JP4608219B2 - レーザ走査顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、生体を観察対象とした生物研究分野に利用するレーザ走査顕微鏡に関するものである。

最近の生物研究分野では、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の発見により、光学顕微鏡により生きた細胞内蛋白を可視化することが可能となり、生細胞の機能解析が頻繁に行なわれるようになっている。

一方、共焦点蛍光観察も、生細胞の３次元解析や細胞内部の解析を行なうために広く用いられている。このような共焦点蛍光観察には、レーザ走査顕微鏡が広く使用されており、現在のレーザ走査顕微鏡の基本構成をなすものとして、特許文献１に開示されたものが知られている。

特許文献１に開示されているレーザ走査顕微鏡は、同文献中の図１に示すようにレーザ走査手段とレーザ導入部を光学顕微鏡に付加することで、共焦点蛍光観察を可能にしている。また、特許文献１には、同文献１中の図６や図１０に示すように内視鏡または医療用に用いる小型の遠隔ヘッドを備えた共焦点顕微鏡も開示されている。この開示されたヘッドは、レーザ光を伝達する光ファイバの出射端を移動させてレーザビームを走査する方式によりヘッドを小型化している。

一方、最近の生物研究分野では、従来のようにペトリディッシュに入った細胞や組織をそれぞれ単独で観察、解析するのでなく、細胞や組織が生育するのに最適な環境である生体内でどのような振る舞いを見せるかを研究することが行なわれつつある。一般的には、マウスやそれ以上のサイズの実験動物を対象とした研究が行なわれているのが現状である。
特開平３−８７８０４号公報

しかしながら、従来のレーザ走査顕微鏡では、光学顕微鏡を母体としているため、試料に対する大きさや観察方向の制限が多い。そのため、研究対象にできる実験動物が限定されている。

また、顕微鏡の観察方向に合わせて実験動物の向きを制限する必要があり、実験動物にストレスを与えずに観察することができないという問題がある。

さらに、顕微鏡ベースであるため、装置全体が大型化しており、実験スペースの制限などが多く実用性に欠けるという事実もある。

一方、特許文献１に開示された小型ヘッドは、実験動物の観察方向の制限を解消できる。しかし、この特許文献１の小型ベッドでは、レーザ走査にともなって光ファイバが移動するので、ファイバの移動によりレーザ光の光量ムラが発生し、正しい観察画像を形成することができない。実験動物を用いた研究などの用途に対して、これは大きな問題となる。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、観察条件の制約がなく、精度の高い観察画像を取得できる小型で取り扱いの容易なレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、少なくとも１つのレーザ光源を有するレーザ発生手段と、筐体を有し、該筐体に対して固定的に設けられ且つレーザ光を導入するレーザ導入部、前記レーザ導入部からのレーザ光を２次元走査する走査ミラーおよび前記レーザ光を試料面上に投影するための少なくとも１つのレンズから構成される光学系を前記筐体内に備えた光学ヘッド部と、前記筐体を前記光学系の光軸に対しほぼ直角な面内で移動可能なＸＹ移動機構と、前記筐体を傾斜させる傾斜機構との少なくとも一方と、前記ＸＹ移動機構または傾斜機構を介して上方から前記筐体を保持し、筐体及びＸＹ移動機構または傾斜機構を支柱と平行な方向に移動可能な焦準部を持つスタンド部と、前記レーザ発生手段のレーザ光源からのレーザ光を前記レーザ導入部に導入するための第１のファイバと、前記第１のファイバと前記レーザ発生手段との間に配置され前記試料より発せられる蛍光を分離する蛍光分離手段と、前記蛍光分離手段により分離された前記試料より発せられる蛍光を検出する少なくとも１つの検出手段とを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記検出手段、前記レーザ発生手段および前記蛍光分離手段が一体的に構成されることを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記レーザ発生手段と前記蛍光分離手段が第２のファイバにより接続されることを特徴としている。

請求項４記載の発明は、少なくとも１つのレーザ光源を有するレーザ発生手段と、筐体を有し、該筐体に対して固定的に設けられ且つレーザ光を導入するレーザ導入部、前記レーザ導入部からのレーザ光を２次元走査する走査ミラー、前記レーザ光を試料面上に投影するための少なくとも１つのレンズから構成される光学系、前記試料面と前記レーザ導入部との間に配置され前記試料より発せられる蛍光を分離する蛍光分離手段および前記蛍光分離手段により分離された前記試料より発せられる蛍光を検出する少なくとも１つの検出手段を前記筐体内に備えた光学ヘッド部と、前記筐体を前記光学系の光軸に対しほぼ直角な面内で移動可能なＸＹ移動機構と、前記筐体を傾斜させる傾斜機構との少なくとも一方と、前記ＸＹ移動機構または傾斜機構を介して上方から前記筐体を保持し、筐体及びＸＹ移動機構または傾斜機構を支柱と平行な方向に移動可能な焦準部を持つスタンド部と、前記レーザ発生手段のレーザ光源からのレーザ光を前記レーザ導入部に導入するための第１のファイバとを具備したことを特徴としている。

請求項５記載の発明は、筐体を有し、該筐体に固定的に設けられた少なくとも１つの半導体レーザ、前記半導体レーザからのレーザ光を２次元走査する走査ミラー、前記レーザ光を試料面上に投影するための少なくとも１つのレンズから構成される光学系、前記試料面と前記半導体レーザとの間に配置され前記試料より発せられる蛍光を分離する蛍光分離手段および前記蛍光分離手段により分離された前記試料より発せられる蛍光を検出する少なくとも１つの検出手段を前記筐体内に備えた光学ヘッド部と、前記筐体を前記光学系の光軸に対しほぼ直角な面内で移動可能なＸＹ移動機構と、前記筐体を傾斜させる傾斜機構との少なくとも一方と、前記ＸＹ移動機構または傾斜機構を介して上方から前記筐体を保持し、筐体及びＸＹ移動機構または傾斜機構を支柱と平行な方向に移動可能な焦準部を持つスタンド部と、を具備したことを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項1乃至５のいずれかに記載の発明において、前記光学系は、前記試料面側に配置され、平行光を前記試料面に集光する第１の光学系と、前記走査ミラーからの光線を前記第１の光学系の後側焦点位置に集光するための第２の光学系を有し、前記第２の光学系を前記筐体側に固定し、前記第１の光学系を光軸方向に移動可能にする移動機構を設けたことを特徴としている。

