JP2009116317A - 顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】セクショニング分解能が変更可能な共焦点観察と通常の共焦点観察とを切り換えて行うことが可能な顕微鏡装置を提供する。
【解決手段】標本３に照明光を照射する照明光学系５と、標本３を共焦点観察するための第１の共焦点観察光学系２１と、標本３をセクショニング分解能を変更して共焦点観察するための第２の共焦点観察光学系２３と、標本３からの観察光を少なくとも第１の共焦点観察光学系２１及び第２の共焦点観察光学系２３の一方へ切り換えて導く光学部材１６ａを有する光路切換手段１６と、共焦点観察光学系２１，２３を経た前記観察光を検出するための検出手段６と、を有することを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。

従来、対物レンズの焦点位置と共役な位置にピンホールを配置することで、観察対象を標本のピント面近傍の薄い層に限定（セクショニング）して観察を行う共焦点顕微鏡が知られており、近年では観察対象となるこの層の厚み、所謂互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行うものが提案されている（例えば、特許文献１を参照。）。
特開2005-274591号公報

しかしながら、通常（所定（固定）のセクショニング分解能）の共焦点顕微鏡と上述のような互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う共焦点顕微鏡を用いて同一の標本を観察しようとすれば、各共焦点顕微鏡において標本の観察位置をその都度セッティングしなければならない。このため、各共焦点顕微鏡で得られる標本の観察画像には観察位置のずれが生じてしまうという問題があった。

そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、ほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察と所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とを切り換えて行うことが可能な顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明は、標本に照明光を照射する照明光学系と、
前記標本を所定のセクショニング分解能で共焦点観察するための第１の共焦点観察光学系と、
前記標本を互いに異なるセクショニング分解能でほぼ同時に共焦点観察を行うための第２の共焦点観察光学系と、
前記標本からの観察光を少なくとも前記第１の共焦点観察光学系及び前記第２の共焦点観察光学系の一方へ切り換えて導く反射部材を有する光路切換手段と、
前記共焦点観察光学系を経た前記観察光を検出するための検出手段と、
を有することを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、ほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察と所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とを切り換えて行うことが可能な顕微鏡装置を提供することができる。

以下、本発明の各実施形態に係る顕微鏡装置を添付図面に基づいて詳細に説明する。
（第１実施形態）
はじめに、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の構成を説明する。
図１（ａ）に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置１は、倒立顕微鏡２、標本３の共焦点観察を行うための共焦点観察システム４、該共焦点観察システム４へ照明光を供給するレーザユニット５、共焦点観察システム４で得られた標本３の観察光を検出する光検出ユニット６、及びコントローラ７からなる。

倒立顕微鏡２は、上方から順に、透過照明装置８、標本３を載置するステージ９、対物レンズ１０、及び結像レンズ１１を有している。なお、この倒立顕微鏡２は、接眼観察用の接眼レンズ、及び標本３からの観察光を接眼レンズへ導くための不図示の光学系も備えている。

共焦点観察システム４は、倒立顕微鏡２の本体２ａに直接取り付けられており、該倒立顕微鏡２の結像レンズ１１側から順に、スキャナレンズ１２、光を二次元的に走査するガルバノスキャナ１３、ダイクロイックミラー１４、集光レンズ１５、光路切換部１６、及び第１ピンホールユニット２１を有している。そして、ダイクロイックミラー１４の反射光路上にはコリメートレンズ１９を有し、さらに光路切換部１６の反射光路上には反射ミラー１８を介して第２ピンホールユニット２３を有している。

第１ピンホールユニット２１は、所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行うためのユニットであって、集光レンズ１５の焦点位置近傍に配置されており円形の開口が形成されたピンホール部材２２からなる。なお、このピンホール部材２２の開口径は、不図示の調整機構によって可変であり、これによって対物レンズ１０の倍率に対して最適な大きさに設定することが可能である。また、斯かる構成の第１ピンホールユニット２１は、光ファイバ２１ａを介して光検出ユニット６と接続されている。

