CN105745528A - 用于以数字方式对阵列上的特征进行计数的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于阵列的多个区域的数字成像、和所述阵列上的标记特征的检测和计数的方法、系统和平台。

Description

用于以数字方式对阵列上的特征进行计数的方法和系统

交叉引用

本申请要求2013年10月7日提交的61/887,853号美国临时申请的权益，所述申请通过引用结合在此。

发明背景

阵列技术在生物医学研究中广泛用于生物分子的检测和基因表达水平的剖析等。阵列通常由固定化探针组成，所述探针可以与样本中的靶分子结合或杂交。结合或杂交事件的检测常常通过使用光学标记(例如荧光团)和扫描或成像技术(例如，荧光扫描或成像)来实现。阵列上的特征是专用于给定靶分子的探针的固定化探针的一个小区域，例如与特定DNA或RNA序列杂交的探针。因此，识别杂交阵列上的标记特征的图案提供了与特定分子有关的信息，例如样本中的DNA或RNA分子，这继而可以在生物医学研究中提供有价值的数据。为生物医学调查提供高质量的、定量数据的两个重要工程要求是(i)正确地对杂交阵列进行成像，以及(ii)正确地分析图像以提取定量数据。现有的光学成像系统通常一次对阵列的一个区域成像，如果很多不同区域需要成像，这可能是个缓慢的过程。另外，当前成像分析的方法通常确定每个阵列特征的信号强度等级(即，模拟量)。强度等级测量常常受制于各种仪器漂移和分析误差，因此用于确定靶分子是否与给定阵列特征结合的改进方法、以及将所述数据转换为样本中存在的靶分子数量的定量测量值对扩展生物医学应用中阵列技术的使用是十分重要的。

发明内容

本披露的方法、系统和平台提供了用于对阵列上的标记特征进行数字计数的手段，并由此通过使用随机标记技术能够定量确定样本中存在的靶分子的数量。

本文中披露了一种成像平台，包括：(a)被配置成用于产生阵列的一个或多个区域的图像的光学仪器，其中，所述阵列包括多个特征，并且其中，所述多个特征包括一组寡核苷酸探针，并且其中，所述寡核苷酸探针与一组标记互补；以及(b)被配置用于进行图像分析的处理器，其中，所述图像分析包括：(i)读取所述光学仪器产生的图像；(ii)确定图像内的阵列中的特征的位置；(iii)测量每个特征的信号强度；(iv)测量每个特征的局部背景强度；(v)使用所述信号强度和局部背景强度计算每个特征的局部背景校正信号强度；(vi)分析完整的特征集合的局部背景校正信号强度，以确定用于在标记与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值；以及(vii)基于检测到的标记特征与未标记特征的数量和泊松分布的预测来计算样本中存在的靶分子的数量。在一些实施例中，所述光学仪器产生的图像是荧光图像。在一些实施例中，所述光学仪器产生的图像是磷光学图像。在一些实施例中，所述光学仪器产生的图像是透射光图像、反射光图像、或散射光图像。在一些实施例中，所述图像分析进一步包括读取事先已经采集的并存储在存储装置中的图像。在一些实施例中，定位图像内的阵列中的特征包括识别阵列上的预定义的基准特征。在一些实施例中，通过以下操作进行局部背景校正信号强度的计算：(i)确定图像内的每个特征上的预定义分析窗口的中心；(ii)根据所述特征内的预定义像素图案来计算信号和背景像素的强度值统计；以及(iii)利用所述信号和背景像素强度值统计计算每个特征的局部背景校正信号强度。在一些实施例中，用于计算每个特征的局部背景校正信号强度的强度值统计选自包括但不限于均值、中值、或信号对背景强度的比率的列表。在一些实施例中，分析完整的特征集合的局部背景校正信号强度以确定动态信号强度阈值包括进行一种或多种统计分析，所述统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或经验分析的列表。在一些实施例中，分析完整的特征集合的局部背景校正信号强度以确定动态信号强度阈值包括通过改变模型参数将模型函数拟合到强度数据。在一些实施例中，分析所述完整的特征集合的局部背景校正信号强度以确定动态信号强度阈值包括使与高于所述阈值的强度与低于所述阈值的强度之间的统计差相关的质量度量最大化。

在一些实施例中，描述了一种阵列读取器系统，所述系统包括用于计算样本中的靶分子的绝对数量的输出单元，其中，所述阵列读取器系统被配置成用于读取包括多个标记特征与未标记特征的阵列。在一些实施例中，所述阵列读取器系统可以进一步包括光学成像系统。在一些实施例中，样本中的靶分子的绝对数量的计算基于将所述光学成像系统产生的光学图像数据转换成标记特征与未标记特征的数量的计数。在一些实施例中，所述输出单元包括数字处理器和可执行软件，其中，所述可执行软件包括用于将光学图像数据转换成标记特征与未标记特征的数量的计数的计算机代码。在一些实施例中，所述阵列包括微阵列、显微镜载玻片、或微孔板。

在所披露的阵列读取系统的一些实施例中，所述光学成像系统具有的放大率小于1、等于1、或大于1。在一些实施例中，所述光学成像系统包括荧光成像系统。在一些实施例中，所述光学成像系统包括磷光成像系统。在一些实施例中，所述光学成像系统包括在透射光成像模式、反射光成像模式、或散射光成像模式或其组合下操作的成像系统。在一些实施例中，所述光学成像系统包括一个或多个图像传感器，其中，所述一个或多个图像传感器具有至少为320×240像素的分辨率。在一些实施例中，所述一个或多个图像传感器包括CCD图像传感器。在一些实施例中，所述一个或多个图像传感器包括CMOS图像传感器。在一些实施例中，所述一个或多个图像传感器包括一个或多个电路板。在一些实施例中，所述光学成像系统进一步包括从包括但不限于显微镜物镜、相机透镜、有限共轭透镜、无限共轭透镜、平凸透镜、双凸透镜、平凹透镜、双凹透镜、消色双胶透镜、或带通滤光片的组中选择的一个或多个部件。在一些实施例中，所述光学成像系统包括荧光成像系统，所述荧光成像系统被设计成与荧光素、Cy3、Cy5、或藻红蛋白荧光团一起使用。在一些实施例中，所述光学成像系统进一步包括照明系统，所述照明系统包括至少一个光源，其中，所述至少一个光源是LED或LED组件。在一些实施例中，所述至少一个光源与所述图像传感器以电子方式同步，所述至少一个光源在所述图像传感器采集图像时打开并且在所述图像传感器不采集图像时关闭。

在所披露的阵列读取器系统的一些实施例中，所述照明系统是满足向甫鲁条件的离轴照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是不满足向甫鲁条件的离轴照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是包括柯勒照明系统的离轴照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是包括阿贝照明系统的离轴照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是包括柯勒照明系统的落射照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是包括阿贝照明系统的落射照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是包括柯勒照明系统的透射照明系统。在一些实施例中，所述照明系统是包括阿贝照明系统的透射照明系统。

在所披露的阵列读取器系统的一些实施例中，所述光学成像系统进一步包括平移平台，其中，所述平移平台是单轴平移平台、双轴平移平台、或多轴平移平台。

在所披露的阵列读取器系统的一些实施例中，所述光学成像系统和所述输出单元结合在单个独立式仪器中。在一些实施例中，所述光学成像系统和所述输出单元被配置成单独的仪器模块。

在所披露的阵列读取器系统的一些实施例中，可执行软件自动地定位所采集图像内的阵列中的特征。在一些实施例中，所述可执行软件还通过以下操作进行局部背景校正：(i)确定图像内的每个阵列特征上的预定义分析窗口的中心；(ii)根据所述特征内的预定义的像素图案来计算信号和背景像素的强度值统计；以及(iii)利用所述信号和背景像素强度值统计计算每个特征的背景校正信号强度值。

在所披露的阵列读取器系统的一些实施例中，可执行软件对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行k均值聚类分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。在一些实施例中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行k中心点聚类分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。

在一些实施例中，可执行软件对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行混合模型统计分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。在一些实施例中，可执行软件还基于所述完整的阵列特征集合的背景校正信号强度值的排序来进行经验分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。在一些实施例中，可执行软件还基于所述完整的阵列特征集合的背景校正信号强度值的成对差的排序来进行经验分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。在一些实施例中，可执行软件模块对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行一种或多种统计分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值，并且其中所述一种或多种统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或经验分析的列表。

在所披露的阵列读取器系统的一些实施例中，可执行软件基于所述检测到的标记特征与未标记特征的数量和泊松分布的预测来计算样本中的靶分子的绝对数量。在一些实施例中，可执行软件还计算靶分子数量的置信区间。

本文中还披露了一种数字成像平台，包括：(a)被配置用于产生阵列的一个或多个区域的图像的光学仪器，其中，所述阵列包括多个特征，所述特征包括寡核苷酸探针，并且其中，所述寡核苷酸探针与一组标记互补；以及(b)数字处理器，其中，所述数字处理器被配置用于进行图像分析，所述图像分析包括：(i)转换多个特征的背景校正信号强度以产生二进制输出数据，所述二进制输出数据确定阵列的一个或多个区域中的标记特征与未标记特征的数量；以及(ii)基于所述阵列的一个或多个区域中的标记特征与未标记特征的数量来计算样本中存在的靶分子的数量。在一些实施例中，所述图像分析进一步包括自动地定位图像内的阵列中的特征。在一些实施例中，所述图像分析进一步包括针对局部背景强度校正每个特征的信号强度。在一些实施例中，所述图像分析进一步包括对多个特征的校正信号强度进行一种或多种统计分析以定义所述阵列的一个或多个区域的一个或多个动态信号强度阈值，其中，所述统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或经验分析的列表。在一些实施例中，样本中存在的靶分子的数量的计算基于阵列的一个或多个区域内检测到的标记特征与未标记特征的数量并且基于泊松分布的预测。

本文中还披露了一种非瞬态计算机可读介质，所述介质存储计算阵列上的标记特征的数量的程序，其中，所述阵列包括多个特征集合，并且其中，特征集合中的单独特征包括一组寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针能够与一组标记杂交，所述非瞬态计算机可读介质包括：(a)定位阵列的数字图像内阵列的单独特征的计算机代码；(b)对一个或多个特征的信号强度进行局部背景校正的计算机代码；(c)分析完整的特征集合的校正信号强度数据并确定校正信号强度阈值的计算机代码；以及(d)将特征的校正信号强度转换成二进制输出数据的计算机代码，由此提供所述阵列上的标记特征的数量的计数。在一些实施例中，定位数字图像内的阵列中的单独特征的计算机代码包括识别所述阵列上的预定义的基准特征。在一些实施例中，用于对每个特征的信号强度进行局部背景校正的计算机代码包括利用信号和背景强度的统计的计算，所述统计选自包括但不限于均值、中值、或信号对背景强度的比率的列表。在一些实施例中，用于分析完整的特征集合的校正信号强度以确定校正信号强度阈值的计算机代码包括进行一种或多种统计分析，所述统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或经验分析的列表。

本文中还描述了一种计算机实现方法，所述方法用于进行阵列信号强度数据的局部背景校正，所述方法包括：(a)确定阵列的数字图像内的特征上的预定义数字分析窗口的中心，(b)根据阵列特征内或周围的预定义的像素图案来计算信号和背景像素的强度值统计；以及(c)利用所述信号和背景强度值统计来计算所述阵列特征的背景校正信号强度。在一些实施例中，所述计算机实现方法进一步包括使用例如阵列上的一组预定义的基准特征自动地定位阵列特征。在一些实施例中，用于计算背景校正信号强度的强度值统计选自包括但不限于均值、中值、或信号对背景强度的比率的列表。

本文披露了一种计算机实现方法，所述方法用于确定动态图像强度阈值以用于在阵列上的标记特征与未标记特征之间进行区分，所述阵列包括多个标记特征与未标记特征，所述计算机实现方法包括：(a)测量阵列中的每个特征的图像强度数据；(b)对所述阵列上的每个特征的图像强度数据进行局部背景校正；以及(c)对所述完整的阵列特征集合的背景校正图像强度数据进行一种或多种统计分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态图像强度阈值，并且其中，所述一种或多种统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或经验分析的列表。

