WO2005029150A1 - Objektiv zur evaneszenten beleuchtung und mikroskop - Google Patents

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WO2005029150A1
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light source
light
microscope
illuminating
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PCT/EP2004/052295
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Heinrich Ulrich
Werner Knebel
Kyra MÖLLMANN
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a lens for total internal reflection microscopy.
  • the invention also relates to a microscope for total internal reflection microscopy with a light source and with an objective
  • a microscope with evanescent illumination of a sample is known from US 2002/0097489 A1.
  • the microscope contains a white light source, the light of which is coupled via a slit diaphragm through the microscope objective into the specimen slide for evanescent illumination.
  • the illuminating light propagates in the slide by total internal reflection, the sample being illuminated only in the area of the evanescent field protruding from the slide.
  • Microscopes of this type are known under the term TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope).
  • TIRFM Total Internal Reflection Fluorescent Microscope
  • DE 101 08 796 A1 discloses a high-aperture lens, in particular for TIRF applications.
  • the objective consists of a first lens with a positive refractive power, a second lens with a negative refractive power, whereby the focal length ratio between the two lenses is in the range of - 0.4 and - 0.1 and the total refractive power is greater than zero.
  • the lens contains two positive lenses, whose ratio diameter to the focal length is greater than 0.3 and less than 0.6.
  • the objective also includes a negative lens and a converging lens, the negative lens facing the front group and the focal length ratio of the negative lens and the converging lens being between ⁇ 0.5 and ⁇ 2.
  • the incident light illuminating arrangement contains an illuminating source that is polarized during operation
  • a microscope for TIRM Total Internal Reflection Microscopy
  • the microscope has a microscope housing and an objective.
  • the illuminating light emanating from an illuminating device can be coupled in via an adapter which can be inserted into the microscope housing.
  • Illumination system includes a laser light source, the light of which is coupled into an optical fiber.
  • a coupling optic is also provided, which focuses the light emerging from the fiber into a rear focal point of the microscope objective.
  • the optical fiber can be displaced in a plane perpendicular to the optical axis of the microscope objective.
  • DE 102 29 935 A1 discloses a device for coupling light into a microscope. Laser light is directed onto the specimen in the light field diaphragm plane by an optical fiber coupling designed as a slide. The invention is particularly suitable for the TIRF method.
  • a sample In scanning microscopy, a sample is illuminated with a light beam in order to observe the detection light emitted by the sample, as reflection or fluorescent light.
  • Illumination light beams are moved in a sample plane with the aid of a controllable beam deflection device, generally by tilting two mirrors, the deflection axes usually being perpendicular to one another, so that one mirror deflects in the x and the other in the y direction.
  • the mirrors are tilted, for example, with the help of galvanometer control elements.
  • the power of the detection light coming from the object is measured depending on the position of the scanning beam.
  • the control elements are usually equipped with sensors for determining the current mirror position. Especially in confocal scanning microscopy, an object is scanned in three dimensions with the focus of a light beam.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, focusing optics with which the light from the source is focused on a pinhole - the so-called excitation diaphragm - a beam splitter, a beam deflection device for beam control, microscope optics, a detection diaphragm and the detectors for detecting the detection - or fluorescent light.
  • the illuminating light is coupled in via a beam splitter.
  • the fluorescent or reflection light coming from the object reaches the beam splitter via the beam deflection device, passes it, and is then focused on the detection diaphragm behind which the detectors are located.
  • This detection arrangement is called a descan arrangement.
  • Detection light that does not originate directly from the focus region takes a different light path and does not pass through the detection diaphragm, so that one obtains point information that passes through sequential scanning of the object with the focus of the illuminating light beam leads to a three-dimensional image.
  • a three-dimensional image is usually achieved by taking image data in layers.
  • the systems known from the prior art have the disadvantage that in some cases very complex and space-consuming optics are necessary in the beam path of the microscope in order to couple the TIRF illuminating light. This adversely affects the detection beam path in particular and often leads to a loss of detection light output. It is the object of the present invention to provide a lens for use in total internal reflection microscopy, which enables the TIRF illuminating light to be coupled into the beam path of the microscope in a particularly efficient manner.
  • a lens which is characterized in that a light source and / or at least one deflection means, which directs the light from a light source into the lens, and / or the exit end of an illuminating optical fiber is arranged in the region of the rear focal plane of the lens.