請求項７記載の発明は、１乃至６のいずれかに記載の発明において、前記筐体は、前記第１の光学系の光軸方向の一部を前記試料面に当接可能にしたことを特徴としている。

請求項８記載の発明は、請求項１乃至７のいずれかに記載の発明において、少なくとも２つの波長の蛍光光量を同時に検出可能にしたことを特徴としている。

本発明によれば、光学ヘッド部の観察位置、角度などを任意に調整できるで、試料の観察方向などの観察条件の制約を解消でき、マウスやラットなどの生体を対象とした観察に最適なレーザ走査顕微鏡を提供できる。

また、光学ヘッド部は、筐体部に固定的に設けられるレーザ導入部にレーザ光源からのレーザ光を導入するファイバが接続されるので、レーザ光の走査にともなうファイバの移動によるレーザ光の光量ムラを防止し、精度の高い観察画像を取得することができる。

さらに、光学ヘッド部をコンパクトに構成できるので、小型で、観察時の取り扱いを容易にできる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示している。

図１において、１００は光学ヘッド部、２００は検出手段としての検出装置、３００はレーザ発生手段としてのレーザ発生装置、４０３は制御部をそれぞれ示している。

これら各部の構成を光線の流れに沿って説明する。

レーザ発生装置３００は、波長の異なるレーザ光源３３１、３４１、３５１、ＡＯＴＦ（音響光軸チューブナルフィルタ）３２０、ダイクロイックミラー３３０、３４０、反射ミラー３５０およびレンズ３１１を内蔵したカップリング３１０により構成されている。

レーザ光源３４１から発せられたレーザ光は、このレーザ光を反射し、レーザ光源３５１からのレーザ光を透過させるダイクロイックミラー３４０により図中光軸Ａ上に反射される。レーザ光源３５１から発せられたレーザ光は、反射ミラー３５０により反射され、ダイクロイックミラー３４０を透過し、光軸Ａ上でレーザ光源３４１のレーザ光と合成される。この合成されたレーザ光は、ダイクロイックミラー３３０で図中光軸Ｂ上に反射されるとともに、レーザ光源３３１から発せられたレーザ光と合成される。

これら合成された光軸Ｂ上の波長の異なるレーザ光は、ＡＯＴＦ３２０により波長選択され、カップリング３１０内のレンズ３１１を介して第２のファイバ２２２に導びかれる。この場合、ＡＯＴＦ３２０は、ＡＯＴＦケーブル３２０ａを介してコントローラ４００に電気的に接続され、選択波長を制御するようになっている。

第２のファイバ２２２には、検出装置２００が接続されている。この検出装置２００は、カップリング２１０を有している。このカップリング２１０には、コリメートレンズ２１１が設けられ、第２のファイバ２２２から出射された発散光を平行光に変換する。コリメートレンズ２１１から出射した平行光は、反射ミラー２１２で、図中光軸Ｃ上に反射され励起用ダイクロイックミラー２３０に入射される。この励起用ダイクロイックミラー２３０は、検出装置２００に対して挿脱可能になっている。ここでの励起用ダイクロイックミラー２３０は、レーザ光源３３１，３４１、３５１が発生するレーザ光の波長を反射する特性を有するものが選択的に用いられる。

励起用ダイクロイックミラー２３０で反射した平行光は、図中光軸Ｄ上に反射し、カップリング２４０に入射し、カップリングレンズ２４１を介して第１のファイバ１１２に入射される。

第１のファイバ１１２には、光学ヘッド部１００が接続されている。この光学ヘッド部１００は、筐体部１００ａを有し、この筐体１００ａに対して固定的にレーザ導入部としてのカップリング１１０が設けられている。このカップリング１１０には、コリメートレンズ１１１が設けられ、第１のファイバ１１２から出射された発散光を平行光に変換する。

コリメートレンズ１１１から出射した平行光は、図中光軸Ｇ上を通ってスキャナー１２０に入射される。スキャナー１２０は、それぞれ異なる回転軸を中心に回動可能なガルバノミラー（走査ミラー）１２１、１２２を有したもので、これらガルバノミラー１２１、１２２でスキャンされた平行光が図示の観察光軸Ｉに導かれる。この場合、ガルバノミラー１２１、１２２は、ケーブル１２１ａ、１２２ａを介してコントローラ４００に接続され、それぞれの回動が制御可能になっている。

観察光軸Ｉ上には、筐体部１００ａに固定された第２の光学系１３０が配置されている。この第２の光学系１３０は、瞳投影レンズ１３１と結像レンズ１３２を有し、観察光軸Ｉに導かれた平行光を瞳投影レンズ１３１により集光した後、再び結像レンズ１３２により平行光に変換する。

第２の光学系１３０からの平行光は、第１の光学系１４０に導かれる。第１の光学系１４０は、筐体部１００ａに固定された移動機構１５０に固定ネジ１４２を介して着脱可能に支持されている。また、第１の光学系１４０は、対物レンズ１４１を有し、この対物レンズ１４１を介して第２の光学系１３０に導かれた特定波長の光を、励起光として試料１６０上へ集光する。

この場合、試料１６０は、励起光の照射により、励起光と異なる特定波長の光（蛍光）を発する蛍光蛋白などが導入されている。具体的には、試料１６０は、表面または内部に蛍光蛋白や近赤外線で励起される蛍光色素を導入したマウスやラット、人の癌細胞に蛍光蛋白を発現したもの、ＲＮＡを導入したマウスやラットの実験動物などが用いられる。