第２ピンホールユニット２３は、互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行うためのユニットであって、光路切換部１６の反射光路上において集光レンズ１５の焦点位置近傍に配置されたマスク部材２４からなる。取得した互いに異なるセクショニング分解能の共焦点画像を用いて演算により任意のセクショニング分解能の共焦点観察画像を取得することができる。
このマスク部材２４は、図１（ｂ）に示すように入射光軸上に位置する小径の円形開口（小径ピンホール）２５ａと該小径ピンホール２５ａよりも大径の円形開口（大径ピンホール）２５ｂとが形成されたピンホールマスク面２５と、これに対向する反射面２６とを備えた透明基板２７からなり、光軸に対して傾けて配置されている。なお、小径ピンホール２５ａ及び大径ピンホール２５ｂは、集光レンズ１５の焦点深度内に収まるように設けられている。そして、斯かる構成の第２ピンホールユニット２３は、光ファイバ２３ａ，２３ｂを介して光検出ユニット６と接続されている。

光路切換部１６は、反射ミラー１６ａを備えたターレット部材からなり、これを回転操作することで当該反射ミラー１６ａを光軸上に配置、或いは何も配置せずに素通し状態とすることができる。なお、斯かる光路切換部１６の構成はターレット部材に限られず、反射ミラー１６ａをスライドさせて光軸上へ選択的に配置する構成のスライド部材等としてもよく、このことは後記第２実施形態においても同様である。

レーザユニット５は、光ファイバ５ａを介して共焦点観察システム４と接続されており、共焦点観察システム４のコリメートレンズ１９側から順に、集光レンズ３０、ダイクロイックミラー３１、及び反射ミラー３２を有し、これらのミラー３１，３２の反射光路上には、シャッタ装置３３ａ,３４ａ、及び波長の異なるレーザ光を発するレーザ光源３
３ｂ,３４ｂをそれぞれ有している。なお、シャッタ装置３３ａ,３４ａには、レーザ光のパワーを調整するための音響光学素子等も含まれている。

光検出ユニット６は、共焦点観察システム４における第１ピンホールユニット２１からの観察光を入力するために光ファイバ２１ａが接続された第１の入力ポート６ａと、第２ピンホールユニット２３の小径ピンホール２５ａを通過した観察光を入力するために光ファイバ２３ａが接続された第２の入力ポート６ｂと、第２ピンホールユニット２３の大径ピンホール２５ｂを通過した観察光を入力するために光ファイバ２３ｂが接続された第３の入力ポート６ｃとを筐体側面に備えている。

そして光検出ユニット６の筐体内部には、次の２つの光検出部３５，３６が備えられている。光検出部３５は、第３の入力ポート６ｃ側から順に、レンズ３７、光路切換ミラー３８、ダイクロイックミラー３９、及び該ダイクロイックミラー３９と波長特性の異なるダイクロイックミラー４０を有している。また、光路切換ミラー３８の反射光路上には、第１の入力ポート６ａに対向するレンズ４１を有している。そして光検出部３５は、各ダイクロイックミラー３９，４０の透過光路上及び反射光路上に、バリアフィルタ４２ａ，４３ａ，４４ａ、集光レンズ４２ｂ，４３ｂ，４４ｂ、微弱光を検出可能なフォトマルチプライヤ（ＰＭＴ）４２ｃ，４３ｃ，４４ｃをそれぞれ有している。
なお、光路切換ミラー３８は、不図示のスライド機構によって光軸上へ挿脱可能に設けられており、これにより第１の入力ポート６ａから入力された観察光と第３の入力ポート６ｃから入力された観察光を選択的に切り換えて各ＰＭＴ４２ｃ，４３ｃ，４４ｃへ導くことが可能である。

また光検出部３６は、第２の入力ポート６ｂ側から順に、レンズ４５、ダイクロイックミラー４６、該ダイクロイックミラー４６と波長特性の異なるダイクロイックミラー４７を有している。そして、各ダイクロイックミラー４６，４７の透過光路上及び反射光路上に、バリアフィルタ４８ａ，４９ａ，５０ａ、集光レンズ４８ｂ，４９ｂ，５０ｂ、ＰＭＴ４８ｃ，４９ｃ，５０ｃをそれぞれ有している。

