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Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung zur Photomanipulation einer Probe, umfassend eine Probenhalterung zur Aufnahme der Probe, eine Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine Beleuchtungslichtquelle und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt, eine Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht, das von der Probe abgestrahlt wird, eine Abbildungsoptik, die die Probe über ein Abbildungsobjektiv in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblatts in einen von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht, schneidet, eine Steuereinheit, sowie Mittel zur Photomanipulation der Probe.
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Die erfindungsgemäße optische Anordnung ist bezüglich der Beobachtung der Probe insbesondere im Zusammenhang mit der Single-Plane-Illumination-Mikroskopie (SPIM), auch als Selective-Plane-Illumination-Mikroskopie bezeichnet, anwendbar. Während mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die Probe in mehreren unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für Punkt abgetastet wird und daraus dreidimensionale Bildinformationen der Probe gewonnen werden, so beruht die SPIM-Technologie auf der Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die dreidimensionale bildliche Darstellung von Proben auf der Grundlage von optischen Schnitten durch verschiedene Ebenen der Probe.
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Dabei bestehen die Vorteile der SPIM-Technologie u.a. in der größeren Geschwindigkeit, mit der die Bilderfassung erfolgt, einem geringeren Ausbleichen von biologischen Proben, sowie einer erweiterten Eindringtiefe des Fokus in die Probe.
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Prinzipiell werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten oder in die Probe eingebracht sind, mit Laserlicht angeregt, das zu einem sogenannten Lichtblatt geformt ist, bzw. auf eine Weise über die Probe geführt wird, dass sich effektiv, d.h. über den Zeitraum der Beobachtung die Form eines Lichtblattes ergibt. Dabei wird mit jeweils einem Lichtblatt eine Ebene in der Tiefe der Probe beleuchtet, mittels dieser Beleuchtung wird ein Bild der Probe in dieser Ebene gewonnen. Wesentlich ist, dass Elemente in der Lichtblattebene auf die Detektorebene abgebildet werden, bzw. dass Lichtblatt- und Detektorebene zueinander konjugiert sind. In herkömmlichen Mikroskopaufbauten, in denen die Detektorebene senkrecht zur optischen Achse des Detektierungsstrahlengangs steht, steht die Richtung, in der Licht detektiert wird, senkrecht oder zumindest nahezu senkrecht auf der Ebene, in der beleuchtet wird.
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Die SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in Stelzer et al., Optics Letter 31,1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004), in der
DE 102 57 423 A1 und in der
WO 2004 / 053 558 A1 .
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Auch aus K. Greger et al.: Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. In: Review of Scientific Instruments 78, 023705 (2007), S. 1-7 ist ein SPIM-Mikroskop bekannt. Das offenbarte SPIM-Mikroskop umfasst eine bewegliche Probenhalterung, eine Beleuchtungseinheit mit einem Laser, der zum Aussenden eines kollimierten Laserstrahls ausgelegt ist, eine Zylinderlinse, die den kollimierten Strahl einem Lichtblatt formen kann, eine Detektierungseinrichtung, ein Abbildungsobjektiv, eine Steuereinheit sowie eine Hilfseinheit. Die Hilfseinheit kann Komponenten zur Probenmanipulation wie beispielsweise ein Laserschneidwerkzeug oder einen Scanner zum strukturierten holografischen Bleichen aufweisen.
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Neben der Beobachtung von Proben kommt auch der Manipulation biologischer, lebender oder nicht lebender Materie sowie anorganischer Materie in der Mikroskopie ein großer Stellenwert zu. Manche Proben können beispielsweise photoaktiviert, photodeaktiviert oder erwärmt werden. Die Manipulation umfasst auch die Bearbeitung von Proben, d.h. beispielsweise die Polymerisation von Proben oder beispielsweise das Trennen von Probenbereichen vom Rest der Probe mittels Laser-Skalpellen. Manipulationsmethoden, die auf der Wechselwirkung der zu manipulierenden Probe mit Licht beruhen, wie beispielsweise Laser-Ablation, Bleichen, Photoaktivierung, sind besonderes dann geeignet, wenn mechanischer Kontakt mit der Probe vermieden werden soll. Bei entsprechend ausgestalteten Optiken können Bereiche sehr präzise mit mikroskopischer Auflösung manipuliert werden.