还披露了一种机构，包括：(a)闭合件；(b)壳体，所述壳体以磁性方式将闭合件保持在第一位置上；以及(c)平移平台，所述平移平台以磁性方式将所述闭合件保持在第二位置。在一些实施例中，所述机构进一步包括位于所述闭合件与壳体之间的衬垫。在一些实施例中，衬垫附接到闭合件上。在一些实施例中，衬垫附接到壳体上。在一些实施例中，闭合件和壳体是基本上不透明的，并且衬垫在第一位置上在闭合件与壳体之间产生基本上不透光封。在一些实施例中，一个或多个磁体被定位成将闭合件在第一位置上保持在壳体上。在一些实施例中，一个或多个磁体被定位成将闭合件在第二位置上保持到平移平台的第一表面上。在一些实施例中，两对或更多对配合定位特征用于在第二位置上将闭合件与平移平台对齐。在一些实施例中，两对或更多对配合定位特征用于将闭合件在第一位置上与壳体对齐。在一些实施例中，所述配合定位特征对包括锥形销和锥形孔。在一些实施例中，壳体包括光学仪器。在一些实施例中，平移平台包括样本支座。在一些实施例中，样本支座被设计成用于保持显微镜载玻片、微阵列、或微孔板。在一些实施例中，闭合件上没有绞链。在一些实施例中，闭合件未通过使用紧固件(如螺钉或夹子)附接至壳体或平移平台。在一些实施例中，闭合件未通过使用粘合剂来附接至壳体或平移平台。在一些实施例中，闭合件不使用闩锁或机械锁。

附图简要说明

在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下阐述了使用本发明的原理的说明性实施例的详细说明和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其附图为：

图1A至图1G示出了光学系统的一个示例及其部件。图1A描绘了示例性光学系统的等角投影图。图1B描绘了光学系统的俯视图。图1C描绘了光学系统的四边形视图。图1D描绘了光学系统的正视图。图1E描绘了示例性光学系统的侧视图，所述光学系统包括单轴平台、成像系统以及照明系统。图1F描绘了光学系统的后视图。图1G描绘了控制光学系统的操作的部件。

图2示出了成像系统中的透镜的示例性布局。

图3示出了照明系统中的透镜的示例性布局。

图4示出了图像数据的非限制性示例；在本案例中，图4A示出了从光学仪器采集的阵列图像，并且图4B示出了单独特征的强度的直方图。

图5示出了滴定实验中针对阵列探针与标记靶分子的杂交而观察到的特征强度分布。

图6A示出了噪声阵列图像。图6B示出了背景调整之前的强度分布。图6C示出了背景调整之后的强度分布。

图7A至图7D示出了为阵列上的特征的数字计数而设计的仪器的外部视图。

图8示出了被设阵列上的特征的数字计数而设计的仪器的内部视图(正视图；3DCAD模型)。

图9描绘了为阵列上的特征的数字计数而设计的仪器的内部视图(后视图；3DCAD模型)。

图10示出了样本装载平台位于伸展(装载)位置上的系统的照片，所述装载平台已经将门从前面板拉出。装载盘上示出了16像素阵列组件。

图11A示出了门组件的分解图，所述门组件利用磁性机构将门定位在样本隔室平台上。图11B示出了门组件的另一个分解图，展示了用于确保门与平台恰当对齐的圆锥形定位器特征。

图12描绘了具有磁体的上部平台组件的分解图，所述磁体与门上的一对相应的磁体配合。

图13示出了具有磁体的前面板组件的分解图，所述磁体与门上的一对相应的磁体配合。

图14示出了阵列的一个实施例中用于阵列产生和分析的观察参考方向图，示出了玻璃基底上的16个阵列位置。示出了标称尺寸(单位为毫米)

图15示出了阵列的一个实施例上的特征的布局。示出了标称尺寸(单位为毫米)

图16示出了为样本中的靶分子的数字计数而设计的阵列的布局，包括阳性对照(基准点)、阴性对照以及索引点的位置。

图17A-B示出了(A)转换到参考方向之后的阵列图像的示例以及(B)双阵列图像的图像尺寸(以像素为单位)和特征位置的示意图。

图18A-B描绘了用于在一个仪器上进行实验的软件工作流程，所述仪器被设计用于阵列上特征的数字计数。(A)使用人工样本装载的单轴系统的工作流程，和(B)使用自动样本盘装载的双轴系统的工作流程。

图19描绘了分析窗口，所述分析窗口包括与阵列中的每个特征相关联的12×12像素面积。

图20描绘了用于阵列中的每个特征的分析窗口内的像素命名的图。

图21描绘了从阵列的图像中获得的强度数据的散点图(上部)，展示了通过分析软件识别的不同类别的特征，并且描绘了特征强度数据的直方图(下部)。虚线指示由所述软件确定的强度阈值的示例，所述软件用于在标记(“开”)特征与未标记(“关”)特征之间进行区分。

图22描绘了阵列特征强度数据的散点图(上部)和直方图(中间)，展示了在阵列的标记(“开”)特征与未标记(“关”)特征之间进行区分的强度阈值(虚线)的使用。在当前描述的分析方法的实施例中，从排序的强度数据的绘图(下部)的最大斜率来确定阈值。

图23描绘了将三分量分布模型拟合到128直条特征强度直方图的结果，所述模型用于确定一个实施例中的强度阈值。

图24展示了用于将一个(左)或两个(右)正态分布拟合到阵列特征强度数据的直方图的偏差计算。在一些实施例中，偏差测量可以用作质量度量。

图25描绘了针对组合重复实验的输出数据的各种方法计算的不确定性。

图26示出了稀释系列数据，所述数据用于使用阵列上的标记特征的数字计数来测量样本中的靶RAN分子的数量。

图27示出了用于稀释系列实验的系统软件所提供的输出数据的屏幕截图。对于稀释系列实验中使用的每个阵列，所述软件显示特征强度数据的直方图，其中，蓝线指示计数所用的阈值，覆盖在阵列的数字表示上。

发明详细说明

阵列技术在生物医学研究中广泛用于生物分子的检测和基因表达水平的剖析等。阵列通常由固定化探针组成，所述探针可以与样本中的靶分子结合或杂交。结合或杂交事件的检测常常通过使用光学标记(例如荧光团)和扫描或成像技术(例如，荧光扫描或成像)来实现。阵列上的特征是专用于给定靶分子的探针的固定化探针的一个小区域，例如与特定DNA或RNA序列杂交的探针。因此，识别杂交阵列上的标记特征的图案提供了与特定分子的存在有关的信息，例如样本中的DNA或RNA分子，这继而可以在生物医学研究中提供有价值的数据。为生物医学调查提供高质量的、定量数据的两个重要工程要求是(i)正确地对杂交阵列进行成像，以及(ii)正确地分析图像以提取定量数据。现有的光学成像系统通常一次对阵列的一个区域成像，如果很多不同区域需要成像，这可能是个缓慢的过程。另外，当前的图像分析方法通常确定每个阵列特征的模拟信号强度等级(即，可以具有在某个最小值与最大值之间的任意值的信号，所述值由各种仪器和实验参数来确定)。模拟强度等级测量常常受制于各种仪器漂移和分析误差，因此用于确定靶分子是否与给定阵列特征结合的改进方法、以及将所述数据转换为样本中存在的靶分子数量的定量测量值对扩展生物医学应用中阵列技术的使用是十分重要的。

本文所披露的方法、系统和平台的优点包括：(i)对阵列的多个区域同时成像，以用于更高生产量的图像采集；以及(ii)改进的方法，用于减少图像数据以便以数字方式确定阵列中的每个特征的结合的靶分子(或靶分子标记)的存在或不存在，由此在一些类型的阵列实验中提供改进的量化，例如那些利用一组随机标记来量化样本中存在的靶分子数量的实验。美国专利8,835,358和PCT申请US2011/065291中描述了随机标记技术的使用，其全文通过引用结合在此。除提供靶分子的更加定量的测量的手段以外，随机标记技术的使用允许在涉及核酸扩增的实验中减轻扩增偏倚。

因此，本文中披露了用于阵列上的标记特征的数字计数的方法、装置、系统、和平台，包括：(i)光学仪器，被配置为形成阵列的一个或多个区域的图像；(ii)包括多个特征的阵列，所述多个特征进一步包括多个探针，并且其中，阵列的一个或多个区域可以包括一个或多个子阵列，并且其中，将所述阵列和子阵列被设计成与多组随机标记一起使用；以及(iii)计算机实现方法，所述方法用于接收输入图像数据；定位阵列图像中的阵列特征；针对局部背景强度值，校正与每个特征相关联的信号强度值；通过对多个特征的校正信号强度数据进行统计分析确定所述一个或多个阵列区域的动态信号强度阈值；通过将特征的校正信号强度数据和信号强度阈值进行比较来对阵列的一个或多个区域上的标记特征与未标记特征的数量进行计数；并且从阵列的一个或多个区域上检测到的标记特征与未标记特征的数量针对一种或多种靶分子种类计算样本中的靶分子的数量。

在一些实施例中，所描述的系统包括：(i)光学仪器(或读取器)，被配置为形成阵列的一个或多个区域的图像；(ii)数字处理器，被配置成用于执行可执行指令并在存储装置中存储数据；以及(iii)用于进行图像分析的计算机代码，以便将图像数据转换为阵列的一个或多个区域上的标记特征与未标记特征的数量的数字计数。在一些实施例中，所述计算机代码进一步包括针对一种或多种靶分子种类从阵列的一个或多个区域上检测的标记特征与未标记特征的数量来计算样本中的靶分子的数量。

在一些实施例中，所描述的平台包括：(i)阵列，被设计为在随机标记实验中使用，其中，所述阵列包括多个特征，所述多个特征进一步包括多个探针，并且其中，阵列的一个或多个区域可以包括一个或多个子阵列，并且其中，所述阵列或子阵列被设计为与多组随机标记一起使用；(ii)光学仪器(或读取器)，被配置为形成阵列的一个或多个区域的图像；(iii)数字处理器，被配置成用于执行可执行指令并在存储装置中存储数据；以及(iv)计算机代码，用于进行图像分析以便将图像数据转换为阵列的一个或多个区域上的标记特征与未标记特征的数量的数字计数。在一些实施例中，所述计算机代码进一步包括针对一种或多种靶分子种类从阵列的一个或多个区域上检测的标记特征与未标记特征的数量来计算样本中的靶分子的数量。

在一些实施例中，描述了将软件应用(或计算机代码产品)，所述软件应用确定阵列上的标记特征的数量，其中，所述软件应用包括执行以下计算机实现方法中的一个或多个方法的代码：(i)接收输入图像数据；(ii)定位阵列图像中的阵列特征；(iii)针对局部背景强度值，校正与每个特征相关联的信号强度值；(iv)通过对多个特征的校正信号强度数据进行统计分析来确定所述一个或多个阵列区域的动态信号强度阈值；(v)通过将特征的校正信号强度数据与信号强度阈值进行比较来对阵列的一个或多个区域上的标记特征与未标记特征的数量进行计数；并且(vi)从阵列的一个或多个区域上检测的标记特征与未标记特征的数量针对一种或多种靶分子种类计算样本中的靶分子的数量。

在一些实施例中，所描述的计算机实现方法用于进行阵列信号强度数据的局部背景校正，所述方法包括：(i)确定阵列的数字图像内的每个阵列特征上的预定义数字分析窗口的中心；(ii)根据每个阵列特征内或周围的预定义的像素图案来计算信号和背景像素的平均或中间强度值；并且(iii)从所述平均或中间信号强度减去所述平均或中间背景强度以确定每个阵列特征的背景校正信号强度值。

在一些实施例中，描述了计算机实现方法用于从阵列的多个特征的校正图像强度数据确定动态图像强度阈值，所述方法包括：(i)收集阵列的每个特征的图像强度数据；(ii)可选地对阵列上的每个特征的图像强度数据进行局部背景校正；并且(iii)对完整的阵列特征的背景校正图像强度数据进行一种或多种统计分析，由此确定用于在阵列的标记特征与未标记特征之间进行分区的动态图像强度阈值。在一些实施例中，所述一种或多种统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或基于图像强度值或图像强度值的成对差异的排序的经验分析的列表。如本文所使用的，术语“动态强度阈值”是指基于对源自正在进行的实验的数据的分析而确定的参数。使用动态图像强度阈值在阵列的标记特征与未标记特征之间进行区分有助于最小化或消除数据处理中的误差，所述误差可能起因于仪器漂移或实验程序。

