DE102016201440A1

DE102016201440A1 - Bilderfassungsvorrichtung einer Mikroskopanordnung, Mikroskopanordnung und Mikroskopieverfahren

Info

Publication number: DE102016201440A1
Application number: DE102016201440.4A
Authority: DE
Inventors: Thomas KALKBRENNER; Tiemo Anhut
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2016-02-01
Filing date: 2016-02-01
Publication date: 2017-08-03

Abstract

Die Erfindung betrifft Bilderfassungsvorrichtung (1) für eine Mikroskopanordnung (A) umfassend einen Detektor (4) mit einem Array von Sensorelementen (5); ein Lichtleitelement (6) aufweisend eine Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle (7), wobei jeder der Lichtleitkanäle (7) mit einem Lichteingang (7.1) an einer gemeinsamen Lichteingangsfläche (8) der Lichtleitkanäle (7) und mit einem Lichtausgang (7.2) an einer gemeinsamen Lichtaustrittsfläche (9) der Lichtleitkanäle (7) endet und das Array von Sensorelementen (5) der Lichtaustrittsfläche (9) zur Erfassung einer in wenigstens einer Teilmenge der Mehrzahl von Lichtleitkanälen (7) geleiteten und aus der Lichtaustrittsfläche (9) austretenden Detektionsstrahlung (20) zugewandt angeordnet sind; eine Beleuchtungseinrichtung (16), mittels der mindestens eine zur Erzeugung der Detektionsstrahlung (20) in einer Probe (17) geeignete Beleuchtungsstrahlung (15) erzeugt oder erzeugbar ist, wobei die Beleuchtungsstrahlung (15) anteilig durch in der Probe (17) befindliche Objekte als Detektionsstrahlung (20) reflektiert und/oder die Objekte durch die Beleuchtungsstrahlung (15) zur Fluoreszenz angeregt werden können. Erfindungsgemäß ist eine Auswerteeinheit (24) vorhanden, die derart konfiguriert ist, dass die Detektionsstrahlung (20) jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) erfassbar ist, eine zweidimensionale Ausdehnung und/oder der Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene (XY) erfassbar ist und eine dreidimensionale Position (PX,Y,Z) des Objekts in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) ermittelbar ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Mikroskop (2), eine Mikroskopanordnung (A), Verwendungen des Mikroskops (2) und/oder der Mikroskopanordnung (A) und ein Mikroskopieverfahren.

Description

Die Erfindung betrifft eine Bilderfassungsvorrichtung einer Mikroskopanordnung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Mikroskopanordnung mit der Bilderfassungsvorrichtung, eine Verwendung der Bilderfassungsvorrichtung oder der Mikroskopanordnung sowie ein Mikroskopieverfahren.
Für die Weitfeldmikroskopie sind grundsätzlich die physikalischen Gesetze der optischen Abbildung auflösungsbestimmend. Man spricht bekanntermaßen auch von der Beugungsgrenze. Seit einiger Zeit werden verschiedene Verfahren zur Überwindung dieser Beugungsgrenze in der Mikroskopie, insbesondere der Lumineszenz- oder Fluoreszenzmikroskopie (Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden) entwickelt und angewendet.
Ein Verfahren, das eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erreicht, ist beispielsweise aus der WO 2006/127692 bekannt. Dort werden ein gattungsgemäßes Verfahren und ein gattungsgemäßes Mikroskop beschrieben. Das als PALM (Photo Activated Light Microscopy) abgekürzte Verfahren verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels optischer Strahlung aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz dann zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Für die Aktivierung und die Fluoreszenzanregung können je nach Markierungssubstanz Strahlungen verschiedener Wellenlängen oder auch Strahlung ein und derselben Wellenlänge verwendet werden. Nicht aktivierte Moleküle der Markierungssubstanz senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine oder zumindest keine merkliche Fluoreszenzstrahlung ab. Die Aktivierung bewirkt deshalb ein Umschalten und man spricht deshalb von einem Umschaltsignal. Im PALM-Verfahren wird das Umschaltsignal so aufgebracht, daß zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so weit beabstandet sind, daß sie gemessen an der optischen Auflösung des verwendeten Weitfeldmikroskops getrennt erfasst oder mittels geeigneter Auswerteverfahren nachträglich trennbar sind. Die aktivierten Moleküle erscheinen im aufgenommenen Weitfeldbild weitgehend isoliert. Für diese isolierten Moleküle kann man rechnerisch das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter Strahlenverteilung ermitteln und die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmen, als es das verwendete Weitfeldmikroskop eigentlich zulässt. Diese gesteigerte Auflösung durch rechnerische Schwerpunktbestimmung der Beugungsverteilung wird in der englischsprachigen Fachliteratur auch als „super resolution“ bezeichnet.
Die verwendeten Verfahren, für das die oben erwähnte PAL-Mikroskopie nur ein Beispiel ist, nutzen zum Isolieren einzelner Markierungsmoleküle in der Regel die Tatsache, daß die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Markierungsmolekül durch das Umschaltsignal aktiviert wird, für alle Moleküle gleich ist. Dadurch kann dafür gesorgt werden, daß die Wahrscheinlichkeit, in einem gegebenen Flächenbereich der Probe vorhandene Markierungsmoleküle zu aktivieren so gering ist, daß es ausreichend große Bereiche gibt, in denen innerhalb der optischen Auflösung des verwendeten Weitfeldmikroskops nur unterscheidbare Markierungsmoleküle Fluoreszenzstrahlung emittieren. Durch passende Gestaltung der Umschaltung, beispielsweise durch passende Wahl der Intensität des Umschaltsignals, wird nun erreicht, daß möglichst nur bezogen auf die optische Auflösung des Weitfeldmikroskops isoliert liegende Markierungsmoleküle aktiviert werden und nachfolgend Fluoreszenzstrahlung aussenden. Die Ortsbestimmung erfolgt deshalb als Ausgangsbasis einer hochempfindlichen Weitfeldmikroskopie und erreicht in deren Bildern eine hochgenaue Lokalisierung einzelner Moleküle im Nanometerbereich.
