JP2009025488A - 顕微鏡及びその観測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】様々な大きさの試料を、様々な用途に応じて効率よく観測できるように、多様な観測形態を可能にする顕微鏡と、その顕微鏡による観測方法を提供すること。
【解決手段】ステージに、試料を載置すると共に、その載置されるＸＹ面内で少なくとも２次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶＺ方向を更に含むＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとを設け、更に、鏡筒を支持すると共に、ＸＹＺ方向に３次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージを設け、まず、粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体像を低倍率の合焦部材で観測し、その後、微調整用ステージの移動制御によって、試料の所望部位を高倍率の合焦部材で観測し、同時に２次元画像検出と共焦点観測を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、多様な観測形態を可能にする顕微鏡と、その顕微鏡による観測方法に関する。

顕微鏡観測一般において、特に大型の試料に対して、おおまかに全体像を観測した後に特定の一部を高精度で観測したり、自動試料走査による自動観測をしたい場合が多くある。自動観測においても、試料の全体像を観測した後に、特定の一部を高精度で観測したい場合が多い。
また、いったん顕微鏡に設置された試料を、別の角度から観測したい場合も少なくない。

従来の一般的な顕微鏡において、試料の観測形態を変えるには、３次元的に直交する方向へ粗動及び微動が可能な１式のＸＹＺステージによって、観測位置を変化させる手段が用いられる程度にとどまっている。
このような観測形態の調整に関連する従来技術には、次のようなものが開示されている。
特開２００６−３００９３５「ＸＹＺステージの側方片寄りを決定するための方法」 特開２００６−２２６７０７「ＸＹテーブル及び走査形プローブ顕微鏡」 特開２００６−２１５２５９「顕微鏡システム、観察方法および観察プログラム」 特開２００６−２３４９３「顕微鏡および顕微鏡システム」 特開２００５−３２２８４３「位置合わせ装置及び位置合わせ方法」

しかし、いずれの従来技術によっても、様々な大きさの試料を、効率よく位置調整して観測したり、観測角度を変えるような多様な観測形態に対応することはできなかった。

そこで、本発明は、様々な大きさの試料を、様々な用途に応じて効率よく観測できるように、多様な観測形態を可能にする顕微鏡と、その顕微鏡による観測方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために、本発明の顕微鏡は次の構成を備える。すなわち、試料を設置するステージと、そのステージを支持すると共に移動させて位置調整するステージ制御手段と、試料に対して光を投光する投光手段と、鏡筒を有して試料からの光を受光する受光手段とを少なくとも備えた顕微鏡において、前記ステージが、試料を載置すると共に、その載置されるＸＹ面内で少なくとも２次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶＺ方向を更に含むＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとから成り、更に、鏡筒に、鏡筒を支持すると共に、ＸＹＺ方向に３次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージが備わることを特徴とする。

ここで、微調整用ステージを、直交するＸＹＺ方向に移動可能なピエゾ素子型のステージとして、走査の利便に寄与させてもよい。

鏡筒調整用ステージに、試料の観測焦点を中心にして、Ｚ方向を含む面内で鏡筒を回転移動させる鏡筒回転調整手段を設けて、試料に対して斜めに観測できるようにしてもよい。

投光手段を落射型照明とし、鏡筒内の落射型照明の光路に、外部の２つ以上の光照射手段からの照射光を導入して試料へ誘導する光分岐部材を設けて、外部からの照射光による試料の変化を観測できるようにしてもよい。

光分岐部材としては、落射型照明の光路に対して傾斜して設置される２つ以上のハーフミラーが簡易に利用可能である。

外部の光照射手段を、ひとつは白色ランプ、それ以外はレーザーとして、生体試料の光損傷等を観測できるようにしてもよい。

受光手段で得た顕微拡大画像の出力を、同時に２つ以上の読み出し装置に出力可能な接続を設けて、観測の利便に寄与させてもよい。

読み出し装置として、２次元画像カメラと、共焦点観測用の微小開口からの光信号を分光する分光装置とそれに接続された光検出器とを設けて、生体試料の蛍光分光観測等に寄与させてもよい。

