的抗体)、STAT1(诸如通过Becton Dickinson目录#610115可获得的抗体)、NFAT-1(诸如通过Becton Dickinson目录#610702可获得的抗体)、STAT1(pY701，克隆14/P-STAT1)(诸如通过Becton Dickinson目录#612132可获得的抗体)、STAT1(pY701，克隆4A)(诸如通过Becton Dickinson目录#612232可获得的抗体)、Jun(诸如通过BectonDickinson目录#610326可获得的抗体)、p53(诸如克隆PAb240，通过Becton Dickinson目录#554166可获得)、p53(诸如克隆80/p53，通过Becton Dickinson目录#610183可获得)、Rb(诸如通过Becton Dickinson目录#554162可获得的抗体)、STAT3(诸如通过BectonDickinson目录#610189可获得的抗体)、STAT2(诸如通过Becton Dickinson目录#610187可获得的抗体)、Fos(诸如通过Becton Dickinson目录#554156可获得的抗体)、雄激素受体(诸如克隆G122-434，通过Becton Dickinson目录#554225可获得)、雄激素受体(诸如抗体克隆G122-25，通过Becton Dickinson目录#554224可获得)、H1K25me1(诸如通过EpiGentek目录#A68342可获得的抗体)、H1K25me2(诸如通过EpiGentek目录#A68343可获得的抗体)、H1K25me3(诸如通过EpiGentek目录#A68370可获得的抗体)、H2(A)K4ac(诸如通过EpiGentek目录#A68365可获得的抗体)、H2(A)K5ac(诸如通过EpiGentek目录#A68350或A4300可获得的抗体)、H2(A)K7ac(诸如通过EpiGentek目录#A683512可获得的抗体)、H2(B)K5ac(诸如通过EpiGentek目录#A68366可获得的抗体)、H2(B)K12ac(诸如通过EpiGentek目录#A68352可获得的抗体)、H2(B)K15ac(诸如通过EpiGentek目录#A68353可获得的抗体)、H2(B)K20ac(诸如通过EpiGentek目录#A68434可获得的抗体)、H3K4ac(诸如通过EpiGentek目录#A69361可获得的抗体)、H3K9ac(诸如通过EpiGentek目录#A4054、4022或A4021可获得的抗体)、H3K14ac(诸如通过EpiGentek目录#A4021可获得的抗体)、H3K18ac(诸如通过EpiGentek目录#A4024可获得的抗体)、H3K23ac(诸如通过EpiGentek目录#A4025可获得的抗体)、H3K56ac(诸如通过EpiGentek目录#A68431可获得的抗体)、H3K9me1(诸如通过EpiGentek目录#A68435可获得的抗体)、H3K9me2(诸如通过EpiGentek目录#A68435可获得的抗体)、H3K9me3(诸如通过EpiGentek目录#A68435可获得的抗体)、H3K27me1(诸如通过EpiGentek目录#A4037可获得的抗体)、H3K27me2(诸如通过EpiGentek目录#A68392或A4038可获得的抗体)、H3K36me(诸如通过EpiGentek目录#A4040、A68396、A4041、A4042或A68388可获得的抗体)、H3K79me1(诸如通过EpiGentek目录#A68419可获得的抗体)、H3K79me2(诸如通过EpiGentek目录#A68419可获得的抗体)、H3K79me3(诸如通过EpiGentek目录#A68419可获得的抗体)、H4K5ac(诸如通过EpiGentek目录#A68408、A68356或A4027可获得的抗体)、H4K8ac(诸如通过EpiGentek目录#A4028可获得的抗体)、H4K12ac(诸如通过EpiGentek目录#A4029或A68357可获得的抗体)、H4K16ac(诸如通过EpiGentek目录#A68404或A68398可获得的抗体)、H4K91ac(诸如通过EpiGentek目录#A68367可获得的抗体)、H4K20me(诸如通过EpiGentek目录#A4046、A4047、A68422或A4048可获得的抗体)，或H4K59me(诸如通过EpiGentek目录#A68337或A68338可获得的抗体)，或者所列项目中的两项或更多项的组合。

如本文使用的，关于试剂与靶的特异性结合的术语“特异性的(specific)”、“特异性地(specifically)”或“特异性(specificity)”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指与试剂对非靶的结合亲和力相比，试剂对靶的结合亲和力是更高的或提高的。因此，特异性结合指优先与所指示的靶而不是非靶结合。然而，应理解特异性结合并不必须排除与靶以外的物质的一些微小或不重要的(例如，背景)相互作用。举例来说，特异性结合可以指以在数值上比10^-5M更小(表明更紧密结合)的解离常数(K_D)结合，例如，K_D小于10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M或10^-9M。例如，特异性结合可以指试剂对靶的结合亲和力是试剂对非靶的结合亲和力的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高。特异性结合也可以指试剂对靶的结合达到可检测到的较大程度，诸如是试剂与非靶的结合亲和力的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高。

在一些实施方案中，结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与试剂寡核苷酸缔合。在一些实施方案中，试剂寡核苷酸包括用于结合试剂(例如，蛋白结合试剂)的独特标识符。如本文使用的术语“缔合(associated)”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指两个或更多个组分之间的相互作用，并且可以包括共价或非共价键合。共价键(两个原子共享一对或更多对价电子)的化学性质在本领域是已知的并且包括，例如，二硫键或肽键。非共价键是原子或分子之间不涉及共享价电子对的化学键。例如，非共价相互作用包括，例如，疏水相互作用、氢键相互作用、离子键合、范德华键合或偶极-偶极相互作用。

如本文使用的，术语“融合蛋白”具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义。它指与DNA消化酶缔合的多肽或化合物的全部或部分。如本文描述的，缔合可以是共价或非共价的。在一些实施方案中，DNA消化酶包含能够消化核酸的任何酶或其功能片段，基本上由能够消化核酸的任何酶或其功能片段组成，或由能够消化核酸的任何酶或其功能片段组成。在一些实施方案中，DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I或Tn5转座酶或其功能片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含与结合试剂(例如，蛋白结合试剂)特异性结合的结构域。在一些实施方案中，结构域包含能够与结合试剂特异性结合的任何多肽或其结合部分，诸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种。在一些实施方案中，融合蛋白与蛋白结合试剂结合。在一种实施方案中，蛋白结合试剂和融合蛋白在使用前缔合为单个复合物。在另一种实施方案中，蛋白结合试剂和融合蛋白不缔合为单个复合物，而是分开的复合物，所述分开的复合物在使用后(例如在组合物进入细胞的核后)缔合。在一些实施方案中，无论蛋白结合试剂和融合蛋白在使用前是缔合的还是分开的，蛋白结合试剂、融合蛋白或包括与融合蛋白缔合的蛋白结合试剂的复合物的尺寸都是足以进入透化的细胞的尺寸和/或足以进入细胞核的核孔的尺寸。

适于一些实施方案的方法、试剂盒和组合物的DNA消化酶的限制性酶包括，例如，I型(例如，EcoAI、EcoK或EcoB)、II型(例如，HhaI、Hind II、HindIII、BamHI、NotI、NdeI、PacI、PvuI、EcoRI、EcorRII、Sau3AI、SmaI或TaqI)、III型(例如，EcoP15、PstII、PhaBI或HinfIII)、IV型(例如，McrBC或Mrr)和/或V型(例如，来自CRISPR的cas9-gRNA复合物)限制性酶。在一些情况下，I型酶是复杂的、多亚基的、组合限制和修饰(combinationrestriction-and-modification)的酶，其远离它们的识别序列随机切割DNA。一般来说，II型酶在接近或在它们的识别序列内的定义的位置处切割DNA。它们可以产生离散的限制性片段和不同的凝胶条带模式。III型酶也是大的组合限制和修饰酶。III型酶通常在它们的识别序列之外裂解并且可能要求在同一DNA分子内两个相反方向的这样的序列来完成裂解；III型酶很少给出完整的消化物。在一些情况下，IV型酶识别修饰的(通常是甲基化的)DNA并且可以通过大肠杆菌的McrBC和Mrr系统来例示。

在一些实施方案中，核靶是靶蛋白(例如染色质缔合的蛋白)。如本文使用的，“靶蛋白”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指感兴趣的多肽，并且结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与其特异性结合。在一些实施方案中，靶蛋白与细胞的染色质或DNA缔合。在一些实施方案中，靶蛋白包括已知或可发现与细胞的染色质或DNA缔合的任何蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是染色质缔合的蛋白或DNA缔合的蛋白。与染色质或DNA缔合的靶蛋白包括，例如，ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、p53、Pol II(8WG16)、RNA Pol IISer2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60或UTF1。在一些实施方案中，蛋白结合试剂与表位特异性结合，所述表位包括甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基，包括，例如，H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi或H4 n末端尾泛素化。因此在一些实施方案中，靶蛋白包括列出的蛋白中的任一种，或列出的蛋白的组合或两种或更多种。

本文描述的一些实施方案包含含有如本文描述的结合试剂(例如，蛋白结合试剂)和融合蛋白的第一组合物。

寡核苷酸探针

根据本文的一些实施方案的方法、试剂盒和组合物，描述了寡核苷酸探针(例如，寡核苷酸条形码)。在一些实施方案中，寡核苷酸探针包括美国专利公布第2015/0299784号或第2018/0276332号(其每项都通过引用并关于本文引用的具体公开内容以其整体并入)中描述的任何寡核苷酸探针。在一些实施方案的方法、试剂盒和组合物中，第二组合物包含第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针。

如本文使用的，术语“寡核苷酸探针”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指包含与靶序列的至少一部分互补的核苷酸序列的寡核苷酸。举例来说，与靶序列的至少一部分互补的核苷酸序列可以包含如本文所描述的“捕获序列”或“靶结合区”。如本文使用的，“互补”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指当寡核苷酸和靶序列反向对齐时寡核苷酸的至少一部分能够与靶序列形成氢键的特性。因此，互补可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸在给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则两个核酸被认为在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全部互补性时它可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“互补体”。如果第一核苷酸序列和与第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“反向互补体”。如本文使用的，术语“互补体”、“互补的”和“反向互补体”可以互换使用。从本公开内容理解如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以是其所杂交的分子的互补体。

互补的核碱基对包括腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)、5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)。互补的寡核苷酸和/或核酸不需要在每个核苷都具有核碱基互补性。相反，一些错配是被容忍的。如本文使用的，涉及寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”意味着这样的寡核苷酸与另一个寡核苷酸或核酸在寡核苷酸的每个核苷处互补。与靶序列的至少一部分互补可以包括完全互补性，诸如100％互补，或少于100％互补，诸如95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％互补，只要互补性足以使得寡核苷酸探针能够与靶序列结合。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸探针包含第一靶结合区(其也可称为“捕获序列”)和样品标识符序列。举例来说，第一靶结合区可以置于样品标识符序列的3’。因此，在第一靶结合区沿靶杂交和5’->3’延伸时，与靶互补的链可以用样品标识符序列条形码化。在一些实施方案中，第一靶结合区和与蛋白结合试剂缔合的试剂寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，使第一寡核苷酸探针和蛋白结合试剂接触导致第一靶结合区与试剂寡核苷酸的杂交，这可以使第一寡核苷酸探针与蛋白结合试剂缔合。考虑了第一靶结合区可以包含与蛋白结合试剂或其一部分互补并因此能够在反应温度与蛋白结合试剂或其一部分杂交的任何合适的序列。例如，第一靶结合区可以包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续的与试剂寡核苷酸的序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，第一靶结合区(其也被称为“捕获序列”)包含多T序列，基本上由多T序列组成，或由多T序列组成，并且试剂寡核苷酸包含多A序列。多T序列可以包括具有多于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个胸苷的连续胸苷的序列，并且多A序列具有互补数目的连续腺嘌呤或多于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个腺嘌呤。还考虑了在一些实施方案中，试剂寡核苷酸不包含多A序列，并因此，第一靶结合区不包含多T序列。在一些实施方案中，第一靶结合区不包括两个、三个、四个或五个连续的胸苷。