  • the further object is achieved by a microscope, which is characterized in that, in the region of the rear focal plane of the objective, the light source and / or at least one deflection means, which directs the light from the light source into the objective, and / or the exit end of an illuminating optical fiber, which is fed by the light source, is arranged.
  • the invention has the advantage that no beam splitters in the beam path of the microscope are necessary for coupling in the TIRF illuminating light. This enables an increased fluorescence yield - since no signal loss is caused. In addition, a high Time resolution can be achieved since no optical components, in particular no beam splitters, have to be switched.
  • the light source and / or at least the deflection means and / or the exit end of the illuminating light fiber is arranged directly in the rear focal plane of the objective.
  • the light source preferably comprises at least one laser, which can be configured, for example, as a semiconductor laser and / or contains at least one LED (light-imitting diode).
  • the light source can comprise several individual light sources; the individual light sources are preferably arranged in a ring.
  • the ring of individual light sources can be arranged, for example, in the lens housing itself, but also on the outside of the lens housing, openings being provided for coupling light.
  • a deflection means is preferably arranged in the rear focal plane or in the region of the rear focal plane of the objective, which deflects the light of the individual light sources in such a way that it emerges from the front lens of the lens at the desired angle.
  • the light source comprises a plurality of individual light sources which emit illuminating light of different wavelengths. The individual light sources can preferably be switched on and off independently of one another.
  • a detector in particular a multiband detector or a spectrometer, is provided which detects synchronously with the switching on of the light source and / or the individual light sources.
  • This variant is particularly advantageous in the case of samples which contain, for example, a plurality of fluorescent dyes, because, according to the invention, spectral analysis of the sample is possible very quickly.
  • optics are provided which focus the light from the light source onto the deflection means.
  • an at least partial coating of an (already present) objective element forms the deflection means.
  • This can be a partially reflective or completely reflective coating.
  • the coating is designed as a dielectric mirror coating, the coating being designed such that the detection light can penetrate it largely unhindered.
  • the light of the light source After passing through the objective, the light of the light source preferably emerges at least at an adjustable angle to the optical axis
  • the position of the light source and / or the at least one deflecting means and / or the exit end is preferably the
  • Optical fiber can be changed within the focal plane.
  • the position of the light source or the deflecting means or the exit end directly influences the angle to the optical axis at which the light from the light source follows
  • Position of the light source or the deflecting means or the exit end can be used mechanical adjusting elements, as are common in microscopy.
  • the angle is for
  • Illumination light of different wavelengths each different.
  • the microscope comprises a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope.
  • a microscope designed as a confocal scanning microscope is particularly suitable for carrying out experiments on the basis of photoactivation or caged-combound release, and in doing so at the TIRF level observe. With such an arrangement, the time resolution is particularly large since, for example, sample stimulation and camera observation can be carried out simultaneously.
  • the microscope according to the invention is particularly suitable for carrying out biological experiments, in particular for photoactivation and / or caged combound release and / or FRAP (fluorecence recovery after photobleaching).
  • Bandpass filters and / or edge filters are preferably arranged in front of the detector, which can be configured as a camera, for example, to be matched to the respective emission focal length of the fluorescence signal.
  • a dispersive element can be provided for color selection, which generates a spectral splitting from which the wavelength components to be detected are masked out.
  • the detector can also be designed as a color detector, for example as a color camera. It is also possible for a dispersive element to split the detection light over several detectors in order to achieve spectral detection.
  • FIG. 2 Another lens according to the invention
  • FIG. 3 Another lens according to the invention
  • a light source 5 is arranged in the rear focal plane 3 of the objective 1 and is formed from a first individual light source 7 and a second individual light source 9.
  • the first individual light source 7 comprises a light-emitting diode (LED), while the second individual light source includes a semiconductor laser.
  • the individual light sources 7, 9 emit illuminating light 11, 13 of different wavelengths.
  • the objective comprises a front lens 15 and a further lens 17.
  • the illuminating light 11 or illuminating light 13 emerges from the microscope objective at an angle Betta or at an angle alpha to the optical axis 19.
  • the angle can be adjusted by moving the individual light source 7 or by moving the individual light source 9 within the rear focal plane. For this purpose, the distance of the individual light source 7 or of the further individual light source 9 to the optical axis is changed using a mechanical adjusting device, not shown.
  • the lens 1 has a lens housing 21.
