EP1668394A1 - Mikroskop mit evaneszenter beleuchtung - Google Patents

Mikroskop mit evaneszenter beleuchtung

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Publication number
EP1668394A1
EP1668394A1 EP04787200A EP04787200A EP1668394A1 EP 1668394 A1 EP1668394 A1 EP 1668394A1 EP 04787200 A EP04787200 A EP 04787200A EP 04787200 A EP04787200 A EP 04787200A EP 1668394 A1 EP1668394 A1 EP 1668394A1
Authority
EP
European Patent Office
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light beam
illuminating light
microscope
illuminating
sample
Prior art date
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Ceased
Application number
EP04787200A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heinrich Ulrich
Werner Knebel
Kyra MÖLLMANN
Jürgen Hoffmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Leica Microsystems CMS GmbH
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Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10344410A external-priority patent/DE10344410A1/de
Application filed by Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Publication of EP1668394A1 publication Critical patent/EP1668394A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes

Definitions

  • the invention relates to a microscope with a first and a second illuminating light beam for illuminating a sample.
  • the invention also relates to a method for - in particular microscopic - examination of a sample.
  • a microscope with evanescent illumination of a sample is known from US 2002/0097489 A1.
  • the microscope contains a white light source, the light of which is coupled via a slit diaphragm through the microscope objective into the specimen slide for evanescent illumination.
  • the illuminating light propagates in the slide by total internal reflection, the sample being illuminated only in the area of the evanescent field protruding from the slide.
  • Microscopes of this type are known under the term TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope).
  • the z-resolution of TIRF microscopes is extremely good due to the evanescent field that only projects into the sample by approx. 100 nm.
  • the lens consists of a first lens a positive refractive power, a second lens with a negative refractive power, the focal length ratio between the two lenses being in the range of - 0.4 and - 0.1 and the total refractive power being greater than zero. Furthermore, the lens contains two positive lenses, whose ratio diameter to the focal length is greater than 0.3 and less than 0.6.
  • the objective also includes a negative lens and a converging lens, the negative lens facing the front group and the focal length ratio of the negative lens and the converging lens being between ⁇ 0.5 and ⁇ 2.
  • a microscope for TIRM Total Internal Reflection Microscopy
  • the microscope has a microscope housing and an objective.
  • the illuminating light emanating from an illuminating device can be coupled in via an adapter which can be inserted into the microscope housing.
  • US 2004/0001253 A1 is a microscope with an optical lighting system that enables simple switching between evanescent lighting and reflection lighting.
  • the lighting system includes a laser light source, the light of which is coupled into an optical fiber.
  • a coupling optic is also provided, which focuses the light emerging from the fiber into a rear focal point of the microscope objective.
  • the optical fiber can be displaced in a plane perpendicular to the optical axis of the microscope objective.
  • a device for coupling light into a microscope is known from DE 10229 935 A1. Laser light is directed onto the specimen in the light field diaphragm plane by an optical fiber coupling designed as a slide. The invention is particularly suitable for the TIRF process.
  • a sample is illuminated with a light beam in order to observe the detection light emitted by the sample, as reflection or fluorescent light.
  • the focus of an illuminating light beam is moved with the aid of a controllable beam deflection device, generally by tilting two mirrors, in a sample plane, the deflection axes usually being perpendicular to one another, so that one mirror deflects in the x direction and the other in the y direction.
  • the mirrors are tilted, for example, with the help of galvanometer control elements.
  • the power of the detection light coming from the object is measured depending on the position of the scanning beam.
  • the control elements are usually equipped with sensors for determining the current mirror position.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, focusing optics with which the light from the source is focused on a pinhole - the so-called excitation diaphragm - a beam splitter, a beam deflection device for beam control, microscope optics, a detection diaphragm and the detectors for detecting the detection - or fluorescent light.
  • the illuminating light is coupled in via a beam splitter.
  • the fluorescent or reflection light coming from the object reaches the beam splitter via the beam deflection device, passes it, and is then focused on the detection diaphragm behind which the detectors are located.
  • This detection arrangement is called a descan arrangement. Detection light that does not originate directly from the focus region takes a different light path and does not pass through the detection diaphragm, so that one obtains point information that passes through sequential scanning of the object with the focus of the illuminating light beam leads to a three-dimensional image. A three-dimensional image is usually achieved by taking image data in layers. Arrangements that determine the resolution of a confocal scanning microscope are given, among other things, by the intensity distribution and the spatial extent of the focus of the excitation light beam. An arrangement for increasing the resolving power for fluorescence applications is known from PCT / DE / 95/00124.
  • the lateral edge areas of the focus volume of the excitation light beam are illuminated with a light beam of a different wavelength, the so-called stimulation light beam, which is emitted by a second laser, in order to stimulate the sample areas excited by the light of the first laser to return to the basic state. Then only the spontaneously emitted light from the areas not illuminated by the second laser is detected, so that an overall improvement in resolution is achieved.
  • STED Stimulated Emission Depletion
  • Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy is a technique that is becoming increasingly important. A great advantage is that the samples do not have to be labeled with dyes. Living cells can also be examined. Compared to conventional Raman microscopy and the well-known confocal Raman microscopy, one can with CARS microscopy Achieve a higher yield of detection light, better suppress unwanted side effects and separate the detection light from the illuminating light more easily. For conventional confocal Raman spectroscopy, a detection pinhole is required to achieve good axial resolution, as well as a high-resolution spectrometer. CARS, on the other hand, is a non-linear optical process (four-wave mixing process).
  • the pump light beam and the Stokes light beam are combined coaxially and focused together on the same sample volume.
  • the direction in which the anti-Stokes radiation is emitted results from the phase matching condition for the four-wave mixing process.
  • a device is known from US Pat. No. 4,405,237 "Coherent anti-Stokes Raman device", in which two pulsed laser beams which are generated by two lasers and which have different wavelengths in the visible range or in the UV range of the spectrum are used, With a suitable choice of wavelengths, the sample can be excited in such a way that it emits the characteristic Coherent anti-Stokes Raman radiation.
  • James WM Chon, Min Gu “Scanning total internal reflection fluorescence microscopy under one- photon and two-photon excitation: Image formation ", Appl. Opt. 43, 1063-1071, 2004 and from Florian Schapper, Jose T.