定义

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非文中另外明确指明，否则单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”以及“所述(the)”包括复数对象。除非另作说明，本文中对“或”的任何引用意指涵盖“和/或”。

如本文所用，术语“系统”和“平台”可互换使用。类似地，术语“图像传感器”、“成像传感器”、“传感器芯片”、以及“相机”可互换使用，以便描述用于成像目的二维感光器，并且在描述数据分析方法时，术语“图像强度”和“信号强度”的用法也可以互换使用。最后，除非另作说明，术语“软件”、“软件应用”、“软件模块”、“计算机程序”、以及“计算机代码”也可以互换使用。

随机标记方法

美国专利8,835,358和PCT申请US2011/065291中描述了随机标记技术的使用，其全文通过引用结合在此。

简而言之，高灵敏度单分子数字计数可以通过相同靶分子集合的随机标记来实现。使用大量非消耗性的唯一标记随机标记靶分子的每个复制品。每个标记靶分子的唯一性由随机选择的统计来确定，并且相比于标记的多样性，取决于集合中相同靶分子的复制品的数量。所得的标记靶分子集合的大小由标记方法的随机性来确定，然后检测到的标记的数量的分析允许计算原始集合或样本中存在的靶分子的数量。当存在的靶分子的复制品的数量与唯一标记的数量的比率低时，标记靶分子是高度唯一的(即，多于一个的靶分子已经用给定标记标记的概率非常低)，并且数字技术效率高。这种随机方法将分子计数的问题从相同分子的定位和识别中的一项转换为与一组预定义标记的检测有关的一系列是/否数字问题。在一些实施例中，借助于DNA测序来检测标记的产品。在其他实施例中，使用本文中所描述的阵列读出系统以高特异性来检测用于选择的一个或多个靶分子的标记产品。

阵列和特征

本文中披露了阵列，被设计成用于在样本中的一个或多个靶分子的随机计数时使用。阵列提供对标记靶分子的存在进行检测的方法，其中，标记包括一组大量且多样的唯一标记。

在许多实施例中，阵列包括位于基底的表面上的多个特征(或斑点)，其中，每个特征进一步包括多个附接探针。在一些实施例中，阵列可以包括一个或多个区域，所述区域中的每一个包括多个特征或子阵列。例如，阵列可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多区域，或可替代地，阵列可以包括15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多区域。在一些实施例中，阵列可以包括60个、70个、80个、90个、100个或更多区域。在其他实施例中，阵列可以包括几百、几千、或几万个区域。

阵列的非限制性示例包括微量滴定盘、微孔板、16孔显微镜载玻片、散斑微阵列、或原位固相合成法制造的微阵列。阵列的区域可以包括16孔显微镜载玻片的一个孔、96孔玻璃底板的一个孔、或384孔玻璃底板的一个孔。可替代地，阵列的区域可以包括多于一个的孔，例如，在一些实施例中，区域可以包括2个相邻孔、4个相邻孔；或者位置彼此紧密相邻的更多数量的孔。在一些实施例中，阵列可以包括高密度寡核苷酸阵列，每平方毫米超过1000个特征，并且阵列上的区域可以包括阵列基底表面的所选区域，例如大约1mm×1mm的面积。

如前文所指，在许多实施例中，选择附接到阵列的特征集合上的一组探针来检测一组特定的唯一标记，所述唯一标记被设计用在随机标记研究中。探针到阵列基底的附接可以共价的或非共价的、永久的或临时的。探针可以是一系列单体，包括但不限于例如脱氧核苷酸、核苷酸、氨基酸、或合成单体，或它们可以是一系列寡聚体，包括但不限于例如寡核苷酸(例如，DNA或RNA序列)或肽序列。在一些情况下，探针可以是高分子，包括但不限于例如抗体或抗体片段。阵列上的每个特征对应于包括固定化探针的阵列基底的一个小区域，所述固定化探针具有与相同靶分子或结合或杂交的相同分子序列。阵列上的两个或更多特征可以是相同的、相似的或不同的。在许多实施例中，阵列会包括用于对齐或定向目的的一个或多个基准标记、以及包括除用于检测随机标记组的特征集合以外的阳性对照特征和阴性对照特征。阳性对照特征可以包括与已知始终存在于样本中的分子结合或杂交的探针、或与以受控的方式刺入样本中的分子结合或杂交的探针。阴性对照特征可以包括专用于已知样本中不存在的分子的探针，或者它们可以包括完全没有探针附接到基底表面上的特征。

在许多实施例中，阵列基底(又被称为支架)可以由很多材料制成。材料可以是固态的。材料可以是半固态的。可用于制造阵列基底的材料的示例包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、聚合物或纸。

在一些实施例中，本披露还描述了用于在随机标记研究中使用的阵列。具体而言，本文中描述了阵列，其中，所述阵列包括其上具有固定化探针的多个特征，所述探针与一组标记互补，所述标记被设计用于在随机标记实验中使用，并且其中，针对标记组中的每个标记，在所述阵列上具有至少一个特征。一些实施例包括阵列，所述阵列包括：(a)多个特征，所述特征可选地被组织进入多个子阵列，其中，所述多个特征包括：(i)一个或多个基准特征，其包括具有定义的基准序列的寡核苷酸探针；(ii)一个或多个阳性对照特征，其包括具有一个或多个定义的阳性对照序列的寡核苷酸探针；(iii)不具有寡核苷酸探针的一个或多个阴性对照特征；以及(iv)包括寡核苷酸探针的多个标记组特征，其中，每个单独特征包括选自一组标记序列的唯一序列，所述标记序列被设计用于一个或多个靶分子的随机标记。在一些实施例中,本披露中描述的阵列包括寡核苷酸探针序列，所述序列包括25-mer，其中5’端可以可选地用6碳原子氨基改性剂来标记。在一些实施例中,本披露中描述的阵列进一步包括寡核苷酸探针，所述探针包括表1中列出的一组960个唯一寡核苷酸序列。在一些实施例中,本披露中描述的阵列包括一组寡核苷酸探针，所述探针与表1中列出的序列组70％同源、80％同源、85％同源、90％同源、95％同源。在一些实施例中,本披露中描述的阵列包括一组寡核苷酸探针，所述探针包括表1中列出的序列的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％或更多。

杂交和检测

在披露的方法、系统和平台的许多实施例中，可以在将样本放置成与阵列上的固定化探针接触之前处理所述样本。例如，在样本制备步骤过程中，可以利用荧光染料分子和/或随机标记对样本中的靶分子进行标记。在与寡核苷酸探针杂交之前，例如，靶DNA或RNA分子可以共价地连接至荧光染料分子，包括但不限于荧光素、Cy3、或Cy5。可替代地，在与阵列上的探针结合或杂交之后对靶分子进行标记。例如，在与阵列上的探针结合或杂交之前，靶分子可以共价地连接至生物素。在结合或杂交步骤之后，那么可以用缀合到光学标签的链霉亲和素对固定化的靶分子进行标记，所述光学标记包括但不限于藻红蛋白、量子点纳米颗粒、金纳米颗粒、或蓝色乳胶珠粒。在与阵列结合或杂交之前或者之后，有很多标记靶分子的方法，并且适合的光学标记或标签有很多可能的选择。

一旦样本已经接触阵列，所述阵列(或所述阵列的一个或多个区域)可以包括一个或多个标记特征。已经接触包括标记靶分子的样本(其中靶分子在接触阵列之前或之后被标记)的阵列的每个区域可以包括例如零个、一个、两个、或更多标记特征。可替代地，已经接触样本的阵列的区域可以包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或更多标记特征。在一些实施例中，已经接触样本的阵列的区域可以包括15个、20个、25个、30个、35、40个、45个、50个、或更多标记特征。在高密度阵列中，已经接触样本的阵列的区域可以包括多于100个标记特征、多于1,000个标记特征、多于10,000个标记特征、多于100,000个标记特征、或多于1,000,000个标记特征。

光学仪器

本文中描述的方法、系统和平台可以包括用于阵列的一个或多个区域的有限共轭数字成像的光学仪器，其中，所述仪器通常包括照明系统、成像系统、和平移平台。在一些实施例中，所述仪器像具有的放大率小于一的“显微镜”那样操作。在其他实施例中，所述仪器像具有的放大率大于一的“显微镜”那样操作。在另外的其他实施例中，所述仪器像具有的放大率等于一的“接触成像器”那样操作。放大率的选择通常会取决于需要对相关区域进行成像的视野，并且取决于图像传感器的大小。

以非限制性示例为例，如果阵列的区域包括16孔显微镜载玻片的单个孔、或96孔玻璃底板的单个孔，待成像区域的尺寸可以是大约7mm×7mm，并且阵列的两个相邻区域之间的节距(中心到中心距离)可以为大约9mm。在一些实施例中，所述光学仪器可用于一次拍摄一个孔的图像，或者同时拍摄2个相邻孔的图像，或者同时拍摄4(2×2)个相邻孔的图像，并且所需的视野或待成像的区域可以被相应地调整。同样，所述光学仪器可以同时形成6(3×2或2×3)个、8(4×2或2×4)个、9(3×3)个、10(5×2或5×2)个、或12(6×2、4×3、3×4、或2×6)个相邻孔的图像。

以另一个非限制性示例为例，如果阵列的区域是384孔玻璃底板的单个孔，则待成像区域的尺寸可以为大约3mm×3mm，阵列的两个相邻区域之间的节距可以为大约4.5mm。同样，在一些实施例中，所述光学仪器可用于一次拍摄一个孔的图像，或者同时拍摄2个相邻孔的图像，或者同时拍摄4(2×2)个、6(3×2或2×3)个、8(4×2或2×4)个、12(4×3或3×4)个、或16(4×4)个相邻孔的图像。

在另一个非限制性示例中，所述光学仪器可用于使高密度寡核苷酸阵列成像，例如每平方毫米具有超过1,000个特征的阵列，并且阵列上的区域可以是大约例如1mm×1mm的面积。

成像系统

光学仪器的一个主要部件是成像系统。除了CCD或CMOS相机以外，成像系统还可以包括一个或多个透镜。通常，CCD或CMOS相机会具有几十万到几百万像素之间的分辨率。高分辨率相机可以具有数千万像素的分辨率，或者更高。

成像系统可以被配置成用于放大阵列的图像。成像系统的所需放大率可以由所需的视野和由CCD或CMOS传感器的大小来确定。以非限制性示例为例，如果光学仪器用于同时拍摄16孔显微镜载玻片的2个相邻孔的图像，所需的视野为大约16mm×8mm。如果CCD或CMOS传感器的光敏面积为大约4.8mm×3.6mm，则仪器是显微镜并且所需的放大率大约为0.3倍。在这种情况中，仅使用来自传感器的中心4.8mm×2.4mm的数据。

以非限制性示例为例，具有0.3倍放大率的适当成像系统可以使用具有85mm焦距的消色双胶透镜和具有25mm焦距的无限共轭相机透镜来构造。如果使用光谱选择性发射滤光片(例如，单带干涉滤光片、多带干涉滤光片、长通干涉滤光片、或长通有色干涉滤光片)，并且这种滤光片通常位于消色双胶透镜和相机透镜之间。具有0.3倍放大率的成像系统的附加结构是可能的。例如，可以省略消色双胶透镜，并且有限共轭相机透镜可以代替无限共轭相机透镜来使用。在这种情况下，光谱选择性发射滤光片优选地位于相机透镜的长共轭侧上。

具有4.8mm×3.6mm光敏面积的传感器被称为1/3英寸格式传感器。如果使用不同大小的传感器，所需的放大率将会不同。以非限制性示例为例，如果所需的视野是16mm×8mm并且使用具有6.4mm×4.8mm光敏面积的传感器(被称为1/2英寸格式传感器)，那么所需的放大率为0.4倍。具有0.4倍放大率的适当成像系统是使用例如具有85mm焦距的消色双胶透镜和具有35mm焦距的无限共轭相机透镜来构造的。

以非限制性示例为例，如果区域的尺寸是0.66mm×0.66mm并且使用具有8.8mm×6.6mm光敏面积的传感器(被称为2/3英寸格式传感器)，那么所述仪器是显微镜并且所需的放大率为大约10。在这种情况中，仅使用来自传感器的中心6.6mm×6.6mm的数据。具有10倍放大率的适当成像系统可以使用例如具有20mm焦距的无限共轭显微物镜和具有200mm焦距的显微镜筒透镜来构造，光谱选择性发射滤光片通常位于显微镜物镜和镜筒透镜之间。可替代地，可以使用有限共轭10x显微物镜并且可以省略显微镜镜筒透镜。在这种情况下，光谱选择性发射滤光片可以位于显微物镜的长共轭侧。