如本文使用的，“杂交”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指互补寡核苷酸和/或核酸的配对或退火。虽然不限于特定的机制，但最常见的杂交机制涉及互补核碱基之间的氢键形成，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键形成。

在一些实施方案的组合物和/或方法中，第二寡核苷酸探针包含第二靶结合区和样品标识符序列。在一些实施方案中，第二靶结合区和与如本文描述的靶蛋白缔合的DNA的单链突出端的至少一部分互补。与靶蛋白缔合的DNA的单链突出端可以由DNA消化酶产生，所述DNA消化酶诸如能够产生限制性位点突出端的限制性酶、微球菌核酸酶I或Tn5转座酶。

在一些实施方案中，组合物和方法包括一种或更多种第二寡核苷酸探针。例如，第二寡核苷酸探针可以包括多种寡核苷酸探针，基本上由多种寡核苷酸探针组成，或由多种寡核苷酸探针组成，特别是对于包含多于一种抗体的多重体。在这样的实施方案中，Tn5转座酶可以包括不同的衔接子装载抗体使得每种抗体结合的DNA结合到不同的衔接子。与每种衔接子互补的不同的寡核苷酸探针可以附接到基底，使得一个基底包括多于两种不同类型的寡核苷酸探针以捕获不同的衔接子添加的DNA片段。

如本文使用的，术语“样品标识符序列”具有本领域普通技术人员根据本说明书理解的普通和习惯含义并且指第一寡核苷酸探针或第二寡核苷酸探针的用于标识寡核苷酸探针的序列。样品标识符序列可以是任何可用于特异性标识寡核苷酸探针的序列。在一些实施方案中，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针包括相同的样品标识符序列。在一些实施方案中，第一寡核苷酸探针包括第一样品标识符序列，并且第二寡核苷酸探针包括第二样品标识符序列。在一些实施方案中，第一样品标识符序列和第二样品标识符序列各自来自一组各异的独特样品标识符序列。样品标识符序列的长度可以取决于样品的数量(或估计数量)。例如，多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达10⁶种或更多种独特样品标记序列。应当理解在一些实施方案中，例如如果所有经历标记的细胞都来自相同的样品，样品标识符序列可以是如本文描述的细胞标记。因此，无论本文在哪里提到“样品标识符序列”(或该根术语的变体)，应当理解在一些实施方案中，样品标识符序列可以是细胞标记。还应当理解在一些实施方案中，核酸可以用样品标识符序列和细胞标记二者标记(例如，如果来自两个或更多个不同样品的细胞被标记)。因此，还应当理解一些包含“样品标记”的实施方案的探针或标记的核酸可以任选地还包含如本文描述的细胞标记。

条形码序列包含可用于标识核酸的核酸序列或由可用于标识核酸的核酸序列组成，所述核酸例如来自细胞的靶蛋白缔合的DNA，或者来源于来自细胞的靶蛋白缔合的DNA的扩增子或逆转录物。举例来说，条形码序列可以包含至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸，包括任何两个所列值之间的范围，例如4个-10个、4个-15个、4个-20个、4个-30个、4个-50个、6个-10个、6个-15个、6个-20个、6个-30个、6个-50个、8个-10个、8个-15个、8个-20个、8个-30个或8个-50个。在一些实施方案中，条形码序列包含随机序列。在一些实施方案中，可以存在至少或至多10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种独特的条形码序列。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针固定在基底上。在一些实施方案中，基底包括寡核苷酸序列可以固定于其上的任何基底，诸如珠、微阵列、板、管或孔。在一些实施方案中，第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针二者固定到同一基底。基底可以基本上由以下组成或由以下组成：珠、微阵列、板、管或孔。

如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价手段。各种不同的固体支持物中的任何一种可以用作固定寡核苷酸探针的固体支持物。

基底可以包括一种类型的固体支持物。基底可以指在其上可以执行本公开内容的方法的连续的固体或半固体表面。例如，基底可以指阵列、筒、芯片、装置和载玻片。因此，“固体支持物”和“基底”可以互换使用。

基底可以包括或基本上由珠、膜、纸、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合组成。在一些实施方案中，支持物的至少一个表面可以是基本上平坦的，尽管在一些实施方案中，可能希望用例如孔、凸起区、针、蚀刻沟槽等物理地分开针对不同的化合物的合成区。根据一些实施方案，基底可以包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：树脂、凝胶、微球或其他几何构型。根据一些实施方案，基底包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板和阵列。固体支持物可以包括珠(例如硅胶、可控孔径玻璃、磁珠、Dynabead、Wang树脂；Merrifield树脂、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠等)、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片等。塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成的)、晶片(wafer)、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或平坦表面(诸如晶片(例如，硅晶片))的凹陷或纳升孔的阵列中的珠，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。

根据本文的一些实施方案的基底或固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他类似构型，包含塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。基底或固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，该形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。

基底诸如珠可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe₃O₄；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁性材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任何组合。

标记靶蛋白缔合的DNA的方法

本文描述的一些实施方案涉及使用如本文描述的结合试剂(例如，蛋白结合试剂)、融合蛋白和寡核苷酸探针标记靶蛋白缔合的DNA的方法。举例来说，方法可以包括将包含靶蛋白的细胞透化，使透化的细胞与消化组合物接触，该消化组合物包含例如融合蛋白和蛋白结合试剂(该蛋白结合试剂与试剂寡核苷酸缔合)使得蛋白结合试剂、融合蛋白形成复合物。方法可以包括用融合蛋白的DNA消化酶消化细胞中靶蛋白缔合的DNA，从而形成DNA的单链突出端。方法可以包括使细胞与第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针接触，该第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针分别与试剂寡核苷酸和DNA的单链突出端杂交。方法可以包括使第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针延伸。结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与靶蛋白的结合和消化可以原位进行(例如，在细胞的核中)。在一些实施方案中，方法可以包括标记、测序、扩增或产生靶蛋白缔合的DNA的文库。

在一些实施方案中，方法包括使细胞透化。细胞可以包括任何包括感兴趣的核酸(诸如靶蛋白缔合的DNA)的细胞。如本文使用的，“透化”具有本领域普通技术人员根据本说明书所理解的普通和习惯含义，并且指促进可及于细胞细胞质或细胞内分子、细胞的组分或结构的过程。细胞的透化可以包括化学或物理透化，诸如将细胞暴露于声处理、甲醛、乙醇、去污剂、表面活性剂、盐酸胍、毛地黄皂苷或Triton X。在一些实施方案中，透化的细胞包含完整的核。在一些实施方案中，透化的细胞包含与基因组DNA保持缔合的染色质。在一些实施方案中，细胞核是分离的，并且本文描述的试剂盒和方法包括使本文描述的试剂与分离的核接触。因此，应理解的是，在本文描述包含核的细胞的任何地方，分离的核也是明确考虑的。因此，在描述了包含含有核的细胞的方法、试剂盒、组合物或用途的任何地方，可以用分离的核代替包含核的细胞。

在一些实施方案中，透化的细胞与如本文描述的组合物接触，该组合物体现为结合试剂(例如，蛋白结合试剂)和融合蛋白(包括，例如，如本文描述的“第一组合物”的一部分)。在一些实施方案中，蛋白结合试剂和融合蛋白的尺寸被设置以进入透化的细胞(例如通过具有的直径大于融合蛋白最大直径的透化开口扩散)并且其尺寸还被设置以进入细胞的核(例如通过核孔扩散)。

在一些实施方案中，结合试剂(例如，蛋白结合试剂)和融合蛋白各自的尺寸被设置以单独地进入透化的细胞和细胞的核(或分离的核)，使得不含融合蛋白的蛋白结合试剂的尺寸被设置以进入透化的细胞和细胞的核，并且使得不含蛋白结合试剂的融合蛋白具有足够的尺寸以进入透化的细胞和细胞的核。在一些实施方案中，蛋白结合试剂和融合蛋白各自的尺寸被分别设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，在透化的细胞与组合物接触后，蛋白结合试剂和融合蛋白分别进入透化的细胞和细胞的核，并在进入细胞的核后互相缔合。因此，在一些实施方案中，透化的细胞首先与蛋白结合试剂接触(例如，通过使透化的细胞与包含蛋白结合试剂、基本上由蛋白结合试剂组成，或由蛋白结合试剂组成的组合物接触)，然后透化的细胞与融合蛋白接触(例如，通过使透化的细胞与包含融合蛋白的组合物接触)。在一些实施方案中，在使透化的细胞与包含蛋白结合试剂的组合物接触前，包含融合蛋白、基本上由融合蛋白组成，或由融合蛋白组成的组合物与透化的细胞接触。在本文描述的任何实施方案中，蛋白结合试剂和融合蛋白可以分别(例如，依次)与透化的细胞接触使得蛋白结合试剂和融合蛋白分别进入透化的细胞和细胞的核。

在一些实施方案中，结合试剂(例如，蛋白结合试剂)和融合蛋白在与透化的细胞接触前互相缔合。在这样的实施方案中，缔合的蛋白结合试剂和融合蛋白的尺寸被设置以相互缔合地进入透化的细胞和细胞的核(例如，通过透化的细胞的细胞膜中的开口和/或通过核孔扩散)。在一些实施方案中，与融合蛋白缔合的蛋白结合试剂的尺寸整体被设置以通过细胞的核孔扩散。在一些实施方案中，与融合蛋白缔合的蛋白结合试剂的组合具有以下直径：不多于1nm、不多于2nm、不多于3nm、不多于4nm、不多于5nm、不多于10nm、不多于20nm、不多于30nm、不多于40nm、不多于50nm、不多于60nm、不多于70nm、不多于80nm、不多于90nm、不多于100nm、不多于110nm或不多于120nm，或者由上文提及的值中的任何两个值所定义的范围内的尺寸。在一些实施方案中，包括蛋白结合试剂的组合物与包括融合蛋白的组合物接触，并且蛋白结合试剂和融合蛋白相互缔合，例如通过融合蛋白的特异性结合蛋白结合试剂的结构域。在一些实施方案中，蛋白结合试剂和融合蛋白相互缔合。在一些实施方案中，缔合的蛋白结合试剂和融合蛋白作为结合复合物与透化的细胞接触，其进入透化的细胞并通过细胞的核孔扩散以结合靶蛋白。因此，在本文描述的任何实施方案中，与融合蛋白结合的蛋白结合试剂可以与透化的细胞接触，使得蛋白结合试剂和融合蛋白结合在一起而进入透化的细胞。

