JP2017044871A

JP2017044871A - 走査型顕微鏡

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Publication number: JP2017044871A
Application number: JP2015167266A
Authority: JP
Inventors: 真悟玉野; Shingo Tamano
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2017-03-02
Also published as: US20190056577A1; US10775598B2; US10107999B2; US20170059840A1

Abstract

【課題】正確な３次元像を高速に取得することができる走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】顕微鏡１００は、対物レンズ８の光軸方向に観察対象物である標本Ｓを走査する可変焦点レンズ５と、光軸と直交する方向に標本Ｓを走査するスキャナ３と、可変焦点レンズ５とスキャナ３を制御する制御部１４を備える。制御部１４は、可変焦点レンズ５に起因して生じる走査位置のズレを補正するための走査制御データに基づいて、スキャナ３を制御する。
【選択図】図１

Description

本発明は、走査型顕微鏡の技術に関し、特に、可変焦点レンズを備える走査型顕微鏡の技術に関する。

観察対象物の３次元像を観察する装置として、共焦点レーザ走査型顕微鏡や多光子励起レーザ走査型顕微鏡などの走査型顕微鏡が知られている。

走査型顕微鏡は、対物レンズの光軸と直交する方向（ｘ方向、ｙ方向）については、ガルバノスキャナや共振スキャナを用いて、数百から数千Ｈｚといった高い周波数で走査することができる。一方、光軸方向（ｚ軸方向）への走査は、典型的には、ピエゾエレクトリックトランスデューサ（以降、ピエゾ素子と記す）やその他のアクチュエータを用いて、対物レンズ又はステージを光軸方向へ移動させることによって行われる。また、特許文献１には、結像レンズを光軸方向に移動させることで、光軸方向への走査を実現する技術が記載されている。

しかしながら、光学系やステージなどの構造物をアクチュエータによって機械的に移動させる方法では、移動時間や移動に伴う振動の静定時間が必要となるため、光軸方向への高速な走査を行うことは難しい。このため、３次元像の取得にも時間がかかってしまう。

このような技術的な課題を解決する手段として、特許文献２には、可変焦点レンズが記載されている。可変焦点レンズを用いることで、印加電流もしくは印加電圧の変更により焦点距離を素早く変化させることができるため、光軸方向への高速な走査が可能となる。また、近年では、焦点距離がこれまで以上に大きく変動する可変焦点レンズが開発されているため、可変焦点レンズの走査手段としての有用性が高まっている。

米国特許第８５５３３２４号明細書特開２００４−３１７７０４号公報特開２００１−２５７９３２号公報特開２００４−０２９６８５号公報

しかしながら、可変焦点レンズを用いて光軸方向への走査を行うと、特許文献３及び特許文献４に記載されているように、可変焦点レンズの焦点距離の変化に起因して、可変焦点レンズを含む光学系の投影倍率が変化してしまう。さらに、光学系で生じる収差も変化してしまう。このため、観察対象物の正確な３次元像を取得することが難しい。
以上のような実情を踏まえ、本発明は、正確な３次元像を高速に取得することができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、対物レンズの光軸方向に観察対象物を走査する可変焦点レンズと、前記対物レンズの光軸と直交する方向に前記観察対象物を走査するスキャナと、前記可変焦点レンズと前記スキャナを制御する制御部と、を備え、前記制御部は、前記可変焦点レンズに起因して生じる走査位置のズレを補正するための走査制御データに基づいて、前記スキャナを制御する走査型顕微鏡を提供する。

本発明の別の態様は、対物レンズの光軸方向に観察対象物を走査する可変焦点レンズと、前記対物レンズの光軸と直交する方向に前記観察対象物を走査するスキャナと、前記可変焦点レンズと前記スキャナを制御する制御部と、を備え、前記制御部は、前記可変焦点レンズに起因して生じる走査位置のズレが補正されるように、前記スキャナを制御する走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、正確な３次元像を高速に取得することができる走査型顕微鏡を提供することができる。

実施例１に係る顕微鏡１００の構成を示した図である。走査制御データの生成方法を示すフローチャートである。横倍率を補正する方法について説明するための図である。糸巻き型のディストーションを補正する方法について説明するための図である。樽型のディストーションを補正する方法について説明するための図である。走査範囲の中心位置ズレを補正する方法について説明するための図である。スキャナと走査位置の関係について説明するための図である。像面湾曲を補正する方法について説明するための図であり、像面湾曲が補正される前の状態を示した図である。像面湾曲を補正する方法について説明するための図であり、像面湾曲が補正された後の状態を示した図である。実施例１に係る顕微鏡１００で行われる３次元画像データ生成処理のフローチャートである。実施例２に係る顕微鏡２００の構成を示した図である。実施例３に係る顕微鏡３００の構成を示した図である。実施例４に係る顕微鏡４００の構成を示した図である。実施例５に係る顕微鏡５００の構成を示した図である。