  • This object is achieved by a microscope, which is characterized in that the first and / or the second illuminating light beam illuminates the sample evanescently.
  • the further object is achieved by a method for — in particular microscopic — examination of a sample with the following steps: • Generation of a first and a second illuminating light beam • Illuminating the sample with that of the first and the second illuminating light beam, at least the first illuminating light beam illuminating the sample evanescently ,
  • the microscope has an objective with an objective pupil, the first and / or the second
  • Illumination light beams in the area of the objective pupil has a focus.
  • An adjusting means is preferably provided with which the spatial position of the focus is changeable within the plane of the objective pupil.
  • the setting means can comprise, for example, a beam deflection device with a plurality of rotating or tilting mirrors or with a gimbal-mounted mirror.
  • the setting means can also be designed as an acousto-optical element or contain micromirrors.
  • a displaceable optical fiber can also be used to adjust the spatial position of the focus of the first and / or the second illuminating light beam.
  • Illuminating light bundle leaves the lens depends on the spatial position of the focus in the lens pupil.
  • a CARS examination of a sample is to be carried out.
  • the first illuminating light bundle is an excitation light bundle for optically stimulating a first sample area and the second illuminating light bundle is a stimulating light bundle for triggering a stimulated emission or for triggering a further excitation, the stimulated Emission and / or the further excitation takes place in a further sample area at least partially overlapping with the first sample area.
  • the excitation light beam and the stimulation light beam both illuminate the sample evanescently, the excitation light beam having a greater depth of penetration than the stimulation light beam.
  • the distance of the focus of the excitation light beam in the objective pupil from the optical axis of the objective is chosen to be greater than the distance of the focus of the stimulation light beam in the objective pupil from the optical axis.
  • the sample is optically excited in a relatively wide layer adjacent to the cover glass or slide, and by the stimulating light beam in a relatively narrower layer adjacent to the slide or cover glass - overlapping with the first layer - by the relatively deeper penetrating excitation light beam. Layer stimulated, optically excited, so that ultimately only fluorescence photons from the part of the layer illuminated with the excitation light beam that is not spatially superimposed by the stimulation light beam are ultimately detected.
  • the sample is evanescently illuminated by the excitation light beam and is optically stimulated by the directly illuminated stimulation light beam.
  • the stimulation light beam is preferably manipulated in such a way that the focus of the stimulation light beam is hollow on the inside.
  • a hollow focus is, for example, with the help of phase filters, which are arranged in a plane conjugate to the focal plane of the objective (Fourier plane).
  • a ⁇ / 2 plate can function as a phase filter, for example, which is over-illuminated by the stimulation light beam, so that only the inner partial region of the stimulation light beam runs through the ⁇ / 2 plate, while the outer ring runs past the ⁇ / 2 plate.
  • the fluorescence photons are detected which originate from the portion of the sample which is evanescently illuminated by the excitation light beam and which lies inside the hollow focus of the stimulation light beam.
  • the sample can be scanned with a very high spatial resolution.
  • the spatial resolution is due to the The penetration depth of the evanescently illuminated excitation light beam is given (for example 100 nm), while in the axial directions the resolution is determined by the dimensions of the hollow focus.
  • the focus of the stimulation light beam is preferably guided with a beam deflection device, preferably in a meandering shape, above or through the sample.
  • the stimulation light beam further excites the already excited sample regions in a third excitation state.
  • This variant is also suitable for achieving a high spatial resolution.
  • the first illuminating light beam and / or the second illuminating light beam is preferably pulsed in time.
  • at least one pulsed light source such as a modem-coupled pulse laser (e.g. titanium sapphire laser)
  • a modem-coupled pulse laser e.g. titanium sapphire laser
  • the use of pulsed semiconductor lasers or regenerative amplifiers is also possible, for example.
  • Illumination light beams are pulsed in time, the time interval between the pulses of the first illumination light beam and the pulses of the second illumination light beam being adjustable.
  • two light sources can be synchronized with one another, the time interval between the pulses being adjustable by means of adjustable delay lines.
  • the light of the first illuminating light beam and the light of the second illuminating light beam can originate from a single light source which emits a primary light beam to be split, it being possible for a change in wavelength (OPO; microstructured fiber; frequency multiplication) or.
  • OPO microstructured fiber
  • frequency multiplication To be provided in the split light branches there is a change in performance (e.g. amplifier or attenuator).
  • the microscope according to the invention preferably has at least one Multi-line light source and / or at least one broadband light source.
  • the wavelengths or are preferably the wavelength of the first illuminating light beam and / or the second
  • Illumination light beam adjustable It is possible according to the invention that the first illuminating light beam and also the second illuminating light beam can contain light of one or more wavelengths, the wavelengths of the first illuminating light beam and the second
  • Illumination light beam adjustable it is advantageous if the opening angle of the illuminating light beam bundle converging to form a focus lying in the objective pupil can be adjusted.
  • the size of the surface that is illuminated evanescently changes. If one selects the area of the area evanescently illuminated by the stimulation light beam so that it is smaller than the area illuminated by the evanescent excitation illuminating light beam, one can directly compare the fluorescence properties of sample layers in the immediate vicinity of the slide surface to the fluorescence properties of sample layers in lower layers receive.
  • the sample is illuminated with an evanescent excitation illumination with a relatively high penetration depth.
  • stimulation light beam which has a small penetration depth (larger entry angle into the slide)
  • a fluorescence is stimulated directly on the slide.
  • the fluorescence image is recorded later (time-gated CCD), so that only fluorescence photons from deeper sample layers are detected.
  • the setting of the respective depths can even be adjusted by changing the radial positions of the two Illumination light focus in the lens pupil can be varied.
  • TIRF the illuminating light intensity in the sample decreases exponentially with the depth of penetration.
  • the STED effect is all the more effective directly on the slide surface, so that, for example, sample layers from a depth of 100 nm can be measured.
  • Bandpass filters and / or edge filters are preferably arranged in front of the detector (for example a multiband detector), which can be configured, for example, as a camera, and are matched to the respective emission focal length of the fluorescence signal.
  • A can be used for color selection.
  • dispersive element can be provided that generates a spectral splitting from which the wavelength components to be detected are masked out.
