WO2008098875A1 - Mikroskop zur herkömmlichen fluoreszenzmikroskopie und zur totalinternen-reflexions-mikroskopie - Google Patents

Mikroskop zur herkömmlichen fluoreszenzmikroskopie und zur totalinternen-reflexions-mikroskopie Download PDF

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WO2008098875A1
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evanescent
coupling
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Andreas Hecker
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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Definitions

  • MICROSCOPY MICROSCOPE FOR CONVENTIONAL FLUORESCENCE MICROSCOPY AND TOTAL INTERNAL REFLECTION MICROSCOPY
  • the present invention relates to a microscope for conventional fluorescence microscopy (epi-fluorescence) and for total internal reflection microscopy, with at least one light source for the conventional fluorescence illumination and at least one light source for the evanescent illumination, and with a lens, which of the Illuminating light coming on different illumination paths on the light source via a beam combiner in the lens and from there to the sample, wherein the beam combiner is structured so that it in the geometrically separated beam paths in the.
  • the illuminating light used for conventional fluorescence illumination and the illuminating light for evanescent illumination Objectively directs.
  • the refraction behavior of light is used in the transition from an optically denser to an optically thinner medium.
  • a stationary evanescent wave forms in the medium with a lower refractive index.
  • the intensity of this well decreases exponentially with the distance to the interface. Because of this, fluorophores farther from the interface are not excited. The background fluorescence is considerably reduced. The image contrast is improved and the resolution is simultaneously increased significantly.
  • US 2002/0097489 A1 discloses a microscope with evanescent illumination of a sample.
  • the microscope includes a white light source whose light is coupled via a slit through the microscope objective into the specimen carrying slide for evanescent illumination.
  • the illumination light propagates in the slide by total internal reflection, whereby the illumination of the sample takes place only in the region of the projecting from the slide evanescent field.
  • Microscopes of this type are known by the term TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope).
  • TIRFM Total Internal Reflection Fluorescent Microscope
  • the objective consists of a first lens having a positive refractive power, a second lens having a negative refractive power, wherein the focal length ratio between the two lenses is in the range of -0.4 and -0.1 and the total refractive power is greater than zero. Furthermore, the lens includes two positive lenses whose focal diameter to focal length is greater than 0.3 and less than 0.6. Further, the objective includes a negative lens and a condenser lens, the negative lens facing the front group, and the focal length ratio of the negative lens and the condenser lens being between -0.5 and -2.
  • the incident illumination arrangement includes a source of illumination that is polarized in use
  • a microscope for TIRM Total Intemal Reflection Microscopy
  • the microscope has a microscope housing and a lens.
  • the illumination light emanating from a lighting device can be coupled in via an adapter which can be inserted into the microscope housing.
  • the illumination system includes a laser light source whose light is coupled into an optical fiber. Furthermore, a coupling-out optical system is provided, which focuses the light emerging from the fiber into a rear focal point of the microscope objective.
  • the optical fiber is displaceable in a plane perpendicular to the optical axis of the microscope objective.
  • a device for coupling light in a microscope is known. There, laser light is directed onto the specimen in the field diaphragm plane by means of an optical fiber coupling designed as a slide.
  • the invention is particularly suitable for the Tl RF method.
  • a sample In scanning microscopy, a sample is illuminated with a light beam to observe the detection light emitted by the sample, as reflection or fluorescent light.
  • Illuminating light beam is moved by means of a controllable beam deflecting device, generally by tilting two mirrors, in a sample plane, wherein the deflection axes are usually perpendicular to each other, so that one mirror deflects in x-, the other in the y-direction.
  • the tilting of the mirror is accomplished, for example, with the help of galvanometer actuators.
  • the performance of the object The coming detection light is measured as a function of the position of the scanning beam.
  • the control elements are equipped with sensors for determining the current mirror position.
  • an object with the focus of a light beam is scanned in three dimensions.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, a focusing optics with which the light of the source is focused on a pinhole - the so-called excitation diaphragm, a beam splitter, a beam deflector for beam control, a microscope optics, a detection diaphragm and the detectors for detecting the detection - or fluorescent light.
  • the illumination light is coupled in via a beam splitter.
  • the fluorescence or reflection light coming from the object passes back to the beam splitter via the beam deflector, passes through it, and is subsequently focused onto the detection aperture behind which the detectors are located.
  • This detection arrangement is called Descan arrangement.
  • Detection light that does not come directly from the focus region takes a different light path and does not pass through the detection aperture, so that one obtains point information that results in a three-dimensional image by sequentially scanning the object with the focus of the illumination light beam.
  • a three-dimensional image is achieved by layerwise image data acquisition.
  • the coupling of the evanescent illumination takes place regularly in the context of two-dimensional solutions, although the adjustment unit realized there is always designed in one dimension.
  • the coupling takes place for example via a so-called neutral divider, ie via a mirror which reflects to a certain extent and otherwise transmits.
  • the coupling via a dichroic splitter is known. It is a special mirror that reflects all other wavelengths down to a certain wavelength.
  • Coupling via a polarization divider to accomplish.
  • the lasers for the evanescent illumination (TIRF illumination) and the laser for the conventional epi-fluorescence illumination are polarized orthogonal to each other and brought together.
  • TIRF illumination TIRF illumination
  • the laser for the conventional epi-fluorescence illumination are polarized orthogonal to each other and brought together.
  • the hitherto known methods and devices for coupling one or more radiation sources to the evanescent illumination are problematic in practice, since the nature of the coupling leads to limitations of the specific properties of the radiation source used in each case.
  • the coupling via a neutral divider has the disadvantage that power losses occur both in the radiation source for the evanescent illumination and in the radiation source for the epi-fluorescence illumination.
  • Coupling via a dichroic divider is disadvantageous since it is necessary to define a specific wavelength or a specific wavelength range. If you want to change the wavelength in such a realization, so you have to make a change of Strahlver insectss or mirror.
