CN105283792B - 用于操作和成像显微样本的方法和光学布置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种方法，其中用操作光操作样本，并且其中借助于SPIM技术在用呈照明光片的形式的照明光、特别是用于荧光激发的激发光照明下成像样本。方法的特征在于，操作光和照明光都由布置在物镜工作位置的相同物镜或由相继被带到物镜工作位置的不同物镜聚焦；并且在穿过物镜之后，操作光和/或照明光借助于转向装置以这样的方式转向使得它相对于物镜的光轴成不同于零度的角传播。
Description
技术领域
本发明涉及一种方法，其中用操作光操作样本，并且其中借助于SPIM技术在使用呈照明光片的形式的照明光(特别是用于荧光激发的激发光)的照明下成像样本。
此外本发明涉及一种光学布置，其用于操作样本并且用于借助于SPIM技术在使用呈照明光片的形式的照明光(特别是用于荧光激发的激发光)的照明下成像样本。
背景技术
在其中进行分层照明样本的SPIM技术(单平面照明显微术)允许更快速地感测图像数据并且例如比样本的斑型扫描样本影响更小。SPIM技术的应用的一个已知领域是荧光显微术的领域，样本中的荧光团用激光激发。在SPIM技术中，激发仅仅发生在照明光片(也称为“光条”)中。由此避免由其它平面中的照明光产生的样本的损伤。
在DE 102 57 423 A1中描述了根据SPIM方法操作的光学装置。使用该显微法，用细光条照明样本，同时垂直于照明光条的平面发生观察。照明和检测在这里经由两个独立的光束路径发生，每个光束路径具有独立的光学器件，特别是具有彼此垂直的两个独立物镜。光条由照明物镜并且由放置在它前面的圆柱形光学器件生成。为了图像采集，样本移动通过相对于检测器静止的光条，以便使用平面检测器分层采集荧光和/或散射光。由此获得的层图像数据然后可以组合成对应于样本的三维图像的数据集。该文献未公开样本的操作。
DE 20 201 110 077 U1公开了一种用于在SPIM显微术的背景下照明样本的布置。该布置包括用于生成光束的光源，用于从光束生成光条的装置，以及至少一个物镜，所述至少一个物镜包括具体化为并且旨在将来自样本的检测光直接地或间接地输送到检测器的光学器件。此外该布置包括位于物镜的光学器件后面、用于转向光条的转向装置。
SPIM技术和光学样本操作的组合在原理上是很吸引人的，原因是具有低样本影响的很快的SPIM技术很好地适合于观察特别是较大的、活的有机物的操作的效果。
从DE 10 2007 047 464 A1已知可用附加的操作光源，其操作光经由透镜布置和反射镜布置经由照明物镜耦合到照明光束路径中。替代地，相同文献附加地提出借助于双色镜将操作光耦合到检测光束路径中，并且通过检测物镜将它引导到样本上。
在该类型的一个操作光经由照明光束路径并且经由检测光束路径输送到样本的实施例中，三个分束器和两个光阑必须费力地插入光束路径中。该设置的优点在于可以从两个方向发生操作。在另一方面，这导致复杂的光学配置并且至少在照明侧导致光损失。
科技出版物“Selective plane illumination microscopy techniques indevelopmental biology”，Huisken等人，Development 136，1963-1975(2009)，公开了一种该类型的装置，其中附加地提供其光经由检测物镜聚焦到样本上的光操作激光器。从“Three-dimensional laser microsurgery in light-sheet based microscopy(SPIM)”，Engelbrecht等人，Optica Express 6420，Vol.15，No.10(2007)，获知很相似的布置。Yanik等人的文章，“Technologies for Micromanipulating,Imaging,and Phenotyping SmallInvertebrates and Vertebrates”，Annu.Rev.Biomed.Eng.2011；13:185-217，也公开了类似的装置和方法，其中样本通过毛细管被泵送。
发明内容
