KR102136648B1

KR102136648B1 - 검출 방법, 마이크로어레이의 해석 방법 및 형광 판독 장치

Info

Publication number: KR102136648B1
Application number: KR1020157008883A
Authority: KR
Inventors: 구니히사 나기노; 슌페이 요시카와; 페이 요시카와
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-04
Publication date: 2020-07-22
Also published as: KR20150064067A; EP2908089B1; WO2014057893A1; US20150276604A1; CN104718427B; EP2908089A1; EP2908089A4; US9823197B2; CN104718427A; JPWO2014057893A1; JP6291842B2

Abstract

본 발명은, 기판의 높이의 차이를 정확하게 검출 가능한 화상을 취득하는 것이 가능한 검출 방법, 마이크로어레이의 해석 방법 및 형광 판독 장치를 제공하는 것이다. 렌즈에 의해 집광된 레이저광을 요철 형상을 갖는 기판에 조사하고, 기판으로부터의 반사광 및/또는 산란광의 수광 강도를 화상 데이터로서 취득하여 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출 방법이며, 렌즈의 초점 위치보다도 렌즈에 가까운 위치에 기판의 광조사면을 배치하고, 광조사면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 검출광으로서 수광하여, 수광한 광의 강도의 변화에 기초하여 기판의 높이의 차이를 검출한다.

Description

검출 방법, 마이크로어레이의 해석 방법 및 형광 판독 장치{DETECTION METHOD, MICROARRAY ANALYSIS METHOD AND FLUORESCENCE READING DEVICE}

본 발명은, 마이크로어레이의 표면에서의 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출 방법, 마이크로어레이의 해석 방법 및 형광 판독 장치에 관한 것이다.

1990년 이후, 생물학, 의학, 약학 방면에서 마이크로어레이라 불리는 기술의 개발이 진행되어 이용되게 되었다. 마이크로어레이는, 유리나 플라스틱 등의 기판 상에 몇십부터 몇만의 프로브를 고정한 것이며, 형광 분자 등으로 표지된 샘플(타깃)을 이 기판에 어플라이하고, 프로브와 샘플의 결합 반응을 형광 등으로 검출하기 위한 것이다. 마이크로어레이는 한 번에 망라적인 측정이 가능하며, 향후 테일러 메이드 의료에 필수적인 것이 될 것으로 기대되고 있다.

종래, DNA를 프로브로서 기판에 고정한 DNA 마이크로어레이(이하, DNA 칩)나, 단백질을 프로브로서 기판에 고정한 단백질 마이크로어레이, 다수의 미소 표본을 프로브로서 기판에 고정화한 조직 마이크로어레이, 다수의 저분자 화합물을 프로브로서 기판에 고정화한 화합물 마이크로어레이 등이 알려져 있다.

이 중, DNA 칩은 가장 실용화가 진행되어 있고, 질환에 관련된 유전자의 탐색이나, 그의 유전자를 사용하여 검사, 진단을 행하고자 하는 연구가 활발하게 행해지고 있으며, 일부는 실용화되어 있다.

이하에 마이크로어레이의 한 형태인 DNA 칩에 대하여 상세하게 설명한다.

DNA 칩은, 유리나 수지 등을 포함하는 기판 상에 DNA를 그리드상으로 스폿(고정화)한 것이다. DNA 칩 상에는, 표지되는 DNA 샘플과 특이적으로 반응 가능한 프로브로서, 단일쇄의 DNA(DNA 프로브)가 스폿되어 있다. 또한, DNA 프로브는, 서열이 기지의 것이 사용된다. 한편, 해석해야 하는 미지 서열의 DNA 샘플(단일쇄 DNA)에는, 광학적으로 검출 가능한 발광 또는 형광 마크를 붙여 둔다. 이와 같이 하면, 해석해야 하는 미지 서열의 DNA 샘플을 DNA 칩 상에 유입한 경우, 상기 DNA 샘플의 서열이 DNA 프로브의 서열과 상보적인 관계에 있으면, DNA 프로브와 DNA 샘플이 결부되어 이중쇄의 DNA가 된다. 따라서, DNA 프로브와 결부되지 않은 DNA 샘플을 모두 세정 제거하고, DNA 칩 상에 잔존하는 판정하고자 하는 DNA 샘플을 발광시켜, 이 발광을 판독 장치(스캐너)에 의해 판독하면, 이중쇄가 된 DNA의 상황을 화상으로서 관찰할 수 있다. 즉, DNA 칩 상에서 발광하는 마크의 분포를 해석함으로써, 구하는 유전자의 존재나, 어떤 유전자가 발현되어 있는지의 여부, 또는 어느 정도 발현되어 있는지를 해석할 수 있다. 이와 같이, DNA 칩 상에 기지의 서열을 갖는 DNA 프로브 세트를 구성하고, 각각 상이한 서열의 DNA 프로브를 DNA 칩 상에 탑재함으로써, 유전자의 변이나 유전자의 발현량 등을 검출할 수 있다.

이하, 도 13에 DNA 칩 해석의 일련의 처리 공정의 상세를 도시한다.

도 13에 도시하는 전처리 공정에 있어서는, 검체로부터 추출한 DNA 샘플 중에 포함되는 미지의 DNA를 증폭하고, 이들 DNA에 형광 마크(예를 들어, Cy3, Cy5 등)를 부여한다(스텝 S201).

이어서 하이브리다이제이션 공정에 있어서, 다종류의 DNA 프로브가 탑재된 DNA 칩의 기판 상에 형광 마크를 부여한 DNA 샘플을 적하한다. 여기서, DNA 샘플이 스폿된 DNA 프로브와 상보적인 관계에 있으면, 결부되어 이중쇄가 된다(스텝 S202).

이어서, 세정 공정에 있어서, 소정의 세정액에 의해 하이브리다이즈한 DNA 칩을 세정한다(스텝 S203). 이에 따라, 그리드상으로 배치된 DNA 프로브와 결부되지 않은 DNA 샘플이 모두 세정 제거된다.

이어서, 세정된 DNA 칩에 대하여 광을 조사하여 스캐닝한다(스텝 S204). 스캐닝 공정에 있어서는, 형광 마크를 여기하는데 적합한 파장의 레이저광을 DNA 칩에 조사하고, 각 DNA 프로브에 각각 결부된(하이브리다이즈된) DNA 샘플로부터의 형광을 전기 신호로서 취득한다. 이에 따라, 스폿된 각 DNA 프로브(유전자)와 결합한 DNA 샘플에 부여된 형광 마크의 발광량이 측정되고, 그에 기초하여 해석 처리를 행하는 형광 화상 데이터를 얻을 수 있다.

해석 공정에 있어서는, 얻어진 형광 화상 데이터에 대하여 템플릿을 이용하여 각 스폿의 형광 강도를 산출하고, 각종 해석을 실행한다(스텝 S205).

여기서, 도 14에, DNA 칩 해석에 사용되는 DNA 칩(100)의 일례를 도시한다. 도 14에 도시하는 DNA 칩(100)은, 요철 형상을 갖는 직사각형의 판상을 이룬다. DNA 칩(100)은, 판면이 격자상으로 분할되어 이루어지는 복수의 블록(101)을 갖는다. 이 블록(101)의 상면에는 대략 원주상 또는 원추대상을 이루어 형성되며, 개개의 유전자에 대응하는 DNA 프로브를 복수 고정하고, 행 방향 및 열 방향으로 소정수 매트릭스상으로 배열된 복수의 스폿(102)이 형성되어 있다. 또한, 복수의 블록(101)은, 각주상으로 절결되어 이루어지는 오목부(103)의 저부에 형성되어 있다. 또한, 스폿(102) 상에 배치되는 DNA 프로브는, 이미 그의 염기 서열이 해독되어 있는 서로 상이한 유전자에 각각 대응하는 것이며, 블록(101) 상에 있어서의 그의 배치 위치는 미리 정해져 있다.

또한, 도 15에, DNA 칩의 형광 화상 데이터에 대하여 적용되는 템플릿의 일례를 도시한다. 도 15에 도시한 바와 같이, 템플릿은 복수(예를 들어, 도 15에서는 32개)의 블록(블록(101)에 대응)으로 분할되어 있으며, 각 블록 내에 있어서는 m행 n열(도 15에서는 22×22)의 매트릭스상으로 배치된 검출 에어리어(DNA 칩(100)의 개개의 스폿(102)에 대응함)가 형성되어 있다.

상기한 해석 공정에 있어서는, 판독한 DNA 칩의 형광 화상 데이터 중의 개개의 스폿(102)에, 해석 툴이 제공하는 템플릿의 검출 에어리어를 적용시키고(얼라인먼트), 당해 검출 에어리어에 있어서 각 스폿(102)의 형광 강도를 산출한다. 이때, 정확한 해석을 실행하기 위해서는 화상 상의 개개의 스폿(102)에 대하여 템플릿의 개개의 검출 에어리어가 정확하게 설정되도록, 얼라인먼트 처리가 정확하게 실행될 필요가 있다.

이 얼라인먼트의 방법으로서는, 블록 단위로 얼라인먼트를 행하는 패턴 매칭법이나 투영법 등이 있다. 그리고, 특허문헌 1이 개시하는 기술과 같이, 포지티브 컨트롤이라 불리는 형광 물질이나 어떤 검체에도 포함되어 있는 하우스키핑 유전자를 스폿한 칩을 사용하여, 얼라인먼트를 정확하게 행하고자 하는 시도도 이루어지고 있다.

