DE10127137A1 - Verfahren zur Scanmikroskopie und Scanmikroskop - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zur Untersuchung mindestens eines Bereichs einer Probe (37) mit einem Scanmikroskop mit mindestens einer Lichtquelle (11) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtbündels (23), das auf die Probe (37) fokussierbar ist, umfasst den Schritt des Aufnehmens (1) eines Übersichtsbildes (45) und des Auswählens (3) mindestens eines interessierenden Bereichs (77, 79) im Übersichtsbild (45) sowie das Fokussieren (5) des Beleuchtungslichtbündels (23) zu einem Beleuchtungsmuster (89), das mehr als einen Fokus (91) beinhaltet, und das Beleuchten (7) des ausgewählten Bereichs (77, 79) der Probe (37) mit dem Beleuchtungsmuster (89). In einem weiteren Schritt erfolgt das Detektieren (9) des von der Probe (37) ausgehenden Detektionslichts (39).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung mindestens eines Bereichs einer Probe mit einem Scanmikroskop.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Scanmikroskop mit einer Lichtquelle, die ein Beleuchtungslichtbündel zur Beleuchtung einer Probe emittiert, mit mindestens einem Detektor zur Detektion des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes und mit einem Objektiv, durch das die Probe beleuchtbar ist, wobei das Objektiv in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist.

Zur Untersuchung von biologischen Proben ist es üblich, die Probe mit optischen Markern, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen zu präparieren. Oft werden, beispielsweise im Bereich der Genuntersuchungen, mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe in die Probe eingebracht, die sich spezifisch an bestimmten Probenbestandteilen anlagern. Aus den Fluoreszenzeigenschaften der präparierten Probe können Rückschlüsse auf die Beschaffenheit oder die Zusammensetzung der Probe oder auf Konzentrationen bestimmter Stoffe innerhalb der Probe gezogen werden.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe ausgehende Detektionslicht, als Streu-, Reflexions- oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahles zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme erzielt.

In der konfokalen Scanmikroskopie kann im Falle der Zweiphotonenanregung (oder Mehrphotonenanregung) auf eine Detektionsblende verzichtet werden, da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Photonendichte und damit vom Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die naturgemäß im Fokus viel höher ist als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht stammt daher mit großer Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.

Insbesondere vor dem Hintergrund einer ohnehin geringen Ausbeute an Fluoreszenzphotonen bei Zweiphotonenanregung ist eine Non-Descan- Anordnung, bei der das Detektionslicht nicht über die Strahlablenkeinrichtung (Descan-Anordnung) und den Strahlteiler zur Beleuchtungslichteinkopplung zum Detektor gelangt, sondern direkt nach dem Objektiv (oder auf der Kondensorseite) mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers ausgelenkt und detektiert wird, interessant; denn im Allgemeinen geht auf diesem Detektionslichtweg weniger Licht verloren.

In der Zellbiologie wird u. a. die Weiterleitung von Informationen von Zelle zu Zelle untersucht. Die miteinander verästelten Nervenzellen stehen untereinander in Kontakt. An den Kontaktstellen sind die sog. Spines, die auf den Dentriten der Zellen zu finden sind, mit den Synapsen einer anderen Zelle verknüpft. Die Spines nehmen in der Regel ein Volumen von < 2 µm × 2 µm × 2 µm ein. Durch Anlegen von Spannungspulsen an das Zellgewebe kann ein Aktionspotential innerhalb eines Neurons erzeugt werden. Hierbei kommt es an den Kontaktstellen zur Öffnung von Kalziumkanälen und zum Einströmen von Kalzium, was durch Kalziumindikatoren (Farbstoffe, die vor allem in Anwesenheit von Kalzium leuchten) nachgewiesen werden kann.

Oft ist man daran interessiert möglichst gleichzeitig mehrere Kontaktstellen zu beobachten, um festzustellen, in welcher zeitlichen Reihenfolge Informationen zwischen Zellen ausgetauscht werden. Hierbei ist man nicht an Bildinformationen interessiert, sondern nur daran, festzustellen, ob ein Informationsaustausch stattgefunden hat. Zu diesem Zweck werden derzeit ausschließlich die Kontaktstellen in schneller Folge sequentiell mit einem Scanmikroskop abgetastet. Der Rest des Bildfeldes des Scanmikroskops bleibt unabgetastet, da er für diese Art der Untersuchung nicht von Interesse ist.