在一些实施方案中，结合试剂(例如，蛋白结合试剂)与透化的细胞的靶蛋白结合，其中靶蛋白与细胞的DNA缔合。蛋白结合试剂与靶蛋白的结合可以包括将融合蛋白置于与靶蛋白缔合的DNA邻近处，使得DNA消化酶融合蛋白能够和与靶蛋白缔合的DNA相互作用，并催化与靶蛋白缔合的DNA的消化。融合蛋白的DNA消化酶，可以因此被带到DNA的紧密邻近处内进行DNA的酶促消化。在一些实施方案中，融合蛋白的DNA消化酶消化与靶蛋白缔合的DNA。在一些实施方案中，DNA的消化导致消化的DNA中的单链突出端。在一些实施方案中，与靶蛋白缔合的DNA的消化产生复合物，该复合物包括与结合到靶蛋白的蛋白结合试剂缔合并与消化的DNA缔合的融合蛋白。消化反应可以通过使反应经受螯合剂(包括例如EDTA和/或EGTA)来猝灭或失活。在一些实施方案中，消化反应分两步发生，包括裂解和衔接子整合。

在一些实施方案中，在抗体结合后，将单细胞和带有寡核苷酸的珠置于孔(例如，微升级孔或纳升级孔)中使得来自单细胞的消化的DNA成为独特的标记。在一些实施方案中，在单细胞位于带有珠的孔中以防止消化的DNA/融合蛋白复合物与来自其他细胞的那些混合后，由Mg++、Ca++或酶缓冲液触发消化。

在一些实施方案中，如本文描述的，使所形成的包含融合蛋白、结合试剂(例如，蛋白结合试剂)、靶蛋白和消化的DNA的复合物与包含第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针的组合物接触。任选地，复合物可以在与第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针接触前从透化的细胞中分离。在接触后，第一寡核苷酸探针的第一靶结合区可以与蛋白结合试剂的试剂寡核苷酸杂交。第二寡核苷酸探针的第二靶结合区可以与消化的DNA的单链突出端杂交。第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针与其各自的互补核酸序列的杂交因此导致这些各自的互补序列与基底缔合。在一些实施方案中，去除(例如，通过与蛋白酶K接触)复合物的多肽部分，而核酸保留。在一些实施方案中，去除未结合的核酸(例如，通过与核酸酶诸如ExoI接触)。

一些实施方案还包括对消化的DNA的进一步操纵，包括使寡核苷酸探针延伸以产生多于一种标记的核酸，在基底上捕获复合物、连接、转录、核酸文库构建、测序、免疫沉淀或其他分析。本文公开的方法、组合物和试剂盒可以还包括靶蛋白缔合的DNA的免疫沉淀。本文描述的任何或所有方法可以使用自动化系统(诸如热循环仪或热混合器)来进行，其中逆转录、连接、消化、孵育和/或洗涤和/或其他步骤是自动化的。

本文公开的方法可以还包括逆转录，例如如果RNA或单链DNA与靶蛋白缔合。逆转录可以产生与RNA或单链DNA互补的DNA。在一些情况下，寡核苷酸探针的至少一部分包含用于逆转录反应的引物。

可以进行一个或更多个核酸扩增反应以产生与靶蛋白(靶核酸序列或标记的核酸)缔合的DNA的多个拷贝，例如，以产生核酸文库。扩增可以以多重化方式进行，其中多于一种靶核酸序列同时被扩增。扩增可用于将测序衔接子添加至核酸分子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞和/或分子标记的至少一部分。扩增反应可以包括扩增以下的至少一部分：样品标签、细胞标记、空间标记、分子标记、靶核酸或其组合。扩增反应可以包括扩增多于一种核酸的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％，或者这些值中的任何两个值之间的范围或数量。方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或分子标记的靶-条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。

如本文描述的寡核苷酸探针可以包含通用标记(其在本文中也可称为通用引物位点)、细胞标记、分子标记和样品标记或其任何组合。例如，寡核苷酸探针可以包含分子标记和样品标记。在组合中，样品标记可以区分样品之间的靶核酸，细胞标记可以区分样品中来自不同细胞的靶核酸，分子标记可以区分细胞中不同的靶核酸(例如，相同靶核酸的不同拷贝)，并且通用标记可以用于扩增靶核酸和对靶核酸测序。

如本文描述的通用标记、分子标记、细胞标记、接头标记和/或样品标记中的任何一种都可以包含核苷酸的随机序列。核苷酸的随机序列可以是计算机产生的。核苷酸的随机序列可能没有与之相关联的模式。通用标记、分子标记、细胞标记、接头标记和/或样品标记可以包含核苷酸的非随机(例如，核苷酸包含模式)序列。通用标记、分子标记、细胞标记、接头标记和/或样品标记的序列可以是商购可得的序列。通用标记、分子标记、细胞标记、接头标记和/或样品标记的序列可以包含随机体序列。随机体序列可以指包括给定长度的随机体的所有可能的序列的寡核苷酸序列。可选地或另外地，通用标记、分子标记、细胞标记、接头标记和/或样品标记可以包含预先确定的核苷酸序列。

在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，PCR具有其普通含义并且可以指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸体外扩增特定DNA序列的反应。如本文使用的，PCR可以包括所述反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR和装配PCR。

与靶蛋白缔合的DNA的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性核酸内切酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。

扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括，但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

如本文描述的扩增可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以各自包含，例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个或更多个核苷酸，包括所列值中的任何两个值之间的范围。引物可以各自包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个或更多个核苷酸，包括所列值中的任何两个值之间的范围。引物可以包含少于12个-15个核苷酸。引物可以各自退火至多于一种随机标记的靶的至少一部分。引物可以各自退火至多于一种标记的靶的3’末端或5’末端(例如，本文描述的通用引物结合位点)。引物可以各自退火至多于一种标记的靶的区域，例如内部区。区域可以包含来自多于一个标记的靶的3’末端的至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。引物可以包括一组固定的引物。引物可以包括至少一种或更多种定制引物。举例来说，与靶杂交的寡核苷酸探针的5’部分可以充当用于扩增靶的引物。任选地，引物可以包含至少一种或更多种对照引物。引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。

一种或更多种引物可以包括通用引物和/或定制引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点，诸如如本文描述的PCR手柄(PCR handle)。根据一些实施方案，一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记、靶或其任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以设计成特异性扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总的标记的靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一种或更多种基因和/或基因间核酸。

可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以通过使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增固定在珠上的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR可以添加P5和P7以及样品索引以使PCR产物变成Illumina测序文库。使用150bp×2测序进行的测序可以揭示读段1上的细胞标记和分子标记、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。

在一些实施方案中，可以通过化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或修饰的碱基可以促进其从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性核酸内切酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含dUTP或ddUTP的核酸可以用于将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)核酸内切酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、Ig蛋白A、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。

当寡核苷酸探针是基因特异性时，靶分子可以与探针杂交并且可以被逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，核酸可以被扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多种靶核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。

在一些实施方案中，可以例如通过桥接扩增在基底上进行扩增。cDNA可以加同聚物尾以产生相容末端，用于使用基底上的寡(dT)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’末端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物中的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，模板分子可以退火至第一引物并且第一引物通过添加核苷酸而在正向方向上延长以形成双链体分子，该双链体分子包含模板分子和与模板互补的新形成的DNA链，或由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链组成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补DNA链。在随后的退火和延长步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，通过共价键连接第一引物并通过杂交连接第二引物。在延长阶段，在同一反应混合物中通过添加核苷酸，第二引物可以在反向方向上延长，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子具有的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链可以与同一的颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延长从而将两个新的桥转换成双链桥。

在一些实施方案中，方法包括反复扩增标记的核酸以产生多于一个扩增子。本文公开的方法可以包括重复扩增进行至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个扩增反应。可选地，方法包括进行至少约25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个扩增反应。

扩增可以还包括将一种或更多种对照核酸添加至一个或更多个包含多于一种核酸的样品中。扩增可以还包括将一种或更多种对照核酸添加至多于一种核酸。对照核酸可以包含对照标记。

在一些实施方案中，方法还包括测序。对靶核酸(包括标记的靶核酸)测序可以包括进行测序反应以确定以下的至少一部分的序列：靶核酸、其互补体、其反向互补体或其任何组合。

标记的靶(例如，扩增的核酸、标记的核酸、标记的核酸的cDNA拷贝等)的序列的确定可以使用各种测序方法进行，包括但不限于杂交测序(SBH)、连接测序(SBL)、定量增量荧光核苷酸添加测序(QIFNAS)、逐步连接和裂解、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、TaqMan报告探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠、摆动测序(wobblesequencing)、多重测序、聚合集落(polymerized colony,POLONY)测序；纳米网格滚环测序(nanogrid rolling circle sequencing,ROLONY)、等位基因特异性寡核苷酸连接测定(例如，寡核苷酸连接测定(OLA)、使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA、连接的锁式探针、或使用连接的环形锁式探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA)等。

在一些实施方案中，确定靶核酸或其任何产物的序列包括成对末端测序、纳米孔测序、高通量测序、鸟枪法测序、染料-终止子测序、多引物DNA测序、引物步移(primerwalking)、Sanger双脱氧测序、Maxim-Gilbert测序、焦磷酸测序、真单分子测序或其任何组合。可选地，随机条形码化靶或其任何产物的序列可以通过电子显微镜或化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列来确定。

可以利用高通量测序方法，诸如使用诸如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos或Polonator平台的平台的循环阵列测序。在一些实施方案中，测序可以包括MiSeq测序。在一些实施方案中，测序可以包括HiSeq测序。

测序可以包括每次运行至少约200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个或更多个测序读段。在一些实施方案中，测序包括每次运行测序至少或至少约1500个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000或10000个或更多个测序读段。测序可以包括每次运行少于或等于约1,600,000,000个测序读段。测序可以包括每次运行少于或等于约200,000,000个读段。

根据附图可以理解本文提供的说明书的一些实施方案。参考图1，提供了与融合蛋白125缔合的结合试剂(例如，蛋白结合试剂105)，融合蛋白125包含消化酶120和特异性结合蛋白结合试剂105的结构域130。蛋白结合试剂105包含试剂寡核苷酸110。在一些实施方案中，试剂寡核苷酸110包括捕获序列，例如多A序列115。如本文讨论的，注意到在一些实施方案中，捕获序列可以是不同于多A序列的序列。在一些实施方案中，诸如图1所示，蛋白结合试剂105与融合蛋白125缔合以形成缔合的蛋白101。例如，蛋白结合试剂105可以非共价或共价结合到融合蛋白125以形成缔合的蛋白101。

如图2所示，透化的细胞205包含与透化的细胞205的核210内的DNA215缔合的核靶(例如，靶蛋白225)。核靶可以包括DNA(例如，甲基化的DNA)或核蛋白(例如，gDNA缔合的蛋白)。在一些实施方案中，DNA 215也可以与其他蛋白诸如脱靶蛋白(off-target protein)220缔合。在一些实施方案中，透化的细胞205与缔合的蛋白101接触，缔合的蛋白101进入透化的细胞205并与靶蛋白225结合，形成包含与靶蛋白225结合的缔合的蛋白101的透化的细胞205。在一些实施方案中，透化的细胞205与蛋白结合试剂105和融合蛋白125接触，融合蛋白125进入透化的细胞205并形成缔合的蛋白101。缔合的蛋白可以与透化的细胞205的核210中的靶蛋白225结合，形成包含与靶蛋白225结合的缔合的蛋白101的透化的细胞205。

如图3所示，融合蛋白125的DNA消化酶120消化DNA 215，并且缔合的蛋白101形成复合物305，复合物305包含蛋白结合试剂105、融合蛋白125、靶蛋白225和具有单链突出端的消化的DNA 215。图3示出了从透化的细胞205中取出的复合物305。在一些实施方案中，方法包括细胞裂解(例如，通过化学或生物化学手段，通过渗透休克，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解)来释放复合物。