２次元画像カメラに、特定の波長の光のみを透過するカラーフィルター或いは偏光フィルターを付設して、観測の利便に寄与させてもよい。

本発明の顕微鏡観測方法は、試料を設置するステージと、そのステージを支持すると共に移動させて位置調整するステージ制御手段と、試料に対して光を投光する投光手段と、鏡筒を有して試料からの光を受光する受光手段とを少なくとも備えた顕微鏡において、前記ステージに、試料を載置すると共に、その載置されるＸＹ面内で少なくとも２次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶＺ方向を更に含むＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとを設け、更に、鏡筒に、鏡筒を支持すると共に、ＸＹＺ方向に３次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージを設け、その粗調整用ステージ、微調整用ステージ、鏡筒調整用ステージによって、試料の観測位置を調整後、まず、粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体像を低倍率の合焦部材で観測し、その後、微調整用ステージの移動制御によって、試料の所望部位を高倍率の合焦部材で観測し、同時に２次元画像検出と共焦点観測を行うことを特徴とする。

ここで、微調整用ステージに、ピエゾ素子型のステージを用い、そのピエゾ素子型微調整用ステージの移動制御によって、試料の一定範囲を高速ＸＹラスター走査すると共に、粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体にわたり低速ＸＹラスター走査し、同時に２次元画像検出と共焦点観測を行い、共焦点出力信号をステージの移動に合わせて記憶、表示させることで、リアルタイム観測に寄与させてもよい。

鏡筒調整用ステージに、試料の観測焦点を中心にして、Ｚ方向を含む面内で鏡筒を回転移動させる鏡筒回転調整手段を設け、その鏡筒回転調整手段の回転制御によって、鏡筒を回転させることで、試料をＺ方向から傾斜した方位で観測して、観測形態の多様化に寄与させてもよい。

投光手段に落射型照明を用い、鏡筒内の落射型照明の光路に光分岐部材を設けて、外部の２つ以上の光照射手段からの照射光を導入して試料へ誘導し、その光照射による試料の変化を観測して、観測形態の多様化に寄与させてもよい。

試料に、蛍光色素ラベルされた生体試料を用い、外部からの光照射による光励起によって蛍光観測を行う際、共焦点観測用の微小開口からの光信号を分光装置を介して分光し、特定の波長の光信号を画像化させることにより観測することで、蛍光観測の用途に寄与させてもよい。

試料に、生体試料を用い、外部の光照射手段に、紫外線レーザーを用い、その紫外線レーザーを試料の所定位置に照射して、その紫外線レーザーを試料の所定位置に照射して、組織の光損傷を、特定の波長フィルターを介した２次元画像装置を介して観測することで、組織の光損傷観測の用途に寄与させてもよい。

本発明によると、粗調整用ステージ、微調整用ステージ、鏡筒調整用ステージによって、計９軸の調整変数を備えるので位置調整の便宜が向上し、また、粗調整用ステージと微調整用ステージとの移動制御によって、観測の効率が向上する。
更に、鏡筒調整用ステージの鏡筒回転調整手段の回転制御によって、試料を斜めから観測でき、多様な観測形態が得られる。
鏡筒内の落射型照明の光路に備わる光分岐部材によっては、外部の光照射手段からの照射光を試料へ誘導でき、光照射による試料の変化も観測可能になる。

以下に、図面を基に本発明の実施形態を説明する。ここに示す実施例に限らず、従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。
図１は、本発明による顕微鏡の要部を示す説明図である。
基台（１１）に、試料を設置するステージを支持すると共に高さ調整を行う試料ステージ高度調整台（１２）と、鏡筒（１３）を支持すると共に高さ調整を行う鏡筒高度調整台（１４）とが設置されている。

試料ステージ高度調整台（１２）には、粗調整用ステージ（２１）と微調整用ステージ（３１）とが積層される。
粗調整用ステージ（２１）は、試料の載置されるＸＹ面及び試料と鏡筒（１３）とを結ぶＺ方向を含むＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、微調整用ステージ（３１）を下方から支持している。
粗調整用ステージ（２１）において各軸方位位置を調整するステージ、すなわちＸ軸調整用ステージ（２２）、Ｙ軸調整用ステージ（２３）、Ｚ軸調整用ステージ（２４）は、粗調整用ステージ制御手段（２５）に接続されて駆動制御される。