Diese Vorgehensweise hat jedoch erhebliche Nachteile: Die Fokusgröße des Abtaststrahles weist bei Verwendung üblicher Objektive (z. B. 63×) Ausdehnungen im Bereich von einigen hundert Nanometern auf. Der Fokus des Abtaststrahles ist damit kleiner als die Kontaktstellen im Bereich der Spines. Während der schnellen sequentiellen Abtastung kommt es zu mechanischen Driften der Probe oder der Teile im Probenbereich, beispielsweise des Probentisches, was zu Relativbewegungen und Positionierungenauigkeiten führt. Da es sich um lebende Proben handelt, kommt es sogar zu Bewegungen der Neuronen und ihrer Bestandteile in der Probe, so dass sich schon nach kurzer Abtastdauer die Kontaktstellen verschieben und vom Abtaststrahl nicht mehr oder nur noch teilweise getroffen werden. Die Verwendung von langbrennweitigen Objektiven führt in Bezug auf die Ausbreitungsrichtung des Abtaststrahles in lateraler Richtung zwar zu einer geeigneten Fokusgröße; jedoch bringt dies zwangsläufig viel zu große Fokuslängen in axialer Richtung mit sich.

Die gleiche Problematik tritt auch bei Bleichexperimenten, die auf der FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) beruhen, auf. Bei diesen Experimenten ist es wichtig, ganze Bereiche, die größer als das Fokusvolumen des Abtaststrahles sind, zielsicher und zuverlässig auszubleichen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren vorzuschlagen, das eine Untersuchung mindestens eines interessierenden Bereichs einer Probe mit einem Scanmikroskop schnell, effizient und zuverlässig ermöglicht.

Obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte:

• - Aufnehmen eines Übersichtsbildes;
• - Auswählen mindestens eines interessierenden Bereichs im Übersichtsbild;
• - Fokussieren des Beleuchtungslichtbündels zu einem Beleuchtungsmuster, das mehr als einen Fokus beinhaltet,
• - Beleuchten des ausgewählten Bereichs der Probe mit dem Beleuchtungsmuster und
• - Detektieren des von der Probe ausgehenden Detektionslichts.

Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben, das eine Untersuchung mindestens eines interessierenden Bereichs einer Probe schnell, effizient und zuverlässig ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop, das die Merkmale des kennzeichnenden Teils des Anspruchs 7 beinhaltet, gelöst

Die Erfindung hat den Vorteil, dass durch den Verzicht auf eine maximale optische Auflösung die spezifische Untersuchung mindestens eines interessierenden Bereichs einer Probe auf zeitliche Veränderungen auf zuverlässige Weise ermöglicht ist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung sind die ausgewählten Bereiche mit Beleuchtungsmustern unterschiedlicher spektraler Eigenschaften beleuchtbar. Hierfür ist vorteilhafter Weise eine spektral breitbandige Lichtquelle vorgesehen, aus deren Emissionsspektrum Licht der gewünschten Wellenlängen ausgewählt wird. In einer anderen Ausgestaltung sind mehrere Lichtquellen, vorzugsweise Laser vorgesehen, deren Licht vor dem Einkoppeln in das Scanmikroskop vereinigt wird, wobei die jeweilige Lichtleistung der Lichtquellen individuell einstellbar oder regelbar ist.

Insbesondere für Bleichexperimente ist es von Vorteil, unterschiedliche Bereiche mit Beleuchtungsmustern unterschiedlicher Lichtleistung zu beleuchten.

In besonders bevorzugter Weise beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren den weiteren Schritt des Stimulierens der Probe. Das Stimulieren erfolgt vorzugsweise mit einem elektrischen, mechanischen oder optischen Signal. Das elektrische Signal wird vorzugsweise als Spannungspuls mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik appliziert. In ganz besonders zu bevorzugender Weise erfolgt die Detektion des von der stimulierten Probe ausgehenden Detektionslichtes in zeitlicher Korrelation zum Stimulieren. Hierfür ist vorzugsweise eine Vorrichtung vorgesehen, die den zeitlichen Abstand zwischen Stimulieren und Ankunft des Detektionslichtes an einem Detektor ermittelt und dem Benutzer anzeigt. In einer anderen Ausführungsvariante ermittelt die Vorrichtung den zeitlichen Abstand der optischen Reaktion mehrerer Bereiche auf eine Stimulation.