コントローラ７は、コンピュータ５２と接続されており、該コンピュータ５２からの指示に基づいて顕微鏡装置１の各部を制御するものである。具体的には、コントローラ７は、倒立顕微鏡２、共焦点観察システム４のガルバノスキャナ１３、レーザユニット５、光検出ユニット６を制御するために、それぞれに対応した制御部７ａ，７ｂ，７ｃ，７ｄを備えている。なお、コンピュータ５２には、標本３の観察画像等を表示するためのモニタ５３も接続されている。

次に、以上に述べた構成の顕微鏡装置１について、所定のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合と、互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う場合とに分けて説明する。

本顕微鏡装置１において、所定のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合には、予め共焦点観察システム４における光路切換部１６を回転操作して、反射ミラー１６ａを光軸外へ退避させ素通し状態にしておく。そして、光検出ユニット６内の光検出部３５の光路切換ミラー３８を光軸上に配置しておく。
この前提の下、レーザユニット５においてレーザ光源３３ｂから発せられた光は、シャッタ装置３３ａを経て、ダイクロイックミラー３１で反射され、集光レンズ３０に入射する。また、もう１つのレーザ光源３４ｂから発せられた光は、シャッタ装置３４ａを経て、反射ミラー３２で反射され、さらにダイクロイックミラー３１を透過して集光レンズ３０に入射する。これにより、各レーザ光源３３ｂ，３４ｂのレーザ光は、集光レンズ３０によってまとめて光ファイバ５ａの端面に集光され、この光ファイバ５ａを介して照明光として共焦点観察システム４へ入力される。

共焦点観察システム４に入力された照明光は、コリメートレンズ１９を経てダイクロイックミラー１４で反射され、ガルバノスキャナ１３とスキャナレンズ１２を介して倒立顕微鏡２へ入力される。この照明光は、倒立顕微鏡２の本体２ａ内において結像レンズ１１と対物レンズ１０を順に介してステージ９上の標本３に照射される。
これによって標本３から発せられた観察光は、再び対物レンズ１０、結像レンズ１１を順に経て共焦点観察システム４へ入力される。この観察光は、共焦点観察システム４において再びスキャナレンズ１２とガルバノスキャナ１３を経た後、ダイクロイックミラー１４を透過しさらに集光レンズ１５を経て、光路切換部１６へ導かれる。そしてこの観察光は、光路切換部１６を素通りして第１ピンホールユニット２１のピンホール部材２２に集光され、該ピンホール部材２２を通過した観察光は、光ファイバ２１ａを介して光検出ユニット６へ第１の入力ポート６ａより入力される。

光検出ユニット６へ入力された観察光は、光検出部３５において、レンズ４１を経た後、光路切換ミラー３８によって反射されてダイクロイックミラー３９へ導かれる。そしてこの観察光は、該ダイクロイックミラー３９によって透過光と反射光に分離され、当該透過光はダイクロイックミラー４０によってさらに透過光と反射光に分離される。即ち観察光は、波長特性の異なる２枚のダイクロイックミラー３９，４０によって、３つの波長成分（ダイクロイックミラー３９の反射光、及びダイクロイックミラー４０の反射光と透過光）に分離されることとなり、この３つの波長成分はそれぞれ対応するバリアフィルタ４２ａ，４３ａ，４４ａと集光レンズ４２ｂ，４３ｂ，４４ｂを順に経た後、ＰＭＴ４２ｃ，４３ｃ，４４ｃで検出される。なお、標本３に照射される照明光は、ガルバノスキャナ１３によって二次元的に走査されるため、各ＰＭＴ４２ｃ，４３ｃ，４４ｃでは標本３の観察領域全体にわたって観察光が検出されることとなる。

そしてこれによりコンピュータ５２は、各ＰＭＴ４２ｃ，４３ｃ，４４ｃから観察光の波長成分毎の検出信号をコントローラ７を介して取得し、これに基づいて標本３の二次元画像データを作成して観察画像をモニタ５３に表示させる。このようにして観察者は、標本３を波長成分毎に共焦点観察することが可能となる。