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Für Proben, die im Wesentlichen eine flache Form haben, wie beispielsweise adhärente Zellen oder Grenzflächen, kann die Manipulation auch mit Optiken, die axial keine hohe Auflösung bieten, sehr präzise ausgeführt werden.
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Für räumlich ausgedehnte, dreidimensionale Proben ist eine räumlich präzise Manipulation jedoch sehr schwierig und nur über technisch aufwendige Aufbauten zu lösen, die häufig auch auf nichtlinearen Wechselwirkungen des Manipulationslichtstrahls mit der Probe basieren.
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Die Standardtechniken der Photomanipulation - um eine einige Beispiele zu nennen: fluorescence loss in photobleaching (FLIP), Photoaktivierung (PA GFP) reversible Photoaktivierung (Dronpa), Photokonversion (Kaede), fluorescence localisation after photobleaching (FLAP), Mikrodissektion, Uncaging - sind teilweise schon seit Jahrzehnten in der Mikroskopie bekannt und dort etabliert. Meist wird ein Laserstrahl mit entsprechender Leistung und Wellenlänge über ein Beobachtungsobjektiv fokussiert und auf die Probe gelenkt. Der Laserstrahl kann mit entsprechender Leistungsmodulierung auch zur Anregung für Anwendungen in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden. Auch in der Augenheilkunde werden Manipulationstechniken eingesetzt, beispielsweise die LASEC-Technik.
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Vorrichtungen, die in dreidimensionalen Proben eine gezielte Manipulation durchführen können und zugleich eine räumliche Bilddarstellung der Probe erlauben, stehen jedoch nur eingeschränkt zur Verfügung. Meist werden hierfür konfokale Laser-Scanning-Mikroskope verwendet. Die Manipulation ist allerdings anregungsseitig nicht konfokal, auch wenn dies für die Abbildung zutrifft. Somit wird ein deutlich größerer Probenbereich ausgeleuchtet, als eigentlich notwendig. Abhilfe bieten hier nur Scanning-Mikroskope, die nicht-lineare Wechselwirkungen auszunutzen, wie beispielsweise die Zwei-Photonen-Anregung. Bei solchen Mikroskopen wird auch anregungsseitig ein konfokaler Manipulationsbereich ausgebildet, der in der Probe mit einiger Genauigkeit positioniert werden kann. Solche Lösungen sind jedoch technisch sehr aufwendig, sie erfordern beispielsweise den Einsatz von Kurzpulslasern und sind bezüglich der Wellenlängenauswahl limitiert.
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Die Manipulation von Proben mit Hilfe von Mikroskopen ist beispielsweise in der
DE 102 33 549 A1 beschrieben. Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Anordnung zu entwickeln, mit der auf einfache Weise die Manipulation in beschränkten Probenbereichen im Wesentlichen in der Fokusebene des Mikroskops durchgeführt werden kann. Insbesondere sollte eine konfokale Probenmanipulation auch ohne Verwendung von Mehrphotoneneffekten möglich sein. Vorteilhaft sollte die Anordnung auch in der Lage sein, eine räumliche, isotrope Abbildung der Probe vor, nach oder während der Manipulation zu ermöglichen.
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Diese Aufgabe wird bei einer optischen Anordnung der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass die Mittel zur Photomanipulation eine erste Manipulationsoptik umfassen, mittels der Licht einer ersten Manipulationslichtquelle in den Beleuchtungsstrahlengang zur Formung eines im wesentlichen ebenen Manipulationslichtblattes eingekoppelt wird. Die erste Manipulationsoptik weist ein erstes Einkoppelelement auf, mit welchem Licht der ersten Manipulationslichtquelle sowohl in den Beleuchtungsstrahlengang als auch in den Abbildungsstrahlengang einkoppelbar ist. Die Beleuchtungseinrichtung weist ein zweites Einkoppelelement auf, mit welchem alternierend oder gleichzeitig Licht der Beleuchtungslichtquelle und Licht der ersten Manipulationslichtquelle in den Beleuchtungsstrahlengang zur Formung eines im Wesentlichen ebenen Lichtblatts einkoppelbar ist.