図１は、本実施例に係る顕微鏡１００の構成を示した図である。顕微鏡１００は、共焦点レーザ走査型顕微鏡である。なお、顕微鏡１００が標本Ｓからの蛍光を検出する蛍光顕微鏡である場合を例にして説明するが、顕微鏡１００は、蛍光顕微鏡に限られず、例えば、反射光を検出する工業用の共焦点レーザ走査型顕微鏡であってもよい。

顕微鏡１００は、レーザ光を出射するレーザ１と、観察対象物である標本Ｓが配置されるステージ９とを備え、レーザ１とステージ９の間の照明光路上に、ビームエキスパンダ１９と、ダイクロイックミラー２と、スキャナ３と、リレーレンズ４と、可変焦点レンズ５と、リレーレンズ６と、ミラー７と、対物レンズ８を備えている。なお、顕微鏡１００が工業用の共焦点レーザ走査型顕微鏡である場合には、顕微鏡１００は、ダイクロイックミラー２の代わりに偏光ビームスプリッターを含み、偏光ビームスプリッターと対物レンズの間にλ/4板を含んでもよい。また、偏光ビームスプリッターとレーザ１の間にλ/2板を含んでもよい。

ビームエキスパンダ１９は、使用する対物レンズの瞳径等に合わせてレーザ１からのレーザ光の光束径（ビーム径）を変更する光学系である。ビームエキスパンダ１９により対物レンズ８の瞳に入射するレーザ光の光束径を制御することで、対物レンズ８で発生する諸収差（球面収差など）を抑制することが可能である。また、例えば、細胞の深部を観察する場合に、励起光の散乱を抑制することも可能である。

ダイクロイックミラー２は、レーザ光を反射させ、蛍光を透過させる特性を有するミラーである。ダイクロイックミラー２は、波長に基づいて入射光を分離する手段である。スキャナ３は、対物レンズ８の光軸と直交する方向に標本Ｓを走査する手段であり、対物レンズ８の瞳と光学的に共役な位置（以降、瞳共役位置）又はその近傍に配置されている。スキャナ３は、対物レンズ８の光軸と直交するｘ方向に走査するスキャナと、対物レンズ８の光軸と直交し且つｘ方向と直交するｙ方向に走査するスキャナを含む。各スキャナは、例えば、ガルバノスキャナ、共振スキャナである。

リレーレンズ４は、スキャナ３を可変焦点レンズ５に投影するレンズである。可変焦点レンズ５は、その焦点距離を変化させることで、対物レンズ８の光軸方向に標本Ｓを走査する手段である。可変焦点レンズ５は、例えば、レンズ形状を変化させることで焦点距離を変化させる。図１において点線で示す光束は、実線で示す光束とは可変焦点レンズ５の焦点距離が異なるときの光束を示している。可変焦点レンズ５は、対物レンズ８の瞳共役位置又はその近傍に配置されている。

リレーレンズ６は、対物レンズ８の瞳を可変焦点レンズ５に投影するレンズである。対物レンズ８は、図示しないレボルバに装着されている。顕微鏡１００では、観察倍率などに応じて、対物レンズ８を含む複数の対物レンズが切り替えて使用される。ステージ９は、図示しないアクチュエータによって対物レンズ８の光軸方向に移動する電動ステージである。

顕微鏡１００は、標本Ｓからの蛍光を検出する光検出器１３を備え、さらに、ダイクロイックミラー２と光検出器１３の間の検出光路上に、レンズ１０と、ピンホール板１１と、レンズ１２を備えている。

レンズ１０は、ダイクロイックミラー２を通過した蛍光を集光するレンズである。ピンホール板１１は、対物レンズ８の前側焦点位置と共役な位置にピンホールが形成された共焦点絞りである。レンズ１２は、ピンホール板１１を通過した蛍光を光検出器１３に導くレンズである。光検出器１３は、検出した蛍光の強度に応じた信号を出力する光検出器であり、例えば、光電子増倍管（PMT：Photomultiplier Tube）である。