  • the coupling via a polarization splitter also causes a serious disadvantage, since all components used must be polarization-preserving.
  • the use of a polarization splitter means waiving another degree of freedom in the radiation sources.
  • the coupling-in by means of small additional mirrors in the illumination beam path of the epi-fluorescence illumination is excluded from the very outset, since this is a one-dimensional solution.
  • the additional mirrors also lead to a partial coverage of the epi-fluorescence illumination, so that even insofar as this possibility for coupling is not acceptable.
  • a device for total internal reflection microscopy is known in which the beam combination of the conventional Epi fluorescence illumination serving illumination light and serving for the evanescent illumination light a Strahlveropter is provided, which is structured so that it serves an outer, transmitting area for the evanescent lighting illumination light and an inner, reflective area for the conventional fluorescent lighting serving Has illumination light.
  • the disadvantage here is that the areas of the Strahlverierss must be matched exactly to the lens used, so that a lens change without simultaneous change of Strahlver insectss is not possible. In that regard, every lens change is associated with an enormous adjustment effort.
  • the present invention is based on the object, a microscope for conventional fluorescence microscopy (epi-fluorescence) and for total internal reflection microscopy and further develop such that a coupling of the evanescent illumination without the disadvantages known from the prior art is possible.
  • the coupling should be done in a structurally simple manner and allow the automatic microscope operation even with changing operating parameters, especially with changing lenses, with a high degree of flexibility.
  • the microscopic microscope according to the invention achieves the above object by the features of claim 1.
  • the generic microscope is characterized in that the Strahlverutz at least two spatially separated zones for coupling the conventional fluorescent lighting serving illumination light and at least two spatially separated zones for has the coupling of serving for evanescent illumination light, the individual zones are matched in size and position to the lens pupils of different lenses.
  • the beam combiner does not have only one single area for the coupling of serving for conventional fluorescent lighting illumination light and a single area for the coupling of serving for evanescent illumination light illumination, but that at least two such areas are provided.
  • these areas are matched in size and position respectively to the objective pupil of different objectives. Accordingly, the microscope can be operated with different lenses, without a complex change of Strahlver insectss would be required. In particular, it is not necessary to readjust the beam path after each lens change. In addition, the entire structure is much easier, since for the Strahlverenberg no switching mechanism or the like, including an associated electronics, must be established.
  • the distance from the optical axis, with which the illuminating light serving for evanescent illumination must be coupled into a lens in order to realize total internal reflection illumination varies as a function of the objective pupil.
  • the objective pupil is calculated from the focal length and the numerical aperture of the underlying objective.
  • the beam combiner is preferably arranged in the plane of the objective pupil or a plane conjugate thereto or at least in the vicinity of such a plane.
  • the beam combiner is a structured mirror, namely a structured sectional mirror.
  • the reflective mirror surface can be vapor-deposited or otherwise generated.
  • the beam combiner is arranged on the optical axis between the light source for the evanescent illumination and the objective, and that the zones for coupling the illumination light used for conventional fluorescent lighting as reflecting surfaces and the zones for coupling the evanescent Lighting serving illumination light are designed as transmission surfaces. This makes it possible to mirror the illumination for the normal fluorescence over the mirror and to position the mirror for the evanescent illumination through the mirror in the objective pupil.
  • the two axes of the illumination light sources are reversed.
  • the beam combiner can be arranged on the optical axis between the light source for the conventional fluorescence illumination and the objective, the zones for the coupling of the illumination light serving for evanescent illumination then serving as reflection surfaces and the zones for coupling the illumination light serving for the conventional fluorescence illumination then executed as transmission surfaces.
  • any structures or geometries of the respective zones of the beam combiner are conceivable, whereby only the geometric separation of the two beam paths for the different types of illumination is important.
  • Very particular preference is given to an embodiment in which the individual zones of the beam combiner are designed as annular surfaces or elliptical annular surfaces extending coaxially with one another.
  • Also conceivable is an embodiment with angular surfaces, wherein the outer surfaces surround the inner surfaces as a whole or at least partially.
  • a change mechanism for the lenses may be provided, which is preferably designed as a revolver or as a slide.
  • a change mechanism for the Strahlverier may be provided, which may be equipped with beam combiners, which could be adapted in each case in the manner described above to different lens groups.
  • the exchange mechanism can already be equipped by the manufacturer or user side can be equipped according to the concrete applications to be made individual.
  • the ring surfaces of the beam combiner are matched in size and position to the objective pupil of at least two of the lenses provided with the changing mechanism.
  • a vote on two different objectives can be achieved by forming a total of four spatially separated annular surfaces, wherein two of the annular surfaces for reflecting / passing through the serving for evanescent illumination light and the other two annular surfaces for transmission / reflection of the serving for conventional fluorescent lighting illumination light serve.
  • the transition region may be partially translucent and partially reflective.
  • the transition region may be e.g. be designed in the sense of a neutral divider with all conceivable proportions depending on the application. It is also possible that the transition region is designed as a gradient mirror.
  • the reflectance or the transmittance of the beam combiner in the transition region has a step-shaped course.
  • the size and position of the annular surfaces and / or the transition regions of the Strahlverierss and thus the Strahlverier is also tunable in total depending on the refractive index of the sample to be examined solution or the sample itself.
  • an intermediate image with variable magnification can be provided between the beam combiner and the objective, so that the size of the pupil can be adapted to the beam combiner to a certain extent.
  • two or more light sources can also be used simultaneously for the conventional fluorescence illumination and / or for the evanescent illumination, whereby a corresponding coupling of the respective illumination light is possible.
  • a simultaneously operating laser can be used which has the function of a manipulation laser. This manipulation laser can be used for conventional epi-fluorescence excitation.