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Zur Photomanipulation wird die Probe also nicht in der üblichen Weise mit zur SPIM-Untersuchung geeignetem Licht, welches zu einem Lichtblatt geformt ist, beleuchtet, sondern mit Licht einer speziellen Manipulationslichtquelle. Das Licht dieser Manipulationslichtquelle wird jedoch in den gleichen Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt und somit zu einem Lichtblatt geformt, wie es auch zur Beobachtung im SPIM-Verfahren verwendet wird. Dabei kann das Licht auch durch das Führen von Laserlicht über die Probe effektiv, d.h. über den Zeitraum der Manipulation, zu einem Lichtblatt geformt werden. Die Einkopplung des Lichts wird durch eine Steuereinheit gesteuert, die entsprechende Einkoppelelemente, wie Blenden, halbdurchlässige Spiegel, räumliche Lichtmodulatoren, beispielsweise galvanometrische Spiegel steuern. Bei der Manipulationslichtquelle kann es sich um einen Laser handeln, der Licht einer anderen Wellenlänge oder eines anderen Wellenlängenbereichs aussendet, als die eigentliche Beleuchtungslichtquelle. Je nach Art des Experiments kann aber auch die Beleuchtungslichtquelle selbst als Manipulationslichtquelle verwendet werden, in diesem Fall kann auf die Manipulationsoptik und die Einkoppelelemente verzichtet werden. Auch die Zusammenfassung mehrerer Laser in einem Lichtquellenmodul ist denkbar, wobei dann je nach gewähltem Verfahren Beleuchtung oder Manipulation, eine oder mehrere der Lichtquellen ausgewählt und in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt werden.
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Neben der Verwendung von ausgewählten Manipulationslichtquellen kann die erste Manipulationsoptik darüber hinaus auch Mittel zur Strukturierung des Lichtblatts umfassen. Das Lichtblatt selbst hat eine im Wesentlichen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs in den Koordinaten X und Y ausgedehnte, an das zu untersuchende Probenfeld angepasste Länge und Breite und eine sich in Richtung der optischen Achse des Abbildungsobjektivs erstreckende Dicke, die im Bereich von wenigen Mikrometern liegt. Dieses Lichtblatt lässt sich räumlich beispielsweise mit Hilfe einer Schlitzblende strukturieren, wobei die Schlitzblende einen oder mehrere Schlitze zur räumlichen Strukturierung umfasst. Diese Schlitzblende wird in einer zur Objektebene des Detektierungsobjektivs konjugierten Ebene im Beleuchtungsstrahlengang eingebracht, das Lichtblatt ist dann in der Bildebene gitterförmig durchmoduliert. Befindet sich beispielsweise eine fluoreszierende Probe im Bereich des Lichtblattes, so ist die Fluoreszenz entsprechend über das Bildfeld durchmoduliert. Anstelle einer Schlitzblende kann auch ein Gitter verwendet werden.
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Die Mittel zur Strukturierung des Lichtblattes umfassen bevorzugt auch Mittel zur zeitlichen Modulation desselben. Beispielsweise kann die Beleuchtungsintensität zeitlich moduliert werden. Auch kann die Polarisation des Lichts beeinflusst werden.
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Wird das Lichtblatt effektiv durch die Führung von Laserlicht über die Probe während des Beobachtungszeitraums geformt, so lassen sich in ähnlicher Weise Mittel zur zeitlichen Modulation des Beleuchtungslichts auch dazu einsetzen, eine räumliche Strukturierung zu erzielen.
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In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung weisen die Mittel zur Strukturierung alternativ oder in Ergänzung auch Mittel zur Erzeugung mehrerer, einander überlagerter Lichtblätter auf.
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Die Strukturierung der Lichtblätter durch Gitter, Blenden oder ähnliches ermöglicht es beispielsweise, beschränkt auf die hellen Bereiche Fotobleichprozesse auszulösen, und anschließend FRAP-Prozesse zu beobachten, da in den dunklen Bereichen keine Bleichprozesse ausgelöst wurden.
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Der Vorteil bei der Verwendung der oben beschriebenen Anordnung liegt darin, dass Manipulationen auf die Fokusebene beschränkt bleiben, außerhalb der Fokusebene wird die Probe nicht beeinträchtigt. Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Anordnung besteht darin, dass die Mittel zur Photomanipulation einfach in schon bestehende Aufbauten für SPIM-Analysen integriert werden können, beispielsweise in einem modularen Aufbau.
