DE10327987A1

DE10327987A1 - Konfokales optisches System

Info

Publication number: DE10327987A1
Application number: DE2003127987
Authority: DE
Inventors: Filipp Prof. Oesterhelt; Claus Prof. Seidel
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2003-06-21
Filing date: 2003-06-21
Publication date: 2005-01-20
Also published as: WO2004113988A1

Abstract

Konfokales optisches System, umfassend: Einkopplungsmittel (15) zum Einkoppeln von Licht einer Lichtquelle (14) zur wenigstens bereichsweisen Beleuchtung eines Objektes, erste Abbildungsmittel (18) zur Abbildung von Licht aus einem Messbereich (11) des Objektes (12) in einer zu der Ebene (10) des Messbereichs konjugierten Ebene (20), reflektive Separationsmittel (40), die im Bereich der konjugierten Ebene (20) angeordnet sind, zur Trennung von Licht aus dem Messbereich (11) und Licht aus den Messbereich (11) umgebenden Objektbereichen, einen ersten Detektor (32') und einen zweiten Detektor (32) zur separaten Erfassung von Licht aus dem Messbereich (11) und Licht aus den umgebenden Objektbereichen, wobei die reflektiven Separationsmittel (40) in der konjugierten Ebene (20) wenigstens eine optische Öffnung aufweisen, durch welche Licht aus dem Messbereich (11) hindurchtreten und auf den ersten Detektor (32') abgebildet werden kann, während Licht aus den umgebenden Objektbereichen zur Abbildung auf den zweiten Detektor (32) reflektiert werden kann oder wobei die reflektiven Separationsmittel (40) in der konjugierten Ebene (20) wenigstens einen optischen Durchlassbereich aufweisen, durch welchen Licht aus den den Messbereich (11) umgebenden Objektbereichen hindurchtreten und auf den ersten Detektor (32') abgebildet werden kann, während Licht aus dem Messbereich (11) zur Abbildung auf den zweiten Detektor (32) reflektiert werden kann.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein konfokales optisches System, umfassend:

– Einkopplungsmittel zum Einkoppeln von Licht einer Lichtquelle zur wenigstens bereichsweisen Beleuchtung eines Objektes,
– erste Abbildungsmittel zur Abbildung von Licht aus einem Messbereich des Objektes in einer zu der Ebene des Messbereichs konjugierten Ebene,
– Reflektive Separationsmittel, die im Bereich der konjugierten Ebene angeordnet sind, zur Trennung von Licht aus dem Messbereich und Licht aus den Messbereich umgebenden Objektbereichen,
– einen ersten Detektor und einen zweiten Detektor zur separaten Erfassung von Licht aus dem Messbereich und Licht aus den umgebenden Objektbereichen.

