JP6655966B2 - 走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、走査型顕微鏡に関する。

走査手段を用いて照射光で試料を走査し、その焦点面付近の試料のデータを取得する走査型顕微鏡がある。特にレーザ走査型顕微鏡では、焦点面近傍に非常に強い光を集中させることが可能であり、焦点面での光の非線形効果による反応を検出することが可能である。このような非線形効果としては、多光子吸収蛍光、第二次高調波の発生、コヒーレントラマン散乱光などの非線形光学効果が考えられる。これらの非線形光学効果による光を収集し、高速に検出することで、２次元画像を生成している。

走査型顕微鏡を用いて、厚みがあり光の透過率が小さい試料を評価する際は、主に試料で反射した蛍光又は後方散乱光等の反射波を射出光として検出する反射型の顕微鏡を用いる。

このような反射型の顕微鏡として、特許文献１には、波長フィルタを用いて、試料から発生した非線形光学光のうち対物レンズを通過した光を波長で切り分け、照射光と異なる波長をもつ光を検出する方法が記載されている。この場合、第二次高調波光や大きく波長の異なる蛍光などの検出が容易である。また、特許文献２には、偏光ビームスプリッタを用いて、照射光の光路と射出光の光路とを分離して、射出光を検出することが記載されている。

特開平１１−３２６７７５号公報 特開２００８−４０１５４号公報

しかし、コヒーレントラマン散乱のうち、照射光と同じ波長をもつ光を検出する誘導ラマン散乱効果を利用した顕微鏡では、特許文献１に記載の方法を利用できない。また、多重散乱した光は偏光が解消されているため、特許文献２のような偏光ビームスプリッタを用いた構成では、射出光の２分の１程度しか照明光の光路から分離できず、試料からの射出光の取得効率が制限される。

本発明はかかる課題に鑑みてなされたもので、試料からの光を従来よりも高効率に取り出すことができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一側面としての走査型顕微鏡は、光源からの照射光により試料を走査させる走査手段と、前記照射光を前記試料に導く対物光学系と、前記走査手段からの前記照射光を前記対物光学系に導くリレー光学系と、前記光源と前記走査手段との間の前記照射光の光路上に配置されており、前記照射光の光路と、前記試料から射出して前記対物光学系、前記リレー光学系及び前記走査手段を通過した射出光の光路とを分離する分離手段と、前記分離手段からの前記射出光を検出する検出手段と、を有し、前記リレー光学系は、前記リレー光学系の入射瞳と前記リレー光学系の射出瞳と前記検出手段との相対位置を変更せず、且つ、前記リレー光学系の入射瞳の瞳径を変更せずに、前記リレー光学系の射出瞳の瞳径を変更可能に構成されていることを特徴とする。

本発明の一側面としての走査型顕微鏡によれば、試料からの光を従来よりも高効率に取り出すことができる。

第１の実施形態の走査型顕微鏡の構成を説明する模式図。 第１の実施形態の走査型顕微鏡を用いた検出方法を説明する模式図。 第１の実施形態のリレー光学系の構成を説明する模式図。 第１の実施形態の分離手段を説明する模式図。 第１の実施形態の分離手段の別の一例を説明する模式図。 第２の実施形態のリレー光学系の構成を説明する模式図。 第３の実施形態の走査型顕微鏡の構成を説明する模式図。 第３の実施形態の走査手段の一例の構成を説明する模式図。 数値実施例１におけるリレー光学系の面番号を説明する図。 数値実施例１における検出光学系の面番号を説明する図。 数値実施例２におけるリレー光学系の面番号を説明する図。

（第１の実施形態）
図１を参照して、本実施形態の走査型顕微鏡１００（以下、「顕微鏡１００」と呼ぶ）の構成を説明する。図１は、顕微鏡１００の構成を説明する模式図である。なお、本実施形態においては、対物光学系１０７の構成は特に限定されず、一般的なものを使用することができる。

顕微鏡１００は、光源１０１、平行化手段１０２、走査手段１０４、リレー光学系１０５、対物光学系１０７、分離手段１１０、検出光学系１１１、及び検出手段１１３を有する。

光源１０１は、試料１０８に照射する照射光としての光束１０３を出力するレーザである。光源１０１から出力された光束１０３は、平行化手段１０２により平行光束化され、分離手段１１０を通過して走査手段１０４に入射する。平行化手段１０２は、光束１０３を平行光束化するレンズである。なお、本明細書では、光源１０１から試料１０８に照射される光束が「照射光」であり、試料１０８に照射された後に試料１０８から射出した光を「射出光」と呼ぶ。「射出光」は、試料１０８内で多重反射及び多重散乱して試料１０８から射出した反射光を含む。

走査手段１０４は、光源１０１からの光束１０３の試料１０８内（試料１０８表面を含む）での集光点（スポット）１０９の位置を変更することにより、光束１０３により試料内（試料１０８）を走査するための構成である。具体的には、走査手段１０４は、走査手段１０４から射出する光束１０３の方向を変更する（偏向する）ことにより、照射光の対物光学系１０７に対する入射角を変更する。走査手段１０４としては、例えば、１軸方向に共振する共振スキャナと、該共振スキャナと直交する方向に共振する（鋸波振動する）ガルバノスキャナとの２つの光偏向素子を含む２軸スキャナを用いる。走査手段１０４の構成はこれに限らず、高速走査のためにＭＥＭＳを用いたレゾナントミラーやポリゴンミラーと組み合わせてもよい。