本顕微鏡装置１において、互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う場合には、予め共焦点観察システム４における光路切換部１６を回転操作して反射ミラー１６ａを光軸上に配置しておく。そして、光検出ユニット６内の光検出部３５の光路切換ミラー３８を光軸外へ退避させておく。
この前提の下、上述した所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合と同様に、レーザユニット５からの照明光が照射された標本３から発せられた観察光は、共焦点観察システム４の光路切換部１６へ導かれる。そしてこの観察光は、該光路切換部１６の反射ミラー１６ａで反射され、さらにミラー１８で反射された後、第２ピンホールユニット２３のマスク部材２４へ入射する。

マスク部材２４に入射した観察光のうち、小径ピンホール２５ａ内に集光した光は、該小径ピンホール２５ａを通過し、光ファイバー２３ａを介して光検出ユニット６へ第２の入力ポート６ｂより入力される。一方、小径ピンホール２５ａの周辺に入射した観察光は、ピンホールマスク面２５で反射され、さらに反射面２６で反射されて大径ピンホール２５ｂへ導かれる。この観察光のうち、大径ピンホール２５ｂ内に集光した光は該大径ピンホール２５ｂを通過し、光ファイバー２３ｂを介して光検出ユニット６へ第３の入力ポート６ｃより入力される。なお、大径ピンホール２５ｂの周辺に入射した観察光は、ピンホールマスク面２５で再び反射され不要光として廃棄される。

次に、光検出ユニット６へ第２の入力ポート６ｂより入力された観察光（小径ピンホール２５ａを通過した観察光）は、光検出部３６において、レンズ４５を経た後、２枚のダイクロイックミラー４６，４７によって３つの波長成分に分離され、それぞれ対応するバリアフィルタ４８ａ，４９ａ，５０ａと集光レンズ４８ｂ，４９ｂ，５０ｂを順に経た後、ＰＭＴ４８ｃ，４９ｃ，５０ｃで検出される。なお、標本３に照射される照明光は、上述のようにガルバノスキャナ１３によって二次元的に走査されるため、各ＰＭＴ４８ｃ，４９ｃ，５０ｃでは標本３の観察領域全体にわたって観察光が検出されることとなる。

これによりコンピュータ５２は、光検出ユニット６の各ＰＭＴ４８ｃ，４９ｃ，５０ｃから観察光の波長成分毎の検出信号をコントローラ７を介して取得し、これに基づいて標本３の二次元画像データを作成して当該コンピュータ５２内に備えられている不図示のメモリに格納する。なお、ここで得られた標本３の二次元画像データは、小径ピンホール２５ａを通過した観察光に基づくものであるため、標本３におけるピント面近傍の薄い層の情報、即ちセクショニング分解能が高い情報を有している。

また、光検出ユニット６へ第３の入力ポート６ｃより入力された観察光（大径ピンホール２５ｂを通過した観察光）は、上述した第１の入力ポート６ａより入力された観察光と同様に光検出部３５で検出され、コンピュータ５２によって波長成分毎の標本３の二次元画像データが作成されてメモリに格納される。なお、ここで得られた標本３の二次元画像データは、大径ピンホール２５ｂを通過した観察光に基づくものであるため、標本３におけるピント面周辺の厚い層の情報、即ちセクショニング分解能が低い情報を有している。

以上のようにしてセクショニング分解能の高い二次元画像データとセクショニング分解能の低い二次元画像データを波長成分毎に得たコンピュータ５２は、これらに演算を施すことで、観察者より指定されているセクショニング分解能の二次元画像データを波長成分毎に作成し観察画像をモニタ５２に表示させる。このようにして観察者は、標本３を波長成分毎に所望のセクショニング分解能にて共焦点観察することが可能となる。
なお、観察者によるセクショニング分解能の変更は、標本３の二次元画像データの取得前後に関わらず、当該コンピュータ５２に設けられている不図示の入力部を介して行うことができる。したがって観察者は、例えばモニタ５３に表示された標本３の観察画像を確認後、セクショニング分解能を低く変更することで、より明るい観察画像をモニタ５３に表示させて再度観察を行うこと等も可能となる。

