CN116569042A - 多重化的单细胞免疫测定 - Google Patents

多重化的单细胞免疫测定 Download PDF

Info

Publication number
CN116569042A
CN116569042A CN202180082865.5A CN202180082865A CN116569042A CN 116569042 A CN116569042 A CN 116569042A CN 202180082865 A CN202180082865 A CN 202180082865A CN 116569042 A CN116569042 A CN 116569042A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solid support
single cells
nucleic acid
sequence
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180082865.5A
Other languages
English (en)
Inventor
黄伟
斯科特·博恩海默
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson and Co filed Critical Becton Dickinson and Co
Publication of CN116569042A publication Critical patent/CN116569042A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Abstract

本文的公开内容包括用于测量单细胞的分泌因子的分泌水平的系统、方法、组合物和试剂盒。本文的公开内容包括固体支持物，所述固体支持物包含能够与由单细胞分泌的分泌因子特异性结合的多于一种捕获探针。在一些实施方案中，捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子。本文的公开内容还包括能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合的分泌因子结合试剂。分泌因子结合试剂可以包含可检测的部分或其前体。能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂可以包含不同的可检测部分或其前体。

Description

多重化的单细胞免疫测定
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年12月9日提交的美国临时专利申请系列第63/123,217号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景
领域
本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如确定单细胞对分泌因子的分泌水平。
对相关技术的描述
在免疫学、肿瘤学和其他领域，研究单细胞表型变异的需求日益增加。孔或液滴中的单细胞捕获已经与用于通过测序读出单细胞基因组和转录组分析的方法耦合。基因表达可能影响蛋白表达和分子的分泌。蛋白-蛋白相互作用可能影响细胞的基因表达和蛋白表达以及分子的分泌。细胞释放的细胞因子和其他分子是免疫学家和其他细胞生物学家非常感兴趣的。用于检测和测量分泌蛋白的传统方法通常是批量测量(而不是在单细胞水平)。在流式细胞术与传统蛋白印迹的比较中，研究来自细胞异质性混合物的单个细胞有巨大的价值。对能够测量单细胞的分泌因子的分泌水平的系统和方法存在需求。对能够测量单细胞的分泌因子的分泌水平并同时测量单细胞蛋白表达和/或基因表达的系统和方法存在需求。
概述
本文的公开内容测量单细胞的分泌因子的分泌水平的方法。在一些实施方案中，方法包括：使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触，所述一个或更多个单细胞能够分泌多于一种分泌因子，每一个第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，并且捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体；以及测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射，以确定由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的至少一种分泌因子的分泌水平。
在一些实施方案中，使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触包括：将一个或更多个单细胞和第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区，所述多于一个分区中的分区包含一个或更多个单细胞中的单细胞和第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物。
在一些实施方案中，方法包括在使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之前：汇集来自多于一个分区中的每一个分区的单个第一固体支持物以产生第二多于一个第一固体支持物，任选地汇集使用磁场来进行。在一些实施方案中，使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触包括使第二多于一个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触。在一些实施方案中，方法包括在使第二多于一个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除多于一种分泌因子结合试剂中未与第二多于一个第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂以产生第三多于一个第一固体支持物，任选地测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射包括测量第三多于一个第一固体支持物中的每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射。在一些实施方案中，去除未与第二多于一个第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。在一些实施方案中，在将第一多于一个第一固体支持物分区之前，将一个或更多个单细胞分区到多于一个分区。在一些实施方案中，在将一个或更多个单细胞分区之前，将第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区。
在一些实施方案中，使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触在多于一个分区中进行。在一些实施方案中，方法包括在使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除多于一种分泌因子结合试剂中未与第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。在一些实施方案中，去除未与第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。方法可以包括汇集来自多于一个分区中的每一个分区的单个第一固体支持物，任选地汇集使用磁场来进行。
在一些实施方案中，第一固体支持物包括约35μm的直径，任选地分区是具有直径50μm的孔。在一些实施方案中，一个或更多个单细胞包括多于100个细胞、多于1000个细胞或多于10000个细胞。在一些实施方案中，多于一个分区中的分区的数目是一个或更多个单细胞中的单细胞的数目的至少2倍大。
在一些实施方案中，多于一个分区包括多于一个液滴，任选地液滴包括油包水液滴。在一些实施方案中，多于一个分区包括微孔阵列的微孔，所述微孔阵列包括至少100个微孔。在一些实施方案中，选择至少100个微孔的尺寸，使得每个微孔可以包含至多一个第一固体支持物。在一些实施方案中，至少100个微孔的平均直径与第一固体支持物的直径之比为约1.5。在一些实施方案中，至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比范围为约0.1至2，任选地至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比为约0.9。在一些实施方案中，每个微孔具有范围为约1000μm3至约786000μm3的体积，任选地每个微孔具有约144000μm3的体积。在一些实施方案中，在将第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区之后，至少100个微孔包含单个第一固体支持物的百分比为至少约10％。在一些实施方案中，在将第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区之后，至少100个微孔包含单个第一固体支持物的百分比为至少约50％。在一些实施方案中，在将一个或更多个单细胞分区到多于一个分区之后，至少100个微孔包含单细胞的百分比在约0.01％和约15％之间。在一些实施方案中，至少100个微孔包含单细胞的百分比在约1％和约11％之间。
在一些实施方案中，方法包括：提供未与一个或更多个单细胞接触的阴性对照第一固体支持物；使所述阴性对照第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合；以及测量阴性对照第一固体支持物的发射。在一些实施方案中，由单细胞分泌的多于一种分泌因子包含由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的通用分泌因子，与结合所述通用分泌因子的分泌因子结合试剂关联的可检测部分的发射鉴定包含单细胞的分区。在一些实施方案中，方法包括：使两个或更多个第一固体支持物与两种或更多种预定浓度的分泌因子接触，所述两个或更多个第一固体支持物中的每一个与不同预定浓度的分泌因子接触；使两个或更多个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自包含可检测部分或其前体，所述多于一种分泌因子结合试剂能够与被两个或更多个第一固体支持物的捕获探针结合的分泌因子特异性结合；以及测量两个或更多个第一固体支持物中的每一个的所述可检测部分的发射，以产生将至少一种分泌因子的分泌水平与可检测部分的发射相关联的校准曲线。
在一些实施方案中，测量步骤包括用流式细胞仪测量可检测部分的发射。在一些实施方案中，流式细胞仪包括常规流式细胞仪、光谱流式细胞仪、高光谱流式细胞仪、成像流式细胞仪或其任何组合。在一些实施方案中，测量步骤包括用荧光显微镜测量可检测部分的发射。在一些实施方案中，测量步骤包括用成像系统测量可检测部分的发射。在一些实施方案中，测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射包括对多于一个分区进行成像。在一些实施方案中，多于一个分区被顺序成像。在一些实施方案中，多于一个分区被同时成像。在一些实施方案中，成像包括显微术、共焦显微术、时差成像(time-lapseimaging)显微术、荧光显微术、多光子显微术、定量相位显微术、表面增强拉曼光谱、摄像、手动视觉分析、自动视觉分析或其任何组合。在一些实施方案中，方法包括在汇集来自多于一个分区中的每一个分区的单个第一固体支持物之前，用成像系统对多于一个分区进行成像以生成成像数据。在一些实施方案中，成像系统被配置为基于所述成像数据对(i)包含单个第一固体支持物和单细胞的分区的数目和/或(ii)包含单个第一固体支持物并且不包含单细胞的分区的数目进行定量。在一些实施方案中，成像系统包括多荧光成像系统。在一些实施方案中，成像系统被配置为捕获和处理至少100个微孔的全部或部分的图像，任选地成像系统还包括照明子系统、成像子系统和处理器。在一些实施方案中，成像系统被配置为进行明场、暗场、荧光或定量相位成像。在一些实施方案中，成像系统包括选择机制，选择机制使用源自经处理的图像的信息来鉴定不包含单细胞的分区，并且选择机制被配置为在后续数据分析中排除不包含单细胞的分区的图像。在一些实施方案中，筒(cartridge)包含微孔阵列，筒包括用于对至少100个微孔进行成像的透明窗，任选地筒包括低自体荧光。
在一些实施方案中，可检测部分包括光学部分、发光部分、电化学活性部分、纳米颗粒或其组合。在一些实施方案中，发光部分包括化学发光部分、电致发光部分、光致发光部分或其组合。在一些实施方案中，光致发光部分包括荧光部分、磷光部分或其组合。在一些实施方案中，荧光部分包括荧光染料。在一些实施方案中，纳米颗粒包括量子点。在一些实施方案中，方法包括进行反应以使可检测部分前体转化为可检测部分。
在一些实施方案中，方法包括：将一个或更多个单细胞与第一固体支持物连接，以形成与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞；以及将与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞作为串联物(tandem)分析。在一些实施方案中，一个或更多个单细胞包含表面细胞靶，第一固体支持物包含多于一种锚定探针，并且多于一种锚定探针中的每一种能够与表面细胞靶特异性结合，从而形成与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞。在一些实施方案中，将一个或更多个单细胞与第一固体支持物连接包括使一个或更多个单细胞和第一固体支持物与固定剂接触。
一个或更多个单细胞可以包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。在一些实施方案中，至少一种分泌因子包括淋巴因子、白细胞介素、趋化因子或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种分泌因子包括细胞因子、激素、分子毒素或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种分泌因子包括神经生长因子、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、转化生长因子、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种分泌因子包括血管生成素、血管生成蛋白-1、血管生成蛋白-2、bNGF、组织蛋白酶S、半乳凝素-7、GCP-2、G-CSF、GM-CSF、PAI-1、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PlGF、PlGF-2、SDF-1、Tie2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、6Ckine、血管生成蛋白-1、血管生成蛋白-2、BLC、BRAK、CD186、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、EpCAM、GDF-15、GM-CSF、GRO、HCC-4、I-309、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1R4(ST2)、IL-2、IL-2R、IL-3、IL-3Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-8RB、IL-11、IL-12、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-13R1、IL-13R2、IL-15、IL-15Rα、IL-16、IL-17、IL-17C、IL-17E、IL-17F、IL-17R、IL-18、IL-18BPa、IL-18Rα、IL-20、IL-23、IL-27、IL-28、IL-31、IL-33、IP-10、I-TAC、LIF、LIX、LRP6、MadCAM-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1γ、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3α、MIP-3β、MPIF-1、PARC、PF4、RANTES、抵抗素、SCF、SCYB16、TACI、TARC、TSLP、TNF-α、TNF-R1、TRAIL-R4、TREM-1、激活蛋白A、双调蛋白、Axl、BDNF、BMP4、组织蛋白酶S、EGF、FGF-1、FGF-2、FGF-7、FGF-21、卵泡抑制素、半乳凝素-7、Gas6、GDF-15、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-3、LAP、NGF R、NrCAM、NT-3、NT-4、PAI-1、TGF-α、TGF-β、TGF-β3、TRAIL-R4、ADAMTS1、组织蛋白酶S、FGF-2、卵泡抑制素、半乳凝素-7、GCP-2、GDF-15、IGFBP-6、LIF、MMP-9、pro-MMP9、RANK、RANKL、RANTES、SDF-1、CXCR4或其任何组合。
分泌因子结合试剂和捕获探针可以能够与同一分泌因子的不同表位结合。在一些实施方案中，分泌因子结合试剂、捕获探针和锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体或其片段包括单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体(diabody)、三特异抗体(triabody)、四特异抗体(tetrabody)、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv(disulfide-linked Fv)、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。在一些实施方案中，捕获探针和/或锚定探针通过以下与第一固体支持物缀合：1,3-偶极环加成反应、杂-Diels-Alder反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合。
表面细胞靶可以包括糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。在一些实施方案中，表面细胞靶包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、BCMA、HLA蛋白、β2-微球蛋白或其任何组合。
方法可以包括将一个或更多个伴随细胞分区到多于一个分区，多于一个分区中的分区包含：(i)一个或更多个单细胞中的单细胞，(ii)第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物，以及(iii)一个或更多个伴随细胞中的单个伴随细胞。方法可以包括裂解分区中的单细胞，并且任选地裂解单细胞包括加热单细胞、使单细胞与去污剂接触、改变单细胞的pH或其任何组合。方法可以包括可逆地固定一个或更多个单细胞和/或可逆地透化一个或更多个单细胞。
在一些实施方案中，一个或更多个单细胞包含多于一个细胞组分靶。在一些实施方案中，方法还包括：使多于一种细胞组分结合试剂与一个或更多个单细胞接触，多于一种细胞组分结合试剂中的每一种包含细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的独特标识符序列，并且细胞组分结合试剂能够与多于一个细胞组分靶中的至少一个特异性结合；使多于一个寡核苷酸条形码与细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸接触以进行杂交，寡核苷酸条形码各自包含分子标记和第一通用序列；使与细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸杂交的多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，每一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含与独特标识符序列的至少一部分互补的序列和分子标记；以及获得多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定一个或更多个单细胞中的每一个中多于一个细胞组分靶中的至少一个细胞组分靶的拷贝数。
一个或更多个单细胞可以包含核酸靶的拷贝。在一些实施方案中，方法还包括：使多于一个寡核苷酸条形码与核酸靶的拷贝接触以进行杂交，多于一个寡核苷酸条形码中的每一个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、能够与核酸靶的拷贝杂交的靶结合区和分子标记；使与核酸靶的拷贝杂交的多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化核酸分子，多于一个条形码化核酸分子各自包含与核酸靶的至少一部分互补的序列；以及获得多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。
多于一个寡核苷酸条形码可以与第二固体支持物关联，并且多于一个分区中的分区包含单个第二固体支持物。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码包含含有捕获序列的靶结合区。在一些实施方案中，靶结合区包含多(dT)区。在一些实施方案中，细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含与捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置为捕获细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸。在一些实施方案中，与捕获序列互补的序列包含多(dA)区。
确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数可以包括基于与多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的分子标记、其互补物或其组合的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，方法包括：使随机引物与多于一个条形码化核酸分子接触，随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补物；以及使与多于一个条形码化核酸分子杂交的随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。在一些实施方案中，方法包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增多于一个延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个延伸产物。在一些实施方案中，方法包括基于与第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数包括基于与第一多于一个条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中多于一个核酸靶中的每一个的数目，所述第一多于一个条形码化扩增子包含多于一个核酸靶中的每一个的序列。在一些实施方案中，多于一个核酸靶中的每一个的序列包括多于一个核酸靶中的每一个的子序列。在一些实施方案中，第一多于一个条形码化扩增子中的核酸靶的序列包括核酸靶的子序列。在一些实施方案中，方法包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第二多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增第一多于一个条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到第一多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，方法包括基于与第二多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，第一多于一个条形码化扩增子和/或第二多于一个条形码化扩增子包括全转录组扩增(WTA)产物。
方法可以包括使用多于一个条形码化核酸分子作为模板合成第三多于一个条形码化扩增子以产生第三多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，合成第三多于一个条形码化扩增子包括对多于一个条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，合成第三多于一个条形码化扩增子包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。方法可以包括获得第三多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息，并且任选地获得序列信息包括将测序衔接子附接到第三多于一个条形码化扩增子或其产物。方法可以包括基于与第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。
核酸靶可以包括核酸分子，例如，包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合的核酸分子。
在一些实施方案中，多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含第一通用序列的互补物。在一些实施方案中，细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含第二通用序列。在一些实施方案中，获得多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括：使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物，以产生多于一个扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸；以及获得多于一个扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的测序信息。在一些实施方案中，获得序列信息包括将测序衔接子附接到多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。
在一些实施方案中，方法包括在使多于一种细胞组分结合试剂与一个或更多个单细胞接触之后，去除多于一种细胞组分结合试剂中未与一个或更多个单细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂。在一些实施方案中，去除未与一个或更多个单细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂包括：去除未与多于一个细胞组分靶中的相应至少一个靶接触的一种或更多种细胞组分结合试剂。细胞组分靶可以包括细胞内蛋白、糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。细胞组分靶可以包括看家蛋白，对所述看家蛋白的检测指示分区中单细胞的存在。
在一些实施方案中，使多于一个寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使多于一个寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，DNA聚合酶包括Klenow片段。在一些实施方案中，逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列是相同的。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列是不同的。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。
在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码各自包含细胞标记。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，与同一第二固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记。在一些实施方案中，与不同第二固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。
在一些实施方案中，第一固体支持物和/或第二固体支持物包括合成颗粒和/或平坦表面。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码中的至少一个被固定在合成颗粒上、部分地固定在合成颗粒上、包封在合成颗粒中或部分地包封在合成颗粒中。在一些实施方案中，合成颗粒是可破坏的。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠，并且任选地珠包括：琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合；选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合；或者可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码中的每一个包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