走査手段１０４により偏向された光束１０３は、リレー光学系１０５に入射する。走査手段１０４は、リレー光学系１０５の入射瞳の位置に配置されている。このように配置することで、走査手段１０４に偏向された光束１０３は、リレー光学系１０５の射出瞳１０６の位置に集まり、瞳を形成する。リレー光学系１０５についての詳細は後述する。

なお、先に記載したように走査手段１０４が２つの偏光素子を有する場合には、リレー光学系１０５の入射瞳の位置に偏光素子の一方を一致させてもよい。また、２つの偏光素子の間にリレー光学系１０５の入射瞳が配置されるようにしても構わない。

リレー光学系１０５を通過した光束１０３は、対物光学系１０７に入射する。対物光学系１０７は、入射した光束１０３を試料１０８に導く光学系である。対物光学系１０７は、光束１０３をスポット１０９に集光する。本実施形態では、対物光学系１０７として対物レンズを用いるが、これに限らず、ミラー等を含んでいてもよい。

リレー光学系１０５は、走査手段１０４からの光束１０３を対物光学系１０７に導く光学系で、リレー光学系１０５の射出瞳１０６の位置と対物光学系１０７の入射瞳の位置とが一致するように配置されている。リレー光学系は、走査手段１０４からの光束１０３を対物光学系１０７の入射瞳に瞳結像する。このような構成にすることにより、光束１０３はスポット１０９に集光され、走査手段１０４による２次元走査に合わせスポット１０９で試料１０８内を走査する。

光束１０３が試料１０８に照射されると、光束１０３と試料１０８とが相互作用し、被線形光学現象が生じる。スポット１０９及びスポット１０９近傍からの射出した射出光は、対物光学系１０７により採光される。

射出光は、対物光学系１０７を透過後、リレー光学系１０５を通り、再び走査手段１０４に入射する。対物光学系１０７で採光された射出光は、走査手段１０４で反射した後、分離手段１１０に到達する。分離手段１１０は、照射光としての光束１０３の光路と射出光の光路とを分離（分岐）する。

ここで、分離手段１１０の構成について、図４を参照して説明する。図４は、分離手段１１０の構成の一例を説明する模式図である。本実施形態の分離手段１１０は、その中心部に光束１０３が通過する透過部（透過領域）４０１を有し、透過部４０１の周囲に光を反射する反射部（反射領域）４０２を有する穴あきミラーである。反射部４０２は、光を反射する反射ミラーである。反射部４０２は、その表面に金属蒸着膜又は射出光の波長において反射率が高くなるよう設計した誘電体多層膜が施されている。透過部４０１は、反射ミラーに物理的に空けた穴（開口）等でもよいし、平板の一部の領域に反射部材が施されないようにして構成してもよい。

透過部４０１のサイズは、光束１０３が直進する方向を法線とした面内において、光束１０３のビーム径以上とする。この条件を満たさないと、光束１０３が分離手段１１０によりケラれてしまい、光強度が低下する恐れがある。また、透過部４０１のサイズが小さいと対物光学系１０７の入射瞳に対し入射するビームが小さくなり、結果としてスポット１０９のサイズが大きくなってしまう。この結果、試料１０８における光密度が低下してしまい、試料１０８で発生する非線形効果が小さくなる。しかし、透過部４０１のサイズが大きいと反射部４０２で反射する射出光が少なくなり、検出手段１１３に入射する射出光の強度が低下するため、その点を考慮して分離手段１１０を設計することが好ましい。

このように、本実施形態では、分離手段１１０によって射出光の光路が折り曲げられ、光束１０３の光路から分離される。この手法によれば、照射光の波長と、検出する射出光の波長とが非常に近接している場合、又は同じ波長である場合でも、照射光の光路と射出光の光路とを分離して射出光を取り出すことができる。そのため、照射光と同じ波長の光の強度を検出する必要のある誘導ラマン散乱光を検出する場合等でも有効である。

分離手段１１０で光束１０３の光路から分離された射出光は、検出光学系１１１により瞳１１２を形成した後、瞳１１２の位置に配置された検出手段１１３により検出される。なお、本実施形態の検出手段１１１は、複数のレンズを用いて構成されているが、これに限らず、ミラー等を含んでいても良い。検出手段１１３は、例えば、射出光の波長に感度を持ち、検出手段１１３に入射した光の強度に応じた電圧を出力するフォトダイオード等が挙げられる。もちろん、光電子増倍管などの別の手段を用いてもよい。

図２を用いて、本実施形態における射出光の光路についてより詳細に説明する。なお、図２では簡単化のため、リレー光学系１０５を２枚のレンズで表記してある。

試料１０８内（試料１０８表面又は試料１０８の内部）でスポットに集光された照射光（光束１０３）は、試料１０８により反射、散乱し、その一部が試料１０８表面から射出する。このような射出光のうち、対物光学系１０７の視野内に射出され、且つ、対物光学系１０７のＮＡの範囲内に射出された射出光は、対物光学系１０７により再び平行光化され、リレー光学系１０５に入射する。平行光化された散乱光はリレー光学系１０５により瞳を形成し、走査手段１０５により再び反射される。

スポット１０９を形成したときと同じ光路を戻る射出光は、走査手段１０４により反射されたとき、ちょうど光源１０１からの光束１０３と一致する方向に伝播する。しかし、スポット１０９の近傍から射出した射出光は、走査手段１０４により走査されたとき、光源１０１からの光束１０３とわずかに角度の異なる光束として射出される。射出光の試料１０８からの射出位置がスポット１０９から離れるに従い、走査手段１０４で反射した後の射出光の光路と光束１０３の光路との角度差が大きくなる。