  • FIG. 2 shows a further lens 1 according to the invention with a lens housing 21 which has a first opening 23 and a further opening 25.
  • the objective has individual light sources 27, 29 arranged in a ring, which are arranged in a ring and belong to a light source 5.
  • the light source 5 is arranged outside the lens housing 21 and the light from the light source 5 is coupled in via the first opening 23 and the second opening 25 and via further openings (not shown) in the lens housing 21.
  • deflection means 31, 33 are provided in the area of the rear focal plane 3 of the objective 1, which deflect the light from the light source 5 into the further beam path of the objective 1.
  • FIG. 3 shows a further objective according to the invention with a lens housing 21, behind the rear focal plane 3 of which the exit end 35 of an illuminating optical fiber 37 is arranged.
  • the illuminating light 39 of a light source 5, which is designed as a laser 41, is coupled into the illuminating optical fiber 37 with the aid of a coupling optics 43.
  • the distance between the exit end 35 of the illumination optical fiber 37 and the optical axis 19 of the objective 1 can be adjusted mechanically.
  • the exit end of the illuminating optical fiber is arranged to be movable within the rear focal plane 3 of the objective 1.
  • the illuminating light 45 emerging from the illuminating optical fiber 37 leaves the objective 21 at an angle alpha to the optical axis 19. This angle can be adjusted by adjusting the position of the exit end 35 of the illumination optical fiber 37 within the rear focal plane 3 of the objective 1.
  • FIG. 4 shows a microscope according to the invention with an objective 1, as was described in FIG. 2.
  • the illuminating light 47 emanating from the individual light source 27 illuminates the sample 51 arranged on the cover glass 49 in an evanescent manner.
  • the detection light 53 emanating from the sample passes through the microscope objective 1 to the tube lens 55 and is then directed by the mirror 57 and via the optics 59 to the detector 61, which is designed as a CCD camera 63.
  • a filter wheel 65 with several different individual filters for selecting the detection spectral range is arranged in front of the detector 61.
  • FIG. 5 shows a further microscope according to the invention, which is similar to the microscope described with reference to FIG. 4.
  • a confocal scanner 67 is provided, the scanning light beam 69 of which is coupled through the scanning lens 71 via the beam splitter 73 into the beam path of the microscope.
  • the scanning light beam 69 which is shown in dashed lines in the figure, reaches the sample 51 through the tube lens and the microscope objective.
  • the scanning light beam 69 can, for example, be used to excite the sample in addition to the evanescent field and / or to manipulate the sample.
  • a confocal raster image recording of the sample can also take place, with the confocal scanner 67 detection light 75 (drawn in dashed lines) emanating from the sample, which reaches the confocal scanner 67 in the opposite light path as the scan beam 69 , receives.

Abstract

Ein Objektiv (1) zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie ist offenbart. Das Objektiv (1) ist dadurch gekennzeichnet, dass im Bereich der hinteren Brennebene (3) des Objektivs (1) eine Lichtquelle (5, 7) und/oder zumindest ein Umlenkmittel (31, 3), das das Licht einer Lichtquelle (5, 7) in das Objektiv (1) lenkt, und/oder das Austrittsende (35) einer Beleuchtungslichtleitfaser (37) angeordnet ist.

Description

Objektiv zur evaneszenten Beleuchtung und Mikroskop
Die Erfindung betrifft ein Objektiv zur Totalinternen-Reflexions- ikroskopie.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Mikroskop zur Totalinternen-Reflexions- Mikroskopie mit einer Lichtquelle und mit einem Objektiv
Aus US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt. Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
Aus DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt.
Aus DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF- Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes
Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 °- d)/60 °.
Aus DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.
Aus US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das
Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar. Aus DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dabei wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht, zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt. Die aus dem Stand der Technik bekannten Systeme haben den Nachteil, dass teilweise sehr aufwendige und raumfordernde Optiken im Strahlengang des Mikroskops notwendig sind, um das TIRF-Beleuchtungslicht eiπzukoppeln. Dies beeinflusst insbesondere den Detektionsstrahlengang nachteilig und führt oft zu Verlust an Detektionslichtleistung. Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Objektiv zur Verwendung in der totalinternen Reflektionsmikroskopie anzugeben, das eine besonders effiziente Einkoppluπg des TIRF-Beleuchtungslichtes in den Strahlengang des Mikroskops ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch ein Objektiv gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass im Bereich der hinteren Brennebene des Objektivs eine Lichtquelle und/oder zumindest ein Umlenkmittel, das das Licht einer Lichtquelle in das Objektiv lenkt, und/oder das Austrittsende einer Beleuchtungslichtleitfaser angeordnet ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mikroskop anzugeben, bei dem die Einkopplung des TIRF-Beleuchtungslichts effizient und verlustarm möglich ist und das gleichzeitig zusätzliche Optiken im Strahlengang des Mikroskops weitgehend überflüssig macht.