移動機構１５０は、図示しないネジ等で筐体部１００ａに固定された固定部１５１に対して観察光軸Ｉと平行に移動可能なフォーカス移動部１５２が設けられており、固定部１５１側に設けられた駆動部１５３によりフォーカス移動部１５２を移動させることで、第１の光学系１４０を観察光軸Ｉに沿って移動可能にしている。駆動部１５３には、フォーカスケーブル１５３ａを介してコントローラ４００に接続され、フォーカス移動部１５２の駆動量が制御可能になっている。

ここで、瞳投影レンズ１３１、結像レンズ１３２および対物レンズ１４１の位置関係は、瞳投影レンズ１３１と結像レンズ１３２をガルバノミラー１２１、１２２のほぼ中間位置と対物レンズ１４１の後側焦点位置に一致させるとともに、ガルバノミラー１２２からの平行光を対物レンズ１４１の前側焦点位置に結像させるようになっている。これにより、ガルバノミラー１２１、１２２を回動させると、瞳投影レンズ１３１に入射する光線が傾き、その結果として対物レンズ１４１による集光位置を観察光軸Ｉに垂直な平面内で移動させることを可能にしている。

筐体部１００ａの上方には、図２に示すような筐体移動機構１７０が設けられている。この筐体移動機構１７０は、対物レンズ１４１の前側焦点位置とほぼ同じ位置を回転中心として筐体部１００ａ全体を図中矢印θ方向に傾ける傾斜機構１７１、筐体部１００ａ全体を図示Ｘ、Ｙ軸方向にそれぞれ移動させるＸ移動機構１７２、Ｙ移動機構１７３を有している。また、筐体移動機構１７０は、実体顕微鏡用スタンド１８０に支持されている。

実体顕微鏡用スタンド１８０は、ベース１８５に直立して設けられた支柱１８４にスタンド固定部１８２を固定し、このスタンド固定部１８２に対し焦準ハンドル１８３により支柱１８４と平行な方向に移動可能な焦準部１８１が設けられ、この焦準部１８１に筐体移動機構１７０が支持されている。

なお、実体顕微鏡用スタンド１８０のベース１８５上には、図示しない手段により試料１６０が保持されている。

一方、試料１６０から発せられる蛍光は、再び対物レンズ１４１、結像レンズ１３２、瞳投影レンズ１３１を通過して、ガルバノミラー１２２、１２１により反射され、コリメートレンズ１１１により第１のファイバ１１２に導かれる。このとき、試料１６０上で光の集光位置以外から発生した蛍光は、第１のファイバ１１２に入射することができない。

第１のファイバ１１２を通った蛍光は、検出装置２００のカップリング２４０に入射し、カップリングレンズ２４１を介して光軸Ｄを通る平行光に変換される。そして、励起用ダイクロイックミラー２３０を透過し、集光レンズ２５２に入射される。

集光レンズ２５２は、平行光を集光し、ピンホール２５１に入射させる。ピンホール２５１は、集光レンズ２５２で集光された光束径と同等から３倍程度の内径を有するものが用いられる。ピンホール２５１を通過した蛍光は、集光レンズ２５２に入射し、再び平行光に変換される。

ここで、ピンホール２５１は、光軸Ｄ方向の位置を集光レンズ２５２による光線集光位置とほぼ同位置に、光軸Ｄ方向に垂直な面内での位置を光軸Ｄと同軸上になるように調整されている。

集光レンズ２５２を透過した蛍光の光路上には、蛍光分離手段を構成する第２のダイクロイックミラー２６０および第３のダイクロイックミラー２７０が配置されている。この場合、これら第２のダイクロイックミラー２６０および第３のダイクロイックミラー２７０は、検出装置２００に対して挿脱自在になっている。

第２のダイクロイックミラー２６０は、光軸Ｄを光軸Ｅに分離し、第３のダイクロイックミラー２７０は、光軸Ｄを光軸Ｆに分離するもので、第２のダイクロイックミラー２６０および第３のダイクロイックミラー２７０を透過した光軸Ｄ上には、第１の吸収フィルタ２３１を介して検出手段としての第１の光検出器２３２、第２のダイクロイックミラー２６０で分離された光軸Ｅ上には、第２の吸収フィルタ２６１を介して検出手段としての第２の光検出器２６２、第３のダイクロイックミラー２７０で分離された光軸Ｆ上には、第３の吸収フィルタ２７１を介して検出手段としての第３の光検出器２７２が配置されている。これら第１の吸収フィルタ２３１、第２の吸収フィルタ２６１、第３の吸収フィルタ２７１は、不要な波長の光を除去して所定の波長の蛍光のみを透過し、各別に第１の光検出器２３２、第２の光検出器２６２、第３の光検出器２７２に導くようにしている。

第１の光検出器２３２は、ケーブル２３２ａを介し、第２の光検出器２６２は、ケーブル２６２ａを介し、第３の光検出器２７２は、ケーブル２７２ａを介してそれぞれコントローラ４００に接続され、検出感度を調整できるようになっている。

また、第１の光検出器２３２は、ケーブル２３２ｂを介し、第２の光検出器２６２は、ケーブル２６２ｂを介し、第３の光検出器２７２は、ケーブル２７２ｂを介してそれぞれパーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと称する。）４０１の図示しない検出ポートに接続されている。ＰＣ４０１は、コントローラ４００を制御するなどの各種ソフトウェアがインストールされており、このソフトウェアによりコントローラ４００を介して各部のコントロールを可能にしている。また、ＰＣ４０１は、第１乃至第３の光検出器２３２、２６２、２７２からの蛍光情報を処理して蛍光画像を生成し、モニター４０２に表示するようにしている。