所以本发明的目的是描述一种方法，其允许特别通用和灵活的样本操作和样本成像。
该目的由一种方法实现，其特征在于操作光和照明光都由下列聚焦：
a.布置在物镜工作位置的相同物镜，或
b.相继被带到物镜工作位置的不同物镜；
并且在穿过所述物镜之后，操作光和/或照明光借助于转向装置以这样的方式转向使得它相对于所述物镜的光轴成不同于零度的角传播。
本发明的另一目的是描述一种前述类型的光学布置，其使用简单的光学配置允许特别通用和灵活的样本操作和样本成像。
该目的由一种光学布置实现，其特征在于操作光和照明光都由下列聚焦：
a.布置在物镜工作位置的相同物镜，或
b.相继被带到物镜工作位置的不同物镜；
并且转向照明光和/或操作光的转向装置在位于物镜工作位置的所述物镜的下游。
本发明使得能够很灵活地并且以单独地可适应于特定应用的方式操作和观察样本。特别地能够用操作光从不同方向照射样本。例如，也允许用操作光从很不相同的方向同心地和(需要时)周期性地重复照射感兴趣的同一个样本区域；这随后详细地进行解释。本发明也使得能够执行感兴趣的样本区域的相干、同时照明。
也能够特别有利地以类似于在例如用于肿瘤治疗的放射疗法中使用的立体定向辐射的方式用操作光照射感兴趣的样本区域。可以例如通过借助于优选地在所有三个空间方向上可调节的合适移位台移位样本定位样本区域，样本安装在所述移位台上。移位台可以特别地具体化为以机动方式可调节。
本发明还具有的很特别优点是照明光和操作光可以从不同方向照射样本。因此，例如在转向装置相对于物镜的移位中，和/或由于用于操作光和/或照明光的可调节光束偏转装置的使用，在入射到样本上的可能方向和角度方面几乎没有限制。特别地，用户不限于仅仅沿着物镜的光轴或垂直于物镜的光轴用照明光和/或操作光照射样本。
特别地也考虑到这点，本发明具有的很特别优点是可以在很大程度上免除在长的子光束路径之间的费力切换和用于耦入或耦出操作光的大量双色镜，即使根据本发明的布置的通用性实际上大于从现有技术已知的布置。当使用多个长的、不同的光束路径时必然产生的不稳定性和附加成本由此被避免。
实际上在这方面能够有利地在随后的时间改装扫描显微镜，特别是共焦扫描显微镜，以便产生根据本发明的光学布置和/或以便执行根据本发明的方法，而没有大的技术费用。
例如可以借助于光学样本操作执行很精确的、微创的显微操作。例如在波长和/或光功率水平和/或强度方面和/或在一个或多个操作光束的几何形状方面的操作光的性质优选地适合于该特定应用。例如，操作光可以是脉冲的。也能够使用非脉冲操作光。
根据本发明的布置在该背景下优选地包含光源，特别是激光光源，其适合于特定应用或适应于特定应用，特别是在前述的性质方面。在根据本发明的光学布置的背景下，例如，同一个照明装置可以用于生成操作光和照明光。然而也可能存在不同的光源以便生成操作光和照明光。
紫外(UV)光是例如可以用于细胞消融、DNA切割和显微切片的高能量光。然而，405nm的普通波长也可以用于光激活和光转换。可见(VIS)光可以用于荧光染料的漂白实验(FRAP－光漂白之后的荧光恢复)。然而，可见光也可以用于光激活和光转换。使用红外(IR)光，可以通过突然升高温度(例如水温度)、通过在很小体积内用红外光照射以高度受控、很低冲击和局部限制方式引入损伤。由组织直接吸收同样是可能的。IR光也可以与光学镊子结合使用。另外，由于生物结构经由多光子(MP)激发原理与红外操作光相互作用的事实，红外操作光可以用于前面描述的过程，如细胞消融、光漂白、光激活和光转换。
有利地，相比于从现有技术已知的装置特别地也能够根据本发明在必要时从明显多于仅仅两个方向操作样本。可调节光束偏转装置(例如串联连接的两个检流计镜，一个在X方向上偏转并且一个在Y方向上偏转)的使用允许例如使用斑点、线性和自由可选择区域操作照明执行操作。特别地能够以受控方式通过用操作光照射操作任何形状的感兴趣的样本区域(ROI)。
转向装置例如可以包括一个或多个反射镜。反射镜特别地可以是平坦的。然而例如如果照明光和/或操作光沿着反射镜表面连续地移动和/或如果要获得附加聚焦，则反射镜也可以是弯曲的。替代地或附加地，转向装置也可能包括至少一个棱镜或至少一个双色分束器。