具有任意所需放大率的成像系统可以使用现成的和定制的光学元件来构造，所述光学元件不一定包括相机透镜或显微镜物镜。光学元件可以具有球形、平坦、非球形、或衍射表面的任意组合。

照明系统

光学仪器的另一个主要部件是照明系统。照明系统的目的是照亮CCD或CMOS相机的视野内的阵列。为了减少对边缘效应和对不对准的敏感性，照明面积稍微大于相机视野可能是值得期待的。以非限制性示例为例，如果视野大约是16mm×8mm，合理的照明面积可以是大约18mm×10mm。照明的类型可以是阿贝照明、柯勒照明、或既非阿贝也非柯勒照明。阿贝照明和柯勒照明是众所周知的并且在例如“OpticalSystemDesign,SecondEdition(光学系统设计，第二版)”第14章，罗伯特E.费舍尔(RobertE.Fischer)等人，SPIE出版社，麦格劳希尔，美国纽约，2008中进行了描述。

在一些实施例中，照明系统可以用于离轴照明。在其他实施例中，照明系统可以用于透射照明或落射照明。如果照明系统用于离轴照明或透射照明，那么照明系统和成像系统彼此分离，无共享光学部件。如果照明系统用于落射照明，那么照明系统和成像系统可以共享分束器并且有可能共享一个或多个透镜。分束器可以是板式分束器或立体分束器。如果光学仪器用于荧光成像，分束器通常是单边或多边长通二色分束器。

照明系统经常可以包含正方形的或矩形的孔径，这样照明面积具有与CCD或CMOS相机所成像的区域一样的形状。在使用离轴照明的实施例中，所述孔径可以是梯形的，而非正方形或矩形的。离轴照明系统可以满足或可以不满足向甫鲁条件。向甫鲁条件在例如“ModernOpticalEngineering,SecondEdition(现代光学工程，第二版)”，沃伦J.史密斯(WarrenJ.Smith)，麦格劳希尔，美国纽约，1990中进行了描述。

在一些实施例中，照明系统可以包含以下内容的一者或更者：球面透镜、非球面透镜、具有矩形或梯形横截面的固态均质化棒、具有矩形或梯形横截面的中空均质化光通道、微透镜阵列或一对微透镜阵列、静止或旋转漫射器、复合抛物面聚光器、除复合抛物面聚光器之外的非成像光学元件(例如，自由形态的折反射元件)、光纤、光纤束、或液芯体光导管。

照明系统可以包含从包括但不限于一个或多个LED、一个或多个激光器、氙弧灯、金属卤化物灯、或白炽灯、或它们的组合的组中选择的一个或多个光源。照明系统还以包含从包括但不限于单带干涉滤光片、多带干涉滤光片、或短通干涉滤光片的列表中选择的光谱选择性感光滤色片。如果照明系统包含两个或更多光源，它们可以是相同的(以非限制性示例为例，具有大约525nm峰值发射波长的两个或更多LED，用于激发Cy3染料)或不同的(以非限制性示例为例，具有大约525nm峰值发射波长的LED，用于激发Cy3染料，和具有大约625nm峰值发射波长的LED，用于激发Cy5染料，在电路板上尽可能近地安装在一起)。双色或多色LED组件可以从例如硅谷光擎公司(LEDEngin,Inc.)(加利福尼亚州圣何塞市)和光学器件创新公司(InnovationsinOptics,Inc.)(马萨诸塞州沃本市)获得。

在一些实施例中，照明系统中的光源可以以电子方式进行控制。以非限制性示例为例，光源可以与CCD或CMOS相机同步，从而使得光源在CCD或CMOS相机开始曝光时打开，而当相机结束曝光时光源。如果照明系统包含两个或更多光源，可以可选地一起或彼此独立地控制它们。

在一些实施例中，光源可以持续地开着。在这种情况下，照明系统可以包含电控快门，并且快门可以与CCD或CMOS相机同步，从而使得快门在CCD或CMOS相机开始曝光时打开，而当相机结束曝光时关闭。

在一些实施例中，光学仪器可以包含单个照明系统。在其他实施例中，所述仪器可以包含两个或更多相同的照明系统。在还有其他实施例中，所述仪器可以包含两个或更多不同的照明系统。以非限制性示例为例，用于检测来自Cy3和Cy5的荧光的光学仪器可以包含用于激发Cy3的一个照明系统和用于激发Cy5的另一个照明系统，或者它可以包含用于激发Cy3和Cy5两者的单个单照明系统。

平移平台

光学仪器的又另一个主要部件可以是一个或多个平移平台。平移平台的一个目的可以是将样本支座移进和移出成像系统的视野。平移平台系统的另一个目的可以是相对于样本或相对于彼此移动成像系统、成像系统的部件、照明系统、或照明系统的部件，以便获得最佳的可能图像。

在当前披露的系统的许多实施例中，平移平台可以进一步包括样本支座。以非限制性示例为例，如果光学仪器用于拍摄16孔显微镜载玻片的图像，平移平台包含载玻片支座。如果光学仪器用于拍摄96孔板或384孔板的图像，则光学仪器包含板支座。载玻片支座、板支座、或其他阵列支撑支座可以采用本领域的技术人员已知的各种方式中的任意一种方式安装在平移平台系统上。

平移平台可以具有一个或多个运动轴。以非限制性示例为例，如果支架是16孔显微镜载玻片并且仪器同时拍摄2个相邻孔的图像，单运动轴可能就足够了。以另一个非限制性示例为例，如果支架是96孔板并且仪器同时拍摄2个相邻孔的图像，将需要至少2个运动轴。还可以添加调整焦点和倾斜度的额外的运动轴。如果仪器在单次曝光中拍摄支架上的所有区域的图像，那么在光学仪器的一些实施例中可以省略平移平台。

壳体

本文中描述的系统和装置可以包括用于确保装置的传感器检测适当的信号的特征。例如，所述系统和装置可以包括挡光特征。挡光特征通常减少意外信号达到光敏传感器。在许多实施例中，成像系统、照明系统、平移平台、以及仪器的其他部件中的一者或多者被壳体包围。壳体可以是不透明的。在一些实例中，壳体用作法拉第笼。在一些实例中，单壳体足以将光挡在系统外。单个壳体还提供系统的外部保护。可替代地，多个壳体可以单独包含仪器的一个或多个部件。在一些实例中，壳体是嵌套壳体。在不同实施例中，壳体可以是不透气的和/或不透液体的。

壳体可以具有接入点，所述接入点可以挡住光以防进入壳体内部。接入点可以包括吸收与壳体内的传感器相关的光谱中的光的材料，例如在可见光谱内的vantablack超黑材料。接入点可以包括闭合装置。闭合装置可以是不透明的。闭合装置可以是例如门。闭合装置在闭合位置上可以是基本不透光的。闭合装置在闭合位置上可以是不透光的。

可以打开闭合装置，例如以便插入和移除16孔载玻片、96孔板、384孔板、或其他阵列支架。传感器(例如，光斩波器)可以用于确定闭合装置是是开着的还是闭合的。仪器的软件或电子硬件可以防止照明系统中的光源在闭合装置开着时打开，可以防止功率施加到图像传感器上，和/或可以防止平移平台在闭合装置开着时移动。

在一些实施例中，壳体可以进一步包括用于自动打开和关闭闭合装置的机构，如图10至图13所示。闭合装置可以提供进入壳体内部。闭合装置可以提供对阵列的触及以便装入仪器和从其中卸下。这种操作可以自动执行。在一些实例中，闭合装置可以在成像过程中挡住环境光，同时可靠地打开以准许载入。

在一些实施例中，闭合装置不包括枢转零件。在一些实施例中，闭合装置不与枢转零件或闩锁相互作用。在所披露的系统和平台的一些实施例中，闭合装置通过磁体保持到壳体上。磁体可以在闭合位置将闭合装置保持到壳体上。磁体可以在打开位置将闭合装置保持到装载装置上，例如，托盘。在从打开位置到闭合位置的转变过程中，闭合装置可以从主要磁性方式附接到装载装置转变到主要以磁性方式附接到壳体上。在从闭合位置到打开位置的转变过程中，闭合装置可以从主要以磁性方式附接到壳体转变到主要以磁性方式附接到装载装置上。在一些实例中，打开状态与闭合状态之间的转变是磁不稳定的，这种不稳定导致闭合装置从转变状态移动至更稳定的打开位置或闭合位置。

闭合装置可以包括由门上的锥形特征提供的自定位功能。支撑配合对每侧上的磁体的零件的厚度、和那些零件内的定位凹坑的深度限定了每个配合对中的磁体之间的间距，并因此限定了吸持力。设计几何形状与电机的功率相匹配，以提供足够的保持力，无需高电机扭矩。所述系统被进一步设计为使得可以控制电机电流和速度(并因此控制扭矩)以提高性能，并避免产生安全隐患。当托盘向外移动以载入阵列组件时，四个磁体对中的两个磁体用于临时将门保持到样本托盘的前方，如图10所描绘的。在托盘向内移动后(并且在此过程中将另外两个磁体对分开)，另外两个磁体对用于将门紧密抵靠住前面板。图11A示出了磁体的各自分配。图12示出了位于平台前方的配合磁体。图13示出了前面板中的配合磁体的位置。为了提供牢固的吸引力(因此提供可靠的操作)，稀土磁体提供大的力量(例如，钕磁体)。本设计的一些实施例要求大约8mm直径和3mm厚度的盘式磁体，其中，磁场平行于轴线。在一些实施例中，用较弱的磁体或以一片磁性材料(例如，铁或低碳钢)替代每对中的一个磁体，这是足够的。

在本文中披露的系统和平台的一些实施例中，提供一种机构，所述机构用于提供一个或多个仪器舱上的自动化门或盖式闭合件，其中，所述机构包括：(a)闭合件；(b)壳体，所述壳体以磁性方式将闭合件保持在第一位置上；以及(c)平移平台，所述平移平台以磁性方式将所述闭合件保持在第二位置。在一些实施例中，所述机构进一步包括位于所述闭合件与壳体之间的衬垫。在所述机构的一些实施例中，衬垫附接到闭合件上。在其他实施例中，衬垫附接到壳体上。在一些实施例中，闭合件和壳体是基本上不透明的，并且衬垫在第一位置上在闭合件与壳体之间产生基本上不透光封。在所述机构的一些实施例中，一个或多个磁体被定位成在第一位置上将闭合件保持到壳体上。在所述机构的一些实施例中，一个或多个磁体被定位成在第二位置上将闭合件保持到平移平台的第一表面上。在一些实施例中，所述机构进一步包括两对或更多对的配合定位特征以便在第二位置上将闭合件与平移平台对齐。在一些实施例中，所述机构进一步包括两对或更多对的配合定位特征以便在第一位置上将闭合件与壳体对齐。在所述机构的一些实施例中，所述配合定位特征对包括锥形销和锥形孔。在一些实施例中，壳体包括光学仪器。在一些实施例中，平移平台包括样本支座。在一些实施例中，样本支座被设计成用于保持显微镜载玻片、微阵列、或微孔板。在一些实施例中，闭合件上没有绞链。在一些实施例中，闭合件未通过使用紧固件(如螺钉或夹子)附接至壳体或平移平台。在一些实施例中，闭合件未通过使用粘合剂来附接至壳体或平移平台。

图像数据

本文描述的用于对阵列上的一个或多个标记特征进行计数的方法、系统和平台可以包括数据输入、或数据输入的使用。数据输入可以包括成像信息和/或阵列的一个或多个区域的图像。图像包括像素数据，其中，以非限制性示例为例，像素数据的每个单元可以采用4位、8位、12位、14位、16位、32位、64位、128位、256位或更多位进行编码。图像可以包含阵列的一个或多个区域。图像的空间分辨率可以由光学仪器的空间分辨率来确定，但在所披露的方法和系统的一些实施例中，以非限制性示例为例，空间分辨率可以基于插值法、外推法、建模、和/或变换通过数字信号处理方案来增强。

本文中描述的用于对阵列上的一个或多个标记特征进行计数的方法、系统和平台可以包括对阵列上的一个、两个或更多不同区域的图像的采集和分析。在一些实施例中，待成像的两个或更多区域可以重叠、部分重叠、或完全不重叠。而且，待成像的两个或更多区域可以相邻或不相邻。