次に、このような第１の実施の形態を手順に沿って説明する。

まず、観察者は、ＰＣ４０１にインストールされた図示しないソフトウェア上で、試料１６０上に照射するレーザ光の波長、強度、観察範囲などを設定する。この設定により、コントローラ４００によりを介してＡＯＴＦ３２０を通過させる波長およびその透過率、ガルバノミラー１２１および１２２の回転角度が般定される。

次に、図示しないソフトウェア上で、観察開始が選択されると、ＡＯＴＦ３２０が実際に制御され、レーザ光源３３１、３４１、３５１から発せられた任意のレーザ光が任意の強度で上述した光路に導かれ、試料１６０上に照射される。これと同時に、ガルバノミラー１２１、１２２がそれぞれ回動を開始し、予め設定した観察範囲に対応する試料１６０上をレーザ光（集光位置）がスキャンする。この状態で、試料１６０から蛍光が発せられると、それぞれの観察位置の蛍光は、それぞれの蛍光波長に対応する第１の光検出器２３２、第２の光検出器２６２、第３の光検出器２７２まで導かれて検出され、それぞれの蛍光情報がＰＣ４０１の図示しない検出ポートに送られる。

ＰＣ４０１内では図示しない検出ポートに送られてきた蛍光情報とガルバノミラー１２１、１２２のスキャン位置情報から蛍光画像を生成し、予め指定した観察範囲の蛍光画像としてモニター４０２上に表示させる。この場合、蛍光画像が暗い場合や、蛍光強度が高すぎるような場合は、図示しないソフトウェアかにコントローラ４００を介して第１の光検出器２３２、第２の光検出器２６２、第３の光検出器２７２の検出感度を調整することで、適正な蛍光画像を同時に得ることができる。

次に、観察位置を設定する場合を説明する。

この場合、観察光軸Ｉに対して垂直な平面内での位置は、Ｘ移動機構１７２、Ｙ移動機構１７３を操作することで、筐体部１００ａ全休を試料１６０に対して移動して行ない、観察光軸Ｉに対して平行な観察位置の調整は、図示しないソフトウェアからコントローラ４００を介して移動機構１５０を制御し、第１の光学系１４０全体を観察光軸Ｉに平行に動かすことで行なう。

観察光軸Ｉ方向の移動量が下足している（移動機構１５０だけでは調整できない）場合には、焦準ハンドル１８３を回転させることで．試料１６０に対して焦準部１８１に固定した筐体部１００ａ全体を移動させて調整する。

さらに、移動機構１５０を微少量（１０ｎｍ〜１μｍ）づつ移動させながら、上述のように蛍光画像を取得した後、それぞれの蛍光画像を重ね合わせることでモニター４０２上に立体画像を表示させることも可能である。また、試料１６０の観察位置によっては、観察光軸Ｉを傾ける必要があるが、この場合は、傾斜機構１７１により筐体部１００ａ全体を傾けて観察する。

従って、このようにすれば、筐体部１００ａ内にレーザ導入部としてのカップリング１１０、ガルバノミラー１２１、１２２を有するスキャナー１２０および対物レンズ１４１を有する光学系などを備えた光学ヘッド部１００の観察位置、角度などを任意に調整可能に設けるようにしたので、試料１６０の観察方向などの観察条件の制約を解消することができ、マウスやラットなどの生体を対象とした観察に最適なレーザ走査顕微鏡を提供できる。

また、光学ヘッド部１００は、筐体部１００ａに固定的に設けられるレーザ導入部（カップリング１１０）にレーザ光源からのレーザ光を導入する第１のファイバ１１２が接続されるので、レーザ光の走査にともなって第１のファイバ１１２が不要に動くことがなくなり、ファイバの移動によるレーザ光の光量ムラを防止でき、実験動物の精度の高い観察画像を取得することができる。

さらに、光学ヘッド部１００は、必要最小限のカップリング１１０、ガルバノミラー１２１、１２２を有するスキャナー１２０および対物レンズ１４１を有する光学系からなり、コンパクトに構成できるので、小型で、観察時の取り扱いを容易にできる。

なお、この第１の実施の形態では３個のレーザ光源と３個の光検出器により３種類の蛍光を同時に取得可能としているが、１個のレーザ光源と１個の光検出器で構成しても上記と同様な効果を得ることができる。また、複数のレーザ光源からのレーザ光を同時に試料１６０上に照射することで、それぞれのレーザ光波長により発生する波長の異なる蛍光を同時に、個別に検出することが可能となり、ＦＲＥＴなどの多波長励起多波長検出も可能となる。

（第１の実施の形態の変形例１）
上述した第１の実施の形態では、レーザ発生装置３００内にＡＯＴＦ３２０を用いたが、これに代えてレーザ光源ごとにレーザ光を遮断可能な図示しないシャッタと、レーザパワーを減衰可能な図示しない光量調整装置を設け、これらをコントローラ４００により制御するようにしてもよい。

こうしても、第１の実施の形態と同様な効果を得られ、さらに装置全体を安価に提供することができる。

（第１の実施の形態の変形例２）
上述した第１の実施の形態では、第１のファイバ１１２と第２のファイバ２２２を個別に用意したが、これら第１のファイバ１１２と第２のファイバ２２２にマルチモードファイバを組み合わせることもできる。

このようにすると、第１の実施の形態と同様な効果の他に、ファイバ位置調整が簡単となり、さらに光量の伝搬効率が良くなり蛍光の検出感度が増すという効果が得られる。

なお、これら第１のファイバ１１２と第２のファイバ２２２は、クリスタルファイバにより構成してもよい。

（第１の実施の形態の変形例３）
上述した第１の実施の形態では、弟１の光学系１４０を固定ネジ１４２により移動機構１５０に固定しているが、固定ネジ１４２をＲＭＳネジとし、第１の光学系１４０に顕微鏡用対物レンズを組み合わせるようにしても良い。