Da in einem einzelnen Bild nur eine Untermenge der Moleküle der Probe im fluoreszierenden Zustand ist, wird das Verfahren sehr oft wiederholt, sodass verschiedene stochastische Untermengen der Markierungsmoleküle fluoreszieren. Die verschiedenen Varianten dieser Mikroskopie, welche auch mit den Kürzeln PALM, STORM, D-STORM, etc. bezeichnet werden, unterscheiden sich hauptsächlich in der Wahl der Markierungsmoleküle (Fluorophore) und in der Art der Umschaltung.
Eine aus der EP 0 909 947 A2 bekannte Lösung zur Erfassung von Detektionsstrahlung betrifft ein Messsystem zur Detektion optischer Signale eines Mikroassays. Dabei werden von einer Vielzahl einzelner Proben, die beispielsweise in einer Mikrotiterplatte vorgelegt sind, mittels eines hochauflösenden Glasfaser-Tapers die von jeder Probe emittierten Signale erfasst und auf einen Bildsensor geleitet. Das Messsystem ermöglicht damit zwar die zeitgleiche Erfassung optischer Signale einer Vielzahl von Proben, nicht aber eine Lokalisierung eines Ursprungsorts des Signals unterhalb der durch die einzelnen Fasern des Glaserfaser-Tapers gegebenen Auflösung.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine gegenüber dem Stand der Technik vereinfachte Möglichkeit zur hochauflösenden Erfassung mindestens einer Detektionsstrahlung vorzuschlagen, durch die zugleich eine dreidimensionale Lokalisation des Ursprungsorts der jeweiligen Detektionsstrahlung in einer Probe ermöglicht ist. Eine weitere der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein gegenüber dem Stand der Technik vereinfachtes Verfahren zur hochauflösenden Erfassung mindestens einer Detektionsstrahlung und der Lokalisation des Ursprungsorts der jeweiligen Detektionsstrahlung in einer Probe vorzuschlagen.
Die Aufgabe wird hinsichtlich der Möglichkeit zur hochauflösenden Erfassung durch eine Bilderfassungsvorrichtung gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch eine Mikroskopanordnung gemäß den Merkmalen des Anspruchs 13 gelöst. Hinsichtlich des Verfahrens wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 18 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Eine Bilderfassungsvorrichtung einer Mikroskopanordnung umfasst einen Detektor mit einem Array von Sensorelementen und ein Lichtleitelement aufweisend eine Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle, wobei jeder der Lichtleitkanäle mit einem Lichteingang an einer gemeinsamen Lichteingangsfläche der Lichtleitkanäle und mit einem Lichtausgang an einer gemeinsamen Lichtaustrittsfläche der Lichtleitkanäle endet und das Array von Sensorelementen der Lichtaustrittsfläche zur Erfassung einer aus der Lichtaustrittsfläche austretenden Detektionsstrahlung zugewandt angeordnet sind. Die Bilderfassungsvorrichtung weist eine Beleuchtungseinrichtung auf, mittels der mindestens eine zur Erzeugung der Detektionsstrahlung in einer Probe geeignete Beleuchtungsstrahlung erzeugt oder erzeugbar ist, wobei die Beleuchtungsstrahlung anteilig durch in der Probe befindliche Objekte als Detektionsstrahlung reflektiert wird und/oder die Objekte durch die Beleuchtungsstrahlung zur Fluoreszenz angeregt werden können.
Erfindungsgemäß umfasst die Bilderfassungsvorrichtung eine Auswerteeinheit, die derart konfiguriert ist, dass die Detektionsstrahlung jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene erfassbar ist. Mittels der Auswerteeinheit ist eine zweidimensionale Ausdehnung und/oder eine Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene erfassbar. Die Auswerteeinheit ist ferner derart konfiguriert, dass eine dreidimensionale Position des Objekts in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene ermittelbar ist.
Unter einer Mikroskopanordnung wird mindestens ein Mikroskop verstanden. Das Mikroskop kann mittels einer Halterung, beispielsweise eines Gehäuses oder eines Stativs, gehalten sein. Eine Mikroskopanordnung kann in weiteren Ausführungen mehrere Mikroskope umfassen, die zur Durchführung gleicher oder verschiedener Mikroskopieverfahren ausgebildet sind.
Ein Mikroskop ist beispielsweise eine optische Vorrichtung, mittels der ein Objekt mit einer Vergrößerung, die vorzugsweise größer als 1 ist, abgebildet wird oder abgebildet werden kann.
Ein Objekt ist beispielsweise ein Molekül, das durch die Beleuchtungsstrahlung zur Emission einer Detektionsstrahlung, beispielsweise zur Fluoreszenz, anregbar ist. Objekte können ferner Körper, beispielsweise Partikel, sein. Das Objekt kann die Beleuchtungsstrahlung oder spektrale Anteile der Beleuchtungsstrahlung reflektieren.
Eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene wird nachfolgend vereinfachend auch als Spot bezeichnet, wobei ein Spot jede beliebige Form, beispielsweise rund oder oval aufweisen kann. Der Spot kann ferner eine unregelmäßige Form aufweisen.
Ein Array von Sensorelementen ist eine Anordnung von zwei oder mehr Sensorelementen beispielsweise in Zeilen und Spalten einer Matrix. Jedes der Sensorelemente stellt ein Bildelement (Pixel) dar, respektive jedes der Sensorelemente erfasst ein Bildelement.
