JP5142315B2 - 顕微鏡及びその観測方法 - Google Patents
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Description
また、いったん顕微鏡に設置された試料を、別の角度から観測したい場合も少なくない。
このような観測形態の調整に関連する従来技術には、次のようなものが開示されている。
更に、鏡筒調整用ステージの鏡筒回転調整手段の回転制御によって、試料を斜めから観測でき、多様な観測形態が得られる。
鏡筒内の落射型照明の光路に備わる光分岐部材によっては、外部の光照射手段からの照射光を試料へ誘導でき、光照射による試料の変化も観測可能になる。
図1は、本発明による顕微鏡の要部を示す説明図である。
基台(11)に、試料を設置するステージを支持すると共に高さ調整を行う試料ステージ高度調整台(12)と、鏡筒(13)を支持すると共に高さ調整を行う鏡筒高度調整台(14)とが設置されている。
粗調整用ステージ(21)は、試料の載置されるXY面及び試料と鏡筒(13)とを結ぶZ方向を含むXYZ方向に3次元的に移動可能であり、微調整用ステージ(31)を下方から支持している。
粗調整用ステージ(21)において各軸方位位置を調整するステージ、すなわちX軸調整用ステージ(22)、Y軸調整用ステージ(23)、Z軸調整用ステージ(24)は、粗調整用ステージ制御手段(25)に接続されて駆動制御される。
試料の載置される微調整用ステージ(31)は、その載置されるXY面内で少なくとも2次元方向に移動可能であり、粗調整用ステージ(21)と同様にXYZ方向に3次元的に移動可能でもよい。
微調整用ステージ(31)には、ピエゾ素子型のステージなど、微小移動制御に適した駆動制御機構を用い、その移動距離は粗調整用ステージ(21)より小さく設計する。
鏡筒調整用ステージ(41)も、XYZ方向に3次元的に移動可能であり、その各軸方位位置を調整するステージ、すなわち鏡筒X軸調整用ステージ(42)、鏡筒Y軸調整用ステージ(43)、鏡筒Z軸調整用ステージ(44)は、鏡筒調整用ステージ制御手段(45)に接続されて駆動制御される。
主制御装置(18)によって、粗調整用ステージ制御手段(25)、微調整用ステージ制御手段(32)、鏡筒調整用ステージ制御手段(45)による試料の観測位置調整や、受光手段(17)による撮像、その撮像データの表示、保存、解析等が司られる。
その2次元画像検出を行う受光手段(17)としての2次元画像カメラには、特定の波長の光のみを透過するカラーフィルター或いは偏光フィルターを付設して、観測の利便に寄与させてもよい。
ピエゾ素子型の微調整用ステージ(31)の移動制御によって、試料の一定範囲を高速XYラスター走査すると共に、粗調整用ステージ(21)の移動制御によって、試料全体にわたり低速XYラスター走査してもよい。
この観測法は、特に生体試料のように、時々刻々と形態が変化するような生体反応が進展するリアルタイム観測に有効である。
試料の観測焦点(50)を中心にして、Z方向を含む面内で鏡筒(13)を回転移動させる鏡筒回転調整手段(51)が、鏡筒調整用ステージ(41)に付設されている。このような回転機構には、例えばX線回折計に使用されているゴニオメーターヘッドなどの従来技術を適宜利用可能である。
この鏡筒回転調整手段(51)の回転制御により鏡筒(13)を回転させることで、試料をZ方向から傾斜した方位で観測できる。
本実施例は、外部の光照射手段(61)からの照射光を、本顕微鏡内に導入して試料へ誘導するものである。
投光手段に落射型照明を用い、鏡筒(13)内の落射型照明の光路に、ハーフミラー等の光分岐部材(62)が付設されている。その光分岐部材(62)により、外部の光照射手段(61)からの照射光が試料へ誘導されるので、その光照射による試料の変化が観測できる。
なお、外部の光照射手段(61)は、白色ランプとレーザーとの複数設けることが好ましい。
受光手段(17)(17’)で得た顕微拡大画像の出力は、同時に複数の読み出し装置に出力可能に接続されている。図示の読み出し装置は、c-ccd等を有する2次元画像カメラ(17)と、共焦点観測用の微小開口(17’)からの光信号を分光する分光装置(71)とそれに接続された光検出器(72)である。