顕微鏡１００は、さらに、記憶部１５を有する制御部１４を備えている。制御部１４は、顕微鏡１００全体の動作を制御するコントローラであり、スキャナ３と、可変焦点レンズ５と、ステージ９を制御する。制御部１４は、スキャナ３に含まれるミラーの振り角、可変焦点レンズ５の焦点距離、ステージ９の光軸方向の位置を変化させることができる。また、制御部１４は、ビームエキスパンダ１９を制御してもよく、ビームエキスパンダ１９から射出されるレーザ光の光束径を変化させてもよい。記憶部１５は、例えば、ハードディスク装置であり、可変焦点レンズ５に起因して生じる走査位置のズレを補正するための走査制御データを記憶する。走査制御データは、スキャナ３若しくは可変焦点レンズ５又はその両方を制御するためのデータであり、対物レンズ毎に記憶部１５に記憶される。走査制御データは、図２で後述する方法により生成され、記憶部１５に記憶される。

以上のように構成された顕微鏡１００では、レーザ１から出射したレーザ光は、ダイクロイックミラー２で反射し、スキャナ３、リレーレンズ４、可変焦点レンズ５、リレーレンズ６、及びミラー７を介して対物レンズ８に入射し、標本Ｓ上に集光する。光の集光位置（以降、走査位置と記す）は、スキャナ３の振り角を変化させることで、光軸と直交する方向（ｘｙ方向）に変化し、可変焦点レンズ５の焦点距離を変化させることで、光軸方向（ｚ方向）に変化する。このため、制御部１４がスキャナ３及び可変焦点レンズ５を制御することで、標本Ｓを３次元に走査することができる。なお、可変焦点レンズ５の焦点距離の変動量には限界があるため、可変焦点レンズ５による光軸方向の走査は、ステージ９の移動により標本Ｓを対物レンズ８の焦点位置近傍にまで近づけた後に行われる。

レーザ光が照射された標本Ｓでは、蛍光が発生し、対物レンズ８、ミラー７、リレーレンズ６、可変焦点レンズ５、リレーレンズ４、及びスキャナ３を介してダイクロイックミラー２に入射する。蛍光は、ダイクロイックミラー２を透過してレンズ１０によってピンホール板１１上に集光する。レーザ光が集光した走査位置から生じた蛍光は、ピンホール板１１に形成されたピンホールを通過して、レンズ１２を介して入射する光検出器１３で検出される。一方、走査位置以外の位置から生じた蛍光は、ピンホール板１１で遮断される。これにより、光検出器１３は、走査位置から生じた蛍光の強度に応じた信号を出力する。

顕微鏡１００は、スキャナ３による走査期間中に、光検出器１３からの出力信号をサンプリングすることで、標本Ｓの２次元像（ｘｙ断面像）を取得し、ｘｙ断面像データを生成する。そして、この処理を可変焦点レンズ５による光軸方向への走査が行われる毎に繰り返す。顕微鏡１００は、このようにして生成されたｚ座標の異なる複数のｘｙ断面像データに基づいて、３次元画像データを生成する。

顕微鏡１００では、制御部１４は、記憶部１５に記憶された走査制御データに基づいて、可変焦点レンズ５に起因して生じる走査位置のズレが補正されるように、スキャナ３又はスキャナ３と可変焦点レンズ５の両方を制御するように構成されている。これにより、可変焦点レンズ５に起因する倍率誤差や収差等を抑えることができるため、顕微鏡１００は、正確な３次元像を取得することができる。また、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５の焦点距離を変化させることにより、標本Ｓを光軸方向に走査する。このため、対物レンズ８やステージ９を光軸方向に移動させる場合に比べて、高速な走査が可能である。従って、顕微鏡１００によれば、正確な３次元像を高速に取得することができる。

図２は、制御部１４による走査制御に使用される走査制御データの生成方法を示すフローチャートである。以下、図２を参照しながら、走査制御データの生成方法について具体的に説明する。

まず、利用者は、キャリブレーション用の標本を準備し、キャリブレーション用の標本をステージ９に配置する（ステップＳ１）。キャリブレーション用の標本は、例えば、蛍光を発する領域の形状が既知な標本である。

キャリブレーション用の標本がステージ９に配置されると、利用者は、平行光束が対物レンズ８に入射するように可変焦点レンズ５を調整する（ステップＳ２）。可変焦点レンズ５が調整されると、利用者は、ステージ９を光軸方向に移動させて、標本にピントが合うように、標本と対物レンズ８の間隔を調整する（ステップＳ３）。ここでは、利用者は、顕微鏡１００が有する図示しない観察手段によって、標本Ｓにピントが合っているかどうかを確認しながら、ステージ９の位置を調整してもよい。