  • Fig. 2 is a schematic view of an embodiment of a usable in the arrangement of FIG. 1
  • Fig. 1 shows the basic structure of a microscope according to the invention, which is suitable both for conventional fluorescence microscopy (epi-fluorescence) and for total internal reflection microscopy. More specifically, Fig. 1 shows the illumination beam path with respect to the two modes.
  • the microscope comprises a light source 1 for the conventional fluorescence illumination and a light source 2 for the evanescent illumination, wherein a scanner 3 may be provided.
  • the microscope comprises an objective 4, wherein the illumination light coming from the light sources 1, 2 on different illumination paths 5, 6 passes through a beam combiner 7 into the objective and from there to the specimen 8.
  • the beam combiner is arranged in a plane conjugate to the plane 13 of the objective pupil.
  • FIG. 2 shows, in a schematic view together with FIG. 1, that the beam combiner 7 is structured in such a way that it illuminates the illumination light used for conventional fluorescence illumination and the illuminating light serving for the evanescent illumination in geometrically separate beam paths 5, 6 into the light beam Lens 4 conducts.
  • two spatially separated annular surfaces 9, 10 are provided for the coupling of the illumination light used for conventional fluorescent lighting and additionally two spatially separated annular surfaces 1 1, 12 for the coupling of the illumination used for evanescent lighting.
  • the beam combiner 7 is designed as a structured sectional mirror with a total of four spatially separated annular surfaces 9 to 12.
  • the individual annular surfaces 9 to 12 are matched in their size and position to the objective pupils of two different objectives, as will be explained in detail below.
  • the areas 9, 10 shown in black represent the mirrored part of the beam combiner 7, through which the epi-fluorescence illumination is placed on the optical axis becomes.
  • the areas 1 1, 12 shown in white are transparent to the light and serve to cover the TIRF illumination, in the context of an arrangement according to FIG. 1. It should be noted here that the beam combiner 7 has a structure as previously discussed inverted structure may have.
  • FIG. 3 shows three different embodiments of a beam combiner 7 for use in an arrangement according to FIG. 1, wherein in each case the profile of the transmittance or the degree of reflection as a function of the radial distance r from the optical axis of the objective 4 is shown.
  • the illustrations in Fig. 3 relate to an embodiment of the beam combiner 7 as shown in Fig. 2, i. with a coupling of the TIRF illumination in transmission and a coupling of the epi-fluorescence illumination in reflection.
  • the relative ratio of the reflectance to the transmittance of the beam combiner is plotted on the ordinate in FIG.
  • a mirrored annular surface or circular surface is initially provided which corresponds to the region 9 shown in black in FIG. 2. To the outside, this is followed by a permeable region for the evanescent illumination, which in FIG. 2 corresponds to the area 10 shown in white.
  • the two areas mentioned are adapted in size to a first lens 4a.
  • the radii of the reflective or permeable annular surfaces 9 and 1 1 are dimensioned.
  • the exemplary embodiment illustrated in FIG. 3b relates to a beam combiner 7 which has a total of six annular surfaces which are matched in their size and position to three different objectives 4a, 4b, 4c.
  • the objective 4a is a 100 ⁇ 1 .46 objective
  • the objective 4b is a 100 ⁇ 1 .46 objective
  • the objective 4c is a 63 ⁇ 1.46 objective.
  • further ring surfaces can be connected, which are matched to other lenses. Basically, the innermost ring surfaces are always tuned to the microscope with the smallest lens pupil and the outermost ring surfaces on the lens with the largest pupil.
  • transition region 14 is formed on the inner edge of the annular surfaces for coupling the illumination light serving for the evanescent illumination.
  • a step-shaped course of the reflectance is realized in each case.
  • FIG. 3 b Although only one stage is shown in FIG. 3 b per transition region 14 for reasons of clarity, several stages can also be implemented per transition region 14.
  • the provision of transition regions 14 offers the advantage of taking into account different refractive indices of the solution containing the sample to be examined or the sample itself.
  • Fig. 3c finally shows the same embodiment as shown in Fig. 3b, wherein instead of stepwise running transition regions gradually extending transition regions 14 are realized in the sense of gradient mirrors.
  • different transition regions can also be realized in one and the same beam combiner (7), thus, for example, a step-shaped and a gradually extending transition region or stepped transitional regions, each with a different number of stages.

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Abstract

Mikroskop zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie (Epi-Fluoreszenz) und zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie, mit mindestens einer Lichtquelle (1) für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und mindestens einer Lichtquelle (2) für die evaneszente Beleuchtung, und mit einem Objektiv (4), wobei das von den Lichtquellen (1, 2) auf unterschiedlichen Beleuchtungspfaden (5, 6) kommende Beleuchtungslicht über einen Strahlvereiniger (7) in das Objektiv (4) und von dort zur Probe (8) gelangt, wobei der Strahlvereiniger (7) derart strukturiert ist, dass er das zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht und das zur evaneszenten Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht in geometrisch voneinander getrennten Strahlengängen (5, 6) in das Objektiv (4) leitet, ist dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger (7) mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Zonen (9, 10) für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts und mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Zonen (11, 12) für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts aufweist, wobei die einzelnen Zonen in ihrer Größe und Position auf die Objektivpupillen unterschiedlicher Objektive (4) abgestimmt sind.

Description

MIKROSKOP ZUR HERKÖMMLICHEN FLUORESZENZMIKROSKOPIE UND ZUR TOTALINTERNEN-REFLEXIONS-MIKROSKOPIE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie (Epi-Fluoreszenz) und zur Totalinternen-Reflexions- Mikroskopie, mit mindestens einer Lichtquelle für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und mindestens einer Lichtquelle für die evaneszente Beleuchtung, und mit einem Objektiv, wobei das von den Lichtquellen auf unterschiedlichen Beleuchtungspfaden kommende Beleuchtungslicht über einen Strahlvereiniger in das Objektiv und von dort zur Probe gelangt, wobei der Strahlvereiniger derart strukturiert ist, dass er das zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht und das zur evaneszenten Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht in geometrisch voneinander getrennten Strahlengängen in das Objektiv leitet.
Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie wird das Brechungsverhalten von Licht beim Übergang von einem optisch dichteren in ein optisch dünneres Medium genutzt. So ergibt sich beispielsweise für den Übergang von Deckglas (n1 =1 ,518) zu Wasser (n2=1 ,33) ein kritischer Winkel von 61 °, der Winkel der Total-Reflexion. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion (Winkel ≥ 61 °) bildet sich im Medium mit geringerem Brechungsindex eine stehende evaneszente Welle. Die Intensität dieser Well fällt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab. Aufgrund dessen werden von der Grenzfläche weiter entfernte Fluorophore nicht angeregt. Die Hinter- grundfluoreszenz wird erheblich reduziert. Der Bildkontrast wird dabei verbessert und die Auflösung wird gleichzeitig deutlich gesteigert. Voraussetzung für die Nutzung des voranstehend geschilderten Phänomens ist ein ausreichend großer Unterschied der Brechungsindizes von Deckglas und Medium. Aus der US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt. Die z-Auflösung von TIRF- Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
Aus der DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen, bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt.
Aus der DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF-Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes
Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen
Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das
Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene
Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 °- d)/60 °.
Aus der DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Intemal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.
Aus der US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.
Aus der DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dort wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das Tl RF- Verfahren geeignet.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
Bei denen aus dem Stand der Technik bekannten Mikroskopen erfolgt die Ein- kopplung der evaneszenten Beleuchtung regelmäßig im Rahmen zweidimensionaler Lösungen, wenngleich die dort realisierte Verstelleinheit stets eindimensional ausgeführt ist. So erfolgt die Einkopplung beispielsweise über einen sogenannten neutralen Teiler, d.h. über einen Spiegel, der in einem gewissen Umfange reflektiert und ansonsten transmittiert. Des Weiteren ist die Einkopplung über einen dichroitischen Teiler bekannt. Dabei handelt es sich um einen besonderen Spiegel, der bis auf eine bestimmte Wellenlänge alle anderen Wellenlängen reflektiert. Ebenso ist es auch bereits bekannt, die Einkopplung über einen Polarisationsteiler zu bewerkstelligen. Dabei werden die Laser für die evaneszente Beleuchtung (TIRF-Beleuchtung) und der Laser für die herkömmliche Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung orthogonal zueinander polarisiert und zusammengeführt. Als eindimensionale Möglichkeit zur Einkopplung der erforderlichen Strahlungsquelle ist es auch bereits bekannt, kleine zusätzliche Spiegel im Beleuchtungsstrahlengang für die EpiFluoreszenz-Beleuchtung zu verwenden.
Die bislang bekannten Verfahren und Vorrichtungen zur Einkopplung einer oder mehrerer Strahlungsquellen zur evaneszenten Beleuchtung sind in der Praxis problematisch, da es durch die Art der Einkopplung zu Einschränkungen der spezifischen Eigenschaften der jeweils verwendeten Strahlungsquelle kommt. So hat die Einkopplung über einen neutralen Teiler den Nachteil, dass Einbußen in der Leistung sowohl bei der Strahlungsquelle für die evaneszente Beleuchtung als auch bei der Strahlungsquelle für die EpiFluoreszenz-Beleuchtung auftreten. Die Einkopplung über einen dichroitischen Teiler ist nachteilig, da man sich dabei auf eine bestimmte Wellenlänge bzw. einen bestimmten Wellenlängenbereich festlegen muss. Will man im Rahmen einer solchen Realisierung die Wellenlänge wechseln, so muss man auch einen Wechsel des Strahlvereinigers bzw. Spiegels vornehmen. Die Einkopplung über einen Polarisationsteiler ruft ebenfalls einen gravierenden Nachteil hervor, da nämlich alle verwendeten Bausteile polarisationserhaltend ausgelegt sein müssen. Außerdem bedeutet die Verwendung eines Polarisationsteilers den Verzicht auf einen weiteren Freiheitsgrad bei den Strahlungsquellen. Schließlich scheidet die Einkopplung mittels kleiner zusätzlicher Spiegel im Beleuchtungsstrahlengang der EpiFluoreszenz-Beleuchtung von vomeherein aus, da es sich dabei um eine eindimensionale Lösung handelt. Die zusätzlichen Spiegel führen außerdem zu einer teilweisen Abdeckung der Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung, so dass auch insoweit diese Möglichkeit zur Einkopplung nicht akzeptabel ist.
Aus der DE 103 09 269 B4 ist eine Vorrichtung für die Totalinterne-Reflexions- Mikroskopie bekannt, bei der zur Strahlvereinigung des zur herkömmlichen Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts sowie des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts ein Strahlvereiniger vorgesehen ist, der derart strukturiert ist, dass er einen äußeren, transmittierenden Bereich für das zur evaneszenten Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht sowie einen inneren, reflektierenden Bereich für das zur herkömmlichen Fluoreszenzbeleuchtung dienende Beleuchtungslicht aufweist. Nachteilig ist dabei, dass die Bereiche des Strahlvereinigers exakt auf das verwendete Objektiv abgestimmt sein müssen, so dass ein Objektivwechsel ohne gleichzeitigen Wechsel des Strahlvereinigers nicht möglich ist. Insoweit ist jeder Objektivwechsel mit einem enormen Justageaufwand verbunden.
Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie (Epi-Fluoreszenz) und zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie derart auszugestalten und weiterzubilden, dass eine Einkopplung der evaneszenten Beleuchtung ohne die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile möglich ist. Außerdem soll die Einkopplung auf konstruktiv einfache Weise erfolgen und den automatischen Mikroskopbetrieb auch bei wechselnden Betriebsparametern, insbesondere bei wechselnden Objektiven, mit einem Höchstmaß an Flexibilität ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist das gattungsbildende Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Zonen für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts und mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Zonen für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts aufweist, wobei die einzelnen Zonen in ihrer Größe und Position auf die Objektivpupillen unterschiedlicher Objektive abgestimmt sind.
Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass sich ein hohes Maß an Flexibilität dadurch erreichen lässt, dass der Strahlvereiniger nicht lediglich einen einzigen Bereich für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenzbeleuchtung dienenden Beleuchtungslichts sowie einen einzigen Bereich für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts aufweist, sondern dass jeweils mindestens zwei solche Bereiche vorgesehen sind. In erfindungsgemäßer Weise sind diese Bereiche in ihrer Größe und Position jeweils auf die Objektivpupillen unterschiedlicher Objektive abgestimmt. Dementsprechend kann das Mikroskop mit unterschiedlichen Objektiven betrieben werden, ohne dass ein aufwendiger Wechsel des Strahlvereinigers erforderlich wäre. Insbesondere ist es nicht notwendig, den Strahlengang nach jedem Objektivwechsel neu zu justieren. Darüber hinaus wird der gesamte Aufbau deutlich einfacher, da für die Strahlvereiniger keinerlei Umschaltmechanismus oder ähnliches, inklusive einer zugehörigen Elektronik, etabliert werden muss.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop wird der Umstand ausgenutzt, dass der Abstand von der optischen Achse, mit dem das zur evaneszenten Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht in ein Objektiv eingekoppelt werden muss, um eine Totalinterne-Reflexionsbeleuchtung zu realisieren, in Abhängigkeit von der Objektivpupille variiert. Die Objektivpupille berechnet sich aus der Brennweite und der numerischen Apertur des zugrunde liegenden Objektivs. In Bezug auf die Einkopplung der Epi-Fluoreszenz- Beleuchtung können bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop zwar gewisse Leistungsverluste auftreten. Verglichen mit einer alternativen Ausführung des Strahlvereinigers in Form eines Polarisationsteilers, bei dem normalerweise 50 % der Leistung verloren gehen, ist dieser Leistungsverlust allerdings tolerabel.
Im Hinblick auf eine besonders einfache Handhabbarkeit ist der Strahlvereiniger bevorzugt in der Ebene der Objektivpupille oder einer dazu konjugierten Ebene oder zumindest in der Nähe einer solchen Ebene angeordnet. Im Konkreten handelt es sich bei dem Strahlvereiniger um einen strukturierten Spiegel, nämlich um einen strukturierten Sektionalspiegel. Die reflektierende Spiegelfläche kann dabei aufgedampft oder sonst wie erzeugt sein.
Im Konkreten ist es denkbar, dass der Strahlvereiniger auf der optischen Achse zwischen der Lichtquelle für die evaneszente Beleuchtung und dem Objektiv angeordnet ist, und dass die Zonen für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenzbeleuchtung dienenden Beleuchtungslichts als Reflexionsflächen und die Zonen für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts als Transmissionsflächen ausgeführt sind. Dadurch ist es möglich, die Beleuchtung für die normale Fluoreszenz über den Spiegel einzuspiegeln und den Spiegel für die evaneszente Beleuchtung durch den Spiegel hindurch in der Objektivpupille zu positionieren.
Grundsätzlich ist es auch möglich, dass die beiden Achsen der Beleuchtungslichtquellen vertauscht sind. Entsprechend kann der Strahlvereiniger auf der optischen Achse zwischen der Lichtquelle für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und dem Objektiv angeordnet sein, wobei die Zonen für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts dann als Reflexionsflächen und die Zonen für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenzbeleuchtung dienenden Beleuchtungslichts dann als Transmissionsflächen ausgeführt sind.
Beliebige Strukturen bzw. Geometrien der jeweiligen Zonen des Strahlvereinigers sind denkbar, wobei es lediglich auf die geometrische Trennung der beiden Strahlengänge für die unterschiedlichen Arten der Beleuchtung ankommt. Ganz besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der die einzelnen Zonen des Strahlvereinigers als koaxial zueinander verlaufende Kreisringflächen oder elliptische Ringflächen ausgebildet sind. Denkbar ist auch eine Ausführungsform mit eckigen Flächen, wobei die äußeren Flächen die inneren Flächen insgesamt oder zumindest bereichsweise umgeben. Hinsichtlich einer nutzerfreundlichen Auswechselbarkeit der Objektive kann ein Wechselmechanismus für die Objektive vorgesehen sein, wobei dieser bevorzugt als Revolvereinrichtung oder als Schieber ausgeführt ist. Zusätzlich oder alternativ kann ein Wechselmechanismus für die Strahlvereiniger vorgesehen sein, wobei dieser mit Strahlvereinigern bestückt sein kann, die jeweils in der oben beschriebenen Weise an unterschiedliche Objektivgruppen angepasst sein könnten. Der Wechselmechanismus kann dabei bereits herstellerseitig bestückt werden oder nutzerseitig entsprechend der konkret vorzunehmenden Applikationen individuellen bestückt werden.
In vorteilhafter Weise sind die Ringflächen des Strahlvereinigers in ihrer Größe und Position auf die Objektivpupillen von wenigstens zwei der mit dem Wechselmechanismus bereitgestellten Objektive abgestimmt. Eine Abstimmung auf zwei unterschiedliche Objektive kann durch Ausbildung von insgesamt vier räumlich voneinander getrennten Ringflächen erreicht werden, wobei zwei der Ringflächen zur Einspiegelung/zum Durchlass des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts und die beiden anderen Ringflächen zum Durchlass/zur Einspiegelung des zur herkömmlichen Fluoreszenzbeleuchtung dienenden Beleuchtungslichts dienen. Eine Erweiterung im Sinne einer Anpassung an drei unterschiedliche Objektive mit insgesamt sechs Ringflächen oder gar an mehr als drei unterschiedliche Objektive mit einer entsprechend erweiterten Zahl an Ringflächen ist prinzipiell denkbar.