나아가, 특허문헌 2가 개시하는 기술과 같이, 기판으로부터의 반사광이나 산란광으로 요철 형상을 화상화하고, 이 화상으로부터 얼라인먼트를 행하는 방법도 고안되어 있다.

일본 특허 공개 제2005-172840호 공보 일본 특허 공개 제2005-24532호 공보

그러나, 블록 단위로 얼라인먼트를 행하는 전형적인 패턴 매칭법이나 투영법은, 모두 하이브리다이즈한 샘플 DNA의 양이 많아, 각 블록(101)에서 충분한 강도의 형광을 발하는 스폿(102)이 1/4부터 반수 정도 존재하지 않으면, 정확하게 얼라인먼트할 수 없다. 그 때문에, 검체로부터 추출한 샘플 중에 포함되는 DNA량이 적은 경우, 얼라인먼트를 정상적으로 행할 수 없는 경우가 있다.

한편, 형광 물질을 스폿하여 배치하는 방법에서는, 충분한 강도의 형광을 발하는 스폿이 적어도 얼라인먼트를 행할 수 있다는 이점이 있지만, 스폿(102) 상에 배치 가능한 DNA수가 감소하고, 칩 제조시에 있어서의 비용 상승 등의 문제가 있다. 또한, 형광 물질을 스폿한 경우, 하이브리다이제이션 중에 그것이 유리되고, 포지티브 컨트롤의 주변을 오염시켜, 데이터를 얻지 못할 우려도 있다.

본 발명은, 상기에 감안하여 이루어진 것이며, 기판의 높이의 차이를 정확하게 검출 가능한 화상을 취득하는 것이 가능한 검출 방법, 마이크로어레이의 해석 방법 및 형광 판독 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상술한 과제를 해결하고, 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 관한 검출 방법은, 렌즈에 의해 집광된 레이저광을 요철 형상을 갖는 기판에 조사하고, 상기 기판으로부터의 반사광 및/또는 산란광의 광 강도를 화상 데이터로서 취득하여 상기 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출 방법이며, 상기 렌즈의 초점 위치보다도 상기 렌즈에 가까운 위치에 상기 기판의 광조사면을 배치하고, 상기 광조사면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 검출광으로서 수광하여, 상기 수광한 광의 강도의 변화에 기초하여 상기 기판의 높이의 차이를 검출하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 검출 방법은, 상기한 발명에 있어서, 상기 기판의 광조사면을 상기 초점 위치에 배치한 경우에, 상기 광조사면으로부터의 정반사광을 상기 검출광으로부터 분리하는 광학계를 사용하여 상기 기판의 높이의 검출을 행하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 검출 방법은, 상기한 발명에 있어서, 상기 렌즈의 초점 거리를 f, 상기 기판을 상기 초점 위치로부터 상기 렌즈에 접근시키는 거리를 α로 했을 때, α/f가 소정의 범위 내가 되도록 설정되는 α에 따른 위치에 상기 기판의 광조사면을 배치하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 마이크로어레이의 해석 방법은, 요철 형상이 형성되며, 각각 형광 표지된 샘플과 결합 가능한 복수의 프로브가 배치된 마이크로어레이에 대하여, 대물 렌즈를 통하여 상기 형광 표지의 여기 파장을 포함하는 광을 조사하고, 또한 상기 마이크로어레이로부터의 광을 수광하여, 상기 수광한 광에 기초한 화상을 바탕으로 상기 마이크로어레이의 해석을 행하는 마이크로어레이의 해석 방법이며, 상기 형광 표지로부터의 형광을 검출하여 형광 화상 데이터를 취득하는 형광 화상 데이터 취득 스텝과, 상기 마이크로어레이의 표면으로부터의 광을 검출하여, 상기 형광 화상 데이터의 얼라인먼트를 행하는 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 얼라인먼트용 화상 데이터 취득 스텝과, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터의 광 강도의 변화를 바탕으로 상기 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출 스텝과, 상기 검출 스텝에 의해 검출된 상기 요철 형상의 높이의 차이에 기초하여 상기 형광 화상 데이터를 보정하는 보정 스텝과, 상기 보정 스텝에 의해 보정된 상기 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정하는 위치 결정 스텝을 포함하고, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터 취득 스텝은, 상기 마이크로어레이의 표면을, 상기 대물 렌즈의 초점 위치에 대하여 상기 대물 렌즈에 가까운 위치에 배치한 상태에서, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 마이크로어레이의 해석 방법은, 상기한 발명에 있어서, 상기 검출 스텝은, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터에서 상기 광 강도의 변화에 기초하여 3개 이상의 기준점을 검출하고, 상기 보정 스텝은, 검출한 기준점을 기초로 상기 형광 화상 데이터의 왜곡을 보정하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 마이크로어레이의 해석 방법은, 상기한 발명에 있어서, 상기 보정 스텝은, 상기 기준점에 기초한 상기 얼라인먼트용 화상 데이터의 경사 각도 θx, θy를 취득하여, 상기 경사 각도 θx, θy 및 하기 수학식 (1), (2)를 바탕으로 상기 형광 화상 데이터의 전단 변형 왜곡을 보정하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 마이크로어레이의 해석 방법은, 상기한 발명에 있어서, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터 취득 스텝은, 상기 대물 렌즈의 초점 거리를 f, 상기 마이크로어레이를 상기 초점 위치로부터 상기 대물 렌즈에 접근시키는 거리를 α로 했을 때, α/f가 소정의 범위 내가 되도록 설정되는 α에 따른 위치에 상기 마이크로어레이의 표면을 배치하여 상기 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 마이크로어레이의 해석 방법은, 상기한 발명에 있어서, 상기 마이크로어레이는 DNA 마이크로어레이인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 형광 판독 장치는, 요철 형상이 형성되며, 각각 형광 표지된 샘플과 결합 가능한 복수의 프로브가 배치된 기판으로부터, 상기 형광 표지의 형광을 포함하는 광을 수광하여, 상기 수광한 광에 기초한 화상 데이터를 취득하는 형광 판독 장치이며, 적어도 소정 파장의 여기광을 포함하는 조명광을 출사하는 광원과, 상기 조명광을 상기 기판에 조사함과 함께, 상기 조명광이 조사된 상기 기판의 표면으로부터의 광을 수광하는 대물 렌즈와, 상기 대물 렌즈가 수광한 광을 검출하여, 상기 검출한 형광에 의한 형광 화상 데이터 및 상기 기판으로부터의 광에 의한 기판 화상 데이터를 취득하는 화상 취득부와, 화상 취득부에 의해 취득된 상기 기판 화상 데이터를 바탕으로 상기 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출부와, 상기 검출부에 의해 검출된 상기 요철 형상의 높이의 차이를 바탕으로 상기 형광 화상 데이터를 보정하는 보정부와, 상기 기판을 유지하는 유지 수단과, 상기 유지 수단을 상기 대물 렌즈의 광축에 따라 이동시키는 구동부를 구비하고, 상기 구동부는, 상기 화상 취득부에 의해 상기 기판 화상 데이터를 취득할 때, 상기 대물 렌즈의 초점 위치에 대하여, 상기 대물 렌즈에 가까운 위치에 상기 기판을 배치하도록 상기 유지 수단을 이동시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 관한 형광 판독 장치는, 상기한 발명에 있어서, 상기 구동부는, 상기 대물 렌즈의 초점 거리를 f, 상기 마이크로어레이를 상기 초점 위치로부터 상기 대물 렌즈에 접근시키는 거리를 α로 했을 때, α/f가 소정의 범위 내가 되도록 설정되는 α에 따른 위치에 상기 기판을 배치하도록 상기 유지 수단을 이동시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 기판의 높이의 차이를 정확하게 검출 가능한 화상을 취득함으로써, 포지티브 컨트롤을 배치하지 않은 DNA 칩의 해석이나, 샘플에 포함되는 DNA량이 적은 칩의 해석의 경우에도, 얼라인먼트 처리를 적절하게 행할 수 있으며, 해석이 가능해진다.

도 1은, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너의 광학계의 일례를 도시하는 모식도이다.
도 2는, 본 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상의 일례를 모식적으로 도시하는 도면이다.
도 3은, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너의 광학계의 주요부의 구성을 도시하는 모식도이다.
도 4a는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너의 광학계의 주요부의 구성을 도시하는 모식도이다.
도 4b는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너의 광학계의 주요부의 구성을 도시하는 모식도이다.
도 5a는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 설명하는 도면이다.
도 5b는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 설명하는 도면이다.
도 5c는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 설명하는 도면이다.
도 6은, 본 발명의 실시 형태에 관한 화상의 얼라인먼트 처리를 도시하는 흐름도이다.
도 7은, 본 발명의 실시 형태에 관한 얼라인먼트용 화상 데이터의 네 코너의 좌표의 검출 방법을 설명하는 모식도이다.
도 8은, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 도시하는 모식도이다.
도 9a는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 설명하는 도면이다.
도 9b는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 설명하는 도면이다.
도 9c는, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 DNA 칩의 화상을 설명하는 도면이다.
도 10은, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너의 광학계의 다른 예를 도시하는 모식도이다.
도 11aa는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11ab는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ba는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11bb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ca는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11cb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11da는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11db는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ea는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11eb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11fa는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11fb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ga는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11gb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ha는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11hb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ia는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11ib는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ja는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11jb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11ka는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11kb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 11la는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩의 화상을 도시하는 도면이다.
도 11lb는, 본 발명의 실시예에 관한 DNA 칩에 있어서의 광 강도 변화의 그래프이다.
도 12a는, 본 발명의 실시예에 관한 슬라이드 글라스의 화상을 도시하는 도면이다.
도 12b는, 도 12a의 화상에 있어서의 화살표 P₁₃-P₁₃'간에서의 광 강도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12c는, 도 12a의 화상에 있어서의 화살표 P₁₃-P₁₃'간에서의 슬라이드 글라스 상의 높이의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 13은, 종래의 DNA 칩 해석의 일련의 처리 공정의 상세를 도시하는 흐름도이다.
도 14는, 종래의 DNA 칩 해석에 사용되는 DNA 칩의 일례를 도시하는 모식도다.
도 15는, 종래의 DNA 칩의 형광 화상 데이터에 대하여 적용되는 템플릿의 일례를 도시하는 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 상세하게 설명한다. 또한, 이하의 실시 형태에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 설명에서 참조하는 각 도면은, 본 발명의 내용을 이해할 수 있을 수 있을 정도로 형상, 크기 및 위치 관계를 개략적으로 나타내고 있는 것에 지나지 않다. 따라서, 본 발명은 각 도면에서 예시된 형상, 크기 및 위치 관계만으로 한정되는 것은 아니다.