In weiteren Ausführungen der Bilderfassungsvorrichtung ist das Array durch Sensorelemente gebildet, die eine unregelmäßige Anordnung zueinander aufweisen. Ein Array kann in weiteren Ausführungen auch durch eine Kombination von regelmäßig und unregelmäßig angeordneten Sensorelementen gebildet sein.
Die Lichteingangsfläche und die Lichtaustrittsfläche erstrecken sich in einer möglichen Ausführung der Bilderfassungsvorrichtung in einer Ebene. In weiteren Ausführungen ist die Lichteingangsfläche und/oder die Lichtaustrittsfläche gewölbt, beispielsweise halbkugelförmiggewölbt, ausgebildet.
Die Auswerteeinheit ist beispielsweise ein Rechner und steht über eine Datenschnittstelle mit dem Detektor in einer zum Datentransfer geeigneten Verbindung.
Die Datenschnittstelle ist beispielsweise USB, LVDS, CamLink, FireWire, GigE oder ein noch zu entwickelnder Schnittstellentyp beziehungsweise Schnittstellenstandard.
Die Beleuchtungsstrahlung ist beispielsweise Licht, insbesondere Laserstrahlung, einer Wellenlänge in einem Wellenlängenbereich von 300 bis 1600 nm. Wird die Beleuchtungsstrahlung als Anregungsstrahlung verwendet, erfolgt die Auswahl der Beleuchtungsstrahlung in Abhängigkeit der anzuregenden Moleküle beziehungsweise der mit den Molekülen verbundenen Fluorophore.
In weiteren Ausführungen der Bilderfassungsvorrichtung ist die Beleuchtungsstrahlung zur Anregung von Molekülen mittels eines Multiphotonenprozesses geeignet. Vorteilhaft ist eine solche Ausführung mit einem weiteren Mikroskop gekoppelt, das zur Multiphotonenmikroskopie oder zur 2-Photonen-Mikroskopie ausgebildet ist. Die Beleuchtungsstrahlung ist dann vorteilhaft mittels des weiteren Mikroskops fokussierbar.
In einer weiteren möglichen Ausführung weist die Bilderfassungsvorrichtung einen Wellenleiter zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung in eine vorhandene Probe auf. Zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung in den Wellenleiter ist mindestens eine Einkoppelstruktur vorhanden. Die Beleuchtungsstrahlung ist in einen vor der Lichteingangsfläche liegenden Einkoppelbereich des Wellenleiters in die Probe eingekoppelt oder einkoppelbar. Der Einkoppelbereich und die Lichteingangsfläche sind derart zueinander ausgerichtet und beabstandet, dass die durch die Beleuchtungsstrahlung in der Probe bewirkte oder bewirkbare Detektionsstrahlung auf mindestens einen der Lichteingänge trifft.
Die Bilderfassungsvorrichtung, insbesondere deren Beleuchtungseinrichtung, ist in einer weiteren möglichen Ausführung derart ausgestaltet, dass mittels der Beleuchtungseinrichtung mindestens eine zur Erzeugung eines evaneszenten Feldes in der Probe geeignete Beleuchtungsstrahlung erzeugt oder erzeugbar ist.
Evaneszente Felder können beispielsweise eingesetzt werden, um Strukturen und Vorgänge an der Oberfläche und den oberflächennahen Schichten einer Probe zu beobachten. Dazu wird beispielsweise das Prinzip der Internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF, Total Internal Fluorescence Microscopy) angewendet. Es wird eine evaneszente Beleuchtung, auch als TIRF-Feld oder als evaneszentes Feld bezeichnet, mindestens eines Bereichs der Probe bewirkt, indem eine geeignete Beleuchtungsstrahlung beispielsweise mittels eines Wellenleiters unter einem flachen Winkel in die Probe eingekoppelt wird. Dabei wird die Beleuchtungsstrahlung an der Grenzfläche des Wellenleiters unter Totalreflexion in den Wellenleiter zurück reflektiert. Zur Erzeugung eines evaneszenten Feldes wird der Umstand ausgenutzt, dass trotz Totalreflexion Licht einer Wellenlänge über die Grenzfläche hinaus in das Medium jenseits der Grenzfläche eindringt und dort schnell abklingt. Durch die abklingende Welle wird das evaneszente Feld hervorgerufen.
Enthält die Probe Moleküle, die durch das Licht (Beleuchtungsstrahlung) des evaneszenten Felds zur Emission einer Detektionsstrahlung, beispielsweise zur Fluoreszenz, anregbar sind, können im Bereich des evaneszenten Feldes diese Moleküle zur Aussendung der Detektionsstrahlung angeregt werden, die erfasst und ausgewertet werden kann. Wird in einer Ausführung der Bilderfassungsvorrichtung kein evaneszentes Feld erzeugt, können Fluoreszenzen von Molekülen alternativ oder zusätzlich mittels Beleuchtungsstrahlung, beispielsweise durch ein weiteres Mikroskop, angeregt werden oder anregbar sein.
Um die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie anwenden zu können, umfasst die Bilderfassungsvorrichtung in einer möglichen Ausführung einen Detektor mit einem Array von Sensorelementen und ein Lichtleitelement aufweisend eine Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle, wobei jeder der Lichtleitkanäle mit einem Lichteingang an einer gemeinsamen Lichteingangsfläche der Lichtleitkanäle und mit einem Lichtausgang an einer gemeinsamen Lichtaustrittsfläche der Lichtleitkanäle endet und das Array von Sensorelementen der Lichtaustrittsfläche zur Erfassung einer aus der Lichtaustrittsfläche austretenden Detektionsstrahlung zugewandt angeordnet ist.