图4描绘了第一寡核苷酸探针405和第二寡核苷酸探针410，各自固定到珠415。在一些实施方案中，第一寡核苷酸探针405包括第一靶结合区406。在一些实施方案中，第一靶结合区406包含多T序列，基本上由多T序列组成，或由多T序列组成。在一些实施方案中，第二寡核苷酸探针410包括第二靶结合区412。在一些实施方案中，第二寡核苷酸探针410包含第二多T序列411，基本上由第二多T序列411组成，或由第二多T序列411组成。

如图5A所示，使复合物305与包括第一寡核苷酸探针405和第二寡核苷酸探针410的基底415接触导致第一靶结合区406与试剂寡核苷酸110的杂交，以及第二靶结合区410与消化的DNA 215的单链突出端的杂交。因此，图5A示出了将复合物305捕获到珠415。在这样的实施方案中，未被捕获到珠上的物质，包括细胞或其组分，例如通过洗涤被去除。

如图5B所示，在一些实施方案中，捕获的复合物可以经历连接和逆转录。这样的步骤可以在自动化仪器(诸如热混合器)中进行。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。根据本文提供的一些实施方案产生的标签片段化产物可以包括空位。DNA片段之间的空位可以通过空位填充酶(诸如DNA聚合酶(例如，Klenow))来填充。如图5C所示，在一些实施方案中，去除蛋白，包括蛋白结合试剂、融合蛋白和靶蛋白。任选地，可以去除多肽，例如通过用蛋白酶K处理捕获的复合物。此外，可以去除未结合的核酸，例如通过与核酸酶(诸如ExoI)接触来去除。如图5D所示，在一些实施方案中，杂交的核酸可以经历进一步的处理以将捕获的复合物的核酸(例如，消化的DNA和试剂寡核苷酸)条形码化，包括例如变性、随机引物延伸和/或聚合酶链式反应。图6描绘了文库的产生，其中固定在基底上的核酸序列包含通用引物结合位点(诸如PCR手柄)、细胞标记(CL)、独特分子标识符(UMI)、捕获序列(例如，多T)和靶DNA序列。可以进行随机引物延伸以产生文库，在一些实施方案中，文库可以包括P5和P7引物衔接子序列。

在一些实施方案中，组合物和方法包括多重构建，使得它们适于多重标记和/或分析。例如，可以提供多于一种结合试剂(例如，蛋白结合试剂)，所述多于一种结合试剂与不同靶蛋白特异性结合并且各自都包括不同的试剂寡核苷酸。在多重构建中，提供了多于一种第一寡核苷酸探针，各自针对不同的试剂寡核苷酸具有特异性。多于一种第一寡核苷酸探针中的每一种能够与不同的试剂寡核苷酸杂交，使得多于一种靶蛋白被捕获。每种靶蛋白可以与不同的DNA缔合，其每一种都可以被多重分析、标记或测序。在多重实施方案中，多于一种结合试剂(例如，蛋白结合试剂)可以包含至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种或更多种独特的蛋白结合试剂，或者在由上文提及的值中的两个或更多个限定的范围内的量，每种结合试剂与独特的靶蛋白特异性结合。注意到在多种实施方案中，细胞可以和与融合蛋白缔合(例如，结合)的靶结合蛋白接触，使得特定的靶结合蛋白与特定的DNA消化酶缔合。

使寡核苷酸探针附加有靶结合区的方法

本文提供的一些实施方案涉及使寡核苷酸探针附加有靶结合区的方法。方法可以包括提供包含样品标识符序列和杂交结构域的寡核苷酸探针。举例来说，寡核苷酸探针可以固定到基底，诸如珠、孔、阵列、板或管。寡核苷酸探针可以与部分双链的DNA(dsDNA)模板接触，该部分双链的DNA(dsDNA)模板包含(i)模板链，该模板链包含与杂交结构域的至少一部分互补的单链互补杂交结构域和与靶结合区互补的序列(例如，靶核酸序列)以及(ii)包含靶结合区的互补链。互补链的靶结合区可以与模板链的靶核酸序列杂交。杂交结构域可以与互补杂交结构域杂交。dsDNA模板可以连接到寡核苷酸探针。dsDNA可以变性。模板链可以被去除。因此，剩余的链可以包含寡核苷酸探针和附加于其的靶结合区。注意到如本文描述的使寡核苷酸附加有靶结合区的任何方法可以与如本文描述的标记靶蛋白缔合的DNA的任何方法结合使用。例如，使用本文描述的方法，可以将定制的靶结合区附加到本文描述的任何寡核苷酸探针。对于标记靶蛋白缔合的DNA的方法(包括两种或更多种不同靶蛋白的多种标记)，定制的靶结合区可用于区分不同靶结合蛋白的独特标识符，使得特定的靶结合蛋白固定在特定的基底上(使得与特定靶蛋白缔合的DNA序列可以被标识)。

在一些实施方案中，杂交结构域是多T序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针还包括聚合酶链式反应(PCR)手柄(诸如通用引物结合位点)、细胞标记和/或独特分子标识符。在一些实施方案中，方法还包括提供包括模板链和互补链的双链DNA(dsDNA)模板。在一些实施方案中，模板链包括与寡核苷酸探针的杂交结构域的至少一部分互补的序列。因此，当寡核苷酸探针的杂交结构域是多T序列时，模板链包含多A序列。在一些实施方案中，与靶结合区互补的序列包含靶核酸序列。靶核酸序列可以包括感兴趣的序列，诸如感兴趣的靶序列。在一些实施方案中，互补链与模板链的靶结合区互补。模板链的互补杂交结构域因此是能够与寡核苷酸探针的杂交结构域杂交的单链突出端。在一些实施方案中，模板链附接至生物素。

在一些实施方案中，方法还包括在寡核苷酸探针的杂交结构域与dsDNA模板的模板链的互补杂交结构域杂交的条件下使寡核苷酸探针与dsDNA模板接触。在一些实施方案中，方法包括将寡核苷酸探针连接到dsDNA模板。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可用于连接两个片段(例如，寡核苷酸探针和包含互补链的dsDNA模板)。在连接后，寡核苷酸探针可以包含附加到其上的互补链。在一些实施方案中，方法包括使dsDNA模板变性。在一些实施方案中，方法包括去除dsDNA模板的模板链。去除模板链可以包括当模板链附接到生物素时与链霉抗生物素蛋白接触。生物素可以与链霉抗生物素蛋白结合，并且结合的生物素-链霉抗生物素蛋白-模板链可以被去除。例如，链霉抗生物素蛋白可以固定在基底(例如珠)上，并且基底可以和与其缔合的生物素-链霉抗生物素蛋白-模板链一起去除。

如图7A-7C所示，显示了根据一些实施方案用靶结合区标记寡核苷酸探针的方法。如图7A所示，提供了具有包含杂交结构域706的寡核苷酸探针705的基底(诸如珠)710。在该实施方案中，杂交结构域706包含多T序列，基本上由多T序列组成，或由多T序列组成。如图7B所示，提供了dsDNA模板。dsDNA模板包含模板链715和互补链718。模板链715包含杂交结构域的互补体716。在这个实例中，杂交结构域的互补体716是多A序列，尽管应当理解可以使用任何合适的杂交结构域和互补体。模板链715包括靶结合区717，并且附接于生物素720。使基底710与dsDNA模板接触导致杂交结构域706与互补杂交结构域716杂交。然后将dsDNA模板连接到寡核苷酸探针705，如图7C所示。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。图8描绘了通过与结合生物素720的链霉抗生物素蛋白805接触去除dsDNA模板的模板链，使得当去除链霉抗生物素蛋白805时去除模板链。举例来说，链霉抗生物素蛋白805可以固定在基底上，使得在去除基底时，去除结合到生物素720的链霉抗生物素蛋白805和模板链。如图9所示，用靶结合区标记的寡核苷酸探针可用于与感兴趣的靶序列结合。

本文描述的任何方法和组合物都可以实施到系统或试剂盒中。因此，本文提供的一些实施方案涉及包含如本文描述的任何结合试剂(例如，蛋白结合试剂)、如本文描述的任何融合蛋白、如本文描述的任何第一寡核苷酸探针，和如本文描述的任何第二寡核苷酸探针的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒的第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针固定在如本文描述的基底上，诸如固体表面、珠、微阵列、板、管或孔上。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于进行反应的组合物，诸如试剂，所述试剂包括用于随机引发的试剂(例如，随机引物和聚合酶)、用于测序的试剂(例如，通用引物)、用于细胞透化的试剂(例如，去污剂)、用于DNA消化的试剂(例如，DNA酶)、用于连接的试剂(例如，连接酶)、用于逆转录的试剂(例如，逆转录酶)和/或用于产生核酸文库的试剂(例如，聚合酶)。因此，这样的试剂可以包括，例如，DNA限制性酶、核酸酶(诸如微球菌核酸酶)、溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶、Klenow聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5和P7衔接子序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。

在一些实施方案中，试剂盒包含包括如本文描述的样品标识符序列和杂交结构域的任何寡核苷酸探针和dsDNA模板。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于标记寡核苷酸探针的试剂，包括，例如，连接酶和/或变性剂(例如，碱)。在一些实施方案中，寡核苷酸探针固定在基底上，诸如固体表面、珠、微阵列、板、管或孔上。

本文描述的一些实施方案还涉及细胞组合物。细胞组合物可以包含细胞，该细胞包含与DNA缔合的靶蛋白和与靶DNA结合的复合物，其中该复合物是如本文描述的包含如本文描述的任何蛋白结合试剂和如本文描述的任何融合蛋白的任何复合物。

本文公开的方法和试剂盒可以包括使用一种或更多种试剂。试剂的实例包括，但不限于，PCR试剂、连接试剂、逆转录试剂、酶试剂、杂交试剂、样品制备试剂、透化试剂(例如，去污剂)、变性试剂和用于核酸纯化和/或分离的试剂。

本文公开的方法和试剂盒可以包括使用一种或更多种缓冲液。缓冲液的实例包括，但不限于，洗涤缓冲液、连接缓冲液、杂交缓冲液、扩增缓冲液和逆转录缓冲液。在一些情况下，杂交缓冲液是商购可得的缓冲液，诸如TMAC Hyb溶液、SSPE杂交溶液和ECONO^TM杂交缓冲液。本文公开的缓冲剂可以包括一种或更多种去污剂。

本文公开的方法和试剂盒可以包括使用一种或更多种运载体。运载体可以增强或改进本文公开的一种或更多种反应(例如，连接反应、逆转录、扩增、杂交)的效率。运载体可以减少或防止分子或其任何产物(例如，标记的分子、标记的cDNA分子、标记的扩增子)的非特异性损失。例如，运载体可以通过吸附到表面来减少标记的分子的非特异性损失。运载体可以降低分子、标记的分子或其任何产物与表面或基底(例如容器、Eppendorf管、移液管尖端)的亲和力。可选地，运载体可以增加分子或其任何产物对表面或基底(例如珠、阵列、玻璃、载玻片、芯片)的亲和力。运载体可以保护分子或其任何产物不被降解。例如，运载体可以保护RNA分子或其任何产物免受核糖核酸酶的影响。可选地，运载体可以保护DNA分子或其任何产物免受DNA酶的影响。运载体的实例包括，但不限于，核酸分子诸如DNA和/或RNA，或多肽。DNA运载体的实例包括质粒、载体、多腺苷酸化的DNA和DNA寡核苷酸。RNA载体的实例包括多腺苷酸化的RNA、噬菌体RNA、噬菌体MS2 RNA、大肠杆菌(E.coli)RNA、酵母RNA、酵母tRNA、哺乳动物RNA、哺乳动物tRNA、短的多腺苷酸化合成RNA和RNA寡核苷酸。RNA运载体可以是多腺苷酸化的RNA。可选地，RNA运载体可以是非多腺苷酸化的RNA。在一些实例中，运载体来自细菌、酵母或病毒。例如，运载体可以是来源于细菌、酵母或病毒的核酸分子或多肽。例如，运载体是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的蛋白。在另一种实例中，运载体是来自大肠杆菌(Escherichia coli)的核酸分子。可选地，运载体是来自哺乳动物(例如，人类、小鼠、山羊、大鼠、奶牛、绵羊、猪、狗或兔)、鸟类、两栖动物或爬行动物的核酸分子或肽。