일반적으로 마이크로어레이의 형광 판독 장치(스캐너)는, 여기 파장의 광 빔 및/또는 마이크로어레이를 일차원적 또는 이차원적으로 주사하여, 기판 상의 검체로부터의 형광을 검출하고, 그의 데이터를 화상화하여, 이 화상을 바탕으로 각 프로브(샘플에 표지된 형광 표지)로부터의 형광량을 구한다. 본 발명에서 사용하는 스캐너의 바람직한 광학계를 도 1에 도시한다. 도 1은, 본 발명의 실시 형태에 관한 스캐너의 광학계의 일례를 도시하는 모식도이다.

예를 들어 도 1에 도시하는 스캐너(1)는, 레이저 광원, 대물 광학계, 광학 필터, 형광 화상 데이터 및 얼라인먼트용 화상 데이터(기판 화상 데이터)를 취득하는 화상 취득부 등으로 구성되며, 스캐너(1)는 상술한 DNA 칩(100)(마이크로어레이)을 2 방향으로 주사하기 위한 주사 기구(도시하지 않았으며, 또한 본 명세서에서는 DNA 칩(100)의 주요면에서, 기판의 길이 방향을 y축, 그에 직교하는 방향을 x축으로 함)와, DNA 칩(100)을 복수 적재하는 오토 로더 기구(도시 생략)를 갖는다.

구체적으로, 스캐너(1)는, 각각 특정 파장의 여기광을 적어도 포함하는 조명광을 기판 표면에 출사하는 레이저 광원(11, 12)과, 상기 여기광을 수광한 프로브로부터의 형광을 평행광으로 하는 대물 렌즈(13)와, 레이저 광원(11, 12) 및 대물 렌즈(13) 사이에 설치되어, 레이저 광원(11, 12)으로부터 각각 출사된 조명광으로 광로(N1) 상을 진행하는 조명광을 대물 렌즈(13)측으로 통과시키는 구멍(140)이 형성됨과 함께, DNA 칩(100)으로부터 발해진 광의 적어도 일부를 광로(N2)측으로 절곡하는 천공 미러(14)와, 레이저 광원(11)으로부터 발해진 여기광에 따른 파장의 광을 커트하면서 DNA 프로브와 하이브리다이즈한 샘플로부터의 형광에 따른 파장의 광만을 투과시키는 여기광 커트 필터(15a) 및 레이저 광원(12)으로부터 발해진 여기광에 따른 파장의 광을 커트하면서, DNA 프로브와 하이브리다이즈한 샘플로부터의 형광에 따른 파장의 광만을 투과시키는 여기광 커트 필터(15b)를 갖는 커트 필터(15)와, DNA 프로브와 하이브리다이즈한 샘플로부터의 형광을 결상하는 결상 렌즈(16)와, DNA 프로브와 하이브리다이즈한 샘플로부터의 형광을 수광함으로써 형광 화상 데이터를 취득함과 함께, 기판 표면으로부터의 반사광을 수광하고, 그의 수광 강도로부터 DNA 칩(100)의 블록(101) 표면의 요철 형상을 검출 가능한 얼라인먼트용 화상 데이터로서 취득하는 화상 취득부(17)를 구비하고 있다. 또한, 여기광 커트 필터(15a, 15b)(커트 필터(15))는, 천공 미러(14)와 화상 취득부(17)를 연결하는 광로(N2)에 대하여 삽입 분리 가능하게 설치된다.

천공 미러(14)는, 여기광을 DNA 칩(100)(대물 렌즈(13))에 입사시키기 위한 구멍(140)이 통상 중앙에 설치되어 있다. 또한, 천공 미러(14)의 구멍(140)은, 도 1에 도시한 바와 같이, 광 판독시에 노이즈가 되는 기판으로부터의 정반사광을 화상 취득부(17)측으로 유도하지 않도록, 형광 또는 여기광의 반사광(검출광)과, 기판으로부터의 정반사광을 기하학적으로 분리하는 기능을 갖는다.

또한, 도 1에 도시하는 형태에 있어서는, 장치를 작게 하기 위해, 레이저 광원(11, 12)으로부터의 여기광을 미러(18, 19)에 의해 굴절시켜 DNA 칩(100)에 도달시킨다.

또한, 주사 기구의 기준축은, 왜곡이 없는 화상을 얻기 위해 직교하고 있는 것이 바람직하다. 주사 기구로서는, 일반적으로 2축 모두 슬라이더를 사용하는 것이 바람직하다.

또한 본 실시 형태에서는, 스캐너(1) 전체의 제어를 행하는 제어부(20)와, DNA 칩(100)을 유지하는 유지부(104)(유지 수단)를, DNA 칩(100)(블록(101))의 주요면이 대물 렌즈(13)의 광축과 평행한 광로(N1)에 따르도록 이동시키는 제어를 행하는 구동부(21)를 구비한다. 구동부(21)의 제어에 의해, DNA 칩(100)은 대물 렌즈(13)에 대하여 근접 또는 이격된다.

또한, 제어부(20)는, DNA 칩(100)의 표면에서의 요철 형상의 높이의 차이(이하, 높이의 차이라고 함)를 검출하는 검출부(20a)와, 검출부(20a)가 검출한 높이의 차이를 바탕으로 화상 취득부(17)가 취득한 화상을 보정하는 보정부(20b)와, 보정부(20b)가 보정한 화상에 기초하여, 미리 기록되어 있는 해석 정의 파일을 참조하여 DNA 칩(100)의 스폿(102)의 위치를 결정하는 결정부(20c)를 갖는다.

본 실시 형태에서는 샘플에 2종의 형광 마크를 붙이고, 그것들의 판독을 행하는 장치로 했기 때문에, 당해 2종의 형광 마크에 대응한 파장의 광을 출사하는 레이저 광원(11, 12)과, 출사되는 여기광의 파장에 각각 대응한 여기광 커트 필터(15a, 15b)를 구비하고 있다. 그러나, 샘플에 1종만의 형광 마크를 붙이고, 그의 판독을 행하는 장치로 할 수도 있으며, 3종 이상의 형광 마크를 붙이고, 그것들의 판독을 행하는 장치로 할 수도 있다. 어떠한 경우에도, 사용하는 형광 마크(형광 색소)에 대응한 레이저 광원과 여기광 커트 필터를 설치할 수 있다.

이어서 스캐너(1)에서의 형광 화상 데이터의 취득 방법에 대하여 설명한다. 우선, 도 1을 사용하여 형광 화상 데이터의 취득 방법에 대하여 설명한다. 또한, 이하에서는 형광 색소로서 Cy5, Cy3을 사용한 형태를 설명하지만, 샘플을 표지하기 위한 형광 색소는 어느 하나일 수도 있고, 또한 이들로 한정되는 것은 아니다. 형광 색소로서는 예를 들어, 플루오레세인(Fluorescein), FITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 555, 로다민(Rhodamine), Cy3.5, 텍사스 레드(Texas Red), TAMRA, 오이스터(Oyster) 650, Cy5.5 등을 사용할 수 있다.

예를 들어, 최초로 형광 색소 Cy5를 판독하기 위해, Cy5용의 레이저 광원(11)(예를 들어 파장 635nm의 광을 발하는 레이저 광원)으로부터 레이저광(즉 형광 색소 Cy5의 여기광)을 조사한다. 레이저광은, 천공 미러(14) 및 대물 렌즈(13)를 통하여 DNA 칩(100)에 조사된다. 조사된 레이저광에 의해 여기 발광한 형광 분자로부터의 형광 및 칩 표면에서 반사 및/또는 산란한 레이저광은, 대물 렌즈(13)에서 서로 대략 평행광이 되어, 광로(N1)에서 도면 중 화살표 방향으로 진행한다.

그 후, 형광 및 레이저광은, 천공 미러(14)에서 반사되어 광로(N2) 상을 진행하고, 광로(N2) 상에 배치된 Cy5용의 여기광 커트 필터(15a)에 입사한다. 또한, DNA 칩(100)의 표면에서 정반사된 레이저광은, 천공 미러(14)의 구멍(140)을 통과한다. 여기 발광한 형광 분자로부터의 형광은, 이 여기광 커트 필터(15a)를 투과하고, 결상 렌즈(16)에서 집광된다.