  • the detector can also be designed as a color detector, for example as a color camera. It is also possible for a dispersive element to split the detection light over several detectors in order to achieve spectral detection.
  • the microscope comprises a scanning microscope; especially a confocal scanning microscope.
  • Fig. 1 An inventive microscope and
  • Fig. 2 shows a detailed view of a microscope according to the invention
  • the first illuminating light beam arrives at a first beam deflection device 5, which contains a gimbal-mounted rotating mirror 7, and is guided by this beam deflection device to a first optics 9, a second optical system 11 and a third optical system 13 and guided by a beam splitter 15, which is designed as a dichroic beam splitter 17, to the microscope objective 19.
  • the microscope objective 19 has a rear focal plane (objective pupil plane 21).
  • the first illuminating light beam 3 has a focus 23 shown as a point in the objective pupil plane 21.
  • the illuminating light beam 3 is coupled into a specimen slide 27 for the evanescent illumination of the sample 25.
  • An immersion means 29 is located between the specimen slide and the objective 19.
  • the microscope has a second light source 31, which emits a second illuminating light beam 33.
  • the second illuminating light beam 33 reaches the first optics 9, the second optics 11 and the third optics 13 via a second beam deflection device 35, which contains a second gimbal-mounted rotating mirror 37, and is directed by the beam splitter 15 to the microscope objective 19.
  • the second illuminating light beam 33 has a focus 39 in the objective pupil plane.
  • the second illuminating light beam 33 is also coupled into the specimen slide 27 for evanescent sample illumination.
  • the first illuminating light beam leaves the microscope objective 19 at an angle ⁇ to the optical axis 41 of the objective 19, while the second illuminating light beam 33 leaves the objective 19 at an angle ⁇ .
  • the angle ⁇ can be adjusted by changing the distance between the first focus 23, the first illuminating light beam 3 and the optical axis 41 of the objective 19.
  • the angle ⁇ can be adjusted by changing the distance of the second focus 39 from the optical axis 41.
  • the position of the first focus 23 and the second focus 39 is set with the aid of the first beam deflection device 5 or with the aid of the second beam deflection device 35, which are preferably each arranged in a plane corresponding to the objective pupil plane 21.
  • the first beam deflection device 5 can be used with the aid of the first beam deflection device 5 or
  • the respective penetration depth of the first illuminating light beam 3 and the second illuminating light beam 33 can be set with the aid of the second beam deflection device 35.
  • the first illuminating light beam 3 is an excitation light beam 43, while the second illuminating light beam 33 is a stimulating beam 45.
  • the excitation light beam 43 excites a first layered sample area of the sample 25.
  • the stimulation light beam 45 has light of a wavelength that is suitable for triggering a stimulated emission of excited sample molecules.
  • the penetration depth of the evanescent stimulation illumination light is less than the penetration depth of the evanescent stimulation illumination light.
  • the first light source 1 is designed as a pulsed titanium sapphire laser 47.
  • the second light source 31 is also pulsed and contains a titanium sapphire laser, not shown, which feeds an OPO (optical parametric oscillator), not shown.
  • the first light source 1 and the second light source 31 are synchronized with one another in such a way that a sample excitation takes place first with a pulse of the excitation light beam 3 and then a stimulated emission is triggered with the light of the stimulation light beam 31 in a sample layer overlapping with the excitation layer.
  • the detector 51 which is designed as a CCD camera 53, detects the fluorescence photons that come from the excitation area of the excitation light beam 3 that is not acted upon by the light from the stimulation light beam 31.
  • the detection light 55 originating from this area passes through the microscope objective 19 to the beam splitter 15, passes it, and then hits the CCD camera 53.
  • FIG. 2 shows a detailed view of a microscope according to the invention for carrying out the method according to the invention.
  • Illumination light beam 3 which is an excitation light beam 43, is focused to a first focus 23. After going through the Microscope objective 19 (indicated by dashed lines), the excitation light beam leaves the objective as a parallel beam and is coupled into a slide 27 for evanescent sample illumination.
  • a second illuminating light beam 33 which is a stimulating light beam 45, is focused to a second second 39 lying in the objective pupil plane 21. After passing through the objective 19 (indicated by dashed lines), the stimulation light beam 45 leaves as a parallel beam.
  • the excitation light beam 43 leaves the lens 19 at a larger angle to the optical axis of the lens than the stimulation light beam 45; accordingly, the depth of penetration of the light of the excitation light bundle 43 into the sample 25 is greater than the penetration depth of the light of the stimulation light bundle 45 of the stimulating light beam 45 has an aperture angle ⁇ 2 that is smaller than, and consequently the diameter of the lens 19 exits
  • Excitation light beam bundle larger than the diameter of the stimulation light beam bundle 45 leaving the objective 19. Accordingly, the axial area of the sample 25 evanescently illuminated by the excitation light beam bundle 43 is larger than the sample area evanescently illuminated by the stimulation light beam bundle 45. With this arrangement it is possible to make comparisons of the fluorescence properties of sample layers in the immediate vicinity of the specimen slide 27 and layers located deeper.
  • the first sample region 57 which is evanescently illuminated by the excitation light beam 43, is optically excited by the light of the excitation light beam 43 (shown with hatching).
  • the second sample area 59 evanescent from the stimulation light beam 45 is smaller than the first sample area 57 and at least partially overlaps it.
  • a stimulated emission is triggered in this second sample area 59 and only then is the spontaneously emitted photons detected with the (not shown) (gated) detector.
  • the detected photons essentially originate from that part of the first sample area 57 which does not overlap with the second sample area 59.

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Abstract

Ein Mikroskop mit einem ersten und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl (3, 38) zum Beleuchten einer Probe (25) ist dadurch gekennzeichnet, dass der erste und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl (3, 33) die Probe (25) evaneszent beleuchtet. Zur CARS-Untersuchung kann der erste Beleuchtungslichtstrahl ein Pumplichtstrahl (43) und der zweite Beleuchtungslichtstrahl ein Stokeslichtstrahl (45) sein. Zur Erzielung einer Auflösungssteigerung kann der erste Beleuchtungslichtstrahl ein Anregungs und der zweite Beleuchtungslichtstrahl ein Stimulationslichtstrahl sein.