同様に、微調整用ステージ（３１）は、微調整用ステージ制御手段（３２）に接続されて駆動制御される。
試料の載置される微調整用ステージ（３１）は、その載置されるＸＹ面内で少なくとも２次元方向に移動可能であり、粗調整用ステージ（２１）と同様にＸＹＺ方向に３次元的に移動可能でもよい。
微調整用ステージ（３１）には、ピエゾ素子型のステージなど、微小移動制御に適した駆動制御機構を用い、その移動距離は粗調整用ステージ（２１）より小さく設計する。

鏡筒高度調整台（１４）には、鏡筒調整用ステージ（４１）が設置される。
鏡筒調整用ステージ（４１）も、ＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、その各軸方位位置を調整するステージ、すなわち鏡筒Ｘ軸調整用ステージ（４２）、鏡筒Ｙ軸調整用ステージ（４３）、鏡筒Ｚ軸調整用ステージ（４４）は、鏡筒調整用ステージ制御手段（４５）に接続されて駆動制御される。

鏡筒（１３）は、鏡筒Ｚ軸調整用ステージ（４４）に延設された鏡筒支持盤（１５）に支持され、光学レンズ等の合焦部材（１６）やＣＣＤカメラ等の受光手段（１７）が接続されている。

その受光手段（１７）や、粗調整用ステージ制御手段（２５）、微調整用ステージ制御手段（３２）、鏡筒調整用ステージ制御手段（４５）は、ＰＣ等の主制御装置（１８）に接続される。
主制御装置（１８）によって、粗調整用ステージ制御手段（２５）、微調整用ステージ制御手段（３２）、鏡筒調整用ステージ制御手段（４５）による試料の観測位置調整や、受光手段（１７）による撮像、その撮像データの表示、保存、解析等が司られる。

主制御装置（１８）には、モニター等の画像表示手段（１９）を付設して、同時に２次元画像検出と共焦点観測を行い、共焦点出力信号をステージの移動に合わせて記憶及び表示させてもよい。
その２次元画像検出を行う受光手段（１７）としての２次元画像カメラには、特定の波長の光のみを透過するカラーフィルター或いは偏光フィルターを付設して、観測の利便に寄与させてもよい。

一般的な観測手順としては、粗調整用ステージ（２１）の移動制御によって、試料の略全体像を低倍率の合焦部材（１６）で観測し、その後、微調整用ステージ（３１）の移動制御によって、試料の所望部位を高倍率の合焦部材（１６）で観測する。その際、撮像データを主制御装置（１８）に逐次保存して、低倍率の撮像画像を検査後に、高倍率で撮像する部位を選定してもよい。

走査方法には、ベクター走査もラスター走査も利用可能である。試料全体にわたってラスター走査すると、時間を要するが、撮像データの相対的な位置関係が高精度で得られる利点がある。
ピエゾ素子型の微調整用ステージ（３１）の移動制御によって、試料の一定範囲を高速ＸＹラスター走査すると共に、粗調整用ステージ（２１）の移動制御によって、試料全体にわたり低速ＸＹラスター走査してもよい。
この観測法は、特に生体試料のように、時々刻々と形態が変化するような生体反応が進展するリアルタイム観測に有効である。

図２は、別実施例の要部を示す説明図である。
試料の観測焦点（５０）を中心にして、Ｚ方向を含む面内で鏡筒（１３）を回転移動させる鏡筒回転調整手段（５１）が、鏡筒調整用ステージ（４１）に付設されている。このような回転機構には、例えばＸ線回折計に使用されているゴニオメーターヘッドなどの従来技術を適宜利用可能である。
この鏡筒回転調整手段（５１）の回転制御により鏡筒（１３）を回転させることで、試料をＺ方向から傾斜した方位で観測できる。