そのため、走査手段１０４からの射出光のうち、スポット１０９と同じ位置からの散乱光や正反射光は透過部４０１を通過して光束１０３の光源１０１側に戻り、スポット１０９と異なる位置から射出した射出光は反射部４０２により反射される。そのため、分離手段１１０は、対物光学系１０７の像面とフーリエ変換の関係にない位置に配置されている。すなわち、分離手段１１０は、対物光学系１０７の入射瞳と共役でない位置に配置されている。

反射部４０２で反射された射出光は、検出光学系１１１を介して検出部１１３で検出される。また、対物光学系１０７の視野外に射出した光束は対物光学系１０７の瞳に到達しないため、検出されない。

このように、分離手段１１０を用いることにより、試料１０８により反射、散乱された射出光を検出することが可能になる。なお、本実施形態では、分離手段１１０としての穴空きミラーの基板として、平行平板を用いたが、これに限らず、入射する光束１０３の偏光方向に合わせた偏光ビームスプリッタを用いることも可能である。

顕微鏡１００を用いて試料１０８の注目部位の拡大又は広範囲観察等を行うために、顕微鏡１００の対物光学系１０７を変更することがある。対物光学系は、それぞれ倍率、入射瞳径等が異なるため、対物光学系１０７を変更すると、その瞳径は対物光学系１０７に合わせて変化する。

光束１０３のビーム径が対物光学系１０７の入射瞳より小さくなると、結果として光束１０３の試料１０８上でのスポット径が大きくなる。スポット径が大きくなると、非線形効果による散乱光の強度が低下し、画像のコントラスト低下や解像度の低下をもたらす。すなわち、対物光学系１０７の性能を十分に発揮し、高コントラストかつ高解像度の画像を得るには、対物光学系１０７の倍率及び入射瞳径に合わせて光束１０３のビーム径を変更することが望ましい。このような構成にすることにより、試料１０８内での光束１０３のスポット径を小さくすることが望ましい。

入射ビーム径を変化させるのにもっとも簡単な方法は、特許文献２に記載されているように、光束１０３が走査手段１０４へ入射する前にズーム式のビームエキスパンダを挿入し、ビーム径を可変にする方法である。しかし、この手法では、分離手段１１０の透過部４０１のサイズ、もしくは反射部５０２のサイズも同時に変化させる必要があり、分離手段１１０を変更する機構が必要となる。そのため、装置の大型化及び精度の低下が発生する恐れがある。

また、走査手段１０４として多く利用される共振ミラー及びガルバノミラー等は、ミラーのサイズに制約がある。そのため、光束１０３のビーム径を拡大すると光束１０３がミラーからはみ出し、光量が低下したり、十分なビーム径を確保できなかったりする恐れがある。ミラーに対しビーム径が非常に小さい光束１０３を入射した場合も、試料１０８内におけるスポット径が大きくなり、解像度が低下する恐れがある。

これらを回避するために、非常に大きなミラーサイズを持つスキャナを採用する等の手段が考えられるが、装置の大型化や部品点数の増加、部品の入れ替えによる精度の低下などが発生する恐れがある。

そこで本実施形態では、リレー光学系１０５を用いて、リレー光学系１０５の光学素子以外の構成の位置又は種類を変化させることなく、対物光学系１０７の入射瞳における光束１０３のビーム径を変化させる。リレー光学系１０５は、走査手段１０４と対物光学系１０７との間の光束１０３の光路上に配置されている。リレー光学系１０５は、以下の条件１〜３を満たすように構成されている。
［条件１］ 走査手段１０４の位置での光束１０３のビーム径を変更しない。
［条件２］ 対物光学系１０７の入射瞳の位置、すなわちリレー光学系１０５の射出瞳１０６の位置における光束１０３のビーム径が可変である。
［条件３］ 走査手段１０４と対物光学系１０７の入射瞳位置との相対位置を変更しない。

さらに、検出手段１１３まで光を導く検出光学系１１１による瞳結像を用いている。すなわち、検出光学系１１１の瞳と走査手段１０４とが共役になるように配置されている。これを換言すると、走査手段１０４（リレー光学系１０５の入射瞳と検出手段１１３の検出面とが共役となるように配置されている。そのため、リレー光学系１０５は、以下の条件４を満たすことが好ましい。
［条件４］ 対物光学系１０７の入射瞳位置と検出手段１１３との相対位置を変更せず、検出光学系１１１の射出瞳の瞳径も変更しない。

これらの条件１〜４を満たすように構成されたリレー光学系１０５によってズームすることにより、リレー光学系１０５の光学素子以外の構成の位置を動かさなくても、対物光学系１０７の入射瞳上での光束１０３のビーム径を変更することができる。

図３は、条件１〜４を満たすように構成されたリレー光学系１０５の一例の構成を説明する模式図である。図３（ａ）が、リレー光学系１０５の射出瞳の瞳径が相対的に小さい場合で、図３（ｂ）がリレー光学系１０５の射出瞳径が相対的に大きい場合の模式図である。

リレー光学系１０５は、走査手段１０４側から、第１のレンズ群３０１と、第２のレンズ群３０２と、第３のレンズ群３０３と、第４のレンズ群３０４と、第５のレンズ群３０５とを有する。リレー光学系１０５の構成はこれに限らない。また、リレー光学系１０５は、ミラー等を含んでいてもよい。