Unter Berücksichtigung der üblichen Geometrien der zugrundeliegenden Strahlengänge ist es von Vorteil, die inneren Ringflächen in ihrer Größe und Position auf dasjenige der Objektive mit der kleineren Objektivpupille und die äußeren Ringflächen in ihrer Größe und Position auf dasjenige der Objektive mit der größeren Objektivpupille abzustimmen. Die Angaben „innen" bzw. „außen" beziehen sich hier auf den radialen Abstand von der optischen Achse des Objektivs. Im Hinblick auf die Abgrenzungen der einzelnen Ringflächen gegeneinander kann vorgesehen sein, dass sich die einzelnen Ringflächen unmittelbar aneinander anschließen. Mit einer derartigen Ausführungsform lässt sich eine optimale Anpassung an mehrere konkret vorgegebene Objektive realisieren. Allerdings liegen typische Proben, die mittels der Totalinternen- Reflexionsmikroskopie untersucht werden, üblicherweise in wässrigen Lösungen vor, deren Brechungsindex oberhalb 1 ,33 liegt, d.h. oberhalb des Brechungsindex von Wasser. Legt man sich nun auf einer Apparatur von bspw. 1 ,35 für die Grenze zwischen zwei der zuvor genannten Ringflächen des Strahlvereinigers fest, bedeutet dies, dass es nicht möglich, die maximal realisierbare Eindringtiefe zu erreichen. Aufgrund des nichtlinearen Zusammenhangs zwischen der Eindringtiefe und dem Einfallswinkel ist dieser Unterschied nicht zu vernachlässigen.
Aus dem genannten Grund kann es von Vorteil sein, zwischen den einzelnen Ringflächen eine Art Trennbereich oder Übergangsbereich auszubilden. Der Übergangsbereich kann teilweise lichtdurchlässig und teilweise reflektierend sein. Im Konkreten kann der Übergangsbereich z.B. im Sinne eines neutralen Teilers mit allen denkbaren Verhältnissen je nach Anwendung ausgeführt sein. Ebenso ist es möglich, dass der Übergangsbereich als Gradientenspiegel ausgeführt ist. In einer weiteren denkbaren Ausführungsform weist der Reflexionsgrad bzw. der Transmissionsgrad des Strahlvereinigers in dem Übergangsbereich einen stufenförmigen Verlauf auf.
Von besonderer Bedeutung ist die Erkenntnis, dass die Größe und Position der Ringflächen und/oder der Übergangsbereiche des Strahlvereinigers und somit der Strahlvereiniger insgesamt auch in Abhängigkeit von dem Brechungsindex der die zu untersuchende Probe beinhaltenden Lösung bzw. der Probe selbst abstimmbar ist. Zusätzlich kann bei fest vorgegebenem Strahlvereiniger zwischen dem Strahlvereiniger und dem Objektiv eine Zwischenabbildung mit variabler Vergrößerung vorgesehen sein, so dass die Größe der Pupille in gewissem Rahmen an den Strahlvereiniger anpassbar ist. In Bezug auf die jeweiligen Lichtquellen sei angemerkt, dass für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und/oder für die evaneszente Beleuchtung jeweils auch zwei oder mehrere Lichtquellen gleichzeitig zum Einsatz kommen können, wobei eine entsprechende Einkopplung des jeweiligen Beleuchtungslichts möglich ist. Auch ist es denkbar, dass neben der evaneszenten Beleuchtung ein simultan arbeitender Laser einsetzbar ist, der die Funktion eines Manipulationslasers hat. Dieser Manipulationslaser kann zur herkömmlichen Epi-Fluoreszenz-Anregung genutzt werden.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
Fig. 1 in einer schematischen Ansicht den grundsätzlichen Verlauf des
Beleuchtungsstrahlengangs in einem erfindungsgemäßen Mikroskop,
Fig. 2 in einer schematischen Ansicht ein Ausführungsbeispiel eines in der Anordnung gemäß Fig. 1 verwendbaren
Strahlvereinigers, und
Fig. 3 in einer schematischen Ansicht unterschiedlich strukturierte
Ausführungsbeispiele eines in der Anordnung gemäß Fig. 1 verwendbaren Strahlvereinigers. Fig. 1 zeigt den grundsätzlichen Aufbau eines erfindungsgemäßen Mikroskops, welches sich sowohl zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie (Epi-Fluoreszenz) und zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie eignet. Genauer gesagt zeigt Fig. 1 den Beleuchtungsstrahlengang in Bezug auf die beiden Betriebsarten. Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle 1 für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und eine Lichtquelle 2 für die evaneszente Beleuchtung, wobei ein Scanner 3 vorgesehen sein kann.
Des Weiteren umfasst das Mikroskop ein Objektiv 4, wobei das von den Licht- quellen 1 , 2 auf unterschiedlichen Beleuchtungspfaden, 5, 6 kommende Beleuchtungslicht über einen Strahlvereiniger 7 in das Objektiv und von dort zur Probe 8 gelangt. Der Strahlvereiniger ist in einer zur Ebene 13 der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet.
Die Fig. 2 zeigt in schematischer Ansicht gemeinsam mit der Fig. 1 , dass der Strahlvereiniger 7 derart strukturiert ist, dass er das zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht und das zur evaneszenten Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht in geometrisch voneinander getrennten Strahlengängen 5, 6 in das Objektiv 4 leitet. Dabei sind zwei räumlich voneinander getrennte Ringflächen 9, 10 für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts und zusätzlich zwei räumlich voneinander getrennte Ringflächen 1 1 , 12 für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts vorgesehen. Mit anderen Worten ist der Strahlvereiniger 7 als strukturierter Sektionalspiegel mit insgesamt vier räumlich voneinander getrennten Ringflächen 9 bis 12 ausgeführt. Erfindungsgemäß sind die einzelnen Ringflächen 9 bis 12 in ihrer Größe und Position auf die Objektivpupillen von zwei unterschiedlichen Objektiven abgestimmt, wie weiter unten im Detail erläutert wird.