Konfokale optische Systeme finden in der Wissenschaft vielfach Anwendung, wobei bildgebende und nicht bildgebende Systeme bekannt sind. Der besondere Vorteil eines konfokalen Systems liegt darin, dass ein Messbereich in einem interessierenden Objekt in seiner dreidimensionalen Ausdehnung sehr genau definierbar ist. Dieser Vorteil offenbart sich beispielsweise bei fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen „dicker" Objekte, d.h. von Objekten, deren räumliche Ausdehnung in Richtung der optischen Achse wesentlich größer ist als der tatsächlich interessierende Messbereich. Auch bei fokussierter Beleuchtung des Messbereiches lässt es sich in der Regel nicht vermeiden, dass auch den Messbereich umgebende Objektbereiche beleuchtet werden. In dem beispielhaft genannten Fall der Fluoreszenzmikroskopie führt dies zu Anregungen von Flurophoren in diesen umgebenden Objektbereichen und damit zur Emission von Fluoreszenzlicht aus diesen Bereichen gemeinsam mit dem Fluoreszenzlicht aus dem eigentlich interessierenden Messbereich. Bei einem konfokalen Aufbau der Messapparatur wird das aus dem Objekt ausgesandte Licht zunächst im Bereich einer Ebene abgebildet, die zu der Objektebene, in welcher sich der interessierende Messbereich befindet, konjugiert ist. Dabei wird Licht aus der Ebene des Messbereichs in der konjugierten Ebene scharf abgebildet, während Licht aus Ebenen oberhalb oder unterhalb der Messbereichsebene entsprechend unterhalb oder oberhalb der konjugierten Ebene scharf abgebildet werden. Das Konfokalprinzip beruht nun darauf, dass im Bereich der konjugierten Ebene Separationsmittel angeordnet sind, mit deren Hilfe es möglich wird, Licht aus dem Messbereich und Licht aus umgebenden Objektbereichen unterschiedlich zu behandeln.
Beim klassischen Konfokalaufbau sind die Separationsmittel als eine senkrecht zur optischen Achse stehenden Lochblende ausgeführt, wobei die Öffnung der Lochblende exakt an der Stelle positioniert ist, an der das aus dem Messbereich stammende Licht fokussiert wird. Neben der Öffnung fokussiertes Licht, welches also aus in der Messbereichsebene neben dem Messbereich liegenden Objektbereichen stammt, wird vom Blendenmaterial absorbiert. Licht, welches aus Bereichen oberhalb oder unterhalb der Messbereichsebene stammt, ist in der konjugierten Ebene nicht fokussiert, sondern hat dort die Gestalt eines großflächigen, unscharfen Flecks. Es wird daher ebenfalls nahezu vollständig von dem Blendenmaterial absorbiert. Durch die Lochblende hindurch tritt also nur das Licht aus dem dreidimensional definierten Messbereich, das dann einer beliebigen, weiteren Behandlung unterzogen werden kann.
Ein Beispiel für eine derartige Weiterbehandlung ist die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie(FCS) zur Messung einzelner oder weniger Fluorophore (Einzelmolekülmessung) in einem ausgedehnten Volumen, beispielsweise einer biologischen Zelle. Bei solchen oder ähnlichen Messungen ist es häufig von besonderem Interesse, die Position des den aktuellen Messbereichs in dem Volumen exakt zu bestimmen, um beispielsweise unterschiedliche FCS-Signale unterschiedlichen Zellstrukturen zuordnen zu können.

DE 100 08 594 A1 offenbart ein konfokales optisches System mit zwei unabhängigen konfokalen Detektionsanordnungen. Während eine Detektionsanordnung als konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) ausgebildet ist, handelt es sich bei der anderen Detektionsanordnung um eine FCS-Anordnung, wie oben erläutert. Zur Bestimmung der Position des aktuellen Messbereichs im Objekt ist eine bewegliche Spiegeleinheit vorgesehen, die den Strahlengang zwischen den beiden Detektionsanordnungen umschalten kann. Dieses System weist jedoch zwei wesentliche Nachteile auf. Zum einen ist die räumliche Übereinstimmung von CLSM- und FCS-Messung von der Reproduzierbarkeit der mechanischen Bewegung des Spiegels abhängig, was in der Regel ungenügend oder nur mit erheblichem technischen Aufwand realisierbar ist. Zum anderen ist keine simultane Nutzung beider Detektionsanordnungen möglich. Ebenfalls in DE 100 08 594 A1 ist ein weiteres konfokales optisches System offenbart, bei dem zwei Detektionsanordnungen (CLSM und FCS) einen gemeinsamen Detektionsstrahlengang nutzen, wobei das Licht aus dem Messbereich mittels teildurchlässiger Spiegel oder Strahlteiler unterschiedlichen Detektionsanordnungen zugeführt wird. Dieses System ermöglicht zwar die simultane Nutzung beider Detektionsanordnungen, hat aber den Nachteil, dass jeder Anordnung nur ein Bruchteil des Detektionslichtes zur Verfügung gestellt wird, was die Einzelmessungen ungenauer macht und zu einer erhöhten Strahlenbelastung der Probe durch längere Messzeiten führt.