本文公开的方法和试剂盒可以包含使用一种或更多种对照剂。对照剂可以包括对照寡核苷酸、非活性酶、非特异性竞争物。可选地，对照剂包括亮杂交(brighthybridization)、亮探针对照(bright probe controls)、核酸模板、加标(spike-in)对照、PCR扩增对照。PCR扩增对照可以是阳性对照。在其他情况下，PCR对照是阴性对照。核酸模板对照可以是已知浓度的。对照剂可以包括一种或更多种标记。

加标对照可以是添加到反应或样品中的模板。例如，可以将加标模板添加到扩增反应。可以在第一个扩增循环后的任何时间将加标模板添加到扩增反应。在一些情况下，在第2个、第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个、第10个、第11个、第12个、第13个、第14个、第15个、第20个、第25个、第30个、第35个、第40个、第45个或第50个扩增循环后，将加标模板添加到扩增反应。可以在最后一个扩增循环前的任何时间将加标模板添加到扩增反应。加标模板可以包含一个或更多个核苷酸或核酸碱基对。加标模板可以包含DNA、RNA或其任何组合。加标模板可以包含一种或更多种标记。

标记核靶缔合的DNA的组合物和方法

在一些实施方案中，提供了用于标记细胞中核靶缔合的DNA的方法和组合物。本文公开了包括进行修饰的抗体介导的标签片段化(tagmentation)的方法。提供了用于本文提供的各种表观遗传学方法的修饰的抗体。目前，Tn5转座酶被广泛用于产生具有特定DNA标签的片段化的DNA(例如，标签片段化)。本文公开了包括靶向用于标签片段化的DNA的特定区域的酶缀合抗体，所述用于标签片段化的DNA的特定区域与感兴趣的表观遗传标记相关。通过将Tn5酶与对那些表观遗传标记(例如组蛋白修饰、DNA甲基化)有特异性的抗体缀合，可以产生与表观遗传标记缔合的DNA文库并进行测序。已经使用目前可用的方法通过亚硫酸氢盐测序研究了DNA甲基化组，但是为了鉴定甲基化组谱，必须对整个基因组进行测序，导致高测序成本。根据本文提供的一些实施方案，为了靶向感兴趣的区域，可以使用检测高度甲基化的区域的结合试剂(例如抗体)或甲基化的DNA结合蛋白来产生特定区域的文库，并且然后可以进行亚硫酸氢盐测序以降低测序成本。这种成本的大幅降低可以改进单细胞甲基化组研究。

不受任何特定理论的约束，与抗体或抗体的Fab形式直接缀合来产生Tn5酶(Tn5ase)可以增加对细胞的可及性(accessibility)并导致改进的测定效率。本文提供的组合物和方法可以扩展到其他应用和更多各异的抗体，包括用于甲基化组分析，并且对于每种表观遗传技术以及甚至在单细胞水平(例如，使用BD Rhapsody系统)，Hi-C/ChIPseq可以允许更小的样品尺寸。Tn5和蛋白A融合蛋白可在抗体与蛋白原位结合后加入。然而，在一些实施方案中，多个结合/洗涤步骤会产生背景和对捕获所有抗体结合区的低效率。通过将酶与抗体直接缀合，这个问题可以得到解决。此外，借助于本文提供的方法和组合物，有可能保存细胞中的mRNA，这使用户能够同时分析表观遗传标记和转录组以实现多组学方法。

提供了与Tn5酶直接缀合的结合试剂(例如，抗体，或与感兴趣的蛋白特异性结合的任何蛋白结合剂)用于各种测定，诸如，例如甲基化组分析、ChIP、HiC或任何种类的使用抗体靶向基因组上感兴趣的区域的测定。核靶可以是任何DNA结合蛋白或修饰的DNA(例如，任何抗体可识别的实体)。核靶可以是染色质结合蛋白。在一些实施方案中，结合试剂(例如，抗体)包括结合试剂寡核苷酸(例如，MI寡核苷酸)。在一些实施方案中，抗体上的MI寡核苷酸是任选的(例如，由于Tn5酶也对切下的DNA加标签，因此在不存在与抗体结合的寡核苷酸的情况下可以进行单细胞(例如，Rhapsody)方案)。

在一些实施方案中，提供了用于抗体介导的标签片段化的方法和组合物。结合试剂可以是修饰的抗体。提供了与Tn5转座酶缀合的结合试剂(例如，抗体)。结合试剂可以是Fab片段与Tn5转座酶的缀合物。本文的公开内容包括对具有DNA条形码的核蛋白或甲基化的核苷酸以及与蛋白G或A缀合的Tn5转座酶有特异性的抗体。本文的公开内容包括对具有DNA条形码的核蛋白或甲基化的核苷酸直接缀合的Tn5转座酶有特异性的抗体及其片段(例如Fab片段)。本文提供的方法和组合物的应用包括ChIP-Seq、Hi-C/ChIP-seq(例如，对特定蛋白或修饰的组蛋白附近的染色质结构进行寻址)、确定甲基化组信息(例如，使用甲基化的半胱氨酸抗体以标签片段化该区域并进行亚硫酸氢盐测序，这可以降低测序成本)，以及任何使用抗体的测序技术。本文公开了包括具有一种或更多种DNA条形码缀合的Fab-Tn5的产生以能够容易地接近细胞从而改进分析性能。

图10A-10B是本文提供的用于标记单细胞中核靶缔合的DNA的缀合物的非限制性示意性图示。在一些实施方案中，提供了对核靶(例如，核蛋白或甲基化的核苷酸)有特异性的结合试剂(例如，抗体1002)。在一些实施方案中提供了转座体。转座体可以包含同二聚体或异二聚体。转座体可以包含转座酶。转座酶可以包括Tn5转座酶。Tn5转座酶可以包括转座酶单体1004a和1004b。Tn5转座酶单体1004a可以包含第一衔接子1008a和与结合试剂特异性结合的结构域1006a(例如，蛋白A或G)。Tn5转座酶单体1004b可以包含第二衔接子1008b和与结合试剂特异性结合的结构域1006b(例如，蛋白A或G)。第一衔接子1008a可以包含第一条形码1010a(例如，T5条形码)并且第二衔接子1008b可以包含第二条形码1010b(例如，T7条形码)。结合试剂和转座体可以在与细胞接触前、与细胞接触后、进入核前、进入核后或其任何组合形成缀合物。本文的公开内容包括包含与转座体直接缀合的对核靶(例如，核蛋白或甲基化的核苷酸)有特异性的结合试剂(例如，抗体1002)的缀合物1012。转座体可以包含同二聚体或异二聚体。转座体可以包含转座酶。转座酶可以包括Tn5转座酶。Tn5转座酶可以包括转座酶单体1016a和1016b。Tn5转座酶单体1016a可以包含第一衔接子1018a并且Tn5转座酶单体1016b可以包含第一衔接子1018b。第一衔接子1018a可以包含第一条形码1020a(例如，T5条形码)并且第二衔接子1018b可以包括第二条形码1020b(例如，T7条形码)。

本文的公开内容包括标记细胞中核靶缔合的DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化。dsDNA可以是基因组DNA(gDNA)。方法可以包括：使核靶与包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂的消化组合物接触以产生各自包含单链突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如核靶缔合的gDNA片段)，其中每种结合试剂包括结合试剂特异性寡核苷酸，该结合试剂特异性寡核苷酸包含针对结合试剂的独特标识符序列。方法可以包括：使用第一多于一种寡核苷酸条形码将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段各自包含与核靶缔合的dsDNA片段的至少一部分互补的序列，其中第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交的第一靶结合区。条形码化核靶缔合的DNA片段可以是单链的或双链的。方法可以包括：使用第二多于一种寡核苷酸条形码将结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化以产生多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与独特标识符序列的至少一部分互补的序列，其中第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的第二靶结合区。

使核靶与消化组合物接触可以包括使消化组合物与透化的细胞接触。使核靶与组合物接触可以包括使结合试剂和DNA消化酶进入透化的细胞并且结合试剂与核靶结合。消化组合物可以包含含有结合试剂和消化酶的融合蛋白。融合蛋白的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。消化组合物可以包含含有结合试剂和消化酶的缀合物。缀合物的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。DNA消化酶可以包含能够与结合试剂特异性结合的结构域。DNA消化酶的结构域可以包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种。当与透化的细胞接触时，结合试剂和DNA消化酶可以彼此分开。结合试剂和DNA消化酶可以分别进入细胞。DNA消化酶可以在细胞的核内与结合试剂结合。DNA消化酶可以在进入细胞的核之前与结合试剂结合。与结合试剂结合的DNA消化酶的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。DNA消化酶可以在结合试剂与核靶结合前与结合试剂结合。与结合试剂结合的缀合物、融合蛋白和/或DNA消化酶可以具有不多于120nm的直径。

第一靶结合区可以与核靶缔合的dsDNA片段的单链突出端的至少一部分互补。在本文提供的方法的一些实施方案中，使核靶与消化组合物接触产生包含结合试剂、DNA消化酶和核靶缔合的dsDNA片段的复合物。将多于一种核靶缔合的dsDNA片段条形码化可以包括使所述复合物与第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码接触。方法可以包括用蛋白酶(例如，蛋白酶K)消化复合物。DNA消化酶可以包括限制性酶、微球菌核酸酶I、转座酶、其功能片段或其任何组合。转座酶可以包括Tn5转座酶。消化组合物可以包含具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子中的至少一种。将结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化可以包括使与结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的第二多于一种寡核苷酸条形码延伸。结合试剂寡核苷酸可以包含与第二靶结合区互补的序列。方法可以包括获得多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列数据。获得多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息可以包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分连接到多于一种条形码结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。

本文的公开内容包括标记细胞中核靶缔合的DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化；使核靶与包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂的缀合物接触以产生各自包含第一5’突出端和第二5’突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及使用第一多于一种寡核苷酸条形码将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，其中第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物杂交的第一靶结合区。条形码化核靶缔合的DNA片段可以是单链的或双链的。细胞可以包括来源于样品的单个细胞。样品可以包括多于一个细胞。细胞可以与两种或更多种缀合物接触(例如，多重化)。两种或更多种缀合物可以包含针对不同核靶的结合试剂。两种或更多种缀合物可以包含相同或不同的转座体。转座体可以包含衔接子，其中序列标识出哪种核靶被结合。