在一些实施方案中，多于一种锚定探针中的每一种包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
在一些实施方案中，多于一种捕获探针中的每一种包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
本文的公开内容包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含：第一固体支持物，第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针各自能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；以及多于一种分泌因子结合试剂，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体。在一些实施方案中，第一固体支持物还包含多于一种锚定探针，并且多于一种锚定探针中的每一种能够与细胞的表面细胞靶特异性结合。在一些实施方案中，第一固体支持物包括约35μm的直径。
组合物可以包含含有微孔阵列的筒，例如，包含至少100个微孔的微孔阵列。在一些实施方案中，选择至少100个微孔的尺寸，使得每个微孔可以包含至多一个第一固体支持物。在一些实施方案中，至少100个微孔的平均直径与第一固体支持物的直径之比为约1.5。在一些实施方案中，至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比范围为约0.1至2，任选地至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比为约0.9。在一些实施方案中，每个微孔具有范围为约1000μm3至约786000μm3的体积，任选地每个微孔具有约144000μm3的体积。
在一些实施方案中，可检测部分包括光学部分、发光部分、电化学活性部分、纳米颗粒或其组合。在一些实施方案中，发光部分包括化学发光部分、电致发光部分、光致发光部分或其组合。在一些实施方案中，光致发光部分包括荧光部分、磷光部分或其组合。在一些实施方案中，荧光部分包括荧光染料。在一些实施方案中，纳米颗粒包括量子点。在一些实施方案中，组合物包含固定剂和/或透化剂。
至少一种分泌因子可以包括淋巴因子、白细胞介素、趋化因子或其任何组合。至少一种分泌因子可以包括细胞因子、激素、分子毒素或其任何组合。至少一种分泌因子可以包括神经生长因子、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、转化生长因子、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子或其任何组合。在一些实施方案中，至少一种分泌因子包括血管生成素、血管生成蛋白-1、血管生成蛋白-2、bNGF、组织蛋白酶S、半乳凝素-7、GCP-2、G-CSF、GM-CSF、PAI-1、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PlGF、PlGF-2、SDF-1、Tie2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、6Ckine、血管生成蛋白-1、血管生成蛋白-2、BLC、BRAK、CD186、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、EpCAM、GDF-15、GM-CSF、GRO、HCC-4、I-309、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1R4(ST2)、IL-2、IL-2R、IL-3、IL-3Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-8RB、IL-11、IL-12、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-13R1、IL-13R2、IL-15、IL-15Rα、IL-16、IL-17、IL-17C、IL-17E、IL-17F、IL-17R、IL-18、IL-18BPa、IL-18Rα、IL-20、IL-23、IL-27、IL-28、IL-31、IL-33、IP-10、I-TAC、LIF、LIX、LRP6、MadCAM-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1γ、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3α、MIP-3β、MPIF-1、PARC、PF4、RANTES、抵抗素、SCF、SCYB16、TACI、TARC、TSLP、TNF-α、TNF-R1、TRAIL-R4、TREM-1、激活蛋白A、双调蛋白、Axl、BDNF、BMP4、组织蛋白酶S、EGF、FGF-1、FGF-2、FGF-7、FGF-21、卵泡抑制素、半乳凝素-7、Gas6、GDF-15、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-3、LAP、NGF R、NrCAM、NT-3、NT-4、PAI-1、TGF-α、TGF-β、TGF-β3、TRAIL-R4、ADAMTS1、组织蛋白酶S、FGF-2、卵泡抑制素、半乳凝素-7、GCP-2、GDF-15、IGFBP-6、LIF、MMP-9、pro-MMP9、RANK、RANKL、RANTES、SDF-1、CXCR4或其任何组合。
在一些实施方案中，分泌因子结合试剂和捕获探针能够与同一分泌因子的不同表位结合。在一些实施方案中，分泌因子结合试剂、捕获探针和锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体或其片段包括单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体(diabody)、三特异抗体(triabody)、四特异抗体(tetrabody)、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv(disulfide-linked Fv)、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。在一些实施方案中，捕获探针和/或锚定探针通过以下与第一固体支持物缀合：1,3-偶极环加成反应、杂-Diels-Alder反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合。
在一些实施方案中，表面细胞靶包括糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。
组合物可以包含多于一个寡核苷酸条形码，多于一个寡核苷酸条形码中的每一个包含分子标记和靶结合区，并且多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。
第一固体支持物可以包括合成颗粒和/或平坦表面。合成颗粒可以是可破坏的。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠，例如琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合；选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合；或者可破坏的水凝胶颗粒。在一些实施方案中，多于一种锚定探针中的每一种包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，多于一种捕获探针中的每一种包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
附图简述
图1图示了非限制性示例性条形码。
图2示出条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。
图3是示出用于从多于一个靶产生在3’末端条形码化的靶的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。
图4A-图4D示出了用于测量单细胞的分泌因子的分泌水平的非限制性示例性工作流程的示意图。
图5示出了本文描述的多重化的单细胞免疫测定的非限制性示例性实施方案的示意图。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank的序列，以及其他数据库关于相关技术通过引用以其整体并入。
对少量核酸(例如信使核糖核苷酸(mRNA)分子)进行定量对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数目也可以是非常具有挑战性的，尤其是当分子数目非常小时。确定样品中分子的绝对数目的一种方法是数字聚合酶链式反应(PCR)。理想地，PCR在每个循环中产生相同拷贝的分子。然而，PCR可具有缺点，使得每个分子以随机概率复制，且此概率根据PCR循环和基因序列而变化，这导致扩增偏倚和不准确的基因表达测量。具有独特分子标记(molecular labels，也称为分子索引(molecular indexes，MI))的随机条形码可以用于计数分子数目和校正扩增偏倚。诸如PreciseTM测定(Cellular Research,Inc.(Palo Alto,CA))和RhapsodyTM测定(Becton,Dickinson and Company(Franklin Lakes,NJ))的随机条形码化可以通过使用分子标记(ML)在逆转录(RT)期间标记mRNA来纠正由PCR和文库制备步骤引起的偏倚。
PreciseTM测定可以利用具有在多(T)寡核苷酸上的大量(例如6561种至65536种)独特分子标记序列的随机条形码的非耗尽性池(non-depleting pool)，以在RT步骤期间与样品中的所有多(A)-mRNA杂交。随机条形码可以包含通用PCR引发位点。在RT期间，靶基因分子与随机条形码随机反应。每一种靶分子可以与随机条形码杂交，导致产生随机条形码化的互补核糖核苷酸(cDNA)分子。在标记后，可以将来自微孔板微孔的随机条形码化cDNA分子汇集到单个管中用于PCR扩增和测序。可以分析原始测序数据以产生读段的数目、具有独特分子标记序列的随机条形码的数目以及mRNA分子的数目。
本文的公开内容包括测量单细胞的分泌因子的分泌水平的方法。在一些实施方案中，方法包括：使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触，所述一个或更多个单细胞能够分泌多于一种分泌因子，每一个第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，并且捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体；以及测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射，以确定由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的至少一种分泌因子的分泌水平。
本文的公开内容包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含：第一固体支持物，所述第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针各自能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；以及多于一种分泌因子结合试剂，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体。在一些实施方案中，第一固体支持物还包含多于一种锚定探针，并且所述多于一种锚定探针中的每一种能够与细胞的表面细胞靶特异性结合。在一些实施方案中，第一固体支持物包括约35μm的直径。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。
如本文使用的，术语“衔接子”可以意指促进关联的核酸的扩增或测序的序列。关联的核酸可以包括靶核酸。关联的核酸可以包括空间标记、靶标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)中的一种或更多种。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子(pre-adenylated adaptors)。衔接子可以是双链或单链的。一种或更多种衔接子可以位于核酸的5’末端或3’末端。当衔接子在5’末端和3’末端包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’末端和/或3’末端的衔接子可以能够与固定在表面上的一种或更多种寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两种或更多种核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两种或更多种核酸分子也可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用序列。可以存在于多于一种核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单种通用引物复制或扩增多于一种不同序列。类似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一种、两种(例如，一对)或更多种通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一种、两种(例如，一对)或更多种单一通用引物复制或扩增多于一种不同序列。因此，通用引物包含可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰具有靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附接到不同靶核酸序列的一个末端或两个末端。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以彼此相同或不同。
如本文使用的，术语“关联”或“与...关联”可以意指两个或更多个物质可以被鉴定为在某个时间点共定位。关联可以意指，两个或更多个物质在或曾经在相似的容器内。关联可以是信息学关联。例如，关于两个或更多个物质的数字信息可以被存储并且可以用于确定一种或更多种物质在某个时间点共定位。关联也可以是物理关联。在一些实施方案中，两个或更多个关联的物质彼此“拴系”、“附接”或“固定”或与共同的固体或半固体表面“拴系”、“附接”或“固定”。关联可以指用于将标记与固体或半固体支持物(诸如珠)附接的共价或非共价方式。关联可以是靶与标记之间的共价键。关联可以包括两个分子(诸如靶分子和标记)之间的杂交。
如本文使用的，术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸在给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全部互补性时它可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“互补物”。如果第一核苷酸序列和与第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“反向互补物”。如本文使用的，“互补”序列可以指序列的“互补物”或“反向互补物”。从本公开内容理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以与其所杂交的分子互补或部分互补。
如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶关联的独特标记的数目的步骤。这种方法(其本质上可以是随机的)将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。
如本文使用的，术语“一个标记(label)”或“多于一个标记(labels)”可以指与样品中的靶关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的连接处，例如天然和非天然序列的连接处。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在多种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。
如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”可以指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的条形码，使得当非耗尽性储库与靶池关联时，每种靶可能与独特条形码关联。每种标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与标记的多样性相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的标记的靶分子的集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，并且然后对检测到的条形码的数目的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数与独特条形码的数目的比例低时，标记的靶分子是高度独特的(即，多于一个靶分子被给定标记标记的概率非常低)。
如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的主链、糖或核酸碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、非天然核酸(xeno nucleic acid)、吗啉代核酸(morpholinos)、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以称为形成核酸的核苷间主链。连键(linkage)或主链可以是3’到5’磷酸二酯连键。
核酸可以包括修饰的主链和/或修饰的核苷间连键。修饰的主链可以包括那些在主链中保留磷原子的主链和那些在主链中没有磷原子的主链。合适的其中含磷原子的修饰的核酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯诸如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates))、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3’-5’连接、2’-5’连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3’至3’、5’至5’或2’至2’连接)。
核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间连键，混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间连键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间连键形成的多核苷酸主链。这些可以包括具有吗啉代(morpholino)连键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他的那些。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连键二者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖主链可以被含酰胺的主链替代，特别是被氨基乙基甘氨酸主链替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的主链可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得PNA具有含酰胺的主链。杂环碱基部分可以直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包括吗啉代主链结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间连键可以替代磷酸二酯连键。
核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸酯可以与核酸互补物形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-C,4’-C-氧亚甲基连键，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH2-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3’-外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳(G-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文使用的，术语“样品”可以指包含靶的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。
如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取样品的切片和/或将所述切片放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片格栅和/或超薄切片机。
如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多于一个条形码(例如，随机条形码)的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座(bearing)、圆柱体或由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成的其他类似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
如本文使用的，术语“随机条形码”可以指本公开内容的包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“随机条形码化”可以指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来关联并对与靶关联的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。
如本文使用的，术语“靶”可以指可与条形码(例如，随机条形码)关联的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白、肽或多肽。在一些实施方案中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“物质(species)”互换使用。
如本文使用的，术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒(retroplasmid)逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶，及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LI.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，尤其是逆转录子、II组内含子、以及多样性产生型逆转录元件)。
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”可互换地使用，以指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列可以例如是在本公开内容的方法中使用的遍及所有条形码通用的已知序列。例如，当使用本文公开的方法标记多于一个靶时，每一种靶特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，多于一个通用衔接子序列可以用于本文公开的方法中。例如，当使用本文公开的方法标记多于一个靶时，至少两种靶特异性序列连接到不同的通用衔接子序列。通用衔接子引物及其互补物可以被包括在两种寡核苷酸中，其中的一种寡核苷酸包含靶特异性序列且另一种寡核苷酸包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是包含靶特异性序列的寡核苷酸的一部分以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可与核苷酸序列杂交并产生靶特异性条形码(例如，靶特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物具有与本公开内容的方法中使用的通用PCR引物不同的序列。
条形码
条形码化，诸如随机条形码化，已描述于以下中：例如，Fu等人,Proc Natl AcadSci U.S.A.,2011May 31；108(22):9026-31；US2011/0160078；Fan等人,Science,2015February 6,347(6222):1258367；US2015/0299784和WO2015/031691；这些中的每一个的内容，包括任何支持或补充信息或材料，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可以用于对靶进行随机标记(例如，条形码化、加标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或这些值中的任何两个值之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。
条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1图示了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包含可以将条形码与固体支持物108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以变化。例如，如图1中所示，通用标记可以是最5’侧的标记(5’-most label)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3’-most label)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记处于任何顺序。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸隔开。
标记(例如，细胞标记)可以包含一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每一种七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数目)，其可被设计成提供错误校正能力。可以设计包含七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组错误校正子序列可被设计成展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的错误校正序列的审查(在下文更详细地描述)可允许人们检测或校正扩增错误或测序错误。在一些实施方案中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。
条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是以下或包括以下：核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有多(A)尾的RNA或其任何组合。在一些实施方案中，多于一个靶可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施方案中，靶结合区可以包括可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。条形码的一种或更多种标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔区(spacer)与条形码的另一种或两种剩余标记隔开。间隔区可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有一个标记被间隔区隔开。
通用标记