次に、顕微鏡１００は、利用者からの指示に従って、標本の面のｘｙ断面像を取得する（ステップＳ４）。ここでは、制御部１４は走査制御データを使用することなくスキャナ３を制御する。即ち、制御部１４が可変焦点レンズ５がない場合と同様にスキャナ３を制御することで、ｘｙ断面像データが生成される。

その後、顕微鏡１００は、焦点深度内のｘｙ断面像を、全て取得済みか否かを判定する（ステップＳ５）。ここでは、顕微鏡１００は、例えば、ステップＳ３でピントが合った面から焦点深度内の領域のｘｙ断面像を一定間隔毎に全て取得したか否かを判定する。

全て取得していないと判定されると（ステップＳ５ＮＯ）、顕微鏡１００は、焦点深度内から外れないようにステージ９を光軸方向に移動させて、標本と対物レンズ８の間の距離を変更する（ステップＳ６）。その後、ｘｙ断面像の取得処理（ステップＳ４）と判定処理（ステップＳ５）を繰り返す。

全て取得したと判定されると（ステップＳ５ＹＥＳ）、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５の全ての焦点距離でｘｙ断面像を、取得済みか否かを判定する（ステップＳ７）。なお、全ての焦点距離とは、例えば、可変焦点レンズ５の焦点距離の変動範囲における一定間隔毎の焦点距離の全てのことである。

全ての焦点距離でｘｙ断面像を取得していないと判定されると（ステップＳ７ＮＯ）、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５の焦点距離を変更する（ステップＳ８）。その後、ピント合わせ処理（ステップＳ３）以降の処理（ステップＳ３からステップＳ７）を繰り返す。

全ての焦点距離でｘｙ断面像を取得したと判定されると（ステップＳ７ＹＥＳ）、顕微鏡１００は、走査制御データを生成して（ステップＳ９）、走査制御データの生成処理を終了する。ここでは、顕微鏡１００は、まず、可変焦点レンズ５の焦点距離毎に生成された複数のｘｙ断面像データから、焦点距離毎に標本の３次元像データを生成する。そして、顕微鏡１００は、焦点距離毎に生成された３次元像データとキャリブレーション用の標本の情報に基づいて、可変焦点レンズ５に起因して生じた走査位置のズレを特定する。最後に、顕微鏡１００は、特定された走査位置のズレが補正されるように走査制御データを生成し、記憶部１５に記憶させる。なお、図２で示したフローチャートは１つの波長での走査制御データを取得するものであるが、観察する波長毎に走査制御データを取得してもよい。また、走査制御データは、制御部１４で生成されてもよい。

以下、図３から図７を参照しながら、走査位置のズレが補正されるように生成される走査制御データの生成方法について、走査位置のズレが生じる要因（横倍率の誤差、ディストーション、中心位置ズレ、像面湾曲）毎に詳細に説明する。

図３は、横倍率を補正する方法について説明するための図である。図３には、横倍率の誤差によって生じる走査範囲の変化が示されている。図３に示すように、横倍率に誤差が生じると、３次元画像データに含まれるｘｙ方向の走査範囲Ｆ１が、誤差がない場合に走査されるｘｙ方向の走査範囲Ｆ０に対して拡大又は縮小（ここでは縮小）される。従って、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因して走査範囲が縮小される場合には、誤差がない場合に設定すべき走査範囲（例えば、走査範囲Ｆ０）よりも広い走査範囲を設定する走査制御データを生成すればよい。また、可変焦点レンズ５に起因して走査範囲が拡大される場合には、誤差がない場合に設定すべき走査範囲よりも狭い走査範囲を設定する走査制御データを生成すればよい。

図４Ａは、糸巻き型のディストーションを補正する方法について説明するための図であり、図４Ｂは、樽型のディストーションを補正する方法について説明するための図である。図４Ａ及び図４Ｂには、ディストーションによって生じる走査範囲の変化が示されている。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ディストーションが生じると、３次元画像データに含まれるｘｙ方向の走査範囲（走査範囲Ｆ２及び走査範囲Ｆ３）の形状が、ディストーションがない場合に走査されるｘｙ方向の走査範囲Ｆ０を縦横に歪めた形状になる。このため、走査範囲Ｆ２（又は走査範囲Ｆ３）の中心から離れるほど走査位置のズレが大きく生じ、特に、ｘ方向（ｙ方向）に離れるほどｘ方向（ｙ方向）の走査位置のズレが大きく生じることになる。従って、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因してディストーションが生じる場合には、走査範囲の中心から離れるほどディストーションがない場合に設定すべき走査位置からｘｙ方向に大きく補正された走査位置を設定する走査制御データを生成すればよい。