在一个可能的实施例中，规定操作光和照明光通过布置在物镜工作位置的相同物镜聚焦到样本上。这样的实施例使得特别地能够用操作光和照明光同时照射样本，并且观察在操作之后快速发生的样本反应。
该类型的实施例具有的特别优点是物镜的相同数值孔径作用于照明光和操作光；并且需要时，操作光可以因此具有与照明光相同的发散。
然而当相同物镜用于操作光和用于照明光时也可以在分离的时间用操作光和用照明光照射样本。
在时间上分离地照射的情况下，特别地能够导致操作光在穿过物镜之后直接入射到样本上，没有转向装置产生的转向，然而一旦照明光已穿过物镜，它以这样的方式用转向装置转向使得它相对于物镜的光轴成不同于零度的角、特别地成大于10度的角、很特别地成直角传播。然而，在这里必须考虑，照明光和操作光的焦点不处于离物镜相同的间距；这例如可以通过将物镜移位一个量而进行补偿，该量等于当在用操作光和用照明光照射之间切换时沿着光轴的间距的差异。
当在用操作光和用照明光照射之间切换时也能够在不同物镜之间切换，具体地通过将相应所需的物镜引入物镜工作位置，以便避免前述的间距差异的问题。在该背景下以这样的方式选择物镜的折射能力使得相对于物镜工作位置的相应焦距对于穿过转向装置的照明光和对于未穿过转向装置的照明光是相同的。
不考虑该实施例，由于其它原因也可以实现物镜的变化，包括以这样的方式使得不是通过不同的折射能力而是例如通过物镜沿着光轴的移位(已经在上面提及)补偿间距差异。
物镜的可移位性或可移动性用电动机或用机械驱动实现。例如在X、Y和/或Z方向上的可移动性可以借助于压电元件或常规驱动技术实现。
如果例如想要例如借助于斑点、线性或自由可选择区域操作照明，在比用于照明光的数值孔径高的数值孔径处执行操作，根据本发明的一个可能实施例，这可以这样实现：在具有较高数值孔径的照明物镜中枢转以便操作，并且枢转回到具有较低数值孔径的初始照明物镜以便观察和用照明光照明。为了允许在正常照明也正在发生的相同焦点区域中操作，必须当物镜变化时执行沿着照明光轴的移位。
高孔径物镜的可使用性具有的特别优点是照明光片和/或照明光束的构象可以特别薄。相对于SPIM成像，由此增加分辨率。
如果例如想要例如借助于斑点、线性或自由可选择区域照明，使用相同物镜(特别是具有高数值孔径的物镜)执行照明和操作，这可以根据本发明的一个可能实施例通过将聚焦操作光和照明光的物镜横向地(即，横向于光轴)移动预定量、由此保证转向装置仍然被照射而实现。其原因在于具有高数值孔径的物镜典型地也是放大率更高的物镜，即具有更小的扫描场。然而，如果仍然想要在转向装置之间布置转向装置的大开口并且因此更大的物体，照明物镜必须横向地偏移特定量使得转向装置仍然由扫描光束照射。如果照明物镜的放大率增加2的因数，则照明物镜的横向位移必须产生如下计算的量：[(较低放大率的扫描场)减去(较高放大率的扫描场)]除以2。如果想要不经由转向装置而是直接地执行操作，并且在也经由转向装置照明的同时在焦平面中操作，则物镜必须沿着光轴移动特定量；该量典型地计算为转向装置的开口的一半(以mm计)。然而如果希望操作样本的其它区域，也可以使用其它值。
例如可以使用圆柱形光学器件例如从具有圆形横截面的(例如，激光的)光束生成光片。为了本发明的目的“圆柱形光学器件”被理解为任何像散光学器件和/或在垂直于光的传播方向的一个方向上比在垂直于光的传播方向的另一方向上更强地聚焦的任何光学器件。
然而在很特别有利的实施例中，提供照明光片是由在光片平面中来回连续地移动的照明光束组成的准光片。为了该目的光学装置例如可以包括在偏转角方面可调节的光束偏转装置，使用所述光束偏转装置照明光束优选地在照明平面中快速地可移动使得照明光片实际上存在于照明光平面中；和/或用被提供用于检测来自样本的光的检测器和用显微镜的下游评价装置，所述照明不可区分于例如用圆柱形光学器件生成的连续照明光片；和/或采集的图像数据不能或基本上不能与当用连续照明光片照明时将生成的数据相区分。
该类型的光束偏转装置例如可以包括至少一个检流计镜。特别地，例如，扫描显微镜(特别是共焦扫描显微镜)的光束偏转装置(所述装置在任何情况下存在)也可以被使用，特别地如果通过扫描显微镜的改装产生光学布置，或者如果借助于扫描显微镜执行根据本发明的方法。