本文中描述的用于对阵列上的一个或多个标记特征进行计数的方法、软件、系统和平台可以包括对整个阵列的或其一部分的图像的采集和分析。在一些实施例中，成像的阵列区域可以包括阵列的总面积的至少约1％。在一些实施例中，成像的阵列区域可以包括阵列的总面积的至少约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在其他实施例中，待成像的阵列区域可以包括阵列的总面积的至少约11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％或更多。在另外的其他实施例中，待成像的阵列区域可以包括阵列的总面积的至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。在一些实施例中，待成像的阵列区域可以包括阵列的总面积的至少约75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％或更多。

本文中描述的用于对阵列上的一个或多个标记特征进行计数的方法、软件、系统和平台可以包括对阵列中的所有特征或其一部分的图像的采集和分析。在一些实施例中，图像可以包括阵列上的特征的总数的10％至100％之间。在一些实施例中，图像可以包括阵列上的特征的总数的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％。在一些实施例中，图像可以包括阵列上的特征的总数的最多95％、最多90％、最多80％、最多70％、最多60％、最多50％、最多40％、最多30％、最多20％、最多10％、或最多5％。图像所包含的特征数量可以在这些值中的任意值所界定的任意范围内(例如，从阵列的特征总数的约15％至约90％)。

图像采集

本文中描述的方法、系统和平台包括用于从光学仪器采集图像的软件。在一些实施例中，例如，对于包括两个或更多图像传感器的光学仪器，图像采集可以采用并行模式操作，即，同时采集两张或更多图像。可替代地，图像采集可以采用串行模式操作，其中，按顺序采集两张或更多图像。通常，图像采集可以采用连续方式(即，其中，在单个曝光时间段内采集图像)或间歇地(即，其中，以不连续方式采集图像，例如，使用两个或更多单独的曝光时间段，其中，在一些实施例中，出于进行信号平均目的而组合两张或更多图像)执行。

在非限制性示例中，阵列可以包括16个孔，其中，为每个孔形成一张图像。图像采集模块可以按顺序读取16张图像。读取16张图像可以在连续时间段内完成；或者，系统可以读取第一图像，之后分析第一图像，并且然后重复图像读取和图像分析过程，直到分析第16张图像。可替代地，图像采集模块可以立即读取一对图像，并重复读取直到采集到所有16张图像。16张图像可以在单个时间段中按顺序被读取。在一些应用中，可以读取一对图像，之后立即进行图像分析。

图像分析

通常，进行图像处理和分析的目标之一是提高信噪比和定量。在理想的阵列实验中，当成像时，包括结合的靶分子的标记特征和/或标记将产生统一的、未饱和的信号等级，并且未标记特征将呈现均匀的黑色，其中信号等级接近0。实际上，由于仪器的和/或实验程序性问题(包括但不限于杂散光、背景荧光(在基于荧光的成像的情况下)、粒状污染物、非特异性实验组分结合)导致的各种假象可能产生的图像妨碍人们提取定量信号强度数据并做出阵列中的哪些特征进行标记的明确请求的能力。因此，本文中描述的方法、系统、和平台可以包括用于进行各种图像处理任务的软件，包括但不限于特征定位、图像方向校正、背景校正、强度测量、数据定标、数据阈值化、以及数据分析功能。

图像方向和特征定位。在一些实施例中，合并到阵列的设计中的基准特征用于确定图像的方向并使用自定义图像分析软件以自动化方式定位特征。以非限制性示例为例，图15和图16中所示的微阵列图案包括32×32特征阵列，其中，位于顶行和底行中的基准特征准许定位数字图像中的阵列。基准特征通常以不对称图案来安排，所述图案的方向很容易识别，例如，位于图16中描述的阵列中的顶行特征中的基准特征可以包括不同的图案，对于该图案，所述行的左端和右端是不对称的，而底行中的基准特征的图案通常不同于顶行中的。这准许方便手工和自动识别阵列的不正确放置，并且还有方便检测成像问题。在一些实施例中，还可以转换图像，从而使得图像的外观方向对应于用户观察的方向，常常被称为观察参考方向，如图14针对被设计与本文中披露的方法、系统和平台一起使用的阵列的具体实施例所示。

特征位置的精细化。在一些实施例中，精细化每个特征的测量位置以便解释阵列制作误差，误差可以产生若干图像像素的偏移。在初始图像定向和特征定位步骤过程中获得的特征位置可以用于将阵列或阵列区域细分成多个分析窗口，例如，阵列可以被分成32×32个分析窗口，其中每个分析窗口包括集中在每个特征上的12×12像素的图像面积，如图19所示。所使用的分析窗口的大小取决于阵列上的特征的大小，并且可以是在阵列的特征与背景区域之间进行正确定位和区分所需的任意大小。以非限制性为例，分析窗口可以被限定为集中在阵列特征上的5×5、7×7、9×9、15×15、51×51、或101×101的像素面积。窗口中的特征的位置可以基于分析窗口内的像素的信号强度分布和聚类来确定。特征的精细化位置被计算为坐标X和Y与对完美直线网格所预测的站点的偏移。在一些实施例中，通过利用同一基底上的不同阵列之间的印刷伪像之间的相关性，可以避免由于缺陷(例如，灰尘)导致的特征位置结果的失真。由于印刷伪像通常是一致的，所以相对于假设的直线网格的校正也是一致的。给定特征的特征位置优化结果在被分析的所有阵列上进行组合，并且中值偏移用于后续的分析，这极大地减少了最终实验结果中的噪声。

局部背景校正。一旦为阵列中的每个位置定义了特征像素集合“S”和背景像素集合“B”(例如，参见图20)，就通过与信号强度和背景强度统计有关的计算将局部背景移除。用在局部背景校正计算的适合的信号和背景强度统计的示例包括但不限于均值、中值、或信号与背景的比率。在一些实施例中，在如上文描述的进行特征位置精细化之后，在信号和背景强度统计的后续计算中，将分析窗口内的像素分配给信号像素、背景像素、或过渡像素，即，要废弃的像素(参见图20)。在所披露的方法的一些实施例中，局部背景校正通过算法空间中的减法来进行，即与信号背景比率计算紧密相关的计算，如以下非限制性示例中所示：

假定对定义的特征和背景区域进行16位像素数据测量，接下来，分别计算信号像素的单值和背景像素的值一个有用的统计是每个像素集合的中值，即

在这种情况下可以使用各种其他统计，如像素集合的均值、或所述集合内的指定的百分位。对和两者使用相同的统计是不必要的，并且不是最优的。例如，低数据噪声和“开”与“关”数据点之间的强分离可以通过使用以下内容获得：

以及

作为进一步的增强，所使用的具体百分位可以是存储在设置文件中的预存储的且可重新配置的参数。

每个斑点的背景校正强度统计是：

$I={\log }_2\left(16\stackrel{\‾}{S}\right)-{\log }_2\left(16\stackrel{\‾}{B}\right)$

图21中示出了散点图的示例(强度统计vs特征数量)和强度数据的直方图。在这个示例中，通过进行算法中的减法来校正背景，这样使得强度度量与和的比率相关。在一些情况下，线性减法(例如)是优选的。一旦已经为完整的特征集合计算了背景校正强度统计，下一个任务就是确定特征中的哪些特征被标记(即“开”或“阳性”)以及特征中的哪些特征未被标记(即，“关”或“阴性”)。这是通过以下内容完成的：基于局部背景校正特征强度的统计分析确定信号强度阈值，并且随后对有多少特征k具有大于这个阈值水平的背景校正信号强度进行计数。可以认为信号强度阈值是“动态”信号强度阈值，因为所述阈值是通过对来自当前实验的数据的分析来确定的，并由此消除了由于像仪器漂移和实验程序的变化这样的因素导致的潜在误差。

动态信号强度阈值的确定。在本文中披露的方法、系统和平台的许多实施例中，通过对完整的特征集合的背景校正信号强度数据进行一种或多种统计分析来确定阵列的一个或多个区域的动态信号强度阈值。可以使用各种统计(或经验)分析技术中的任意一种技术，包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、探针参考分布方法、或基于背景校正信号强度值的排序、背景校正信号强度值的成对差异的排序的经验分析等。在一些实施例中，分析可以利用在多个分析窗口上、多个阵列区域上、或在指定的时间段内收集的空间和/或时间信息来提高分析的质量并由此改进所披露的方法的定量方面在一些实施例中，其他信息源(包括但不限于例如探针的位置、频繁出现的伪像图案、以前得到的结果、文献报告、阵列制造商的建议、人类知识、和/或人类的指导)可以整合到分析中。

以阈值确定的非限制性示例为例，在所披露的方法的一些实施例中，背景校正信号强度阈值可以使用经验方法(例如，“E-导数”方法；参见图22)来确定，其中，完整的阵列特征集合的背景校正信号强度数据构成了集合I＝{I_i}。集合I以升序排序，以便获得有序的校正信号强度值集合z＝{z_i}＝{排序[y_i]}。接着，计算每个排序阵列之间的差以便获得d＝{d₁，d₂，d_i，…，d_m}，其中d_i＝z_i+1-z_i。然后利用宽度为w的“窗口”使强度差平滑，以产生平滑、有序的阵列s。

$s_j=\frac{{\Σ}_{i=j-w}^{j+w}{d}_i}{2w+1}$

阈值是T，平滑、有序数据的斜率最陡的点(参见图21)：

T＝最大(s_j)

“开”(或标记的)特征的数量k是：

$k={\mathrm{\Σ}}_{i=1}^{m}I\[I_i>T\].$

以阈值确定的另一个非限制性示例为例，在一些实例中，背景校正信号强度阈值可以通过将背景校正特征强度数据拟合到两个或更多假设的分布上来确定(即，“混合模型”方法)，其中，所述假设分布包括正态分布、均匀分布等。通过假设阳性特征强度产生自具有较高平均信号强度的阳性特征分布并且阴性特征强度产生自具有较低平均信号强度的阴性特征分布，混合模型方法本质上是对产生数据的基础过程进行建模。另外，这种方法对每个分布产生的特征强度的变化进行建模，这在阳性特征强度趋于变化小得多而阳性特征强度趋于变化大得多的情况下是有用的。分布的选择由背景校正特征强度直方图中的数据曲线的形状来确定。使用如期望最大化算法这样的方法从数据来估计模型的参数，例如，估计的“开”和“关”特征的平均强度以及它们相应的方差。

以阈值确定的另一个非限制性示例为例，在一些实施例中，背景校正信号强度阈值可以通过将背景校正信号强度数据拟合到包括三个假设的分布的模型函数来确定(即，“三分量模型””)，其中，假设的分布包括“关”斑点的对数正态分布Dist1、“开”斑点的正态分布Dist2、以及平直偏移FlatLevel。模型的可调参数包括：(i)起始直方图中直条的数量，(ii)Dist1幅值，(iii)Dist1位置，(iv)Dist1标准偏差，(v)Dist2幅值，(vi)Dist2位置，(vii)Dist2标准偏差，以及(viii)FlatLevel。图23中示出了到直方图数据的示例拟合。用于在将特征强度数据拟合到这种分布之后确定阈值的方法的一个非限制性示例如下：(i)将三分量分布拟合到直方图数据，并且(ii)通过计算以下值来设置阈值T：(1)强度t_低，其中拟合的对数正态分布分量的高强度侧下降到低于1(或定义的用于比较的参数)；(2)强度t_subflat，其中拟合的对数正态分布分量的高强度侧下降到低于拟合的FlatLevel结果；(3)强度t_subnorm，其中拟合的对数正态分布分量的高强度侧下降到低于那个直方图直条上拟合的正态分布的值；以及(4)选择T＝最小[t_低,t_subflat,t_subnorm]。使用三分量模型方法确定阈值的替代方法对本领域的技术人员而言明显的。计算模型参数的起始值是有益的，以提高建模过程的速度和可靠性，这可以使用如粗搜索这样的方法来识别直方图中的主峰或基于源自典型的历史数据集的假设来实现。