以上、本実施形態によれば、ほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察と所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とを、標本の観察位置がずれることなく、光路切換部１６によって素早く簡単に切り換えて行うことが可能な顕微鏡装置１を実現することができる。また本実施形態に係る顕微鏡装置１は、本来ならば３つの光検出ユニットを要する構成であるものの、上述した構成の光検出ユニット６を用いることで、電気ケーブルや筐体部品を減らし、さらに設置スペースの小型化を図ることができる。

（第２実施形態）
以下、本実施形態に係る顕微鏡装置について、上記第１実施形態と同様の構成である部分には同じ符号を付してその説明を省略し、異なる構成の部分について詳細に説明する。
図２に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置６０は、共焦点観察システム４における光路切換部１６が、反射ミラー１６ａ、及びビームスプリッタを備えたターレット部材からなり（本実施形態では、ビームスプリッタとしてハーフミラー１６ｂと不図示のダイクロイックミラーを備えている。）、これを回転操作することで所望の光学部品を光軸上に選択的に配置、或いは何も配置せずに素通し状態とすることができる。

また、本実施形態に係る顕微鏡装置６０は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１の光検出ユニット６に代えて、３つの光検出ユニット６１，６２，６３を備えている。
第１ピンホールユニット２１と光ファイバ２１ａを介して接続されている光検出ユニット６１は、上記第１実施形態における光検出ユニット６の光検出部３６と同様の構成である。

また、第２ピンホールユニット２３と光ファイバ２３ａを介して接続されている光検出ユニット６２は、入力ポート側から順に、レンズ６５、ダイクロイックミラー切換部６６、及びダイクロイックミラー切換部６７を有している。そして、各ダイクロイックミラー切換部６６，６７の透過光路上及び反射光路上に、集光レンズ６８ｂ，６９ｂ，７０ｂ、ＰＭＴ６８ｃ，６９ｃ，７０ｃをそれぞれ有している。

ここで、ダイクロイックミラー切換部６６，６７は、ダイクロイックミラー６６ａ，６７ａと該ダイクロイックミラー６６ａ，６７ａに対応してその反射光路上に配置されたバリアフィルタ６６ｂ，６７ｂとの組み合わせを複数組備えたターレット部材からなる。なお、ダイクロイックミラー切換部６７は、ダイクロイックミラー６７ａの透過光路上にも対応するバリアフィルタ６７ｃが備えられている。これにより観察者は、斯かる構成のダイクロイックミラー切換部６６，６７をそれぞれ回転操作することで、所望の波長特性を有するダイクロイックミラー及びバリアフィルタの組み合わせを光軸上に選択的に配置し、観察光を所望の波長成分に分離することが可能となる。
なお、第２ピンホールユニット２３と光ファイバ２３ｂを介して接続されている光検出ユニット６３は、前述の光検出ユニット６２と同様の構成である。

次に、以上に述べた構成の顕微鏡装置６０について、所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合、互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う場合、及びこれらの観察を同時に行う場合に分けて説明する。

本顕微鏡装置６０において、所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合には、予め共焦点観察システム４の光路切換部１６を回転操作し、いずれの光学部材も光軸上に配置せず素通し状態にしておく。
この前提の下、上記第１実施形態で述べた所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合と同様に標本３から発せられた観察光は共焦点観察システム４の第１ピンホールユニット２１を経た後、光検出ユニット６１へ導かれ該光検出ユニット６１で検出される。これによりコンピュータ５２は、光検出ユニット６１からの検出信号に基づいて標本３の二次元画像データを波長成分毎に作成し観察画像をモニタ５３に表示させる。これによって観察者は、標本３を波長成分毎に共焦点観察することが可能となる。