特别地当光片的形状需可调节时，特别有利的是光束偏转装置包括优选地在尤其为相互垂直的不同偏转平面中偏转的多个检流计镜，例如X检流计镜和Y检流计镜，或其它可调节偏转装置。特别地使用利用转向装置生成平坦准光片的例子，多个偏转装置的优点变得明显，所述转向装置包括一个或多个弯曲转向镜：如果仅仅通过在一个平面中偏转照明光束照明弯曲转向镜，则然后(由于弯曲转向镜上的照明光束的轨迹必然是弯曲的)将导致不平坦而是弯曲的准光片。然而通过使用在不同偏转平面中偏转的两个检流计镜，能够以这样的方式牵引转向镜上的照明光束的轨迹使得得到的是平坦准光片。
相反地(即使在使用平坦转向镜的背景下)需要时也能够通过检流计镜的适当控制生成基本上任何配置的准光片。
转向照明光片在其中传播的光片平面优选地横向对准照明物镜和/或检测物镜的光轴。
如先前所述，可以有利地规定，特别地使用在偏转角方面可调节的光束偏转装置将照明光和/或操作光通过物镜并且可选地经由另外的光学元件引导到转向装置上。
特别地，可以有利地规定，同时或顺序地使用具有多个转向器件(特别是转向镜)的转向装置转向照明光和/或操作光，所述装置在位于物镜工作位置的物镜的下游。
转向器件可以特别地不同地布置和/或不同地对准和/或属于不同类型。例如可以提供特别地借助于在偏转角方面可调节的光束偏转装置，将操作光和/或照明光交替地引导到不同定位和/或定向的转向器件上，其中每个转向器件将操作光和/或照明光转向到样本上，特别是转向到相同样本区域上。由此能够用操作光从不同方向照射同一个样本区域。
这使得特别地能够同心地和/或立体定向地照射到同一个样本区域上。由此例如可以用操作光强烈地照射感兴趣的样本区域，同时避开周围区域，特别是因为入射操作光的影响分布在相同区域的外部。由此特别地能够例如使构成操作光束的操作光在锥形表面上移动，特别地使用在偏转角方面可调节的光束偏转装置，并且经由在物镜的下游的转向装置，所述转向装置特别地包括多个转向器件。
对于特定应用，例如如果将不同地操作不同样本区域，则可以在操作器件和/或在光束偏转期间可以修改操作光的功率水平。
转向装置也可能包括多个转向器件；或者以这样的方式成形(特别是弯曲)使得照明光和/或操作光可以从不同方向引导到样本上、特别是引导到感兴趣的样本区域上。
在一个可能的实施例中来自样本的检测光穿过聚焦照明光的物镜和/或由物镜准直。
然而优选地，来自样本的检测光穿过不同于聚焦照明光和/或操作光的物镜的检测物镜和/或由检测物镜准直。
特别地，可以有利地规定，聚焦照明光和/或操作光的物镜的光轴和检测物镜的光轴彼此平行地和/或以共线方式对准。该类型的实施例具有的特别优点是光学装置可以是特别紧凑和稳健的配置，并且样本照明区域特别容易接近，因此允许将样本快速和精确地连续引入样本照明区域中。
特别地，可以有利地规定，照明光片首先在竖直方向上前进通过照明物镜并且然后使用转向装置转向到水平方向以便照明样本的一个层。来自照明层的光(特别是荧光)优选地在竖直方向上前进通过检测物镜。该类型的配置使得能够使用标准直立或倒置显微镜台以产生根据本发明的光学装置。
在很特别有利的实施例中，规定聚焦照明光和/或操作光的物镜和例如可以包括一个或多个转向镜的转向装置相对于彼此可移动地布置。替代地或附加地，也可以提供转向装置可移动地紧固在聚焦照明光和/或操作光的物镜上，和/或转向装置可移动地紧固在检测物镜上。这些实施例具有的优点是容易调节照明光和/或操作光是直接地还是经由转向装置照射样本。另外，通过转向装置和聚焦照明光和/或操作光的物镜之间的相对位置的调节，能够修改照明光和/或操作光入射到样本上的方向。
替代地或附加地，偏转装置也能够围绕检测物镜和/或围绕检测物镜的光轴可旋转地布置，特别是紧固在检测物镜上。这样的实施例使得例如容易地能够调节或修改照明光和/或操作光入射到样本上的方向。
可以有利地规定，使用照明光和/或操作光引起双光子激发。根据本发明的光学布置可以在这方面有利地包括用于生成照明光和/或操作光的脉冲激光器，特别是皮秒或飞秒激光器。
如先前所述，可以通过改装扫描显微镜(特别是共焦扫描显微镜)产生根据本发明的光学布置。根据本发明的光学布置也能够优选地以这样的方式包含扫描显微镜(特别是共焦扫描显微镜)使得独立于SPIM图像的生成，所述布置也可以用作扫描显微镜。