以阈值确定的另一个非限制性示例为例，在一些实施例中，背景校正信号强度阈值可以使用“分峰基准点”方法来确定。以下描述了这种方法，其较好地处理了低质量数据。使用基准行中的“开”(标记存在)与“关”(标记不存在)特征之间的扩展自然定义的尺度将特征强度数据初始地分裂为高和低强度组。然后，为每个组找到直方图峰(在使用标准方法(如移动平均滤波器)可选地使数据平滑之后)。然后，通过检查低强度组峰周围的强度数据的扩展来确定阈值。定义基准强度的上界和下界：(i)F_off＝[OFF基准点的中值]，(ii)F_on＝[ON基准点的中值]，以及(iii)F_范围＝F_on–F_off。在等级Splitvalue＝F_off+PeakSplit×F_范围，基于基准尺度进行数据的初始分裂，其中参数PeakSplit是F_范围的百分率。发现2个峰：(i)对于强度小于Splitvalue的所有特征，峰1＝直方图为最大值的强度尖峰，(ii)对于强度大于Splitvalue的所有特征，峰2＝直方图为最大值的强度尖峰。计算峰1附近的所有特征的标准偏差Stdev1，定义为从最低强度直到峰1+峰偏移分数(PeakOffsetFraction)×(峰2-峰1)的所有索引特征，其中峰偏移分数是可调参数。将阈值设置为T_psf和T_LocMin,中的较小者，它们的计算如下：(i)T_psf＝峰1+StdevMultiple×Stdev1，其中StdevMultiple是参数，或者T_LocMin＝对应于峰1和T_psf之间的平滑直方图曲线的最小值的强度。还可以使用相似的办法，所述办法使用不同的方法来确定另一个峰周围的扩展。

本文披露的方法和系统可以包括检测阵列上的一个或多个区域内的一个或多个标记特征。在一些实施例中，检测区域内的标记特征可以包括将特征的背景校正信号强度与动态信号强度阈值进行比较，所述动态信号强度阈值是通过对完整的特征集合的背景校正信号强度的统计分析得到的。当给定特征的背景校正信号强度高于阈值时，可以将所述特征分类为标记特征。可替代地，如果给定特征的背景校正信号强度低于阈值时，可以将所述特征分类为未标记。因此，将背景校正信号强度阈值应用到完整的特征集合的校正信号强度数据构成了数据到数字输出的二进制转换，其中，将特征分类为标记的(“开”)或未标记的(“关”)。本领域的技术人员将认识到，可应用于实现这种二进制转换的分析步骤的类型和顺序有许多可能的变化。

样本中的靶分子的绝对数量的计算。样本中的靶分子的绝对数量(其中，已经以如前文描述的随机方式标记了靶分子)可以使用包括多个特征集合的阵列来确定，所述特征集合包括特定于随机标记组中的标记的探针。在靶分子或标记的靶分子与阵列杂交或结合后，按上述那样使阵列成像并处理，并且基于泊松分布统计从标记特征的数量k确定样本中的靶分子数量N。

$N=-m*log(1-\frac{k}{m})$

其中，m是特征总数(即，随机标记组中的唯一标记的总数)。

质量度量。在一些实施例中，包括数据质量的数值测量是有利的，以便帮助估计实验的成功。在一些实施例中，这种质量测量可以基于逐特征强度数据的统计。一种简单的质量测量Q_Sep1简单地是背景校正和换算度之后阳性和阴性特征强度的均值之间的差，即Q_Sep1＝(具有高于信号强度阈值的强度的特征的平均强度)-(具有低于阈值的强度的特征的平均强度)。在一些实施例中，这种度量还可以通过换算每个分布的标准偏差均值之间的差来将扩展结合到特征分布的强度中，例如Q_Sep2＝Q_Sep1/(具有低于阈值强度的强度的特征的强度标准偏差)。可以基于建模分布的分离和宽度构建其他质量测量结果，所述建模分布被拟合到实验数据。在一些实施例中，偏差测量结果可用于质量度量(图24)；这种计算基于两个拟合的正态分布之间的分离程度。在一些实施例中，优选的是通过将阈值设置为使质量度量最大化的值来凭经验确定动态强度阈值。

置信区间在本文中披露的方法的一些实施例中，当使用上述技术指定在样本中检测的靶分子的绝对数量的估计值时，定义置信区间(更为完整的描述参见杜布(Dube)等人的(2008)的PLoSONE3(8)：e2876)是有利的。对于采用单组m个不同标记的单一反应，随机标记实验的N的估计的95％置信区间可以从k推导。N的95％置信区间范围从N_低到N_高，其中

以及

两个样本中的靶分子的复制品数量的比率。研究人员经常通过计算两个或更多样本中的基因表达水平之间的比率来试图比较不同样本中的基因表达水平。使用如上文所述的那些计算，可以推导出这种比率的置信区间，其中，使用本文中披露的方法、系统和平台来确定每个样本中的靶分子的数量。

重复实验图25中示出了进行重复实验的益处、以及相关联的不确定性的正确计算。尽管重复实验的结果(蓝点)可以简单地组合(蓝色误差条)，但计算泊松统计的不确定性(其中由于包括较大的标记池，人们会考虑重复次数)得出图中所示的较小的绿色误差条。这种估计的精度会取决于重复实验之间的一致性而变化，并且在认为重复实验的标记是多种多样的标记的池时采用了数值简化。因此，在所披露的方法的一些实施例中，用于计算置信区间的不同方法在高k/m比率上可能更为适合。

用户接口

本文中披露的方法、软件、系统、以及平台可以包括用户接口或用户接口的使用。用户接口可以提供一个或多个用户输入。来自用户接口的输入可以包括用于以实时模式对一个或多个标记特征进行计数的指令。来自用户接口的输入可以包括用于对一张或多张图像的一个或多个特征进行计数的指令。所述一张或多张图像可以是存档图像。所述一张或多张图像可以是现场采集的图像。

不同的平台操作员可以在分析图像的定时方面具有他们自己的偏好。一个平台操作员可能想在现场采集图像的同时就进行图像分析。另一个平台操作员可能在已收集所有图像之后进行图像分析。或者，另一个平台操作员可能对一组存档图像进行图像分析。这些选择可以通过至用户接口的输入来选择。

数据处理装置

本文中披露的方法、软件、系统、以及平台可以包括数字处理装置或数字处理装置的使用。数字处理装置可以包括执行装置功能的一个或多个中央处理单元(CPU)。数字处理装置可以包括被配置成用于执行可执行指令的操作系统。数字处理装置可以连接至计算机网络。数字处理装置可以连接至互联网，这样使得它接入万维网。数字处理装置可以连接至云计算基础设施。数字处理装置可以连接至内联网。数字处理装置可以连接至数据存储装置。

以非限制性示例为例，合适的数字处理装置可以包括服务器计算机、台式计算机、膝上计算机、笔记本计算机、小型笔记本计算机、笔记本计算机、上网本计算机、机顶计算机、手持式计算机、互联网设备、移动智能电话、平板计算机、个人数字助理、视频游戏控制台、以及车辆。在一些实例中，智能电话可能适用于本文中描述的系统。在一些实例中，选择具有可选的计算机网络连接行的电视、视频播放器和数字音乐播放器可能适合用于本文描述的系统。合适的平板计算机可以包括具有本领域的技术人员已知的小册子、场记板和可改变的配置的那些计算机。

数字处理装置可以包括被配置成用于执行可执行指令的操作系统。操作系统可以是软件，包括程序和数据，所述软件管理装置的硬件并提供服务以执行应用。以非限制性示例为例，合适的服务器操作系统可以包括FreeBSD操作系统、OpenBSD操作系统、操作系统、Linux操作系统、MacOSX操作系统、操作系统、Windows操作系统、以及操作系统。以非限制性示例为例，合适的个人计算机操作系统可以包括 操作系统、MacOS操作系统、操作系统、以及类UNIX操作系统，例如操作系统。操作系统由云计算提供。以非限制性示例为例，合适的移动智能电话操作系统可以包括 OS操作系统、操作系统、 操作系统、操作系统、WindowsOS操作系统、WindowsOS操作系统、操作系统、以及操作系统。

数字处理装置可以包括存储器和/或存储装置。存储器和/或存储装置可以是用于在临时或永久基础上存储数据或程序的一个或多个物理设备。数字处理装置可以是易失性存储器并且可能需要电力来保持存储的信息。数字处理装置可以是非易失性存储器并且可以在不对数字处理装置供电时保留存储的信息。非易失性存储器可以包括闪存。非易失性存储器可以包括动态随机存取存储器(DRAM)。非易失性存储器可以包括铁电随机存取存储器(FRAM)。非易失性存储器可以包括相变随机存取存储器(PRAM)。以非限制性示例为例，存储装置可以包括CD-ROM、DVD、闪存装置、磁盘驱动器、磁带驱动器是、光盘装置、以及基于云计算的存储器。存储器和/或存储装置可以是如本文披露的那些装置的组合。

数字处理装置可以包括显示器。显示器可用于向用户发送视觉信息。显示器可以是阴极射线管(CRT)。显示器可以是液晶显示器(LCD)。显示器可以是薄膜晶体管液晶显示器(TFT-LCD)。显示器可以是有机发光二极管(OLED)显示器。OLED显示器可以是无源矩阵OLED(PMOLED)或有源矩阵OLED(AMOLED)显示器。显示器可以是等离子体显示器。显示器可以是视频投影机。显示器可以是如本文披露的那些装置的组合。

数字处理装置可以包括从用户接收信息的输入装置。输入装置可以是键盘。以非限制性示例为例，输入装置可以是定点装置，如鼠标、轨迹球、跟踪板、操纵杆、游戏控制器、或定位笔。输入装置可以是触摸屏或多点触摸屏。输入装置可以是用于捕捉声音或其他声音输入的麦克风。输入装置可以是用于捕捉移动或视觉输入的摄像机。输入装置可以是如本文披露的那些装置的组合。

非瞬态计算机可读存储介质

本文中披露的方法、软件、系统、以及平台可以包括用程序进行编码的一个或多个非瞬态计算机可读存储介质，所述程序包括可选地联网的数字处理装置的操作系统可执行的指令。计算机可读存储介质可以是数字处理装置的有形部件。计算机可读存储介质可以可选地从数字处理装置被移除。以非限制性示例为例，计算机可读存储介质可以包括CD-ROM、DVD、闪存装置、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、云计算系统和服务等等。程序和指令可以永久地、基本上永久地、半永久地、或非暂时地编码在介质上。

计算机程序(一般)

本文中披露的方法、软件、系统、以及平台可以包括至少一个计算机处理器、或计算机处理器的使用。计算机处理器可以包括计算机程序。计算机程序可以包括被写入的、在数字处理装置的CPU中可执行的指令序列，所述序列用于执行特定任。计算机可读指令可以被实现为执行具体的任务或实现具体的抽象数据类型的程序模块，如功能、特征、应用编程接口(API)、数据结构等等。可以用不同版本的不同语言来写入计算机程序。

计算机可读指令的功能可以根据需要组合或分布在不同环境中。计算机程序可以包括一个指令序列。计算机程序可以包括多个指令序列。可以从一个位置提供计算机程序。可以从多个位置提供计算机程序。计算机程序可以包括一个或多个软件模块。计算机程序可以部分或整体包括一个或多个web应用、一个或多个移动应用、一个或多个独立式应用、一个或多个web浏览器插件、扩展件、加载宏、或附加软件、或它们的组合。

web应用

计算机程序可以包括web应用。根据本文中提供的披露，本领域的技术人员将认识到web应用可以利用一个或多个软件框架和一个或多个数据库系统。web应用可以创建在软件框架上，如NET或RubyonRails(RoR)。以非限制性示例为例，web应用可以利用一个或多个数据库系统，包括关系数据库系统、非关系数据库系统、面向特征的数据库系统、关联数据库系统、和XML数据库系统。以非限制性示例为例，合适的关系数据库系统可以包括SQL服务器、mySQL^TM数据库系统、以及数据库系统。本领域的技术人员还将认识到，可以用一种或多种语言的一个或多个版本来写入web应用。可以用一种或多种标记语言、表示定义语言、客户端脚本语言、服务器端编码语言、数据库查询语言、或它们的组合来写入web应用。可以在某种程度上用标记语言来写入web应用，如超文本标记语言(HTML)、可扩展超文本标记语言(XHTML)、或可扩展标记语言(XML)。可以在某种程度上用表示定义语言来写入web应用，如层叠样式表(CSS)。可以在某种程度上用客户端脚本语言来写入web应用，如异步Javascript和XML(AJAX)、动作脚本、Javascript或银光()。可以在某种程度上用服务器端编码语言来写入web应用，如动态服务器网页(ASP)、Perl、Java^TM、JavaServer页面(JSP)、超文本预处理器(PHP)、Python^TM、Ruby、Tcl、Smalltalk、或Groovy。可以在某种程度上用数据库查询语言来写入web应用，如结构化查询语言(SQL)。web应用可以集成企业服务器产品，如Lotusweb应用可以包括媒体播放元件。媒体播放特征元件可以利用许多合适的多媒体技术中的一种或多种技术，以非限定性示例为例，如HTML5、 Java^TM、和

移动应用

计算机程序可以包括提供给移动数字处理装置的移动应用。移动应用可以在制造移动数字处理装置时被提供给移动数字处理装置。移动应用可以通过本文中描述的计算机网络提供给移动数字处理装置。

可以使用本领域已知的硬件、语言、和开发环境通过本领域的技术人员已知的技术来创建移动应用。本领域的技术人员将认识到，可以用若干种语言来写入移动应用。以非限制性示例为例，合适的编程语言包括C、C++、C#、Featureive-C、Java^TM、Javascript、Pascal、FeaturePascal、Python^TM、Ruby、VB.NET,WML、以及具有或不具有CSS的XHTML/HTML、或它们的组合。

可以从若干个来源获得合适的移动应用开发环境。以非限制性示例为例，商购的开发环境包括AirplaySDK、alcheMo、Celsius、Bedrock、FlashLite、.NETCompactFramework、Rhomobile、以及WorkLightMobilePlatform。其他开发环境可以无成本地获得，以非限制性示例为例，Lazarus、MobiFlex、MoSync、以及Phonegap。并且，移动装置制造商发布软件开发者套件，以非限制性示例为例，包括iPhone和iPad(iOS)SDK、安卓^TMSDK、SDK、BREWSDK、OSSDK、SymbianSDK、webOSSDK、以及MobileSDK。

本领域的技术人员将认识到，若干商业论坛可用于发布移动应用，以非限制性示例为例，应用商店、安卓^TM市场、应用世界、AppStoreforPalm装置应用商店、webOS应用目录、移动市场应用、设备Ovi商店、应用、以及DSi商店。

独立应用程序

计算机程序可以包括独立式应用，独立式应用可以是可以作为独立计算机进程运行的程序，而不是现有进程的附加软件，例如，不是插件。本领域的技术人员将认识到，可以经常编译独立使应用。编译器可以是将用编程语言编写入的源代码转换为二进制特征码(如汇编语言或机器码)的计算机程序。以非限制性示例为例，合适的编译的编程语言包括C、C++、Featureive-C、COBOL、Delphi、Eiffel、Java^TM、Lisp、Python^TM、VisualBasic、以及VB.NET、或它们的组合。可以经常进行编译，以便至少部分地创建可执行程序。计算机程序可以包括一个或多个可执行的编译应用。

web浏览器插件

计算机程序可以包括网络浏览器插件。在计算时，插件可以是将特殊功能添加到较大软件应用的一个或多个软件部件。软件应用程序的制作人可以支持插件以便能够使第三方开发者创建扩展应用的能力，以支持容易添加新特征并减少应用的大小。当受到支持时，插件可能能够自定义软件应用的功能。例如，插件常用在web浏览器中以播放视频、产生互动性、扫描查找病毒、和显示具体的文件类型。本领域的技术人员会熟悉若干种web浏览器插件，包括播放器、以及工具栏可以包括一个或多个web浏览器扩展件、加载宏、或附加软件。工具栏可以包括一个或多个浏览器栏、工具带、或桌面带。

根据本文中提供的披露内容，本领域的技术人员将认识到若干插件框架是可以获得的，所述插件框架能够以各种编程语言开发插件，以非限制性示例为例，包括C++，Delphi、Java^TM、PHP、Python^TM、以及VB.NET、或它们的组合。

web浏览器(又称为互联网浏览器)可以是被设计用来与网络连接数字处理装置一起使用、用于检索、呈现、和遍历万维网上的信息资源的软件应用。以非限制性示例为例，合适的web浏览器包括Internet浏览器、浏览器、Chrome浏览器、浏览器、浏览器、以及KDEKonqueror浏览器。web浏览器可以是移动web浏览器。以非限制性示例为例，移动web浏览器(又称为微型浏览器，迷你浏览器、和无线浏览器)可以被设计用在移动数字处理装置上，以非限制性示例为例，包括手持计算机、平板计算机、笔记本计算机、小型笔记本计算机、智能电话、音乐播放器、个人数字助理(PDA)、以及手持式视频游戏系统。以非限制性示例为例，合适的移动网络浏览器包括浏览器、RIM浏览器、苹果浏览器、Blazer浏览器、浏览器、 移动浏览器、Internet移动浏览器、基础web浏览器、浏览器、移动浏览器、以及PSP^TM浏览器。

软件模块(常规的)

本文中披露的方法、软件、系统、以及平台可以包括一个或多个软件、服务器、以及数据库模块，或它们的使用。根据本文中提供的披露内容，使用本领域已知的机器、软件、和语言通过本领域的技术人员已知的技术来创建软件模块。本文中披露的软件模块可以采用众多方式来实现。软件模块可以包括一个文件、一个代码段、一个编程特征、一个编程结构、或它们的组合。软件模块可以包括多个文件、多个代码段、多个编程特征、多个编程结构、或它们的组合。以非限制性示例为例，一个或多个软件模块可以包括web应用、移动应用、以及独立式应用。软件模块可以位于一个计算机程序或应用中。软件模块可以位于多于一个的计算机程序或应用中。软件模块可以在一个机器上托管。软件模块可以在多于一个的机器上托管。软件模块可以在云计算平台上托管。软件模块可以在一个或多个机器的一个位置上托管。软件模块可以在一个或多个机器的多于一个的位置上托管。

数据库

本文中披露的方法、软件、系统、以及平台可以包括一个或多个数据库、或它们的使用。根据本文中提供的披露内容，本领域的技术人员将认识到，许多数据库可以适合于图像信息的存储和检索。以非限制性示例为例，合适的数据库可以包括关系数据库、非关系数据库、面向特征的数据库、特征数据库、实体-联系模型数据库、关联数据库、以及XML数据库。数据库可以是基于互联网的。数据库可以是基于web的。数据库可以是基于云计算的。数据库可以是基于一个或多个本地计算机存储装置的。

示例

以下说明性示例表示本文中披露的方法、系统、以及平台的特定实施例，但无意于以任何方式进行限制。

示例1-光学仪器

图1示出了光学仪器的一个实施例。所述实施例用于同时使16孔显微镜载玻片孔的2个相邻孔成像。每个孔包含1024(32×32)个特征，又称为斑点，它们可以用荧光标记。斑点直径是大约80微米。相邻是点的中心距是161微米。所述仪器的目的是确定每个斑点的亮度。图1E示出了平移平台系统105、成像系统106、和照明系统107。平移平台系统包含单轴平移平台，所述单轴平移平台是从HaydonKerk26000系列线性致动器所驱动的日本三住公司(Misumi)的SSELBW9-170型循环球载玻片来构造的。16孔显微镜载玻片的支座安装在平移平台上。线性致动器由PeterNorberg咨询公司的BC2D20-0700型移动控制器来控制。图1G示出了USB集线器112、定制电路板113、以及运动控制器114。运动控制器和CCD相机是USB装置。USB集线器允许在计算机与仪器之间通过单一USB缆线进行通信。定制电路板包含Luxdrive公司的3021-D-E-1000型LED驱动器。定制电路板包含逻辑芯片以使LED和CCD相机同步(当CCD相机开始曝光时打开LED并且当CCD相机结束曝光时关闭)并且在仪器的门打开时防止LED开启。

示例2-成像系统

图2中示出了成像系统的一个实施例。支架205的表面上的染料分子发射的光由消色双胶透镜204进行准直、被带通滤光片203滤波、并且由相机透镜202聚焦到CCD相机的传感器201上。透镜204(爱特蒙特光学公司的47640型)具有85mm的焦距和25mm的直径。滤光片203(Semrock公司的FF01-593/40-25型)是用于cy3或藻红蛋白染料的发射带通滤光片。透镜202(富士能公司的HF25HA-1B型)具有25mm的焦距。透镜202是多元件透镜，但在图2中将它示为极薄的单元件透镜，因为多元件的设计细节属于富士能公司。透镜202的相邻孔径光阑设置为2.8。CCD相机(灰点研究公司的CMLN-13S2M-CS型)具有1296×964个像素和3.75微米的像素大小。在此实施例中，仅使用中心1280×640个像素。相机的塑料壳体被拆除并且相机的电路板由小型风扇冷却。透镜204和202形成了具有0.3倍放大率的有限共轭成像系统。

示例3-照明系统

图3中示出了照明系统的一个实施例。光源301发射的光经透镜302准直，然后在到达样本308之前经过孔径303、带通滤光片304、以及透镜305、306和307。光源301(硅谷光擎公司的LZ4-40G100型)是具有大约525nm峰发射波长的LED。透镜302(索雷博光电(Thorlabs)公司的ACL2520-A型)是直径25mm且焦距20mm的非球面透镜。孔径303(Fotofab公司的定制部件)是25mm直径钢盘中的矩形孔(19mm×7.5mm)。滤光片304(Semrock公司的FF01-531/40-25型)是用于cy3或藻红蛋白染料的激发带通滤光片。透镜305、306和307是直径25mm且焦距60mm的平凸透镜。透镜301和302形成了3倍放大率的有限共轭成像系统，并且将光源301成像到透镜306和307的光瞳上。透镜306和307形成了具有1倍放大率的有限共轭成像系统并且将孔径303成像在样本308上。所述照明系统相对于样本308倾斜45度。照亮的面积为大约19mm×10.6mm，其中10.6mm(＝7.5mm/cosine(45度))。

示例4-参考探针制备

此实验的目的是说明特殊方法的使用以便对出现在阵列上的杂交数量进行计数。这个示例使用特定DNA序列将其附接至阵列上的探针。这个实验中使用的32×32特征阵列包含960个不同的测量班点以及32个阳性对照探针和32个阴性对照探针(参见图15和图16)。32个阳性对照探针用于确保实际的结合可以使用原寡核苷酸实现，而32个阴性对照探针不包含斑点，完全没有探针。在图像部分步骤，我们考虑探针具有高于设定的强度阈值的强度，那么我们指的是作为阳性探针的探针，而如果探针强度低于设定的强度阈值，我们指的是作为阴性特征的探针。假设阳性探针测量样本中是否存在大量相应的互补寡核苷酸，而阴性特征表示不存在寡核苷酸。另外，阳性探针被称为标记，意味着我们可以计数多达960个唯一标记或条形码，以测量样本中960个寡核苷酸的复制品，那么这可以进一步概括为预测原始样本中的寡核苷酸的实际量。根据实验，在总共M个标记或总共960个标记中，通过从实际观察的唯一条形码或阳性探针的数量k，我们可以计算样本中的寡核苷酸复制品的总数N。

示例5-照明系统

所述实验的目的是展示计算用于在阵列上的标记特征与未标记特征之间进行区分的阈值的一种方法。

I.设I_LL为强度下限，I_UL为强度上限，并且w是窗口大小。

II.获取一组可行的阈值强度，y＝{y_i：I_LL＜I_i＜I_UL}

III.以升序对y进行排序，以获得y^*。

IV.计算d＝{d₁,d₂,d_i,…,d_m}，其中d_i＝y_i+1 ^*-y_i ^*。

V.计算所观察的每个强度的间隙统计：

$x_j=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{t=j-w}^{j+w}{d}_i}{2w+1}$

VI.识别阈值c，使得c＝最大(x_j)

VII.计算高于阈值c的斑点的数量k，其中

VIII.鉴于所需的模拟次数nsim，进行以下程序nsim次：从y＝{y₁，y₂，...，y_m}随机选择m个值进行替换，以获得y_sim。然后，用y_sim重复步骤I-VII以获得最终的计数。

IX.计算nsim个模拟计数的标准偏差

X.按照下式计算所述计数的95％CI：

$[k-1.96{\widehat{\mathrm{\σ}}}_k,k+1.96{\widehat{\mathrm{\σ}}}_k]$

注意，为了获得样本中分子数量的真实估计，我们需要用以下等式进行转换：

$N=-m*log(1-\frac{k}{m})$

并且类似地，对于95％CI上下限值，其中m是阵列上的特征的总数。

示例6-kan基因的检测

这个实验的目的是确定样本中的kan基因的数量。包含kan基因的样本与阵列杂交。图4A显示了从成像系统获取的阵列的区域。斑点处的明亮强度与在所述斑点存在的基因的较高概率相关。图像分析软件检查强度分布的统计，如偏差、偏度、峰度、以及中值。这些统计为软件提供了指导，以便自动选择最佳方法来检测kan基因的存在。在此示例中，使用混合模型算法将强度阈值确定为6.6，其将强度分布最优地分为“开”和“关”域，如图4B所示。

示例7-滴定实验

这个实验的目的是确定样本中的kan基因的数量。在获得区域的强度测量结果之后，计算强度分布并在图5中示出。具有普通技术人员可以识别出分布中的两个模式；然而，确定阈值的精确值是非常困难的。所发明的软件使确定信号强度阈值的任务自动化，并确定6.02的强度值提供了用于在标记特征与未标记特征之间进行区分的最佳阈值。

示例8-背景调整

这个实验的目的是展示一种处理图像的背景减法方法的使用。图6A示出了具有明显伪像的采集图像。进行系统的背景减运算以减少噪声。我们定义以斑点为中心的分析窗口。然后，软件计算平均斑点强度斑点标准偏差σ_S、斑点像素的数量n_S、背景均值背景标准偏差σ_B、以及背景像素的数量n_B。接着，软件计算每个斑点的log2减去背景的强度统计：

$I=\frac{{\log }_2\left(16\stackrel{\‾}{S}\right)-{\log }_2\left(16\stackrel{\‾}{B}\right)}{\sqrt{\frac{{{\mathrm{\τ}}_S}^2}{n_S}+\frac{{{\mathrm{\τ}}_B}^2}{n_B}}}$

其中

${\mathrm{\τ}}_S={\log }_2\left(16\right({\mathrm{\σ}}_S+\stackrel{\‾}{S}\left)\right)-{\log }_2\left(16{\mathrm{\σ}}_S\right)$

${\mathrm{\τ}}_B={\log }_2\left(16\right({\mathrm{\σ}}_B+\stackrel{\‾}{B}\left)\right)-{\log }_2\left(16{\mathrm{\σ}}_B\right)$

图6B和图6C分别示出了背景调整之前和之后的强度分布，展示了背景校正增强了软件正确评估阵列上的标记特征的存在的能力。

示例9-替代性背景调整

这个实验的目的是用于调整背景的替代方式。我们定义以斑点为中心的分析窗口。然后，软件计算斑点中值强度和中值局部背景强度接着，软件计算每个斑点的log2减去背景的强度统计：

$I={\log }_2\left(16\tilde{S}\right)-{\log }_2\left(16\tilde{S}\right).$

示例10-像素16暗盒和定制微阵列

这个示例展示了在进行随机标记实验时所披露的方法、系统和平台使用的阵列的一个实施例。

像素16暗盒包括：(i)用作阵列基底的环氧硅烷功能化玻璃载片；(ii)图14至图16中描述的定制微阵列的16个复制品，印刷在载玻片的功能化表面上；以及(iii)附着到载玻片的印刷侧的聚合物孔架，所述载玻片用于定义16个孔，这些孔流体地分离并且与阵列图案相配准。

在阵列印刷之后，所述孔架利用模切双面粘合剂附着到载玻片上。

定制DNA微阵列布局。微阵列图案包括32×32斑点阵列，如图15和图16所示。顶行和底行中的基准斑点准许定位扫描的图像中的阵列。并且，基准斑点以非对称图案排列，所述图案的取向易于识别：顶行具有末端不同的图案，而底行不同于顶行。这准许容易手工和自动识别像素16的不正确放置，并且还方便成像问题的检测。剩余的960个斑点各自与表1中列出的唯一探针序列中之一相关。

寡核苷酸序列和溶液组分。提供寡核苷酸溶液用于在96孔微型板中制备打印溶液。所提供的浓度是在H2O中100μM。打印之前使用TecanGenMate进行稀释。稀释是880μL的原寡核苷酸+1320μL的缓冲液。所使用的稀释缓冲液是具有0.00833％的十二烷基肌氨酸钠的250mM磷酸钠。使用0.2μm过滤器过滤缓冲液。在各探针制备操作中，制备三组板。在各源板后去掉顶部。最终配制的溶液是40μMDNA在具有0.005％十二烷基肌氨酸钠的150mM磷酸钠中。以在H2O中500μM提供基准寡核苷酸。基准寡核苷酸序列是：5’-/5AmMC6/TCCTGAACGGTAGCATCTTGACGAC-3’，25个碱基，5’氨基修饰剂C6，标准脱盐；以在H₂O中500μM提供。通过混合176μL的基准寡核苷酸，704μL的水和1320μL的缓冲液来稀释该基准寡核苷酸。最终基准混合物是40μM在具有0.005％十二烷基肌氨酸钠的150mM磷酸钠中。

寡核苷酸序列表表1中列出针对960个探针序列的寡核苷酸序列(即，与在分子计数实验中使用的随机标记序列的组互补的序列)。

表1-定制微阵列的寡核苷酸探针序列

示例11-滴定或稀释系列

并行地进行多个实验的能力能够利用一系列起始浓度或大量靶点从样本中直接探究计数结果，有时又称为滴定实验或稀释系列。

图26中示出了标记的RPLPO基因序列的稀释系列数据的示例。图中标绘的是每个阵列的计数结果N，其中，反应中的mRNA的标称起始浓度显示在X轴上。

图27中示出了用于相同的实验的分析软件的图形化输出中的一些图形输出。对于每个阵列，存在具有如下要素的合成显示：(i)索引斑点的强度直方图(绿色)；(ii)与直方图相配准的蓝色线，示出了斑点计数的动态阈值；(iii)32×32网格，其是每个阵列的数字表示。网格中的白色站点表示强度高于动态阈值的斑点，黑色站点表示强度低于动态阈值，并且(iv)作为文本报告每个阵列的结果N和质量评分Q。

尽管本文已经示出并描述了本发明的优选实施例，但对于本领域的技术人员而言是显而易见的是这类实施例仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将进行许多更改、变化和替代。应该理解的是，本文中所描述的本发明的实施例的不同替代方案可以用于实践本发明。

Claims (50)

1.一种阵列读取器系统，包括用于计算样本中的靶分子的绝对数量的一个输出单元，其中，所述阵列读取器系统被配置成用于读取包括多个标记特征与未标记特征的一个阵列。

2.如权利要求1所述的阵列读取器系统，进一步包括一个光学成像系统。

3.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述计算基于将所述光学成像系统产生的光学图像数据转换成所述标记特征与未标记特征的数量的计数。

4.如权利要求1所述的阵列读取器系统，其中，所述输出单元包括一个数字处理器和可执行软件。

5.如权利要求4所述的阵列读取器，其中，所述可执行软件包括用于将光学图像数据转换成所述标记特征和未标记特征的数量的计数的计算机代码。

6.如权利要求1所述的阵列读取器系统，其中，所述阵列包括一个微阵列、显微镜载玻片或微孔板。

7.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统具有的放大率小于1、等于1、或大于1。

8.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统包括一个荧光成像系统。

9.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统包括一个磷光成像系统。

10.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统包括在透射光成像模式、反射光成像模式、或散射光成像模式或它们的组合下操作的一个成像系统。

11.如权利要求8、9或10所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统包括一个或多个图像传感器。

12.如权利要求11所述的阵列读取器系统，其中，所述一个或多个图像传感器具有至少为320×240像素的分辨率。

13.如权利要求11所述的阵列读取器系统，其中，所述一个或多个图像传感器是CCD图像传感器。

14.如权利要求11所述的阵列读取器系统，其中，所述一个或多个图像传感器是CMOS图像传感器。

15.如权利要求11所述的阵列读取器系统，其中，所述一个或多个图像传感器包括一个或多个电路板。

16.如权利要求8、9或10所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统进一步包括从包括但不限于显微镜物镜、相机透镜、有限共轭透镜、无限共轭透镜、平凸透镜、双凸透镜、平凹透镜、双凹透镜、消色双胶透镜、或带通滤光片的组中选择的一个或多个部件。

17.如权利要求8所述的阵列读取器系统，其中，所述荧光成像系统被设计用于与荧光素、Cy3、Cy5、或藻红蛋白荧光团一起使用。

18.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统进一步包括一个照明系统，所述照明系统包括至少一个光源。

19.如权利要求18所述的阵列读取器系统，其中，所述至少一个光源是LED或LED组件。

20.如权利要求18所述的阵列读取器系统，其中，所述至少一个光源与图像传感器以电子方式同步，所述至少一个光源在所述图像传感器采集图像时打开并且在所述图像传感器不采集图像时关闭。

21.如权利要求18所述的阵列读取器系统，其中，所述照明系统是离轴照明系统。

22.如权利要求21所述的阵列读取器系统，其中，所述离轴照明系统满足向甫鲁条件。

23.如权利要求21所述的阵列读取器系统，其中，所述离轴照明不系统满足向甫鲁条件。

24.如权利要求21所述的阵列读取器系统，其中，所述离轴照明系统是柯勒照明系统。

25.如权利要求21所述的阵列读取器系统，其中，所述离轴照明系统是阿贝照明系统。

26.如权利要求18所述的阵列读取器系统，其中，所述照明系统是落射照明系统。

27.如权利要求26所述的阵列读取器系统，其中，所述落射光照明系统是柯勒照明系统。

28.如权利要求26所述的阵列读取器系统，其中，所述落射照明系统是阿贝照明系统。

29.如权利要求18所述的阵列读取器系统，其中，所述照明系统是透射照明系统。

30.如权利要求29所述的阵列读取器系统，其中，所述透射照明系统是柯勒照明系统。

31.如权利要求29所述的阵列读取器系统，其中，所述透射照明系统是阿贝照明系统。

32.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统进一步包括一个平移平台。

33.如权利要求32所述的阵列读取器系统，其中，所述平移平台是单轴平移平台。

34.如权利要求32所述的阵列读取器系统，其中，所述平移平台是双轴平移平台。

35.如权利要求32所述的阵列读取器系统，其中，所述平移平台是多轴平移平台。

36.如权利要求4所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件自动地定位所采集的图像内的阵列中的特征。

37.如权利要求36所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还通过以下操作进行局部背景校正：(i)确定一张图像内的每个阵列特征上的一个预定义分析窗口的中心；(ii)根据所述特征内的预定义的像素图案来计算信号和背景像素的强度值统计；以及(iii)利用所述信号和背景像素强度值统计计算每个特征的背景校正信号强度值。

38.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行k均值聚类分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。

39.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行k中心点聚类分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。

40.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行混合模型统计分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。

41.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还基于所述完整的阵列特征集合的背景校正信号强度值的排序来进行经验分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。

42.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还基于所述完整的阵列特征集合的背景校正信号强度值的成对差的排序来进行经验分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值。

43.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的所述背景校正信号强度值进行一种或多种统计分析，由此确定一个用于在所述阵列中的标记特征与未标记特征之间进行区分的动态信号强度阈值，并且其中，所述一种或多种统计分析选自包括但不限于k均值聚类、k中心点聚类、混合模型统计分析、或经验分析的列表。

44.如权利要求5、38、39、40、41、42、或43所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还基于所述检测到的标记特征与未标记特征的数量和泊松分布的预测来计算样本中的靶分子的绝对数量。

45.如权利要求44所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还计算所述靶分子的数量的一个置信区间。

46.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统和所述输出单元组合在单个独立式仪器中。

47.如权利要求2所述的阵列读取器系统，其中，所述光学成像系统和所述输出单元被配置成单独的仪器模块。

48.如权利要求3或5所述的阵列读取器系统，其中，样本中的靶分子的绝对数量是从所述检测到的标记特征与未标记特征的数量和泊松分布的预测中计算的。

49.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的局部背景校正信号强度值进行分析以确定一个动态信号强度阈值，并且其中，所述分析包括通过改变模型参数将一个模型函数拟合到所述强度数据上。

50.如权利要求37所述的阵列读取器系统，其中，所述可执行软件还对所述完整的阵列特征集合的局部背景校正信号强度值进行分析以确定一个动态信号强度阈值，并且其中，所述分析包括使与高于所述阈值的特征强度与低于所述阈值的特征强度之间的统计差相关的质量度量最大化。