Description

Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung
Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem ersten und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur - insbesondere mikroskopischen -Untersuchung einer Probe.
Aus US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt.
Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
Aus DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt.
Aus DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF- Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 °- d)/60 °. Aus DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden. Aus US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar. Aus DE 10229 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dabei wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF- Verfahren geeignet.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt. Anordnungen, die das Auflösungsvermögen eines konfokalen Rastermikroskops ist unter anderem durch die Intensitätsverteilung und die räumliche Ausdehnung des Fokus des Anregungslichtstrahls gegeben. Eine Anordnung zur Steigerung des Auflösungsvermögens für Fluoreszenzanwendungen ist aus der PCT/DE/95/00124 bekannt. Hierbei werden die lateralen Randbereiche des Fokusvolumens des Anregungslichtstrahls mit einem Lichtstrahl einer anderen Wellenlänge, dem sog. Stimulationslichtstrahl, der von einem zweiten Laser emittiert wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche stimuliert in den Grundzustand zurück zu bringen. Detektiert wird dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten Laser beleuchteten Bereichen, so daß insgesamt eine Auflösungsverbesserung erreicht wird. Für dieses Verfahren hat sich die Bezeichnung STED (Stimulated Emission Depletion) eingebürgert.
Beispielsweise aus US 2002/0167724 A1 und aus US 6,667,830 B1 ist eine Variante der STED-Technik bekannt, bei der die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche mit dem Licht des zweiten Lasers zunächst weiter - nämlich in einen dritten Zustand - angeregt werden. Bei dieser Variante, für die sich auch der Begriff „up-conversion" eingebürgert hat, wird äquivalent zu der Variante der direkten stimulierten Abregung in den Grundzustand eine Auflösungssteigerung erzielt.
Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)-Mikroskopie ist eine Technik, die zunehmend an Bedeutung gewinnt. Ein großer Vorteil ist, dass die Proben nicht mit Farbstoffen markiert werden müssen. Außerdem können lebende Zellen untersucht werden. Im Vergleich zur herkömmlichen Raman-Mikroskopie und der bekannten konfokalen Raman-Mikroskopie kann man bei der CARS-Mikroskopie eine höhere Ausbeute an Detektionslicht erzielen, störende Nebeneffekte besser unterdrücken und das Detektionslicht leichter vom Beleuchtungslicht trennen. Für die konventionelle konfokale Raman-Spektroskopie wird ein Detektionspinhole benötigt, um eine gute axiale Auflösung zu erreichen, sowie ein hochauflösendes Spektrometer. CARS dagegen ist ein nichtlinearer optischer Prozess (Vierwellen-Mischprozess). Ähnlich, wie bei der Multiphotonen-Mikroskopie, bei der zwei oder mehr Photonen gleichzeitig absorbiert werden, wird, da die Wahrscheinlichkeit des Phasenrichtigen gleichzeitigen Zusammentreffens mehrer Photonen im Fokus auf Grund der höheren Photonendichte am größten ist, kein Detektionspinhole benötigt. Ohne Detektionspinhole wird die gleiche axiale Auflösung erzielt wie bei der Multiphotonen-Mikroskopie. Für die CARS-Spektroskopie werden üblicherweise 2 Laser, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren (vP und vs, Pump- und Stokeslaser), benutzt, wobei vs durchstimmbar sein sollte, um ein CARS-Spektrum VCARS ZU erzeugen (VCARS =2VP - vs, ICARS ~ (lp)2 ls)- Stimmt die Differenzfrequenz vP - vs mit der Differenzfrequenz zwischen zwei molekularen Vibrationszuständen |l) und |θ) in der Probe überein, so ist das
CARS-Signal sogar noch verstärkt. Der Pumplichtstrahl und der Stokeslichtstrahls werden bei mikroskopischen Anwendungen koaxial vereinigt und gemeinsam auf dasselbe Probenvolumen fokussiert. Die Richtung, in der die Anti-Stokes-Strahlung emittiert wird, ergibt sich aus der Phasenanpassungsbedingung für den Vier-Wellen-Mischprozess.
Aus der US-Patentschrift 4,405,237 „Coherent anti-Stokes Raman device" ist eine Vorrichtung bekannt, bei der zwei gepulste Laserstrahlen, die von zwei Lasern erzeugt werden und die unterschiedliche Wellenlängen im sichtbaren Bereich oder im UV-Bereich des Spektrums aufweisen, genutzt werden, um eine Probe simultan zu beleuchten. Bei geeigneter Wahl der Wellenlängen kann die Probe derart angeregt werden, dass sie die charakteristische Coherent anti-Stokes Raman-Strahlung emittiert. Aus James W.M. Chon, Min Gu, „Scanning total internal reflection fluorescence microscopy under one-photon and two-photon excitation : Image formation", Appl. Opt. 43, 1063-1071 , 2004 und aus Florian Schapper, Jose T. Gongalves, Martin Oheim, "Fluorescence imaging with two-photon evanescent wave excitation", Eur. Biophys. J. 32, 635-643, 2003 ist bekannt eine evaneszent beleuchtete Probe über einen Zweiphotonenprozess anzuregen.
Die bislang bekannten Techniken zur evaneszenten Probenbeleuchtung erlauben lediglich die Probenschichten zu untersuchen, die direkt an das Deckglas bzw. direkt an den Objektträger angrenzen.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mikroskop anzugeben, das eine weitgehend flexible Probenuntersuchung, insbeondere auch der Bereiche, die nicht unmittelbar an das Deckglas oder an den Objektträger angrenzen, zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der erste und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl die Probe evaneszent beleuchtet.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur - insbesondere rastermikroskopischen - Untersuchung einer Probe anzugeben, die weitgehend flexibel ist und sich nicht auf die Probenschichten beschränkt, die unmittelbar an das Deckglas bzw. an den Objektträger angrenzen. Die weitere Aufgabe wird durch ein Verfahren zur - insbesondere mikroskopischen -Untersuchung einer Probe mit folgenden Schritten gelöst: • Erzeugen eines ersten und eines zweiten Beleuchtungslichtstrahls • Beleuchten der Probe mit dem der ersten und der zweite Beleuchtungslichtstrahl, wobei zumindest der erste Beleuchtungslichtstrahl die Probe evaneszent beleuchtet.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante weist das Mikroskop ein Objektiv mit einer Objektivpupille auf, wobei der erste und/oder der zweite
Beleuchtungslichtstrahlenbündel im Bereich der Objektivpupille einen Fokus aufweist. Vorzugsweise ist ein Einstellmittel vorgesehen, mit dem die räumliche Position des Fokus innerhalb der Ebene der Objektivpupille veränderbar ist. Das Einstellmittel kann beispielsweise eine Strahlablenkeinrichtung mit mehreren Dreh- oder Kippspiegeln oder mit einem kardanisch aufgehängten Spiegel umfassen. Das Einstellmittel kann auch als akustooptisches Element ausgebildet sein oder Mikrospiegel beinhalten. Zum Einstellen der räumlichen Position des Fokus des ersten und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahlenbündels kann auch eine verschiebbare Lichtleitfaser dienen.