条形码可以包含一种或更多种通用标记。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记对于附接至给定固体支持物的条形码组中的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记对于附接至多于一个珠的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可以用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可以用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。
维度标记
条形码可以包含一种或更多种维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于靶被条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间关联。维度标记可以在标记的时间被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以将细胞的群体条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码对细胞再次进行脉冲处理，等等。每次脉冲(例如，细胞周期的每个时期)时的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物学时间。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一个实例中，样品(例如，细胞、细胞的群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的响应。
维度标记可以是可激活的。可激活的维度标记可以在特定时间点被激活。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以被例如可逆地激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，连接另一种分子，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光罩(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将维度标记激活。
在一些实施方案中，维度标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特的维度标记序列。维度标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
空间标记
条形码可以包含一种或更多种空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码关联的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标关联。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以相对于基底固定。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标(landmark)固定。界标可在空间中被鉴定。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(identifiable identifier)(诸如色码、条形码、磁特性(magnetic property)、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)关联。在一些实施方案中，将多于一个空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。
空间标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是至少或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特的空间标记序列。空间标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少以下或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至150个之间的核苷酸。空间标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
细胞标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含提供用于确定哪种靶核酸来源于哪种细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一个实例，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特的细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一个实例，细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一个实例，细胞标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
条形码序列
条形码可以包含一种或更多种条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器(例如，提供粗略估计)的核酸序列。
在一些实施方案中，将一组相异的(diverse)条形码序列附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下或可以有约以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一个条形码可以包括约6561种具有不同序列的条形码序列。作为另一个实例，多于一个条形码可以包括约65536种具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以有至少以下或可以有至多以下的独特条形码序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种。独特分子标记序列可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，独特分子标记序列被颗粒(例如水凝胶珠)部分或全部包含。
在不同实施方式中，条形码的长度可以是不同的。例如，条形码的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。作为另一个实例，条形码的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
分子标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种分子标记。分子标记可以包含条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器的核酸序列。
在一些实施方案中，将一组相异的分子标记附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下或可以有约以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一个条形码可以包括约6561种具有不同序列的分子标记。作为另一个实例，多于一个条形码可以包括约65536种具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以有至少以下或可以有至多以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种。具有独特分子标记序列的条形码可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。
对于使用多于一个随机条形码进行的条形码化(例如，随机条形码化)，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现次数的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现次数的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
分子标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
靶结合区
条形码可以包含一个或更多个靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如，与特定基因序列特异性杂交)的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含能够与限制性酶位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。
在一些实施方案中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指可以独立于靶核酸的特定序列结合多于一个靶核酸的序列。例如，靶结合区可以包含随机多聚体序列、多(dA)序列、多(dT)序列、多(dG)序列、多(dC)序列或其组合。例如，靶结合区可以是与mRNA分子上的多(A)尾杂交的寡(dT)序列。随机多聚体序列可以是，例如，随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的所有条形码，靶结合区是相同的。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的多于一个条形码，靶结合区可以包括两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。例如，可以使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换到条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子在该cDNA分子3’末端上含有条形码序列(诸如分子标记)。
在一些实施方案中，靶结合区可以包含寡(dT)，所述寡(dT)可以与包含多腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，条形码在本文中可以称为基因特异性条形码。
定向特性(Orientation Property)
随机条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种可以用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包含不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定向成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码激活时可以自组装成特定的定向(例如，核酸纳米结构)。
亲和特性(Affinity Property)
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的化学部分和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对样品上的特定部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或特定细胞类型或分子附近的靶可以被标记(例如，被随机标记)。在一些实施方案中，亲和特性可以提供空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。
抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合性)部分(如抗体片段)。
抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、与细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)结合的抗体和治疗性抗体。
通用衔接子引物
条形码可以包含一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(诸如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指遍及所有条形码的通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5-30个核苷酸。
接头
当条形码包含多于一个类型的标记(例如，多于一个细胞标记或多于一个条形码序列，诸如一个分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)码。
固体支持物
在一些实施方案中，本文公开的条形码(诸如随机条形码)可以与固体支持物关联。固体支持物可以是例如合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一个条形码(例如，第一多于一个条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)相差至少一个核苷酸。同一固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记可以是例如约5-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5-20个核苷酸长。合成颗粒可以是例如珠。
珠可以是例如硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。珠可以包括材料诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。
在一些实施方案中，珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合物珠(例如可变形珠或凝胶珠)(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。
在一些实施方案中，颗粒可以是可破坏的(例如，可溶解的、可降解的)。例如，聚合物珠可以例如在期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可以导致聚合物珠以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶珠可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。
例如，分析物和/或试剂(诸如寡核苷酸条形码)可以偶联/固定至凝胶珠的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)和/或凝胶珠的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，本文描述的试剂与凝胶珠或任何其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定型部分(例如，经由化学交联物，包括本文描述的化学交联物)。在施加刺激后，不稳定型部分可以被裂解并释放所固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定型部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定至凝胶珠的情况下，使二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定型部分可以作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分和/或作为试剂或分析物的一部分被包括。在一些实施方案中，多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上、被部分固定在颗粒上、被包封在颗粒中、被部分包封在颗粒中或其任何组合。
在一些实施方案中，凝胶珠可以包括宽范围的不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(poly(pyrolle)，PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PPA)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
许多化学刺激可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例可以包括但不限于pH介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁崩解、珠壁的触发解聚和珠壁转换反应。批量(bulk)改变也可以用于触发珠的破坏。
通过各种刺激对微胶囊的批量或物理改变在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理改变，其中珠破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化或珠壁的孔隙率的改变。
生物刺激也可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可以包含具有对特定蛋白酶的裂解敏感的肽交联的聚合物。更特别地，一个实例可以包括包含GFLGK肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳壁的肽交联被裂解并且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一个实例中，珠包括包含纤维素的壳壁。壳聚糖水解酶的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚及其内部内容物释放的生物触发物。
还可以在施加热刺激后诱导珠释放其内容物。温度的改变可以引起珠的各种改变。热量的变化可以引起珠熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可以增加珠的内部组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。在又其他的情况下，热量可以使珠转化成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。
将磁性纳米颗粒包括在微胶囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及将珠引导成阵列。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁珠。在一个实例中，将Fe3O4纳米颗粒掺入含聚电解质的珠中在存在振荡磁场刺激的情况下触发破裂。
珠也可以由于电刺激的结果被破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒类似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对齐、电导率或氧化还原反应。在一个实例中，含电敏材料的珠在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。
也可以使用光刺激来破坏珠。许多光触发物是可能的，并且可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。涂覆有SiO2的聚电解质胶囊的UV照射可以导致珠壁的崩解。可以将可光切换材料(诸如偶氮苯基团)掺入珠壁中。在施加UV或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式至反式异构化。在此方面，掺入光子开关(photon switch)产生在施加光触发物后可以崩解或变得更多孔的珠壁。
例如，在图2中图示的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔上之后，在框212处可以将珠引入微孔阵列的多于一个微孔上。每个微孔可以包含一个珠。珠可以包含多于一个条形码。条形码可以包含附接至珠的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或其任何组合。
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。与固体支持物关联的条形码可各自包含选自以下组的条形码序列，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物关联的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码的一定百分比包含相同的细胞标记。例如，所述百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。作为另一个实例，所述百分比可以是至少以下或可以是至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的条形码可以具有选自以下组的不同的细胞标记，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的细胞标记。
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一个条形码关联的多于一个合成颗粒的固体支持物将样品中的多于一个靶条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可以包括与多于一个条形码关联的多于一个合成颗粒。不同固体支持物上的多于一个条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。固体支持物可以例如在二维或三维包括多于一个条形码。合成颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。固体支持物可以包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可以包埋到半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物关联。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可以与基底关联。
如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价方式。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于条形码的原位固相合成。
在一些实施方案中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)的其他类似配置。珠可以由例如塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任何组合构成。珠可以是或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形的。
珠可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任何组合。
在一些实施方案中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包括水凝胶。
本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。每个颗粒可以包含多于一个寡核苷酸(例如，条形码)。多于一个寡核苷酸中的每一个可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，寡(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。多于一个寡核苷酸的每一个的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、这些值中的任何两个值之间的数字或范围或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。在一些实施方案中，多于一个颗粒中的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个颗粒包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包括具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒全都不具有相同的细胞标记序列。
在每个颗粒上的多于一个寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。例如，多于一个寡核苷酸中的至少100种包含不同的条形码序列。作为另一个实例，在单个颗粒中，多于一个寡核苷酸中的至少100种、500种、1000种、5000种、10000种、15000种、20000种、50000种、这些值中的任何两个值之间的数字或范围或更多种包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多于一个包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数目)的比例可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更高。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸的每一个还包含样品标记、通用标记或二者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微米颗粒。
珠的尺寸可以不同。例如，珠的直径范围可以为从0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是以下或可以是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短以下或者约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短以下或约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
珠可以附接至基底和/或包埋到基底中。珠可以附接至凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质和/或包埋到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用珠上的条形码上存在的空间标记来鉴定，该空间标记可以用作位置地址。
珠的实例可以包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、微珠、抗体缀合的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合的珠、蛋白G缀合的珠、蛋白A/G缀合的珠、蛋白L缀合的珠、寡(dT)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMagTM羧基封端磁珠。
珠可以与量子点或荧光染料关联(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多于一个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬关联，使其成为顺磁性或铁磁性。珠可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠成像。珠可以具有与珠关联的可检测代码。例如，珠可以包含条形码。珠可以改变尺寸，例如由于在有机溶液或无机溶液中溶胀。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。
固体支持物(例如，珠)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如，珠)可以蚀刻有标识符(例如，数字)。标识符可以通过对珠成像来可视化。
固体支持物可以包括可溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、构建模块(building block)或其他与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这种与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以以溶液中游离，诸如在微量滴定孔中的形式；以流通形式，诸如在柱中；或以浸量尺(dipstick)使用。
固体支持物可以包括膜、纸(paper)、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何配置的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或珠，平坦表面诸如晶片(例如，硅晶片)的凹陷或纳升孔阵列，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。