図３も、別実施例の要部を示す説明図である。
本実施例は、外部の光照射手段（６１）からの照射光を、本顕微鏡内に導入して試料へ誘導するものである。
投光手段に落射型照明を用い、鏡筒（１３）内の落射型照明の光路に、ハーフミラー等の光分岐部材（６２）が付設されている。その光分岐部材（６２）により、外部の光照射手段（６１）からの照射光が試料へ誘導されるので、その光照射による試料の変化が観測できる。
なお、外部の光照射手段（６１）は、白色ランプとレーザーとの複数設けることが好ましい。

これによると、蛍光色素ラベルされた生体試料を用い、外部からの光照射による光励起を利用すると、蛍光観測が可能になる。

また、生体試料を用い、外部の光照射手段（６１）に紫外線レーザーを用いると、その紫外線レーザーを試料の所定位置に照射して、組織の光損傷観測が可能になる。

図４及び５は、実験に用いた顕微鏡及びステージ近傍の斜視図（写真）であり、図６は、その概要を示す説明図である。
受光手段（１７）（１７’）で得た顕微拡大画像の出力は、同時に複数の読み出し装置に出力可能に接続されている。図示の読み出し装置は、c-ccd等を有する２次元画像カメラ（１７）と、共焦点観測用の微小開口（１７’）からの光信号を分光する分光装置（７１）とそれに接続された光検出器（７２）である。

２次元画像カメラ（１７）及び光検出器（７２）からの出力は、ビデオモニター（１９）に画像表示される。
その際、共焦点観測用の微小開口（１７’）からの光信号は、分光装置（７１）によって、特定の波長の光信号が画像化される。
同時に２次元画像検出と共焦点観測を行うことで、共焦点出力画像を微調整用ステージ（３１）の移動に合わせて、主制御装置（１８）に記憶したり、ビデオモニター（１９）に表示させることができる。

なお、共焦点観測法では、微小開口（１７’）を用い、厚みのある試料中の特定の面に焦点を合わせることで、その上下の焦点が合っていない面からの光が排除される。そのため、厚みのある試料のそれぞれの深度での蛍光像を主制御装置（１８）で重ね合わせて３次元構造を構築することができる。特にレーザー光を用いると解像度が向上する。

図７及び８は、粗調整用ステージ（２１）の例の平面図及び正面図である。
図示の粗調整用ステージ（２１）（駿河精機社製）は、試料の載置されるＸＹ方向に移動可能である。ダイアル（２２ａ）の操作によって手動でＸ軸調整用ステージ（２２）をＸ方向に移動でき、ダイアル（２３ａ）の操作によって手動でＹ軸調整用ステージ（２３）をＹ方向に移動できる。主制御装置（１８）と接続して、ＰＣによる自動スキャンしてもよい。

図９は、微調整用ステージ（３１）の例の平面図である。
微調整用ステージ（３１）には、ピエゾ素子型のステージ（NANONICS社製）が利用可能であり、その中央部には、試料を載置すると共に光を透過するガラス等を設置するための開口部（３３）が備わる。

図１０及び１１は、鏡筒調整用ステージ（４１）の例の正面図及び側面図である。
図示の鏡筒調整用ステージ（４１）（駿河精機社製）は、ＸＹＺ方向に移動可能である。ダイアル（４２ａ）の操作によって手動で鏡筒Ｘ軸調整用ステージ（４２）をＸ方向に移動でき、ダイアル（４３ａ）の操作によって手動で鏡筒Ｙ軸調整用ステージ（４３）をＹ方向に移動でき、ダイアル（４４ａ）の操作によって手動で鏡筒Ｚ軸調整用ステージ（４４）をＺ方向に移動できる。
鏡筒（１３）は、鏡筒Ｚ軸調整用ステージ（４４）の開口部（４６）に嵌合された鏡筒支持盤（１５）を介して支持される。

図１２は、鏡筒回転調整手段（５１）の例の正面図である。
図示の鏡筒回転調整手段（５１）（駿河精機社製）は、試料の観測焦点（５０）を中心にして、Ｚ方向を含む面内で鏡筒（１３）を回転移動させることができる。鏡筒回転調整手段（５１）は、鏡筒調整用ステージ（４１）内に付設してもよいし、鏡筒調整用ステージ（４１）に連設してもよい。鏡筒（１３）を回転移動させる移動角は、±４°程度である。