リレー光学系１０５は、第１のレンズ群３０１と、第２のレンズ群３０２と、第５のレンズ群３０５を固定し、第３のレンズ群３０３及び第４のレンズ群３０４の位置が可変となっている。第３のレンズ群３０３及び第４のレンズ群３０４を移動させることにより、瞳の位置は固定したまま、リレー光学系１０５の射出瞳１０６径を変更することができる。

本実施形態の場合、リレー光学系１０５の入射瞳位置でのビーム径は２ｍｍで固定であり、射出瞳径は２．９ｍｍから７．０ｍｍまで変更可能としている。例えば、ＮＡ＝０．１５、焦点距離１０ｍｍの対物光学系の入射瞳径は３ｍｍであり、ＮＡ＝１．０、焦点距離３．３ｍｍの対物光学系の入射瞳径は６．６ｍｍであるため、複数の対物光学系の入射瞳径に対応可能であることが分かる。

ただし、リレー光学系１０５でズームを行うと、Ｌａｇｒａｎｇｅ−Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚの不変量から、対物光学系１０７の入射瞳における光束１０３の走査振幅（走査角度）が変化してしまう。このため、対物光学系１０７の入射瞳でのビーム径を拡大すると、走査角が減少し、観察範囲が狭くなる。このため、瞳径のズームに同期させ、走査手段１０４の走査角を可変にする。このような構成にすることにより、対物光学系１０７の種類を変更することにより瞳径が変化しても、観察視野を確保することが可能になる。

また、リレー光学系１０５を採用することにより、対物光学系１０７の入射瞳上での光束１０３のビーム径を可変にしながら、検出手段上（検出手段１１３上）での射出光のビーム径（瞳径）を一定に保つこともできる。検出手段１１３は、Ｓｉフォトダイオードなどを用いるが、Ｓｉフォトダイオードのサイズが大きくなるにつれて検出の速度が低下する。このため、高速なフレームレートで検出を行うためには、検出手段１１３上での光束径を小さくすることが必要になる。本実施形態の構成では、検出手段１１３上でのビーム径は２ｍｍと小さく、高速検出も可能となっている。

なお、分離手段１１０は上述の構成に限らず、図５に示したように、光束１０３を反射する反射部５０２を有し、スポット１０９と異なる位置から射出された射出光を透過する構成等でもよい。射出光を透過する透過領域は、何も設けなくてもよいし、射出光を透過する透過部材を反射部５０２の周囲に設けてもよい。

反射部５０２のような微小ミラーを用いた場合、特に微弱光となる射出光を反射する構成でないため、反射部５０２における光の反射率を気にする必要が無いが、微小ミラーの配置方法などに制約がある。反射部５０２を有する分離手段１１０を用いる場合は、反射部５０２のサイズを光束１０３のビーム径以上に構成することが好ましい。

本実施形態の顕微鏡１００は、走査手段１０４より光源１０１側に分離手段１１０を有する走査型顕微鏡である。分離手段１１０を有することにより、試料からの光を従来よりも高効率に取り出すことができる。

また、本実施形態の顕微鏡１００は、入射瞳と射出瞳１０６と検出手段１１３との相対位置を変更せずに、入射瞳径及び検出手段１１３の瞳径に対する射出瞳１０６の瞳径を変更可能なリレー光学系１０５を有する。そのため、本実施形態のリレー光学系１０５によれば、入射瞳と射出瞳１０６と検出手段１１３の瞳との相対位置及びリレー光学系１０５の入射瞳径を変更せずに、リレー光学系１０５の射出瞳１０６の瞳径を変更することができる。

このような構成のリレー光学系１０５を用いることにより、対物光学系１０７の変更によって対物光学系１０７の入射瞳径が変化した場合に、対物光学系１０７の入射瞳径の変化による試料１０８内での照射光（光束１０３）のスポット径への影響を低減できる。その結果、対物光学系１０７の性能を生かした高解像度、高コントラストの画像を得ることができる。

（第２の実施形態）
図６を用いて、本実施形態の走査型顕微鏡について説明を行う。本実施形態では、第１の実施形態のリレー光学系１０５の代わりに、リレー光学系２０５を用いる点が第１の実施形態と異なるが、それ以外の構成は第１の実施形態と同様である。第１の実施形態と同様の構成については詳細な説明を省略し、リレーレンズ系２０５の構成についてのみ説明する。図６は、本実施形態のリレー光学系２０５の構成の一例を説明する模式図である。

本実施形態のリレー光学系２０５は、走査手段１０４側から、第１のレンズ群５０１、第２のレンズ群５０２、第３のレンズ群５０３、第４のレンズ群５０４及び第５のレンズ群５０５を有する。本実施形態では、第１の実施形態とは逆に、中間結像面の走査手段１０４側に、移動するレンズ群を集中させ、対物光学系１０７側のレンズ群の位置を固定している。具体的には、リレー光学系２０５の第３のレンズ群５０３及び第４のレンズ群５０４の位置を変更することにより、上述の条件１〜４を満たしてズームを行えるように構成されている。

移動群の配置は第１の実施形態の構成、又は第２の実施形態の構成のどちらでも構わない。また、リレー光学系の構成はこれに限らず、走査手段１０４側の１つ又は複数のレンズ群と、対物光学系１０７側の１つ又は複数のレンズ群と、の両方を移動可能にして、ズーム比を拡大しても構わない。