EP 0 911 667 A1 offenbart ein gattungsbildendes System, bei dem die Separationsmittel im Bereich der konjugierten Ebene reflektiv ausgeführt sind. Sie sind insbesondere als ein sogenanntes DMD-Modul (digital micromirror device) realisiert, bei dem eine Vielzahl von miniaturisierten Spiegelelementen flächendeckend auf einem Chip angeordnet sind, deren Winkelstellung programmierbar einzeln einstellbar ist. Hat nun das Spiegelelement auf den das aus einem Messbereich stammende Licht fokussiert wird, eine erste Winkelstellung und die ihn umgebenden Spiegelelemente eine zweite Winkelstellung, können das Licht aus dem Messbereich und das Licht aus den umgebenden Objektbereichen auf unterschiedliche, bildgebende Detektoren reflektiert werden. Dieses System nutzt also das bei dem klassischen Aufbau verworfene Licht aus den umgebenden Objektbereichen zum Aufbau eines (nicht konfokalen) Bildes (Weitfeldmessung), das an der Stelle des Messbereichs einen dunklen Fleck aufweist, der zur Lokalisierung des Messbereichs im Objekt herangezogen werden kann. Dieses System ermöglicht eine simultane Durchführung der konfokalen und nicht-konfokalen Messung ohne Zeitverlust. Allerdings muss dieses System als technisch sehr aufwendig angesehen werden, was sich in hohen Kosten für das Gerät an sich sowie dessen komplexe Programmierung niederschlägt. In der genannten Druckschrift wird das System zur simultanen Messung einer Vielzahl von Messbereichen in einem Objekt mit dem Ziel einer besonders schnellen und probenschonenden, bildgebenden Messung offenbart, wobei die Informationen aus den jeweils umgebenden Objektbereichen für eine komplexe Bildanalyse verwendet werden. Für diese komplexe Anwendung erscheint der zur Realisierung des Systems notwendige technische Aufwand gerechtfertigt. Bei anderen Anwendungen jedoch, bei denen beispielsweise lediglich die Lokalisation einer FCS-Messung in einem Objekt gefragt ist, muss der hohe Aufwand als gravierender Nachteil angesehen werden. Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gattungsgemäßes System derart weiterzubilden, dass auf einfache Weise eine simultane Durchführung einer konfokalen wie einer Weitfeldmessung ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 dadurch gelöst, dass die reflektiven Separationsmittel in der konjugierten Ebene wenigstens eine optische Öffnung aufweisen, durch welche Licht aus dem Messbereich hindurchtreten und auf den ersten Detektor abgebildet werden kann, während Licht aus den umgebenden Objektbereichen zur Abbildung auf den zweiten Detektor reflektiert werden kann.

Auf diese Weise kann das Licht, das aus den Messbereich umgebenden Objektbereichen stammt zum Aufbau eines nicht-konfokalen Bildes genutzt werden, während gleichzeitig das Licht aus dem Messbereich konfokal erfasst und auf geeignete Weise weiter verwertet werden kann. Im Gegensatz zum Stand der Technik ist dieses System auf besonders einfache Weise kostengünstig realisierbar. Auch ist es vergleichsweise leicht möglich, klassische Konfokal-Systeme erfindungsgemäß nachzurüsten und so deren Anwendungsspektrum erheblich zu erweitern.

Das erfindungsgemäße System lässt sich besonders kostengünstig realisieren, indem die reflektiven Separationsmittel als eine gegen die konjugierte Ebene um einen Winkel schrägstehende Lochblende ausgebildet sind, deren dem Objekt zugewandte Fläche verspiegelt ist. Die Schrägstellung der Lochblende erfolgt zu dem Zweck, dass Licht aus den umgebenden Objektbereichen auf einen Detektor außerhalb des übrigen Detektionsstrahlengangs gelenkt wird. Es können Lochblenden mit einem oder mehreren Löchern zur Parallelisierung der Messung vorgesehen sein.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung gegenüber dem gattungsbildenden Stand der Technik besteht darin, dass eine besonders empfindliche FCS-Messung in dem konfokalen Strahlengang mit einer minimierten Anzahl optischer Elemente durchgeführt werden kann. Insbesondere ist keine Umlenkung mittels eines mechanisch bewegbaren Spiegelelementes in direkter Nachbarschaft einer Vielzahl weiterer beweglicher Spiegelelementes erforderlich, so dass eine minimale Störanfälligkeit bei maximaler Vibrationsbeständigkeit erreicht wird.

Bei einer alternativen Ausführungsform wird statt der Lochblende, welche eine mechanische Durchgangsöffnung enthält, eine transparente Scheibe verwendet, deren dem Objekt zugewandte Fläche um wenigstens einen transparenten Durchlassbereich herum verspiegelt ist. Damit wird auf fertigungstechnisch besonders einfache Weise eine optische Öffnung mit sie umgebender Spiegelfläche ausgebildet. Ist das transparente Trägersubstrat, z.B. Glas, Quarz, Saphir oder ähnliches, geeignet ausgewählt, so dass die konfokale Messung nicht beeinträchtigt wird, stellt diese Variante eine besonders kostengünstige Alternative zu einer echten Lochblende dar. Es können Scheiben mit einem oder mehreren transparenten Durchlassbereichen zur Parallelisierung der Messung vorgesehen sein.