如先前所述，在特别简单设计方式中，转向装置可以布置在检测物镜上，所述检测物镜布置在检测装置的检测侧。这巧妙地利用呈检测物镜的形式的现有部件以便在其上牢固地定位生成光片所必需的转向装置。特别为了高灵活性和简单适应在利用光学布置的背景下的不同要求，转向装置可以布置在检测物镜上，尤其是以非破坏性可移动方式。换句话说，转向装置可以布置在检测物镜上以用于使用照明光片的显微应用，并且可以从检测物镜去除以用于不同期望照明。另外，不同尺寸的转向装置可以交替地使用，并且可以在损坏的情况下容易地更换。
转向装置例如可以包括反射镜布置，其优选地具有多个反射元件和/或具有至少一个棱镜和/或至少一个双色分束器。同样以简单方式，转向装置可以布置在检测物镜的前侧。
反射镜布置可以以简单方式包括两个平坦的和相互相对定位的反射元件以用于从两侧照明和/或操作样本。为了特别可靠地避免在样本区域中的阴影，反射镜布置可以包括可以沿着可预定长度的圆弧布置的多个平坦的或弯曲的反射元件。单独的反射元件可以以简单反射镜附件实现，使得在制造反射镜附件时预先确定反射元件相对于彼此的相对定位。
同样有利地，可以以这样的方式选择弯曲反射元件的曲率半径使得从反射元件反射的所有光束或来自反射元件的可预定数量的光束在一个焦点处会合。最高光束负载因此位于该焦点处；它可以设在样本的中心处。为了在单焦点处的该类型的聚焦，曲率半径等于从样本的中心延伸到沿着圆弧布置的反射元件的圆弧的半径。为了使用光片照明，曲率半径应当大于两个这样的从样本的中心到圆弧的半径。
附图说明
本发明的主题在附图中示意性地描绘并且在下面参考附图进行描述，相同功能的元件用相同的附图标记标示。在附图中：
图1是根据本发明的光学布置的示例性实施例的示意性侧视图；
图2是根据本发明的光学布置的示例性实施例的示意性侧视图，具有与图1中的照明物镜不同定位的照明物镜；
图3是根据本发明的另一光学布置的示例性实施例的示意性侧视图，其中照明物镜横向地偏移；
图4示意性地描绘可能的转向装置；
图5是描绘转向装置的另一可能形式的示意图；
图6是描绘可能的转向装置的示意图，所述转向装置具有沿着圆弧布置的多个弯曲反射元件；以及
图7是描绘具有多个弯曲和反射元件的另一可能转向装置的示意图。
具体实施方式
图1是根据本发明的光学布置的示例性实施例的示意性侧视图，所述光学布置用于操作样本1并且用于使用SPIM技术在用呈照明光片5的形式的照明光(特别是用于荧光激发的激发光)照明下成像样本。照明光由光源(未在该图中描绘)生成并且通过分束器10行进到可调节光束偏转装置8并且然后经由扫描透镜11和镜筒透镜12穿过布置在物镜工作位置的、聚焦照明光的物镜9的入射光瞳15。在穿过物镜9之后，照明光借助于包括转向镜7的转向装置4以这样的方式转向使得它相对于物镜9的光轴成不同于零度的角传播。
光束偏转装置8可以特别地具体化为在两个不同方向(特别是X方向和Y方向)上相互独立地偏转入射光。例如，光束偏转装置8可以包含两个检流计镜，其旋转轴布置在相互垂直的平面中。替代地，光束偏转装置8也可以例如包括万向安装镜。
在图中仅仅很示意性描绘的照明光片5优选地是准光片，其通过从光源(未描绘)发射的呈照明光束的形式的照明光借助于光束偏转装置8快速地来回移动而生成。由此特别地可以获得均匀强度分布。然而也能够借助于像散光学器件产生照明光片5。
来自用照明光片5照明的样本的层的检测光使用检测装置3进行检测。检测光借助于检测物镜6准直，并且然后借助于光学器件13成像到检测器14上，所述检测器例如可以具体化为平面检测器，特别是CCD照相机或基于CMOS的传感器。检测器生成电信号，所述电信号可以用于(可选地在电子处理之后)将样本呈现在监视器上。通过沿着物镜的光轴移动样本能够连续地获得大量可以组合成三维描绘的二维图像。
以该方式，例如，首先可以获得样本的或至少一个样本层的或特别感兴趣的样本区域的第一图像，以便然后执行(如下所述)操作，该操作的效果之后可以被再次可见以便生成另一图像。
光学装置包括发射操作光的另一光源2。由光源2生成的操作光由分束器10转向到光束偏转装置8并且然后经由扫描透镜11和镜筒透镜12行进到布置在物镜工作位置的物镜9。物镜9也聚焦操作光。然而，光束偏转装置8不象先前对照明光那样将操作光引导到转向镜7中的一个上，而是以这样的方式引导使得在穿过物镜9之后它直接照射样本1。