한편, 여기광 커트 필터(15a)에 도달한 여기광(칩 표면에서 반사 및/또는 산란한 광)은 커트된다. 결상 렌즈(16)에서 집광된 형광은, 화상 취득부(17)에 입사한다. 화상 취득부(17)는, 수광한 광 데이터에 대하여 광전 변환 처리를 실시하여, 광의 강약에 따른 전기 신호(아날로그 신호)를 출력한다. 이러한 공정을, DNA 칩(100)을 2 방향으로 주사시켜 반복하면서, 화상 취득부(17)로부터 출력된 전기 신호를 A/D 변환하여 형광 화상 데이터를 작성한다.

이어서, 형광 색소 Cy3의 로딩을 행한다. 형광 색소 Cy3의 로딩은, Cy5용의 레이저 광원(11)을 Cy3용의 레이저 광원(12)(예를 들어 레이저 파장 532nm의 광을 발하는 레이저 광원)으로 치환함과 함께, Cy5용의 여기광 커트 필터(15a)를 Cy3용의 여기광 커트 필터(15b)로 치환하는 것 이외에는, 형광 색소 Cy5의 로딩과 마찬가지로 행할 수 있다. 즉, Cy3용의 레이저 광원(12)으로부터 레이저광(즉 형광 색소 Cy3의 여기광)을 조사함과 함께, Cy3용의 여기광 커트 필터(15b)로 상기 여기광 커트 필터(15b)에 도달한 여기광(즉 칩 표면에서 반사 및/또는 산란한 광)을 제거함으로써, 형광 색소 Cy5와 마찬가지로 형광 화상 데이터를 작성한다.

도 2는, 본 실시 형태에 관한 스캐너(1)에서 판독한 DNA 칩(100)의 화상의 일례를 모식적으로 도시하는 도면이다. 여기서, 스캐너의 주사 기구가 2개의 슬라이더를 구비한 것인 경우, 이들 슬라이더가 반드시 직교하고 있다고는 할 수 없다. 장치 조립시, 또는 시간의 경과 등에 따라 어긋나는 경우가 있다. 그 때문에, 스캐너(1)에서 판독한 DNA 칩(100)의 화상도, 예를 들어 도 2(a)에 도시한 바와 같이 x축에 대하여 기울어져 있을 가능성이 있다. 이와 같이, 취득한 화상에서의 주사 기구의 주사 방향이 x축 및/또는 y축과 일치하지 않는 경우에는 얻어진 형광 화상 데이터가 왜곡되어, 템플릿의 검출 에어리어를 얻어진 화상에 정확하게 위치 정렬할 수 없다. 또한, 슬라이더의 x축, y축이 기계적으로 직교하고 있었던 경우에도, 형광 화상의 x축, y축과, 슬라이더의 축이 직교하고 있지 않기 때문에, DNA 칩(100)을 세팅했을 때에 회전하여, 결과적으로 형광 화상이 회전하고 있는 경우도 있다. 이들 경우도, 템플릿의 검출 에어리어를 얻어진 화상에 정확하게 위치 정렬할 수 없다.

이 때문에, 화상으로부터 직교도의 어긋남을 검출하여, 슬라이더가 직교하는 주사 기구에서 얻어지는 화상과 동등해지도록 보정하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 형광 화상 데이터를 x축에 대하여 y축 방향으로 투영하고, 좌표 X마다의 적산 강도(각 화소값의 적산값)를 산출한다. 이 처리를, 좌표 원점 주위에 형광 화상 데이터를 미리 설정한 각도씩 회전시켜 반복한다. 예를 들어, 투영 방향과 스폿의 y축 방향의 배열 방향이 어긋나 있는 경우의 적산 강도 그래프는, 도 2(b)에 도시한 바와 같이 진폭이 작은 그래프가 된다.

한편, 투영 방향과 스폿의 y축 방향의 배열 방향이 일치한 경우의 적산 강도 그래프는, 도 2(c)에 도시한 바와 같이, 일정한 간격으로 진폭에 변화가 발생하여, 신호의 진폭이 최대가 된다. 투영 데이터의 이러한 특징을 이용하여, 적산 강도의 표준 편차가 최댓값을 취하는 각도를 구함으로써, 스폿(102)의 y축에 대한 서열의 각도를 검출할 수 있다. 마찬가지로 x축에 대한 서열의 각도를 구하고, 전단 변형 등의 화상 처리를 실시함으로써 스폿의 배열 방향을 직교시키는 것이 가능하다.

이상과 같이 하여 형광 화상 데이터를 취득하는 경우, 검체가 매우 적으면, 형광 색소 Cy5, Cy3 모두 형광을 발하는 DNA 프로브(DNA 샘플과 하이브리다이즈한 DNA 프로브)수가 적어지기 때문에 블록의 경계를 알 수 없고, 또한 화상의 직교도 보정도 할 수 없기 때문에, 얼라인먼트 처리가 불가능해진다.

따라서, 본 발명에 있어서는, 상기와 같은 형광 화상 데이터 이외에 DNA 칩(100)을 재세팅하지 않고, 얼라인먼트용 화상 데이터도 취득한다. 얼라인먼트용 화상 데이터의 취득시에는, 대물 렌즈(13)에서 레이저광이 집광된 초점 위치보다도 DNA 칩(100)을 대물 렌즈(13)측에 접근시켜 설치하여, 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 것이 바람직하다. 도 3은, 본 실시 형태에 관한 스캐너(1)의 광학계의 주요부의 구성을 도시하는 모식도이다. 도 4a, 4b는, 본 실시 형태에 관한 스캐너(1)의 광학계의 주요부의 구성을 도시하는 모식도이며, 도 4a는 DNA 칩(100)의 오목부(103)에서 경사를 갖는 경우를 도시하는 도면이고, 도 4b는 DNA 칩(100)의 오목부(103)에서 경사를 갖지 않는 경우를 도시하는 도면이다.

도 3은, 입사광이 천공 미러(14)를 통해 DNA 칩(100)의 블록(101)의 표면(광조사면)에 입사되는 모습을 나타내고 있다. 입사광은 레이저광으로 대표되는 평행광이다. 입사광이 대물 렌즈(13)에서 집광된 초점 위치(저스트 포커스 위치, 표면 위치 P0)에 블록(101)의 표면이 있다고 가정한 경우, 그의 정반사광은 대물 렌즈(13)에서 집광되어, 이상적으로는 입사광과 동일한 직경이 되고, 대부분의 정반사광은 천공 미러(14)의 구멍(140)을 통과하여, 화상 취득부(17)측에는 거의 유도되지 않는다(도 3 중 실선 화살표 Y1). 단, 대물 렌즈(13)의 수차(구면 수차, 코마 수차, 비점 수차 등)에 의해, 일부의 반사광이 천공 미러(14)에서 반사되어, 화상 취득부(17)로 유도되지만 그의 강도는 작다.

한편, 초점 위치보다도 먼 위치(표면 위치 P1)에 DNA 칩(100)의 블록(101)의 표면이 있는 경우, 그의 표면으로부터의 정반사광은, 대물 렌즈(13)로부터 보면, 초점 위치(표면 위치 P0)보다도 먼 부분으로부터 발해진 점광원으로 간주된다. 그 때문에, 그의 반사광은 대물 렌즈의 입사광측에서 초점을 연결한다(도 3 중 일점쇄선 화살표 Y2). 따라서, 천공 미러(14)의 위치에서, 광의 직경이 표면 위치 P0에서의 표면으로부터의 광의 직경과 비교하여 작아진다. 따라서, 대부분의 정반사광은 천공 미러(14)의 구멍(140)을 통과하기 때문에, 화상 취득부(17)측으로 유도되지 않고 더 어두워진다.

이러한 이유에 의해, DNA 칩(100)의 반사광을 화상화하면, 예를 들어 블록(101)의 상면(대물 렌즈에 가까운 부분)이 밝고, 오목부(103)의 저부(대물 렌즈로부터 먼 부분)가 어두운 화상을 얻을 수 있다.

그러나, DNA 칩(100)의 표면에 미세한 흠집이나 부착물이 있는 경우, 그곳에서 난반사가 발생한다. 이 난반사의 광로를 도 3의 파선 화살표 Y3으로 나타낸다. 이 난반사된 광은 천공 미러(14)에서 반사되어, 화상 취득부(17)측으로 들어간다. 이 때문에, DNA 칩(100)의 표면에 미세한 흠집이나 부착물이 있는 경우, 난반사에 의한 화상 혼란이 발생하여, 기판의 요철을 화상화할 수 없는 경우가 발생한다. 특히 기판이 수지제인 경우, 금형에 의한 성형으로 제작하는 경우가 많지만, 가공 공구에 의한 금형의 절삭 자국이 그대로 기판에 전사되어, 난반사에 의한 화상 혼란이 발생하는 경우가 많다.

이상의 문제를 해소하기 위해, DNA 칩(100)의 촬상 대상 표면을 초점 위치(표면 위치 P0)보다도 대물 렌즈(13)에 접근시킨 위치(표면 위치 P2)에서 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득한다. 그렇게 하면, 도 3의 점선 화살표 Y4로 나타낸 바와 같이, 정반사광은 대물 렌즈(13)로부터 보아 초점 거리보다도 가까운 부분으로부터 발하는 점광원으로 간주되기 때문에, 대물 렌즈(13)를 통과하여도 발산하고, 천공 미러(14)에서 화상 취득부(17)측으로 반사된다. 이 때문에, 난반사광(예를 들어, 파선 화살표 Y3)의 영향이 적어지고, 기판의 단차(에지) 부분만이 어두워진다.