Der Winkel bezüglich der optischen Achse des Objektivs, unter dem der zur evaneszenten Beleuchtung der Probe vorgesehene
Beleuchtungslichtstrahlenbündel das Objektiv verlässt, hängt von der räumlichen Position des Fokus in der Objektivpupille ab. Der Winkel ist umso größer, je größer der Abstand des jeweiligen Fokus von der optischen Achse ist. Daher ist erfindungsgemäß insbesondere der Abstand des Fokus von der optischen Achse des Objektivs zur Einstellung des Winkels und damit zur Einstellung der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in die Probe einstellbar.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops ist um eine CARS-Untersuchung einer Probe zu realisieren. Der erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel, ein Pumplichtstrahl und der zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel, ein Stokeslichtstrahls.
In einer anderen, ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Rastermikroskops ist insbesondere zur Erzielung einer hohen Ortsauflösung das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel ein Anregungslichtstrahlenbündel zur optischen Anregung eines ersten Probenbereichs und der zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel ein Stimulationslichtstrahlenbündel zum Auslösen einer stimulierten Emission oder zum Auslösen einer weiteren Anregung, wobei die stimulierte Emission und/oder die weitere Anregung in einem weiteren zumindest teilweise mit dem ersten Probenbereich überlappenden Probenbereich stattfindet.
Besonders bevorzugt ist eine Variante, bei der das Anregungslichtstrahlenbündel und das Stimulationslichtstrahlenbündel beide die Probe evaneszent beleuchten, wobei das Anregungslichtstrahlenbündel eine größere Eindringtiefe aufweist als das Stimulationslichtstrahlenbündel. Um dies zu realisieren, wird der Abstand des Fokus des Anregungslichtstrahlenbündels in der Objektivpupille von der optischen Achse des Objektivs größer gewählt, als der Abstand des Fokus des Stimulationslichtstrahlenbündels in der Objektivpupille von der optischen Achse. Durch den relativ tiefer eindringenden Anregungslichtstrahlenbündel wird die Probe in einer an das Deckglas bzw. an den Objektträger angrenzenden relativ breiten Schicht optisch angeregt und durch den Stimulationslichtstrahl in einer relativ schmaleren, an den Objektträger bzw. an das Deckglas angrenzenden -mit der ersten Schicht überlappenden- Schicht stimuliert, optisch abgeregt, so dass letztlich weitgehend ausschließlich Fluoreszenzphotonen aus dem Teil der mit dem Anregungslichtstrahlenbündel beleuchteten Schicht detektiert werden, die nicht von dem Stimulationslichtstrahlenbündel beleuchteten Schicht räumlich überlagert ist.
In einer anderen erfindungsgemäßen Variante wird die Probe von dem Anregungslichtstrahlenbündel evaneszent beleuchtet und von dem direkt beleuchteten Stimulationslichtstrahlenbündel optisch stimuliert abgeregt. Das Stimulationslichtstrahlenbündel ist hierbei vorzugsweise derart manipuliert, dass der Fokus des Stimulationslichtstrahlenbündels innen hohl ausgebildet ist. Ein Hohlfokus ist beispielsweise mit Hilfe von Phasenfiltern, die in einer zur Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene (Fourierebene) angeordnet sind. Als Phasenfilter kann beispielsweise eine λ/2-Platte fungieren, die von dem Stimulationslichtstrahl überleuchtet wird, so dass nur der innere Teilbereich des Stimulationslichtstrahlenbündels durch die λ/2-Platte verläuft, während der äußere Ring an der λ/2-Platte vorbei verläuft. Letztlich werden die Fluoreszenzphotonen detektiert, die aus dem vom Anregungslichtstrahlenbündel evaneszent beleuchteten Teilbereich der Probe stammen, der im inneren des Hohlfokus des Stimulationslichtstrahlenbündels liegt. Auf diese Weise kann eine Abrasterung der Probe mit einer sehr hohen Ortsauflösung erfolgen. In z-Richtung ist die Ortsauflösung durch die Eindringtiefe des evaneszent beleuchteten Anregungslichtstrahls gegeben (z.B. 100 nm), während in den axialen Richtungen das Auflösungsvermögen durch die Abmessungen des Hohlfokus bestimmt sind. Zum Abrastern der Probe wird der Fokus des Stimulationslichtstrahlenbündels vorzugsweise mit einer Strahlablenkeinrichtung, vorzugsweise mäanderförmig über bzw. durch die Probe geführt.
In einer besonderen Ausgestaltungsvariante erfolgt durch das Stimulationslichtstrahlenbündel eine weitere Anregung der bereits angeregten Probeπbereiche in einem dritten Anregungszustand. Auch diese Variante ist geeignet, um eine hohe Ortsauflösung zu erzielen.
Vorzugsweise ist das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel und/oder das zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel zeitlich gepulst. Hierzu kann beispielsweise zumindest eine gepulste Lichtquelle, wie ein modemverkuppelter Pulslaser (z.B. Titansaphirlaser) vorgesehen sein. Auch die Verwendung von gepulsten Halbleiterlasern oder von regenerativen Verstärkern ist beispielsweise möglich.