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In der Fokusebene jedoch wird die Probe über die Ausdehnung eines ganzen Streifens oder einer Linie manipuliert, die Beschränkung auf ein kleineres Gebiet ist nicht möglich. Das zu manipulierende oder manipulierte Gebiet in der Probe lässt sich allerdings weiter einschränken, wenn die Mittel zur Photomanipulation eine zweite Manipulationsoptik umfassen, mittels der Licht einer zweiten Manipulationslichtquelle in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt und über das Abbildungsobjektiv auf die Probe gelenkt wird.
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In dieser Ausgestaltung der Erfindung wird die Probe also nicht nur mit dem Manipulationslichtblatt, sondern zusätzlich über das Abbildungsobjektiv aus einer Richtung im Wesentlichen senkrecht zur Ebene des Lichtblatts beleuchtet.
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Neben der ersten Manipulationslichtquelle kann auch die zweite Manipulationslichtquelle als Laserlichtquelle ausgestaltet sein, die mindestens einen Laser umfasst. Auch hier lassen sich selbstverständlich wieder mehrere Laser in einem Modul vereinen, so dass wahlweise zwischen einem oder mehreren Lasern ausgewählt werden kann. Erste und zweite Manipulationslichtquelle strahlen dabei bevorzugt Licht unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche aus, sie können aber auch beide Licht der gleichen Wellenlänge bzw. des gleichen Wellenlängenbereichs, je nach geforderter Applikation ausstrahlen.
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Insbesondere kann die zweite Manipulationsoptik als Laser-Scanning-Mikroskop ausgestaltet sein. Auch solche Mikroskopeinheiten gibt es modular, beispielsweise das LSM-DUO-Scan der Firma Carl Zeiss. Darüber hinaus ist es möglich, mit einer einzigen Manipulationslichtquelle beide Manipulationsoptiken zu speisen, indem der Strahl der Lichtquelle entsprechend aufgeteilt wird. Erste und zweite Manipulationslichtquelle sind in diesem Fall identisch. Im günstigsten Fall kann daher die Beleuchtungsquelle sowohl zur Beleuchtung als auch zur Manipulation über einen der beiden oder beide Manipulationsstrahlengänge dienen.
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Bei der Verwendung von zwei Manipulationsoptiken, wie eben beschrieben, deren Strahlengänge in der Probe im Wesentlichen senkrecht aufeinandertreffen, ist es daher ohne großen Aufwand bezüglich Umbau und Kosten möglich, die Manipulation auf eine kleines Gebiet der Probe zu beschränken, nämlich auf das Gebiet, in dem sich die Lichtstrahlen der Manipulationsoptiken kreuzen. Auf diese Weise wird eine konfokale Probenmanipulation möglich, ohne dass man jedoch dabei aufwendige Anordnungen zur Ausnutzung von Mehrphotoneneffekten benötigt. Bei der Verwendung von beiden Manipulationslichtstrahlen ist jedoch ohne weiteres auch die Ausnutzung von Mehrphotoneneffekten bei der Untersuchung möglich.
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Ein wesentlicher Vorteil der SPIM-Technologie ist die Möglichkeit, räumliche Bilder der Probe zu erzeugen, auch in der vorliegenden Anordnung ist daher die Probe und/oder die Probenhalterung zweckmäßigerweise beweglich, bevorzugt rotier- und verschiebbar gelagert. Auf diese Weise können alle Bereiche der Probe einer Manipulation, insbesondere auch einer räumlich streng lokalisierten Manipulation zugänglich gemacht werden. Die Steuereinheit ist dabei zweckmäßig zur Ansteuerung von beiden Manipulationsoptiken ausgelegt. Außerdem weist die Anordnung zweckmäßig eine Auswerteeinheit auf, die das - beispielsweise auf einem flächenförmigen CCD-Detektor pixelweise - detektierte Licht in Daten, d.h. digitale Signale umwandelt und auch auswertet, wobei die Signalumwandlung häufig auch in der Detektierungseinrichtung selbst vorgenommen wird. Die Steuereinheit steuert die Bewegung der Probe und/oder der Probenhalterung, bevorzugt in Abhängigkeit von der Auswertung der Daten. Aber auch eine Steuerung nach einem vorgegebenen Programm, bei der die Probe beispielsweise vollständig durchleuchtet wird und immer wieder die gleichen Manipulationsprozeduren durchgeführt werden, ist mit entsprechender Ansteuerung möglich.