Es ist eine Beleuchtungseinrichtung vorhanden, mittels der mindestens eine zur Erzeugung eines evaneszenten Feldes in einer Probe geeignete Beleuchtungsstrahlung erzeugt oder erzeugbar ist. Weiterhin sind ein Wellenleiter zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung in eine vorhandene Probe und mindestens eine zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung in den Wellenleiter ausgebildeten Einkoppelstruktur ausgebildet. Die Beleuchtungsstrahlung ist in einen vor der Lichteingangsfläche liegenden Einkoppelbereich des Wellenleiters in die Probe eingekoppelt oder einkoppelbar. Der Einkoppelbereich und die Lichteingangsfläche sind derart zueinander ausgerichtet und beabstandet, dass die durch die Beleuchtungsstrahlung in der Probe bewirkte oder bewirkbare Detektionsstrahlung auf mindestens einen der Lichteingänge trifft. Ferner ist eine Datenschnittstelle zur Verbindung mit einer Auswerteeinheit vorhanden.
Die Beleuchtungsstrahlung kann wiederum anteilig durch in der Probe befindliche Objekte als Detektionsstrahlung reflektiert und/oder die Objekte durch die Beleuchtungsstrahlung (Anregungsstrahlung) zur Fluoreszenz angeregt werden.
Die Auswerteeinheit ist vorteilhaft derart konfiguriert, dass die Detektionsstrahlung jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene erfassbar ist. Mittels der Auswerteeinheit ist eine zweidimensionale Ausdehnung und/oder eine Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene erfassbar. Die Auswerteeinheit ist ferner vorteilhaft derart konfiguriert, dass eine Position des Objekts in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene ermittelbar ist.
Die Bilderfassungsvorrichtung weist in einer für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie geeigneten Ausführung den Wellenleiter zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung in eine Probe auf. Die Beleuchtungsstrahlung wird in dem Wellenleiter unter Totalreflexion an den Grenzflächen des Wellenleiters geführt. Über einen Bereich, über den die Probe mit dem Wellenleiter in Kontakt steht, insbesondere auf einer seiner Grenzflächen aufgetragen ist, ist der Einkoppelbereich gebildet. Wie bereits oben beschrieben, tritt in dem Einkoppelbereich ein Anteil der Beleuchtungsstrahlung in die Probe über, wodurch das evaneszente Feld erzeugt oder erzeugbar ist. Mittels des Wellenleiters können sehr große evaneszente Felder mit sehr guter optischer Qualität auf stabile Weise erzeugt werden.
Um ein Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung in den Wellenleiter zu ermöglichen, weist dieser mindestens eine Einkoppelstruktur auf.
Diese Einkoppelstruktur ist beispielsweise ein optisch wirksames Prisma, ein Gitter und/oder eine zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung ausgebildete Stirnfläche. Die Einkoppelstruktur ist dabei beispielsweise mit einer bestimmten Qualität und/oder Strukturierung der Oberfläche ausgebildet, mittels der beziehungsweise mittels denen ein Einkoppeln ermöglicht, zumindest aber unterstützt ist.
Der Wellenleiter ist in einer möglichen Ausführung als ein selbständiges Element ausgebildet.
In weiteren Ausführungen ist der Wellenleiter auf einem Substrat aufgebracht, beispielsweise mit diesem kraft- und/oder formschlüssig verbunden. Eine solche Ausführung ist beispielsweise mittels mindestens einer konischen und/oder profilierten Vertiefung, zum Beispiel in der Art einer Schwalbenschwanzführung, realisiert.
Die hochbrechende Schicht des Wellenleiters besteht beispielsweise aus Tantalpentoxid (Ta₂O₅).
Der Wellenleiter ist in weiteren Ausführungen mittels einer bereichsweisen Gefügeänderung des Substrats ausgebildet und/oder durch Auftragen eines von dem Substrat abweichenden Materials realisiert. Ein Auftrag weiteren Materials kann beispielsweise durch Gießen oder Beschichten, aber auch durch Aufkleben oder Aufschweißen des weiteren Materials, durch Beschichten und/oder durch selektives Abtragen eines beispielsweise aufgeschleuderten Photoresist-Polymers erfolgen. Eine Gefügeänderung kann ferner durch Dotieren bewirkt sein.
Das Substrat ist beispielsweise ein Objektträger. Der Wellenleiter ist flächig an einer ersten Seitenfläche des Objektträgers ausgebildet. Dabei kann der Wellenleiter in und/oder auf dem Substrat ausgebildet sein.
Diese Ausführung einer erfindungsgemäße Bilderfassungsvorrichtung stellt ein dediziertes TIRF-Hochauflösungssystem mit einem einfachen optischen Aufbau dar, das auch für automatisierte Anwendungen, beispielsweise in TIRF-basierten Hochauflösungs-Readersystemen, geeignet ist. Mittels der Bilderfassungsvorrichtung, insbesondere mittels des Wellenleiters, ist im Gegensatz zu einer Verwendung eines TIRF-Objektivs ein großflächiges, homogenes evaneszentes Feld mit einer hohen Intensität bereitstellbar. Ferner kann die Bilderfassungsvorrichtung in einem hohen Maße integriert, also kompakt ausgebildet werden und kostengünstig produziert werden. In vorteilhaften, da preisgünstigen und einfach aufgebauten Ausführungen, ist die Bilderfassungsvorrichtung ohne eine optische Linse ausgebildet.
In einer vorteilhaften Ausführung der Bilderfassungsvorrichtung ist das Lichtleitelement eine Faserplatte oder ein Faser-Taper mit einer Anzahl lichtleitender Fasern als Lichtleitkanäle. Mittels der einzelnen Lichtleitkanäle in Form der Fasern ist die Detektionsstrahlung gezielt zu den jeweiligen Sensorelementen führbar, anstatt emittiertes Licht der Detektionsstrahlung mit optischen Linsen auf einen beugungsbeschränkten Punkt auf einer Kamera zu führen.
Eine Faserplatte weist eine Anzahl von meist parallel zueinander ausgerichteten Fasern und einen gleichbleibenden Querschnitt auf.