Ist eine optische Öffnung in der Blendenebene kreisförmig ausgeführt, führt dies zu einer ovalen Projektion in der konjugierten Ebene. Um dem entgegen zu wirken, kann bei einer besonders günstigen Ausführungsform vorgesehen sein, dass eine optische Öffnung oval ausgebildet ist, derart, dass eine Projektion in die konjugierte Ebene kreisförmig ist.

Alternativ wird die genannte Aufgabe in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 5 dadurch gelöst, dass die reflektiven Separationsmittel in der konjugierten Ebene wenigstens einen optischen Durchlassbereich aufweisen, durch welchen Licht aus den den Messbereich umgebenden Objektbereichen hindurchtreten und auf den ersten Detektor abgebildet werden kann, während Licht aus dem Messbereich zur Abbildung auf den zweiten Detektor reflektiert werden kann.

Diese Variante des erfindungsgemäßen Systems lässt sich besonders kostengünstig realisieren, indem die reflektiven Separationsmittel als eine gegen die konjugierte Ebene um einem Winkel schräg stehende, transparente Scheibe ausgebildet sind, deren dem Objekt zugewandte Fläche innerhalb eines transparenten Durchlassbereichs wenigstens einen verspiegelten Flächenbereich aufweist. Der Zweck der Schrägstellung ergibt sich analog aus dem oben gesagten. Es können Scheiben mit einem oder mehreren verspiegelten Flächenbereichen zur Parallelisierung der Messung vorgesehen sein.

Ist ein verspiegelter Flächenbereich in der Scheibenebene kreisförmig ausgeführt, führt dies zu einer ovalen Projektion in der konjugierten Ebene. Um dem entgegen zu wirken, kann bei einer besonders günstigen Ausführungsform vorgesehen sein, dass ein verspiegelter Flächenbereich oval ausgebildet ist, derart, dass eine Projektion in die konjugierte Ebene kreisförmig ist.

Die konkrete Ausgestaltung der Detektoren kann unterschiedlich erfolgen. So ist bei einer vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass der zweite Detektor ein bildgebender Detektor ist. Im Bereich der bildgebenden Detektoren stehen dem Fachmann eine Vielzahl von Varianten, beispielsweise CCD, CID, o.ä. zur Verfügung, die in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung geeignet ausgewählt werden können.

Bei manchen Anwendungen, z.B. bei der Messung von Einzelmolekülen, welche sich in einem vergleichsweise großen Volumen bewegen können, ist weniger die Positionsbestimmung des Messbereichs in einem größeren Objekt von Bedeutung, sondern vielmehr die Erkenntnis, ob und wie das interessierende Fluorophor im Messbereich positioniert ist oder aus diesem auswandert.

Bei einer besonders günstigen Ausführungsform ist daher vorgesehen, dass der zweite Detektor -bildgebend oder nicht bildgebend- aus einer Mehrzahl von Detektoreinheiten besteht, deren optische Eingangsflächen parallel zu einer Abbildungsebene räumlich versetzt zueinander angeordnet sind. Dies kann beispielsweise in Form einer mehrfach, z.B. zwei- oder viergeteilten Photodiode oder mehrere CCD-Detektoren erfolgen, der die einzelnen Diodenflächen geeignet geschaltet sind, um ein Wandern eines Lichtpunktes zu detektieren. Dabei kann das System so eingerichtet sein, dass im Fall, dass sich ein interessierendes lichtemittierendes Objekt im Messvolumen befindet, auf dem zweiten Detektor kein Signal erfasst wird, da das gesamte emittierte Licht auf den ersten Detektor geleitet wird. Beginnt das interessierende Molekül jedoch aus dem Messbereich auszuwandern, kann es mit dem zweiten Detektor erfasst werden, wobei die beschriebene räumlich versetzte Anordnung einzelner Detektoreinheiten die Bestimmung der Auswanderungsrichtung ermöglicht.

Eine solche Ausführungsform des zweiten Detektors ist jedoch nur in der Lage, die Auswanderungsrichtung in der Ebene des Messbereichs zu erkennen. Eine Auswanderung senkrecht dazu würde lediglich zu einer Vergrößerung des Lichtflecks auf dem zweiten Detektor führen, was keine Aussage über das Vorzeichen der Auswanderungsrichtung erlaubt. Um Abhilfe zu schaffen kann der Detektor etwas außerhalb der konjugierten Ebene angeordnet werden, sodass das Bild eines Fluorophors zwar größer als sein minimales, beugungsbegrenztes Bild ist, eine Positionsänderung des Fluorophors aus der Messebene hinaus bewirkt dann aber -je nach Bewegungsrichtung- ein kleiner oder größer werdendes Bild, woraus die Bewegungsrichtung eindeutig bestimmbar ist.