在这里必须考虑如下事实：照明光和操作光的焦点具有在样本内的不同位置，使得先前用照明光片的焦点照明的区域不能使用操作光的焦点进行操作。
这通过沿着光轴移位物镜9进行矫正，如图中的双箭头所示。移位行程优选地与焦点相对于物镜的间距的初始差异一样大。
图2显示随着样本到物镜的间距的增加执行操作所必需的位置。然而如上面详细地所述，也可以以不同方式实现补偿，例如通过使用附加光学器件(特别特殊地在操作光唯一在其中传播的光束路径的部分中，例如在另一光源2和分束器10之间)和/或通过使用不同物镜进行照明和操作。
一旦已发生操作，物镜可以再次往回移位以便再次以上述的方式生成样本(特别是被操作样本区域)的图像。
转向装置4布置在检测物镜6上。转向装置4包括两个转向镜7以允许从两侧可选择地照明样本。这特别地允许从一侧照明到结构上，该结构例如由于被样本自身的一部分遮蔽而不能从另一侧照射在上面，或仅仅不充分地照射在上面。
另外也能够借助于位于物镜工作位置的物镜9准直来自样本的另一检测光16，并且将它输送到检测器(未在图中描绘)。该背景下的分束器10以这样的方式具体化使得检测光16可以经过。
图3是根据本发明的另一光学布置的示例性实施例的示意性侧视图，其允许也使用具有高数值孔径的物镜9。具有更高数值孔径的物镜典型地具有高分辨率能力的优点，但是具有更小的视场(扫描场)。在图中所示的布置的情况下，因此规定，横向地(由双箭头和物镜9的两个描绘指示)移动物镜9使得即使当使用具有高数值孔径的物镜9时也照射转向装置。除了横向移位之外，优选地附加地执行沿着物镜9的光轴的移位以便保持照明和检测几何形状。
代替用于独立地生成操作光和照明光的两个光源，可以替代地提供由相同光源生成操作光和照明光。这例如可以是光源2。取决于特定应用，光源2可以具体化为生成UV和/或IR和/或可见光。
图4至7在沿着物镜9的光轴观察的平面图中显示具有不同实施方式和不同布置的转向镜7和操作光和/或照明光的可能光束路径的转向装置4的不同示例性实施例。
图4是显示具有彼此相对布置的两个转向镜7的一个可能转向装置4的示意图。转向镜7偏转具体化为照明光片的照明光以便照明样本或样本的至少一部分位于其中的视场17。视场17优选地对应于成像到检测器(特别是二维检测器)上的区域。替代地或附加地，当然也能够借助于转向镜7将操作光引导到样本上。
图5是描绘具有均沿着圆弧布置在相对定位侧的多个转向镜7的转向装置的另一可能形式的示意图。也类似于图6和7中所示的转向装置，该类型的转向装置4很特别地适合于从不同方向同心地和/或立体定向地照射到样本区域上。
图6是描绘具有沿着圆弧布置的多个弯曲转向镜7的一个可能转向装置4的示意图。转向镜7的曲率半径优选地等于圆弧的半径r的两倍以上。
图7是显示具有彼此相对并且沿着可预定长度的圆弧布置的弯曲转向镜7的另一有利转向装置4的示意图。转向镜7的曲率半径对应于圆弧的半径，使得由反射元件7反射的光的聚焦存在于由圆弧形成的圆的中心处。所有反射光束在中心处会合，使得最大负载可以通过立体定向照明出现在选定样本区域中。例如通过借助于样本安装在其上的、优选地在所有三个空间方向上合适地可调节的移位台移位样本，样本区域可以定位在中心。移位台可以特别地配置成以机动方式可调节。
可以在图5至7中所示的转向装置的基础上保证光学布置的通用性。与单独的转向元件的具体布置和配置无关，每个转向装置可以具体化为预包装附件，特别是用于紧固到物镜和/或检测物镜的预包装附件。具有反射镜元件布置的附件然后仅仅需要更换以便在不同应用之间变化。
为了避免重复，关于根据本发明的光学布置的另外有利实施例，读者参见描述的概括部分和附带的权利要求。
最后，应当明确地注意上述的示例性实施例仅仅用于权利要求中的教导的论述，而不是将它限制到示例性实施例。
Claims (38)
1.一种用于操作和成像样本的方法，其中用操作光操作样本，并且其中借助于单平面照明显微技术在用呈照明光片的形式的照明光照明下成像样本，
其中操作光和照明光都由下列聚焦：
a.布置在物镜工作位置的相同物镜，或
b.相继被带到物镜工作位置的不同物镜；
并且其中在穿过所述物镜之后，操作光和照明光中的至少一个借助于转向装置以这样的方式转向使得它相对于所述物镜的光轴成不同于零度的角传播。