Dagegen verändert sich der Querschnitt eines Faser-Tapers in Verlaufsrichtung der Lichtleitkanäle. Infolge der Querschnittsveränderung ist die Lichtaustrittsfläche des Faser-Tapers an die Form und/oder Abmessungen des Detektors beziehungsweise dessen Sensorelemente anpassbar. Die Lichteintrittsfläche ist beispielsweise an eine Form und/oder die Abmaße eines Probenfeldes anpassbar.
Das Verhältnis von Lichteintrittsfläche und Lichtaustrittsfläche gibt den Abbildungsmaßstab der Faserplatte beziehungsweise des Faser-Tapers an.
Der Abbildungsmaßstab ist beispielsweise aus einem Bereich von 1 bis 6 gewählt.
Die Fasern können jeweils eine seitliche Umhüllung (cladding) aufweisen. Um eine hohe Übertragungseffizienz der Detektionsstrahlung sicherzustellen, sind die Lichtkanäle möglichst dicht gepackt und die Umhüllung ist möglichst dünn ausgebildet.
Um die Detektionsstrahlung von einem Ursprungsort in der Probe jeweils nur einem oder wenigen Sensorelemente zuzuleiten, ist in einer möglichen Ausführung der erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung jedem der Sensorelemente der Lichtausgang mindestens eines Lichtleitkanals zugeordnet. Vorteilhaft erfolgt diese Zuordnung eineindeutig, so dass ein Lichtleitkanal, insbesondere dessen Lichtausgang, jeweils nur einem einzigen Sensorelement zugeordnet ist.
Entspricht der Querschnitt eines Lichtleitkanals in seiner Dimensionierung dem Sensorelement, ist eine 1:1-Kopplung der Sensorelemente mit den Lichtleitkanälen ermöglicht.
Der Durchmesser der Lichtleitkanäle beträgt bei einer 1:1-Kopplung vorzugsweise weniger als 20 µm, beispielsweise 16 µm. bzw. ist im Idealfall an die Größe der Sensorelemente angepasst.
Einem Sensorelement können die Lichtausgänge mehrerer Lichtleitkanäle zugeordnet sein, so dass ein Kopplungsverhältnis von beispielsweise 2 (entspricht: 2:1; Lichtleitkanäle: Sensorelement) oder höher vorliegt.
Im Fall eines Kopplungsverhältnisses größer 1 sind die Durchmesser der Lichtleitkanäle vorteilhaft kleiner und betragen weniger als 10 µm, zum Beispiel 3 µm. bzw. ist der Durchmesser der Lichtleitkanäle vorteilhaft um einen durch die Wurzel des Kopplungsverhältnisses gegebenen Faktor kleiner als die Sensorelemente.
Eine nicht-eineindeutige Zuordnung der Lichtleitkanäle zu den Sensorelementen kann unter Nutzung geeigneter Analysealgorithmen durch Berechnungen bereinigt werden, wie weiter unten ausgeführt wird.
Um beispielsweise gestreute Beleuchtungsstrahlung zu reduzieren und somit die Qualität der Erfassung der Detektionsstrahlung zu verbessern, ist in weiteren Ausführungen der Bilderfassungsvorrichtung zwischen der Lichtaustrittsfläche und der zweiten Seitenfläche mindestens eine Filterschicht ausgebildet. Die mindestens eine Filterschicht ist beispielsweise auf der Lichtaustrittsfläche und/ oder auf der zweiten Seitenfläche ausgebildet. Bei einer Ausbildung der Filterschicht auf der zweiten Seitenfläche ist zudem eine Auswahl des Objektträgers mit einer spezifischen Filterschicht möglich, um einen Mikroskopievorgang einer Kombination einer bestimmten Probe und einer Beleuchtungsstrahlung zu optimieren. Diese Filterschicht kann bei Verwendung mehrerer Beleuchtungswellenlängen z. B. als multi-Notch Laserunterdrückungsfilter für die mehreren Wellenlängen ausgeführt werden, so dass bei Wellenlängenwechsel oder Mehrfarbmessungen kein Filterwechsel erforderlich wird.
Das Substrat, insbesondere der Objektträger und das Lichtleitelement sind vorteilhaft über mindestens eine Schicht eines optischen Koppelmediums miteinander optisch gekoppelt.
Ist beziehungsweise sind die Lichtaustrittsfläche und/ oder die zweite Seitenfläche mit einer Filterschicht beschichtet, dann sind die beschichtete Lichtaustrittsfläche und/ oder die beschichtete zweite Seitenfläche vorteilhaft über mindestens eine Schicht eines optischen Koppelmediums miteinander optisch gekoppelt.
Das Koppelmedium ist vorteilhaft ein Immersionsmedium mit einer hohen spezifischen Brechzahl wie Wasser, Öl, Glycerin, Gel oder ein transparenter Festkörper. Idealerweise hat das Koppelmedium die Brechzahl des Substrats und des Objektträgers. Weichen die Brechzahlen von Substrat und Objektträger voneinander ab, liegt die Brechzahl des Koppelmediums zwischen der Brechzahl des Substrats und der Brechzahl des Objektträgers.
Die Beleuchtungseinrichtung ist in weiteren Ausführungen der Bilderfassungsvorrichtung direkt an den Wellenleiter angekoppelt. Zwischen der Beleuchtungseinrichtung, die beispielsweise durch Hochleistungslaserdioden gebildet ist, und dem Wellenleiter sind keine zusätzlichen optischen Elemente erforderlich.
Die erfindungsgemäße Bilderfassungsvorrichtung ist sehr kompakt und ohne bewegliche Komponenten ausgebildet.
Zusätzlich oder alternativ zu der direkten Ankopplung der Beleuchtungseinrichtung an den Wellenleiter sind in weiteren Ausführungen der Wellenleiter, falls vorhanden, das Lichtleitelement und der Detektor in einer gemeinsamen Halterung relativ zueinander gehalten und bilden ein Bilderfassungsmodul.