Von besonderem Vorteil ist eine Ausgestaltungsform, bei der das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel und das zweite
Beleuchtungslichtstrahlenbündel zeitlich gepulst sind, wobei der zeitliche Abstand der Pulse des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu den Pulsen des zweiten Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar ist. In dieser Variante können beispielsweise zwei Lichtquellen aufeinander synchronisiert sein, wobei der zeitliche Abstand der Pulse durch einstellbare Verzögerungsstrecken einstellbar ist. In einer anderen Variante kann auch das Licht des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels und das Licht des zweiten Beleuchtungslichtstrahlenbündels von einer einzigen Lichtquelle entstammen, die einen aufzuteilenden Primärlichtstrahl emittiert, wobei vorgesehen sein kann, dass in den aufgeteilten Lichtzweigen eine Wellenlängenveränderung (OPO; mikrostrukturierte Faser; Frequenzvervielfachung) oder eine Leistungsveränderung (z.B. Verstärker oder Abschwächer) erfolgt.
Das erfindungsgemäße Mikroskop weist vorzugsweise zumindest eine Mehrlinienlichtquelle und/oder zumindest eine Breitbandlichtquelle auf. Vorzugsweise sind die Wellenlängen bzw. ist die Wellenlänge des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels und/oder des zweiten
Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar. Es ist erfindungsgemäß möglich, dass der erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel und auch der zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel Licht einer oder mehrerer Wellenlängen beinhalten kann, wobei sich die Wellenlängen des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels und des zweiten
Beleuchtungslichtstrahlenbündels voneinander unterscheiden können. In einer besonders bevorzugten Variante ist der Durchmesser des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels und/oder des zweiten
Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar. Insbesondere ist es von Vorteil, wenn der Öffnungswinkel des zu einem in der Objektivpupille liegenden Fokus zusammenlaufenden Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar ist. Durch Änderung des Öffnungswinkels bei der Fokussierung in die Objektivpupille ändert sich die Größe der Fläche, die evaneszent beleuchtet wird. Wählt man die Fläche der durch den Stimulationslichtstrahl evaneszent beleuchteten Fläche so, dass sie kleiner ist als die von dem evaneszent anregenden Beleuchtungslichtstrahlenbündel beleuchtete Fläche, so kann man einen direkten Vergleich der Fluoreszenzeigenschaften von Probenschichten in unmittelbarer Nähe der Objektträgeroberfläche zu den Fluoreszenzeigenschaften von Probenschichten in tiefergelegenen Schichten erhalten.
Bei einer vorteilhaften Variante wird die Probe mit einer evaneszenten Anregungs-Beleuchtung mit einer relativ hohen Eindringtiefe beleuchtet werden. Mit einer evaneszenten STED-Beleuchtung
(Stimulationslichtstrahlenbündel), die eine geringe Eindringtiefe aufweist (größerer Eintrittswinkel in den Objektträger), wird eine Fluoreszenz direkt am Objektträger stimuliert abgeregt. Die Aufnahme des Fluoreszenzbildes erfolgt zeitlich später (time-gated CCD), so dass nur Fluoreszenzphotonen aus tiefer liegenden Probenschichten detektiert werden. Die Einstellung der jeweiligen Tiefen sind sogar einstellbar, indem die radialen Positionen der beiden Beleuchtungslichtfokusse in der Objektivpupille variiert werden. Die Beleuchtungslichtintensität in der Probe nimmt bei TIRF exponentiell mit der Eindringtiefe ab. Umso effektiver ist der STED-Effekt direkt an der Objektträgeroberfläche, so dass z.B. Probenschichten ab 100nm Tiefe vermessen werden können.
Vorzugsweise sind vor dem Detektor (beispielsweise Multibanddetektor), der beispielsweise als Kamera ausgestaltet sein kann, Bandpassfilter und/oder Kantenfilter angeordnet auf die jeweilige Emissionsbrandweite des Fluoreszenzsignals durch abgestimmt sind. Zur Farbselektion kann ein. dispersives Element vorgesehen sein, dass eine spektrale Aufspaltung erzeugt, aus der die zu detektierenden Wellenlängenanteile ausgeblendet werden. Der Detektor kann auch als Farbdetektor, beispielsweise als Farbkamera ausgestaltet sein. Genauso ist es möglich, dass ein dispersives Element das Detektionslicht auf mehrere Detektoren aufteilt, um eine Spektraldetektion zu erreichen.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mikroskop ein Rastermikroskop; insbesondere ein konfokales Rastermikroskop.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 Ein erfindungsgemäßes Mikroskop und
Fig. 2 Eine Detailansicht eines erfindungsgemäßen Mikroskops zur
Erläuterung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop mit einer ersten Lichtquelle 1 , die ein erstes Beleuchtungslichtstrahlenbündel 3 erzeugt. Das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel gelangt zu einer ersten Strahlablenkeinrichtung 5, die einen kardanisch aufgehängten Drehspiegel 7 beinhaltet und wird von dieser Strahlablenkeinrichtung zu einer ersten Optik 9, einer zweiten Optik 11 und einer dritten Optik 13 geführt und von einem Strahlteiler 15, der als dichroitischer Strahlteiler 17 ausgeführt ist, zu dem Mikroskopobjektiv 19 gelenkt. Das Mikroskopobjektiv 19 weist eine hintere Brennebene (Objektivpupillenebene 21) auf. Das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel 3 weist in der Objektivpupillenebene 21 einen als Punkt dargestellten Fokus 23 auf. Das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 3 wird zur evaneszenten Beleuchtung der Probe 25 in einen Objektträger 27 eingekoppelt. Zwischen dem Objektträger und dem Objektiv 19 befindet sich ein Immersionsmittel 29. Das Mikroskop weist eine zweite Lichtquelle 31 , die ein zweites Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33 emittiert auf. Das zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33 gelangt über eine zweite Strahlablenkeinrichtung 35, die einen zweiten kardanisch aufgehängten Drehspiegel 37 beinhaltet, zur ersten Optik 9, zur zweiten Optik 11 und zur dritten Optik 13 und wird von dem Strahlteiler 15 zum Mikroskopobjektiv 19 gelenkt. Das zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33 weist in der Objektivpupillenebene einen Fokus 39 auf. Das zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33 wird ebenfalls zur evaneszenten Probenbeleuchtung in den Objektträger 27 eingekoppelt. Das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel verlässt das Mikroskopobjektiv 19 unter einem Winkel α zur optischen Achse 41 des Objektivs 19, während das zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33 das Objektiv 19 unter einem Winkel ß verlässt. Der Winkel α ist durch Verändern des Abstandes des ersten Fokus 23, des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels 3 zur optischen Achse 41 des Objektivs 19 einstellbar. Analog ist der Winkel ß durch Verändern des Abstandes des zweiten Fokus 39 von der optischen Achse 41 einstellbar. Die Einstellung der Position des ersten Fokus 23 und des zweiten Fokus 39 erfolgt mit Hilfe der ersten Strahlablenkeinrichtung 5 bzw. mit Hilfe der zweiten Strahlablenkeinrichtung 35, die vorzugsweise jeweils in einer zur Objektivpupillenebene 21 korrespondierenden Ebene angeordnet sind. Da die Eindringtiefe der evaneszenten Beleuchtung direkt vom Winkel α bzw. vom Winkel ß abhängt, kann mit Hilfe der ersten Strahlablenkeinrichtung 5 bzw. mit Hilfe der zweiten Strahlablenkeinrichtung 35 die jeweilige Eindringtiefe des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels 3 und des zweiten Beleuchtungslichtstrahlenbündels 33 eingestellt werden.