2.根据权利要求1所述的方法，其中操作光和照明光从不同方向引导到样本上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
a.所述照明光片是由连续地来回移动的照明光束组成的准光片，或
b.所述照明光片是由使用在偏转角方面可调节的光束偏转装置连续地来回移动的照明光束组成的准光片，或
c.所述照明光片使用圆柱形光学器件生成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中用操作光和照明光同时照明样本。
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
a.首先用操作光并且然后用照明光在时间上连续地照明样本；或
b.首先用照明光并且然后用操作光在时间上连续地照明样本；或
c.用照明光和操作光交替地照明样本。
6.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中一旦照明光已穿过所述物镜，它以这样的方式用所述转向装置转向使得它相对于所述物镜的光轴成不同于零度的角传播，而操作光在穿过所述物镜之后照射样本而不转向。
7.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中照明光和操作光中的至少一个使用在偏转角方面可调节的光束偏转装置引导到所述转向装置上。
8.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中：
a.所述转向装置包括多个转向器件；和/或
b.所述转向装置包括多个不同的或不同布置的转向器件。
9.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中：
a.用操作光从多个不同方向照射样本或待操作的同一个样本区域；或
b.用操作光同心地或立体定向地照射待操作的样本区域；或
c.使用光束偏转装置并且经由在所述物镜的下游的至少一个转向装置在锥形表面上移动构成操作光束的操作光；或
d.在操作期间或在光束偏转期间修改操作光的功率水平。
10.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中：
a.来自样本的检测光穿过聚焦照明光的物镜或用聚焦照明光的物镜准直；或
b.来自样本的检测光穿过检测物镜或用检测物镜准直，所述检测物镜不同于聚焦照明光和操作光中的至少一个的物镜。
11.根据权利要求10所述的方法，其中聚焦照明光和操作光中的至少一个的所述物镜的光轴和所述检测物镜的光轴彼此平行地或以共线方式对准。
12.根据权利要求5所述的方法，其中：
a.所述转向装置和聚焦照明光和操作光中的至少一个的所述物镜相对于彼此可移动地布置；或
b.所述转向装置可移动地紧固在聚焦照明光和操作光中的至少一个的所述物镜上；或
c.所述转向装置可移动地紧固在所述检测物镜上；或
d.所述转向装置可旋转地围绕所述检测物镜或围绕所述检测物镜的光轴布置。
13.根据权利要求1至5之一所述的方法，其中使用操作光和照明光中的至少一个引起双光子激发。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述照明光是用于荧光激发的激发光。
15.根据权利要求6所述的方法，其中所述角大于10度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述角是直角。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个转向器件是多个转向镜。
18.根据权利要求8所述的方法，其中所述不同布置的转向器件是不同对准的。
19.一种用于操作和成像样本的光学布置，其中借助于单平面照明显微技术在用呈照明光片的形式的照明光照明下成像样本，
其中操作光和照明光都由下列聚焦：
a.布置在物镜工作位置的相同物镜，或
b.相继被带到物镜工作位置的不同物镜；
并且其中转向照明光和操作光中的至少一个的至少一个转向装置在位于物镜工作位置的所述物镜的下游。