Ist die gemeinsame Halterung unabhängig von einem Mikroskopgehäuse ausgebildet, ist das Bilderfassungsmodul leicht in verschiedene Mikroskope integrierbar und kann ebenfalls leicht wieder entnommen werden, um beispielsweise eine Wartung oder einen Austausch des Bilderfassungsmoduls durchzuführen.
Die Beleuchtungseinrichtung ist in weiteren Ausführungen ebenfalls an der Halterung angeordnet und mit ihrer optischen Achse zu der Einkoppelstruktur des Wellenleiters derart ausgerichtet, dass ein Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung ermöglicht ist.
Mit der an der Halterung angeordneten Beleuchtungseinrichtung bildet die Bilderfassungsvorrichtung vorteilhaft ein eigenständiges Superauflösungs-Mikroskopsystem, das sich durch eine sehr kompakte Baugröße auszeichnet.
Die erfindungsgemäße Bilderfassungsvorrichtung ist vorteilhaft stabil und kompakt ausführbar, wodurch deren Integration in ein Mikroskop oder die Nachrüstung eines Mikroskops mit der Bilderfassungsvorrichtung erleichtert ist.
Ein Mikroskop mit einer erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung ist beispielsweise ein Lichtmikroskop insbesondere in einer seiner Ausführungen als ein Fluoreszenzmikroskop, ein Konfokalmikroskop, ein 2-Photonenmikroskop, ein PALM-Mikroskop, ein STED-Mikroskop (Stimulated Emission Depletion), ein TIRF-Mikroskop oder ein Lichtscheibenmikroskop (SPIM, Single Plane Illumination Microscopy).
Die Beleuchtungsstrahlung kann beispielsweise als eine Weitfeldbeleuchtung ausgebildet sein, wobei es zweckmäßig ist, wenn die Beleuchtungsstrahlung unter einem Winkel auf die Probe gerichtet ist, der größer als ein Akzeptanzwinkel der Lichtleitkanäle ist, um eine direkte Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung in die Lichtleitkanäle zu vermeiden.
In weiteren Ausführungen der Bilderfassungsvorrichtung ist die Beleuchtungsstrahlung beispielsweise in Form eines Lichtblatts mit einer geringen Divergenz oder mittels eines weiteren Objektivs in die X-Y-Ebene gerichtet oder richtbar. In letzterem Fall ist es vorteilhaft mittels geeigneter Mittel, beispielsweise mittels Filtern oder mittels einer schiefen Beleuchtung mit einem Winkel größer dem Akzeptanzwinkel der Lichtleitkanäle die Beleuchtungsstrahlung soweit schräg einfallen zu lassen, dass eine direkte Einkopplung in die Lichtleitkanäle reduziert oder vermieden wird.
Vorteilhaft ist eine solche Ausführung mit einem weiteren Mikroskop gekoppelt, das zur Multiphotonenmikroskopie oder zur 2-Photonen-Mikroskopie ausgebildet ist. Die Beleuchtungsstrahlung ist dann vorteilhaft mittels des weiteren Mikroskops fokussierbar.
Die Erfindung betrifft ferner eine Mikroskopanordnung mit einer Bilderfassungsvorrichtung.
Dabei ist in einer möglichen Ausführung der Mikroskopanordnung eine optische Achse mindestens eines weiteren Mikroskops auf die Probe gerichtet oder richtbar. Mittels einer solchen Ausführung der Mikroskopanordnung sind beispielsweise vorteilhaft verschiedene Mikroskopieverfahren kombiniert durchführbar. Dazu ist beispielsweise das weitere Mikroskop zur Multiphotonenmikroskopie oder zur 2-Photonen-Mikroskopie ausgebildet.
In einer weiteren Ausführung der Mikroskopanordnung ist das weitere Mikroskop als ein punktscannendes Mikroskop ausgebildet. Eine solche Ausführung erlaubt beispielsweise eine Reduzierung der Strahlungsbelastung der Probe, indem eine Bestrahlung der Probe mit ungenutzter Beleuchtungsstrahlung vermieden oder zumindest reduziert wird.
Das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren umfasst die Schritte

i. des Beleuchtens einer Probe mit einer Beleuchtungsstrahlung,
ii. des Erzeugens einer Detektionsstrahlung, wobei die Beleuchtungsstrahlung anteilig durch in der Probe befindliche Objekte reflektiert und/oder gestreut und/oder die Objektedurch die Beleuchtungsstrahlung zur Fluoreszenz angeregt werden,
iii. des Leitens eines Anteils der Detektionsstrahlung mittels eines Lichtleitelements zu Sensorelementen eines Detektors, wobei das Lichtleitelement mit einer Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle gewählt wird, von denen jeder Lichtleitkanal einem Sensorelement zugeordnet wird, so dass die Detektionsstrahlung jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene (Spot) erfasst wird,
iv. des Erfassens einer zweidimensionalen Ausdehnung und/oder einer Form der Intensitätsverteilung in einer X-Y-Ebene und
v. des Ermittelns einer Position des Objekts in X,Y,Z-Richtung in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene.

Eine Position des Objekts in X- und/oder Y-Richtung in der X-Y-Ebene zu ermitteln ist mittels dem Fachmann bekannter Verfahren möglich.
Eine Position des Objekts in Z-Richtung, also eine Information über eine Tiefe des Ursprungsorts / des Objekts in der Probe, wird erhalten, indem die zweidimensionale Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung (Spot) ausgewertet wird. Das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren wird nicht mit einer klassischen optischen Abbildung über eine Linse oder ein Linsensystem ausgeführt. Es gibt also keinen Fokuspunkt der Detektionsoptik, daher ist der Spot am kleinsten, wenn das Objekt einen geringen Abstand zu den Lichtleitkanälen aufweist. Ist der Abstand größer, befindet sich das Objekt beispielsweise in der Mitte oder gar an dem den Lichteingängen der Lichtleitkanäle abgewandten Bereichen der Probe, weist auch der Spot eine größere zweidimensionale Ausdehnung auf.