その際、共焦点観測用の微小開口(17’)からの光信号は、分光装置(71)によって、特定の波長の光信号が画像化される。
同時に2次元画像検出と共焦点観測を行うことで、共焦点出力画像を微調整用ステージ(31)の移動に合わせて、主制御装置(18)に記憶したり、ビデオモニター(19)に表示させることができる。
図示の粗調整用ステージ(21)(駿河精機社製)は、試料の載置されるXY方向に移動可能である。ダイアル(22a)の操作によって手動でX軸調整用ステージ(22)をX方向に移動でき、ダイアル(23a)の操作によって手動でY軸調整用ステージ(23)をY方向に移動できる。主制御装置(18)と接続して、PCによる自動スキャンしてもよい。
微調整用ステージ(31)には、ピエゾ素子型のステージ(NANONICS社製)が利用可能であり、その中央部には、試料を載置すると共に光を透過するガラス等を設置するための開口部(33)が備わる。
図示の鏡筒調整用ステージ(41)(駿河精機社製)は、XYZ方向に移動可能である。ダイアル(42a)の操作によって手動で鏡筒X軸調整用ステージ(42)をX方向に移動でき、ダイアル(43a)の操作によって手動で鏡筒Y軸調整用ステージ(43)をY方向に移動でき、ダイアル(44a)の操作によって手動で鏡筒Z軸調整用ステージ(44)をZ方向に移動できる。
鏡筒(13)は、鏡筒Z軸調整用ステージ(44)の開口部(46)に嵌合された鏡筒支持盤(15)を介して支持される。
図示の鏡筒回転調整手段(51)(駿河精機社製)は、試料の観測焦点(50)を中心にして、Z方向を含む面内で鏡筒(13)を回転移動させることができる。鏡筒回転調整手段(51)は、鏡筒調整用ステージ(41)内に付設してもよいし、鏡筒調整用ステージ(41)に連設してもよい。鏡筒(13)を回転移動させる移動角は、±4°程度である。
走査電子顕微鏡によって、径125nmの穴状構造が、500nm周期で配列していることが明確にわかる。
図14は、本発明の顕微鏡装置により観測した図13の2次元フォトニック構造のカラーCCDカメラによるリアルタイム観測像を示す静止画である。
2次元フォトニック構造を、カラーCCDカメラ(17)でリアルタイム観測した際に、その観測像を静止画として切り出し、モニター(19)に表示すると共にPC(18)に保存した。
光源(61)としてグリーンレーザーを用い、試料の2ミクロン角を走査し、微小開口(17’)からの光信号を分光装置(71)を介して、レーザー散乱2次元走査画像を得た。
図16は、図15によって得られた共焦点顕微鏡による2次元走査画像から、光強度を縦軸として得た3次元画像表示例である。
PC(18)上に得られた図15の2次元走査画像を、画像処理ソフトウエアにて処理して3次元構造を得た。
12 試料ステージ高度調整台
13 鏡筒
14 鏡筒高度調整台
15 鏡筒支持盤
16 合焦部材
17、17’ 受光手段
18 主制御装置
19 モニター
21 粗調整用ステージ
22 X軸調整用ステージ
22a ダイアル
23 Y軸調整用ステージ
23a ダイアル
24 Z軸調整用ステージ
25 粗調整用ステージ制御手段
31 微調整用ステージ
32 微調整用ステージ制御手段
33 開口部
41 鏡筒調整用ステージ
42 鏡筒X軸調整用ステージ
42a ダイアル
43 鏡筒Y軸調整用ステージ
43a ダイアル
44 鏡筒Z軸調整用ステージ
44a ダイアル
45 鏡筒調整用ステージ制御手段
46 開口部
50 試料の観測焦点
51 鏡筒回転調整手段
61 外部の光照射手段
62 光分岐部材
71 分光装置
72 光検出器
Claims (13)
- 試料を設置するステージと、そのステージを支持すると共に移動させて位置調整するステージ制御手段と、試料に対して光を投光する投光手段と、鏡筒を有して試料からの光を受光する受光手段とを少なくとも備えた顕微鏡において、
前記ステージが、
試料を載置すると共に、その載置されるXY面内で少なくとも2次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、
その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶZ方向を更に含むXYZ方向に3次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとから成り、