Günstiger kann es jedoch sein, wie bei einer vorteilhaften Weiterbildung vorgesehen, die optischen Eingangsflächen der einzelnen Detektoreinheiten senkrecht zu einer Abbildungsebene räumlich gestaffelt anzuordnen. Bei geeigneter Ausführung hat eine Auswanderung des interessierenden Fluorophors senkrecht zur Messbereichsebene eine Vergrößerung des Teillichtflecks auf einer Detektoreinheit zur Folge, während sich ein ergänzender Teillichtfleck auf einer anderen, räumlich weiter vorne oder weiter hinten angeordneten Detektoreinheit verkleinern bzw. verschwinden würde. Durch geeignete Auswertung der Detektorsignale kann damit auch das Vorzeichen der Auswanderungsrichtung senkrecht zur Messbereichsebene erkannt werden.

Die konkrete Ausführung der einzelnen Detektoreinheiten bzw. ihrer Eingangsflächen kann auf unterschiedliche Weise erfolgen, so ist bei einer vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass die optischen Eingangsflächen der einzelnen Detektoreinheiten als die Stirnseiten optischer Fasern oder Faserbündel ausgebildet sind. Diese können das einfallende Licht dann vorzugsweise jeweils einem nicht-bildgebenden Sensorelement zuleiten. Als Sensorelement kann etwa eine besonders empfindliche Avalanche-Photodiode (APD) oder ähnliches verwendet werden. Bei einer anderen Ausführungsform ist vorgesehen, dass die einzelnen Detektoreinheiten jeweils bildgebend, z.B. als unabhängige CCD-Elemente, ausgeführt sind.

Ein ähnlicher Effekt wie durch die räumliche Staffelung einzelner Detektoreinheiten senkrecht zu einer Abbildungsebene kann erzielt werden, indem die Abbildungsmittel zur Abbildung des Lichts aus den umgebenden Objektbereichen auf den zweiten Detektor eine astigmatische Abbildungseinheit umfassen. Wie dem Fachmann bekannt ist, haben astigmatische Abbildungseinheiten, insbesondere astigmatische Linsen, keinen Brennpunkt, sondern zwei im Wesentlichen senkrecht zu einander stehende Brennlinien in unterschiedlichen Abständen vor bzw. hinter der Linsenebene. Bei Verwendung einer astigmatischen Abbildungseinheit zur Abbildung auf den zweiten Detektor äußert sich ein Auswandern eines Lichtpunktes aus dem Messbereich senkrecht zur Messbereichsebene in einer Längsverformung des Lichtflecks in der Eingangssebene des Detektors, wobei die Ausrichtung der Formänderung ein Hinweis auf das Vorzeichen der Auswanderungsrichtung aus dem Messbereich ist.

Obwohl die astigmatische Abbildung und die räumliche Staffelung von Detektoreinheiten senkrecht zu einer Abbildungsebene vornehmlich alternativ gedacht sind, ist selbstverständlich eine Kombination beider Maßnahmen möglich.

Um die mögliche Messdauer auch bei wanderndem Lichtpunkt zu maximieren, sind bei einer vorteilhaften Weiterbildung Nachführmittel vorgesehen, mittels derer die Kolokalisation eines gegebenen Objektelementes und des Messbereichs beibehalten werden kann.

Derartige Nachführmittel können entweder den optischen Strahlengang (Beleuchtungs- und/oder Detektionsstrahlengang) des Systems ändern oder aber das Objekt selber entsprechend bewegen.

Zur Automatisierung der Nachführung ist vorzugsweise eine Datenverarbeitungseinheit zur Aufnahme und Auswertung von Messsignalen des zweiten Detektors einerseits sowie zur Ansteuerung der Nachführmittel andererseits vorgesehen, welche programmtechnisch derart eingerichtet ist, dass die Nachführmittel in Abhängigkeit von Auswertungsergebnissen der Messsignale des zweiten Detektors ansteuerbar sind.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden, ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.

In den Zeichnungen zeigen
1: einen schematischen Strahlengang einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Systems;
2a: eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Abbildung auf den zweiten Detektor;
2b: eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Abbildung des zweiten Detektors;
3a: eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Abbildung auf den zweiten Detektor.
3b: eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Abbildung des zweiten Detektors.
1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes konfokales optisches System. In einer Messbereichsebene 10 liegt der interessierende Messbereich 11 eines ausgedehnten Objektes 12, z.B. einer biologischen Zelle. Die Ausrichtung der Messbereichsebene 10 wird definiert durch die optische Achse 13 des Detektionsstrahlengangs des Systems, die senkrecht auf der Messbereichsebene 10 steht.
Das dargestellte System zeigt eine für Fluoreszenzmessungen geeignete Variante. Im Detektionsstrahlengang ist eine Lichtquelle 14, insbesondere eine Lasereinheit angeordnet, deren Licht mittels der Optik 15 parallelisiert bzw. deren Laserstrahl geeignet auf geweitet wird. Über einen für das Anregungslicht reflektiven Strahlteiler 16 wird das Anregungslicht mit dem Objektiv 17 im Messbereich 11 fokussiert. Das vom Messbereich emittierte, aufgrund der Stokes-Verschiebung längerwellige Fluoreszenzlicht passiert den Strahlteiler 16 im Wesentlichen parallel und wird von der ersten Abbildungsoptik 18 in einer Ebene 20 erneut fokussiert, welche zu der Messbereichsebene 10 konjugiert ist. Über eine weitere Abbildungsoptik 31' wird das Licht erneut parallelisiert und in der Eingangsebene 30' des Detektors 32' fokussiert. Der Detektor 32' kann beliebig ausgestaltet sein, ist für FCS-Messungen jedoch vorzugsweise als empfindliche Photodiode oder Photo-Counting-Vorrichtung ausgestaltet. Im nicht-idealen, realistischen Fall werden auch den Messbereich 11 umgebende Objektbereiche von dem Anregungslicht beleuchtet, so dass auch Fluorophore in diesen Bereichen Fluoreszenzlicht emittieren. Licht aus umgebenden Objektbereichen in der Messbereichsebene 10 werden in der konjugierte Ebene 20 seitlich versetzt von dem Licht aus dem Messbereich 11 abgebildet, während Licht aus umgebenden Objektbereichen außerhalb der Messbereichsebene 10 oberhalb bzw. unterhalb der konjugierten Ebene 20 fokussiert werden.
Im Bereich der konjugierten Ebene 20 ist bei der dargestellten Ausführungsform eine verspiegelte Lochblende 40 angeordnet, die gegen die konjugierte Ebene 20 um einen Winkel α schräggestellt ist. Die Öffnung der Lochblende ist mit dem Abbildungspunkt des Lichtes aus dem Messbereich 12 kolokalisiert. Das bedeutet, dass dieses Licht, wie in 1 mit den durchgezogenen Linien angedeutet, ungehindert hindurchtreten und auf den Detektor 32' abgebildet werden kann. Das Licht aus den umgebenden Objektbereichen wird hingegen von der spiegelnden Fläche 41 der Lochblende 40 aus dem Detektionsstrahlengang des Detektors 32' in den Detektionsstrahlengang des zweiten Detektors 32 reflektiert. Zur Abbildung auf den Detektor 32 wird eine geeignete Abbildungsoptik 31 verwendet.
Die in 1 mit dem Bezugszeichen 30 versehene Eingangsebene des Detektors 32 ist eine gedachte Ebene, die zu der konjugierten Ebene 20 und der Messbereichsebene 10 konjugiert ist. In dieser Ebene wird lediglich Licht aus den umgebenden Objektbereichen in der Messbereichsebene 10 scharf abgebildet. Licht aus umgebenden Objektbereichen außerhalb der Messbereichsebene 10 werden dagegen vor oder hinter der Ebene 30 scharf abgebildet. 2a zeigt den Detektionsstrahlengang des zweiten Detektors 32 in einer ersten Ausführungsform, bei der eine Abbildungslinse 311 als herkömmliche sphärische Linse ausgebildet ist. Das in der Brennebene der Linse 311 entstehende Bild des Lichtes aus den umgebenden Objektbereichen ist schematisch als Lichtfleck 312 dargestellt, der in seinem Inneren eine Verdunklung 313 aufweist, die dem Messbereich entspricht. Der Bereich 313 ist ein Verdunklungsbereich, da das entsprechende Licht aus dem Messbereich erfindungsgemäß auf den ersten Detektor 32' geleitet wurde.
2b stellt eine mit der Abbildungsoptik gem. 2a besonders vorteilhaft zusammenwirkende Ausführungsform des Detektors 32 dar. Der Detektor weist dabei vier einzelne Detektoreinheiten 321, 322, 323 und 324 auf, die sowohl in der Abbildungsebene als auch senkrecht dazu, d.h. parallel zur optischen Achse räumlich gestaffelt angeordnet sind. Die Detektoreinheiten 321 und 322 liegen dabei in einer vorgelagerten Ebene im Vergleich zu den Detektoreinheiten 323 und 324.
Diese Ausführungsform eignet sich besonders zur Messung einzelner Fluorophore. Befindet sich das interessierende Fluorophor exakt im Messbereich, wird auf dem Detektor 32 kein Signal detektiert. Beginnt das Fluorophor jedoch aus dem Messbereich auszuwandern, kann durch die zweifach gestaffelte Anordnung der Detektoreinheiten sowohl die Auswanderung in der Messbereichsebene als auch senkrecht dazu erkannt werden.
3a zeigt eine weitere Ausführungsform des Detektionsstrahlengangs des Detektors 32. Dabei ist eine Abbildungslinse 314 als astigmatische Linse ausgebildet. Mit den Bezugszeichen 315 und 317 sind die länglichen Lichtflecke bezeichnet, die sich als Abbildung des Lichtes aus den umgebenden Objektbereichen um die jeweiligen Brennlinien der Linse 314 ergeben. Auch die Lichtflecke 315 und 317 weisen zentrale Verdunklungen 316 und 318 auf, die von der Umleitung des Lichtes aus dem Messbereich auf den ersten Detektor 32 herrühren.
3b zeigt eine Ausführungsform des Detektors 32, die in besonders vorteilhafter Weise mit der astigmatischen Anordnung von 3a zusammenwirkt. Auch hier ist der Detektor 32 aus vier einzelnen Detektorelementen zusammengesetzt, deren Eingangsflächen 325, 326, 327 und 328 in einer gemeinsamen Abbildungsebene angeordnet sind. Die Eingangsflächen sind bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel die Stirnflächen von optischen Fasern, die das einfallende Licht jeweils einer hochempfindlichen Sensoreinheit zuführen.
Wie in 3b durch den schraffierten und den senkrecht dazu stehenden, gestrichelten Lichtfleck angedeutet, äußert sich bei dieser Anordnung eine Auswanderung eines Lichtpunktes aus dem Messbereich senkrecht zur Messbereichsebene in einer Verformung des Lichtflecks in der Abbildungsebene, wobei in 3b zwei Extremformen dargestellt sind. Diese Verformung hängt vor allem vom Vorzeichen der Auswanderungsrichtung ab, wobei ihre konkrete Form jedoch wesentlich vom optischen Aufbau mitbestimmt wird.
Natürlich stellen die in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele lediglich besonders vorteilhafte Ausführungsformen zur Illustration der Erfindung dar. Auf Grundlage der in den Ansprüchen definierten technischen Lehre kann der Fachmann, insbesondere im Hinblick auf die konkrete Ausgestaltung des Anregungsstrahlengangs, des Detektionsstrahlengangs, der speziellen Form der Separationsmittel und der Bau- und Funktionsweise der einzelnen Detektoren vielfältige Abwandlungen auffinden.

Claims

Konfokales optisches System, umfassend: – Einkopplungsmittel (15) zum Einkoppeln von Licht einer Lichtquelle (14) zur wenigstens bereichsweisen Beleuchtung eines Objektes, – erste Abbildungsmittel (18) zur Abbildung von Licht aus einem Messbereich (11) des Objektes (12) in einer zu der Ebene (10) des Messbereichs konjugierten Ebene (20), – Reflektive Separationsmittel (40), die im Bereich der konjugierten Ebene (20) angeordnet sind, zur Trennung von Licht aus dem Messbereich (11) und Licht aus den Messbereich (11) umgebenden Objektbereichen, – einen ersten Detektor (32') und einen zweiten Detektor (32) zur separaten Erfassung von Licht aus dem Messbereich (11) und Licht aus den umgebenden Objektbereichen dadurch gekennzeichnet, dass die reflektiven Separationsmittel (40) in der konjugierten Ebene (20) wenigstens eine optische Öffnung aufweisen, durch welche Licht aus dem Messbereich (11) hindurchtreten und auf den ersten Detektor (32') abgebildet werden kann, während Licht aus den umgebenden Objektbereichen zur Abbildung auf den zweiten Detektor (32) reflektiert werden kann.
Optisches System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die reflektiven Separationsmittel als eine gegen die konjugierte Ebene (20) um einen Winkel (α) schräg stehende Lochblende (40) ausgebildet sind, deren dem Objekt zugewandte Fläche (41) verspiegelt ist.
Optisches System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die reflektiven Separationsmittel als eine gegen die konjugierte Ebene um einem Winkel schräg stehende, transparente Scheibe ausgebildet sind, deren dem Objekt zugewandte Fläche um wenigstens einen transparenten Durchlassbereich herum verspiegelt ist.
Optisches System nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Öffnung oval ausgebildet ist, derart, dass ihre Projektion in die konjugierte Ebene kreisförmig ist.
Konfokales optisches System, umfassend: – Einkopplungsmittel (15) zum Einkoppeln von Licht einer Lichtquelle (14) zur wenigstens bereichsweisen Beleuchtung eines Objektes, – erste Abbildungsmittel (18) zur Abbildung von Licht aus einem Messbereich (11) des Objektes (12) in einer zu der Ebene (10) des Messbereichs konjugierten Ebene (20), – Reflektive Separationsmittel (40), die im Bereich der konjugierten Ebene (20) angeordnet sind, zur Trennung von Licht aus dem Messbereich (11) und Licht aus den Messbereich (11) umgebenden Objektbereichen, – einen ersten Detektor (32') und einen zweiten Detektor (32) zur separaten Erfassung von Licht aus dem Messbereich (11) und Licht aus den umgebenden Objektbereichen dadurch gekennzeichnet, dass die reflektiven Separationsmittel (40) in der konjugierten Ebene (20) wenigstens einen optischen Durchlassbereich aufweisen, durch welchen Licht aus den den Messbereich (11) umgebenden Objektbereichen hindurchtreten und auf den ersten Detektor (32') abgebildet werden kann, während Licht aus dem Messbereich (11) zur Abbildung auf den zweiten Detektor (32) reflektiert werden kann.
Optisches System nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet dass die reflektiven Separationsmittel als eine gegen die konjugierte Ebene um einem Winkel schräg stehende, transparente Scheibe ausgebildet sind, deren dem Objekt zugewandte Fläche innerhalb eines transparenten Durchlassbereichs wenigstens einen verspiegelten Flächenbereich aufweist.
Optisches System nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein verspiegelter Flächenbereich oval ausgebildet ist, derart, dass seine Projektion in die konjugierte Ebene kreisförmig ist.
Optisches System nach einem vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Detektor (32) ein bildgebender Detektor ist.
Optisches System nach einem vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Detektor (32) aus einer Mehrzahl von Detektoreinheiten (321, 322, 323, 324; 325, 326, 327, 328) besteht, deren optische Eingangsflächen parallel zu einer Abbildungsebene räumlich versetzt zueinander angeordnet sind.
Optisches System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Eingangsflächen der einzelnen Detektoreinheiten (321, 322, 323, 324) senkrecht zu einer Abbildungsebene räumlich gestaffelt angeordnet sind.
Optisches System nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Eingangsflächen der einzelnen Detektoreinheiten (325, 326, 327, 328) als die Stirnseiten optischer Fasern oder Faserbündel ausgebildet sind.
Optisches System nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die optischen Fasern oder Faserbündel einfallendes Licht jeweils einem nicht-bildgebenden Sensorelement zuleiten.
Optisches System nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Detektoreinheiten jeweils bildgebend ausgeführt sind.
Optisches System nach einem vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zweite Abbildungsmittel (31) zur Abbildung des Lichts aus den umgebenden Objektbereichen auf den zweiten Detektor (32) eine astigmatische Abbildungseinheit (314) umfassen.
Optisches System nach einem vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Nachführmittel vorgesehen sind, mittels derer die Kolokalisation eines gegebenen Objektelementes und des Messbereichs beibehalten werden kann.
Optisches System nach einem vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Datenverarbeitungseinheit zur Aufnahme und Auswertung von Messsignalen des zweiten Detektors sowie zur Ansteuerung der Nachführmittel vorgesehen ist, welche programmtechnisch derart eingerichtet ist, dass die Nachführmittel in Abhängigkeit von Auswertungsergebnissen der Messsignale des zweiten Detektors ansteuerbar sind.