Vorteilhaft entfällt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Uneindeutigkeit der bei der klassischen Mikroskopabbildung ausgeführten Fokusdurchmesser-Auswertungen, bei denen beispielsweise nicht erkannt werden kann, ob sich das Objekt ober- oder unterhalb der jeweiligen Fokusebene befindet.
So kann z. B. durch Anpassen einer 2D-Gaussfunktion zum einen der Ort des Moleküls als Zentrum der Gaussfunktion als Ursprungsort der Detektionsstrahlung hochgenau ermittelt werden, zum anderen liefert die Anpassung auch die Spotgröße als Fitparameter, die wiederum ein Maß für den Abstand des Moleküls von der Eintrittsfläche und damit auch von der Substratoberfläche ist.
Der Zusammenhang von Spotgröße und dem Abstand des Objekts von der Substratoberfläche (Position in Richtung der Z-Achse) kann analytisch berechnet oder auf der Grundlage von vorab durchgeführten Testmessungen ermittelt werden. Dazu kann beispielsweise eine Punktlichtquelle, beispielsweise ein hinterleuchtetes Loch mit sublambda-Durchmesser in einem Metallschirm (der sogenannte Sterntest) mit einem geeichten Stellelement, beispielsweise einem Piezo-Manipulator, in definierte Abstände bewegt werden. Aus den jeweils gemessenen Spotdurchmessern wird eine Eichkurve erstellt.
Da die beschriebene Bilderfassungsvorrichtung keine klassische Abbildung erzeugt, sondern einzelne Objekte, beispielsweise Moleküle, lokalisiert werden, kann die Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene auch signifikant von einer Gaussfunktion abweichen. Sie ergibt sich durch die Akzeptanzwinkel der Lichtleitkanäle und kann entweder berechnet oder wiederum durch eine Eichmessung ermittelt werden.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung, eines Mikroskops mit einer solchen Bilderfassungsvorrichtung oder einer Mikroskopanordnung mit einer solchen Bilderfassungsvorrichtung ausgeführt.
In einer weiteren Ausgestaltung des Mikroskopieverfahrens wird in Abhängigkeit von Messwerten der Detektionsstrahlung, die durch Sensorelemente zu wenigstens einem Erfassungszeitpunkt erfasst wurden, eine dem Erfassungszeitpunkt zugeordnete räumliche Verteilung der Messwerte ermittelt. Anhand der räumlichen Verteilung der Messwerte wird die erfasste Detektionsstrahlung einem Lichtleitkanal und einem zu der Position des Lichteingangs des Lichtleitkanals korrespondierenden Ursprungsort in der Probe zugeordnet.
Vorteilhaft werden Messwerte benachbarter Sensorelemente genutzt und die räumliche Verteilung berechnet. Dabei werden die Dicke des Substrats beziehungsweise des Wellenleiters, die Abstrahlcharakteristik der die Detektionsstrahlung aussendenden Emitter sowie die numerische Apertur des Lichtleitkanals berücksichtigt.
Wird das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren als Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ausgeführt, wird das evaneszente Feld durch eine in dem Wellenleiter geführte, in die Probe abklingende Welle der Beleuchtungsstrahlung erzeugt. Hierbei können sehr große evaneszente Felder mit sehr guter optischer Qualität auf stabile Weise erzeugt werden.
Die Bilderfassungsvorrichtung beziehungsweise das Mikroskop mit der Bilderfassungsvorrichtung und/oder eine Mikroskopanordnung mit der Bilderfassungsvorrichtung ist vorteilhaft für ein Screening der Probe, insbesondere für ein automatisiertes Screening verwendbar. Unter einem Screening wird hier ein systematisches Erfassen von Detektionsstrahlung mindestens einer Probe zu unterschiedlichen Erfassungszeitpunkten und/oder an unterschiedlichen Erfassungsorten verstanden.
Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die Bilderfassungsvorrichtung beziehungsweise das Mikroskop und/oder eine Mikroskopanordnung mit der Bilderfassungsvorrichtung können beispielsweise zur Sequenzierung und Analyse von DNS genutzt werden, indem beispielsweise DNS/Protein Mikroarray Lesegeräte (DNA/protein microarray reader) mit einer hohen räumlichen Auflösung realisiert werden. Weiterhin ist eine automatisierte hochauflösende Mikroskopie an Zellen möglich, die beispielsweise auf der Probenfläche auf dem Objektträger wachsen. Es ist auch möglich, auf der Probenfläche befindliche Biomoleküle wie Oligonukleotide hochauflösend zu mikroskopieren.
Das TIRF-Verfahren wird beispielsweise bei lokalisierungsbasierten Hochauflösungsverfahren wie PALM (Photoactivated Light Microscopy; photoaktivierte Lokalisationsmikrsokopie) eingesetzt, um das sogenannte „Sectioning“, also die selektive Anregung einer dünnen Schicht in Z-Richtung, zu erreichen.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile sind mittels einer für die TIRF-Mikroskopie ausgeführten Bilderfassungsvorrichtung, mittels eines Mikroskops mit der Bilderfassungsvorrichtung und/oder mittels einer Mikroskopanordnung mit der Bilderfassungsvorrichtung vorteilhaft reduziert. Eine dreidimensionale Lokalisierung eines Objektes in der Probe ist vorteilhaft über die Beugungsgrenze hinaus, insbesondere über die Beugungsgrenze der Lichtleitkanäle hinaus, ermöglicht.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem ersten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung in einem Teilschnitt,
2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem zweiten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung,
3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem dritten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung in einem Teilschnitt.