図６（ａ）が射出瞳径を相対的に大きくした場合、図６（ｃ）が射出瞳径を相対的に小さくした場合、図６（ｂ）が図６（ａ）における射出瞳径と図６（ｃ）における射出瞳径との間にした場合の模式図である。図６（ａ）では、入射瞳径に対し射出瞳径が小さくなる縮小系、図６（ｂ）ではほぼ等倍、図６（ｃ）では入射瞳径に対し射出瞳径が大きくなる拡大系となっている。本実施形態の場合、入射瞳径は４ｍｍで固定されており、射出瞳径は図６（ａ）で２．５ｍｍ、図６（ｂ）で３．７ｍｍ、図６（ｃ）で７．３ｍｍとなっている。このように、リレー光学系２０５の複数のレンズ群５０１〜５０４の配置次第で、入射瞳径を変更せずに、射出瞳径を縮小系から拡大系まで変化させることが可能となる。

このように、本実施形態の走査型顕微鏡は、走査手段１０４より光源１０１側に分離手段１１０を有する走査型顕微鏡である。分離手段１１０を有することにより、試料からの光を従来よりも高効率に取り出すことができる。

また、本実施形態の走査型顕微鏡は、入射瞳と射出瞳１０６と検出手段１１３との相対位置を変更せずに、入射瞳径及び検出手段１１３の瞳径に対する射出瞳１０６の瞳径を変更可能なリレー光学系２０５を有する。そのため、本実施形態のリレー光学系２０５によれば、入射瞳と射出瞳１０６と検出手段１１３の瞳との相対位置及びリレー光学系２０５の入射瞳径を変更せずに、リレー光学系２０５の射出瞳１０６の瞳径を変更することができる。

このような構成のリレー光学系２０５を用いることにより、対物光学系１０７の変更によって対物光学系１０７の入射瞳径が変化した場合に、対物光学系１０７の入射瞳径の変化による試料１０８内での照射光（光束１０３）のスポット径への影響を低減できる。その結果、対物光学系１０７の性能を生かした高解像度、高コントラストの画像を得ることができる。

また、本実施形態では、射出瞳径を縮小系から拡大系まで変更できるようにリレー光学系２０５を構成している。このような構成にすることにより、走査手段１０４のミラー径よりも入射瞳径が小さい対物光学系１０７を用いても、対物光学系１０７に入射する光束１０３の光量ロスを低減することができ、対物光学系１０７の性能をより発揮させることが可能になる。

（第３の実施形態）
図７を用いて、本実施形態の走査型顕微鏡７００（以下、「顕微鏡７００」と呼ぶ）の説明を行う。顕微鏡７００は、２つの光源を有する誘導ラマン散乱顕微鏡である。図７は、顕微鏡７００の構成を説明する模式図である。なお、図７には第１の実施形態と同様の構成には同様の符番を付し、以降の説明では、第１の実施形態と同様の構成については詳細な説明を省略する。

顕微鏡７００は、リレー光学系１０５、分離手段１１０、検出光学系１１１、検出手段１１３、第１の光源７０１、第２の光源７０２、第１の波長選択手段７０５、ノイズ低減手段７０６、合波手段７０７、及び走査手段７０９を有する。さらに、顕微鏡７００は、２つの異なる対物光学系としての第１の対物レンズ７１２ａ及び第２の対物レンズ７１２ｂと、リボルバー７１８と、センサ７１９と、走査制御回路７２１と、主制御回路７２２と、駆動部７２３と、処理部７２４とを有する。

第１の光源７０１は、第１の照射光としての第１の光束７０３を出力する。第２の光源７０２は、第２の照射光としての第２の光束７０４を出力する。第１の光束７０３の波長は、第２の光束７０４の波長と異なる。第１の光束７０３は波長選択手段７０５に入射し、第２の光束７０４は、ノイズ低減手段７０６へ入射する。

波長選択手段７０５は、広帯域の波長をもつ光から狭帯域の光を選択する手段である。具体的には、例えば、特許５６９７５８４号に示された波長可変バンドパスフィルタ等を用いることができる。ノイズ低減手段７０６は、第２の光源７０２からの第２の光束７０４に含まれる強度ブレを低減するものである。具体的には、例えば、特許５６２３６５２号に記載されているような遅延合波によるノイズ低減手段等を用いることができる。

ただし、波長選択手段７０５及びノイズ低減手段７０６の構成はこれに限るものではなく、例えば波長選択手段７０５として波長可変型のファブリペローフィルタ等を用いてもよい。同様に、ノイズ低減手段７０６として、光束７０３の強度を測定し、その強度が一定になるよう、第１の光源７０１又は第２の光源７０２にその情報をフィードバックする手法等を用いても構わない。

波長選択手段７０５で波長選択された光束７０３及びノイズ低減手段７０６を射出した光束７０４は、合波手段７０７に入射し、１つのビーム７０８となって走査手段７０９へと入射する。走査手段７０９は、走査手段１０４と同様にビーム７０８を偏向する手段である。本実施形態の走査手段７０９は、図８に示すように、共振ミラー８０１とガルバノミラー８０２とが直交配置された構成をしており、入射したビーム７０８で試料１０８を２次元方向に走査する。走査手段７０９からのビーム７０８は、リレー光学系１０５へと入射し、射出瞳１０６を形成する。リレー光学系１０５からのビーム７０８は、第１の対物レンズ７１２ａと第２の対物レンズ７１２ｂのうち、ビーム７０８の光路上に配置されている方に入射する。