このようにすると、第１の実施の形態と同様な効果の他に、倍率やＮＡ、収差レベルなど様々なスペックを持つ対物レンズと組み合わせることが可能となり、システム性が向上する。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図３は、本発明の第２の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

図３では、光ヘッド部１００、レーザ発生装置３００および制御部４０３を有しているが、これらの基本機能は、第１の実施の形態と同様なので説明を省略する。

この場合、レーザ発生装置３００から発せられる波長の異なるレーザ光は、カップリング３１０内のレンズ３１１を介して第２のファイバ５０２に導かれる。

第２のファイバ５０２には、光ヘッド部１００が接続されている。この筐体部１００ａには、カップリング１１０を有し、このカップリング１１０に設けられたコリメートレンズ１１１により第２のファイバ５０２から出射された発散光を平行光に変換する。

コリメートレンズ１１１から出射した平行光は、図中光軸Ｇ上を通ってガルバノミラー１２１、１２２を有するスキャナー１２０に入射される。そして、これらガルバノミラー１２１、１２２でスキャンされた平行光が図示の観察光軸Ｉに導かれる。

この場合も、ガルバノミラー１２１、１２２は、ケーブル１２１ａ、１２２ａを介してコントローラ４００に接続され、それぞれの回動が制御可能になっている。

観察光軸Ｉに導かれた平行光は、筐体部１００ａに固定された第２の光学系１３０に導かれ、瞳投影レンズ１３１により集光した後、再び結像レンズ１３２により平行光に変換すされる。

その後、第２の光学系１３０からの平行光は、第１の光学系１４０に導かれる。第１の光学系１４０は、筐体部１００ａに固定された移動機構１５０に固定ネジ１４２を介して着脱可能に支持されている。そして、第１の光学系１４０の対物レンズ１４１を介して特定波長の光を、励起光としてマウスなどの試料１６０上へ集光する。この場合も、試料１６０は、励起光の照射により、励起光と異なる特定波長の光（蛍光）を発する蛍光蛋白などが導入されている。

この場合、筐体部１００ａは、観察光軸Ｉ方向に突出した筒状の突出部５０１を有し、この突出部５０１の中空部に対物レンズ１４１を有する第１の光学系１４０を位置させるようにしている。また、突出部５０１は、先端面５０１ａを試料１６０面に当接され、この状態で、対物レンズ１４１を介して励起光が試料１６０上へ照射されるようになっている。

試料１６０から発せられる蛍光は、再び対物レンズ１４１、結像レンズ１３２、瞳投影レンズ１３１を通過して、ガルバノミラー１２２、１２１により反射され光軸Ｇ上に導かれる。

光軸Ｇ上には、コリメートレンズ１１１とスキャナー１２０の間にダイクロイックミラー５０３が着脱自在に配置されている。ダイクロイックミラー５０３は、コリメートレンズ１１１から出射されたレーザ光を透過し、試料１６０から発せられた蛍光を反射するような特性を有している。

これにより、ガルバノミラー１２２、１２１により反射された蛍光は、ダイクロイックミラー５０３で反射し、図示光軸Ｈ上に導かれる。

光軸Ｈ上には、筐体部１００ａに着脱可能に設けられた光検出部５０８が配置されている。光検出部５０８は、吸収フィルタ５０４、集光レンズ５０５、ピンホール５０７および光検出器５０６を有している。光軸Ｈ上に導かれた蛍光は、吸収フィルタ５０４により不利益な光が除去されて集光レンズ５０５へ導かれ、集光レンズ５０５で集光された光は、光束径と同等から３倍程度の内径を有するピンホール５０７を介して不要な光が除去され、光検出器５０６へ導かれる。ここで、ピンホール５０７は、光軸Ｈ方向の位置を集光レンズ５０５による光線集光位置とほぼ同位置に、光軸Ｈ方向に垂直な面内での位置を光軸Ｈと同軸上になるように調整されている。

光検出器５０６は、ケーブル５０６ａを介してコントローラ４００に接続されるとともに．ケーブル５０６ｂを介してＰＣ４０１の図示しない検出ポートにに接続されている。

この場合も、ＰＣ４０１は、コントローラ４００を制御するなどの各種ソフトウェアがインストールされており、このソフトウェアによりコントローラ４００を介して各部のコントロールを可能にしている。また、ＰＣ４０１は、光検出器５０６からの蛍光情報を処理して蛍光画像を生成し、モニター４０２に表示するようにしている。

次に、このような第２の実施の形態の作用を説明する。

この場合、観察を行なうにあたって、まず、筐体部１００ａの突出部５０１の先端面５０１ａが試料１６０に接触するように筐体部１００ａの全体位置を調整する。この位置調整方法については、第１の実施の形態で述べたと同様である。

次に、第１の実施の形態と同様にして、図示しないソフトウェアにより使用するレーザ光の波長、強度、観察範囲などを設定し、その後、観察開始を指示し、さらに光検出器５０６の検出感度の調整、観察位置の調整などを行なう。これにより、光検出器５０６からＰＣ４０１の図示しない検出ポートに蛍光情報が送られてくると、ガルバノミラー１２１、１２２のスキャン位置情報を用いて、蛍光画像を生成し、予め指定した観察範囲の蛍光画像としてモニター４０２上に表示する。

従って、このようにしても、マウスやラットといった生体を対象とした観察に適した小型で、観察位置、角度を任意に調整可能なレーザ走査顕微鏡を提供することができる。この場合、ファイバを経由せずに試料１６０からの蛍光を光検出器５０６に取り込むことができるので、微弱な蛍光も確実に検出することが可能となる。

また、筐体部１００ａの観察光軸Ｉ方向に突出した筒状の突出部５０１を試料１６０に押し付けるようにしているので、試料１６０を動かないよう固定にした安定した状態で観察を行なうことができ、また、筒状の突出部５０１の中空部に対物レンズ１４１が配置されているので、対物レンズ１４１への不要な光（室内灯など）の侵入による蛍光画像の劣化を防止することもできる。