Die weitere Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass im Bereich der hinteren Brennebene des Objektivs die Lichtquelle und/oder zumindest ein Umlenkmittel, das das Licht der Lichtquelle in das Objektiv lenkt, und/oder das Austrittsende einer Beleuchtungslichtleitfaser, die von der Lichtquelle gespeist ist, angeordnet ist.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass zur Einkopplung des TIRF- Beleuchtungslichts keine Strahlteiler im Strahlengang des Mikroskops notwendig sind. Hierdurch ist eine erhöhte Fluoreszenzausbeute - da kein Signalverlust verursacht wird - ermöglicht. Darüber hinaus kann eine hohe Zeitauflösung erzielt werden, da keine optischen Bauteile, insbesondere keine Strahlteiler geschaltet werden müssen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Lichtquelle und/oder zumindest das Umlenkmittel und/oder das Austrittsende der Beleuchtungslichtfaser unmittelbar in der hinteren Brennebene des Objektivs angeordnet.
Als Lichtquelle ist nahezu jede in der Mikroskopie übliche Lichtquelle verwendbar. Vorzugsweise umfasst die Lichtquelle zumindest einen Laser, der beispielsweise als Halbleiterlaser ausgebildet sein kann und/oder zumindest eine LED (Light-Imiting-Diode) beinhaltet. Die Lichtquelle kann in einer besonderen Ausgestaltungsvariante mehrere Einzellichtquellen umfassen, vorzugsweise sind die Einzellichtquellen ringförmig angeordnet. Der Ring von Einzellichtquellen kann beispielsweise im Objektivgehäuse selbst, aber auch außen am Objektivgehäuse, wobei Öffnungen zur Lichteinkopplung vorgesehen sind, angeordnet sein. Im Falle der Anordnung der Einzellichtquellen außerhalb des Objektivgehäuses ist vorzugsweise in der hinteren Brennebene bzw. im Bereich der hinteren Brennebene des Objektivs ein Umlenkmittel angeordnet, das das Licht der Einzellichtquellen derart umlenkt, dass es unter dem gewünschten Winkel aus der Frontlinse des Objektivs austritt. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante umfasst die Lichtquelle mehrere Einzellichtquellen, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren. Vorzugsweise sind die Einzellichtquellen unabhängig voneinander ein- und ausschaltbar.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops ist ein Detektor, insbesondere ein Multibanddetektor oder ein Spektrometer vorgesehen, der synchron zum Einschalten der Lichtquelle und/oder der Einzellichtquellen detektiert. Diese Variante ist besonders vorteilhaft bei Proben, die beispielsweise mehrere Fluoreszenzfarbstoffe beinhalten, weil erfindungsgemäß zeitlich sehr schnell eine spektrale Untersuchung der Probe ermöglicht ist.
Erfindungsgemäß ist es möglich, beliebige Anregungslichtwellenlängen auszuwählen bzw. verschiedene Kombinationen von Anregungswellenlängen auszuwählen und die Einzellichtquellen entsprechend simultan oder sequenziell zu schalten.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Objektivs bzw. des erfindungsgemäßen Mikroskops ist eine Optik vorgesehen, die das Licht der Lichtquelle auf das Umlenkmittel fokussiert.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante bildet eine zumindest teilweise Beschichtung eines (ohnehin vorhandenen) Objektivelements, beispielsweise einer Linse das Umlenkmittel. Hierbei kann es sich um eine teilreflektierende oder ganz reflektierende Beschichtung handeln. In einer besonders bevorzugten Variante ist die Beschichtung als dielektrische Spiegelbeschichtung ausgeführt, wobei die Beschichtung derart ausgebildet ist, dass das Detektionslicht sie weitgehend ungehindert durchdringen kann.