図５は、走査範囲の中心位置ズレを補正する方法について説明するための図である。図５には、走査範囲の中心位置がズレることによって生じる走査範囲の変化が示されている。なお、走査範囲の中心位置ズレは、例えば、可変焦点レンズ５の焦点距離の変更により、可変焦点レンズ５の光軸方向が変化してしまう場合に生じ得る。図５に示すように、中心位置ズレが生じると、３次元画像データに含まれるｘｙ方向の走査範囲Ｆ４は、中心位置ズレがない場合に走査されるｘｙ方向の走査範囲Ｆ０がシフト（平行移動）した範囲になる。なお、シフトする方向は中心位置がズレた方向であり、シフトする距離は中心位置がズレた距離である。従って、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因して中心位置ズレが生じる場合には、中心位置ズレがない場合に設定すべき走査範囲から、ズレが生じる方向とは反対の方向にズレが生じる距離と同じ距離だけシフトした走査範囲を設定する走査制御データを生成すればよい。

図６には、リレーレンズＲＬにより対物レンズＯＢの瞳共役位置にスキャナＳＣが配置された光学系が示されている。このような光学系では、スキャナＳＣの振り角（スキャナＳＣの反射面と光軸のなす角度）が変化することで、対物レンズＯＢの瞳位置に入射する主光線の角度が変化する。この角度の変化が対物レンズＯＢによって集光位置（走査位置）のｘｙ方向への位置の変化に変換されるため、スキャナＳＣの振り角を変更することで、集光位置を変化させることができる。なお、図６には、スキャナＳＣの振り角を変更することで、走査位置が位置Ｐ１から位置Ｐ２に移動した例が示されている。

顕微鏡１００の光学系も図６に示す光学系と同様に機能するため、顕微鏡１００でもスキャナ３の振り角を変更することで、走査位置をｘｙ方向に変化させることができる。図３から図５で説明した各要因（横倍率の誤差、ディストーション、中心位置ズレ）及びそれらの組み合わせは、いずれも可変焦点レンズ５に起因する走査位置のズレがｘｙ方向に生じるものである。従って、可変焦点レンズ５に起因して横倍率の誤差、ディストーション、中心位置ズレが発生し、その結果、走査位置のズレが生じる場合には、顕微鏡１００は、制御部１４が走査制御データに基づいてスキャナ３を制御するだけで、走査位置のズレを補正することができる。この場合、走査制御データはいずれも、スキャナ３を制御するためのデータである。具体的には、可変焦点レンズ５の焦点距離に応じてスキャナ３を制御するためのデータであり、例えば、スキャナ３の振り角を目標とするｘｙｚ座標毎に指定するためのデータである。つまり、制御部１４が可変焦点レンズ５の焦点距離に応じてスキャナ３を制御することで、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因する走査位置のズレを補正することができる。

図７Ａ及び図７Ｂは、像面湾曲を補正する方法について説明するための図であり、図７Ａ及び図７Ｂには、像面湾曲によって生じる走査範囲の変化が示されている。図７Ａは、像面湾曲が補正される前の状態を示した図であり、図７Ｂは、像面湾曲が補正された後の状態を示した図である。なお、図７Ａ及び図７Ｂでは、可変焦点レンズ５と標本の間の光学系（リレーレンズ６、ミラー７、対物レンズ８）の記載は省略されている。図７Ａに示すように、像面湾曲が生じると、３次元画像データに含まれる走査範囲Ｆ５がｚ方向に反った形状を有することになるため、走査範囲の中心付近の走査位置のｚ座標と中心から離れた走査位置のｚ座標が異なることになる。従って、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因して像面湾曲が生じる場合には、走査範囲の中心から離れるほど像面湾曲がない場合に設定すべき走査位置からｚ方向に大きく補正された走査位置を設定する走査制御データを生成すればよい。