Ein optisches Stimulieren erfolgt vorzugsweise durch Beleuchten der Probe mit Licht geeigneter Wellenlänge und Lichtleistung. Hierbei ist es insbesondere hinsichtlich der Herstellungskosten des Scanmikroskops von besonderem Vorteil, die Lichtquelle derart auszubilden, dass sie sowohl ein Beleuchtungslichtbündel zur Fluoreszenzanregung der Probe als auch Licht einer anderen Wellenlänge zur optischen Stimulierung, beispielsweise zur Freisetzung "gefangener Verbindungen", wie Calcium oder Glutamat (caged compound release), emittiert.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters zur Beleuchtung der Probe mit dem Beleuchtungsmuster in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar und zur direkten Beleuchtung der Probe mit dem Beleuchtungslichtbündel aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar.

In einer Ausführungsvariante ist das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters von außen in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar, wobei Führungselemente, wie Führungsschienen, Gleitschienen oder eine Bajonettfassung, vorgesehen sind, die ein einfaches und zuverlässiges Einbringen und Positionieren ermöglichen. Weiterhin sind Anschlagelemente vorgesehen, die eine Arbeitsposition des Elements zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters im Beleuchtungsstrahlengang definieren und die derart ausgestaltet sind, dass das positionierte Auskoppelelement automatisch in Bezug auf den Detektionsstrahlengang justiert ist und nach der Positionierung keine weitere Justierung des Auskoppelelements erforderlich ist.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein Revolver oder ein Schiebeschlitten, der mindestens eine Elementaufnahme aufweist, zur Positionierung des Elements zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters vorgesehen, wobei an oder in der Elementaufnahme das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters derart angebracht ist, dass es durch einfaches Drehen des Revolvers oder durch Schieben des Schiebeschlittens in dem Beleuchtungsstrahlengang positionierbar ist. Eine Justierung des Auskoppelelements erfolgt nur einmalig beim Anbringen des Elements in dem oder an dem Revolver oder Schiebeschlitten. Der weist vorzugsweise eine Einrastvorrichtung auf, die den Revolver oder den Schiebeschlitten lösbar fixiert, wenn das Element in dem Beleuchtungsstrahlengang positioniert ist. In einer weiteren Ausführungsvariante weist der Revolver oder der Schiebeschlitten mehrere Elementaufnahmen auf, in den andere Elemente, die ein anderes Beleuchtungsmuster erzeugen, angebracht sind. Weiterhin weist der Revolver oder der Schiebeschlitten mindestens eine Leerposition auf, die in den Beleuchtungsstrahlengang derart einbringbar ist, dass das Beleuchtungslicht ungehindert passiert. Diese erfindungsgemäße Lösung ist kostengünstig und hochflexibel.

In einer bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters mindestens eine Mikrolinse. Ganz besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters ein Mikrolinsenarray ist. Das Mikrolinsenarray erzeugt vorzugsweise mehrere nebeneinander in einer Ebene liegende Fokusse. In einer anderen Ausführungsvariante umfasst das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters ein optisches Element mit Facettenschliff, beispielsweise ein Axikon, wobei die einzelnen Facetten Teile des Beleuchtungslichtstrahles in unterschiedliche Richtungen ablenken. Vorzugsweise ist das optische Element farbkorrigiert. D. h., dass der Anlenkwinkel einer Facette für alle Wellenlängen gleich ist.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform erzeugt das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters einen multigaußschen Lichtstrahl. Ganz besonders vorteilhaft ist es, das Element derart anzuordnen, dass der multigaußsche Lichtstrahl bereits in der Lichtquelle entsteht. Lichtquellen bzw. Laser dieser Art sind beispielsweise aus der Veröffentlichung von A. Tovar, "Multi-Gausian-Beams A Super-Gausian Alternative", Proceedings of SPIE, Vol 3930 (2000) Seite 87 bis 94, bekannt.

Das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters ist vorzugsweise in einer zur Fokusebene optisch konjugierten Fourierebene angeordnet.