Vorzugsweise tritt das Licht der Lichtquelle nach Durchlaufen des Objektivs unter zumindest einem einstellbaren Winkel zur optischen Achse aus dem
Objektiv aus. Dieser Winkel ist für die evaneszente Eindringtiefe in die Probe von entscheidender Bedeutung. Vorzugsweise ist die Position der Lichtquelle und/oder des zumindest einen Umlenkmittels und/oder des Austrittsendes der
Lichtleitfaser innerhalb der Brennebene veränderbar. Die Position der Lichtquelle bzw. des Umlenkmittels bzw. des Austrittsendes beeinflusst direkt den Winkel zur optischen Achse, unter dem das Licht der Lichtquelle nach
Durchlaufen des Objektivs aus dem Objektiv austritt. Zum Einstellen der
Position der Lichtquelle bzw. des Umlenkmittels bzw. des Austrittsendes können mechanische Stellelemente, wie sie in der Mikroskopie üblich sind, verwendet werden. In einer besonderen Variante ist der Winkel für
Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlänge jeweils unterschiedlich.
In einer besonderen Ausgestaltungsvariante umfasst das Mikroskop ein Rastermikroskop, insbesondere ein konfokales Rastermikroskop. Ein als konfokales Rastermikroskop ausgebildetes Mikroskop ist insbesondere dazu geeignet, Experimente auf der Basis von Photoactivation oder Caged- Combound-Release durchzuführen und dabei in der TIRF-Ebene zu beobachten. Die Zeitauflösung ist bei einer solchen Anordnung besonders groß, da beispielsweise simultan eine Probenstimulation und eine Kamerabeobachtung vorgenommen werden kann.
Das erfindungsgemäße Mikroskop ist insbesondere zur Durchführung von biologischen Experimenten, insbesondere bei Photoactivation und/oder Caged-Combound-Release und/oder FRAP (Fluorecence recovery after photobleaching) geeignet.
Vorzugsweise sind vor dem Detektor, der beispielsweise als Kamera ausgestaltet sein kann, Bandpassfilter und/oder Kantenfilter angeordnet auf die jeweilige Emissionsbrandweite des Fluoreszenzsignals durch abgestimmt sind. Zur Farbselektion kann ein dispersives Element vorgesehen sein, dass eine spektrale Aufspaltung erzeugt, aus der die zu detektierenden Wellenlängenanteile ausgeblendet werden. Der Detektor kann auch als Farbdetektor, beispielsweise als Farbkamera ausgestaltet sein. Genauso ist es möglich, dass ein dispersives Element das Detektionslicht auf mehrere Detektoren aufteilt, um eine Spektraldetektion zu erreichen.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen: Fig. 1 Ein erfindungsgemäßes Objektiv
Fig. 2 Ein weiteres erfindungsgemäßes Objektiv
Fig. 3 Ein weiteres erfindungsgemäßes Objektiv
Fig. 4 Ein erfindungsgemäßes Mikroskop und
Fig. 5 Ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Objektiv 1 , das zur totalinternen Reflektionsmikroskopie verwendet werden kann. In der hinteren Brennebene 3 des Objektivs 1 ist eine Lichtquelle 5 angeordnet, die aus einer ersten Einzellichtquelle 7 und einer zweiten Einzellichtquelle 9 gebildet ist. Die erste Einzellichtquθlle 7 umfasst eine Light-Emitting-Diode (LED), während die zweite Einzellichtquelle einen Halbleiterlaser beinhaltet. Die Einzellichtquellen 7, 9 emittieren Beleuchtungslicht 11 , 13 unterschiedlicher Wellenlängen. Das Objektiv umfasst eine Frontlinse 15 und eine weitere Linse 17. Das Beleuchtungslicht 11 bzw. das Beleuchtungslicht 13 tritt unter einem Winkel Betta bzw. unter einem Winkel Alpha zur optischen Achse 19 aus dem Mikroskopobjektiv aus. Der Winkel ist durch Verschieben der Einzellichtquelle 7 bzw. durch Verschieben der Einzellichtquelle 9 innerhalb der hinteren Brennebene einstellbar. Hierzu wird der Abstand der Einzellichtquelle 7 bzw. der weiteren Einzellichtquelle 9 zur optischen Achse mit einer nicht gezeigten mechanischen Stellvorrichtung verändert. Das Objektiv 1 weißt ein Objektivgehäuse 21 auf.