図７Ｂに示すように、レンズ形状を変化させて可変焦点レンズ５の焦点距離を変化させると、走査位置のｚ座標を変化させることができる。像面湾曲は、可変焦点レンズ５に起因する走査位置のズレがｚ方向に生じるものである。従って、可変焦点レンズ５に起因して像面湾曲が発生し、その結果、走査位置のズレが生じる場合には、顕微鏡１００は、制御部１４が走査制御データに基づいて可変焦点レンズ５を制御するだけで、走査位置のズレを補正することができる。この場合、走査制御データは、可変焦点レンズ５を制御するためのデータである。具体的には、目標とするｚ座標（走査位置の情報）から逆算される可変焦点レンズ５の焦点距離と目標とするｘｙ座標（走査位置の情報）から逆算されるスキャナ３の振り角に応じて可変焦点レンズ５を制御するためのデータであり、例えば、可変焦点レンズ５の焦点距離を目標とするｘｙｚ座標毎に指定するためのデータである。つまり、制御部１４が目標とするｚ座標から逆算される可変焦点レンズ５の焦点距離と目標とするｘｙ座標から逆算されるスキャナ３の振り角とに応じて可変焦点レンズ５を制御することで、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因する走査位置のズレを補正することができる。

また、可変焦点レンズ５に起因して走査位置のズレがｘｙ方向とｚ方向の両方に生じる場合（例えば、像面湾曲とディストーションが生じた場合など）には、顕微鏡１００は、制御部１４が走査制御データに基づいてスキャナ３と可変焦点レンズ５を制御することで、走査位置のズレを補正することができる。この場合、走査制御データは、目標とするｚ座標から逆算される可変焦点レンズ５の焦点距離に応じてスキャナ３を制御するためのデータと、目標とするｚ座標から逆算される可変焦点レンズ５の焦点距離と目標とするｘｙ座標から逆算されるスキャナ３の振り角とに応じて可変焦点レンズ５を制御するためのデータを含んでいる。走査制御データは、例えば、スキャナ３の振り角と可変焦点レンズ５の焦点距離とを、目標とするｘｙｚ座標毎に指定するためのデータである。つまり、制御部１４が、目標とするｚ座標から逆算される可変焦点レンズ５の焦点距離に応じてスキャナを制御し、目標とするｚ座標から逆算される可変焦点レンズ５の焦点距離と目標とするｘｙ座標から逆算されるスキャナ３の振り角とに応じて可変焦点レンズ５を制御することで、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５に起因する走査位置のズレを補正することができる。また、走査位置のズレは観察する波長毎に異なるため、それぞれの波長で走査制御データを持ってもよい。

図８は、顕微鏡１００で行われる３次元画像データ生成処理のフローチャートである。以下、図８を参照しながら、走査制御データを使用して３次元画像データを生成する方法について具体的に説明する。なお、図８に示す３次元画像データ生成処理は、標本Ｓがステージ９に配置され、対物レンズ８に平行光束が入射するように可変焦点レンズ５の焦点距離が調整された状態で、利用者が標本Ｓにピントを合わせた後に行われる。

まず、顕微鏡１００は、初期設定を行う（ステップＳ１１）。ここでは、顕微鏡１００は、使用する対物レンズ、走査範囲（ｘｙ方向の走査範囲及びｚ方向の走査範囲）、ｘｙ断面像を取得するｚ座標の間隔（以降、ｚ間隔と記す）などの情報を設定する。これらの情報は、利用者によって顕微鏡１００に入力されてもよく、予め記憶部１５に記憶された設定ファイルから読み出されてもよい。

次に、顕微鏡１００は、走査制御データを読み出す（ステップＳ１２）。ここでは、制御部１４が、対物レンズ毎に記憶部１５に記憶された走査制御データの中から、使用する対物レンズ（ここでは、対物レンズ８）に対応する走査制御データを読み出す。

走査制御データを読み出すと、顕微鏡１００は、読み出した走査制御データに基づいて、ｘｙ断面像を取得する（ステップＳ１３）。ここでは、可変焦点レンズ５に起因してｘｙ方向に走査位置のズレが生じる場合には、制御部１４が対物レンズ８に応じた走査制御データに基づいてスキャナ３を制御する。また、可変焦点レンズ５に起因してｘｙ方向及びｚ方向に走査位置のズレが生じる場合には、制御部１４が対物レンズ８に応じた走査制御データに基づいてスキャナ３及び可変焦点レンズ５を制御する。その結果、ｘｙ断面像が取得され、ｘｙ断面像データが生成される。

その後、顕微鏡１００は、全てのｚ座標でｘｙ断面像を取得済みか否かを判定する（ステップＳ１４）。ここでは、顕微鏡１００は、例えば、ステップＳ１１で設定されたｚ方向の走査範囲内をｚ間隔毎に全て走査済みか否かを判定する。