固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送到整个循环系统。
基底和微孔阵列
如本文使用的，基底可以指固体支持物类型。基底可以指可以包含本公开内容的条形码或随机条形码的固体支持物。基底可以例如包括多于一个微孔。基底可以例如是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括定义体积的小的反应室。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔捕获单细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包含本公开内容的条形码试剂。
条形码化的方法
本公开内容提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中不同位置处的不同靶的数目的方法。该方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)紧密接近样品放置，裂解样品，将不同的靶与条形码关联，对靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。该方法还可以包括对从条形码上的空间标记获得的信息进行分析和/或将所述信息可视化。在一些实施方案中，该方法包括使样品中的多于一个靶可视化。将多于一个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后产生二维映射图和三维映射图。将样品中的多于一个靶可视化可以包括将多于一个靶映射到样品的映射图上。将多于一个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在对样品中的多于一个靶进行条形码化之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在一些实施方案中，可以在裂解样品之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在产生二维映射图或三维映射图之前或之后裂解样品可以包括加热样品、使样品与去污剂接触、改变样品的pH或其任何组合。
在一些实施方案中，将多于一个靶条形码化包括将多于一个条形码与多于一个靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)。将多于一个靶条形码化可以包括产生条形码化靶的索引文库。产生条形码化靶的索引文库可以用包含多于一个条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来进行。
使样品和条形码接触
本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。细胞可以例如通过重力流来接触，其中可以使细胞沉降并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片放置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。可以使样品(例如，细胞)分散遍及基底，例如，通过在基底上生长/培养细胞。
当条形码紧密接近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比例接触，使得每一种不同的靶可以与本公开内容的不同条形码关联。为了确保靶与条形码之间的有效关联，可以将靶与条形码交联。
细胞裂解
在细胞和条形码的分配之后，可以将细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)或消化酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶与条形码的关联，可以通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
在一些实施方案中，可以使用滤纸来裂解样品。可以在滤纸上部用裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸用压力施加至样品，这可以促进样品的裂解以及样品的靶与基底的杂交。
在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加至基底来进行。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至少约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH是约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1M、0.5M或1M或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1M、0.5M或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、tween、NP-40)。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的去污剂浓度是约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于所使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的螯合剂浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的还原剂浓度是约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl，约pH 7.5，约0.5M LiCl，约1％十二烷基硫酸锂，约10mM EDTA和约5mM DTT。
裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或20分钟或更多分钟。裂解的细胞可以包括至少约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可以包括至多约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。
将条形码附接至靶核酸分子
在细胞裂解和核酸分子从细胞释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的条形码随机关联。关联可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡(dT)可以与靶的多(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施方案中，可以将从裂解的细胞释放的核酸分子与基底上的多于一个探针关联(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡(dT)时，可以将mRNA分子与探针杂交并且逆转录。寡核苷酸的寡(dT)部分可以充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框216处，mRNA分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。
附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够与限制性位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如，EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。
例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框220处，随后可以将来自多于一个细胞(或多于一个样品)的标记的靶(例如，靶-条形码分子)汇集至例如管中。标记的靶可以通过例如回收(retrieving)条形码和/或附接靶-条形码分子的珠来汇集。
可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现附接的靶-条形码分子的基于固体支持物的集合的回收。汇集靶-条形码分子后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不先汇集来自多于一个细胞的标记的靶核酸分子。
逆转录或核酸延伸
本公开内容提供了使用逆转录(例如，在图2的框224处)或核酸延伸来产生靶-条形码缀合物的方法。靶-条形码缀合物可以包含条形码以及靶核酸的全部或一部分的互补序列(即，条形码化的cDNA分子，诸如随机条形码化的cDNA分子)。关联的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡(dT)引物的长度可以是12-18个核苷酸或可以是约12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’末端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，mRNA分子向标记的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡(dT)引物的长度是12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’末端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，靶是cDNA分子。例如，可以使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换到条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子在该cDNA分子3’末端上含有条形码序列(诸如分子标记)。
逆转录可以重复地发生以产生多于一个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。该方法可以包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。
扩增
可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228处)以产生标记的靶核酸分子的多于一个拷贝。扩增可以以多重化方式进行，其中多于一个靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或这些值中的任何两个值之间的范围或数字。该方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶-条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。
在一些实施方案中，扩增可以使用聚合酶链式反应(PCR)来进行。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR以及组装PCR。
标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶的3’末端或5’末端。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶的内部区域。内部区域可以与多于一个标记的靶的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。
一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或其任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总标记靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一种或更多种基因。
可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至珠的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物变成Illumina测序文库。使用150bp×2测序的测序可以揭示读段1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。
在一些实施方案中，可以使用化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或经修饰的碱基可以用于促进将核酸从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性内切核酸酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖苷酶(UDG)处理含dUTP或ddUTP的核酸可以用于将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)内切核酸酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底去除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、Ig蛋白A、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。
当探针是基因特异性时，可以将分子与探针杂交，并且逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，核酸可以被扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多种靶核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。
在一些实施方案中，可以例如用桥接扩增在基底上进行扩增。cDNA可以加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡(dT)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’末端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物中的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延长以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补DNA链。在随后的退火和延长步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，通过共价键连接第一引物并通过杂交连接第二引物。在延长阶段，通过在同一反应混合物中添加核苷酸，第二引物可以在反向方向上延长，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子具有的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延长步骤中，每条链可以与同一颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延长从而将两个新的桥转换成双链桥。
扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的指数式扩增。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及组装PCR。
在一些实施方案中，标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和/或分支延伸扩增(RAM)。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可选地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
在一些实施方案中，方法包括反复扩增标记的核酸以产生多于一个扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。可选地，方法包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。
扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至一个或更多个包含多于一个核酸的样品中。扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至多于一个核酸。对照核酸可以包含对照标记。
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定型和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含至少约7-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的3’末端和/或5’末端。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的内部区域。内部区域可以与多于一个标记的核酸的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种管家基因引物。一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或其产物。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是与本公开内容的阵列附接的探针。
在一些实施方案中，将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或靶的条形码化片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化靶的索引文库包括从样品中的多于一个靶产生多于一个索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以相差以下、相差约以下、相差至少以下或相差至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，产生条形码化靶的索引文库包括使多于一个靶(例如mRNA分子)与包含多(T)区和标记区的多于一个寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子(每一种包含cDNA区和标记区)，其中多于一个靶包括至少两种不同序列的mRNA分子，且多于一个寡核苷酸包括至少两种不同序列的寡核苷酸。产生条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。
条形码化(例如，随机条形码化)可以包括使用核酸条形码或标签以标记个体核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，其包括在从mRNA产生cDNA分子时将DNA条形码或标签添加至cDNA分子。可以进行巢式PCR以使PCR扩增偏倚最小化。可以添加用于测序(例如下一代测序(NGS))使用的衔接子。例如在图2的框232处，可以使用测序结果来确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、分子标记和核苷酸片段的序列。
图3是示出了产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库，诸如条形码化的mRNA或其片段的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以用独特分子标记序列、细胞标记序列和通用PCR位点对每个mRNA分子进行编码。具体地，通过将一组条形码(例如，随机条形码)310与RNA分子302的多(A)尾区308杂交(例如，随机杂交)，可以将RNA分子302逆转录以产生标记的cDNA分子304(包括cDNA区306)。条形码310中的每一个可以包括靶结合区，例如多(dT)区312、标记区314(例如，条形码序列或分子)和通用PCR区316。
在一些实施方案中，细胞标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一个随机条形码中的每一个还包括通用标记和细胞标记中的一种或更多种，其中通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包含3个至20个核苷酸。
在一些实施方案中，标记区314可以包含条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一种或更多种。条形码序列或分子标记318的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码可以是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。维度标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。
在一些实施方案中，标记区314可以包括以下、可以包括约以下、可以包括至少以下或可以包括至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每一种标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以含有以下、可以含有约以下、可以含有至少以下或可以是至多以下：10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种、1010种、1011种、1012种、1013种、1014种、1015种、1020种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且条形码或随机条形码310的组可以例如，各自包含独特标记区314。标记的cDNA分子304可以进行纯化以去除过量的条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠纯化。
如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集至1支管中，并且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。因为独特标记区314，汇集是可能的。特别地，可以将标记的cDNA分子304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括以单一反应体积用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用、利用约、利用至少或利用至多10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种、1010种、1011种、1012种、1013种、1014种、1015种、1020种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括使用包括靶向特定基因的定制引物326A-C的第1PCR引物池324和通用引物328。定制引物326可以与标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。
如图3的步骤3中示出的，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物扩增。巢式PCR可以使PCR扩增偏倚最小化。特别地，巢式PCR标记的扩增子322可通过巢式PCR进行进一步扩增。巢式PCR可以包括在单个反应体积中用巢式PCR引物332a-c的巢式PCR引物池330和第2通用PCR引物328’进行的多重PCR。巢式PCR引物池330可以包含以下、可以包含约以下、可以包含至少以下或可以包含至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的巢式PCR引物332。巢式PCR引物332可以包含衔接子334，并与标记的扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以包含衔接子336，并与标记的扩增子322的通用PCR区域316杂交。由此，步骤3产生衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，巢式PCR引物332和第2通用PCR引物328’可以不包含衔接子334和衔接子336。而是，衔接子334和衔接子336可以连接至巢式PCR的产物以产生衔接子标记的扩增子338。
如步骤4中示出的，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的PCR产物进行PCR扩增用于测序。特别地，可以使用衔接子334和衔接子336对衔接子标记的扩增子338进行一个或更多个另外的测定。衔接子334和衔接子336可以与引物340和引物342杂交。一种或更多种引物340和引物342可以是PCR扩增引物。一种或更多种引物340和引物342可以是测序引物。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于对衔接子标记的扩增子338测序。引物342可以包含板索引344，使得使用同一组条形码或随机条形码310产生的扩增子可以使用下一代测序(NGS)在一个测序反应中测序。
多重化的单细胞免疫测定
在免疫学、肿瘤学和其他领域，研究单细胞表型变异的需求日益增加。孔或液滴中的单细胞捕获已经与用于通过测序读出单细胞基因组和转录组分析的方法耦合。历史上使用荧光团标记的抗体研究单细胞相关蛋白，并通过荧光成像或流式细胞术读出，但最近可以通过测序读取来自单细胞的寡核苷酸标记的抗体。测量单细胞分泌或细胞内蛋白表达的方法已经落后。在一些实施方案中，本文的公开内容提供了使用多重化的单细胞免疫测定采用荧光标记的抗体来研究从单细胞分泌的分子(诸如细胞因子)和来自裂解的细胞的细胞内蛋白表达的方法。
图5示出了本文描述的多重化的单细胞免疫测定的非限制性示例性实施方案的示意图。在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物与单细胞分析系统、工作流程和平台(例如，BD Rhapsody)相容。例如，在一些实施方案中，方法采用微孔筒、流量控制移液管(rate-controlled pipettes)和/或仪器来用单个珠和细胞装载孔。在本文提供的组合物和方法的一些实施方案中，将具有适当尺寸(例如，基于所选分区的尺寸)的固体支持物(例如，微珠)装载到具有适当尺寸的多于一个分区(例如，微孔)的表面上，使得每个孔可以装载不多于一个珠。例如，具有35um直径的珠可以装载到具有50um孔的表面。接下来，可以以使得孔的数目大于细胞的数目(例如，10:1孔/细胞比)的浓度将细胞装载到表面上。在一些实施方案中，这确保了在孔中具有两个或更多个细胞的可能性是低的。珠和细胞可以通过重力沉降在微孔中。然后，细胞可以在受控条件下在孔中孵育预先指定的时间段，使得从细胞释放或分泌的分子积累到孔的体积中。在一些实施方案中，孔之间的液体连通受到限制以防止串扰。
在本文提供的组合物和方法的一些实施方案中，每个固体支持物(例如，珠)可以涂覆有多于一种捕获抗体——每种感兴趣的分析物一种——使得从孔中的细胞释放的分析物被捕获在珠上。固体支持物(例如，珠)的表面积可以足够大以从几种不同的测定中的每一种中获得足够数量的抗体。在孵育期结束时，珠可以被捕获并合并。固体支持物可以被洗涤，并且然后用检测抗体池染色，其中每种测定具有带有独特荧光标记的独特检测抗体。在一些实施方案中，这允许在珠表面上形成多色“夹心”复合物，其荧光信号和与珠结合的细胞因子的量成比例。因此，每个固体支持物(例如，珠)记录来自单个分区(例如，孔)的细胞的分泌组。接下来，在一些实施方案中，固体支持物可以在多色荧光检测系统，诸如流式细胞仪或荧光成像仪上进行分析，其中每个阳性珠代表单细胞，并且每种荧光颜色代表每种细胞因子。
在本文提供的采用成像分析的方法的一些实施方案中，所有标记和洗涤过程都发生在筒中，并且荧光成像发生在筒中。在一些实施方案中，筒是光学透明的，具有低自体荧光。在一些实施方案中，图像数据可以使用户容易地确定哪些珠与细胞共定位。
在本文提供的采用流式细胞术分析的方法的一些实施方案中，从筒中去除固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，通过在微孔筒的顶表面上施加外部磁力以捕获固体支持物(例如磁珠)，而从筒中去除磁珠。这可以发生在细胞和珠的初始孵育之后，允许珠洗涤和用检测抗体大量标记，或者在筒中洗涤和检测标记结束时发生。本文提供的采用流式细胞术分析的一些实施方案包括确定哪些珠已与细胞接触的步骤，因为在一些实施方案中，许多孔可以包含珠但不包含细胞。在去除珠之前，成像扫描仪可用于对具有珠以及具有或不具有细胞的孔的数目进行定量。在不包括成像扫描仪的一些实施方案中，可以基于装载的细胞浓度和泊松统计进行估计。这些数据可用于估计流式细胞术数据中预期的阴性与阳性珠事件的绝对数目和比例。在本文提供的一些实施方案中，已经与缓冲液和试剂一起孵育但没有细胞的阴性对照珠可以用于为所有通道中的阴性背景信号提供另外的对照。此外，从所有细胞分泌的阳性对照标志物可用于对装载细胞的珠进行阳性鉴定。