Bei dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel repräsentieren die schwarz dargestellte Bereiche 9, 10 den verspiegelten Teil des Strahlvereinigers 7, durch den die Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung auf die optische Achse gelegt wird. Die weiß dargestellten Bereiche 1 1 , 12 sind für das Licht durchlässig und dienen zur Durchspiegelung der TIRF-Beleuchtung, und zwar im Rahmen einer Anordnung gemäß der Fig. 1. An dieser Stelle sei angemerkt, dass der Strahlvereiniger 7 einen zu dem zuvor erörterten Aufbau invertierten Aufbau haben kann.
Fig. 3 zeigt drei unterschiedliche Ausführungsformen eines Strahlvereinigers 7 zum Einsatz in einer Anordnung gemäß Fig. 1 , wobei konkret jeweils der Verlauf des Transmissionsgrades bzw. des Reflexionsgrades in Abhängigkeit des radialen Abstands r von der optischen Achse des Objektivs 4 dargestellt ist. Die Darstellungen in Fig. 3 beziehen sich auf eine Ausführungsform des Strahlvereinigers 7 wie in Fig. 2 gezeigt, d.h. mit einer Einkopplung der TIRF- Beleuchtung in Transmission und einer Einkopplung der Epi-Fluoreszenz- Beleuchtung in Reflexion. Entsprechend ist in Fig. 3 auf der Ordinate das relative Verhältnis des Reflexionsgrades zu dem Transmissionsgrad des Strahlvereinigers aufgetragen.
Wie in Fig. 3a gezeigt, ist im Zentrum des Strahlvereinigers 7 zunächst eine verspiegelte Ringfläche bzw. Kreisfläche vorgesehen, die dem in Fig. 2 schwarz dargestellten Bereich 9 entspricht. Nach außen schließt sich daran ein durchlässiger Bereich für die evaneszente Beleuchtung an, der in Fig. 2 dem weiß dargestellten Bereich 10 entspricht. Die beiden genannten Bereiche sind in ihrer Größe an ein erstes Objektiv 4a angepasst. Bei dem Objektiv 4a handelt es sich in dem konkret dargestellten Ausführungsbeispiel um ein 100 x 1 .46 Objektiv (Vergrößerung gleich 100, numerische Apertur AN = 1 .46). Bezieht man sich auf Wasser mit einem Brechungsindex von 1 ,33 als exemplarischem Probenmaterial, so liegt der Bereich der Epi-Fluoreszenz bei diesem Objektiv 4a im Bereich von r = 0 mm bis r = 2,66 mm. TIRF findet in einem Bereich von r = 2,66 mm bis r = 2,92 mm statt. Entsprechend sind die Radien der reflektierenden bzw. durchlässigen Ringflächen 9 und 1 1 dimensioniert. Die sich nach außen anschließenden Ringflächen - reflektierende Ringfläche 10 sowie durchlässige Ringfläche 12 - sind in dem dargestellten Beispiel auf ein 63 x 1 .46 Objektiv 4b abgestimmt. Bei diesem Objektiv liegt die EpiFluoreszenz in einem Bereich von r = 0 mm bis r = 4,1 mm und der Bereich, in dem TIRF stattfindet, verläuft von r = 4,1 mm bis r = 4,65 mm.
Das in Fig. 3b dargestellte Ausführungsbeispiel bezieht sich auf einen Strahlvereiniger 7, der insgesamt sechs Ringflächen aufweist, die in ihrer Größe und Position auf drei unterschiedliche Objektive 4a, 4b, 4c abgestimmt sind. Im Konkreten handelt es sich hier bei dem Objektiv 4a um ein 100 x 1 .46 Objektiv, bei dem Objektiv 4b um ein 100 x 1 .46 Objektiv und bei dem Objektiv 4c um ein 63 x 1.46 Objektiv. Prinzipiell können sich weitere Ringflächen anschließen, die auf weitere Objektive abgestimmt sind. Grundsätzlich sind die innersten Ringflächen stets auf das Mikroskop mit der kleinsten Objektivpupille und die äußersten Ringflächen auf das Objektiv mit der größten Pupille abgestimmt.
In Fig. 3b ist des Weiteren zu erkennen, dass am inneren Rand der Ringflächen zur Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts ein Übergangsbereich 14 ausgebildet ist. In den Übergangsbereichen 14 ist jeweils ein stufenförmiger Verlauf des Reflexionsgrades realisiert. Obschon in Fig. 3b pro Übergangsbereich 14 aus Gründen der Übersichtlichkeit jeweils nur eine Stufe dargestellt ist, können pro Übergangsbereich 14 auch mehrere Stufen realisiert sein. Die Vorkehrung von Übergangsbereichen 14 bietet den Vorteil der Berücksichtigung unterschiedlicher Brechungsindizes der die zu untersuchende Probe beinhaltenden Lösung bzw. der Probe selbst. Ist der innere Rand einer Ringfläche für die Einkopplung von TIRF-Beleuchtungslicht bspw. auf Hepes, einer Nährlösung mit einem Brechungsindex von 1 .38, abgestimmt, so ließe sich bei einer wässrigen Lösung mit einem Brechungsindex von 1 .33 nicht mehr die maximal erreichbare Eindringtiefe realisieren. Durch die Ausbildung eines stufenförmigen Übergangs 14 in diesem Bereich lässt sich dieses Problem umgehen und kann auch für die wässrige Lösung die theoretisch maximal mögliche Eindringtiefe erreicht werden. Am äußeren Rand einer Ringfläche für die Einkopplung von TIRF-Beleuchtung ist kein Übergangsbereich notwendig, da der äußere Rand eines TIRF-Bereiches durch die numerische Apertur des jeweiligen Objektivs fest vorgegeben ist.