全て取得していないと判定されると（ステップＳ１４ＮＯ）、顕微鏡１００は、可変焦点レンズ５の焦点距離を変更してｚ座標を変更する（ステップＳ１５）。ここでは、制御部１４が走査位置のｚ座標がｚ間隔だけ変化するように可変焦点レンズ５の焦点距離を変更する。その後、ｘｙ断面像の取得処理（ステップＳ１３）と判定処理（ステップＳ１４）を繰り返す。

全て取得したと判定されると（ステップＳ１４ＹＥＳ）、顕微鏡１００は、３次元画像データを生成し（ステップＳ１５）、３次元画像データ生成処理を終了する。ここでは、顕微鏡１００は、ステップＳ１３で生成されたｚ座標の異なる複数のｘｙ断面像データから３次元画像データを生成する。なお、図８で示したフローチャートは１つの波長での３次元画像データを生成するものであるが、３次元画像データを観察する波長毎に生成し、重ね合わせて１つの多色３次元画像データを生成してもよい。また、光学系が持つ色収差情報を基にそれぞれの波長で３次元像位置が一致するように可変焦点レンズとスキャナを制御しながら３次元画像データを生成してもよい。

図９は、本実施例に係る顕微鏡２００の構成を示した図である。顕微鏡２００は、共焦点レーザ走査型顕微鏡である。顕微鏡２００は、スキャナ３と可変焦点レンズ５の配置が顕微鏡１００とは反対になっている点を除き、顕微鏡１００と同様である。顕微鏡２００によっても、走査制御データに基づいて標本Ｓを走査することで、実施例１に係る顕微鏡１００と同様に、正確な３次元像を高速に取得することができる。

図１０は、本実施例に係る顕微鏡３００の構成を示した図である。顕微鏡３００は、共焦点レーザ走査型顕微鏡である。顕微鏡３００は、可変焦点レンズ５が対物レンズ８の瞳位置又はその近傍に配置されている点を除き、顕微鏡２００と同様である。顕微鏡３００によっても、走査制御データに基づいて標本Ｓを走査することで、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡と同様に、正確な３次元像を高速に取得することができる。この構成は、対物レンズ８の瞳位置が対物レンズ８の外側に位置する場合に採用し得る。

図１１は、本実施例に係る顕微鏡４００の構成を示した図である。顕微鏡４００は、共焦点レーザ走査型顕微鏡である。顕微鏡４００は、対物レンズ８を光軸方向に移動させるアクチュエータ１６を備えている点が、顕微鏡１００とは異なっている。顕微鏡４００は、制御部１４がアクチュエータ１６に対物レンズ８を移動させることで、標本Ｓと対物レンズ８との間の距離を変更することができる。その他の点は、顕微鏡１００と同様である。顕微鏡４００によっても、走査制御データに基づいて標本Ｓを走査することで、実施例１から実施例３に係る顕微鏡と同様に、正確な３次元像を高速に取得することができる。

なお、顕微鏡４００では、対物レンズ８の移動により、対物レンズ８の瞳共役位置と可変焦点レンズ５の位置関係も変化する。このため、可変焦点レンズ５に起因する走査位置のズレが対物レンズ８の位置によって変化し得る。この点を考慮して、記憶部１５には、対物レンズの位置毎の走査制御データが記憶されてもよく、制御部１４は、対物レンズの位置に応じた走査制御データに基づいて、スキャナ３又はスキャナ３と可変焦点レンズ５の両方を制御してもよい。また、対物レンズ８の移動によって可変焦点レンズ５が対物レンズ８の瞳共役位置から大きく外れた結果、走査位置のズレが可変焦点レンズ５によって調整できない大きさとなることが起こり得る。記憶部１５には、このような場合に使用される、走査位置をｚ方向にオフセットするためのオフセット用データが追加で記憶されていてもよい。

図１２は、本実施例に係る顕微鏡５００の構成を示した図である。顕微鏡５００は、共焦点レーザ走査型顕微鏡である。顕微鏡５００は、スキャナ３とダイクロイックミラー２の間に、リレーレンズ１７と、波面変調器１８を備えている点が、顕微鏡４００とは異なっている。リレーレンズ１７は、波面変調器１８をスキャナ３に投影するレンズである。波面変調器１８は、波面収差を補正するための波面収差補正装置であり、対物レンズの瞳共役位置に配置されている。