在本文提供的方法的一些实施方案中，通过将捕获珠与已知浓度的分析物的滴定物混合，并如以上描述的洗涤和用检测抗体标记，来产生校准曲线。然后，可以通过对这些珠运行流式细胞术或筒成像来校准测量方法。
可以将珠和单细胞置于油包水液滴中，而不是微孔中。在一些实施方案中，在孵育期结束时裂解细胞，用于测量细胞内蛋白，包括与细胞信号传导测定相关的细胞内磷蛋白或细胞因子。在一些实施方案中，对“看家”蛋白的检测指示装载了细胞的孔(与空白孔相对)。在一些实施方案中，细胞通过细胞上的表面标志物和珠上的捕获抗体(例如，抗CD45抗体)与珠结合，并且珠和细胞在流式细胞术中作为串联物分析。在一些实施方案中，细胞在孵育结束时的“固定”步骤中连接到珠，并且珠和细胞可以在流式细胞术中作为串联物分析。在本文公开的方法的一些实施方案中，多色荧光成像被用作测量珠上结合的荧光标记的检测方法。在一些实施方案中，用2种不同的细胞类型装载分区(例如，孔)，并且监测细胞杀伤或细胞相互作用测定期间的分泌。在一些实施方案中，通过使用报告物的荧光读出来监测细胞杀伤。在一些实施方案中，转录组和/或蛋白组的变化通过scRNAseq或scAbseq使用本文提供的方法进行监测。
方法和组合物可以与单细胞分析系统、工作流程和平台(例如BD Rhapsody)相容。在一些实施方案中，单细胞在单个孔中与单个珠一起孵育。在一些实施方案中，珠组合了多于一种夹心型免疫测定。在一些实施方案中，每种测定使用不同的荧光检测颜色，并且测定可以使用高参数流式细胞仪或成像仪来分辨。
图4A-图4D示出了用于测量单细胞的分泌因子的分泌水平的非限制性示例性工作流程的示意图。工作流程可以包括将第一多于一个固体支持物404a(例如，珠)分区400a到多于一个分区402。工作流程可以包括将细胞408a(例如，T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物)分区400b到多于一个分区402。多于一个分区中的分区402(例如，孔、液滴)可以包含单细胞408a和单个固体支持物404a。细胞408a可以包含分泌囊泡410，所述分泌囊泡410包含未释放的分泌因子412a、412b、412c、412d。分泌因子412a、412b、412c和412d可以是不同的分泌因子。细胞408a可以能够分泌分泌因子412a、412b、412c和412d。固体支持物404a可以包含捕获探针406a、406b、406c和406d，这些捕获探针可以能够分别与分泌因子412a、412b、412c和412d特异性结合。工作流程可以包括孵育400c，孵育400c包括分泌因子的分泌和其与捕获探针的结合。工作流程可以包括汇集400d来自多于一个分区中的每一个分区的单个固体支持物(以产生第二多于一个固体支持物)。汇集可以使用磁场来进行。工作流程可以包括提供未与细胞408a和/或分泌因子412a、412b、412c和412d接触的阴性对照固体支持物416(例如，珠)。工作流程可以包括提供已与预定浓度的分泌因子412a、412b、412c和412d接触的一个或更多个校准固体支持物414(例如，珠)。工作流程可以包括使阴性对照固体支持物416、固体支持物404a和/或校准固体支持物414与多于一种分泌因子结合试剂418a、418b、418c和418d接触400e。分泌因子结合试剂418a、418b、418c和418d可以能够分别与分泌因子412a、412b、412c和412d特异性结合。分泌因子结合试剂418a、418b、418c和418d可以分别包含可检测部分420a、420b、420c和420d。工作流程可以包括孵育期，以允许分泌因子结合试剂与由捕获探针结合的所述分泌因子结合。工作流程可以包括一次或更多次洗涤400f，洗涤400f包括去除未与分泌因子412a、412b、412c和412d结合的分泌因子结合试剂418a、418b、418c和418d，分泌因子412a、412b、412c和412d分别被捕获探针406a、406b、406c和406d结合(以产生第三多于一个固体支持物)。工作流程可以包括分析400g阴性对照固体支持物416、固体支持物404a和/或校准固体支持物414。分析400g可以包括测量每一个固体支持物的每一个可检测部分的发射(例如，通过流式细胞术、通过荧光显微术)，以确定由一个或更多个单细胞408a中的每一个分泌的分泌因子412a、412b、412c、412d的分泌水平。工作流程可以包括测量校准固体支持物414的每一个可检测部分的发射，以产生将分泌因子412a、412b、412c、412d的分泌与可探测部分的发射相关联的校准曲线。
在一些实施方案中，提供了测量单细胞的分泌因子的分泌水平的方法。在一些实施方案中，方法包括：使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触，所述一个或更多个单细胞能够分泌多于一种分泌因子，每一个第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，并且捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体；以及测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射，以确定由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的至少一种分泌因子的分泌水平。一个或更多个单细胞可以包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。
使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触可以包括：将一个或更多个单细胞和第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区，多于一个分区中的分区包含一个或更多个单细胞中的单细胞和第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物。方法可以包括：在使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之前：汇集来自多于一个分区中的每一个分区的单个第一固体支持物以产生第二多于一个第一固体支持物，任选地汇集使用磁场来进行。使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触可以包括使第二多于一个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触。方法可以包括在使第二多于一个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除多于一种分泌因子结合试剂中未与第二多于一个第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂以产生第三多于一个第一固体支持物，任选地测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射包括测量第三多于一个第一固体支持物中的每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射。去除未与第二多于一个第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂可以包括：去除未与分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。
在一些实施方案中，使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触在多于一个分区中进行。方法可以包括在使第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除多于一种分泌因子结合试剂中未与第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。去除未与第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂可以包括：去除未与分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的一种或更多种分泌因子结合试剂。方法可以包括汇集来自多于一个分区中的每一个分区的单个第一固体支持物，任选地汇集使用磁场来进行。在将第一多于一个第一固体支持物分区之前，可以将一个或更多个单细胞分区到多于一个分区，或者在将一个或更多个单细胞分区之前，可以将第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区。
第一固体支持物可以包括约35μm的直径。第一固体支持物可以包括约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的直径。分区可以是具有直径50μm的孔。在一些实施方案中，分区(例如，孔)包括约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm或者这些值中的任何两个值之间的数字或范围的直径。
一个或更多个单细胞可以包括至少约10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、109个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的细胞。多于一个分区中的分区的数目可以是一个或更多个单细胞中的单细胞的数目的至少1.1倍(例如，1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍、10000倍或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)高。
多于一个分区可以包括多于一个液滴(例如，油包水液滴)。多于一个分区可以包括微孔阵列的微孔。微孔阵列可以包括至少约10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、20000个、30000个、40000个、50000个、60000个、70000个、80000个、90000个、100000个、106个、107个、108个、109个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的微孔。
可以选择分区(例如，至少100个微孔)的尺寸，使得每个分区(例如，微孔)可以包含至多一个第一固体支持物。分区(例如，至少100个微孔)的平均直径与第一固体支持物的直径之比可以是约1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.5:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、96:1、97:1、98:1、99:1、100:1、200:1或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比可以在约0.1至2的范围(例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)。在一些实施方案中，至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比为约0.9。在一些实施方案中，每个微孔具有范围为约1000μm3至约786000μm3(例如，1000μm3、5000μm3、10000μm3、50000μm3、100000μm3、500000μm3、786000μm3或这些值中的任何两个值之间的数字或范围)的体积。每个微孔可以具有约144000μm3的体积。
在一些实施方案中，在将第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区之后，分区(例如，微孔阵列的微孔)包含单个第一固体支持物的百分比为至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
在一些实施方案中，在将一个或更多个单细胞分区到多于一个分区之后，分区(例如，微孔阵列的微孔)包含单细胞的百分比在约0.01％和约15％之间。在将一个或更多个单细胞分区到多于一个分区之后，分区(例如，微孔阵列的微孔)包含单细胞的百分比可以是约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，至少100个微孔包含单细胞的百分比在约1％和约11％之间。分区(例如，微孔阵列的微孔)包含单细胞的百分比可以是约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
在一些实施方案中，方法包括：提供未与一个或更多个单细胞接触的阴性对照第一固体支持物；使所述阴性对照第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合；以及测量阴性对照第一固体支持物的发射。在一些实施方案中，由单细胞分泌的多于一种分泌因子包含由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的通用分泌因子，与结合所述通用分泌因子的分泌因子结合试剂关联的可检测部分的发射鉴定包含单细胞的分区。在一些实施方案中，方法包括：使两个或更多个第一固体支持物与两种或更多种预定浓度的分泌因子接触，使两个或更多个第一固体支持物中的每一个与不同预定浓度的分泌因子接触；使两个或更多个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自包含可检测部分或其前体，所述多于一种分泌因子结合试剂能够与被两个或更多个第一固体支持物的捕获探针结合的分泌因子特异性结合；以及测量两个或更多个第一固体支持物中的每一个的所述可检测部分的发射，以产生将至少一种分泌因子的分泌水平与可检测部分的发射相关联的校准曲线。
测量步骤可以包括用流式细胞仪(例如，常规流式细胞仪、光谱流式细胞仪、高光谱流式细胞仪、成像流式细胞仪或其任何组合)测量可检测部分的发射。测量步骤可以包括用荧光显微镜测量可检测部分的发射。测量步骤可以包括用成像系统测量可检测部分的发射。测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射可以包括对多于一个分区进行成像。在一些实施方案中，可以顺序地或同时地对多于一个分区进行成像。成像可以包括显微术、共焦显微术、时差成像显微术、荧光显微术、多光子显微术、定量相位显微术、表面增强拉曼光谱、摄像、手动视觉分析、自动视觉分析或其任何组合。方法可以包括在汇集来自多于一个分区中的每一个分区的单个第一固体支持物之前，用成像系统对多于一个分区进行成像以生成成像数据。成像系统可以被配置为基于所述成像数据对(i)包含单个第一固体支持物和单细胞的分区的数目和/或(ii)包含单个第一固体支持物并且不包含单细胞的分区的数目进行定量。成像系统可以包括多荧光成像系统。成像系统可以被配置为捕获和处理至少100个微孔的全部或一部分的图像。成像系统可以包括照明子系统、成像子系统和/或处理器。成像系统可以被配置为进行明场、暗场、荧光或定量相位成像。在一些实施方案中，成像系统包括选择机制，选择机制使用源自经处理的图像的信息来鉴定不包含单细胞的分区，并且选择机制被配置为在后续数据分析中排除不包含单细胞的分区的图像。筒可以包含微孔阵列。筒可以包括用于对至少100个微孔进行成像的透明窗。筒可以包括低自体荧光。
方法可以包括：将一个或更多个单细胞与第一固体支持物连接以形成与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞；以及将与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞作为串联物分析。在一些实施方案中，一个或更多个单细胞包含表面细胞靶，第一固体支持物包含多于一种锚定探针，并且多于一种锚定探针中的每一种能够与表面细胞靶特异性结合，从而形成与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞。将一个或更多个单细胞与第一固体支持物连接可以包括使一个或更多个单细胞和第一固体支持物与固定剂接触。
方法可以包括将一个或更多个伴随细胞分区到多于一个分区，其中多于一个分区中的分区包含：(i)一个或更多个单细胞中的单细胞，(ii)第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物，以及(iii)一个或更多个伴随细胞中的单个伴随细胞。方法可以包括裂解分区中的单细胞。裂解单细胞可以包括加热单细胞、使单细胞与去污剂接触、改变单细胞的pH或其任何组合。方法可以包括可逆地固定一个或更多个单细胞和/或可逆地透化一个或更多个单细胞。
在2021年1月15日提交的题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR SINGLE CELLSECRETOMICS”的美国专利申请第17/151,058号(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述了采用以下来测量来自细胞的分泌因子的系统、方法、组合物和试剂盒：(i)双特异性探针，其包含能够与细胞的表面细胞靶特异性结合的锚定探针和能够与由细胞分泌的分泌因子特异性结合的捕获探针，所述细胞与捕获探针关联，和/或(ii)分泌因子结合试剂，其能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合。
固体支持物、探针和结合试剂
第一固体支持物和/或第二固体支持物可以包括合成颗粒和/或平坦表面。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码中的至少一个被固定在合成颗粒上、部分地固定在合成颗粒上、包封在合成颗粒中或部分地包封在合成颗粒中。合成颗粒可以是可破坏的。合成颗粒可以包括珠。珠可以包括：琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合；选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合；或者可破坏的水凝胶颗粒。
在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸条形码中的每一个包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，多于一种锚定探针中的每一种包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，多于一种捕获探针中的每一种包含接头官能团，合成颗粒包含固体支持物官能团，并且支持物官能团和接头官能团彼此关联，并且任选地接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
本文提供的组合物和方法的一些实施方案是多重化的。在一些实施方案中，第一固体支持物能够结合2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的分泌因子。在一些实施方案中，第一固体支持物包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的捕获探针。所述不同的捕获探针可以能够结合不同的分泌因子和/或同一分泌因子的不同区域。在一些实施方案中，多于一种分泌因子结合试剂包括2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的分泌因子结合试剂。所述不同的分泌因子结合试剂可以能够结合不同的分泌因子和/或同一分泌因子的不同区域。所述不同的分泌因子结合试剂可以各自包含不同的可检测部分或其前体。不同的可检测部分可以是光谱上不同的部分。本文提供的方法的一些实施方案包括确定由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的分泌因子的分泌水平。
至少一种分泌因子可以包括淋巴因子、白细胞介素、趋化因子或其任何组合。至少一种分泌因子可以包括细胞因子、激素、分子毒素或其任何组合。至少一种分泌因子可以包括神经生长因子、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、转化生长因子、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子或其任何组合。至少一种分泌因子可以包括血管生成素、血管生成蛋白-1、血管生成蛋白-2、bNGF、组织蛋白酶S、半乳凝素-7、GCP-2、G-CSF、GM-CSF、PAI-1、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PlGF、PlGF-2、SDF-1、Tie2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、6Ckine、血管生成蛋白-1、血管生成蛋白-2、BLC、BRAK、CD186、ENA-78、嗜酸性粒细胞趋化因子-1、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、EpCAM、GDF-15、GM-CSF、GRO、HCC-4、I-309、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1R4(ST2)、IL-2、IL-2R、IL-3、IL-3Rα、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-8RB、IL-11、IL-12、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-13R1、IL-13R2、IL-15、IL-15Rα、IL-16、IL-17、IL-17C、IL-17E、IL-17F、IL-17R、IL-18、IL-18BPa、IL-18Rα、IL-20、IL-23、IL-27、IL-28、IL-31、IL-33、IP-10、I-TAC、LIF、LIX、LRP6、MadCAM-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、M-CSF、MIF、MIG、MIP-1γ、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3α、MIP-3β、MPIF-1、PARC、PF4、RANTES、抵抗素、SCF、SCYB16、TACI、TARC、TSLP、TNF-α、TNF-R1、TRAIL-R4、TREM-1、激活蛋白A、双调蛋白、Axl、BDNF、BMP4、组织蛋白酶S、EGF、FGF-1、FGF-2、FGF-7、FGF-21、卵泡抑制素、半乳凝素-7、Gas6、GDF-15、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-3、LAP、NGF R、NrCAM、NT-3、NT-4、PAI-1、TGF-α、TGF-β、TGF-β3、TRAIL-R4、ADAMTS1、组织蛋白酶S、FGF-2、卵泡抑制素、半乳凝素-7、GCP-2、GDF-15、IGFBP-6、LIF、MMP-9、pro-MMP9、RANK、RANKL、RANTES、SDF-1、CXCR4或其任何组合。
分泌因子结合试剂和捕获探针可以能够与同一分泌因子的不同表位结合。在一些实施方案中，分泌因子结合试剂、捕获探针和锚定探针中的一种或更多种包括抗体(例如，单克隆抗体)或其片段。抗体或其片段可以包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。捕获探针和/或锚定探针可以通过以下与第一固体支持物缀合：1,3-偶极环加成反应、杂-Diels-Alder反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合。
表面细胞靶可以包括糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。表面细胞靶可以包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15u、CD15s、CD15su、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85a、CD85d、CD85j、CD85k、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158e、CD158i、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CD199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217a、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240CE、CD240DCE、CD240D、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD308、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、BCMA、HLA蛋白、β2-微球蛋白或其任何组合。
用于同时进行单细胞转录组和蛋白组谱分析的方法
在一些实施方案中，提供了用于对单细胞的转录组和/或蛋白组进行定量分析的方法。本文描述的方法和系统可以与使用与寡核苷酸关联(例如，与寡核苷酸附接或缀合)的抗体(本文也称为AbO或AbOligo)的方法和系统一起使用。使用AbO来确定单细胞中的蛋白表达谱和追踪样品来源的实施方案已在美国专利申请第15/715,028号(公布为美国专利申请公布第2018/0088112号)和美国专利申请第15/937,713号中描述；每项专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。一个或更多个单细胞可以包含多于一个细胞组分靶。方法可以包括：使多于一种细胞组分结合试剂与一个或更多个单细胞接触，所述多于一种细胞组分结合试剂中的每一种包含细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含用于细胞组分结合试剂的独特标识符序列，并且细胞组分结合试剂能够与多于一个细胞组分靶中的至少一个特异性结合；使多于一个寡核苷酸条形码与细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸接触以进行杂交，寡核苷酸条形码各自包含分子标记和第一通用序列；使与细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸杂交的多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，每一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含与独特标识符序列的至少一部分互补的序列和分子标记；以及获得多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定一个或更多个单细胞中的每一个中多于一个细胞组分靶中的至少一个细胞组分靶的拷贝数。
在一些实施方案中，一个或更多个单细胞包含核酸靶的拷贝。方法可以包括：使多于一个寡核苷酸条形码与核酸靶的拷贝接触以进行杂交，多于一个寡核苷酸条形码中的每一个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、能够与核酸靶的拷贝杂交的靶结合区和分子标记；使与核酸靶的拷贝杂交的多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化核酸分子，所述多于一个条形码化核酸分子各自包含与核酸靶的至少一部分互补的序列；以及获得多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。
多于一个寡核苷酸条形码可以与第二固体支持物关联，并且多于一个分区中的分区包含单个第二固体支持物。寡核苷酸条形码可以包括包含捕获序列的靶结合区。靶结合区可以包含多(dT)区。细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸可以包含与捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置为捕获细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸。与捕获序列互补的序列可以包含多(dA)区。
确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数可以包括基于与多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的分子标记、其互补物或其组合的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。方法可以包括：使随机引物与多于一个条形码化核酸分子接触，所述随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补物；以及使与多于一个条形码化核酸分子杂交的随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。方法可以包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子。扩增多于一个延伸产物可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个延伸产物。方法可以包括基于与第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数可以包括基于与第一多于一个条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中多于一个核酸靶中的每一个的数目，所述第一多于一个条形码化扩增子包含多于一个核酸靶中的每一个的序列。多于一个核酸靶中的每一个的序列可以包括多于一个核酸靶中的每一个的子序列。第一多于一个条形码化扩增子中的核酸靶的序列可以包括核酸靶的子序列。