촬상 대상 표면의 표면 위치 P2는, 대물 렌즈(13)의 초점 거리 f와, DNA 칩(100)을 초점 위치(표면 P0)로부터 대물 렌즈(13)에 접근시키는 거리 α의 관계 α/f를 사용하여 설정되는 것이 바람직하다. 이 α/f의 바람직한 범위는 0.017 내지 0.17이고, 더욱 바람직하게는 0.033 내지 0.17이다. 구동부(21)는, 제어부(20)의 제어하, 설정된 α의 위치에 DNA 칩(100)의 촬상 대상면이 배치되도록 유지부(104)를 이동하는 제어를 행한다.

여기서, 도 4a에 도시한 바와 같이, DNA 칩(100)의 오목부(103)의 측면이 각도 θ로 경사져 있는 경우, 그의 반사광은 다른 방향을 향한다. 또한, 오목부(103)의 측면이 수직(각도 θ=90도)으로 솟아 있는 경우(도 4b), 렌즈로 복귀되는 반사광은 2회 반사가 된다. 2회 반사이면 매우 광이 약해진다(통상, 투명체의 반사율은 4％ 정도이기 때문에, 2회 반사의 광량은 1회 반사에 대하여 1/25의 강도가 됨). 그 때문에 기판의 단차 부분이 어두워진다.

오목부(103)의 각도 θ의 바람직한 범위는, 20도부터 90도이다. 90도보다 크면 기판의 제작이 곤란하며, 20도 미만이면 단차 부분을 화상 데이터에서 인식할 수 없는 경우가 있다. 도 14와 같은 DNA 칩(100)은, 생산성의 관점에서 수지를 사출 성형함으로써 제작하는 것이 바람직하다. 이 경우, 성형의 용이함(금형으로부터의 빼냄 용이함)이라는 점에서, 각도 θ는 20도부터 80도인 것이 더욱 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어진 얼라인먼트용 화상의 예를 도 5a 내지 5c에 도시한다. 도 5a 내지 5c는, 본 실시 형태에 관한 스캐너로 판독한 마이크로어레이의 화상을 설명하는 도면이다. 도 5a는, 얼라인먼트용 화상을 도시하는 도면이다. 도 5b는, 도 5a의 얼라인먼트용 화상에 있어서의 화살표 P-P'간에서의 광 강도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5c는, 도 5a의 얼라인먼트용 화상에 있어서의 화살표 P-P'간에서의 DNA 칩(100)의 높이의 차이를 나타내는 그래프다. 도 5b로부터, DNA 칩(100)의 오목부(103)의 측면에 대응하는 위치에서 반사광량이 줄어들어 있으며, 기판 상의 요철 형상을 화상화할 수 있는 것을 확인할 수 있다. 이것을 바탕으로 얼라인먼트용 화상 중의 DNA 칩(100)의 오목부(103)의 위치를 판단하여, 형광 화상을 얼라인먼트하는 것이 가능해진다.

얼라인먼트용 화상 데이터 취득용의 광원에 대해서는, 바람직하게는 레이저 광원(예를 들어 파장 405nm, 532nm, 635nm)을 사용할 수 있다. 레이저 광원의 경우에는 평행광이기 때문에, 도 3에서 설명한 현상에 의해 얼라인먼트용 화상 데이터에서 에지(광 강도차)를 명확하게 검출 가능하다.

여기서, 구체적으로 상기한 장치 구성에 있어서 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하기 위해서는, Cy5용의 레이저 광원(11)으로부터 레이저광을 조사함과 함께, Cy3용의 여기광 커트 필터(15b)를 사용하는 것이 바람직하다. Cy3용의 여기광 커트 필터(15b)에는 일반적으로 550 내지 600nm를 투과하는 대역 통과 필터를 사용하는 경우가 많지만, 상기 여기광 커트 필터(15b)는, 일반적으로 Cy5의 여기광의 파장의 광(635nm)을 약간 투과하기 때문에(예를 들어, 635nm의 광의 OD값이 약 5), 도 5a에 도시한 바와 같이 DNA 칩(100)의 요철 형상을 화상화하는 것이 가능하다. 즉, 특정 파장의 광에 의해 여기 발광한 형광 분자로부터의 형광이 아닌, 기판 표면으로부터의 반사광이나 산란광을 수광하여, 상기 기판 그 자체의 요철 형상을 화상화할 수 있다.

얼라인먼트용 화상 데이터를 취득할 때에는, 초점 위치보다도 DNA 칩(100)을 대물 렌즈(13)에 가까운 장소에 배치하는 것이 바람직하다. 초점 위치는, 대물 렌즈(13)의 높이를 고정하여 DNA 칩(100)을 높이 방향(대물 렌즈(13)의 광축 방향)으로 변화시켜 각 DNA 프로브로부터의 형광량을 측정하고, 그의 값이 가장 커지는 높이를 실측함으로써 구할 수 있다. 반대로 DNA 칩(100)의 높이를 고정하고, 대물 렌즈(13)의 높이를 상하하는 것도 가능하다. DNA 칩(100)의 표면의 반사광이나 산란광을 수광할 때, 상술한 α/f의 관계에 기초하여, DNA 칩(100)의 표면(촬상 대상면)의 위치를 초점 위치로부터 100㎛ 이상 렌즈측에 접근시키는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 200㎛ 이상이다. 접근시키는 거리의 상한에 대해서는, DNA 칩(100)과 대물 렌즈(13)가 충돌하지 않는 정도이면 특별한 제한은 없지만, 스캐너(1)와 같은 장치에서는 통상 3000㎛ 이하이다. 얼라인먼트용 화상 데이터 취득용의 광원에 대해서는, 스캐너의 부품 개수를 적게 할 수 있기 때문에, 형광 분자를 여기하기 위한 여기광을 출사하는 광원을 사용하는 것이 바람직하지만, 별도로 얼라인먼트용 화상 데이터 취득용 광원을 설치하여도 상관없다.

또한, 얼라인먼트용 화상 데이터의 취득시에 필터를 사용하지 않는 방법도 채용할 수 있다. 그러나, 필터를 사용하지 않는 경우에는, 화상 취득부에 들어가는 광량이 지나치게 커지기 때문에 화상 취득부의 광 검출 기구를 손상시킬 가능성이 있다. 따라서, 상기한 바와 같이, Cy5용의 레이저 광원(11)으로부터 레이저광을 조사하는 경우에는 여기광 커트 필터(15b)를 사용하는 등, 조사하는 광원의 파장을 약간 투과하는 필터를 사용하는 것이 바람직하다. 반대로, Cy3용의 레이저 광원(12)으로부터 레이저광을 조사하여 여기광 커트 필터(15a)를 사용할 수도 있다. 또한, 여기광 커트 필터(15a, 15b) 대신에 ND 필터를 사용하거나, 여기광 커트 필터(15a, 15b)나 ND 필터를 사용하지 않고 레이저광의 출력 자체를 약하게 하여 얼라인먼트용 화상 데이터를 얻어도 상관없다. 물론, 이들의 조합도 적용할 수 있다.

또한, 도 5a 내지 5c에서는, 초점 위치로부터 기판(DNA 칩(100))을 250㎛ 렌즈측에 접근시켜 취득하였다. 이와 같이, 적극적으로 초점 위치로부터 기판을 렌즈측에 접근시키고, 레이저광의 반사광을 적극적으로 수광함으로써, 도 5a와 같은 기판 표면의 에지 형상이 나타난 얼라인먼트용 화상 데이터가 얻어진다.

이와 같이 하여 취득한 얼라인먼트용 화상 데이터를 사용하면, 기판의 에지(오목부(103)의 외연)를 정확하게 검출하는 것이 가능하다. 이하, DNA 칩(100)을 사용한 경우의 상기한 방법을 포함한 얼라인먼트의 구체적인 순서예를 기재한다. 도 6은, 본 실시 형태에 관한 화상의 얼라인먼트 처리를 도시하는 흐름도이다.

우선, 스캐너(1)에 DNA 칩(100)을 세팅하고, 상술한 바와 같이 화상 취득부(17)에 의해 형광 색소 Cy5 및 Cy3의 형광 화상 데이터를 로딩한다(스텝 S101). 이어서, DNA 칩(100)을 세팅한 채, Cy5용의 레이저 광원(11)으로부터 레이저광을 조사함과 함께, Cy3용의 여기광 커트 필터(15b)를 사용하여, 화상 취득부(17)에 의해 얼라인먼트용 화상 데이터를 로딩한다(스텝 S102). 이때, DNA 칩(100)은, 상술한 바와 같이 초점 위치보다도 대물 렌즈(13)에 가까운 위치에 배치된다. 또한, 스텝 S102에 있어서는, Cy3용의 레이저 광원(12)으로부터 레이저광을 조사함과 함께 Cy5용의 여기광 커트 필터(15a)를 사용할 수도 있다.

그리고, 스텝 S103 이후에, 얼라인먼트용 화상 데이터를 사용하여 형광 화상 데이터에서의 각 DNA 프로브의 위치를 결정하고, 해석한다.

구체적으로는, 우선, 얼라인먼트용 화상 데이터에서의 적어도 3개의 기준점을 검출한다(스텝 S103). 여기서, 적어도 3개의 기준점으로서는, 예를 들어 도 7에 도시한 바와 같이 얼라인먼트용 화상에서의 네 코너의 좌표를 들 수 있다. 이러한 네 코너의 좌표의 검출 방법은 검출부(20a)에 의해 행해지며, 명암 정보를 사용한 에지 검출에 의한 상술한 오목부(103)의 위치 판단을 들 수 있다.