さらに、移動機構１５０を筐体部１００ａ内部に配置し、第１の光学系１４０を筒状の突出部５０１内部で観察光軸方向に移動可能にしているので、観察光軸Ｉ方向の観察位置の調整時にも筒状の突出部５０１の先端面５０１ａを試料１６０に押し付けた状態を維持でき、これにより、生きたマウスなどの場合も、試料１６０に無用な負荷を与えることを防止できる。

なお、この第２の実施の形態では３個のレーザ光源を組み合わせた例を示しているが、１個の１個のレーザ光源と光検出器で構成しても上記と同様な効果を得ることができる。

（第２の実施の形態の変形例）
上述した第２の実施の形態では、光軸Ｈ上にダイクロイックミラー５０３とともに、吸収フィルタ５０４、集光レンズ５０５、ピンホール５０７および光検出器５０６を有する光検出部５０８を配置したが、さらに、これと全く同様な少なくとも１個の光検出部を用意し、光軸Ｇまたは光軸Ｈ上に配置するようにしてもよい。この場合、新たに設けられる光検出部の光検出器は、光検出部５０８と同様に、検出感度をコントローラ４００から制御可能で、検出した蛍光情報をケーブル５０６ｂを介してＰＣ４０１に送出するようにする。

このようにすれば、試料１６０に波長の異なるレーザ光を照射し、それぞれに対応する波長の異なる蛍光を光検出部５０８で分離検出することが可能となり、ＦＲＥＴなどの多波長励起多波長検出が可能となる。

（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。

図４は、本発明の第３の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

図４では、光学ヘッド部１００と制御部４０３を有しているが、これらの基本機能は、第１の実施の形態と同様なので説明を省略する。

この場合、光学ヘッド部１００の筐体部１００ａには、図中光軸Ｇ上に直接レーザ光源６０１が設けられている。ここでのレーザ光源６０１には、半導体レーザなどの小型レーザ光源が用いられる。

また、レーザ光源６０１は、レーザケーブル６０１ａを介してコントローラ４００に接続され、制御可能になっている。

レーザ光源６０１から発せられるレーザ光は、光軸Ｇ上を通ってガルバノミラー１２１、１２２を有するスキャナー１２０に入射される。そして、これらガルバノミラー１２１、１２２でスキャンされた平行光が図示の観察光軸Ｉに導かれる。

この場合も、ガルバノミラー１２１、１２２は、ケーブル１２１ａ、１２２ａを介してコントローラ４００に接続され、それぞれの回動が制御可能になっている。

観察光軸Ｉに導かれた平行光は、筐体部１００ａに固定された第２の光学系１３０に導かれ、瞳投影レンズ１３１により集光した後、再び結像レンズ１３２により平行光に変換すされる。

その後、第２の光学系１３０からの平行光は、第１の光学系１４０に導かれる。第１の光学系１４０は、筐体部１００ａに固定された移動機構１５０に固定ネジ１４２を介して着脱可能に支持されている。そして、第１の光学系１４０の対物レンズ１４１を介して特定波長の光を、励起光としてマウスなどの試料１６０上へ集光する。この場合も、試料１６０は、励起光の照射により、励起光と異なる特定波長の光（蛍光）を発する蛍光蛋白などが導入されている。

試料１６０から発せられる蛍光は、再び対物レンズ１４１、結像レンズ１３２、瞳投影レンズ１３１を通過して、ガルバノミラー１２２、１２１により反射され光軸Ｇ上に導かれる。

光軸Ｇ上には、コリメートレンズ１１１とスキャナー１２０の間にダイクロイックミラー６０３が着脱自在に配置されている。

ガルバノミラー１２２、１２１により反射された蛍光は、ダイクロイックミラー６０３で反射し、図示光軸Ｈ上に導かれる。光軸Ｈ上には、筐体部１００ａに着脱可能に設けられた光検出部６０８が配置されている。光検出部６０８は、吸収フィルタ６０４、集光レンズ６０５、ピンホール６０７および光検出器６０６を有している。

この場合、ダイクロイックミラー６０３および光検出部６０８を構成する吸収フィルタ６０４、集光レンズ６０５、ピンホール６０７および光検出器６０６については、第２の実施の形態で述べたと同様である。

光検出器６０６は、ケーブル６０６ａを介してコントローラ４００に接続されるとともに．ケーブル６０６ｂを介してＰＣ４０１の図示しない検出ポートに接続されている。

この場合も、ＰＣ４０１は、コントローラ４００を制御するなどの各種ソフトウェアがインストールされており、このソフトウェアによりコントローラ４００を介して各部のコントロールを可能にしている。また、ＰＣ４０１は、光検出器６０６からの蛍光情報を処理して蛍光画像を生成し、モニター４０２に表示するようにしている。

次に、このような第３の実施の形態の作用を説明する。

この場合も、第１の実施の形態と同様にして、図示しないソフトウェアにより使用するレーザ光の波長、強度、観察範囲などを設定し、その後、観察開始を指示し、さらに光検出器５０６の検出感度の調整、観察位置の調整などを行なう。

この状態で、レーザ光源６０１からレーザ光が発せられると、レーザ光は、観察光軸Ｉに導かれ、対物レンズ１４１を介して試料１６０に照射される。これと同時に、ガルバノミラー１２１、１２２を駆動すると、予め設定した観察範囲に対応する試料１６０上をレーザ光（集光位置）がスキャンする。この状態で、試料１６０から蛍光が発せられると、それぞれの観察位置の蛍光は、ダイクロイックミラー６０３で反射し、光検出部６０８の光検出器６０６まで導かれて検出され、蛍光情報がＰＣ４０１の図示しない検出ポートに送られる。