方法可以包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第二多于一个条形码化扩增子。扩增第一多于一个条形码化扩增子可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到第一多于一个条形码化扩增子。方法可以包括基于与第二多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。第一多于一个条形码化扩增子和/或第二多于一个条形码化扩增子可以包括全转录组扩增(WTA)产物。
方法可以包括使用多于一个条形码化核酸分子作为模板合成第三多于一个条形码化扩增子以产生第三多于一个条形码化扩增子。合成第三多于一个条形码化扩增子可以包括对多于一个条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。合成第三多于一个条形码化扩增子可以包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物以及靶特异性引物进行的PCR扩增。方法可以包括获得第三多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。获得序列信息可以包括将测序衔接子附接到第三多于一个条形码化扩增子或其产物。方法可以包括基于与第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。
核酸靶可以包括核酸分子(例如，核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合)。
在一些实施方案中，多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含第一通用序列的互补物。细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸可以包含第二通用序列。在一些实施方案中，获得多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括：使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物，以产生多于一个扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸；以及获得多于一个扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的测序信息。获得序列信息可以包括将测序衔接子附接到多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。方法可以包括在使多于一种细胞组分结合试剂与一个或更多个单细胞接触之后，去除多于一种细胞组分结合试剂中未与一个或更多个单细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂。去除未与一个或更多个单细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂可以包括：去除未与多于一个细胞组分靶中的相应至少一个靶接触的一种或更多种细胞组分结合试剂。细胞组分靶可以包括细胞内蛋白、糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。细胞组分靶可以包括看家蛋白，并且对所述看家蛋白的检测可以指示分区中单细胞的存在。在一些实施方案中，延伸多于一个寡核苷酸条形码包括使用逆转录酶(例如，病毒逆转录酶，诸如鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶(例如，Klenow片段)来延伸多于一个寡核苷酸条形码。
第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以是相同的或不同的。第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。测序衔接子可以包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。测序引物可以包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个可以包含不同的分子标记序列。多于一个寡核苷酸条形码各自可以包含细胞标记。多于一个寡核苷酸条形码的每一种细胞标记可以包含至少6个核苷酸。与同一第二固体支持物关联的寡核苷酸条形码可以包含相同的细胞标记。与不同第二固体支持物关联的寡核苷酸条形码可以包含不同的细胞标记。
可检测部分
在一些实施方案中，可检测部分(例如，可检测标记)包括光学部分、发光部分、电化学活性部分、纳米颗粒或其组合。在一些实施方案中，发光部分包括化学发光部分、电致发光部分、光致发光部分或其组合。在一些实施方案中，光致发光部分包括荧光部分、磷光部分或其组合。在一些实施方案中，荧光部分包括荧光染料。在一些实施方案中，纳米颗粒包括量子点。在一些实施方案中，该方法包括进行反应以使可检测部分的前体转化为可检测部分。在一些实施方案中，进行反应以使可检测部分的前体转化为可检测部分包括使可检测部分的前体与底物接触。在一些这样的实施方案中，使可检测部分的前体与底物接触产生该两分子之间反应的可检测副产物。
可检测部分的特性和结构
在一些实施方案中，可检测标记、部分或标志物可以是基于以下可检测出的：例如荧光发射、吸光度、荧光偏振、荧光寿命、荧光波长、吸光波长、斯托克斯位移(Stokesshift)、光散射、质量、分子质量、氧化还原、声学、Raman、磁性、射频、酶促反应(包括化学发光和电化学发光)或其组合。例如，标记可以是荧光团、发色团、酶、酶底物、催化剂、氧化还原标记、放射标记、声学标记、Raman(SERS)标签、质量标签、同位素标签(例如，同位素纯稀土元素)、磁性颗粒、微粒、纳米颗粒、寡核苷酸或其任何组合。在一些实施方案中，标记是荧光团(即，荧光标记、荧光染料等)。感兴趣的荧光团可以包括但不限于适合在分析应用(例如，流式细胞术、成像等)中使用的染料，诸如吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料(例如，二苯基甲烷染料)、含叶绿素染料、三芳基甲烷染料(例如，三苯基甲烷染料)、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、菁染料、不对称菁染料、醌-亚胺染料、嗪染料、二氨吖嗪染料、藏红染料、吲达胺、靛酚染料、氟染料、噁嗪染料、噁酮染料、噻嗪染料、噻唑染料、呫吨染料、芴染料、派洛宁染料、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料，以及组合上述染料中的两种或更多种的染料(例如，串联的)，具有一个或更多个单体染料单元的聚合物染料和上述染料中的两种或更多种的混合物。大量染料可从诸如以下的各种来源商购可得：例如，Molecular Probes(Eugene,OR)、Dyomics GmbH(Jena,Germany)、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)、Sirigen,Inc.(Santa Barbara,CA)和Exciton(Dayton,OH)。例如，荧光团可以包括4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’二磺酸；吖啶及衍生物诸如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和异硫氰酸吖啶；别藻蓝蛋白；藻红蛋白；多甲藻素(peridinin)-叶绿素蛋白；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸(Lucifer Yellow VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)；Brilliant Yellow；香豆素及衍生物，诸如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青及其衍生物，如四氯四溴荧光素(cyanosine)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5’,5”-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二乙基氨基香豆素；五乙酸二乙烯三胺；4,4’-二异硫氰酸二氢-芪-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯偶氮基苯基-4’-异硫氰酸(DABITC)；伊红及衍生物，诸如伊红和异硫氰酸伊红；赤藓红及衍生物，诸如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；乙锭；荧光素及衍生物，诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、氯三嗪基荧光素、萘并荧光素和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；Lissamine罗丹明，荧光黄(Lucifer yellow)；异硫氰酸孔雀石绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿(Oregon green)；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘及衍生物，诸如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-丁酸芘；活性红4(Reactive Red 4,CibacronTM亮红3B-A)；罗丹明及衍生物，诸如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺(lissamine)、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas red))、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合衍生物；呫吨；染料缀合的聚合物(即，聚合物附接的染料)，诸如异硫氰酸荧光素-右旋糖酐，以及组合两种或更多种染料(例如，串联的)的染料，具有一种或更多种单体染料单元的聚合物染料和上述染料中的两种或更多种的混合物或其组合。
可检测部分可以选自一组光谱不同的可检测部分。光谱不同的可检测部分包括具有可区分发射光谱的可检测部分，即使它们的发射光谱可能重叠。可检测部分的非限制性实例包括呫吨衍生物：荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、伊红和德克萨斯红；花青衍生物：花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂碳花青和部花青(merocyanine)；方酸菁衍生物和环取代的方酸菁，包括Seta、SeTau和Square染料；萘衍生物(丹磺酰和prodan衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物：吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；蒽衍生物：蒽醌类，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙；芘衍生物；cascade蓝；噁嗪衍生物：尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170；吖啶衍生物：原黄素(proflavin)、吖啶橙、吖啶黄；芳基次甲基(arylmethine)衍生物：金胺、结晶紫、孔雀石绿；和四吡咯衍生物：卟吩，酞菁，胆红素。可检测部分的其他非限制性实例包括羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、Cascade蓝、Pacific蓝、Pacific橙、Lucifer黄、NBD、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、红613、PerCP、TruRed、FluorX、荧光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-罗丹明、Lissamine罗丹明B、德克萨斯红、别藻蓝素(APC)、APC-Cy7缀合物、Hoechst 33342、DAPI、Hoechst 33258、SYTOX Blue、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、溴化乙錠、吖啶橙、SYTOX绿、TOTO-1、TO-PRO-1、TO-PRO：花青单体、噻唑橙、CyTRAK橙、碘化丙啶(PI)、LDS 751、7-AAD、SYTOX橙、TOTO-3、TO-PRO-3、DRAQ5、DRAQ7、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR和SNARF。
在一些实施方案中，感兴趣的荧光团可以包括但不限于适合在分析应用(例如，流式细胞术、成像等)中使用的染料，诸如吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料(例如，二苯基甲烷染料)、含叶绿素染料、三芳基甲烷染料(例如，三苯基甲烷染料)、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、菁染料、不对称菁染料、醌-亚胺染料、嗪染料、二氨吖嗪染料、藏红染料、吲达胺、靛酚染料、氟染料、噁嗪染料、噁酮染料、噻嗪染料、噻唑染料、呫吨染料、芴染料、派洛宁染料、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料，以及组合两种或更多种染料的染料(例如，串联的)，以及具有一个或更多个单体染料单元的聚合物染料，以及上述染料中的两种或更多种的混合物。例如，荧光团可以是4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’二磺酸；吖啶及衍生物诸如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和异硫氰酸吖啶；别藻蓝蛋白；藻红蛋白；多甲藻素(peridinin)-叶绿素蛋白；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸(Lucifer Yellow VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)；BrilliantYellow；香豆素及衍生物，诸如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青及其衍生物，如四氯四溴荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5’,5”-二溴邻苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二乙基氨基香豆素；五乙酸二乙烯三胺；4,4’-二异硫氰酸二氢-芪-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯偶氮基苯基-4’-异硫氰酸(DABITC)；伊红及衍生物，诸如伊红和异硫氰酸伊红；赤藓红及衍生物，诸如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；乙锭；荧光素及衍生物，诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、氯三嗪基荧光素、萘并荧光素和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；Lissamine罗丹明，Lucifer黄；异硫氰酸孔雀石绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘及衍生物，诸如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-丁酸芘；活性红4(Reactive Red 4,CibacronTM亮红3B-A)；罗丹明及衍生物，诸如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺(lissamine)、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合衍生物；呫吨；染料缀合的聚合物(即，聚合物附接的染料)，诸如异硫氰酸荧光素-右旋糖酐，以及组合上述染料中的两种或更多种(例如，串联的)的染料，具有一种或更多种单体染料单元的聚合物染料和上述染料中的两种或更多种的混合物。
一组光谱不同的可检测部分可以例如包括五种不同的荧光团、五种不同的发色团、五种荧光团和发色团的组合、四种不同的荧光团和非荧光团的组合、四种发色团和非发色团的组合、或四种荧光团和发色团和非荧光团非发色团的组合。在一些实施方案中，可检测部分可以是以下光谱不同的部分之一：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种、10000种，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
可检测部分的激发波长可以改变，例如是以下或是约以下：10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、110纳米、120纳米、130纳米、140纳米、150纳米、160纳米、170纳米、180纳米、190纳米、200纳米、210纳米、220纳米、230纳米、240纳米、250纳米、260纳米、270纳米、280纳米、290纳米、300纳米、310纳米、320纳米、330纳米、340纳米、350纳米、360纳米、370纳米、380纳米、390纳米、400纳米、410纳米、420纳米、430纳米、440纳米、450纳米、460纳米、470纳米、480纳米、490纳米、500纳米、510纳米、520纳米、530纳米、540纳米、550纳米、560纳米、570纳米、580纳米、590纳米、600纳米、610纳米、620纳米、630纳米、640纳米、650纳米、660纳米、670纳米、680纳米、690纳米、700纳米、710纳米、720纳米、730纳米、740纳米、750纳米、760纳米、770纳米、780纳米、790纳米、800纳米、810纳米、820纳米、830纳米、840纳米、850纳米、860纳米、870纳米、880纳米、890纳米、900纳米、910纳米、920纳米、930纳米、940纳米、950纳米、960纳米、970纳米、980纳米、990纳米、1000纳米，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。可检测部分的发射波长也可以改变，例如是以下或是约以下：10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、110纳米、120纳米、130纳米、140纳米、150纳米、160纳米、170纳米、180纳米、190纳米、200纳米、210纳米、220纳米、230纳米、240纳米、250纳米、260纳米、270纳米、280纳米、290纳米、300纳米、310纳米、320纳米、330纳米、340纳米、350纳米、360纳米、370纳米、380纳米、390纳米、400纳米、410纳米、420纳米、430纳米、440纳米、450纳米、460纳米、470纳米、480纳米、490纳米、500纳米、510纳米、520纳米、530纳米、540纳米、550纳米、560纳米、570纳米、580纳米、590纳米、600纳米、610纳米、620纳米、630纳米、640纳米、650纳米、660纳米、670纳米、680纳米、690纳米、700纳米、710纳米、720纳米、730纳米、740纳米、750纳米、760纳米、770纳米、780纳米、790纳米、800纳米、810纳米、820纳米、830纳米、840纳米、850纳米、860纳米、870纳米、880纳米、890纳米、900纳米、910纳米、920纳米、930纳米、940纳米、950纳米、960纳米、970纳米、980纳米、990纳米、1000纳米，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
可检测部分的分子量可以不同，例如是以下或是约以下：10道尔顿、20道尔顿、30道尔顿、40道尔顿、50道尔顿、60道尔顿、70道尔顿、80道尔顿、90道尔顿、100道尔顿、110道尔顿、120道尔顿、130道尔顿、140道尔顿、150道尔顿、160道尔顿、170道尔顿、180道尔顿、190道尔顿、200道尔顿、210道尔顿、220道尔顿、230道尔顿、240道尔顿、250道尔顿、260道尔顿、270道尔顿、280道尔顿、290道尔顿、300道尔顿、310道尔顿、320道尔顿、330道尔顿、340道尔顿、350道尔顿、360道尔顿、370道尔顿、380道尔顿、390道尔顿、400道尔顿、410道尔顿、420道尔顿、430道尔顿、440道尔顿、450道尔顿、460道尔顿、470道尔顿、480道尔顿、490道尔顿、500道尔顿、510道尔顿、520道尔顿、530道尔顿、540道尔顿、550道尔顿、560道尔顿、570道尔顿、580道尔顿、590道尔顿、600道尔顿、610道尔顿、620道尔顿、630道尔顿、640道尔顿、650道尔顿、660道尔顿、670道尔顿、680道尔顿、690道尔顿、700道尔顿、710道尔顿、720道尔顿、730道尔顿、740道尔顿、750道尔顿、760道尔顿、770道尔顿、780道尔顿、790道尔顿、800道尔顿、810道尔顿、820道尔顿、830道尔顿、840道尔顿、850道尔顿、860道尔顿、870道尔顿、880道尔顿、890道尔顿、900道尔顿、910道尔顿、920道尔顿、930道尔顿、940道尔顿、950道尔顿、960道尔顿、970道尔顿、980道尔顿、990道尔顿、1000道尔顿(Da)，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。可检测部分的分子量也可以不同，例如是以下或是约以下：10千道尔顿、20千道尔顿、30千道尔顿、40千道尔顿、50千道尔顿、60千道尔顿、70千道尔顿、80千道尔顿、90千道尔顿、100千道尔顿、110千道尔顿、120千道尔顿、130千道尔顿、140千道尔顿、150千道尔顿、160千道尔顿、170千道尔顿、180千道尔顿、190千道尔顿、200千道尔顿、210千道尔顿、220千道尔顿、230千道尔顿、240千道尔顿、250千道尔顿、260千道尔顿、270千道尔顿、280千道尔顿、290千道尔顿、300千道尔顿、310千道尔顿、320千道尔顿、330千道尔顿、340千道尔顿、350千道尔顿、360千道尔顿、370千道尔顿、380千道尔顿、390千道尔顿、400千道尔顿、410千道尔顿、420千道尔顿、430千道尔顿、440千道尔顿、450千道尔顿、460千道尔顿、470千道尔顿、480千道尔顿、490千道尔顿、500千道尔顿、510千道尔顿、520千道尔顿、530千道尔顿、540千道尔顿、550千道尔顿、560千道尔顿、570千道尔顿、580千道尔顿、590千道尔顿、600千道尔顿、610千道尔顿、620千道尔顿、630千道尔顿、640千道尔顿、650千道尔顿、660千道尔顿、670千道尔顿、680千道尔顿、690千道尔顿、700千道尔顿、710千道尔顿、720千道尔顿、730千道尔顿、740千道尔顿、750千道尔顿、760千道尔顿、770千道尔顿、780千道尔顿、790千道尔顿、800千道尔顿、810千道尔顿、820千道尔顿、830千道尔顿、840千道尔顿、850千道尔顿、860千道尔顿、870千道尔顿、880千道尔顿、890千道尔顿、900千道尔顿、910千道尔顿、920千道尔顿、930千道尔顿、940千道尔顿、950千道尔顿、960千道尔顿、970千道尔顿、980千道尔顿、990千道尔顿、1000千道尔顿(kDa)，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
聚合物染料
在一些情况下，荧光团(即，染料)是荧光聚合物染料。可用于本发明的方法和系统的荧光聚合物染料可以不同。在该方法的一些情况中，聚合物染料包括缀合的聚合物。
缀合的聚合物(CP)的特征在于离域化电子结构，所述离域化电子结构包含交替的非饱和键(例如，双键和/或三键)和饱和键(例如，单键)的主链，其中π-电子可以从一个键移动到另一个键。因此，缀合的主链可以在聚合物染料上赋予延伸的线性结构，并且聚合物重复单元之间的键角有限。例如，蛋白和核酸虽然也是聚合物，但在一些情况下并不形成延伸的棒状结构，而是折叠成高阶三维形状。此外，CP可以形成“刚性棒”聚合物主链并经历在沿着聚合物主链的单体重复单元之间有限的扭曲(例如，扭转)角。在一些情况下，聚合物染料包括具有刚性棒结构的CP。如以上概述的，聚合物染料的结构特征可以对分子的荧光特性具有影响。
任何方便的聚合物染料可以用于本发明的方法和系统。在一些情况下，聚合物染料是具有能够捕获光以放大荧光团的荧光输出的结构的多发色团。在一些情况下，聚合物染料能够捕获光并有效地将其转化为波长更长的发射光。在一些实施方案中，聚合物染料具有可以有效地将能量传递到附近发光物质(例如，“信号传导发色团”)的光捕获多发色团系统。能量转移的机制包括，例如，共振能量转移(例如，Forster(或荧光)共振能量转移，FRET)、量子电荷交换(Dexter能量转移)等。在一些情况下，这些能量转移机制的范围相对较短；也就是说，光捕获多发色团系统与信号传导发色团的紧密接近提供了有效的能量转移。在有效能量传递的条件下，当光捕获多发色团系统中单个发色团的数目大时，发生来自信号传导发色团的发射的放大；也就是说，来自信号传导发色团的发射在当入射光(“激发光”)处于被光捕获多发色团系统吸收的波长时比在当信号传导发色团被泵光直接激发时更强烈。
多发色团可以是缀合的聚合物。缀合的聚合物(CP)的特征在于离域化电子结构，并且可以用作为针对化学和生物靶的高响应性光学报告物。由于有效缀合的长度大幅短于聚合物链的长度，主链包含大量紧密接近的缀合的区段。因此，缀合的聚合物对光捕获是有效的并且实现经由能量转移的光放大。
在一些情况下，聚合物可以用作直接荧光报告物，例如具有高消光系数、高亮度等的荧光聚合物。在一些情况下，聚合物可以用作强发色团，其中颜色或光密度用作指示物。
感兴趣的聚合物染料包括但不限于由Gaylord等人在以下中描述的那些染料：美国公布第20040142344号、美国公布第20080293164号、美国公布第20080064042号、美国公布第20100136702号、美国公布第20110256549号、美国公布第20120028828号、美国公布第20120252986号、美国公布第20130190193号和美国公布第20160025735号，这些美国公布的公开内容通过引用以其整体并入本文；和Gaylord等人,J.Am.Chem.Soc.,2001,123(26),pp6417-6418；Feng等人,Chem.Soc.Rev.,2010,39,2411-2419；和Traina等人,J.Am.Chem.Soc.,2011,133(32),pp12600-12607，这些文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。
聚合物染料可以包括缀合的聚合物(CP)，所述缀合的聚合物(CP)包括形成缀合的系统的多于一个第一光学活性单元，所述第一光学活性单元具有第一吸收波长(例如，如本文描述的)，在所述第一吸收波长处，所述第一光学活性单元吸收光以形成激发态。CP可以是聚阳离子、聚阴离子和/或电荷中性缀合的聚合物。
CP为了在生物样品中使用可以是水溶性的。可以在聚合物染料中包含任何方便的取代基团以提供增加的水溶性，诸如亲水性取代基团，例如亲水性聚合物，或带电取代基团，例如在水性溶液中，例如在生理条件下带正电或负电的基团。任何方便的水溶性基团(WSG)可以用于本发明的光捕获多发色团。术语“水溶性基团”是指在水性环境中良好地溶剂化的官能团，并且它赋予它所附接的分子改进的水溶性。在一些实施方案中，与缺少WSG的多发色团相比，WSG增加了多发色团在主要为水性的溶液(例如，如本文描述的)中的溶解度。水溶性基团可以是在水性环境中良好地溶剂化的任何方便的亲水性基团。在一些实施方案中，亲水性水溶性基团带电荷，例如，带正或负电荷或是两性离子的。在一些实施方案中，亲水性水溶性基团是中性亲水性基团。在一些实施方案中，WSG是亲水性聚合物，例如聚乙二醇、纤维素、壳聚糖或其衍生物。