도 7에 도시한 바와 같이, DNA 칩(100)에 있어서, 검출부(20a)에 의해 오목부(103)의 외연이 검출될 수 있는 영역 Ea1 내지 Ea4, Eb1 내지 Eb4를 미리 설정하고, 각각의 영역에서 도 5a에 도시한 바와 같은 화살표 P-P'간에서의 광 강도의 변화를 측정하여, DNA 칩(100)의 높이의 차이를 검출한다. 그 후, 검출부(20a)는, 각 영역 Ea1 내지 Ea4, Eb1 내지 Eb4에서 검출된 높이의 차이의 중심 위치를 사용하여, 영역 Ea1의 중심 위치와 영역 Ea2의 중심 위치를 직선적으로 연결하여 오목부(103)의 외연의 한 변으로 한다. 오목부(103)의 외연의 그 밖의 3 변에 대해서도, 영역 Ea3의 중심 위치 및 영역 Ea4의 중심 위치, 영역 Eb1의 중심 위치 및 영역 Eb2의 중심 위치, 영역 Eb3의 중심 위치 및 영역 Eb4의 중심 위치를 각각 직선적으로 연결한다. 이에 따라, 화상 취득부(17)에 의해 얻어진 얼라인먼트 화상에서의 오목부(103)의 외연을 형성한다. 또한, 각각 연결되어 형성된 직선끼리의 교점(좌표)을 구함으로써, 오목부(103)의 네 코너를 기준점(110a 내지 110d)으로 하여 얻을 수 있다.

이어서, 스텝 S104, S105에 있어서, 기준점에 기초하여 형광 화상 데이터의 왜곡을 보정한다.

구체적으로는, 보정부(20b)는, 예를 들어 상술한 기준점(110a 내지 110d)의 좌표로부터, 오목부(103)의 외연에서의 각 변의 x축에 대한 경사 각도 θx 및y축에 대한 경사 각도 θy를 검출한다(스텝 S104). 경사 각도 θx, θy는, 네 코너의 좌표를 연결한 4개의 선분에 대하여, 해당 방향의 (대향하는) 2개의 선분의 각도의 평균값을 취하는 것이 바람직하다. 또한, 기준점이 3점이어도, 경사 각도 θx, θy를 산출 가능하다. 그리고, 보정부(20b)는, 도 8 (a), (b)에 도시한 바와 같이, y축에 따른 변(오목부(103)의 외연의 변)의 y축에 대한 경사 각도 θy를 보정 각도로서 사용하고, 형광 화상 데이터를 회전시켜, 오목부(103)의 y축에 따른 변을 y축에 대하여 평행하게 한다. 또한, 보정부(20b)는, 도 8(b), (c)에 도시한 바와 같이, x축에 따른 변(오목부(103)의 외연의 변)의 x축에 대한 경사 각도 θx를 보정 각도로서 사용하여, 형광 화상 데이터를 회전시켜, 오목부(103)의 x축에 따른 변을 x축에 대하여 평행하게 한다. 변환 후에는 도 8(c)에 도시한 바와 같이, x축, y축에 대하여 외연이 각각 평행한 화상을 얻을 수 있다.

또한, 보정부(20b)는, 회전 후의 화상에 대하여, 상술한 바와 같이 검출한 2 방향으로 규칙적으로 배열되어 있는 스폿(102)에 대하여, 상술한 경사 각도 θx, θy 및 하기 수학식 (1), (2)에 기초하여 변환(전단 변형)을 실시한다(스텝 S105). 이에 따라, 화상의 전단 변형 왜곡을 보정한다. 여기서, 하기 수학식 (1)의 (x, y)는 변환 전의 좌표, (X, Y)는 변환 후의 좌표이다. 또한, 스캐너의 주사 기구의 어긋남(주사 기구의 기준축의 직교도)에 상당하는 θxy는, 하기 수학식 (1), (2)에 도시한 바와 같이 경사 각도 θx로부터 경사 각도 θy를 뺌으로써 구한다.

또한, DNA 칩(100)이 수지 성형품인 경우, 하이브리다이제이션 공정이나 세정 공정에서의 흡습이나 온도 변화에 따라 수지가 팽창하는 경우가 있다. 각 공정에서의 처리 시간에 따라 상이하지만, 몇십㎛ 팽창하는 경우가 있어, 얼라인먼트의 정밀도에 영향을 준다.

이 때문에, 보정부(20b)는, 예를 들어 상술한 네 코너의 좌표로부터 x축 방향 및 y축 방향의 칩 길이를 산출함과 함께, 설계값과 일치하도록 형광 화상 데이터에 대하여 수축 팽창 보정을 행한다(스텝 S106, S107).

이어서, 상기와 같이 하여, 보정부(20b)에 의해 각도 보정, 전단 변형 보정, 수축 팽창 보정이 실시된 형광 화상 데이터에 대하여, 결정부(20c)가 해석 정의 파일을 참조하여 형광 화상의 얼라인먼트를 행한다. 미리 해석 정의 파일에 보존되어 있는 템플릿에서의 각 스폿의 위치 정보는, 예를 들어 칩 좌측 상단의 코너(기준점(110a))를 원점으로 한, 각 스폿의 중심 좌표가 되어 있다. 이 때문에, 결정부(20c)는 스텝 S107에서 수축 보정한 후의 화상에 대하여, 예를 들어 좌측 상단 코너의 좌표를 원점으로 하여, 각 스폿 프레임을 계산함으로써 각 스폿(프로브)의 위치를 결정하고, 도 9a 내지 9c에 도시한 바와 같은 얼라인먼트를 행한다(스텝 S108). 또한, 도 9a이 Cy3의 형광 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한 결과를 도시하는 화상, 도 9b가 Cy5의 형광 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한 결과를 도시하는 화상이다. 이에 따라, 각 스폿(102)에 대하여, 각 스폿(102)에 따른 템플릿(도 15 참조)을 적용시켜, 검출 에어리어와 대응시킬 수 있다. 또한, 일례로서, 확인을 위해 얼라인먼트용 화상 데이터에 대하여 얼라인먼트를 행한 결과를 도 9c에 도시한다. 도 9c에 도시한 바와 같이, 얼라인먼트 처리에 의해, DNA 칩(100)의 오목부(103)의 외연의 1각에서의 직선 부분이 기준점(1101)에서 직교하고 있는 것을 알 수 있었다.

그 후, 스텝 S108에서 구한 각 스폿의 중심 좌표로부터, 스폿 반경 내의 화소의 신호 강도에 대하여 평균값, 중앙값, 표준 편차 등의 통계량을 산출하고, 스폿이 속하는 블록 번호, 스폿의 행렬 번호, 배치되어 있는 DNA 프로브명과 합하여, 각종 수치 데이터를 파일로서 출력한다(스텝 S109). 상술한 처리에 의해, 얻어진 형광 화상 데이터에 대하여 왜곡 등의 수정을 행하고, 평균값, 중앙값, 표준 편차 등의 정확한 통계량을 산출한다.

또한, 상기 스텝 S101, S102의 순서 및 스텝 S106, S107의 순서는 교체될 수도 있다.

본 발명에 있어서는, 이와 같이 하여 DNA 샘플의 DNA 프로브로의 하이브리다이즈에 기초하여 얻어진 형광 화상 데이터를 처리하여 원하는 수치 데이터를 취득하지만, 얻어지는 각종 수치 데이터는, 검체 내에서 구하는 유전자의 존재나, 어떤 유전자가 발현되어 있는지의 여부, 또는 어느 정도 발현되어 있는지를 해석하기 위해 등으로 사용된다.

또한, 이상과 같은 DNA 칩(100)의 해석에 있어서는, DNA 칩(100)에 형성된 요철을 이용하여 화상의 보정, 얼라인먼트를 행한다. 그 때문에, 검체로부터 추출한 샘플 중에 포함되는 DNA량이 적게 발광하는 DNA 프로브가 적은 화상, 나아가, 주사 기구의 정밀도가 나쁜 판독 장치에 의해 얻어진 화상에 대해서도, DNA 칩(100) 상에 배치된 검출 에어리어의 위치 결정 처리를 고정밀도로 실행 가능해진다.

상술한 실시 형태에 따르면, DNA 칩(100)의 촬상 대상 표면을 초점 위치(표면 위치 P0)보다도 대물 렌즈(13)에 접근시킨 위치(표면 위치 P2)에서 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하도록 했기 때문에, 기판의 높이의 차이를 정확하게 검출 가능한 화상을 취득할 수 있다. 이에 따라, 포지티브 컨트롤을 배치하지 않은 DNA 칩의 해석이나, 샘플에 포함되는 DNA량이 적은 칩의 해석의 경우에도, 얼라인먼트 처리를 적절하게 행할 수 있으며, 해석이 가능해진다.

여기서, 도 10에 본 발명에서 사용하는 스캐너에 적합한 광학계의 다른 형태를 도시한다. 또한, 도 10에 있어서, 도 1에 도시하는 스캐너(1)의 구성 요소와 동일한 것에는 동일한 부호가 부여되어 있다. 도 10에 도시하는 스캐너(2)는, 스캐너(1)의 천공 미러(14) 대신에 미소 미러(14a)를 사용함으로써, 미소 미러(14a)에서 여기광을 반사시켜 DNA 칩(100)에 입사시킴과 함께, 광 판독시, 노이즈가 되는 DNA 칩(100)으로부터의 정반사광을 화상 취득부(17)측으로 유도하지 않도록, 형광 또는 여기광의 반사광(검출광)과 정반사광을 기하학적으로 분리하는 기능을 갖는다. 이에 따라, 정반사광을 광로(N3)로부터 분리할 수 있다. 이 구성에 있어서도, 상술한 스캐너(1)와 마찬가지의 효과를 얻을 수 있다.