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Insbesondere lässt sich die erfindungsgemäße optische Anordnung zur Photomanipulation mit einer oder mehrerer der Manipulationsmethoden FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP, Photokonversion, Photoaktivierung, Photoinaktivierung, Mikrodissektion, Polymerisation, Ablation, Schmelzen, Erwärmung sowie Manipulation von Anregung- und Emissionseigenschaften von Farbstoffen verwenden. Auch zur räumlich lokalisierten Manipulation einer räumlich ausgedehnten Probe lässt sich die erfindungsgemäße Anordnung ohne weiteres verwenden.
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Die Erfindung soll im Folgenden anhand von Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale aufweisen, näher erläutert werden. In den dazugehörigen Zeichnungen zeigt:
- 1 eine optische Anordnung zur Photomanipulation mit einer normalen Beleuchtungslichtquelle und einer Manipulationslichtquelle,
- 2 eine ähnliche optische Anordnung, bei der die Beleuchtungslichtquelle als Manipulationslichtquelle verwendet wird,
- 3 die optische Anordnung aus 1, jedoch mit einer zusätzlichen zweiten Manipulationsoptik und zwei Manipulationslichtquellen,
- 4 die optische Anordnung aus 1, jedoch mit einem zweiten Manipulationsstrahlengang und einer gemeinsamen Manipulationslichtquelle.
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In 1 ist eine optische Anordnung zur Photomanipulation einer Probe 1 gezeigt. Die Probe 1 wird von einer Probenhalterung 2 aufgenommen. Die Probe 1 kann beispielsweise in einen Gelzylinder aus Agarose eingebettet werden, der in der Probenhalterung 2 befestigt wird. Bevorzugt ist die Probenhalterung 2 rotierbar gelagert, was hier durch den Pfeil angedeutet wird. Bevorzugt ist die Probenhalterung 2 außerdem verschiebbar gelagert, d.h. in allen drei Raumrichtungen verfahrbar, so dass alle Bereiche der Probe 1 beleuchtet und detektiert werden können. Alternativ kann auch die Probe 1 beweglich gelagert und die Probenhalterung 2 fest konstruiert sein, so dass die Bewegungen von Probe 1 und Probenhalterung 2 entkoppelt sind. Die Anordnung verfügt über eine Beleuchtungseinrichtung mit einer Beleuchtungslichtquelle 3 und einen Beleuchtungsstrahlengang, gekennzeichnet durch zwei Linsen 4 und 5. Mittels der Beleuchtungseinrichtung kann die Probe 1 mit einem Lichtblatt gemäß der SPIM-Technologie beleuchtet werden. Das Licht wird im vorliegenden Fall vorzugsweise parallel zur Rotationsachse der Probenhalterung 2 auf die Probe 1 gelenkt. Die Anordnung weist außerdem eine Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht auf, welches von der Probe 1 abgestrahlt wird. Wesentlicher Bestandteil der Detektierungseinrichtung ist ein zeilen- oder flächenförmiger Detektor, der im vorliegenden Beispiel als CCD-Kamera 6 ausgestaltet ist. Auch andere Detektoren, beispielsweise auf CMOS-Basis sind verwendbar, sofern sich die registrierten Intensitätssignale ohne weiteres in digitale Informationen umwandeln lassen. Die Probe 1 bzw. Licht, das von der Probe 1 kommt, wird durch eine Abbildungsoptik mit einem Abbildungsobjektiv 7, welches sich in einem Abbildungsstrahlengang befindet, mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung, d.h. die CCD-Kamera 6, abgebildet. Das Lichtblatt zur Beleuchtung ist im Fokus des Abbildungsobjektivs 7 im Wesentlichen eben. Die optische Achse des Abbildungsobjektivs 7 schneidet außerdem die Ebene des Lichtblatts in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht, wie in 1 dargestellt. Die optische Anordnung weist außerdem eine Steuereinheit 8 auf, die im Beispiel mit einer optionalen Auswerteeinheit 9 kombiniert ist. In der Auswerteeinheit 9 wird das detektierte Licht in Daten umgewandelt und ausgewertet. Die Richtung, in der Licht detektiert wird, ist durch den mit „D“ gekennzeichneten Pfeil zwischen Abbildungsobjektiv 7 und CCD-Kamera 6 gekennzeichnet.