如本文使用的，术语“聚环氧乙烷”、“PEO”、“聚乙二醇”和“PEG”可互换使用，并指包含由式-(CH2-CH2-O-)n-描述的链的聚合物或其衍生物。在一些实施方案中，“n”是5000或更少，诸如1000或更少、500或更少、200或更少、100或更少、50或更少、40或更少、30或更少、20或更少、15或更少，诸如5至15或10至15。理解的是，PEG聚合物可以具有任何方便的长度，并且可以包含各种末端基团，包括但不限于烷基、芳基、羟基、氨基、酰基、酰氧基和酰胺基末端基团。官能化PEG可适用于在本发明的多发色团中使用。感兴趣的水溶性基团包括但不限于羧酸、膦酸、磷酸、磺酸、硫酸、亚磺酸、酯、聚乙二醇(PEG)和修饰的PEG、羟基、胺、铵、胍盐、多胺和锍(sulfonium)、多醇、直链或环状糖类，伯胺、仲胺、叔胺或季胺和多胺，膦酸基团、次膦酸基团，抗坏血酸基团、二醇，包括聚醚、-COOM’、-SO3M’、-PO3M’、-NR3 +、Y’、(CH2CH2O)pR及其混合物，其中Y’可以是任何卤素、硫酸盐、磺酸盐或含氧阴离子，p可以是1至500，每个R可以独立地是H或烷基(诸如甲基)，并且M’可以是阳离子平衡离子或氢、-(CH)2CH2O)yyCH2CH2XRyy、-(CH2CH2O)yyCH2CH2X-、-X(CH2CH2O)yyCH2CH2-、二醇和聚乙二醇，其中yy选自1至1000，X选自O、S和NRZZ，并且RZZ和RYY独立地选自H和C1-3烷基。
聚合物染料的长度可以变化。在一些实施方案中，聚合物染料的单体重复单元或区段的特定数目可以落入以下的范围：2至500,000个，诸如2至100,000个、2至30,000个、2至10,000个、2至3,000个或2至1,000个单元或区段，或诸如100至100,000个、200至100,000个或500至50,000个单元或区段。在一些实施方案中，聚合物染料的单体重复单元或区段的数目在以下的范围内：2至1000个单元或区段，诸如2至750个单元或区段、诸如2至500个单元或区段、诸如2至250个单元或区段、诸如2至150个单元或区段、诸如2至100个单元或区段、诸如2至75个单元或区段、诸如2至50个单元或区段并包括2至25个单元或区段。
聚合物染料可以具有任何方便的分子量(MW)。在一些实施方案中，聚合物染料的MW可以表示为平均分子量。在一些情况下，聚合物染料具有以下的平均分子量：500至500,000，诸如1,000至100,000、2,000至100,000、10,000至100,000或甚至500,000至100,000的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物染料具有70,000的平均分子量。
在一些实施方案中，聚合物染料包含以下结构：
其中CP1、CP2、CP3和CP4独立地是缀合的聚合物区段或寡聚结构，其中CP1、CP2、CP3和CP4中的一种或更多种是改变带隙的n-缀合的重复单元。
在一些实施方案中，缀合的聚合物是聚芴缀合的聚合物、聚亚苯基亚乙烯缀合的聚合物、聚亚苯基醚缀合的聚合物、聚亚苯基聚合物，以及其他类型的缀合的聚合物。
在一些情况下，聚合物染料包含以下结构：
其中每个R1独立地是增溶基团或接头染料；L1和L2是任选的接头；每个R2独立地是H或芳基取代基；每个A1和A2独立地是H、芳基取代基或荧光团；G1和G2各自独立地选自由以下组成的组：末端基团、π缀合的区段、接头和连接的特异性结合成员；每个n和每个m独立地是0或从1至10,000的整数；并且p是从1至100,000的整数。感兴趣的增溶基团包括但不限于水溶性官能团，诸如亲水性聚合物(例如，聚亚烷基氧化物、纤维素、壳聚糖等)，以及进一步被亲水性基团取代的烷基、芳基和杂环基团，亲水性基团诸如聚亚烷基氧化物(例如，聚乙二醇，包括2-20个单元的PEG)、铵、锍、鏻，以及带电荷(正、负或两性离子)的亲水性水溶性基团等。
在一些实施方案中，聚合物染料包括作为聚合物主链的一部分的具有以下结构之一的缀合的区段：
其中每个R3独立地是任选地取代的水溶性官能团，例如亲水性聚合物(例如，聚亚烷基氧化物、纤维素、壳聚糖等)或进一步被亲水性基团取代的烷基或芳基，亲水性基团诸如聚亚烷基氧化物(例如，聚乙二醇，包括2-20个单元的PEG)、铵、锍、鏻，以及带电荷(正、负或两性离子)的亲水性水溶性基团；Ar是任选地取代的芳基或杂芳基基团；并且n是1至10000。在一些实施方案中，R3是任选地取代的烷基基团。在一些实施方案中，R3是任选地取代的芳基基团。在一些实施方案中，R3被聚乙二醇、染料、化学选择性官能团或特异性结合部分取代。在一些实施方案中，Ar被聚乙二醇、染料、化学选择性官能团或特异性结合部分取代。
在一些实施方案中，聚合物染料包含以下结构：
其中每个R1是增溶基团或接头染料基团；每个R2独立地是H或芳基取代基；L1和L2是任选的接头；每个A1和A3独立地是H、荧光团、官能团或特异性结合部分(例如，抗体)；并且n和m各自独立地是0到10000，其中n+m>1。
聚合物染料可以具有一种或更多种期望的光谱性质，诸如特定的吸收最大波长、特定的发射最大波长、消光系数、量子产率等(参见例如Chattopadhyay等人,“Brilliantviolet fluorophores:A new class of ultrabright fluorescent compounds forimmunofluorescence experiments.”Cytometry Part A,81A(6),456-466,2012)。
聚合物染料可以具有在280nm和850nm之间的吸收曲线。在一些实施方案中，聚合物染料具有在280nm和850nm范围内的吸收最大值。在一些实施方案中，聚合物染料吸收具有在280nm和850nm之间范围内的入射光，其中感兴趣的吸收最大值的具体实例包括但不限于：348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm和652nm。在一些实施方案中，聚合物染料具有在选自由以下组成的组的范围内的吸收最大波长：280-310nm、305-325nm、320-350nm、340-375nm、370-425nm、400-450nm、440-500nm、475-550nm、525-625nm、625-675nm和650-750nm。聚合物染料可以具有以下的吸收最大波长：348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm、652nm，或在这些值中的任何两个值之间的范围。
在一些实施方案中，聚合物染料具有范围为400nm至850nm诸如415nm至800nm的发射最大波长，其中感兴趣的发射最大值的具体实例包括但不限于：395nm、421nm、445nm、448nm、452nm、478nm、480nm、485nm、491nm、496nm、500nm、510nm、515nm、519nm、520nm、563nm、570nm、578nm、602nm、612nm、650nm、661nm、667nm、668nm、678nm、695nm、702nm、711nm、719nm、737nm、785nm、786nm、805nm。在一些实施方案中，聚合物染料具有在选自由以下组成的组的范围内的发射最大波长：380-400nm、410-430nm、470-490nm、490-510nm、500-520nm、560-580nm、570-595nm、590-610nm、610-650nm、640-660nm、650-700nm、700-720nm、710-750nm、740-780nm和775-795nm。在一些实施方案中，聚合物染料具有以下的发射最大值：395nm、421nm、478nm、480nm、485nm、496nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm、737nm、750nm、786nm，或这些值中的任何两个的范围。在一些实施方案中，聚合物染料具有以下的发射最大波长：421nm±5nm、510nm±5nm、570nm±5nm、602nm±5nm、650nm±5nm、711nm±5nm、786nm±5nm，或这些值中的任何两个的范围。在一些实施方案中，聚合物染料具有选自由以下组成的组的发射最大值：421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm和786nm。
在一些实施方案中，聚合物染料具有以下的消光系数：1×106cm-1M-1或更大，诸如2×106cm-1M-1或更大、2.5×106cm-1M-1或更大、3×106cm-1M-1或更大、4×106cm-1M-1或更大、5×106cm-1M-1或更大、6×106cm-1M-1或更大、7×106cm-1M-1或更大或8×106cm-1M-1或更大。在一些实施方案中，聚合物染料具有以下的量子产率：0.05或更高，诸如0.1或更高、0.15或更高、0.2或更高、0.25或更高、0.3或更高、0.35或更高、0.4或更高、0.45或更高、0.5或更高、0.6或更高、0.7或更高、0.8或更高、0.9或更高、0.95或更高、0.99或更高，并包括0.999或更高。例如，感兴趣的聚合物染料的量子产率的范围可以为0.05至1，诸如0.1至0.95，诸如0.15至0.9，诸如0.2至0.85，诸如0.25至0.75，诸如0.3至0.7，并包括0.4至0.6的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.1或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.3或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.5或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.6或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.7或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.8或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.9或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有0.95或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有1×106或更大的消光系数和0.3或更高的量子产率。在一些实施方案中，聚合物染料具有2×106或更大的消光系数和0.5或更高的量子产率。
组合物和试剂盒
在一些实施方案中，提供了组合物(例如，试剂盒)。在一些实施方案中，组合物包含：第一固体支持物，所述第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针各自能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；以及多于一种分泌因子结合试剂，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体。在一些实施方案中，第一固体支持物还包含多于一种锚定探针，并且多于一种锚定探针中的每一种能够与细胞的表面细胞靶特异性结合。在一些实施方案中，组合物可以包含含有微孔阵列的筒。在一些实施方案中，组合物包含固定剂和/或透化剂。在一些实施方案中，组合物包括如本文描述的第二固体支持物。在一些实施方案中，组合物包含多于一个寡核苷酸条形码，所述多于一个寡核苷酸条形码中的每一个包含分子标记和靶结合区，并且多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。
术语
在至少一些先前描述的实施方案中，一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
本领域的技术人员将理解，对于本文公开的这个和其他过程和方法，在该过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序实现。此外，所概述的步骤和操作仅作为示例提供，并且该步骤和操作中的一些可以是任选的，组合成较少的步骤和操作，或者扩展成另外的步骤和操作，而不偏离所公开的实施方案的本质。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于上下文和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，并且尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中的术语，通常意在作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”，等等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制为包含仅一种此类陈述的实施方案，甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，此类陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到，本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字，并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
从前述内容，应当理解，本文出于说明的目的已经描述了本公开内容的各种实施方案，并且可以在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案并不旨在进行限制，真正的范围和精神由以下权利要求来指示。

Claims (99)

1.一种用于测量单细胞的分泌因子的分泌水平的方法，所述方法包括：
使一个或更多个单细胞与第一多于一个第一固体支持物接触，其中所述一个或更多个单细胞能够分泌多于一种分泌因子，其中每一个第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针能够与由单细胞分泌的所述多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，并且其中所述捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；
使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，其中能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且其中能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体；以及
测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射，以确定由一个或更多个单细胞中的每一个分泌的至少一种分泌因子的分泌水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使一个或更多个单细胞与所述第一多于一个第一固体支持物接触包括：
将所述一个或更多个单细胞和所述第一多于一个第一固体支持物分区到多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包含所述一个或更多个单细胞中的单细胞和所述第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括在使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触之前：
汇集来自所述多于一个分区中的每一个分区的所述单个第一固体支持物以产生第二多于一个第一固体支持物，任选地所述汇集使用磁场来进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触包括使所述第二多于一个第一固体支持物与所述多于一种分泌因子结合试剂接触。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括在使所述第二多于一个第一固体支持物与所述多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除所述多于一种分泌因子结合试剂中未与所述第二多于一个第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂以产生第三多于一个第一固体支持物，任选地测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射包括测量所述第三多于一个第一固体支持物中的每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射，任选地去除未与所述第二多于一个第一固体支持物接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与所述分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂。
6.根据权利要求2所述的方法，其中使所述第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触在所述多于一个分区中进行。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括在使所述第一固体支持物与所述多于一种分泌因子结合试剂接触之后，去除所述多于一种分泌因子结合试剂中未与所述第一固体支持物接触的一种或更多种分泌因子结合试剂，任选地去除未与所述第一固体支持物接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂包括：去除未与所述分泌因子中被捕获探针结合的相应至少一种分泌因子接触的所述一种或更多种分泌因子结合试剂。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的方法，所述方法还包括汇集来自所述多于一个分区中的每一个分区的所述单个第一固体支持物，任选地所述汇集使用磁场来进行。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中在将所述第一多于一个第一固体支持物分区之前，将所述一个或更多个单细胞分区到所述多于一个分区。
10.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中在将所述一个或更多个单细胞分区之前，将所述第一多于一个第一固体支持物分区到所述多于一个分区。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一固体支持物包括约35μm的直径，任选地所述分区具有直径50μm的孔。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个单细胞包括多于100个细胞、多于1000个细胞或多于10000个细胞。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区中的分区的数目是所述一个或更多个单细胞中的单细胞的数目的至少2倍大。
14.根据权利要求2-13中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区包括多于一个液滴，任选地所述液滴包括油包水液滴。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区包括微孔阵列的微孔，其中所述微孔阵列包括至少100个微孔。
16.根据权利要求15所述的方法，其中：
选择至少100个微孔的尺寸，使得每个微孔可以包含至多一个第一固体支持物；
所述至少100个微孔的平均直径与所述第一固体支持物的直径之比为约1.5；
所述至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比范围为约0.1至2，任选地所述至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比为约0.9；和/或
每个微孔具有范围为约1000μm3至约786000μm3的体积，任选地每个微孔具有约144000μm3的体积。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的方法，其中在将所述第一多于一个第一固体支持物分区到所述多于一个分区之后，所述至少100个微孔中包含单个第一固体支持物的百分比为至少约10％或至少约50％。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中在将所述一个或更多个单细胞分区到所述多于一个分区之后，所述至少100个微孔中包含单细胞的百分比在约0.01％和约15％之间。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述至少100个微孔中含有单细胞的百分比在约1％和约11％之间。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，所述方法包括：
提供未与所述一个或更多个单细胞接触的阴性对照第一固体支持物；
使所述阴性对照第一固体支持物与所述多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合；以及
测量所述阴性对照第一固体支持物的发射。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中由单细胞分泌的所述多于一种分泌因子包括由所述一个或更多个单细胞中的每一个分泌的通用分泌因子，其中与结合所述通用分泌因子的所述分泌因子结合试剂关联的可检测部分的发射鉴定包含单细胞的分区。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，所述方法还包括：
使两个或更多个第一固体支持物与两种或更多种预定浓度的分泌因子接触，其中所述两个或更多个第一固体支持物中的每一个与不同预定浓度的所述分泌因子接触；
使所述两个或更多个第一固体支持物与多于一种分泌因子结合试剂接触，所述多于一种分泌因子结合试剂各自包含可检测部分或其前体，所述多于一种分泌因子结合试剂能够与被所述两个或更多个第一固体支持物的捕获探针结合的分泌因子特异性结合；以及
测量所述两个或更多个第一固体支持物中的每一个的所述可检测部分的发射，以产生将所述至少一种分泌因子的分泌水平与所述可检测部分的发射相关联的校准曲线。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述测量步骤包括用流式细胞仪测量所述可检测部分的发射。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述流式细胞仪包括常规流式细胞仪、光谱流式细胞仪、高光谱流式细胞仪、成像流式细胞仪或其任何组合。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述测量步骤包括用荧光显微镜测量所述可检测部分的发射。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述测量步骤包括用成像系统测量所述可检测部分的发射。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中测量每一个第一固体支持物的每一个可检测部分的发射包括对所述多于一个分区进行成像。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述多于一个分区被顺序和/或同时成像。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中成像包括显微术、共焦显微术、时差成像显微术、荧光显微术、多光子显微术、定量相位显微术、表面增强拉曼光谱、摄像、手动视觉分析、自动视觉分析或其任何组合。
30.根据权利要求3-29中任一项所述的方法，所述方法包括在汇集来自所述多于一个分区中的每一个分区的所述单个第一固体支持物之前，用成像系统对所述多于一个分区进行成像以生成成像数据。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述成像系统：
包括多荧光成像系统；
被配置为捕获和处理所述至少100个微孔的全部或部分的图像，任选地其中所述成像系统还包括照明子系统、成像子系统和处理器；
被配置为基于所述成像数据对(i)包含单个第一固体支持物和单细胞的分区的数目和/或(ii)包含单个第一固体支持物并且不包含单细胞的分区的数目进行定量；
被配置为进行明场、暗场、荧光或定量相位成像；和/或
包括选择机制，其中所述选择机制使用源自经处理的图像的信息来鉴定不包含单细胞的分区，并且其中所述选择机制被配置为在后续数据分析中排除不包含单细胞的分区的图像。
32.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，其中筒包含所述微孔阵列，其中所述筒包括用于对所述至少100个微孔进行成像的透明窗，任选地所述筒包括低自体荧光。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述可检测部分包括光学部分、发光部分、电化学活性部分、纳米颗粒或其组合，任选地所述纳米颗粒包括量子点。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述发光部分包括化学发光部分、电致发光部分、光致发光部分或其组合。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述光致发光部分包括荧光部分、磷光部分或其组合，任选地所述荧光部分包括荧光染料。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，所述方法包括进行反应以使所述可检测部分的前体转化为所述可检测部分。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述一个或更多个单细胞与第一固体支持物连接以形成与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞；以及
将与第一固体支持物关联的所述一个或更多个单细胞作为串联物分析。
38.根据权利要求37所述的方法，其中：
所述一个或更多个单细胞包含表面细胞靶，其中所述第一固体支持物包含多于一种锚定探针，并且其中所述多于一种锚定探针中的每一种能够与所述表面细胞靶特异性结合，从而形成与第一固体支持物关联的一个或更多个单细胞；和/或
将所述一个或更多个单细胞与第一固体支持物连接包括使所述一个或更多个单细胞和所述第一固体支持物与固定剂接触。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个单细胞包括T细胞、B细胞、肿瘤细胞、髓样细胞、血细胞、正常细胞、胎儿细胞、母体细胞或其混合物。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述至少一种分泌因子包括：
淋巴因子、白细胞介素、趋化因子或其任何组合；
细胞因子、激素、分子毒素或其任何组合；和/或
神经生长因子、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、转化生长因子、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子或其任何组合。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂和所述捕获探针能够与同一分泌因子的不同表位结合。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述分泌因子结合试剂、所述捕获探针和所述锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段，任选地所述抗体或其片段包括单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述捕获探针和/或所述锚定探针通过以下与所述第一固体支持物缀合：1,3-偶极环加成反应、杂Diels-Alder反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述表面细胞靶包括：
糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。
45.根据权利要求2-44中任一项所述的方法，所述方法还包括将一个或更多个伴随细胞分区到所述多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包含：(i)所述一个或更多个单细胞中的单细胞，(ii)所述第一多于一个第一固体支持物中的单个第一固体支持物，以及(iii)所述一个或更多个伴随细胞中的单个伴随细胞。
46.根据权利要求2-45中任一项所述的方法，所述方法包括裂解所述分区中的所述单细胞，并且任选地裂解所述单细胞包括加热所述单细胞、使所述单细胞与去污剂接触、改变所述单细胞的pH或其任何组合。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，所述方法包括可逆地固定所述一个或更多个单细胞和/或可逆地透化所述一个或更多个单细胞。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个单细胞包含多于一个细胞组分靶，所述方法还包括：