상기 실시 형태에 있어서는, 기판에 DNA 프로브가 스폿된 DNA 칩의 실시 형태를 설명했지만, 본 발명은 RNA, 단백질, 미소 표본, 저분자 화합물, 세포 등을 스폿한 칩에 대해서도 적용 가능하다.

예를 들어, 상기에서 설명한 요철 형상을 갖는 DNA 칩(100)에 있어서, DNA 프로브 대신에 단백질(항체)을 고정화하고, 검체와의 반응의 유무나 정량화를 형광으로 검출하는 경우에도 마찬가지의 방법을 사용할 수 있다. 시료 세포의 용해액에 존재하는 단백질을 Cy5, 컨트롤 세포 용해액에 존재하는 단백질을 Cy3으로 표지하여, 양자를 혼합하여 항체 어레이와 반응하는 경우나, 단백질을 형광 표지하는 대신에 비오틴 표지하고, 항체 어레이에 결합한 후, 효소 표지 아비딘을 사용하여 시그널을 증감하는 방법 등이 있다. 이러한 경우에도, 본 발명에 의해 고정밀도로 얼라인먼트가 가능해지고, 형광 강도의 각종 수치 데이터를 파일로서 출력 가능하다. RNA 어레이의 경우에도, 요철 형상을 갖는 기판(스폿(102)) 상에 고정화된 RNA와, 형광 표지한 DNA나 RNA와의 하이브리다이제이션을 형광으로 검출하는 경우에 본 방법을 사용할 수 있다. 미소 표본·세포 어레이에 있어서도, 요철 형상을 갖는 기판 상에 고정화된 미소 표본이나 세포와 형광 표지 검체(예를 들어 항체)의 결합 반응을 형광에 의해 검출할 때에 본 발명을 적응하는 것이 가능하다.

실시예

이하 실시예 등을 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

초정밀 기계 가공에 의해, 도 14에 도시하는 DNA 칩(100)과 같은 형상의 기판에 대응하는 금형을 제작하고, 이 금형을 사용하여 사출 성형에 의해 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트)를 포함하는 기판을 DNA 칩(100)으로서 제작하였다. 금형에는 공구에 의한 절삭 자국이 있으며, 그 때문에 기판에도 공구 절삭 자국이 전사되어 있는 상태였다. 절삭 자국에 의한 기판 높이의 혼란은 실측한 바, 1㎛ 이하였다.

제작한 DNA 칩(100)의 볼록부(스폿(102)) 상면에 DNA 프로브를 고정하고, 하이브리다이제이션까지 행하여, DNA 칩 스캐너(3D-진 스캐너(Gene Scanner)(3D-진(Gene)(등록 상표)))로 형광 화상 및 얼라인먼트용 화상의 취득을 행하였다. 형광 화상과 얼라인먼트용 화상의 취득에 관한 장치 구성 및 조건은 이하 (1) 내지 (4)와 같다.

(1) 스캐너의 광학계는, 도 1에 도시하는 스캐너(1)의 광학계를 사용하였다. 즉, DNA 칩(100)에 레이저광을 입사하고, 또한 기판으로부터의 정반사광을 통과하기 위한 천공 미러(14)를 갖고 있는 것이다.

(2) 스폿(102)으로부터의 형광 취득시에 DNA 칩(100)의 높이(대물 렌즈(13)와 DNA 칩(100)의 거리)를 변화시켜, 형광 강도가 가장 강해지는 높이 위치를 0으로 하였다. 이 위치가 레이저광의 초점 위치(표면 위치 P0)이다. 본 실시예에서는 Cy5로 표지화한 DNA 샘플을 사용하였기 때문에, 파장 635nm의 레이저와 Cy5용의 대역 통과 필터를 사용하였다. 또한, 본 스캐너에는, 기판과 렌즈의 거리를 조정할 수 있는 기능이 부여되어 있다.

(3) Cy5의 형광을 측정하는 레이저(파장 635nm)를 사용하고, 필터로서는 Cy3을 측정할 때에 사용하는 대역 통과 필터와 동일한 것을 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 Cy3용의 필터는 635nm에서 OD값이 약 5로, 약간 635nm의 파장을 투과한다. 레이저광과 필터의 조합을 상술한 조합으로 함으로써, 기판 표면으로부터의 반사·산란광을 취득하여 화상 데이터화가 가능하다.

(4) 오프셋 위치(초점 위치로부터 기판 표면까지의 거리)는 -500㎛로부터 +1500㎛까지 변화시키고, 반사·산란광의 화상 비교를 행하였다(도 3). 또한, 오프셋 위치가 0이란 표현은, 기판이 대물 렌즈에서 조여진 레이저광의 초점 위치(표면 위치 P0)에 있는 것을 나타낸다. 또한, 오프셋 위치의 부호가 마이너스인 경우에는, 초점 위치를 기준으로 하여 기판이 대물 렌즈로부터 먼 위치(표면 위치 P1)에 있으며, 부호가 플러스인 경우에는, 기판이 초점 위치를 기준으로 하여 대물 렌즈에 가까운 위치(표면 위치 P2)에 있는 것을 나타낸다.

도 11(도 11a 내지 도 11l)은, 본 발명의 실시예에 따른 스캐너(1)에서 판독한 DNA 칩(100)(기판)의 화상(A) 및 광 강도 변화의 그래프(B)이다. 여기서, 도 11a는, 오프셋 위치가 0인 경우의 화상, 및 화상 중의 화살표 P₁-P₁'간에서의 광 강도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11b 내지 도 11i는, 오프셋 위치가 +100, +200, +300, +400, +500, +750, +1000, +1500인 경우의 화상, 및 화상 중의 화살표 P₂-P₂'간, 화살표 P₃-P₃'간, 화살표 P₄-P₄'간, 화살표 P₅-P₅'간, 화살표 P₆-P₆'간, 화살표 P₇-P₇'간, 화살표 P₈-P₈'간, 화살표 P₉-P₉'간에서의 광 강도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11j 내지 도 11l은, 오프셋 위치가 -100, -200, -500인 경우의 화상 및 화상 중의 화살표 P₁₀-P₁₀'간, 화살표 P₁₁-P₁₁'간, 화살표 P₁₂-P₁₂'간에서의 광 강도 변화를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 11에 도시하는 화상은, 상술한 보정부(20b)에 의해 보정된 얼라인먼트용 화상 데이터에 따른 화상이다.

도 11에 도시한 바와 같이, 오프셋 위치가 +200㎛ 이상인 경우에는, 기판의 에지 부분(실제 높이의 차 90㎛, 도 4a에서 도시하는 경사 각도 θ는 70도)에 대응한 명확한 콘트라스트가 부여된 화상 및 광 강도 변화의 그래프가 얻어졌다(도 11ca, 11cb 내지 도 11ia, 11ib). 한편, 오프셋 위치가 0㎛이면, 절삭 자국에 의한 기판 표면의 거칠음(높이 1㎛ 이하)이 원인으로 난반사가 발생하여, 90㎛의 요철 형상과는 일치하지 않지만, 절삭 자국과 일치하는 반사 강도의 혼란을 발생하고 있었다(도 11ab). 오프셋 위치가 +100㎛인 경우에는, 0㎛와 비교하여 절삭 자국의 영향은 작아지지만, 그 영향은 남아있었다(도 11bb). 또한, 오프셋 위치가 -100㎛, -200㎛이면, 절삭 자국에 의한 기판 표면의 거칠음(높이 1㎛ 이하)이 원인으로 난반사가 발생하여, 반사 강도의 혼란이 발생하고 있었다(도 11jb, 도 11kb). 오프셋 위치가 -500㎛이면, 기판 표면의 화상을 취득할 수 없었다(도 11la).

이상의 결과에 의해, 오프셋 위치가 +200㎛ 이상, +1000㎛ 이하 사이에서 기판의 에지 부분이 어두운 특히 바람직한 화상이 얻어졌다. 또한, 오프셋 위치가 +1500㎛이면, 에지 부분을 인식할 수 있지만 전체적으로 어두워진 경향이 보였다. 오프셋 위치가 마이너스인 경우에는 에지를 완전히 인식할 수 없는 화상밖에 얻어지지 않았다.

또한, 이들 결과에 기초하여, 얼라인먼트용 화상을 취득할 때의 오프셋 위치를 -500㎛, 0㎛, +100㎛, +200㎛, +500um, +1000㎛, +1250㎛, +1500㎛로 변화시키고, 화상의 얼라인먼트 처리를 적절하게 행할 수 있는지의 여부의 평가를 다음의 순서 (1)' 내지 (5)'으로 행하였다.

(1)' 하이브리다이제이션 처리 완료된 DNA 칩을 합계 20매 준비하였다. 또한, DNA 칩의 기판의 형상은 도 14에 도시하는 바와 같다. 에지 부분의 높이의 차는 90㎛이며, 도 4a에서 도시하는 각도 θ는 70도이다.

(2)' 각각의 DNA 칩에 대하여, 오프셋 위치 0㎛(초점 위치)에서 Cy5의 형광 화상을 취득하였다.

(3)' 오프셋 위치를 -100㎛, 0㎛, +100㎛, +200㎛, +500㎛, +750㎛, +1000㎛, +1250㎛, +1500㎛로 하고, 각 위치에서 얼라인먼트용 화상을 각각 취득하였다. 이때, Cy5의 형광을 측정하는 레이저(파장 635nm)을 사용하고, 필터로서는 Cy3을 측정할 때에 사용하는 대역 통과 필터와 동일한 것을 사용하였다.