本顕微鏡装置６０において、互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う場合には、予め共焦点観察システム４の光路切換部１６を回転操作して反射ミラー１６ａを光軸上に配置しておく。また、光検出ユニット６２，６３における各ダイクロイックミラー切換部６６，６７を回転操作して所望の波長特性を有するダイクロイックミラーを光軸上に配置しておく。
この前提の下、上記第１実施形態で述べた互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う場合と同様に、標本３から発せられた観察光は共焦点観察システム４の第２ピンホールユニット２３へ導かれる。これにより、マスク部材２４の小径ピンホール２５ａを通過した観察光と大径ピンホール２５ｂを通過した観察光は、それぞれ光検出ユニット６２，６３へ導かれ該光検出ユニット６２，６３で検出される。これによりコンピュータ５２は、上記第１実施形態で述べた互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行う場合と同様に、観察者より指定されているセクショニング分解能の二次元画像データを波長成分毎に作成して観察画像をモニタに表示させる。これにより観察者は、標本３を波長成分毎に所望のセクショニング分解能にて共焦点観察することが可能となる。

本顕微鏡装置６０において、所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察とを同時に行う場合には、予め共焦点観察システム４における光路切換部１６を回転操作してハーフミラー１６ｂを光軸上に配置しておく。また、光検出ユニット６２，６３における各ダイクロイックミラー切換部６６，６７を回転操作して所望の波長特性を有するダイクロイックミラーを光軸上に配置しておく。

この前提により、上述した所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行う場合と同様に標本３から発せられた観察光は、共焦点観察システム４における光路切換部１６のハーフミラー１６ｂによって透過光と反射光に分離される。そして透過光は第１ピンホールユニット２１へ導かれ、これと同時に反射光は第２ピンホールユニット２３へ導かれる。このため、各ピンホールユニット２１，２３に対応する各光検出ユニット６１，６２，６３では観察光が同時に検出されることとなる。
これによりコンピュータ５２は、所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察による標本３の二次元画像データとほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察による標本３の二次元画像データとを作成し、これらの観察画像を同時にモニタ５３に表示する。これによって観察者は所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察と、ほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察とを同時に行うことが可能となる。

ここで、本顕微鏡装置６０において所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察とを同時に行う場合には、共焦点観察システム４における光路切換部１６の不図示のダイクロイックミラーを光軸上に配置してもよい。これにより、所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察と、ほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察とを異なる波長で同時に行うことが可能となる。具体的には、例えば波長５５０ｎｍ以下の観察光によって所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察を行い、波長５５０ｎｍ以上の観察光によって互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察をほぼ同時に行うことができる。

以上、本実施形態によれば、上記第１実施形態に係る顕微鏡装置と同様に、ほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察と所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とを、標本の観察位置がずれることなく、光路切換部１６によって素早く簡単に切り換えて行うことが可能な顕微鏡装置６０を実現することができる。また、本実施形態では、上述のようにほぼ同時に行う互いに異なるセクショニング分解能の共焦点観察と所定（固定）のセクショニング分解能の共焦点観察とを同時に行うこともできる。

（第３実施形態）
以下、本実施形態に係る顕微鏡装置について、上記第１実施形態と同様の構成である部分には同じ符号を付してその説明を省略し、異なる構成の部分について詳細に説明する。
図３に示すように本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、集光レンズ１５に光軸と直交する方向へ電動で移動できる機構を備えている。

これは、不図示のダイクロイックミラー切換部のダイクロイックミラー１４を使用する励起波長ごとに適切なダイクロイックミラーに切り換えること、及び光路切換部１６の反射ミラー１６ａを挿入又は脱却することにより、各ダイクロイックミラー１４、反射ミラー１６ａの位置ズレに起因して生じる、集光レンズ１５の焦点位置とピンホール部材２２、マスク部材２４の小径ピンホール２５a、大径ピンホール２５ｂの中心とのズレを修正するためのものである。
集光レンズ１５に光軸と直交する方向へ電動で移動できる機構を設けることにより、光軸をｚ軸方向とする３次元直交座標系において、集光レンズ１５は、ｘ軸方向、ｙ軸方向へ、それぞれモータ１１３、１１４によって移動される。なお、移動機構の詳細については後述する。