ＰＣ４０１内では図示しない検出ポートに送られてきた蛍光情報とガルバノミラー１２１、１２２のスキャン位置情報から蛍光画像を生成し、予め指定した観察範囲の蛍光画像としてモニター４０２上に表示させる。この場合、蛍光画像が暗い場合や、蛍光強度が高すぎるような場合は、図示しないソフトウェアかにコントローラ４００を介して光検出器６０６の検出感度を調整することで、適正な蛍光画像を得ることができる。

この場合の観察位置の設定については、第１の実施の形態で述べたと同様である。

従って、このようにしても、マウスやラットといった生体を対象とした観察に適した小型で、観察位置、角度を任意に調整可能なレーザ走査顕微鏡を提供することができる。この場合、レーザ光源６０１が筐体部１００ａに直接設けられることで、装置全体をさらに小型化でき、特別に大きな実験室などを用意する必要が全くなくなる。また、ファイバを経由することなくレーザ光源６０１のレーザ光を取り込むと同時に、試料１６０からの蛍光を検出できるので、ファイバによるレーザ光のロス、蛍光のロスのない効率のよいシステムを得られ、さらに、環境面でも優れた効果が得られる。

（第３の実施の形態の変形例）
上述した第２の実施の形態では、光軸Ｇ上にレーザ光源６０１を配置し、光軸Ｈ上にダイクロイックミラー６０３とともに、吸収フィルタ６０４、集光レンズ６０５、ピンホール６０７および光検出器６０６を有する光検出部６０８を配置したが、さらに、レーザ光源６０１と波長の異なるレーザ光を発生する少なくとも１個のレーザ光源を用意し、このレーザ光源からのレーザ光をダイクロイックミラーを介して光軸Ｇ上のレーザ光源６０１のレーザ光に合成するようにし、また、光検出部６０８と全く同様な少なくとも１個の光検出部を用意し、光軸Ｇまたは光軸Ｈ上に配置するようにしてもよい。この場合、新たに設けられるレーザ光源は、レーザ光源６０１と同様にレーザケーブルを介してコントローラ４００に接続され制御可能とし、また、新たに設けられる光検出部の光検出器も、光検出部６０８と同様に、検出感度をコントローラ４００から制御可能で、検出した蛍光情報をケーブル５０６ｂを介してＰＣ４０１に送出するようにする。

このようにすれば、試料１６０に波長の異なるレーザ光を照射し、それぞれに対応する波長の異なる蛍光を各光検出部で分離検出することが可能となり、ＦＲＥＴなどの多波長励起多波長検出が可能となる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

なお、上述した実施の形態には、以下の発明も含まれる。

（１）請求項３記載の発明であって、前記蛍光分離手段と前記検出手段のうち１つは、第１のファイバから出射した第１の光軸上に配置されることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、蛍光の反射回数を最小にすることで蛍光のロスを少なくすることができる。

（２）（１）記載の発明であって、前記第１の光軸上で前記蛍光分離手段と前記検出手段との間に配置された第２の蛍光分離手段と、前記第２の蛍光分離手段により分離された第２の光軸上に第２の検出手段を配置することで２色の蛍光を同時に検出可能としたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、ＦＲＥＴなどの多波長励起多波長検出が可能になる。

（３）（２）記載の発明であって、前記蛍光分離手段と第２の蛍光分離手段との間に配置された第３の蛍光分離手段と、前記第３の蛍光分離手段により分離された第３の光軸上に第３の検出手段を配置することで３色の蛍光を同時に検出可能としたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、３色以上の多波長励起多波長検出が可能になる
（４）請求項１乃至４のいずれか記載の発明であって、前記第１および、または第２のファイバは、マルチモードファイバであることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、ファイバの光軸調整が簡単にでき、さらに蛍光の伝搬効率が良い。

（５）請求項１乃至４のいずれか記載の発明であって、前記第１および、または第２のファイバは、クリスタルファイバであることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、ファイバによる蛍光のロスを最小にすることができる。

（６）請求項６記載の発明であって、前記第１の光学系を前記ヘッド部から着脱自在としたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、観察倍率を変更することが可能となる。

（７）（６）記載の発明であって、前記第１の光学系を顕微鏡の対物レンズとしたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、顕微鏡の汎用対物レンズを使うことでシステム性が広がる。

（８） 請求項７記載の発明であって、傾斜機構は、筐体の回転軸が試料面上に構成されることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、筐体の傾斜調整時に観察中心位置のずれがない。

（９） 請求項７記載の発明であって、前記スタンド部は、実体顕微鏡用架台としたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、汎用装置を組み合わせることで、システム性が広がる。

（１０） 請求項１乃至９のいずれか記載の発明であって、前記試料は、人の癌細胞に蛍光蛋白を発現したものであることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、様々な研究用途に対応できる。

（１１） 請求項１乃至９のいずれか記載の発明であって、前記試料は、ＲＮＡを導入したマウスやラットの実験動物であることを特徴とするレーザ走査顕微鏡。

このようにすれば、様々な研究用途に対応できる。

本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられる筐体移動機構の概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。 本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。

符号の説明

１００…光ヘッド部、１００ａ…筐体部、１１０…カップリング、
１１１…コリメートレンズ １１２…第１のファイバ、１２０…スキャナー
１２１．１２２…ガルバノミラー、１２１ａ．１２２ａ…ケーブル
１３０…第２の光学系、１３１…瞳投影レンズ
１３２…結像レンズ、１４０…第１の光学系
１４１…対物レンズ、１４２…固定ネジ、１５０…移動機構
１５１…固定部、１５２…フォーカス移動部
１５３…駆動部、１５３ａ…フォーカスケーブル
１６０…試料、１７０…筐体移動機構、１７１…傾斜機構
１７２…Ｘ移動機構、１７３…Ｙ移動機構
１８０…実体顕微鏡用スタンド、１８１…焦準部
１８２…スタンド固定部、１８３…焦準ハンドル
１８４…支柱、１８５…ベース、２００…検出装置
２１０…カップリング、２１１…コリメートレンズ
２１２…反射ミラー、２２２…第２のファイバ
２３０…励起用ダイクロイックミラー、２３１…第１の吸収フィルタ
２３２…第１の光検出器、２３２ａ、２３２ｂ…ケーブル
２４０…カップリング、２４１…カップリングレンズ
２５１…ピンホール、２５２…集光レンズ、２６０…第２のダイクロイックミラー
２６１…第２の吸収フィルタ、２６２…第２の光検出器
２６２ａ、２６２ｂ…ケーブル、２７０…第３のダイクロイックミラー
２７１…第３の吸収フィルタ、２７２…第３の光検出器
２７２ａ、２７２ｂ…ケーブル、３００…レーザ発生装置
３１０…カップリング、３１１…レンズ、３２０…ＡＯＴＦ
３２０ａ…ＡＯＴＦケーブル、３３０．３４０…ダイクロイックミラー
３３１．３４１…レーザ光源、３４１…レーザ光源
３５０…反射ミラー、３５１…レーザ光源、４００…コントローラ
４０１…ＰＣ、４０２…モニター、４０３…制御部
５０１…突出部、５０１ａ…先端面、５０２…第２のファイバ
５０３…ダイクロイックミラー、５０４…吸収フィルタ
５０５…集光レンズ、５０６…光検出器、５０６ａ、５０６ｂ…ケーブル
５０７…ピンホール、５０８…光検出部
６０１…レーザ光源、６０１ａ…レーザケーブル
６０３…ダイクロイックミラー、６０４…吸収フィルタ
６０５…集光レンズ、６０６…光検出器、６０６ａ、６０６ｂ…ケーブル
６０７…ピンホール、６０８…光検出部

Claims (8)

1. 少なくとも１つのレーザ光源を有するレーザ発生手段と、
   筐体を有し、該筐体に対して固定的に設けられ且つレーザ光を導入するレーザ導入部、前記レーザ導入部からのレーザ光を２次元走査する走査ミラーおよび前記レーザ光を試料面上に投影するための少なくとも１つのレンズから構成される光学系を前記筐体内に備えた光学ヘッド部と、
   前記筐体を前記光学系の光軸に対しほぼ直角な面内で移動可能なＸＹ移動機構と、前記筐体を傾斜させる傾斜機構との少なくとも一方と、
   前記ＸＹ移動機構または傾斜機構を介して上方から前記筐体を保持し、筐体及びＸＹ移動機構または傾斜機構を支柱と平行な方向に移動可能な焦準部を持つスタンド部と、
   前記レーザ発生手段のレーザ光源からのレーザ光を前記レーザ導入部に導入するための第１のファイバと、
   前記第１のファイバと前記レーザ発生手段との間に配置され前記試料より発せられる蛍光を分離する蛍光分離手段と、
   前記蛍光分離手段により分離された前記試料より発せられる蛍光を検出する少なくとも１つの検出手段と
   を具備したことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
2. 前記検出手段、前記レーザ発生手段および前記蛍光分離手段が一体的に構成されることを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
3. 前記レーザ発生手段と前記蛍光分離手段が第２のファイバにより接続されることを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
4. 少なくとも１つのレーザ光源を有するレーザ発生手段と、
   筐体を有し、該筐体に対して固定的に設けられ且つレーザ光を導入するレーザ導入部、前記レーザ導入部からのレーザ光を２次元走査する走査ミラー、前記レーザ光を試料面上に投影するための少なくとも１つのレンズから構成される光学系、前記試料面と前記レーザ導入部との間に配置され前記試料より発せられる蛍光を分離する蛍光分離手段および前記蛍光分離手段により分離された前記試料より発せられる蛍光を検出する少なくとも１つの検出手段を前記筐体内に備えた光学ヘッド部と、
   前記筐体を前記光学系の光軸に対しほぼ直角な面内で移動可能なＸＹ移動機構と、前記筐体を傾斜させる傾斜機構との少なくとも一方と、
   前記ＸＹ移動機構または傾斜機構を介して上方から前記筐体を保持し、筐体及びＸＹ移動機構または傾斜機構を支柱と平行な方向に移動可能な焦準部を持つスタンド部と、
   前記レーザ発生手段のレーザ光源からのレーザ光を前記レーザ導入部に導入するための第１のファイバと
   を具備したことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
5. 筐体を有し、該筐体に固定的に設けられた少なくとも１つの半導体レーザ、前記半導体レーザからのレーザ光を２次元走査する走査ミラー、前記レーザ光を試料面上に投影するための少なくとも１つのレンズから構成される光学系、前記試料面と前記半導体レーザとの間に配置され前記試料より発せられる蛍光を分離する蛍光分離手段および前記蛍光分離手段により分離された前記試料より発せられる蛍光を検出する少なくとも１つの検出手段を前記筐体内に備えた光学ヘッド部と、
   前記筐体を前記光学系の光軸に対しほぼ直角な面内で移動可能なＸＹ移動機構と、前記筐体を傾斜させる傾斜機構との少なくとも一方と、
   前記ＸＹ移動機構または傾斜機構を介して上方から前記筐体を保持し、筐体及びＸＹ移動機構または傾斜機構を支柱と平行な方向に移動可能な焦準部を持つスタンド部と、
   具備したことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
6. 前記光学系は、前記試料面側に配置され、平行光を前記試料面に集光する第１の光学系と、前記走査ミラーからの光線を前記第１の光学系の後側焦点位置に集光するための第２の光学系を有し、
   前記第２の光学系を前記筐体側に固定し、前記第１の光学系を光軸方向に移動可能にする移動機構を設けたことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のレーザ走査顕微鏡。
7. 前記筐体は、前記第１の光学系の光軸方向の一部を前記試料面に当接可能にしたことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のレーザ走査顕微鏡。
8. 少なくとも２つの波長の蛍光光量を同時に検出可能にしたことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載のレーザ走査顕微鏡。

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