将多于一种核靶缔合的dsDNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)或其产物条形码化可以包括将核靶缔合的dsDNA片段或其产物连接到第一多于一种寡核苷酸条形码。将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化可以包括使杂交到多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的第一多于一种寡核苷酸条形码延伸。第一衔接子可以包含第一条形码序列并且第二衔接子可以包含第二条形码序列。在一些实施方案中，第一条形码序列和/或第二条形码序列标识核靶。第一5’突出端和/或第二5’突出端可以包含多(dA)区、多(dT)区或其任何组合。第一5’突出端和/或第二5’突出端可以包含与第一靶结合区互补的序列或其互补体。第一靶结合区可以包含与核靶缔合的dsDNA片段的5’区、3’区或内部区的至少一部分互补的序列。第一衔接子和/或第二衔接子可以包含转座子的DNA末端序列。

透化可以包括化学或物理透化。透化可以包括使细胞与去污剂和/或表面活性剂接触。透化可以包括通过声处理使细胞透化。方法可以包括：使细胞中的核透化以产生透化的核。方法可以包括：在使核透化之前固定包含核的细胞。

核靶可以包括甲基化的核苷酸、DNA缔合的蛋白、染色质缔合的蛋白或其任何组合。核靶可以包括ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol II Ser2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol IISer2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1或其任何组合。

在一些实施方案中，结合试剂特异性结合到包含甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基的表位，该组蛋白残基选自由以下组成的组：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化或其任何组合。结合试剂可以包括四聚体、适配体、蛋白支架或其任何组合。结合试剂可以包含抗体或其片段(例如，单克隆抗体)。抗体或其片段可以包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。

结合试剂可以经由化学偶联、遗传融合、非共价结合或其任何组合与转座体缀合。缀合物可以通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。缀合物可以通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。缀合物可以通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。结合试剂可以经由蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种与转座体缀合。转座酶可以包括Tn5转座酶。在一些实施方案中，转座体包含与结合试剂特异性结合的结构域，其中结合试剂和转座体在与透化的细胞接触时彼此分开，并且分别进入细胞，并且其中转座体在细胞的核内与结合试剂结合。在一些实施方案中，转座体在进入透化的细胞之前与结合试剂结合，并且其中与结合试剂结合的转座体的尺寸被设置以通过核孔进入细胞的核。在一些实施方案中，缀合物具有不多于120nm的直径。转座体、结合试剂和/或缀合物具有的直径可以是至少以下或是至多以下：1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、128nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。结合试剂和转座体各自的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。透化的细胞可以包含含有染色质的完整的核，染色质在结合试剂与核靶结合时保持与基因组DNA缔合。在一些实施方案中，结合试剂与核靶的结合发生在透化的细胞的核中。

方法可以包括：获得多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段(例如，核靶缔合的gDNA片段)或其产物的序列数据。方法可以包括：基于获得的测序数据中的多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物的序列确定与gDNA相关的信息。确定与gDNA相关的信息可以包括基于获得的测序数据中多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列确定gDNA的基因组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA缔合的核小体。确定gDNA的基因组信息可以包括：通过将多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列与gDNA的参考序列比对来确定gDNA的至少一部分序列。确定与gDNA相关的信息可以包括基于获得的测序数据中多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列确定gDNA的甲基化组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA缔合的核小体。方法可以包括：对多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一种转化的核靶缔合的dsDNA片段。化学转化可以包括亚硫酸氢盐处理，并且酶促转化可以包括APOBEC介导的转化。将多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化可以包括将多于一种转化的核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化。确定甲基化组信息可以包括：确定测序数据中具有胸腺嘧啶碱基的多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的位置以及gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定gDNA中具有甲基胞嘧啶碱基、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基和/或N6-甲基腺嘌呤(m(6)A)碱基的相应位置。方法可以包括：Hi-C/ChiP-seq、ChiP-seq、Hi-C、染色质构象捕获(3C)、环化染色质构象捕获(4C)、碳拷贝染色体构象捕获(5C)、染色质免疫沉淀(ChiP)、ChIP-Loop、组合3C-ChIP-克隆(6C)、捕获-C或其任何组合。

细胞可以包含核酸靶的拷贝。方法可以包括确定细胞中核酸靶的拷贝数。方法可以包括：使第二多于一种寡核苷酸条形码与核酸靶的拷贝接触进行杂交；使与核酸靶的拷贝杂交的第二多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化核酸分子，所述多于一种条形码化核酸分子各自包含与核酸靶的至少一部分互补的序列和分子标记；以及获得多于一种条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定细胞中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，使第一多于一种寡核苷酸条形码和/或第二多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶(例如，Klenow片段)使多于一种寡核苷酸条形码延伸。逆转录酶可以包括病毒逆转录酶(例如，病毒逆转录酶诸如鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)。核酸靶可以包括核酸分子(例如，核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合)。第一靶结合区和/或第二靶结合区可以包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。获得多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段(例如核靶缔合的gDNA片段)的序列信息可以包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物。获得多于一种条形码化核酸分子的序列信息可以包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一种条形码化核酸分子或其产物。

在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列，并且其中第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第二通用序列。在一些实施方案中，第一通用序列和第二通用序列可以是相同或不同的。第一通用序列和/或第二通用序列可以包含以下的结合位点：测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。测序衔接子可以包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。测序引物可以包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码各自可以包含分子标记。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种可以包含不同的分子标记序列。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的每一种分子标记可以包含至少6个核苷酸。

第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码可以与固体支持物缔合。与相同的固体支持物缔合的第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码各自可以包含相同的样品标记。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的每一种样品标记可以包含至少6个核苷酸。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码各自可以包含细胞标记。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的每一种细胞标记可以包含至少6个核苷酸。与相同的固体支持物缔合的第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的寡核苷酸条形码可以包含相同的细胞标记。与不同的固体支持物缔合的第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的寡核苷酸条形码可以包含不同的细胞标记。固体支持物可以包括合成颗粒、平坦表面，或其组合。方法可以包括：使包含第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码的合成颗粒与细胞缔合。方法可以包括：在使合成颗粒与细胞缔合后将细胞裂解。将细胞裂解可以包括加热细胞、使细胞与去污剂接触、改变细胞的pH，或其任何组合。合成颗粒和单细胞可以在同一分区(例如，孔或液滴)中。在一些实施方案中，第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码是固定或部分地固定在合成颗粒上的，或者第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码是包封或部分地包封在合成颗粒中的。

合成颗粒可以是可破坏的(例如，可破坏的水凝胶颗粒)。合成颗粒可以包括珠，任选地珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。合成颗粒可以包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，以及其任何组合。第一多于一种寡核苷酸条形码和第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码可以包含接头官能团。合成颗粒可以包含固体支持物官能团。在一些实施方案中，支持物官能团和接头官能团彼此缔合，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。

本文的公开内容包括试剂盒。试剂盒可以包含消化组合物，所述消化组合物包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中结合试剂包含结合试剂特异性寡核苷酸，该结合试剂特异性寡核苷酸包含针对结合试剂的独特标识符序列。DNA消化酶可以包括限制性酶、微球菌核酸酶I、转座酶(例如，Tn5转座酶)、其功能片段或其任何组合。消化组合物可以包含具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子中的至少一种。消化组合物可以包含含有结合试剂和消化酶的融合蛋白。融合蛋白的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。消化组合物可以包含含有结合试剂和消化酶的缀合物。缀合物的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。DNA消化酶可以包含能够与结合试剂特异性结合的结构域。DNA消化酶的结构域可以包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种。与结合试剂结合的DNA消化酶的尺寸可以被设置以通过细胞的核孔扩散。试剂盒可以包含蛋白酶(例如蛋白酶K)。

本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含缀合物，所述缀合物包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。试剂盒可以包含：缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶(例如，包括Klenow片段)。试剂盒可以包含：逆转录酶，任选地其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，并且任选地病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。试剂盒可以包含：连接酶。试剂盒可以包含：去污剂和/或表面活性剂。试剂盒可以包含：缓冲液、筒或两者。试剂盒可以包含：一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。

核靶可以包括DNA缔合的蛋白或染色质缔合的蛋白。核靶可以包括甲基化的核苷酸。核靶可以包括ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol II Ser2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol IISer2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1或其任何组合。在一些实施方案中，结合试剂特异性结合到包含甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基的表位，该组蛋白残基选自由以下组成的组：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化或其任何组合。结合试剂可以包含四聚体、适配体、蛋白支架或其任何组合。结合试剂可以包含抗体或其片段(例如，单克隆抗体)。抗体或其片段可以包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。

结合试剂可以经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与转座体缀合。缀合物可以通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。缀合物可以通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。缀合物可以通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。结合试剂可以经由蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种与转座体缀合。转座酶可以包括Tn5转座酶。在一些实施方案中，缀合物具有不多于120nm的直径。转座体、结合试剂和/或缀合物具有的直径可以是至少以下或是至多以下：1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、128nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。结合试剂和转座体各自的尺寸可以被设置以通过核孔扩散。

试剂盒可以包含：多于一种寡核苷酸条形码。多于一种寡核苷酸条形码中的每一种可以包含分子标记和靶结合区。多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种可以包含不同的分子标记序列。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。寡核苷酸条形码可以包含相同的样品标记和/或相同的细胞标记。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸条形码的每一种样品标记和/或细胞标记包含至少6个核苷酸。多于一种寡核苷酸条形码的每一种分子标记可以包含至少6个核苷酸。

多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种可以是部分地固定在合成颗粒上的。多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种可以是固定或部分地固定在合成颗粒上的；和/或多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种可以是包封或部分地包封在合成颗粒中的。合成颗粒可以包括珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。合成颗粒可以包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，以及其任何组合。所述多于一种寡核苷酸条形码中的每一种包含接头官能团。合成颗粒可以包含固体支持物官能团。支持物官能团和接头官能团可以彼此缔合。接头官能团和支持物官能团可以单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。

实施例

本文描述的实施方案的一些方面在以下实施例中进一步详细公开，其并不是以任何方式意在限制本公开内容的范围。

实施例1

使寡核苷酸探针附加有靶结合区

本实施例描述了根据本文描述的一些实施方案使寡核苷酸探针附加有靶结合区。

提供了寡核苷酸探针，其中寡核苷酸探针包含样品标识符序列和杂交结构域。寡核苷酸探针包括PCR手柄(诸如通用引物结合位点)、细胞标记和独特分子标识符(UMI)。杂交结构域可以是具有七个连续胸苷的多T序列，如图7A所示。杂交结构域可以包含不同长度的多(dT)区。多(dT)区的长度可以是以下或是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、18个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。寡核苷酸探针被固定到珠。寡核苷酸探针不包含靶结合区。靶结合区是与靶序列特异性结合(互补)的序列。

提供了dsDNA模板，其中dsDNA模板包含模板链和互补链。模板链包含互补杂交结构域，所述互补杂交结构域是具有七个连续的腺嘌呤的多A序列，如图7B所示。模板链还包含与靶结合区互补的序列并与互补链杂交，互补链包括为TCGCATGTG的靶结合区序列，在图7B中被标识为NNNNN，其中靶结合区序列与靶序列特异性结合(互补)。应当理解本实施例的靶结合区序列是示例性的，并且图7B所示的序列(NNNN)可以是长度为约1个至约40个核苷酸的任何序列。模板链附接到生物素。

寡核苷酸探针与dsDNA模板接触，并且模板链的多A序列与寡核苷酸探针的互补多T序列杂交。寡核苷酸探针连接到互补链，如图7C所示，并且互补链通过经受变性剂从模板链变性。连接酶用于连接片段。模板链通过与链霉抗生物素蛋白接触去除，链霉抗生物素蛋白与生物素结合从而去除模板链，如图8所示。寡核苷酸探针因此用靶结合区标记。