顕微鏡５００によっても、走査制御データに基づいて標本Ｓを走査することで、実施例１から実施例４に係る顕微鏡と同様に、正確な３次元像を高速に取得することができる。また、顕微鏡５００では、スキャナ３及び可変焦点レンズ５によっては補正することができない収差（例えば、球面収差など）を波面変調器１８で補正することができる。このため、さらに正確な３次元像の取得が可能となる。

なお、図１２では、透過型の波面変調器１８を例示したが、例えば、ＬＣＯＳやデフォーマブルミラーなどの反射型の波面変調器が採用されてもよい。また、図１２では、波面変調器１８がスキャナ３と（図示しない）ダイクロイックミラー２の間に配置されているが、波面変調器１８は対物レンズ８の瞳共役位置に配置されていればよい。

上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。走査型顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。この明細書で説明される個別の実施例の文脈におけるいくつかの特徴を組み合わせて単一の実施例としてもよい。

例えば、上述した実施例では、顕微鏡が共焦点レーザ走査型顕微鏡である場合を例示したが、走査型顕微鏡であればよく、例えば、多光子励起レーザ走査型顕微鏡であってもよい。または、光源は必ずしもレーザに限られず、レーザ以外に、例えば、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、水銀ランプなどの光源を有する走査型顕微鏡であってもよい。

また、上述した実施例では、記憶部１５が対物レンズ毎に走査制御データを記憶する例を示したが、走査制御データは、対物レンズ毎で且つビームエキスパンダ１９から射出されるレーザ光の光束径毎に記憶部１５に記憶されてもよい。対物レンズの瞳に入射するレーザ光の光束径によって対物レンズで生じる収差が変化するが、そのような走査制御データを用いることで、可変焦点レンズに起因して生じる走査位置のズレだけではなく、対物レンズで生じる収差の変化に起因して生じる走査位置のズレも補正することができる。

１・・・レーザ、２・・・ダイクロイックミラー、３、ＳＣ・・・スキャナ、４、６、１７、ＲＬ・・・リレーレンズ、５・・・可変焦点レンズ、７・・・ミラー、８、ＯＢ・・・対物レンズ、９・・・ステージ、１０、１２・・・レンズ、１１・・・ピンホール板、１３・・・光検出器、１４・・・制御部、１５・・・記憶部、１６・・・アクチュエータ、１８・・・波面変調器、１９・・・ビームエキスパンダ、１００、２００、３００、４００、５００・・・顕微鏡、Ｓ・・・標本、Ｆ０、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５・・・走査範囲、Ｐ１、Ｐ２・・・位置

Claims

対物レンズの光軸方向に観察対象物を走査する可変焦点レンズと、
前記対物レンズの光軸と直交する方向に前記観察対象物を走査するスキャナと、
前記可変焦点レンズと前記スキャナを制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、前記可変焦点レンズに起因して生じる走査位置のズレを補正するための走査制御データに基づいて、前記スキャナを制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１に記載の走査型顕微鏡において、
前記制御部は、前記走査制御データに基づいて、前記可変焦点レンズと前記スキャナを制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１又は請求項２に記載の走査型顕微鏡において、
前記制御部は、前記対物レンズに応じた前記走査制御データに基づいて、前記スキャナ、又は、前記可変焦点レンズと前記スキャナの両方を制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記制御部は、前記対物レンズの位置に応じた前記走査制御データに基づいて、前記スキャナ、又は、前記可変焦点レンズと前記スキャナの両方を制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、さらに、
前記走査制御データが記憶された記憶部を備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、さらに、
波面収差を補正する波面収差補正装置を備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
対物レンズの光軸方向に観察対象物を走査する可変焦点レンズと、
前記対物レンズの光軸と直交する方向に前記観察対象物を走査するスキャナと、
前記可変焦点レンズと前記スキャナを制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、前記可変焦点レンズに起因して生じる走査位置のズレが補正されるように、前記スキャナを制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項７に記載の走査型顕微鏡において、
前記制御部は、前記可変焦点レンズの焦点距離に応じて前記スキャナを制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項７に記載の走査型顕微鏡において、
前記制御部は、前記可変焦点レンズに起因して生じる走査位置のズレが補正されるように、前記スキャナと前記可変焦点レンズを制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項９に記載の走査型顕微鏡において、
前記制御部は、
前記走査位置の情報から逆算される前記可変焦点レンズの焦点距離に応じて前記スキャナを制御し、
前記走査位置の情報から逆算される前記可変焦点レンズの焦点距離と前記走査位置の情報から逆算される前記スキャナの振り角に応じて前記可変焦点レンズを制御する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。