対物レンズ７１２ａ及び対物レンズ７１２ｂのそれぞれは、試料１０８と対向して配置された状態で、それぞれの入射瞳の位置が、リレー光学系１０５の射出瞳１０６の位置と一致するように配置されている。そのため、ビーム７０８は、対物レンズ７１２ａ又は対物レンズ７１２ｂにより、試料１０８内のスポット１０９に集光される。走査手段７０９によって、スポット１０９は試料１０８内を２次元方向に移動する。

試料１０８から射出した射出光は、対物レンズ７１２ａ、７１２ｂにより集められ、再びリレー光学系１０５へ入射し、走査手段７０９上に瞳を形成する。走査手段７０９によって再度反射された射出光のうち、スポット１０９の近傍から射出した射出光は分離手段１１０によりビーム７０８の光路と分離され、検出光学系１１１を介して検出手段１１３上に瞳を形成する。

検出手段１１３で検出する射出光から、特定の波長帯域の光を取り出して検出したい場合には、検出手段１１３の直前にはフィルタ（不図示）が配置し、特定の波長帯域の光を取り出して検出手段１１３に入射するように構成する。例えば、ＳＲＳ顕微鏡の場合は、異なる２つの波長を有する射出光のうちの一方の波長の光をフィルタで抽出して検出手段１１３に入射する。フィルタ（不図示）は、特定の波長範囲の光を抽出する分光部で、具体的には、バンドパスフィルタ又はショートパスフィルタ等を用いる。

射出光のうち、検出手段１１３は、走査手段７０９の走査に合わせ射出光の強度を検出する。検出手段１１３の検出結果である強度のデータは、処理部７２４において、スポット位置と対応させて２次元的に配置することで、射出光の２次元画像のデータを取得できる。処理部７２４が取得した二次元画像のデータは、表示装置７２５に表示することができる。

ここで、スポット１０９近傍で起きる現象を考える。ここで、第１の光束７０３の波長をλ１、第２の光束７０４の波長λ２とする。波数差（１／λ２−１／λ１）が、スポット１０９近傍に存在する分子のもつ振動準位差に等しくなったとき、誘導ラマン散乱現象（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）が発生する。このとき、例えば、第１の光源７０１からの第１の光束７０３の強度はわずかに増加し、逆に第２の光源７０２からの第２の光束７０４の強度はわずかに減少する。そのため、第１の光束７０３の波長λ１を波長選択手段７０４で変化させることによって波数差（１／λ２−１／λ１）を変化させれば、ＳＲＳを用いてスポット１０９近傍に存在する物質の振動準位スペクトルを取得することができる。

このＳＲＳは照射光の強度の増減と言う形で生じる。振動準位スペクトルを取得するには、試料１０８にビーム７０８が照射されることによって生じた強度の増減を、試料１０８を透過した透過光の強度の増減、もしくは試料１０８で反射、散乱した後方散乱光（射出光）の強度の増減として取得する必要がある。このため、試料１０８として生体サンプル等の透過光の測定が困難なサンプルを用いた場合、射出光を対物レンズを通して測定する必要がある。また、ＳＲＳは非線形現象であり、スポット１０９内の光密度が大きいほどＳＲＳによる強度の増減が大きくなる。このため、可能な限りビーム７０８のスポット径を小さくする必要があり、対物レンズ７１２ａ、７１２ｂそれぞれの入射瞳に対し、入射光量を可能な限りロスしない大きさでビーム７０８を入射させることが好ましい。

本実施形態の顕微鏡７００は、対物レンズ７１２ａ、７１２ｂが取り付けられているリボルバー７１８を回転させることにより、対物レンズを切り替えることができる。例えば、焦点距離３ｍｍ、ＮＡ１．０の対物レンズ（７１２ａ）を、焦点距離１０ｍｍ、ＮＡ０．４の対物レンズ（７１２ｂ）に切り替える。このとき、入射瞳径は６ｍｍから８ｍｍへと変化する。ここで、リボルバー７１８に取り付けられたセンサ７１９により、第１の対物レンズ７１２ａの第２の対物レンズ７１２ｂへの切り替えを検出し、制御回路７２２へ信号を送る。そして、センサ７１９の検出結果に合わせ、使用する対物レンズの倍率及び入射瞳径に応じて、制御回路７２２が予め記録されたルックアップテーブル（ＬＵＴ）７２０から最適なビーム径を読み出す。

その後、駆動部７２３がリレー光学系１０５の位置可変なレンズ群を駆動して、リレー光学系１０５の射出瞳１０６の径が最適なビーム径と一致するよう、リレー光学系１０５により自動的にズームさせる。このように対物光学系の切り替えと同期させて、リレー光学系１０５を駆動することで、使用する対物光学系を変更しても、その倍率及び入射瞳径の変化による試料１０８内での照射光（ビーム７０８）のスポット径への影響を低減できる。その結果、対物レンズ７１２ａ、７１２ｂのそれぞれの性能を生かした高解像度、高コントラストの画像を得ることができる。また、対物光学系を変更しても、測定の条件の変化を低減してＳＲＳ画像を得ることが可能になる。

さらに、走査手段７０９の走査角を考える。上述のようにリレー光学系１０５によって、射出瞳１０６の瞳径を変更した場合、使用する対物レンズ７１２ａ、７１２ｂの入射瞳に対するビーム７０８の走査角も変化する。例えば、第１の対物レンズ７１２ａから第２の対物レンズ７１２ｂに切り替えた場合、走査角は約１／３になってしまうため、観察範囲が１／９まで狭くなってしまう。