20.根据权利要求19所述的光学布置，其中照明光和操作光从不同方向照射样本。
21.根据权利要求19所述的光学布置，其中：
a.所述照明光片是由连续地来回移动的照明光束组成的准光片，或
b.所述照明光片是由使用在偏转角方面可调节的光束偏转装置连续地来回移动的照明光束组成的准光片，或
c.存在生成所述照明光片的圆柱形光学器件。
22.根据权利要求19所述的光学布置，其中可以用操作光和照明光同时照明样本。
23.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中：
a.首先用操作光并且然后用照明光在时间上连续地照明样本；或
b.首先用照明光并且然后用操作光在时间上连续地照明样本；或
c.用照明光和操作光交替地照明样本。
24.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中一旦照明光已穿过所述物镜，它以这样的方式用所述转向装置转向使得它相对于所述物镜的光轴成不同于零度的角传播，而操作光在穿过所述物镜之后照射样本而不转向。
25.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中照明光和操作光中的至少一个使用在偏转角方面可调节的光束偏转装置引导到所述转向装置上。
26.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中所述转向装置包括多个不同的或不同布置的转向器件，以便转向在位于物镜工作位置的所述物镜中聚焦的照明光或在位于物镜工作位置的所述物镜中聚焦的操作光。
27.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中：
a.用操作光从多个不同方向照射样本或待操作的同一个样本区域；或
b.用操作光同心地和/或立体定向地照射待操作的样本区域；或
c.使用光束偏转装置并且经由在所述物镜的下游的至少一个转向装置在锥形表面上移动构成操作光束的操作光；或
d.功率水平修改装置在光束偏转期间修改操作光的功率水平。
28.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中：
a.来自样本的检测光穿过聚焦照明光的物镜和/或用聚焦照明光的物镜准直；或
b.来自样本的检测光穿过检测物镜和/或用检测物镜准直，所述检测物镜不同于聚焦照明光和操作光中的至少一个的物镜。
29.根据权利要求28所述的光学布置，其中聚焦照明光和操作光中的至少一个的所述物镜的光轴和所述检测物镜的光轴彼此平行地或以共线方式对准。
30.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中：
a.所述转向装置和聚焦照明光和操作光中的至少一个的所述物镜相对于彼此可移动地布置；和/或
b.所述转向装置可移动地紧固在聚焦照明光和/或操作光的所述物镜上；或
c.所述转向装置可移动地紧固在所述检测物镜上；或
d.所述转向装置可旋转地围绕所述检测物镜或围绕所述检测物镜的光轴布置。
31.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中：
a.使用操作光和照明光中的至少一个引起双光子激发；和/或
b.存在脉冲激光器，以便生成照明光和操作光中的至少一个。
32.根据权利要求19至22之一所述的光学布置，其中通过改装扫描显微镜或共焦扫描显微镜产生根据本发明的光学布置所述光学装置；或所述光学布置包含扫描显微镜或共焦扫描显微镜。
33.根据权利要求19所述的光学布置，其中所述照明光是用于荧光激发的激发光。
34.根据权利要求24所述的光学布置，其中所述角大于10度。
35.根据权利要求34所述的光学布置，其中所述角是直角。
36.根据权利要求26所述的光学布置，其中所述转向器件是转向镜。
37.根据权利要求26所述的光学布置，其中所述不同布置的转向器件是不同对准的。
38.根据权利要求31所述的光学布置，其中所述脉冲激光器是飞秒或皮秒激光器。
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