(4)' 도 7의 기준점(110a 내지 110d)에 상당하는 기준점을, 각각의 얼라인먼트용 화상 데이터에 기초하여 명암 정보를 사용한 에지 검출법에 의해 검출하였다.

(5)' 도 6의 스텝 S104 내지 S108의 공정까지 행하고, 오프셋 위치가 -100㎛, 0㎛, +100㎛, +200㎛, +500㎛, +1000㎛, +1250㎛, +1500㎛인 위치에서, 각각 20매의 DNA 칩에 대하여 형광 화상이 정확하게 얼라인먼트되어 있는지의 여부를 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

이상과 같이, 얼라인먼트용 화상을 취득할 때에 DNA 칩을 초점 위치에 대하여 대물 렌즈에 접근시킴으로써, 명백하게 얼라인먼트의 신뢰성이 증가되어 있는 것을 알 수 있었다. 상기한 실시예에서는 얼라인먼트용 화상을 취득할 때, 초점 위치보다도 기판을 +200㎛ 대물 렌즈측에 접근시켜 설치함으로써, 신뢰성이 크게 증가되어 있는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 실시예에 관한 스캐너(1)에 탑재되어 있는 대물 렌즈의 f값은 6.0mm였다. 따라서, 상기한 결과로부터, 오프셋 위치(α) +100 내지 +1000의 범위에서 α/f의 바람직한 범위는, 0.017(100/6000)부터 0.17(1000/6000)의 범위였다. 이 범위에서는 성공 확률이 95％ 이상이다. 더욱 바람직하게는 오프셋 위치가 +200 내지 +1000의 범위이며, α/f의 범위는 0.033(200/6000)부터 0.17(1000/6000)이다. 이 범위이면 얼라인먼트의 성공 확률은 100％이다.

(참고예)

평평한 슬라이드 글라스 상에 두께 150㎛의 테이프를 붙이고, 그것을 상기한 스캐너(1)에 세팅하였다. 오프셋량 +250㎛의 상태에서, Cy5의 형광을 측정하는 레이저(파장 635nm)를 사용하고, 필터로서는 Cy3을 측정할 때에 사용하는 대역 통과 필터와 동일한 것을 사용하여, 얼라인먼트용 화상에 상당하는 화상 데이터를 얻었다. 이 조건은 도 4a에서 도시하는 각도 θ가 90도에 상당한다. 그 결과를 도 12a 내지 12c에 도시한다.

도 12a 내지 12c는, 본 참고예에 관한 슬라이드 글라스의 화상 및 형광 강도의 그래프이다. 도 12a는, 스캐너(1)에 의해 얻어진 화상이다. 도 12b는, 도 12a의 화상에 있어서의 화살표 P₁₃-P₁₃'간에서의 광 강도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 12c는, 도 12a의 화상에 있어서의 화살표 P₁₃-P₁₃'간에서의 슬라이드 글라스 상의 높이의 차이를 나타내는 그래프이다. 이에 따라, 슬라이드 글라스에 부착된 테이프여도, 광의 강도 변화로부터 높이의 차이를 파악할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 에지에 상당하는 부분이 어두워져 있어, 각도 θ가 90도여도 문제없다고 생각된다.

본 발명에 관한 검출 방법, 마이크로어레이의 해석 방법 및 형광 판독 장치는, 기판의 높이의 차이를 정확하게 검출 가능한 화상을 취득하고, 얼라인먼트 처리를 적절하게 행하는데 적합하다.

1, 2 스캐너
11, 12 레이저 광원
13 대물 렌즈
14 천공 미러
14a 미소 미러
15 커트 필터
15a, 15b 여기광 커트 필터
16 결상 렌즈
17 화상 취득부
18, 19 미러
20 제어부
20a 검출부
20b 보정부
20c 결정부
21 구동부
100 DNA 칩
101 블록
102 스폿
103 오목부
104 유지부
140 구멍

Claims

렌즈에 의해 집광된 레이저광을 요철 형상을 갖는 기판에 조사하고, 상기 기판으로부터의 반사광 및/또는 산란광의 광 강도를 화상 데이터로서 취득하여 상기 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출 방법이며,
상기 렌즈의 초점 위치보다도 상기 렌즈에 가까운 위치이며, 상기 렌즈의 초점 거리를 f, 상기 기판을 상기 초점 위치로부터 상기 렌즈에 접근시키는 거리를 α로 했을 때, α/f가 0.017 내지 0.17의 범위 내가 되도록 설정되는 α에 따른 위치에 상기 기판의 광조사면을 배치하고, 상기 광조사면으로부터의 반사광 및/또는 산란광을 검출광으로서 수광하여, 상기 수광한 광의 강도의 변화에 기초하여 상기 기판의 높이의 차이를 검출하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 기판의 광조사면을 상기 초점 위치에 배치한 경우에, 상기 광조사면으로부터의 정반사광을 상기 검출광으로부터 분리하는 광학계를 사용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
삭제
요철 형상이 형성되며, 각각 형광 표지된 샘플과 결합 가능한 복수의 프로브가 배치된 마이크로어레이에 대하여, 대물 렌즈를 통하여 상기 형광 표지의 여기 파장을 포함하는 광을 조사하고, 또한 상기 마이크로어레이로부터의 광을 수광하여, 상기 수광한 광에 기초한 화상을 바탕으로 상기 마이크로어레이의 해석을 행하는 마이크로어레이의 해석 방법이며,
상기 형광 표지로부터의 형광을 검출하여 형광 화상 데이터를 취득하는 형광 화상 데이터 취득 스텝과,
상기 마이크로어레이의 표면으로부터의 광을 검출하여, 상기 형광 화상 데이터의 얼라인먼트를 행하는 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 얼라인먼트용 화상 데이터 취득 스텝과,
상기 얼라인먼트용 화상 데이터의 광 강도 변화를 바탕으로 상기 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출 스텝과,
상기 검출 스텝에 의해 검출된 상기 요철 형상의 높이의 차이에 기초하여 상기 형광 화상 데이터를 보정하는 보정 스텝과,
상기 보정 스텝에 의해 보정된 상기 형광 화상 데이터에서의 각 프로브의 위치를 결정하는 위치 결정 스텝
을 포함하고,
상기 얼라인먼트용 화상 데이터 취득 스텝은, 상기 마이크로어레이의 표면을, 상기 대물 렌즈의 초점 위치에 대하여 상기 대물 렌즈에 가까운 위치이며, 상기 대물 렌즈의 초점 거리를 f, 상기 마이크로어레이를 상기 초점 위치로부터 상기 대물 렌즈에 접근시키는 거리를 α로 했을 때, α/f가 0.017 내지 0.17의 범위 내가 되도록 설정되는 α에 따른 위치에 배치한 상태에서, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터를 취득하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 해석 방법.
제4항에 있어서, 상기 검출 스텝은, 상기 얼라인먼트용 화상 데이터에서 상기 광 강도의 변화에 기초하여 3개 이상의 기준점을 검출하고,
상기 보정 스텝은, 검출한 기준점을 기초로 상기 형광 화상 데이터의 왜곡을 보정하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 해석 방법.
제5항에 있어서, 상기 보정 스텝은, 상기 기준점에 기초한 상기 얼라인먼트용 화상 데이터의 경사 각도 θx, θy를 취득하여, 상기 경사 각도 θx, θy 및 하기 수학식 (1), (2)를 바탕으로 상기 형광 화상 데이터의 전단 변형 왜곡을 보정하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 해석 방법.
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제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 DNA 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이의 해석 방법.
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요철 형상이 형성되며, 각각 형광 표지된 샘플과 결합 가능한 복수의 프로브가 배치된 기판으로부터, 상기 형광 표지의 형광을 포함하는 광을 수광하여, 상기 수광한 광에 기초한 화상 데이터를 취득하는 형광 판독 장치이며,
적어도 소정 파장의 여기광을 포함하는 조명광을 출사하는 광원과,
상기 조명광을 상기 기판에 조사함과 함께, 상기 조명광이 조사된 상기 기판의 표면으로부터의 광을 수광하는 대물 렌즈와,
상기 대물 렌즈가 수광한 광을 검출하여, 상기 검출한 형광에 의한 형광 화상 데이터 및 상기 기판으로부터의 광에 의한 기판 화상 데이터를 취득하는 화상 취득부와,
화상 취득부에 의해 취득된 상기 기판 화상 데이터를 바탕으로 상기 요철 형상의 높이의 차이를 검출하는 검출부와,
상기 검출부에 의해 검출된 상기 요철 형상의 높이의 차이를 바탕으로 상기 형광 화상 데이터를 보정하는 보정부와,
상기 기판을 유지하는 유지 수단과,
상기 유지 수단을 상기 대물 렌즈의 광축에 따라 이동시키는 구동부
를 구비하고,
상기 구동부는, 상기 화상 취득부에 의해 상기 기판 화상 데이터를 취득할 때, 상기 대물 렌즈의 초점 위치에 대하여, 상기 대물 렌즈에 가까운 위치이며, 상기 대물 렌즈의 초점 거리를 f, 상기 기판을 상기 초점 위치로부터 상기 대물 렌즈에 접근시키는 거리를 α로 했을 때, α/f가 0.017 내지 0.17의 범위 내가 되도록 설정되는 α에 따른 위치에 상기 기판을 배치하도록 상기 유지 수단을 이동시키는 것을 특징으로 하는 형광 판독 장치.
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