Fig. 2 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Objektiv 1 mit einem Objektivgehäuse 21 , dass eine erste Öffnung 23 und eine weitere Öffnung 25 aufweist. Das Objektiv weist ringförmig angeordnete Einzellichtquellen 27, 29 auf, die ringförmig angeordnet sind und zu einer Lichtquelle 5 gehören. Die Lichtquelle 5 ist außerhalb des Objektivgehäuses 21 angeordnet und das Licht der Lichtquelle 5 wird über die erste Öffnung 23 und über die zweite Öffnung 25 sowie über weitere nicht gezeigte Öffnungen im Objektivgehäuse 21 eingekoppelt. Zur Einkopplung sind im Bereich der hinteren Brennebene 3 des Objektivs 1 Umlenkmittel 31 , 33 vorgesehen, die das Licht der Lichtquelle 5 in den weiteren Strahlengang des Objektivs 1 lenken.
Fig. 3 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Objektiv mit einem Objektivgehäuse 21 , hinter dessen hinterer Brennebene 3 das Austrittsende 35 einer Beleuchtungslichtleitfaser 37 angeordnet ist. Das Beleuchtungslicht 39 einer Lichtquelle 5, die als Laser 41 ausgebildet ist, wird mit Hilfe einer Einkoppeloptik 43 in die Beleuchtungslichtleitfaser 37 eingekoppelt. Der Abstand des Austrittsendes 35 der Beleuchtungslichtleitfaser 37 zur optischen Achse 19 des Objektivs 1 ist mechanisch verstellbar. Hierzu ist das Austrittsende der Beleuchtungslichtleitfaser innerhalb der hinteren Brennebene 3 des Objektivs 1 beweglich angeordnet. Das aus der Beleuchtungslichtleitfaser 37 austretende Beleuchtungslicht 45 verlässt das Objektiv 21 unter einem Winkel Alpha zur optischen Achse 19. Dieser Winkel ist durch Verstellen der Position des Austrittsendes 35 der Beleuchtungslichtleitfaser 37 innerhalb der hinteren Brennebene 3 des Objektivs 1 einstellbar.
Fig. 4 zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop mit einem Objektiv 1, wie es in Fig. 2 beschrieben wurde. Das von der Einzellichtquelle 27 ausgehende Beleuchtungslicht 47 beleuchtet die auf dem Deckglas 49 angeordnete Probe 51 evaneszent. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 53 gelangt durch das Mikroskopobjektiv 1 hindurch zur Tubuslinse 55 und wird anschließend von dem Spiegel 57 und über die Optik 59 zum Detektor 61 , der als CCD-Kamera 63 ausgestaltet ist, gelenkt. Vor dem Detektor 61 ist ein Filterrad 65 mit mehreren unterschiedlichen Einzelfiltern zur Auswahl des Detektionsspektralbereichs angeordnet.
Fig. 5 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop, dass ähnlich ausgebildet ist wie das bezüglich Fig. 4 geschilderte Mikroskop. Zusätzlich ist ein konfokaler Scanner 67 vorgesehen, dessen Scanlichtstrahl 69 durch die Scanlinse 71 hindurch über den Strahlteiler 73 in den Strahlengang des Mikroskops eingekoppelt wird. Der Scanlichtstrahl 69, der in der Figur gestrichelt ausgeführt ist, gelangt durch die Tubuslinse und das Mikroskopobjektiv zur Probe 51. Der Scanlichtstrahl 69 kann beispielsweise zum Anregen der Probe zusätzlich zum evaneszenten Feld und/oder zum Manipulieren der Probe verwendet werden. Simultan zum Aufnehmen eines Abbildes der Probe mit dem Detektor 61 kann auch eine konfokale Rasterbildaufnahme der Probe erfolgen, wobei der konfokale Scanner 67 von der Probe ausgehendes Detektionslicht 75 (gestrichelt gezeichnet), das auf umgekehrtem Lichtweg, wie der Scanstrahl 69 zum konfokalen Scanner 67 gelangt, empfängt.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Bezugszeichenliste:
1 Objektiv
3 hintere Brennebene
5 Lichtquelle
7 erste Einzellichtquelle
9 zweite Einzellichtquelle
11 Beleuchtungslicht
13 Beleuchtungslicht
15 Frontlinse
17 weitere Linse
19 optische Achse
21 Objektivgehäuse
23 erste Öffnung
25 weitere Öffnung
27 Einzellichtquelle
29 Einzellichtquelle 1 Umlenkmittel
33 Umlenkmittel 5 Austrittsende 7 Beleuchtungslichtleitfaser 9 Beleuchtungslicht 1 Laser 3 Einkoppeloptik 5 Beleuchtungslicht 47 Beleuchtungslicht
49 Deckglas
51 Probe
53 Detektionslicht
55 Tubuslinse
57 Spiegel
59 Optik
61 Detektor
63 Kamera
65 Filterrad
67 Scanner
69 Scanlichtstrahl
71 Scan linse
73 Strahlteiler
75 Detektionslicht

Claims

Patentansprüche
1. Objektiv zur Totaliπterneπ-Reflexions-Mikroskopie, dadurch gekennzeichnet, dass im Bereich der hinteren Brennebene des Objektivs eine Lichtquelle und/oder zumindest ein Umlenkmittel, das das Licht einer Lichtquelle in das Objektiv lenkt, und/oder das Austrittsende einer Beleuchtungslichtleitfaser angeordnet ist.