Fig. 3c zeigt schließlich das gleiche Ausführungsbeispiel wie in Fig. 3b dargestellt, wobei anstelle von stufenförmig ausgeführten Übergangsbereichen graduell verlaufende Übergangsbereiche 14 im Sinne von Gradientenspiegeln realisiert sind. Selbstverständlich können bei ein und demselben Strahlvereiniger (7) auch unterschiedliche Übergangsbereiche realisiert sein, so bspw. ein stufenförmiger und ein graduell verlaufender Übergangsbereich oder stufenförmige Übergangsbereiche mit jeweils einer unterschiedlichen Anzahl von Stufen.
In Bezug auf Merkmale, die sich den Figuren nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.
Schließlich sei darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Mikroskop zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie (EpiFluoreszenz) und zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie, mit mindestens einer Lichtquelle (1) für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und mindestens einer Lichtquelle (2) für die evaneszente Beleuchtung, und mit einem Objektiv (4), wobei das von den Lichtquellen (1, 2) auf unterschiedlichen Beleuchtungspfaden (5, 6) kommende Beleuchtungslicht über einen Strahlvereiniger (7) in das Objektiv (4) und von dort zur Probe (8) gelangt, wobei der Strahlvereiniger (7) derart strukturiert ist, dass er das zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht und das zur evaneszenten Beleuchtung dienende Beleuchtungslicht in geometrisch voneinander getrennten Strahlengängen (5, 6) in das Objektiv (4) leitet, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass der Strahlvereiniger (7) mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Zonen (9, 10) für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenz-Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts und mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Zonen (11, 12) für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts aufweist, wobei die einzelnen Zonen in ihrer Größe und Position auf die Objektivpupillen unterschiedlicher Objektive (4) abgestimmt sind.
2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger (7) in der Ebene (13) der Objektivpupille oder einer dazu konjugierten Ebene oder zumindest in der Nähe einer solchen Ebene angeordnet ist.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger (7) auf der optischen Achse zwischen der Lichtquelle (2) für die evaneszente Beleuchtung und dem Objektiv (4) angeordnet ist, und dass die Zonen (9, 10) für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenz- Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts als Reflexionsflächen und die Zonen (1 1 , 12) für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts als Transmissionsflächen ausgeführt sind.
4. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlvereiniger (7) auf der optischen Achse zwischen der Lichtquelle (1 ) für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und dem Objektiv (4) angeordnet ist, und dass die Zonen (1 1 , 12) für die Einkopplung des zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts als Reflexionsflächen und die Zonen (9, 10) für die Einkopplung des zur herkömmlichen Fluoreszenz- Beleuchtung dienenden Beleuchtungslichts als Transmissionsflächen ausgeführt sind.
5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Zonen (9, 10, 1 1 , 12) des Strahlvereinigers (7) als koaxial zueinander verlaufende Kreisringflächen oder elliptische Ringflächen ausgebildet sind.
6. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wechselmechanismus, vorzugsweise in Form eines Revolverkopfes oder eines Schiebers, für die Objektive (4) und/oder für die Strahlvereiniger (7) vorgesehen ist.
7. Mikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ringflächen (9, 10, 1 1 , 12) des Strahlvereinigers (7) in ihrer Größe und Position auf die Objektivpupillen von wenigstens zwei der mit dem Wechselmechanismus bereitgestellten Objektive (4) abgestimmt sind.
8. Mikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die inneren Ringflächen (9, 1 1 ) in ihrer Größe und Position auf dasjenige der Objektive (4a) mit der kleineren Pupille und die äußeren Ringflächen(10, 12) in ihrer Größe und Position auf dasjenige der Objektive (4b) mit der größeren Pupille abgestimmt sind.
9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die einzelnen Ringflächen (9, 10, 1 1 , 12) unmittelbar aneinander anschließen.
10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich an den inneren Rand einer Ringfläche (1 1 , 12) für die Einkopplung von zur evaneszenten Beleuchtung dienenden Beleuchtungslicht ein Trennbereich oder Übergangsbereich (14)anschließt.
1 1 . Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Übergangsbereich (14) teilweise lichtdurchlässig und teilweise reflektierend ist.
12. Mikroskop nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Übergangsbereich (14) im Sinne eines neutralen Teilers ausgeführt ist.
13. Mikroskop nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Übergangsbereich (14) als Gradientenspiegel ausgeführt ist.
14. Mikroskop nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Reflexionsgrad bzw. der Transmissionsgrad des Strahlvereinigers (7) in dem Übergangsbereich (14) einen stufenförmigen Verlauf aufweist.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe und Position der Ringflächen (9, 10, 1 1 , 12) und/oder der Übergangsbereiche (14) des Strahlvereinigers (7) und somit der Strahlvereiniger (7) insgesamt auf den Brechungsindex der die zu untersuchende Probe (8) beinhaltenden Lösung bzw. der Probe (8) selbst abgestimmt ist.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass bei fest vorgegebenem Strahlvereiniger (7) zwischen dem Strahlvereiniger (7) und dem Objektiv (4) eine Zwischenabbildung mit variabler Vergrößerung vorgesehen ist, so dass eine Anpassung der Größe der Pupille auf den Strahlvereiniger (7) erfolgen kann.
17. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass für die herkömmliche Fluoreszenz-Beleuchtung und/oder für die evaneszente Beleuchtung jeweils zwei oder mehrere Lichtquellen (1 , 2) vorgesehen sind.
18. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass neben der evaneszenten Beleuchtung ein simultan arbeitender Manipulationslaser einsetzbar ist.
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