Das erfindungsgemäße Scanmikroskop beinhaltet eine Strahlablenkeinrichtung, die es gestattet, das Beleuchtungsmuster sequentiell auf verschiedene ausgewählte Bereiche zu lenken. Vorzugsweise ist ein spektral selektives Element, beispielsweise ein AOTF (acousto optical tunable filter) vorgesehen, das eine Beleuchtung der Bereiche mit Licht unterschiedlicher spektraler Eigenschaften ermöglicht.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Scanmikroskop ein konfokales Scanmikroskop.

Hinsichtlich eines Verfahrens ist zunächst ein Übersichtsbild aufzunehmen, um festzustellen, wo die interessierenden Bereiche liegen und um diese auszuwählen und ggf. zu markieren.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens,

Fig. 2 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop in Descan- Anordnung,

Fig. 3 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop in Non-Descan- Anordnung,

Fig. 4a, 4b ein optisches Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters,

Fig. 5a, 5b ein weiteres optisches Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters,

Fig. 6 eine schematische Darstellung der Auswahl der interessierenden Bereiche,

Fig. 7 eine schematische Darstellung der Abtastung der interessierenden Bereiche mit dem Beleuchtungsmuster.

Fig. 8 ein weiteres erfindungsgemäßes Scanmikroskop in Non- Descan-Anordnung und

Fig. 9 eine schematische Darstellung der Abtastung der interessierenden Bereiche einer stimulierbaren Probe.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens. Zunächst erfolgt das Aufnehmen 1 eines Übersichtsbildes. Das Übersichtsbild wird auf herkömmliche Weise mit einem Abtaststrahl, der mäanderförmig über die Probe geführt wird, erzeugt. Im nächsten Schritt erfolgt das Auswählen 3 mindestens eine interessierenden Bereichs im Übersichtsbild. Das Auswählen erfolgt durch Markieren des interessierenden Bereichs im Übersichtsbild. In weiteren Schritten folgt das Fokussieren 5 des Beleuchtungslichtbündels zu einem Beleuchtungsmuster mit mehr als einem Fokus und das Beleuchten 7 des ausgewählten Bereichs mit dem Beleuchtungsmuster. In einem letzten Schritt erfolgt das Detektieren 9 des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes, wobei es sich dabei insbesondere um Streu-, Reflexions- oder Fluoreszenzlicht handelt.