図１３は、本発明の顕微鏡装置により観測する２次元フォトニック構造の電子顕微鏡像である。
走査電子顕微鏡によって、径１２５nmの穴状構造が、５００nm周期で配列していることが明確にわかる。
図１４は、本発明の顕微鏡装置により観測した図１３の２次元フォトニック構造のカラーＣＣＤカメラによるリアルタイム観測像を示す静止画である。
２次元フォトニック構造を、カラーＣＣＤカメラ（１７）でリアルタイム観測した際に、その観測像を静止画として切り出し、モニター（１９）に表示すると共にＰＣ（１８）に保存した。

図１５は、本発明による顕微鏡を用いた共焦点顕微鏡による２次元走査画像である。
光源（６１）としてグリーンレーザーを用い、試料の２ミクロン角を走査し、微小開口（１７’）からの光信号を分光装置（７１）を介して、レーザー散乱２次元走査画像を得た。
図１６は、図１５によって得られた共焦点顕微鏡による２次元走査画像から、光強度を縦軸として得た３次元画像表示例である。
ＰＣ（１８）上に得られた図１５の２次元走査画像を、画像処理ソフトウエアにて処理して３次元構造を得た。

本発明によると、多軸の位置調整による観測の効率化と共に、試料を斜めから観測したり、外部からの照射光を試料へ誘導したり、多様な観測形態が可能になるので、微細な工業製品の製造検査や、医化学研究や、ラマン分光法を用いた化学分析など用途が広く、産業上利用価値が高い。

本発明による顕微鏡の要部を示す説明図 別実施例の要部を示す説明図 別実施例の要部を示す説明図 実験に用いた顕微鏡の斜視図（写真） 実験に用いた顕微鏡のステージ近傍の斜視図（写真） 実験に用いた顕微鏡の概要を示す説明図 粗調整用ステージの平面図 同、正面図 微調整用ステージの平面図 鏡筒調整用ステージの正面図 同、側面図 鏡筒回転調整手段の正面図 ２次元フォトニック構造の電子顕微鏡像 ２次元フォトニック構造のカラーＣＣＤカメラによるリアルタイム観測像を示す静止画 共焦点顕微鏡による２次元走査画像 共焦点顕微鏡による２次元走査画像から得た３次元画像

符号の説明

１１ 基台
１２ 試料ステージ高度調整台
１３ 鏡筒
１４ 鏡筒高度調整台
１５ 鏡筒支持盤
１６ 合焦部材
１７、１７’ 受光手段
１８ 主制御装置
１９ モニター
２１ 粗調整用ステージ
２２ Ｘ軸調整用ステージ
２２ａ ダイアル
２３ Ｙ軸調整用ステージ
２３ａ ダイアル
２４ Ｚ軸調整用ステージ
２５ 粗調整用ステージ制御手段
３１ 微調整用ステージ
３２ 微調整用ステージ制御手段
３３ 開口部
４１ 鏡筒調整用ステージ
４２ 鏡筒Ｘ軸調整用ステージ
４２ａ ダイアル
４３ 鏡筒Ｙ軸調整用ステージ
４３ａ ダイアル
４４ 鏡筒Ｚ軸調整用ステージ
４４ａ ダイアル
４５ 鏡筒調整用ステージ制御手段
４６ 開口部
５０ 試料の観測焦点
５１ 鏡筒回転調整手段
６１ 外部の光照射手段
６２ 光分岐部材
７１ 分光装置
７２ 光検出器

Claims (15)