そこで、センサ７１９により検出された対物レンズ７１２の切り替え情報を、主制御回路７２２へ転送する。主制御回路７２２は、取得した切り替え情報を走査制御回路７２１へ送る。走査制御回路７２１は、対物レンズ７１２の切り替え情報に応じて、必要となる走査角の情報をＬＵＴ７２０から取り出し、走査手段７０９の走査角を約３倍に変化させる。こうすることで、リボルバー７１５により対物レンズ７１２ａ、７１２ｂが切り替えられても、必要な視野範囲を確保することも可能になる。

本実施形態の顕微鏡７００は、走査手段１０４より光源７０１側に分離手段１１０を有する。分離手段１１０を有することにより、試料１０８からの光を従来よりも高効率に取り出すことができる。

また、顕微鏡７００は、入射瞳と射出瞳１０６と検出手段１１３との相対位置を変更せずに、入射瞳径及び検出手段１１３の瞳径に対する射出瞳１０６の瞳径を変更可能なリレー光学系１０５を有する。そのため、本実施形態のリレー光学系１０５によれば、入射瞳と射出瞳１０６と検出手段１１３の瞳との相対位置及びリレー光学系１０５の入射瞳径を変更せずに、リレー光学系１０５の射出瞳１０６の瞳径を変更することができる。

リレー光学系１０５を用いることにより、使用する対物光学系を変更することによって対物光学系の入射瞳径の変化した場合に、対物光学系の入射瞳径の変化による試料１０８内での照射光（光束１０３）のスポット径への影響を低減できる。その結果、対物光学系の性能を生かした高解像度、高コントラストの画像を得ることができる。

また、走査手段７０９の走査角も対物光学系の変更に同期させ変化させることで、試料１０８内における観察範囲を確保することも可能になる。

なお、本実施形態では、リレー光学系１０５を用いていたが、リレー光学系１０５の構成はこれに限らず、条件１〜４を満たす光学系であればよい。例えば、第２の実施形態のリレー光学系２０５などを用いてもよい。また、本実施形態では、対物光学系の変更に応じてリレー光学系１０５及び走査手段７０９による走査角を自動で変化させていたが、手動で変化させる方法でももちろん構わない。

また、本実施形態では走査手段として共振ミラーとガルバノミラーを組み合わせたものを示したが、例えば半導体技術により作製された２軸走査可能なＭＥＭＳミラーなどを用いても構わない。また、共振ミラーの代わりにポリゴンミラーを用いるなど、他の方法を用いても構わない。

（数値実施例１）
第１の実施形態の顕微鏡１００におけるリレー光学系１０５の数値実施例を示す。リレー光学系１０５の入射瞳径は走査手段１０４上での照射光のビーム径、リレー光学系１０５の射出瞳径は対物光学系１０７の入射瞳位置での照射光のビーム径に相当する。走査角は正方形の視野を確保するための走査角（光学角、０−ｐｅａｋの値）である。リレー光学系１０５の光学データを表１に示し、後述するＰｏｓｉｔｉｏｎ１、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２のそれぞれにおける移動レンズ群の面間隔を表２に示した。また、検出光学系１１１の光学データを表３に示した。表１における面番号は、入射瞳面側からの面の順番を指す（図９参照）。表２における面番号は、入射瞳面側からの面の順番を指す（図１０参照）。

Ｐｏｓｉｔｉｏｎ１（瞳径小） 入射瞳径：２ｍｍ 射出瞳径：２．９ｍｍ 走査角：８．２３ｄｅｇ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２（瞳径大） 入射瞳径：２ｍｍ 射出瞳径：７．０ｍｍ 走査角：３．３４ｄｅｇ

各表において、ＳＴＯは入射瞳面、ＩＭＧは射出瞳面を示す。また、屈折率、分散はｄ線（５８７．５６ｎｍ）の値を記載している。使用波長は７９０ｎｍである。

本数値実施例の光学系は図１に示す光学系に相当するが、本数値実施例中には走査手段１０４や分離手段１１０については記載していない。

（数値実施例２）
第２の実施形態の走査型顕微鏡におけるリレー光学系２０５の数値実施例を示す。リレー光学系１０５の入射瞳径は走査手段１０４上での照射光のビーム径、リレー光学系１０５の射出瞳径は対物光学系１０７の入射瞳位置での照射光のビーム径に相当する。走査角は正方形の視野を確保するための走査角（光学角、０−ｐｅａｋの値）である。リレー光学系２０５の光学データを表４に示し、後述するＰｏｓｉｔｉｏｎ１、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ３のそれぞれにおける移動レンズ群の面間隔を表５に示した。表４における面番号は、入射瞳面側からの面の順番を指す（図１１参照）。

Ｐｏｓｉｔｉｏｎ１（瞳径小） 入射瞳径：４ｍｍ 射出瞳径：２．５ｍｍ 走査角：１．０４ｄｅｇ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２（瞳径中） 入射瞳径：４ｍｍ 射出瞳径：３．７ｍｍ 走査角：１．５２ｄｅｇ
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ３（瞳径大） 入射瞳径：４ｍｍ 射出瞳径：７．３ｍｍ 走査角：３．００ｄｅｇ