光路切換部１６の反射ミラー１６ａを挿入した場合であって、各ダイクロイックミラーの集光位置と小径ピンホール２５ａ、大径ピンホール２５ｂの中心とのズレ量、及び光路切換部１６に何も配置せずに素通し状態の場合であって、各ダイクロイックミラーの集光位置とピンホール部材２２の中心とのズレ量を装置出荷前に求め、これらを一致させるための補正値をコントローラ７内のメモリに記憶させておく。そして、光路切換部１６の反射ミラー１６ａ及びダイクロイックミラー切換部のダイクロイックミラー１４がある所定のポジションとされたら、集光レンズ１５の移動機構を制御するためにコントローラ７内に設けられた制御部７ｅが対応する補正値に基づいてモータ１１３、１１４を駆動し、集光レンズ１５をｘ軸方向、ｙ軸方向に２次元的に移動させる。このことにより、常に、集光レンズ１５の焦点位置がピンホール部材２２、マスク部材２４の小径ピンホール２５ａ、大径ピンホール２５ｂの中心と一致するようにすることができる。これにより、光量ロスのない共焦点顕微鏡とすることができる。

図４に、本発明の実施の形態である走査型共焦点顕微鏡に用いられる集光レンズ１５の駆動部の例を示す。集光レンズ１５はＸ方向駆動ステージ１５１上にあり、Ｘ方向駆動ステージ１５１は、Ｘ方向ガイド１５２、１５３上を、モータ１１３、カップリング１５５、送りねじ１５６により、Ｘ方向に移動することができる。このＸ方向駆動ステージ１５１はＹ方向駆動ステージ１５８上にある。また、Ｙ方向駆動ステージ１５８も同様に、Ｙ方向ガイド１５９、１６０上を、モータ１１４、カップリング１６２、送りねじ１６３により、Ｙ方向に駆動することができる、上述の集光レンズ駆動機構には座標原点を求めるためにＸ、Ｙ各軸にリミットセンサ１５７、１６４が取り付けられている。

コントローラ７内の不図示のＣＰＵは電源投入時に、以下の方法で原点検知を行う。Ｘ方向駆動ステージ１５１をリミットセンサ１５７方向に駆動し、Ｘ方向駆動ステージ１５１とリミットセンサ１５７が接触することにより、リミットセンサ１５７はＣＰＵにリミット状態であることを通知する。この通知を受けたＣＰＵはリミットセンサ１５７からある一定のパルス分駆動した位置をＸ方向の原点とする。Ｙ方向も同様にＹ方向駆動ステージ１５８とリミットセンサ１６４が接触状態にあることを検知し、ＣＰＵはリミットセンサ１６４から一定のパルス分駆動した位置をＹ方向の原点とする。原点検知後はパルスモータのパルス数のみを制御することでＸ、Ｙの位置を高い再現性で制御することが可能となる。

図３の集光レンズ駆動機構を備えた共焦点顕微鏡において、装置出荷前にダイクロイックミラー切換部の各ダイクロイックミラー１４と光路切換部１６の反射ミラー１６ａのポジション毎の全ての組み合わせにおいて、集光レンズ１５の焦点位置がピンホール部材２２、マスク部材２４の小径ピンホール２５ａ、大径ピンホール２５ｂの中心と一致するために必要な集光レンズ１５の補正値（Ｘ，Ｙ）を予め計測し、コンピュータ５２内のメモリに格納する。コンピュータ５２では、図５（ａ）に示す形式でメモリに格納する（図５（ａ）は、光路切換部１６のポジション（１は反射ミラー、２は素通し状態）、ダイクロイックミラー切換部のポジション（１〜３は、励起波長、蛍光波長に対応した各ダイクロイックミラー１４）における参照表である）。このときの補正値はパルスモータのパルス数としているため制御が簡単である。

上述した集光レンズ１５の補正値がメモリに格納されている場合の本体部のモータ制御は、図６に示すように以下のシーケンスで行う。
処理１…コンピュータ５２内のソフトウェアからの駆動指示により、コントローラ７内のＣＰＵは必要な駆動部材（光路切換部１６、ダイクロイックミラー切換部、集光レンズ１５の駆動部等）の選択を行う。
処理２…処理１で駆動部材として光路切換部１６あるいはダイクロイックミラー切換部を駆動する場合、メモリから集光レンズ補正パルス数を取得する。
処理３…処理１で選択された部材の駆動を開始する。集光レンズ１５の駆動量は処理２で取得した集光レンズ補正パルス数とする。
処理４…処理１で選択された全ての駆動部が停止して処理が完了となる。