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Die optische Anordnung verfügt darüber hinaus über Mittel zur Photomanipulation der Probe 1. Diese Mittel zur Photomanipulation umfassen eine erste Manipulationsoptik, mittels der Licht einer ersten Manipulationslichtquelle 10 in den Beleuchtungsstrahlengang zur Formung eines im wesentlichen ebenen Manipulationslichtblatts eingekoppelt wird. Die Richtung, in der Manipulationslicht auf die Probe gelenkt wird, ist durch den mit „M“ gekennzeichneten Pfeil zwischen der Linse 5 und der Probenhalterung 2 gekennzeichnet. Im vorliegenden Fall umfasst die Manipulationsoptik neben einer Linse 11, die ebenso wie die Linse 4 und 5 selbstverständlich Anordnungen von mehreren Linsen symbolisieren kann, auch einen Umlenkspiegel 12 und, zum Einkoppeln in den Beleuchtungsstrahlengang, ein entsprechendes Einkoppelelement 13, welches beispielsweise als halbdurchlässiger Spiegel oder als Polarisationsstrahlteiler oder auch als galvanometrischer Spiegel ausgestaltet sein kann. In Ergänzung kann außerdem eine als Shutter ausgestaltete Blende 14, beispielsweise eine Irisblende, vorgesehen sein, die Licht durchlässt oder blockiert, je nachdem, wie sie von der Steuereinheit 8 angesteuert wird. Auch das Einkoppelelement 13 bzw. der Umlenkspiegel 12 können ggf. von der Steuereinheit 8 angesteuert werden, beispielsweise wenn das Einkoppelelement 13 als galvanometrischer Spiegel ausgestaltet ist, oder wenn anstelle der Blende 14 der Umlenkspiegel 12 gedreht wird, um das Licht in eine Lichtfalle zu lenken und zu blockieren. Wesentlich ist nur, dass Mittel zum Einkoppeln in den Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen sind, sowie die Möglichkeit, diese zu steuern. Diese Verbindungen von der Steuereinheit 8 zu den angesteuerten Elementen der optischen Anordnungen sind der Übersicht halber nicht eingezeichnet. Die erste Manipulationslichtquelle 10 kann beispielsweise als Laserlichtquelle ausgestaltet sein. Sie kann auch mehrere einzeln oder zusammen schaltbare Laser verschiedener Wellenlängen umfassen.
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Die Anordnung weist darüber hinaus auch Mittel zur Strukturierung des Lichtblattes auf. Im gezeigten Beispiel umfassen die Mittel zur Strukturierung des Lichtblatts eine in den Strahlengang einschiebbare Schlitzblende 15 mit einem oder mehreren Schlitzen zur räumlichen Strukturierung des Lichtblattes.
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Während mit der in 1 gezeigten Anordnung eine Beobachtung der Probe und eine Manipulation der Probe alternierend oder ggf. auch gleichzeitig möglich ist, so ist die in 2 gezeigte Anordnung, die im Wesentlichen die gleichen Elemente wie die in 1 gezeigte Anordnung umfasst, einfacher ausgestaltet. Als erste Manipulationslichtquelle 10 ist hier die Beleuchtungslichtquelle 3 vorgesehen. Dabei hängt von der jeweiligen Anwendung ab, d.h. von den verwendeten Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereichen, in denen die erste Manipulationslichtquelle 10 Licht abstrahlt, ob die Probe 1 mit diesem Licht auch in üblicherweise beobachtet werden kann, oder ob mit der Anordnung nur eine Manipulation möglich ist. Auch hier sind wieder Mittel zur Strukturierung des Lichtblattes vorgesehen, neben einer Schlitzblende 15 können diese Mittel außerdem Mittel zur zeitlichen Modulation des Lichtblatts umfassen, beispielsweise eine Steuerung der Intensität oder Wellenlänge oder auch Mittel zur Erzeugung mehrerer, einander überlagerter Lichtblätter.
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In 3 ist eine ähnliche Anordnung wie in l gezeigt, jedoch weisen die Mittel zur Photomanipulation der Probe 1 hier zusätzlich noch eine zweite Manipulationsoptik auf. Licht einer zweiten Manipulationslichtquelle 16 wird in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt und über das Abbildungsobjektiv 7 auf die Probe 1 gelenkt. Zur Einkopplung sind auch hier ein Umlenkspiegel 12, und eine Blende 14 vorgesehen, sowie ein Strahlteiler 17 zur endgültigen Einkopplung des Manipulationslichtes in den Abbildungsstrahlengang, der jedoch in Detektierungsrichtung von der Probe 1 kommendes Licht zur CCD-Kamera 6 durchlässt. Auch die zweite Manipulationslichtquelle 16 kann als Laserlichtquelle, die mindestens einen Laser umfasst, ausgestaltet sein. Die erste Manipulationslichtquelle und die zweite Manipulationslichtquelle 16 können dabei auch Licht unterschiedlicher Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche ausstrahlen. Außerdem kann die zweite Manipulationsoptik als Laser-Scanning-Mikroskop ausgestaltet sein. Dies ermöglicht die konfokale Beleuchtung der Probe über den Abbildungsstrahlengang. Werden die Umlenkspiegel 12 nicht als vollreflektierende, sondern als teildurchlässige Spiegel ausgestaltet, so kann auch Licht der ersten Manipulationslichtquelle 10 - wie durch die gestrichelte Linie angedeutet - in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt werden. Bei entsprechender Ausgestaltung des Einkoppelelementes 13 kann sogar Licht aus der Beleuchtungsquelle 3 in den Abbildungsstrahlengang eingekoppelt werden und ermöglicht so eine normale Beobachtung im Auflicht. Darüber hinaus ist auch eine Kombination der zweiten Manipulationsoptik, wie sie in 3 gezeigt ist, mit einer Anordnung gemäß 2 möglich.
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Eine andere Variante ist in 4 gezeigt, hier sind erste Manipulationslichtquelle 10 und zweite Manipulationslichtquelle 16 identisch. Statt eines Umlenkspiegels 12 kommt hier jedoch ein weiteres Einkoppelelement 13 zum Einsatz, das beispielsweise als Strahlteiler ausgestaltet sein kann, so dass beide Manipulationsstrahlengänge gleichzeitig mit Licht gespeist werden, oder aber auch als schaltbarer Spiegel, der alternierend oder nach Bedarf einen der beiden Strahlengänge speist. Auf den Beleuchtungsstrahlengang mit der Beleuchtungslichtquelle 3 kann - ebenso wie bei der in 3 gezeigten Anordnung - ggf. auch verzichtet werden, wenn eine Beleuchtung nicht notwendig ist, sondern die Anordnung auf die reine Manipulation beschränkt werden soll. Alternativ können auch alle Lichtquellen zu einer einzigen Lichtquelle zusammengefasst sein, oder mindestens in einem Lichtquellenmodul zusammengefasst sein, so dass der Aufbau weiter vereinfacht wird.
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Mit den gezeigten Anordnungen ist es möglich, in einem beschränkten Bereich der Probe Photomanipulationen durchzuführen, wobei der Aufwand, sowohl hinsichtlich der Konstruktion als auch der Kosten gegenüber anderen Anordnungen, die räumlich begrenzt photomanipulieren, gering ausfällt. Im Falle der Anordnung mit einer Manipulationsoptik, bei der das Manipulationslicht zu einem Lichtblatt geformt wird, bleibt der Bereich der Probe 1, der manipuliert wird, auf die Fokusebene des Abbildungsobjektivs 7 beschränkt. Der Bereich ist dabei jedoch noch relativ groß und unflexibel, da entweder nur ganze Linien oder - bei räumlicher Strukturierung des Lichtblattes - Streifen manipuliert werden können.