Fig. 2 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop in Descan-Anordnung, mit einer Lichtquelle 11, die einen ersten und einen zweiten Laser 13, 15 beinhaltet. Das von dem ersten Laser 13 emittierte Licht 17, das eine Wellenlänge von 630 nm auf weist, und das von dem zweiten Laser 15 emittierte Licht 19, das eine Wellenlänge von 488 nm aufweist, wird mit einem dichroitischen Strahlteiler 21 zu einem Beleuchtungslichtbündel 23 vereinigt. Das Beleuchtungslichtbündel 23 gelangt über einen Hauptstrahlteiler 25 zu einer Strahlablenkeinrichtung 27, die einen kardanisch aufgehängten Spiegel 29 beinhaltet. Durch die Scanoptik 31, die Tubusoptik 33 und das Objektiv 35, wird das Beleuchtungslichtbündel 23 über bzw. durch die Probe 37 geführt. Bei biologischen Proben 37 (Präparaten) oder transparenten Proben 37 kann das Beleuchtungslichtbündel 23 auch durch die Probe 37 geführt werden. Dies bedeutet, dass verschiedene Fokusebenen des Objekts nacheinander durch das Beleuchtungslichtbündel 23 abgetastet werden. Die nachträgliche Zusammensetzung ergibt dann ein dreidimensionales Bild der Probe. Das von der Lichtquelle 11 kommende Beleuchtungslichtbündel 23 ist in allen Abbildungen als durchgezogene Linie dargestellt Das von der Probe 37 ausgehende Detektionslicht 39 gelangt durch das Objektiv 35, die Tubusoptik 33 und Scanoptik 31 sowie über die Strahlablenkeinrichtung 27 zurück zum Hauptstrahlteiler 25, passiert diesen und trifft schließlich auf den Detektor 41, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Das Detektionslicht 39 ist gestrichelt dargestellt. Der Detektor 41 erzeugt ein in der Amplitude zur Leistung der des Detektionslichtes 39 proportionales elektrisches Signal. Dieses elektrische Signal wird an die Verarbeitungseinheit 43 weitergegeben. Die in der Strahlablenkeinrichtung 27 mit Hilfe eines nicht dargestellten induktiv oder kapazitiv arbeitenden Positionssenors erfassten Positionssignale werden ebenfalls an die Verarbeitungseinheit 43 übergeben. Es ist für einen Fachmann selbstverständlich, dass die Position des Spiegels 29 auch über die Verstellsignale ermittelt werden kann. Die eingehenden Analogsignale werden in der Verarbeitungseinheit 43 zunächst digitalisiert. Die Positions- und Detektionssignale werden in der Verarbeitungseinheit 43 einander zugeordnet und zu einem Übersichtsbild 45 zusammengesetzt, das auf dem Display 47 angezeigt wird. Die Aufbereitung und Darstellung der Daten auf dem Display 47 erfolgt mit einem PC 49. Das bei einem konfokalen Scanmikroskop üblicherweise vorgesehene Beleuchtungspinhole 51 und das Detektionspinhole 53 sind der Vollständigkeit halber schematisch eingezeichnet. Weggelassen sind wegen der besseren Anschaulichkeit hingegen einige optische Elemente zur Führung und Formung der Lichtstrahlen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann hinlänglich bekannt. Die Leistung und die spektrale Zusammensetzung des Beleuchtungslichtbündels ist mit Hilfe eines AOTF 55 einstellbar. Hier wäre auch die Verwendung eines elektrooptischen Bauteils, beispielsweise eines EOM's möglich. Zum Auswählen 3 mindestens eines interessierenden Bereichs dient eine Computermaus 57, mit der der ausgewählte Bereich markierbar wird. Zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters ist ein Element 59 vorgesehen, das ein Mikrolinsenarray und einen Kollimator beinhaltet, wobei die Brennweite der Mikrolinsen 25 mm und die des Kollimators 250 mm beträgt. Der Durchmesser und der Abstand der Mikrolinsen zueinander beträgt ca. 100 µm. Das Objektiv 35 weist eine Brennweite vom 5 mm auf (40×). Der Durchmesser des Beleuchtungslichtbündels 23 beträgt in der Pupille des Objektivs 4 mm. Das Element zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters 59 ist in einem nicht dargestellten Revolver angeordnet und somit leicht in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar und aus diesem entfernbar.

Fig. 3 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop in Non-Descan- Anordnung. Das von einer Lichtquelle 11, die als modenverkoppelter Titan- Saphir-Laser 61 ausgeführt ist, kommende Beleuchtungslichtbündel 23 weist eine Wellenlänge von ca. 800 nm auf. Der Beleuchtungsstrahlengang entspricht im Wesentlichen dem des in Fig. 2 beschriebenen Scanmikroskops. Das Detektionslicht 39 gelangt über einen Kondensor 63 zum Detektor 41. Bei dieser Non-Descan-Anordnung mit Zweiphotonenanregung ist sowohl das Anregungs-, als auch das Detektionspinhole entbehrlich und daher weggelassen. Die Darstellung des Übersichtsbildes 45 und das Auswählen 3 eines interessierenden Bereichs erfolgt analog wie bei dem in Fig. 2 beschriebenen konfokalen Scanmikroskop.

Fig. 4a zeigt ein optisches Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters 59 in der Draufsicht. Das Element 59 besteht aus einem Glassubstrat 67 und weist mehrere Facetten 65 auf.

Fig. 4b zeigt das in Fig. 4a beschriebene optische Element 59 in der Seitenansicht.

Fig. 5a zeigt ein weiteres optisches Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters 59, das ein Mikrolinsenarray 69 und einen Kollimator 71, der als Einzellinse ausgeführt ist, beinhaltet. Das Mikrolinsenarray 69 besteht aus einem Substrat 73, in das die Mikrolinsen 75 aus dem Vollen eingearbeitet sind.

Fig. 5b zeigt schematisch das in Fig. 5a beschriebene Mikrolinsenarray 69 in der Draufsicht.

Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung der Auswahl der interessierenden Bereiche 77, 79 im Übersichtsbild 45. Im Übersichtsbild ist eine biologische Zelle 81 zu sehen, die mit den Dendriten 83, 85 zweier weiterer Nervenzellen in Verbindung steht. Mit Hilfe des Mauszeigers 87 werden die interessierenden Bereiche 77, 79, in diesem Fall die Kontaktstellen, umfahren und so gleichzeitig markiert.

Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung der Abtastung der interessierenden Bereiche mit dem Beleuchtungsmuster 89. Das Beleuchtungsmuster 89 beinhaltet 16 Fokusse 91. Der Abstand benachbarter Fokusse beträgt 500 nm. Mit Hilfe der Strahlablenkeinrichtung 27 wird die Beleuchtung sequentiell zwischen den beiden interessierenden Bereichen 77, 79 hin und her geschaltet. Der Bereich 77 wird mit einer anderen Lichtleistung beleuchtet, als der Bereich 79. Dies wird durch Synchronisation des Strahlablenkeinrichtung 27 mit dem AOTF 55 (oder dem EOM) erreicht.

Fig. 8 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Scanmikroskop in Non-Descan- Anordnung. Das Detektionslicht 39 gelangt durch das Objektiv 35 zu einem dichroitischen Strahlteiler 93, der das Detektionslicht 39 zum Detektor 41 leitet. Für das Beleuchtungslichtbündel 23 ist der dichroitische Strahlteiler 93 weitgehend transparent. Bei dieser Non-Descan-Anordnung mit Zweiphotonenanregung ist sowohl das Anregungs-, als auch das Detektionspinhole entbehrlich und daher weggelassen. Die Darstellung des Übersichtsbildes 45 und das Auswählen 3 eines interessierenden Bereichs erfolgt analog wie bei dem in Fig. 2 beschriebenen konfokalen Scanmikroskop.

Fig. 9 zeigt eine schematische Darstellung der Abtastung der interessierenden Bereiche einer stimulierbaren Probe. Es handelt sich um eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Zellbiologie. Mit Hilfe einer Mikropipette 95 wird ein Kalzium-Indikator in die biologische Zelle 81 eingebracht. Der Kalzium-Indikator füllt die Zelle aus und ist nicht dargestellt. Die Spines der Nervenzelle sind durch genetische Manipulation mit GFP (Green Fluorescent Protein) 41 markiert. An die Spines sind die Synapsen anderer Nervenzellen angekoppelt. Die interessierenden Bereiche werden abwechselnd in schneller Folge mit dem Beleuchtungsmuster 89 eines Beleuchtungslichtstrahles von 488 nm, 514 nm und 568 nm Wellenlänge entlang der angedeuteten Scanbahn 46 beleuchtet. Über die Mikroelektroden 97 kann ein Spannungspuls zwischen der Zelle 81 und seiner Umgebung angelegt werden. Da die Zelle 81 mit benachbarten Nervenzellen wie beschrieben in Kontakt steht, strömt durch den Spannungsstoß Kalzium an den Kontaktstellen ein, was anhand der Kalzium-Indikatoren und des GFP (das mit einer anderen Wellenlänge, als der Kalzium-Indikator fluoresziert) bei schneller rasterförmiger Beleuchtung detektiert werden kann. Die Zuverlässigkeit der Auffindung der Kontaktstellen ist sehr hoch; denn nur an den Orten kann eine Kontaktstelle vorliegen, an denen das und der Kalzium- Indikator gleichzeitig aufleuchten. Zur Steigerung der Zuverlässigkeit erfolgt die Detektion des von der Probe 37 ausgehenden Lichtes in zeitlicher Korrelation zum Auslösen der Stimulation. Die Position der Kontaktstellen wird abgespeichert und dem Benutzer angezeigt.

Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

Bezugszeichenliste

1

Aufnehmen

3

Auswählen

5

Fokussieren

7

Beleuchten

9

Detektieren

11

Lichtquelle

13

erster Laser

15

zweiter Laser

17

emittiertes Licht

19

emittiertes Licht

21

Strahlteiler

23

Beleuchtungslichtbündel

25

Hauptstrahlteiler

27

Strahlablenkeinrichtung

29

Spiegel

31

Scanoptik

33

Tubusoptik

35

Objektiv

37

Probe

39

Detektionslicht

41

Detektor

43

Verarbeitungseinheit

45

Übersichtsbild

47

Display

49

PC

51

Beleuchtungspinhole

53

Detektionspinhole

55

AOTF

57

Computermaus

59

Element zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters

61

Titan-Saphir-Laser

63

Kondensor

65

Facetten

67

Glassubstrat

69

Mikrolinsenarray

71

Kollimator

73

Substrat

75

Mikrolinsen

77

interessierender Bereich

79

interessierender Bereich

81

biologische Zelle

83

Dendrit

85

Dendrit

87

Mauszeiger

89

Beleuchtungsmuster

91

Fokus

93

dichroitischer Strahlteiler

95

Mikropipette

97

Mikroelektroden

Claims (20)