1. 試料を設置するステージと、そのステージを支持すると共に移動させて位置調整するステージ制御手段と、試料に対して光を投光する投光手段と、鏡筒を有して試料からの光を受光する受光手段とを少なくとも備えた顕微鏡において、
   前記ステージが、
   試料を載置すると共に、その載置されるＸＹ面内で少なくとも２次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、
   その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶＺ方向を更に含むＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとから成り、
   更に、鏡筒に、
   鏡筒を支持すると共に、ＸＹＺ方向に３次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージが備わる
   ことを特徴とする顕微鏡。
2. 微調整用ステージが、
   直交するＸＹＺ方向に移動可能なピエゾ素子型のステージである
   請求項１に記載の顕微鏡。
3. 鏡筒調整用ステージに、
   試料の観測焦点を中心にして、Ｚ方向を含む面内で鏡筒を回転移動させる鏡筒回転調整手段が備わる
   請求項１または２に記載の顕微鏡。
4. 投光手段が、落射型照明であり、
   鏡筒内の落射型照明の光路に、外部の２つ以上の光照射手段からの照射光を導入して試料へ誘導する光分岐部材が備わる
   請求項１ないし３に記載の顕微鏡。
5. 光分岐部材が、落射型照明の光路に対して傾斜して設置される２つ以上のハーフミラーである
   請求項４に記載の顕微鏡。
6. 外部の光照射手段が、ひとつは白色ランプであり、それ以外はレーザーである
   請求項４または５に記載の顕微鏡。
7. 受光手段で得た顕微拡大画像の出力を、同時に２つ以上の読み出し装置に出力可能な接続が備わる
   請求項１ないし６に記載の顕微鏡。
8. 読み出し装置が、２次元画像カメラと、共焦点観測用の微小開口からの光信号を分光する分光装置とそれに接続された光検出器である
   請求項７に記載の顕微鏡。
9. ２次元画像カメラが、特定の波長の光のみを透過するカラーフィルター或いは偏光フィルターを備える
   請求項８に記載の顕微鏡。
10. 試料を設置するステージと、そのステージを支持すると共に移動させて位置調整するステージ制御手段と、試料に対して光を投光する投光手段と、鏡筒を有して試料からの光を受光する受光手段とを少なくとも備えた顕微鏡において、
    前記ステージに、
    試料を載置すると共に、その載置されるＸＹ面内で少なくとも２次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、
    その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶＺ方向を更に含むＸＹＺ方向に３次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとを設け、
    更に、鏡筒に、
    鏡筒を支持すると共に、ＸＹＺ方向に３次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージを設け、
    その粗調整用ステージ、微調整用ステージ、鏡筒調整用ステージによって、試料の観測位置を調整後、
    まず、粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体像を低倍率の合焦部材で観測し、
    その後、微調整用ステージの移動制御によって、試料の所望部位を高倍率の合焦部材で観測し、
    同時に２次元画像検出と共焦点観測を行う
    ことを特徴とする顕微鏡の観測方法。
11. 微調整用ステージに、ピエゾ素子型のステージを用い、
    そのピエゾ素子型微調整用ステージの移動制御によって、試料の一定範囲を高速ＸＹラスター走査すると共に、
    粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体にわたり低速ＸＹラスター走査し、
    同時に２次元画像検出と共焦点観測を行い、共焦点出力信号をステージの移動に合わせて記憶、表示させる
    請求項１０に記載の顕微鏡の観測方法。
12. 鏡筒調整用ステージに、試料の観測焦点を中心にして、Ｚ方向を含む面内で鏡筒を回転移動させる鏡筒回転調整手段を設け、
    その鏡筒回転調整手段の回転制御によって、鏡筒を回転させることで、試料をＺ方向から傾斜した方位で観測する
    請求項１０または１１に記載の顕微鏡の観測方法。
13. 投光手段に、落射型照明を用い、
    鏡筒内の落射型照明の光路に光分岐部材を設けて、外部の２つ以上の光照射手段からの照射光を導入して試料へ誘導し、
    その光照射による試料の変化を観測する
    請求項１０ないし１２に記載の顕微鏡の観測方法。
14. 試料に、蛍光色素ラベルされた生体試料を用い、
    外部からの光照射による光励起によって蛍光観測を行う際、共焦点観測用の微小開口からの光信号を分光装置を介して分光し、特定の波長の光信号を画像化させることにより観測する
    請求項１３に記載の顕微鏡の観測方法。
15. 試料に、生体試料を用い、
    外部の光照射手段に、紫外線レーザーを用い、
    その紫外線レーザーを試料の所定位置に照射して、組織の光損傷を、特定の波長フィルターを介した２次元画像装置を介して観測する
    請求項１３に記載の顕微鏡の観測方法。

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