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Mit den in 3 und 4 gezeigten Anordnungen, bei denen jeweils zwei Manipulationsoptiken bzw. zwei Manipulationsstrahlengänge vorgesehen sind, lassen sich auch räumlich stark lokalisierte Gebiete in der Probe manipulieren, ohne dass beispielsweise auf aufwendige Mehrphotoneneffekte zurückgegriffen werden muss. Bei entsprechender Auswahl von Proben und Manipulationstechnik ist es möglich, dass Manipulationsgebiet in der Probe auf den Bereich zu beschränken, der vom Licht beider Manipulationsstrahlengänge in der Überlappung erfasst wird.
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Beispielsweise lassen sich Proben mit Farbstoffen einfärben, deren Antwortverhalten (Response) in Bezug auf die eingestrahlte Leistungsdichte nichtlinear ist. So kann man beispielsweise einen Farbstoff verwenden, dessen Antwortverhalten quadratisch auf die eingestrahlte Leistungsdichte reagiert. Doppelte Leistungsdichte würde die Stärke des Signals vervierfachen. Falls beide Manipulationsoptiken mit der gleichen Leistungsdichte auf die Probe strahlen, so wird ein Beobachter in dem Gebiet der Probe 1, in dem sich die Strahlen kreuzen, die vierfache Signalintensität beobachten, in den übrigen Gebieten nur die einfache. Die Auswahl findet hier also nicht mit Mehrphotonen-Effekten statt, sondern durch die Addition der Leistungsdichten. Selbstverständlich ist auch eine Kombination mit Mehrphotonen-Techniken denkbar.
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Ein anderes Anwendungsbeispiel ist eine Probe, die unterhalb eines Schwellwertes für die Leistungsdichte überhaupt keine Antwort zeigt, sondern erst dann, wenn oberhalb dieser Schwelle angeregt wird. Falls die Leistungsdichte des Lichtes der beiden Manipulationslichtquellen beim Auftreffen auf die Probe jeweils geringer ist als der Schwellwert, in der Summe aber über diesem liegt, so kann auf diese Weise auch ein lokal sehr eng begrenztes Gebiet ausgewählt werden. Weist die Probe einen absoluten Schmelzpunkt im Bereich der addierten Leistungsdichten der Manipulationslichtquellen auf, so lässt sich die Probe 1 an diesem Punkt beispielsweise durch die Überlagerung der beiden Strahlen aufbrechen. Dies kann beispielsweise zur Mikrodissektion verwendet werden. Die Lichtquelle kann in den beiden eben geschilderten Fällen jeweils dieselbe sein.
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Auch unterschiedliche Lichtquellen lassen sich selbstverständlich verwenden. Bestrahlt man eine Probe, die mit Farbstoffen des Typs Dronpa 3 markiert ist, so regen beispielsweise weder die Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 405nm, noch die Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 488nm Emissionen an. Erst bei einer simultanen Kombination beider Anregungswellenlängen zeigen sich helle Emissionen. Diese Emissionen treten jedoch in der Probe 1 nur in der Region auf, in der sich die beiden Strahlen überlappen bzw. kreuzen, also in einem räumlich sehr geschränkten Gebiet, auch wenn die Manipulationsoptiken für sich genommen jeweils ein größeres Gebiet beleuchten.
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Die optische Anordnung lässt sich außer in den eben beschriebenen Beispielen auch bei einer Vielzahl anderer Manipulationsverfahren, insbesondere solchen, die die Fluoreszenz analysieren, beispielsweise FRAP, FLIP, FLAP, etc. anwenden.
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Mit den oben beschriebenen optischen Anordnungen zur Photomanipulation ist es nicht nur möglich, auf die Verwendung von Anordnungen zur Ausnutzung von Mehrphotoneneffekten zu verzichten, was weniger aufwendig und kostengünstiger ist, darüber hinaus ist es auch möglich kleinere Probenvolumen als bei der Verwendung von Mehrphotonentechniken zu untersuchen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Probe
- 2
- Probenhalterung
- 3
- Beleuchtungslichtquelle
- 4,5
- Linsen
- 6
- CCD-Kamera
- 7
- Abbildungsobjektiv
- 8
- Steuereinheit
- 9
- Auswerteeinheit
- 10
- erste Manipulationslichtquelle
- 11
- Linse
- 12
- Umlenkspiegel
- 13
- Einkoppelelement
- 14
- Blende
- 15
- Schlitzblende
- 16
- zweite Manipulationslichtquelle
- 17
- Strahlteiler