In dieser Ausgestaltungsvariante ist das erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel 3 ein Anregungslichtstrahlenbündel 43, während das zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33 ein Stimulationsstrahlenbündel 45 ist. Das Anregungslichtstrahlenbündel 43 regt einen ersten schichthaften Probenbereich der Probe 25 an. Das Stimulationslichtstrahlenbündel 45 weist Licht einer Wellenlänge auf, die zum Auslösen einer stimulierten Emission angeregter Probenmoleküle geeignet ist. Die Eindringtiefe des evaneszenten Stimulationsbeleuchtungslichtes ist in dieser Variante geringer als die Eindringtiefe des evaneszenten Anregungsbeleuchtungslicht.es. Die erste Lichtquelle 1 ist als gepulster Titansaphirlaser 47 ausgeführt. Die zweite Lichtquelle 31 ist ebenfalls gepulst und beinhaltet einen nicht gezeigten Titansaphirlaser, der einen nicht gezeigten OPO (Optisch parametrischen Oszillator) speist. Die erste Lichtquelle 1 und die zweite Lichtquelle 31 sind derart aufeinander synchronisiert, dass zunächst mit einem Puls des Anregungslichtstrahlenbündels 3 eine Probenanregung erfolgt und anschließend mit dem Licht des Stimulationslichtstrahlenbündels 31 in einer mit der Anregungsschicht überlappenden Probenschicht eine stimulierte Emission ausgelöst wird. Letztlich detektiert werden von dem Detektor 51 , der als CCD-Kamera 53 ausgeführt ist, die Fluoreszenzphotonen, die aus dem nicht von dem Licht des Stimulationslichtstrahlenbündels 31 beaufschlagten Anregungsbereich des Anregungslichtstrahlenbündels 3 stammen. Das aus diesem Bereich stammende Detektionslicht 55 gelangt durch das Mikroskopobjektiv 19 zu dem Strahlteiler 15, passiert diesen, um anschließend auf die CCD-Kamera 53 zu treffen.
Fig 2 zeigt eine Detailansicht eines erfindungsgemäßen Mikroskops zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Ein erstes
Beleuchtungslichtstrahlenbündel 3, das ein Anregungslichtstrahlenbündel 43 ist, ist zu einem ersten Fokus 23 fokussiert. Nach Durchlaufen des Mikroskopobjektivs 19 (gestrichelt angedeutet) verlässt das Anregungslichtstrahlenbündel das Objektiv als Parallelstrahlenbündel und wird zur evaneszenten Probenbeleuchtung in einen Objektträger 27 eingekoppelt. Ein zweites Beleuchtungslichtstrahlenbündel 33, das ein Stimulationslichtstrahlenbündel 45 ist, wird zu einem zweiten in der Objektivpupillenebene 21 liegenden zweiten Fokus 39 fokussiert. Nach Durchlaufen des Objektivs 19 (gestrichelt angedeutet) verlässt das Stimulationslichtstrahlenbündel 45 als Parallelstrahlenbündel. Das Anregungslichtstrahlenbündel 43 verlässt das Objektiv 19 unter einem größeren Winkel zur optischen Achse des Objektivs als das Stimulationslichtstrahlenbündel 45; demgemäss ist die Eindringtiefe des Lichtes des Anregungslichtstrahlenbündels 43 in die Probe 25 größer als die Eindringtiefe des Lichtes des Stimulationslichtstrahlenbündels 45. Der zu dem ersten Fokus 23 des Anregungslichtstrahlenbündels 43 zusammenlaufende Lichtkegel weist einen Öffnungswinkel (^ auf, während der zu dem zweiten Fokus 39 zusammenlaufende Lichtkegel des Stimulationslichtstrahlenbündels 45 einen Öffnungswinkel φ2 aufweist, der kleiner als ist; folglich ist der Durchmesser des das Objektiv 19 verlassenden
Anregungslichtstrahlenbündels größer als der Durchmesser des das Objektiv 19 verlassenden Stimulationslichtstrahlenbündels 45. Demgemäss ist die von dem Anregungslichtstrahlenbündel 43 evaneszent beleuchtete axiale Fläche der Probe 25 größer als die von dem Stimulationslichtstrahlenbündel 45 evaneszent beleuchtete Probenfläche. Mit dieser Anordnung ist es möglich, Vergleiche der Fluoreszenzeigenschaften von Probenschichten in unmittelbarer Nähe des Objektträgers 27 und tiefer gelegener Schichten zu ziehen. Der von dem Anregungslichtstrahlenbündel 43 evaneszent beleuchtete erste Probenbereich 57 wird von dem Licht des Anregungslichtstrahlenbündels 43 optisch angeregt (schraffiert eingezeichnet). Der von dem Stimulationslichtstrahlenbündel 45 evaneszente zweite Probenbereich 59 ist kleiner als der erste Probenbereich 57 und überlappt zumindest teilweise mit diesem. In diesem zweiten Probenbereich 59 wird eine stimulierte Emission ausgelöst und erst danach die spontan emittierten Photonen mit dem nicht gezeigten (gegateten) Detektor detektiert. Die detektierten Photonen stammen im wesentlichen aus dem Teil des ersten Probenbereichs 57, der nicht mit dem zweiten Probenbereich 59 überlappt.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Bezugszeichenliste:
1 erste Lichtquelle
3 erstes Beleuchtungslichtstrahlenbündel 5 erste Strahlablenkeinrichtung
7 kardanisch aufgehängter Drehspiegel
9 erste Optik
11 zweite Optik
13 dritte Optik 15 Strahlteiler
17 dichroitischer Strahlteiler
19 Mikroskopobjektiv
21 Objektivpupillenebene 3 Fokus 5 Probe 7 Objektträger 9 Immersionsmittel 1 zweite Lichtquelle 3 zweites Beleuchtungslichtstrahlenbündel 5 zweite Strahlablenkeinrichtung 7 zweiter kardanisch aufgehängter Drehspiegel 9 Fokus 1 optische Achse 3 Anregungslichtstrahlenbündel 5 Stimulationsstrahlenbündel Titansaphirlaser Detektor Kamera Detektionslicht erster Probenbereich zweiter Probenbereich

Claims

Patentansprüche
1. Mikroskop mit einem ersten und einem zweiten Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl die Probe evaneszent beleuchtet.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein Objektiv mit einer Objektivpupille aufweist, und dass der erste Beleuchtungslichtstrahl und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl im Bereich der Objektivpupille einen Fokus aufweist.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein
Einstellmittel vorgesehen ist, mit dem die räumliche Position des Fokus innerhalb der Ebene der Objektivpupille veränderbar ist.
4. Mikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellmittel eine im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels angeordnete einstellbare Strahlablenkeinrichtung umfasst.
5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Fokus von der optischen Achse des Objektivs - insbesondere zur Einstellung der Eindringtiefe in die Probe bei evaneszenter Beleuchtung - einstellbar ist.
6. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur CARS-Untersuchung der erste
Beleuchtungslichtstrahl ein Pumplichtstrahl und der zweite Beleuchtungslichtstrahl ein Stokeslichtstrahl ist.
7. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl ein Aπregungslichtstrahl zum optischen Anregen eines ersten Probenbereichs ist und der zweite Beleuchtungslichtstrahl ein Stimulationslichtstrahl zum Auslösen einer stimulierten Emission oder einer weiteren Anregung in einem weiteren, zumindest teilweise mit dem ersten Probenbereich überlappenden Probenbereich, ist.
8. Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl und der Stimulationslichtstrahl die Probe evaneszent beleuchten und dass der Anregungslichtstrahl eine größere Eindringtiefe aufweist, als der Stimulationslichtstrahl.
9. Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Fokus des Anregungslichtstrahl von der optischen Achse des Objektivs größer ist, als der Abstand des Fokus Stimulationslichtstrahls von der optischen Achse.
10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl zeitlich gepulst ist.
11. Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl und der zweite Beleuchtungslichtstrahl zeitlich gepulst sind und dass die der zeitliche Abstand der Pulse des ersten Beleuchtungslichtstrahls zu den Pulsen des zweiten Beleuchtungslichtstrahls einstellbar ist.
12. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser des ersten Beleuchtungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls einstellbar ist.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop zumindest eine Mehrlinienlichtquelle und/oder zumindest eine Breitbandlichtquelle aufweist und die Wellenlänge bzw. die Wellenlängen des ersten Beleuchtungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls einstellbar ist.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein Rastermikroskop insbesondere ein konfokales Rastermikroskop ist.
15. Verfahren zur - insbesondere mikroskopischen -Untersuchung einer Probe mit folgenden Schritten: • Erzeugen eines ersten und eines zweiten Beleuchtungslichtstrahls • Beleuchten der Probe mit dem der ersten und der zweite Beleuchtungslichtstrahl, wobei zumindest der erste Beleuchtungslichtstrahl die Probe evaneszent beleuchtet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die
Beleuchtung durch das Objektiv eines Mikroskops erfolgt, wobei der erste Beleuchtungslichtstrahl und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl im Bereich der Objektivpupille des Objektivs einen Fokus aufweist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt: • Einstellen der räumliche Position des Fokus des ersten und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls innerhalb der Ebene der Objektivpupille mit einem Einstellmittel.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellmittel eine im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels angeordnete einstellbare Strahlablenkeinrichtung umfasst.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, gekennzeichnet durch den Schritt: • Einstellen der jeweiligen Eindringtiefe in die Probe bei evaneszenter Beleuchtung durch Einstellen des jeweiligen Abstandes des Fokus von der optischen Achse des Objektivs.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass zur CARS-Untersuchung der erste Beleuchtungslichtstrahl ein Pumplichtstrahl und der zweite Beleuchtungslichtstrahl ein Stokeslichtstrahl ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl ein Anregungslichtstrahl zum optischen Anregen eines ersten Probenbereichs ist und der zweite Beleuchtungslichtstrahl ein Stimulationslichtstrahl zum Auslösen einer stimulierten Emission oder einer weiteren Anregung in einem weiteren, zumindest teilweise mit dem ersten Probenbereich überlappenden Probenbereich, ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl und der Stimulationslichtstrahl die Probe evaneszent beleuchten und dass der Anregungslichtstrahl eine größere Eindringtiefe aufweist, als der Stimulationslichtstrahl.
23. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand des Fokus des Anregungslichtstrahl von der optischen Achse des Objektivs größer ist, als der Abstand des Fokus Stimulationslichtstrahls von der optischen Achse.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl und/oder der zweite Beleuchtungslichtstrahl zeitlich gepulst ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Beleuchtungslichtstrahl und der zweite Beleuchtungslichtstrahl zeitlich gepulst sind und dass die der zeitliche Abstand der Pulse des ersten Beleuchtungslichtstrahls zu den Pulsen des zweiten Beleuchtungslichtstrahls eingestellt wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser des ersten Beleuchtungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls einstellt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt: • Einstellen der Wellenlänge bzw. der Wellenlängen des ersten Beleuchtungslichtstrahls und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahls.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mikroskops, insbesondere eines Rastermikroskops oder eines konfokalen Rastermikroskops.
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