实施例2

标记单细胞的靶蛋白缔合的DNA

本实施例描述了根据本文描述的一些实施方案的标记单细胞的靶蛋白缔合的DNA。

提供了单细胞，其中所述单细胞包含与DNA缔合的感兴趣的靶蛋白。单细胞经受透化条件(例如，与0.1％Triton X-100接触10分钟)，其中单细胞被透化。透化的细胞与结合试剂(例如，蛋白结合试剂)抗组蛋白H3抗体(如由Abcam提供的，以目录#ab8895列出)和融合蛋白接触。蛋白结合试剂与感兴趣的靶蛋白(在本例中，组蛋白H3)特异性结合。蛋白结合试剂包含试剂寡核苷酸、包含独特标识符序列的寡核苷酸标签和多A标签。融合蛋白包含DNA消化酶EcoRI和蛋白A，其与抗组蛋白H3抗体结合，如图1所示。使单细胞与抗体/消化酶复合物接触导致复合物进入细胞核并与靶蛋白结合，靶蛋白与DNA缔合，如图2所示。可选地，抗体可以在细胞与消化酶接触前或后分别与透化的细胞接触，使得复合物的每个组分分别进入细胞并且使得抗体/消化酶的复合物在细胞核内原位形成。

使核内具有复合物的透化的细胞经历酶消化，使得消化酶裂解DNA，并释放包含抗体、消化酶、靶蛋白和缔合DNA的复合物，如图3所示。消化的DNA包含单链突出端，这是消化酶产生限制性位点突出端的结果。图3所示的复合物与实施例1中制备的具有寡核苷酸探针的珠接触，并如图4所示。珠包含第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针。第一寡核苷酸探针是缺乏靶结合区但是具有与附接于抗体的多A序列互补的多T序列的探针，因此与抗体上的试剂寡核苷酸杂交。第二寡核苷酸探针包含在图4中被标识为NNNN的靶结合区，并该靶结合区与消化的DNA上的单链突出端互补，导致与消化的DNA杂交，如图5A所示。各个片段被连接并逆转录，如图5B所示。

所有的蛋白质组分，包括抗体、消化酶、蛋白A和靶蛋白，都通过使珠经受蛋白酶K而去除。未结合的核酸通过使珠与ExoI接触而去除。通过随机引物延伸和PCR扩增产生核酸文库，如图5C所示。

任选地，细胞核可以被分离。分离核可以通过低渗裂解细胞来进行。然后核可以被离心并在缓冲溶液中洗涤，并与凝集素包被的磁珠复合。凝集素-核复合物与靶向感兴趣的蛋白的抗体重悬，孵育2小时。核在缓冲液中洗涤以去除未结合的抗体。使核重悬于具有蛋白A/微球菌核酸酶融合蛋白的缓冲液中，并孵育1小时。然后在缓冲液中洗涤核以去除未结合的蛋白A/微球菌核酸酶融合蛋白。将核置于金属块(metal block)中并置于冰水中，并且加入CaCl₂以启动微球菌核酸酶的核酸酶活性以裂解DNA结合蛋白周围的DNA。通过加入螯合剂诸如EDTA和/或EGTA使消化反应猝灭。然后如实施例1中描述地使组分与珠接触，并分析分离的DNA。

术语

在至少一些先前描述的实施方案中，在一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。

本领域技术人员将理解，对于本文公开的这个和其他过程和方法，在过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序实现。此外，所概述的步骤和操作仅作为示例提供，并且一些步骤和操作可以是任选的，组合成更少的步骤和操作，或者扩展成另外的步骤和操作而不偏离所公开的实施方案的本质。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于背景和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。

本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常旨在作为“开放性的”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含这种介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一种这种陈述的实施方案中，甚至当相同的权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，这种陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。

如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的该范围的子范围和子范围组合。任何列举的范围可以被容易地认为充分地描述了并且使得同一范围能够被分成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言文字诸如“多达(up to)”、“至少”、“大于”、“少于”等包括所引述的数字并且指随后可以被分成如以上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。

从前述内容，应当理解本文出于说明的目的已经描述了本公开内容的各种实施方案，并且可以在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案并不旨在进行限制，实际的范围和精神由以下权利要求书来指示。

序列表

<110> 贝克顿迪金森公司

宋慧媛

<120> 单细胞染色质免疫沉淀测序测定

<130> 68EB-298713-WO

<150> 62/876,922

<151> 2019-07-22

<150> 63/049,980

<151> 2020-07-09

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(11)

<223> n是a、c、g或t

<400> 1

tttttttnnn n 11

<210> 2

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n是a、c、g或t

<400> 2

nnnnnaaaaa a 11

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(12)

<223> n是a、c、g或t

<400> 3

tttttttnnn nn 12

Claims (127)

1.一种标记细胞中核靶缔合的DNA的方法，所述方法包括：

使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化，其中任选地所述dsDNA是基因组DNA(gDNA)；

使所述核靶与消化组合物接触以产生各自包含单链突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段，所述消化组合物包含DNA消化酶和能够与所述核靶特异性结合的结合试剂，其中每种结合试剂包含含有针对所述结合试剂的独特标识符序列的结合试剂特异性寡核苷酸；

使用第一多于一种寡核苷酸条形码将所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段各自包含与所述核靶缔合的dsDNA片段的至少一部分互补的序列，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够杂交到所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的第一靶结合区；以及

使用第二多于一种寡核苷酸条形码将所述结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化以产生多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特标识符序列的至少一部分互补的序列，其中所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够与所述结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的第二靶结合区。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使所述核靶与所述消化组合物接触包括使所述消化组合物与透化的细胞接触。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中使所述核靶与所述组合物接触包括所述结合试剂和所述DNA消化酶进入所述透化的细胞并且所述结合试剂与所述核靶结合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述消化组合物包含含有所述结合试剂和所述消化酶的融合蛋白，任选地其中所述融合蛋白的尺寸被设置以通过所述细胞的核孔扩散。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述消化组合物包含含有所述结合试剂和所述消化酶的缀合物，任选地其中所述缀合物的尺寸被设置以通过所述细胞的核孔扩散。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述DNA消化酶包含能够与所述结合试剂特异性结合的结构域，并且任选地所述DNA消化酶的所述结构域包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述结合试剂和所述DNA消化酶在与所述透化的细胞接触时彼此分开，并且其中所述结合试剂和所述DNA消化酶分别地进入所述细胞。

8.根据权利要求6-7中任一项所述的方法，其中所述DNA消化酶在所述细胞的核内结合所述结合试剂。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述DNA消化酶在进入所述细胞的核之前结合所述结合试剂，并且其中与所述结合试剂结合的所述DNA消化酶的尺寸被设置以通过所述细胞的核孔扩散。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述DNA消化酶在所述结合试剂结合所述核靶之前结合所述结合试剂。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中与所述结合试剂结合的所述缀合物、所述融合蛋白和/或所述DNA消化酶具有不多于120nm的直径。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一靶结合区与所述核靶缔合的dsDNA片段的所述单链突出端的至少一部分互补。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中使所述核靶与所述消化组合物接触产生包含所述结合试剂、所述DNA消化酶和核靶缔合的dsDNA片段的复合物，并且其中将所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段条形码化包括使所述复合物与所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码接触，任选地包括在条形码化后用蛋白酶消化所述复合物，进一步任选地所述蛋白酶包括蛋白酶K。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I、转座酶、其功能片段或其任何组合，任选地所述转座酶包括Tn5转座酶，进一步任选地所述消化组合物包含具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子中的至少一种。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中将所述结合试剂特异性寡核苷酸或其产物条形码化包括使与所述结合试剂特异性寡核苷酸或其产物杂交的所述第二多于一种寡核苷酸条形码延伸，任选地所述结合试剂寡核苷酸包含与所述第二靶结合区互补的序列。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列数据，任选地其中获得所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到所述多于一种条形码化结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。

17.一种标记细胞中核靶缔合的DNA的方法，所述方法包括：

使包含与双链脱氧核糖核酸(dsDNA)缔合的核靶的细胞透化，其中任选地所述dsDNA是基因组DNA(gDNA)；

使所述核靶与缀合物接触以产生各自包含第一5’突出端和第二5’突出端的多于一种核靶缔合的dsDNA片段，所述缀合物包含转座体和能够与所述核靶特异性结合的结合试剂，其中所述转座体包含转座酶、具有所述第一5’突出端的第一衔接子和具有所述第二5’突出端的第二衔接子；以及

使用第一多于一种寡核苷酸条形码将所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化以产生多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含能够杂交到所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的第一靶结合区。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化包括将所述核靶缔合的dsDNA片段或其产物连接到所述第一多于一种寡核苷酸条形码。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中将所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化包括使杂交到所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的所述第一多于一种寡核苷酸条形码延伸。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子包含第一条形码序列并且所述第二衔接子包含第二条形码序列，并且任选地所述第一条形码序列和/或所述第二条形码序列标识所述核靶。

21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述第一5’突出端和/或所述第二5’突出端包含多(dA)区、多(dT)区或其任何组合。

22.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述第一5’突出端和/或所述第二5’突出端包含与所述第一靶结合区互补的序列或其互补体。

23.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述第一靶结合区包含与以下的至少一部分互补的序列：核靶缔合的dsDNA片段的5’区、3’区或内部区。

24.根据权利要求14-23中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子和/或所述第二衔接子包含所述转座子的DNA末端序列。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述透化包括化学透化或物理透化。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述透化包括使所述细胞与去污剂和/或表面活性剂接触。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述透化包括通过声处理使所述细胞透化。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞中的核透化以产生透化的核。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述核透化前固定包含所述核的细胞。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述核靶包括甲基化的核苷酸、DNA缔合的蛋白、染色质缔合的蛋白或其任何组合。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述核靶包括ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA PolII Ser2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1或其任何组合。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述结合试剂与表位特异性结合，所述表位包括选自由以下组成的组的甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化或其任何组合。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述结合试剂包含四聚体、适配体、蛋白支架或其任何组合。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述结合试剂包含抗体或其片段，并且任选地所述抗体或其片段包括单克隆抗体。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。

36.根据权利要求17-35中任一项所述的方法，其中所述结合试剂经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与所述转座体缀合。

37.根据权利要求17-36中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。

38.根据权利要求17-37中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。

39.根据权利要求17-38中任一项所述的方法，其中所述缀合物通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。

40.根据权利要求17-39中任一项所述的方法，其中所述结合试剂经由蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种与所述转座体缀合。

41.根据权利要求17-40中任一项所述的方法，其中所述转座酶包括Tn5转座酶。

42.根据权利要求17-41中任一项所述的方法，其中所述转座体包含特异性结合所述结合试剂的结构域，其中所述结合试剂和所述转座体在与所述透化的细胞接触时彼此分开，并且分别进入所述细胞，并且其中所述转座体在所述细胞的核内与所述结合试剂结合。

43.根据权利要求17-41中任一项所述的方法，其中所述转座体在进入所述透化的细胞前与所述结合试剂结合，并且其中与所述结合试剂结合的所述转座体的尺寸被设置以通过核孔进入所述细胞的核。

44.根据权利要求17-43中任一项所述的方法，其中所述缀合物具有不多于120nm的直径。

45.根据权利要求17-44中任一项所述的方法，其中所述结合试剂和所述转座体各自的尺寸被设置以通过所述细胞的核孔扩散。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述透化的细胞包含含有染色质的完整的核，所述染色质在所述结合试剂与所述核靶结合时保持与基因组DNA缔合。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述结合试剂与所述核靶的结合发生在所述透化的细胞的所述核中。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物的序列数据。