使多于一种细胞组分结合试剂与所述一个或更多个单细胞接触，其中所述多于一种细胞组分结合试剂中的每一种包含细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含用于所述细胞组分结合试剂的独特标识符序列，并且其中所述细胞组分结合试剂能够与所述多于一个细胞组分靶中的至少一个特异性结合；
使多于一个寡核苷酸条形码与所述细胞成分结合试剂特异性寡核苷酸接触以进行杂交，其中所述寡核苷酸条形码各自包含分子标记和第一通用序列；
使与所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸杂交的所述多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，所述多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸各自包含与所述独特标识符序列的至少一部分互补的序列和所述第一分子标记；以及
获得所述多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息，以确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述多于一个细胞组分靶中的至少一个细胞组分靶的拷贝数。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个单细胞包含核酸靶的拷贝，所述方法还包括：
使多于一个寡核苷酸条形码与所述核酸靶的拷贝接触以进行杂交，其中所述多于一个寡核苷酸条形码中的每一个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、能够与所述核酸靶的拷贝杂交的靶结合区和分子标记；
使与核酸靶的拷贝杂交的所述多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化核酸分子，所述多于一个条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列；以及
获得所述多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中核酸靶的拷贝数。
50.根据权利要求48-49中任一项所述的方法，其中所述多于一个寡核苷酸条形码与第二固体支持物关联，并且其中所述多于一个分区中的分区包含单个第二固体支持物。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸条形码包含靶结合区，所述靶结合区包含捕获序列，任选地所述靶结合区包含多(dT)区。
52.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含与所述捕获序列互补的序列，所述捕获序列被配置为捕获所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸，任选地与所述捕获序列互补的序列包含多(dA)区。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的分子标记、其互补物或其组合的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的方法，所述方法包括：
使随机引物与所述多于一个条形码化核酸分子接触，其中所述随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补物；以及
使与所述多于一个条形码化核酸分子杂交的所述随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。
55.根据权利要求54所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子，任选地扩增所述多于一个延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述多于一个延伸产物。
56.根据权利要求55所述的方法，所述方法包括基于与所述第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数。
57.根据权利要求55-56中任一项所述的方法，其中确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述第一多于一个条形码化扩增子中的条形码化扩增子关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述多于一个核酸靶中的每一个的数目，所述第一多于一个条形码化扩增子包含所述多于一个核酸靶中的每一个的序列。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多于一个核酸靶中的每一个的序列包括所述多于一个核酸靶中的每一个的子序列。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个条形码化扩增子中所述核酸靶的序列包括所述核酸靶的子序列。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物来扩增所述第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第二多于一个条形码化扩增子；任选地扩增所述第一多于一个条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述第一多于一个条形码化扩增子。
61.根据权利要求60所述的方法，所述方法包括基于与所述第二多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个条形码化扩增子和/或所述第二多于一个条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。
63.根据权利要求49-62中任一项所述的方法，所述方法包括使用所述多于一个条形码化核酸分子作为模板合成第三多于一个条形码化扩增子以产生第三多于一个条形码化扩增子，
任选地合成第三多于一个条形码化扩增子包括对所述多于一个条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，
还任选地合成第三多于一个条形码化扩增子包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。
64.根据权利要求63所述的方法，所述方法包括：
获得所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息，并且任选地获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物；以及
基于具有与所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目来确定所述一个或更多个单细胞中的每一个中所述核酸靶的拷贝数。
65.根据权利要求49-64中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括核酸分子，任选地所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。
66.根据权利要求48-65中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含所述第一通用序列的互补物。
67.根据权利要求48-66中任一项所述的方法，其中所述细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸包含第二通用序列，其中获得所述多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的序列信息包括：
使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物，以产生多于一个扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸；以及
获得所述多于一个扩增的条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物的测序信息。
68.根据权利要求48-67中任一项所述的方法，其中获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述多于一个条形码化细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其产物。
69.根据权利要求48-68中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述多于一种细胞组分结合试剂与所述一个或更多个单细胞接触之后，去除所述多于一种细胞组分结合试剂中未与所述一个或更多个单细胞接触的一种或更多种细胞组分结合试剂，任选地去除未与所述一个或更多个单细胞接触的所述一种或更多种细胞组分结合试剂包括：去除未与多于一个细胞组分靶中的相应至少一个靶接触的所述一种或更多种细胞组分结合试剂。
70.根据权利要求48-69中任一项所述的方法，其中所述细胞组分靶包括：
细胞内蛋白、糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合；和/或
看家蛋白，其中对所述看家蛋白的检测指示所述分区中单细胞的存在。
71.根据权利要求48-70中任一项所述的方法，其中使所述多于一个寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’核酸外切酶活性和3’至5’核酸外切酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使所述多于一个寡核苷酸条形码延伸，任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段，和/或所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，还任选地其中所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。
72.根据权利要求48-71中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列：
是相同的；
是不同的；和/或
包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。
73.根据权利要求55-72中任一项所述的方法，其中：
所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分；和/或
所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。
74.根据权利要求48-73中任一项所述的方法，其中所述多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。
75.根据权利要求48-74中任一项所述的方法，其中所述多于一个寡核苷酸条形码各自包含细胞标记，任选地所述多于一个寡核苷酸条形码的每一种细胞标记包含至少6个核苷酸，还任选地与同一第二固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记，任选地与不同第二固体支持物关联的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述第一固体支持物和/或所述第二固体支持物包括合成颗粒和/或平坦表面，任选地所述合成颗粒是可破坏的。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述多于一个寡核苷酸条形码中的至少一个被固定在所述合成颗粒上、部分地固定在所述合成颗粒上、包封在所述合成颗粒中或部分地包封在所述合成颗粒中。
78.根据权利要求76-77中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包括珠，并且任选地所述珠包括
琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合；
选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合；或
可破坏的水凝胶颗粒。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，
其中所述多于一个寡核苷酸条形码中的每一个包含接头官能团，
其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且
其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此关联，
并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，
其中所述多于一种锚定探针中的每一种包含接头官能团，
其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且
其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此关联，
并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
81.根据权利要求76-80中任一项所述的方法，
其中所述多于一种捕获探针中的每一种包含接头官能团，
其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且
其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此关联，
并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
82.一种组合物，所述组合物包含：
第一固体支持物，所述第一固体支持物包含多于一种捕获探针，所述多于一种捕获探针各自能够与由单细胞分泌的多于一种分泌因子中的至少一种特异性结合，其中所述捕获探针中的至少两种能够结合不同的分泌因子；以及
多于一种分泌因子结合试剂，所述多于一种分泌因子结合试剂各自能够与被捕获探针结合的分泌因子特异性结合，其中所述多于一种分泌因子结合试剂中的每一种包含可检测部分或其前体，其中能够结合相同分泌因子的分泌因子结合试剂包含相同的可检测部分或其前体，并且其中能够结合不同分泌因子的分泌因子结合试剂包含不同的可检测部分或其前体。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述第一固体支持物还包含多于一种锚定探针，并且其中所述多于一种锚定探针中的每一种能够与细胞的表面细胞靶特异性结合。
84.根据权利要求82-83中任一项所述的组合物，其中所述第一固体支持物包含约35μm的直径。
85.根据权利要求82-84所述的组合物，所述组合物还包含含有微孔阵列的筒，任选地所述微孔阵列包含至少100个微孔。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中：
选择至少100个微孔的尺寸，使得每个微孔可以包含至多一个第一固体支持物；
所述至少100个微孔的平均直径与所述第一固体支持物的直径之比为约1.5；
所述至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比范围为约0.1至2，任选地所述至少100个微孔的平均直径与深度的横纵比为约0.9；和/或
每个微孔具有范围为约1000μm3至约786000μm3的体积，任选地每个微孔具有约144000μm3的体积。
87.根据权利要求82-86中任一项所述的组合物，其中所述可检测部分包括光学部分、发光部分、电化学活性部分、纳米颗粒或其组合，任选地所述纳米颗粒包括量子点。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述发光部分包括化学发光部分、电致发光部分、光致发光部分或其组合。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述光致发光部分包括荧光部分、磷光部分或其组合，任选地所述荧光部分包括荧光染料。
90.根据权利要求82-89中任一项所述的组合物，所述组合物还包含：
固定剂和/或透化剂；
多于一个寡核苷酸条形码，其中所述多于一个寡核苷酸条形码中的每一个包含分子标记和靶结合区，并且其中所述多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列；和/或
用于逆转录反应和/或扩增反应的一种或更多种试剂。
91.根据权利要求82-90中任一项所述的组合物，其中所述至少一种分泌因子包括：
淋巴因子、白细胞介素、趋化因子或其任何组合；
细胞因子、激素、分子毒素或其任何组合；和/或
神经生长因子、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、转化生长因子、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子或其任何组合。
92.根据权利要求82-91中任一项所述的组合物，其中所述分泌因子结合试剂和所述捕获探针能够与同一分泌因子的不同表位结合。
93.根据权利要求82-92中任一项所述的组合物，其中所述分泌因子结合试剂、所述捕获探针和所述锚定探针中的一种或更多种包括抗体或其片段，任选地所述抗体或其片段包括单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、包含互补的scFv(串联scFv)或双特异性串联scFv的单链、Fv构建体、二硫键连接的Fv、双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白或纳米抗体、适配体、亲和体、affilin、affitin、affimer、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单特异抗体或其任何组合。
94.根据权利要求82-93中任一项所述的组合物，其中所述捕获探针和/或所述锚定探针通过以下与所述第一固体支持物缀合：1,3-偶极环加成反应、杂Diels-Alder反应、亲核取代反应、非羟醛型羰基反应、碳-碳多重键加成、氧化反应、点击反应或其任何组合。
95.根据权利要求83-94中任一项所述的组合物，其中所述表面细胞靶包括：
糖类、脂质、蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、细胞标志物、B细胞受体、T细胞受体、主要组织相容性复合体、肿瘤抗原、受体、细胞内蛋白或其任何组合。
96.根据权利要求82-95中任一项所述的组合物，其中所述的第一固体支持物包括合成颗粒和/或平坦表面，任选地所述合成颗粒是可破坏的。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述合成颗粒包括珠，并且任选地所述珠包括
琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合；
选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合；或
可破坏的水凝胶颗粒。
98.根据权利要求96-97中任一项所述的组合物，
其中所述多于一种锚定探针中的每一种包含接头官能团，
其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且
其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此关联，
并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的组合物，
其中所述多于一种捕获探针中的每一种包含接头官能团，
其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且
其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此关联，
并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
CN202180082865.5A 2020-12-09 2021-12-08 多重化的单细胞免疫测定 Pending CN116569042A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063123217P 2020-12-09 2020-12-09
US63/123,217 2020-12-09
PCT/US2021/062473 WO2022125701A1 (en) 2020-12-09 2021-12-08 Multiplexed single cell immunoassay

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116569042A true CN116569042A (zh) 2023-08-08

Family

ID=80118958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180082865.5A Pending CN116569042A (zh) 2020-12-09 2021-12-08 多重化的单细胞免疫测定

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220178909A1 (zh)
EP (1) EP4260063A1 (zh)
CN (1) CN116569042A (zh)
WO (1) WO2022125701A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP3861134A1 (en) 2018-10-01 2021-08-11 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
CN112969789A (zh) 2018-11-08 2021-06-15 贝克顿迪金森公司 使用随机引发的单细胞全转录组分析
EP4242322A3 (en) 2019-01-23 2023-09-20 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
EP4004231A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 Becton, Dickinson and Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
CN115244184A (zh) 2020-01-13 2022-10-25 贝克顿迪金森公司 用于定量蛋白和rna的方法和组合物
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US11739443B2 (en) 2020-11-20 2023-08-29 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9371559B2 (en) 2002-06-20 2016-06-21 The Regents Of The University Of California Compositions for detection and analysis of polynucleotides using light harvesting multichromophores
CA2497152C (en) 2002-08-26 2016-06-07 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detection and analysis of polynucleotides using light harvesting multichromophores
CN101553579B (zh) 2006-10-06 2016-01-20 赛里根有限公司 用于定向生物标志物信号放大的荧光方法和材料
SG177355A1 (en) 2009-06-26 2012-02-28 Sirigen Inc Signal amplified biological detection with conjugated polymers
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP3981819B1 (en) 2010-01-19 2024-02-28 Sirigen II Limited Novel reagents for directed biomarker signal amplification
EP4148118A1 (en) * 2012-08-24 2023-03-15 Yale University System, device and method for high-throughput multi-plexed detection
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
CN110499251A (zh) * 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
CN110498858B (zh) * 2019-07-26 2024-01-23 深圳市达科为生物工程有限公司 一种动态检测单细胞外泌蛋白分泌情况的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4260063A1 (en) 2023-10-18
US20220178909A1 (en) 2022-06-09
WO2022125701A1 (en) 2022-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116569042A (zh) 多重化的单细胞免疫测定
US20210222244A1 (en) Methods and compositions for single cell secretomics
US11965208B2 (en) Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US11739443B2 (en) Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
KR102438495B1 (ko) 단일 세포를 위한 샘플 인덱싱
US11834715B2 (en) Oligonucleotide-comprising cellular component-binding reagents and methods of using the same
CN116157534A (zh) 用于单细胞分析的cDNA加标对照
CN115335520A (zh) 用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔
CN113454234A (zh) 杂合体靶向和全转录物组扩增
EP3914728A1 (en) Oligonucleotides associated with antibodies
EP3788170A1 (en) Molecular barcoding on opposite transcript ends
WO2023039433A1 (en) Non-sequencing pcr-based method for detection of antibody-conjugated oligonucleotides
WO2020150356A1 (en) Polymerase chain reaction normalization through primer titration
US20220187286A1 (en) Single cell secretome analysis
WO2023150764A1 (en) Sorting of mrna and abseq containing barcoded beads by flow
WO2024097263A1 (en) Bead-based single cell secretome analysis
WO2023154694A1 (en) Reference beads for linking imaging and sequencing readouts with single-cell resolution
US20240132961A1 (en) Oligonucleotide-Comprising Cellular Component-Binding Reagents and Methods of Using the Same
WO2023172977A1 (en) Modified flow proxy assay prior to single-cell cite-seq

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination