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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung der Orientierung von Molekülen in biologischen Proben, insbesondere in Zellen, unter Anwendung der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie.
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Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie wird das Brechungsverhalten von Licht beim Übergang von einem optisch dichteren in ein optisch dünneres Medium genutzt. So ergibt sich beispielsweise für den Übergang von Deckglas (n1 = 1,518) zu Wasser (n2 = 1,33) ein kritischer Winkel von 61 °, der Winkel der Total-Reflexion. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion (Winkel ≥ 61 °) bildet sich im Medium mit geringerem Brechungsindex eine stehende evaneszente Welle. Die Intensität dieser Welle fällt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab. Aufgrund dessen werden von der Grenzfläche weiter entfernte Fluorophore nicht angeregt. Die Hintergrundfluoreszenz wird erheblich reduziert. Der Bildkontrast wird dabei verbessert und die Auflösung wird gleichzeitig deutlich gesteigert. Voraussetzung für die Nutzung des voranstehend geschilderten Phänomens ist ein ausreichend großer Unterschied der Brechungsindizes von Deckglas und Medium.
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Aus der
US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch Totalinterne-Reflextion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt.
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Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
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Aus der
DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen, bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von –0,4 und –0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen –0,5 und –2 liegt.
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Aus der
DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF-Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n × 180 ° – d)/60 °).
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Aus der
DE 101 43 481 A1 ist ebenfalls ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.
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Aus der
US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem bekannt, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.
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Aus der
DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dort wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Dies ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.
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Des Weiteren ist aus der
US 2003/0058530 A1 eine Vorrichtung zur Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie bekannt, die jedoch nicht zur Ermittlung der Orientierung von Molekülen in biologischen Proben verwendet wird.
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Insbesondere bei der Untersuchung biologischer Proben, vor allem bei der Untersuchung der molekularen Struktur von Zellen, besteht der Bedarf, die Orientierung der Moleküle bzw. Dipole in der Probe zu ermitteln. Dabei wäre es von besonderem Vorteil, wenn man die Ermittlung entsprechender Orientierungen mit Vorrichtungen durchführen könnte, die sich zur Untersuchung der biologischen Proben ohnehin bereits im Einsatz befinden.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Ermittlung der Orientierung von Molekühlen in biologischen Proben, insbesondere in Zellen, anzugeben, welches apparative Einrichtungen nutzt, die zur Untersuchung biologischer Proben ohnehin bereits zum Einsatz kommen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach nutzt das erfindungsgemäße Verfahren zur Ermittlung der Orientierung von Molekülen in biologischen Proben, insbesondere in Zellen, die Totalinterne-Reflexions-Mikroskopie, wobei Beleuchtungslicht durch ein Objektiv hindurch in der Ebene der Objektivpupille fokussiert wird, wobei durch Beleuchtung unterschiedlicher Positionen in der Objektivpupille unterschiedlich orientierte evaneszente Felder in der Probe erzeugt werden und wobei daraus resultierende unterschiedliche Intensitäten an Fluoreszenz mit unterschiedlichen Orientierungen der Moleküle in der Probe korrelieren.
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Erfindungsgemäß ist zunächst einmal erkannt worden, dass sich die Totalinterne-Reflexions-Mikroskopie auch zur Ermittlung der Orientierung von Molekülen in biologischen Proben eignet. Dabei ist wesentlich, dass im Rahmen dieser besonderen Art der Mikroskopie ein Mikroskopobjektiv durch eine punktförmige Beleuchtung der Objektivaustrittspupille evaneszent beleuchtet wird. Dies geschieht dadurch, dass Beleuchtungslicht durch ein Objektiv hindurch in der Ebene der Objektivpupille fokussiert wird. Im Rahmen dieses Verfahrens werden unterschiedliche Positionen in der Objektivpupille angefahren bzw. beleuchtet, wodurch sich in Bezug auf das in der Probe entstehende evaneszente Feld eine ganz besondere Situation ergibt, nämlich in Bezug auf die Ausbreitungsrichtung des evaneszenten Feldes relativ zu den jeweiligen Molekülen in der Probe. Entsprechend dem auf die Grenzfläche auftreffenden Lichtstrahl ergibt sich eine Ausbreitungsrichtung des evaneszenten Feldes in der vom einfallenden Lichtstrahl und dem auf die Grenzfläche stehenden Lot gebildeten Ebene. Entsprechend der Position des Beleuchtungslichts in der Objektivpupille und auch entsprechend dem Auftreffwinkel des Lichts erhält die in der Probe entstehende evaneszente Welle eine bestimmte Orientierung, wodurch sich eine Ausbreitungsrichtung des evaneszenten Feldes relativ zu der zu untersuchenden Probe und somit zu den darin befindlichen Molekülen ergibt. Aus der besonderen Art der Beleuchtung, nämlich mittels eines evaneszenten Feldes mit definierter Ausbreitungsrichtung, ergeben sich unterschiedliche Intensitäten an Fluoreszenz. Diese unterschiedlichen Intensitäten korrelieren mit den jeweiligen – unterschiedlichen – Orientierungen der Moleküle bzw. Dipole in der Probe, so dass sich entsprechend der „ Antwort“ der Moleküle im Wege der Intensitäten an Fluoreszenz die Orientierung der Moleküle feststellen lässt.
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An dieser Stelle sei angemerkt, dass es zur Ermittlung der Orientierung von Molekülen in biologischen Proben mittels Totalinterner-Reflexions-Mikroskopie erforderlich ist, unterschiedliche Positionen in der Objektivpupille mit Beleuchtungslicht zu fokussieren, um nämlich unterschiedlich orientierte evaneszente Felder auszulösen. Nur dann ist es möglich, durch einen Intensitätsvergleich des Fluoreszenzlichts Rückschlüsse auf die Orientierung der Moleküle zu treffen.
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Zur Beleuchtung der Probe wird in bevorzugter Weise eine Laserlichtquelle verwendet. Eine übliche Weißlichtquelle, beispielsweise mit Schlitzblende, lässt sich ebenfalls verwenden.
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Des Weiteren ist es von Vorteil, wenn zur Beleuchtung unterschiedlicher Positionen in der Objektivpupille, insbesondere zur Beleuchtung beliebiger Positionen, der Lichtstrahl mittels einer zweidimensional wirkenden Einstelleinrichtung positioniert wird. Dabei lassen sich Einstelleinrichtungen verwenden, wie sie beispielsweise aus der
WO 2005/031427 A1 oder aus der
WO 2005/031432 A1 – für sich gesehen – bekannt sind. Noch einmal sei angemerkt, dass es hier um die Beleuchtung unterschiedlicher Positionen in der Objektivpupille geht, wodurch unterschiedlich orientierte evaneszente Felder in der Probe erzeugbar sind. Mit Hilfe einer zweidimensional wirkenden Einstelleinrichtung lassen sich beliebige Punkte in der Objektivpupille ausleuchten, so dass eine solche Einstelleinrichtung den Anforderungen zur Ermittlung der Orientierung von Molekülen in biologischen Proben entspricht. Im Falle der Verwendung einer Laserlichtquelle lässt sich der Laserlichtstrahl mittels der Einstelleinrichtung beliebig in der Objektivpupille positionieren, wodurch wiederum die Orientierung der Moleküle innerhalb der Zelle entsprechend den voranstehenden Ausführungen auflösbar und entsprechend darstellbar ist.
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Mit dem Beleuchtungslicht werden unterschiedliche Positionen in der Objektivpupille beleuchtet, wobei sich entsprechend der jeweiligen Position des Beleuchtungslichts eine bestimmte relative Orientierung des resultierenden evaneszenten Feldes zu der jeweiligen Molekülorientierung ergibt. So ergeben sich Wechselwirkungen zwischen den Bausteinen der Zelle – Moleküle bzw. Dipole – und der Ausbreitungsrichtung des evaneszenten Feldes aus der Lage des Bausteins innerhalb der biologischen Umgebung.
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Im Konkreten entstehen aufgrund unterschiedlicher Orientierungen zwischen der Ausbreitungsrichtung des evaneszenten Feldes und der Orientierung der Moleküle in der Probe unterschiedliche Wechselwirkungsquerschnitte, die wiederum zu unterschiedlichen Intensitäten der Fluoreszenz führen. Aus den unterschiedlichen Intensitäten lassen sich die jeweiligen Lagen bzw. Orientierungen der Moleküle ableiten.
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In besonders vorteilhafter Weise wird die Probe in einer vorzugsweise vorgebbaren Sequenz von Pupillenpositionen evaneszent beleuchtet. Daraus resultiert wiederum eine Sequenz von evaneszenten Feldern mit unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen, woraus sich aus der dabei entstehenden Fluoreszenz bzw. Intensität der Fluoreszenz Bilder erzeugen lassen. Aus der sich innerhalb der Sequenz ändernden Intensität der Fluoreszenz wird die Orientierung eines Moleküls bzw. der in der Probe befindlichen Moleküle bestimmt.
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Im Rahmen der evaneszenten Beleuchtung der Probe in einer bestimmten Sequenz ist es von weiterem Vorteil, wenn die Sequenz der Pupillenpositionen derart gewählt wird, dass daraus resultierende evaneszente Felder unter einem vorgebbaren Winkel zueinander orientiert sind, um nämlich eine Abgrenzung in Bezug auf mögliche Orientierung der Moleküle vornehmen zu können. So kann die Sequenz der Pupillenposition derart gewählt werden, dass daraus resultierende evaneszente Felder zunächst einmal orthogonal zueinander orientiert sind, um nämlich eine grenzwertmäßige Betrachtung in Bezug auf die Orientierung der Moleküle vornehmen zu können. Dabei wird der besonderen beispielhaften Situation Rechnung getragen, dass ein Molekül bzw. Dipol bei einem unter einem bestimmten Winkel auf das Molekül auftreffenden evaneszenten Feld mit hoher Intensität fluoresziert, während bei einer um 90° gedrehten bzw. versetzten Orientierung des evaneszenten Feldes kaum mehr oder gar keine Fluoreszenz auftritt.
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Zu einer eindeutigen Bestimmung der Orientierung eines Moleküls, insbesondere eines Dipols, ist es von weiterem Vorteil, wenn dessen Emissionsverhalten bei unterschiedlich orientierten evaneszenten Feldern zu dem Molekül als bekannt vorausgesetzt wird, so dass sich aus den unterschiedlichen Intensitäten entsprechend des Sequenz von Positionen des Beleuchtungslichts in der Objektivpupille die Orientierung des Moleküls herleitbar ist.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
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1 in einer schematischen Darstellung das Prinzip der evaneszenten Beleuchtung im Falle der Totalreflexion und
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2a und 2b schematische Ansichten auf eine Probe, wobei sich das evaneszente Feld entsprechend der Position des Beleuchtungslichts in der Objektivpupille mit unterschiedlicher Orientierung gegenüber einem Molekül bzw. Dipol einer biologischen Probe ausbreitet.
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1 zeigt vom Prinzip her die evaneszente Beleuchtung bei Totalreflexion. Die zu beleuchtende Probe ist lediglich durch deren Grenzfläche 1 dargestellt. Ein Laserlichtstrahl 2 wird als Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille fokussiert, wodurch sich eine ganz besondere Position des fokussierten Beleuchtungslichts auf der Probe bzw. Grenzfläche 3 ergibt. Zum Lot 4 hin trifft der Laserlichtstrahl 2 unter einem bestimmten Winkel α auf die Probe. Der einfallende Laserlichtstrahl 2 wird totalreflektiert, was durch den reflektierten Laserlichtstrahl 5 dargestellt ist.
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Entsprechend dem evaneszenten Beleuchtungsprinzips dringt ein evaneszentes Feld in die Probe ein, welches durch den Pfeil 6 symbolisiert ist. Pfeil 7 symbolisiert die Ausbreitungsrichtung des evaneszenten Feldes.
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Die 2a und 2b zeigen im Rahmen von Prinzipdarstellungen zwei unterschiedliche Einstellungen in Bezug auf die Positionen des Beleuchtungslichts in der Objektivpupille.
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Gemäß der Darstellung in 2a liegt die Position 8 des Beleuchtungslichts, nämlich die relative Position des Lasers in der Objektivpupille, bei einem Azimut 9.00 Uhr. Entsprechend ergibt sich eine Ausbreitungsrichtung 9 des evaneszenten Feldes in Bezug auf die zu untersuchende Probe 10, wobei der Einfachheit halber ein Dipol 13 dargestellt ist. So zeigt 2a die relative Position, das daraus resultierende evaneszente Feld mit seiner Ausbreitungsrichtung 9 in Bezug auf die Orientierung des Dipols 13. Dabei ist vorstellbar, dass der Dipol 13 bei entsprechender evaneszenter Beleuchtung nicht wechselwirkt, so dass keine oder kaum Intensität an Fluoreszenzlicht feststellbar ist.
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Gemäß der Darstellung in 2b hat sich die Position 11 des Laserlichts gegenüber der Darstellung in 2a von Azimut 9.00 Uhr auf Azimut 12.00 Uhr verändert, woraus sich eine entsprechend geänderte Ausbreitungsrichtung 12 des evaneszenten Feldes relativ zu der zu untersuchenden Probe 10 bzw. des Dipols 13 ergibt. Dabei ist vorstellbar, dass hier eine Wechselwirkung mit dem Dipol 13 stattfindet, so dass eine gewisse Intensität an Fluoreszenzlicht detektierbar ist.
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Im Hinblick auf weitere Merkmale und Vorteilsangaben, die sich den Figuren nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.
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Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass das voranstehende erörterte Ausführungsbeispiel lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiel einschränkt.