2. Objektiv nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle zumindest einen Laser, insbesondere einen Halbleiterlaser, und/oder zumindest eine LED umfasst.
3. Objektiv nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dass die Lichtquelle mehrere Einzellichtquellen umfasst, die ringförmig angeordnet sind.
4. Objektiv nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle mehrere Einzellichtquellen umfasst, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren.
5. Objektiv nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzellichtquellen unabhängig voneinander ein- und ausschaltbar sind.
6. Objektiv nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optik vorgesehen ist, die das Licht der Lichtquelle auf das Umlenkmittel fokussiert.
7. Objektiv nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine teilweise Beschichtung eines Objektivelements, insbesondere einer Linse, das Umlenkmittel bildet.
8. Objektiv nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die teilweise Beschichtung eine, vorzugsweise dielektrische, Spiegelbeschichtung umfasst.
9. Objektiv nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht der Lichtquelle nach Durchlaufen des Objektivs unter zumindest einem einstellbaren Winkel zur optischen Achse aus dem Objektiv austritt.
10. Objektiv nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Position der Lichtquelle und/oder des zumindest einen Umlenkmittels und/oder des Austrittsendes innerhalb der Brennebene veränderbar ist.
11. Objektiv nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das der Winkel für Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlänge unterschiedlich ist.
12. Mikroskop zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie mit einer Lichtquelle und mit einem Objektiv, dadurch gekennzeichnet, dass im Bereich der hinteren Brennebene des Objektivs die Lichtquelle und/oder zumindest ein Umleπkmittel, das das Licht der Lichtquelle in das Objektiv lenkt, und/oder das Austrittsende einer Beleuchtungslichtleitfaser, die von der Lichtquelle gespeist ist, angeordnet ist.
13. Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die
Lichtquelle zumindest einen Laser, insbesondere einen Halbleiterlaser, und/oder zumindest eine LED umfasst.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dass die Lichtquelle mehrere Einzellichtquellen umfasst, die ringförmig angeordnet sind.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle mehrere Einzellichtquellen umfasst, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzellichtquellen unabhängig voneinander ein- und ausschaltbar sind.
17. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optik vorgesehen ist, die das Licht der Lichtquelle auf das Umlenkmittel fokussiert.
18. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine teilweise Beschichtung eines Objektivelements, insbesondere einer Linse, das Umlenkmittel bildet.
19. Mikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die teilweise Beschichtung eine, vorzugsweise dielektrische, Spiegelbeschichtung umfasst.
20. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht der Lichtquelle nach Durchlaufen des Objektivs unter zumindest einem einstellbaren Winkel zur optischen Achse aus dem Objektiv austritt.
21. Mikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die
Position der Lichtquelle und/oder des zumindest einen Umlenkmittels und/oder des Austrittsendes innerhalb der Brennebene veränderbar ist.
22. Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das der Winkel für Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlänge unterschiedlich ist.
23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop einen Detektor, insbesondere einen Multibanddetektor aufweist, der synchron zum Einschalten der Lichtquelle und/oder der Einzellichtquellen detektiert. 24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop umfasst.
25. Verwendung eines Mikroskops nach einem der Ansprüche 12 bis
24. bei biologischen Experimenten, insbesondere bei Photoactivation und/oder Caged-Combound-Release und/oder FRAP (Fluorecence recovery after photobleaching).
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