更に、鏡筒に、
鏡筒を支持すると共に、XYZ方向に3次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージが備わり、
また、受光手段で得た顕微拡大画像の出力を、同時に2つ以上の読み出し装置に出力可能な接続が備わり、
その読み出し装置が、2次元画像カメラと、共焦点観測用の微小開口からの光信号を分光する分光装置とそれに接続された光検出器である
ことを特徴とする顕微鏡。 - 微調整用ステージが、
直交するXYZ方向に移動可能なピエゾ素子型のステージである
請求項1に記載の顕微鏡。 - 鏡筒調整用ステージに、
試料の観測焦点を中心にして、Z方向を含む面内で鏡筒を回転移動させる鏡筒回転調整手段が備わる
請求項1または2に記載の顕微鏡。 - 投光手段が、落射型照明であり、
鏡筒内の落射型照明の光路に、外部の2つ以上の光照射手段からの照射光を導入して試料へ誘導する光分岐部材が備わる
請求項1ないし3のいずれかに記載の顕微鏡。 - 光分岐部材が、落射型照明の光路に対して傾斜して設置されるハーフミラーである
請求項4に記載の顕微鏡。 - 外部の光照射手段が、ひとつは白色ランプであり、それ以外はレーザーである
請求項4または5に記載の顕微鏡。 - 2次元画像カメラが、特定の波長の光のみを透過するカラーフィルター或いは偏光フィルターを備える
請求項1ないし6のいずれかに記載の顕微鏡。 - 試料を設置するステージと、そのステージを支持すると共に移動させて位置調整するステージ制御手段と、試料に対して光を投光する投光手段と、鏡筒を有して試料からの光を受光する受光手段とを少なくとも備えた顕微鏡において、
前記ステージに、
試料を載置すると共に、その載置されるXY面内で少なくとも2次元方向に移動可能であり、その移動距離が微小である微調整用ステージと、
その微調整用ステージを支持すると共に、鏡筒と試料とを結ぶZ方向を更に含むXYZ方向に3次元的に移動可能であり、その移動距離が微調整用ステージの移動距離より大きな粗調整用ステージとを設け、
更に、鏡筒に、
鏡筒を支持すると共に、XYZ方向に3次元的に移動可能である鏡筒調整用ステージを設け、
その粗調整用ステージ、微調整用ステージ、鏡筒調整用ステージによって、試料の観測位置を調整後、
まず、粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体像を低倍率の合焦部材で観測し、
その後、微調整用ステージの移動制御によって、試料の所望部位を高倍率の合焦部材で観測し、
同時に2次元画像検出と共焦点観測を行う
ことを特徴とする顕微鏡の観測方法。 - 微調整用ステージに、ピエゾ素子型のステージを用い、
そのピエゾ素子型微調整用ステージの移動制御によって、試料の一定範囲を高速XYラスター走査すると共に、
粗調整用ステージの移動制御によって、試料の略全体にわたり低速XYラスター走査し、
同時に2次元画像検出と共焦点観測を行い、共焦点出力信号をステージの移動に合わせて記憶、表示させる
請求項8に記載の顕微鏡の観測方法。 - 鏡筒調整用ステージに、試料の観測焦点を中心にして、Z方向を含む面内で鏡筒を回転移動させる鏡筒回転調整手段を設け、
その鏡筒回転調整手段の回転制御によって、鏡筒を回転させることで、試料をZ方向から傾斜した方位で観測する
請求項8または9に記載の顕微鏡の観測方法。 - 投光手段に、落射型照明を用い、
鏡筒内の落射型照明の光路に光分岐部材を設けて、外部の2つ以上の光照射手段からの照射光を導入して試料へ誘導し、
その光照射による試料の変化を観測する
請求項8ないし10のいずれかに記載の顕微鏡の観測方法。 - 試料に、蛍光色素ラベルされた生体試料を用い、
外部からの光照射による光励起によって蛍光観測を行う際、共焦点観測用の微小開口からの光信号を分光装置を介して分光し、特定の波長の光信号を画像化させることにより観測する
請求項11に記載の顕微鏡の観測方法。 - 試料に、生体試料を用い、
外部の光照射手段に、紫外線レーザーを用い、
その紫外線レーザーを試料の所定位置に照射して、組織の光損傷を、特定の波長フィルターを介した2次元画像装置を介して観測する
請求項11に記載の顕微鏡の観測方法。
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