例えば、光路切換部１６のポジションが図５(ａ)の１でダイクロイックミラー切換部のポジションが図５（ａ）の２（光路切換部１６に何も配置せずに素通し状態）の場合、集光レンズ１５はＸ方向にＸ２パルス、Ｙ方向にＹ２パルス駆動させることにより、集光レンズ１５の焦点位置がピンホール部材２２の中心と一致する。
図５（ａ）では、ダイクロイックミラー切換部と光路切換部１６の全ての組み合わせについての補正値をメモリに格納するようにしているが、これに限定されず、図５（ｂ）に示すように、ダイクロイックミラー切換部の各ポジションに対する補正値、及び光路切換部１６の反射ミラー１６ａを脱却して素通しにした状態（ポジション２）に対する、反射ミラー１６ａを挿入した状態（ポジション１）のオフセット量をメモリに格納しておいてもよい。

（ａ）は本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図であり、（ｂ）は第２ピンホールユニットにおけるマスク部材の構成を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。 本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。 本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置に用いられる集光レンズの駆動部の例を示す図である。 補正値の格納方式の例を示す図である。 駆動部材を駆動するシーケンスを示す図である。

符号の説明

１，６０，１００ 顕微鏡装置
２ 倒立顕微鏡
３ 標本
４ 共焦点観察システム
５ レーザユニット
６，６１，６２ 光検出ユニット
７ コントローラ
１６ 光路切換部
１６ａ 反射ミラー
１６ｂ ハーフミラー
２１ 第１ピンホールユニット
２３ 第２ピンホールユニット
２４ マスク部材
５２ コンピュータ

Claims (5)

1. 標本に照明光を照射する照明光学系と、
   前記標本を所定のセクショニング分解能で共焦点観察するための第１の共焦点観察光学系と、
   前記標本を互いに異なるセクショニング分解能でほぼ同時に共焦点観察を行うための第２の共焦点観察光学系と、
   前記標本からの観察光を少なくとも前記第１の共焦点観察光学系及び前記第２の共焦点観察光学系の一方へ切り換えて導く反射部材を有する光路切換手段と、
   前記共焦点観察光学系を経た前記観察光を検出するための検出手段と、
   を有することを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記第２の共焦点観察光学系は、前記標本からの前記観察光をセクショニング分解能の異なる少なくとも２つの光束に分離する光分離手段を有しており、
   前記光束から得られた少なくとも２つの共焦点画像のデータに基づき、前記共焦点画像とセクショニング分解能の異なる共焦点画像のデータを作成する演算手段を有していることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記光路切換手段は、前記反射部材と、前記標本からの前記観察光を前記第１の共焦点観察光学系及び前記第２の共焦点観察光学系へ同時に導く光学部材とを切換可能に有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記検出手段は、
   前記第１の共焦点観察光学系及び前記第２の共焦点観察光学系で得られた前記観察光を個別に入力するための複数の入力ポートと、
   前記観察光を検出するための検出素子と、
   前記複数の入力ポートに入力された前記観察光を選択的に前記検出素子へ導く光路切換部材と、を有することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
5. 前記照明光学系は、前記照明光を標本に導くとともに、前記観察光を前記光路切換手段に導く光路分割手段を有し、
   前記第１の共焦点観察光学系は、第１のピンホール部材と前記観察光を前記第１のピンホール部材に集光させる集光光学系とを有し、
   前記第２の共焦点観察光学系は、第２のピンホール部材と前記観察光を前記第２のピンホール部材に集光させる前記集光光学系を有し、
   前記光路分割手段及び前記光路切換手段の前記光学部材のいずれか一方の切り換えに伴って発生する、前記集光光学系の集光位置と、前記第１のピンホール部材又は第２のピンホール部材との位置ズレを補正する補正量を予め記憶しておく記憶手段と、
   前記記憶手段に記憶された前記補正量に基づいて、前記集光光学系の位置を移動させることにより前記位置ズレを補正する補正機構を備えた請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。

Images