49.根据权利要求48所述的方法，所述方法包括基于获得的所述测序数据中的所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物的序列确定与所述gDNA相关的信息。

50.根据权利要求49所述的方法，其中确定与所述gDNA相关的信息包括基于获得的所述测序数据中的所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列确定所述gDNA的基因组信息。

51.根据权利要求50所述的方法，所述方法包括消化与所述双链gDNA缔合的核小体。

52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中确定所述gDNA的基因组信息包括：

通过将所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列与所述gDNA的参考序列比对来确定所述gDNA的至少部分序列。

53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中确定与所述gDNA相关的信息包括基于获得的所述测序数据中的所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列确定所述gDNA的甲基化组信息。

54.根据权利要求53所述的方法，所述方法包括消化与所述双链gDNA缔合的核小体。

55.根据权利要求53-54中任一项所述的方法，所述方法包括对所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一种转化的核靶缔合的dsDNA片段，其中化学转化包括亚硫酸氢盐处理，并且其中酶促转化包括APOBEC介导的转化。

56.根据权利要求55所述的方法，其中将所述多于一种核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化包括将所述多于一种转化的核靶缔合的dsDNA片段或其产物条形码化。

57.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，其中确定所述甲基化组信息包括：

确定所述测序数据中所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段具有胸腺嘧啶碱基的位置以及所述gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定所述gDNA中具有5-甲基胞嘧啶(5mC)碱基和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基的相应位置。

58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述方法包括Hi-C、染色质构象捕获(3C)、环化染色质构象捕获(4C)、碳拷贝染色体构象捕获(5C)、染色质免疫沉淀(ChIP)、ChIP-Loop、组合3C-ChIP-克隆(6C)、捕获-C或其任何组合。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述方法包括Hi-C/ChiP-seq。

60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述方法包括ChiP-seq。

61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述细胞包含核酸靶的拷贝，所述方法还包括：

使第二多于一种寡核苷酸条形码与所述核酸靶的拷贝接触进行杂交；

使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述第二多于一种寡核苷酸条形码延伸以产生多于一种条形码化核酸分子，所述多于一种条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列和分子标记；以及

获得多于一种条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数。

62.根据权利要求15-61中任一项所述的方法，其中使所述第一多于一种寡核苷酸条形码和/或所述第二多于一种寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使所述多于一种寡核苷酸条形码延伸。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述DNA聚合酶包括Klenow片段。

64.根据权利要求62所述的方法，其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地其中所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。

65.根据权利要求61-64中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括核酸分子，并且任选地所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述第一靶结合区和/或所述第二靶结合区包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。

67.根据权利要求48-66中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到所述多于一种条形码化核靶缔合的DNA片段或其产物。

68.根据权利要求61-67中任一项所述的方法，其中获得所述多于一种条形码化核酸分子的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到所述多于一种条形码化核酸分子或其产物。

69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第一通用序列，并且其中所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含第二通用序列。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述第一通用序列和所述第二通用序列是相同的。

71.根据权利要求69所述的方法，其中所述第一通用序列和所述第二通用序列是不同的。

72.根据权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列和/或所述第二通用序列包含以下的结合位点：测序引物和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。

73.根据权利要求16-72中任一项所述的方法，其中所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。

74.根据权利要求16-73中任一项所述的方法，其中所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。

75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码各自包含分子标记。

76.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的分子标记序列。

77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码的每种分子标记包含至少6个核苷酸。

78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码与固体支持物缔合。

79.根据权利要求78所述的方法，其中与相同的固体支持物缔合的所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码各自包含相同的样品标记。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码的每种样品标记包含至少6个核苷酸。

81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码各自包含细胞标记，并且任选地所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码的每种细胞标记包含至少6个核苷酸。

82.根据权利要求81所述的方法，其中与相同的固体支持物缔合的所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记。

83.根据权利要求81-82中任一项所述的方法，其中与不同的固体支持物缔合的所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。

84.根据权利要求78-83中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包括合成颗粒、平坦表面或其组合。

85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，所述方法包括使包含所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码的合成颗粒与所述细胞缔合。

86.根据权利要求85所述的方法，所述方法包括在使所述合成颗粒与所述细胞缔合后将所述细胞裂解，任选地将所述细胞裂解包括加热所述细胞、使所述细胞与去污剂接触、改变所述细胞的pH，或其任何组合。

87.根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒和所述单细胞在同一分区中，并且任选地所述分区是孔或液滴。

88.根据权利要求78-87中任一项所述的方法，其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码是固定或部分地固定在所述合成颗粒上的，或者所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码是包封或部分地包封在所述合成颗粒中的。

89.根据权利要求78-88中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒是可破坏的，任选地所述合成颗粒是可破坏的水凝胶颗粒。

90.根据权利要求78-89中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包括珠，任选地所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

91.根据权利要求78-90中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

92.根据权利要求78-91中任一项所述的方法，

其中所述第一多于一种寡核苷酸条形码和所述第二多于一种寡核苷酸条形码中的每一种寡核苷酸条形码包含接头官能团，

其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且

其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此缔合，并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。

93.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

消化组合物，所述消化组合物包含DNA消化酶和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中所述结合试剂包含含有针对所述结合试剂的独特标识符序列结合试剂特异性寡核苷酸。

94.根据权利要求93所述的试剂盒，其中所述DNA消化酶包括限制性酶、微球菌核酸酶I、转座酶、其功能片段或其任何组合，任选地所述转座酶包括Tn5转座酶，进一步任选地所述消化组合物包含具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子中的至少一种。

95.根据权利要求93-94中任一项所述的试剂盒，其中所述消化组合物包含含有所述结合试剂和所述消化酶的融合蛋白，任选地其中所述融合蛋白的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。

96.根据权利要求93-94中任一项所述的试剂盒，其中所述消化组合物包含含有所述结合试剂和所述消化酶的缀合物，任选地其中所述缀合物的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。

97.根据权利要求93-94中任一项所述的试剂盒，其中所述DNA消化酶包含能够与所述结合试剂特异性结合的结构域，任选地所述DNA消化酶的所述结构域包含蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L中的至少一种，进一步任选地与所述结合试剂结合的所述DNA消化酶的尺寸被设置以通过细胞的核孔扩散。

98.根据权利要求93-97中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含蛋白酶，任选地所述蛋白酶包括蛋白酶K。

99.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

缀合物，所述缀合物包含转座体和能够与核靶特异性结合的结合试剂，其中所述转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。

100.根据权利要求93-99中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶包括Klenow片段。

101.根据权利要求93-100中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含逆转录酶，任选地其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，并且任选地所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。

102.根据权利要求93-101中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含连接酶、去污剂、表面活性剂、缓冲液和筒中的一种或更多种。

103.根据权利要求93-102中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。

104.根据权利要求93-103中任一项所述的试剂盒，其中所述核靶包括DNA缔合的蛋白或染色质缔合的蛋白。

105.根据权利要求93-104中任一项所述的试剂盒，其中所述核靶包括甲基化的核苷酸。

106.根据权利要求93-105中任一项所述的试剂盒，其中所述核靶包括ALC1、雄激素受体、Bmi-1、BRD4、Brg1、coREST、C-jun、c-Myc、CTCF、EED、EZH2、Fos、组蛋白H1、组蛋白H3、组蛋白H4、异染色质蛋白-1γ、异染色质蛋白-1β、HMGN2/HMG-17、HP1α、HP1γ、hTERT、Jun、KLF4、K-Ras、Max、MeCP2、MLL/HRX、NPAT、p300、Nanog、NFAT-1、Oct4、P53、Pol II(8WG16)、RNA Pol II Ser2P、RNA Pol II Ser5P、RNA Pol II Ser2+5P、RNA Pol II Ser7P、Rb、RNA聚合酶II、SMCI、Sox2、STAT1、STAT2、STAT3、Suz12、Tip60、UTF1或其任何组合。

107.根据权利要求93-106中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂与表位特异性结合，所述表位包括选自由以下组成的组的甲基化(me)、磷酸化(ph)、泛素化(ub)、类泛素化(su)、生物素化(bi)或乙酰化(ac)的组蛋白残基：H1S27ph、H1K25me1、H1K25me2、H1K25me3、H1K26me、H2(A)K4ac、H2(A)K5ac、H2(A)K7ac、H2(A)S1ph、H2(A)T119ph、H2(A)S122ph、H2(A)S129ph、H2(A)S139ph、H2(A)K119ub、H2(A)K126su、H2(A)K9bi、H2(A)K13bi、H2(B)K5ac、H2(B)K11ac、H2(B)K12ac、H2(B)K15ac、H2(B)K16ac、H2(B)K20ac、H2(B)S10ph、H2(B)S14ph、H2(B)33ph、H2(B)K120ub、H2(B)K123ub、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K56ac、H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3R8me、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3R17me、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K122ac、H3T3ph、H3S10ph、H3T11ph、H3S28ph、H3K4bi、H3K9bi、H3K18bi、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H4R3me、H4K20me、H4K59me、H4S1ph、H4K12bi和H4 n-末端尾泛素化或其任何组合。

108.根据权利要求93-107中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂包含四聚体、适配体、蛋白支架或其任何组合。

109.根据权利要求93-108中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂包含抗体或其片段，任选地所述抗体或其片段包括单克隆抗体。

110.根据权利要求109所述的试剂盒，其中所述抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、dsFv、由抗体片段形成的双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或其任何组合。

111.根据权利要求99-110中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂经由化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其任何组合与转座体缀合。

112.根据权利要求99-111中任一项所述的试剂盒，其中所述缀合物通过1,3-偶极环加成反应、杂-第尔斯-阿尔德反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合形成。

113.根据权利要求99-112中任一项所述的试剂盒，其中所述缀合物通过乙炔和叠氮化物之间的反应形成。

114.根据权利要求99-113中任一项所述的试剂盒，其中所述缀合物通过醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。

115.根据权利要求99-114中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂经由蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L的至少一种与转座体缀合。

116.根据权利要求99-115中任一项所述的试剂盒，其中所述转座酶包括Tn5转座酶。

117.根据权利要求99-116中任一项所述的试剂盒，其中所述缀合物具有不多于120nm的直径。

118.根据权利要求99-117中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂和所述转座体各自的尺寸被设置以通过核孔扩散。

119.根据权利要求93-118中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含多于一种寡核苷酸条形码，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的每一种包含分子标记和靶结合区，并且其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少10种包含不同的分子标记序列。

120.根据权利要求119所述的试剂盒，其中所述靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。

121.根据权利要求119-120中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸条形码包含相同的样品标记和/或相同的细胞标记，并且任选地所述多于一种寡核苷酸条形码的每种样品标记和/或细胞标记包含至少6个核苷酸。

122.根据权利要求119-121中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸条形码的每种分子标记包含至少6个核苷酸。

123.根据权利要求119-122中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种是部分地固定在所述合成颗粒上的，其中所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种是固定或部分地固定在所述合成颗粒上的；和/或所述多于一种寡核苷酸条形码中的至少一种是包封或部分地包封在所述合成颗粒中的。

124.根据权利要求123所述的试剂盒，其中所述合成颗粒包括珠，任选地其中所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

125.根据权利要求123-124中任一项所述的试剂盒，其中所述合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

126.根据权利要求123-125中任一项所述的试剂盒，

其中所述多于一种寡核苷酸条形码的每一种包含接头官能团，

其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且

其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此缔合。

127.根据权利要求126所述的试剂盒，其中所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。

Images