1. Verfahren zur Untersuchung mindestens eines Bereichs einer Probe (37) mit einem Scanmikroskop mit mindestens einer Lichtquelle (11) zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtbündels (23), das auf die Probe (37) fokussierbar ist gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• - Aufnehmen (1) eines Übersichtsbildes (45);
• - Auswählen (3) mindestens eines interessierenden Bereichs (77, 79) im Übersichtsbild (45);
• - Fokussieren (5) des Beleuchtungslichtbündels (23) zu einem Beleuchtungsmuster (89), das mehr als einen Fokus (91) beinhaltet,
• - Beleuchten (7) des ausgewählten Bereichs (77, 79) der Probe (37) mit dem Beleuchtungsmuster (89) und
• - Detektieren (9) des von der Probe (37) ausgehenden Detektionslichts (39).

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die weiteren Schritte:

• - Zuordnen je einer Beleuchtungslichtleistung zu dem ausgewählten Bereich (77, 79) und
• - Einstellen der zugeordneten Beleuchtungslichtleistung.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die weiteren Schritte:

• - Zuordnen mindestens einer Beleuchtungslichtwellenlänge zu dem ausgewählten Bereich (77, 79) und
• - Einstellen der zugeordneten Beleuchtungslichtwellenlänge.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt:

• - Stimulieren und/oder Manipulation der Probe.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Stimulieren mit einem elektrischen, mechanischen oder optischen Signal erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektieren (9) des von der Probe (37) ausgehenden Detektionslichtes (39) in zeitlicher Korrelation zum Stimulieren erfolgt.

7. Scanmikroskop mit einer Lichtquelle (11), die ein Beleuchtungslichtbündel (23) zur Beleuchtung einer Probe (37) emittiert, mit mindestens einem Detektor (41) zur Detektion des von der Probe (37) ausgehenden Detektionslichtes (39) und mit einem Objektiv (35), durch das die Probe (37) beleuchtbar ist, wobei das Objektiv (35) in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein interessierender Bereich (77, 79) der Probe (37) auswählbar ist und ein Element (59) zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters (89), das mehr als einen Fokus (91) beinhaltet, vorgesehen ist.

8. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsmuster (89) auf den ausgewählten Bereich (77, 79) der Probe (37) richtbar ist.

9. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters (59) zur Beleuchtung der Probe (37) mit dem Beleuchtungsmuster (89) in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar und zur direkten Beleuchtung der Probe (37) mit dem Beleuchtungslichtbündel (23) aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernbar ist.

10. Scanmikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung zur Führung und/oder Positionierung des Elements zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters (59) vorgesehen ist.

11. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters (59) mindestens eine Mikrolinse (75) beinhaltet.

12. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters (59) Facetten (65) aufweist.

13. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Element zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters (59) einen multigaussischen Lichtstrahl erzeugt.

14. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgewählte Bereich (77, 79) der Probe (37) durch die Beleuchtung ausbleichbar ist.

15. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere ausgewählte Bereiche (77, 79) sequentiell beleuchtbar sind.

16. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche ausgewählte Bereiche (77, 79) mit Beleuchtungsmustern (89) zumindest teilweise unterschiedlicher Wellenlängen beleuchtbar sind.

17. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche ausgewählte Bereiche mit Beleuchtungsmustern (89) unterschiedlicher Lichtleistung oder unterschiedlicher Lichtleistungsverteilung beleuchtbar sind.

18. Scanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung zum Stimulieren der Probe (37) vorgesehen ist.

19. Scanmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionslicht (39) zeitlich korreliert zum Stimulieren der Probe (37) detektierbar ist.

20. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Scanmikroskop ein konfokales Scanmikroskop ist.