各表において、ＳＴＯは入射瞳面、ＩＭＧは射出瞳面を示す。また、屈折率、分散はｄ線（５８７．５６ｎｍ）の値を記載している。使用波長は７９０ｎｍである。

以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。

例えば、上述の実施形態では、分離手段１１０に平板状のミラーを用いていたが、曲面を有するミラーを用いることも可能である。曲面を有するミラーを用いる場合は、走査手段１０４と検出手段１１３の検出面とが共役となるよう、曲面及び検出光学系１１１を設計する。

上述の各実施形態では、走査手段１０４を用いて試料１０８内の２次元走査を行っている。しかし、走査方法はこれに限らず、１軸のガルバノミラーによる走査と、試料１０８を支持するステージ（不図示）のガルバノミラーの走査方向の垂直方向の駆動と、を組み合わせて２次元走査を行ってもよい。さらに、ステージ（不図示）を２次元面内で駆動してもよい。さらに、試料１０８の画像を取得する必要がなければ、走査手段１０４による集光点の走査を行わずに、試料１０８内の１点のみを観察すればよい。

第３の実施形態において、検出手段１１３が射出光を検出する方式として、変調器を用いずに繰り返し周波数がｎ：１（ｎは２以上）となる光源を用いてロックイン検出を行う方式、又は、強度変調器を用いたロックイン検出方式を採用してもよい。

また、上述の各実施形態は、ＣＲＳ計測、光源が１つの多光子顕微鏡等に限定せず、光源を複数有する多光子吸収、多光子蛍光を計測する顕微鏡等にも適用できる。また、上述の各実施形態では、試料１０８からの射出光の計測を行う構成を示したが、試料１０８への光を照射するための構成をプローブ化して、顕微鏡の一形態である内視鏡を構成してもよい。

１０１ 光源
１０４ 走査手段
１０５ リレー光学系
１０７ 対物光学系
１１０ 分離手段
１１３ 検出手段

Claims (17)

1. 光源からの照射光により試料を走査させる走査手段と、
   前記照射光を前記試料に導く対物光学系と、
   前記走査手段からの前記照射光を前記対物光学系に導くリレー光学系と、
   前記光源と前記走査手段との間の前記照射光の光路上に配置されており、前記照射光の光路と、前記試料から射出して前記対物光学系、前記リレー光学系及び前記走査手段を通過した射出光の光路とを分離する分離手段と、
   前記分離手段からの前記射出光を検出する検出手段と、を有し、
   前記リレー光学系は、前記リレー光学系の入射瞳と前記リレー光学系の射出瞳と前記検出手段との相対位置を変更せず、且つ、前記リレー光学系の入射瞳の瞳径を変更せずに、前記リレー光学系の射出瞳の瞳径を変更可能に構成されている
   ことを特徴とする走査型顕微鏡。
2. 前記対物光学系の入射瞳の瞳径に基づいて、前記リレー光学系の射出瞳の瞳径を変更する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
3. 前記走査手段は、前記対物光学系の倍率と前記対物光学系の入射瞳の瞳径とにしたがって、前記照射光の走査角度を変更する
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記リレー光学系は、前記リレー光学系の射出瞳の位置が前記対物光学系の入射瞳の位置となるように配置されている
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
5. 前記走査手段は、前記リレー光学系の入射瞳の位置に配置されている
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
6. 前記分離手段からの前記射出光を前記検出手段に導く検出光学系を有し、
   前記検出光学系は、前記走査手段と前記検出手段の検出面とが共役になるように構成されている
   ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
7. 前記リレー光学系は、前記検出光学系の瞳の瞳径を変更せずに、前記リレー光学系の射出瞳の瞳径を変更可能に構成されている
   ことを特徴とする請求項６に記載の走査型顕微鏡。
8. 前記分離手段は、前記照射光を透過する透過領域と、前記照射光の前記試料内における集光点と異なる位置から射出された前記射出光を反射する反射領域と、を有する
   ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
9. 前記透過領域のサイズは、前記照射光のビーム径以上である
   ことを特徴とする請求項８に記載の走査型顕微鏡。
10. 前記分離手段は、前記照射光を反射する反射領域と、前記照射光の前記試料内における集光点と異なる位置から射出された前記射出光を透過する透過領域と、を有する
    ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
11. 前記反射領域のサイズは、前記照射光のビーム径以上である
    ことを特徴とする請求項１０に記載の走査型顕微鏡。
12. 前記分離手段は、前記対物光学系の像面とフーリエ変換の関係にない位置に配置されていることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
13. 前記光源を第１の光源、前記照射光を第１の照射光とすると、
    前記第１の照射光と異なる波長の第２の照射光を出力する第２の光源と、
    前記第１の照射光と前記第２の照射光とを合波する合波手段と、を有し、
    前記合波手段で合波された前記第１の照射光及び前記第２の照射光は、前記走査手段、前記リレー光学系及び前記対物光学系を介して前記試料に照射される
    ことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
14. 前記分離手段は、前記合波手段と前記対物光学系との間の前記第１の照射光の光路上に配置されており、
    前記分離手段と前記検出手段との間に配置されており、前記射出光から前記第１の照射光の波長の光を抽出するフィルタを有する
    ことを特徴とする請求項１３に記載の走査型顕微鏡。
15. 前記射出光は、前記試料でコヒーレントラマン散乱された散乱光を含む
    ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の走査型顕微鏡。
16. 前記射出光は、前記試料で誘導ラマン散乱された散乱光を含む
    ことを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
17. 前記射出光は、前記試料で後方散乱された散乱光を含む
    ことを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。

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