4 eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem vierten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung,
5a eine schematische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einem fünften Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung in der seitlichen Ansicht,
5b eine schematische Darstellung des fünften Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit dem fünften Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung in der Draufsicht und
6 eine schematische Darstellung zweier Spots mit unterschiedlichen Positionen in X, Y und Z-Richtung.
Die folgenden schematischen Abbildungen dienen der Veranschaulichung von Ausführungsbeispielen der Erfindung und sind nicht maßstäblich. Gleiche Bezugszeichen kennzeichnen dabei gleiche technische Elemente.
In der 1 ist schematisch eine Bilderfassungsvorrichtung 1 dargestellt, die in einem Mikroskop 2 integriert ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist von der Vielzahl der Elemente des Mikroskops 2 lediglich ein Objektiv 3 schematisch dargestellt. Ein Detektor 4, der durch eine Kamera mit einem EMCCD-Chip 4.1 (electron multiplying charge-coupled device) realisiert ist, weist eine Anzahl von in einem Array angeordneten Sensorelementen 5 (siehe 5) und eine Datenschnittstelle 23 zur Verbindung mit einer Auswerteeinheit 24 (siehe 4 bis 5) auf. Auf dem Detektor 4 ist ein als ein Faser-Taper 6.1 ausgebildetes Lichtleitelement 6 aufgesetzt. Durch die Bilderfassungsvorrichtung 1 und das Mikroskop 2 ist eine Mikroskopanordnung A gebildet.
Das Lichtleitelement 6 umfasst eine Anzahl von optisch voneinander getrennten Lichtleitkanälen 7 in Form lichtleitender Fasern. Zur Veranschaulichung sind in dem Teilschnitt beispielhaft lediglich zwei Lichtleitkanäle 7 dargestellt. Die Lichtleitkanäle 7 weisen jeweils an ihrem einen Ende einen Lichteingang 7.1 und an ihrem anderen Ende einen Lichtausgang 7.2 auf. Eine Lichtleitung im Inneren der Lichtleitkanäle 7 erfolgt nach dem Prinzip der Totalreflexion.
Alle Lichteingänge 7.1 befinden sich in einer gemeinsamen Lichteintrittsfläche 8 während sich alle Lichtausgänge 7.2 in einer gemeinsamen Lichtaustrittsfläche 9 befinden. Die Lichteintrittsfläche 8 ist mit einer Filterschicht 10 zur Reduzierung von Streuanteilen einer Beleuchtungsstrahlung 15 (siehe 2, 4 und 5) versehen.
Die derart beschichtete Lichteintrittsfläche 8 ist durch einen Objektträger 11 überdeckt, der als ein Substrat eines Wellenleiters 13 dient.
Eine erste Seitenfläche 11.1 des Objektträgers 11 ist der Lichteintrittsfläche 8 abgewandt, während eine zweite Seitenfläche 11.2 des Objektträgers 11 der Lichteintrittsfläche 8 zugewandt ist.
Zwischen der beschichteten Lichteintrittsfläche 8 und der zweiten Seitenfläche 11.2 ist Immersionsöl als ein Koppelmedium 12 zur optischen Kopplung von Lichtleitelement 6 und Objektträger 11 eingebracht.
Der Wellenleiter 13 ist an der ersten Seitenfläche 11.1 durch eine hochbrechende Schicht aus Tantalpentoxid ausgebildet. Auf dem Wellenleiter 13 sind zwei Einkoppelstrukturen 14 vorhanden, die jeweils als ein Koppelprisma 14.1 ausgebildet sind und mittels denen eine Laserstrahlung als eine Beleuchtungsstrahlung 15 in den Wellenleiter 13 einkoppelbar ist.
Die Beleuchtungsstrahlung 15 ist durch zwei Strahlungsquellen 16.1 einer Beleuchtungseinrichtung 16 bereitgestellt und mittels nicht näher dargestellter Optiken in die Koppelprismen 14.1 gerichtet.
Die Lichteintrittsfläche 8 entspricht der Form und den Abmessungen einer Probenfläche auf der ersten Seitenfläche 11.1. Die Lichtaustrittsfläche 9 ist hinsichtlich ihrer Form und Abmessungen an das Array der Sensorelemente 5 angepasst, wobei die Lichtaustrittsfläche 9 größer als die Lichteintrittsfläche 8 ist und daher der Detektor 4 einen vergrößernden Abbildungsmaßstab (> 1) aufweist.
Eine Detektionsstrahlung 20 (siehe 2, 4 und 5), die an der Lichteintrittsfläche 8 in mindestens einiger der Lichtleitkanäle 7 eingetreten ist, wird an der Lichtaustrittsfläche 9 vergrößert, also auf einer größeren Fläche, als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung in der X-Y-Ebene abgebildet. Die räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung wird auch als Spot 21 (siehe 5) bezeichnet. Dieser Umstand ist in der 1 mithilfe der Abstände der Lichtleitkanäle 7 darstellbar. Die Lichtleitkanäle 7 weisen an der Lichteintrittsfläche 8 einen geringeren Abstand zueinander auf als an der Lichtaustrittsfläche 9.
In weiteren Ausführungen der Bilderfassungsvorrichtung 1 nimmt ein Durchmesser der Lichtleitkanäle 7 von der Lichteintrittsfläche 8 zur Lichtaustrittsfläche 9 zu.
Der Wellenleiter 13 mitsamt dem Objektträger 11, das Lichtleitelement 6 und der Detektor 4 sind mittels einer gemeinsamen Halterung 22 relativ zueinander gehalten und bilden ein Bilderfassungsmodul.
Die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Bilderfassungsvorrichtung 1 und/oder des Mikroskops 2 sowie das erfindungsgemäße Verfahren werden anhand der 2 bis 5 detaillierter erläutert.
Das in der 2 dargestellte zweite Ausführungsbeispiel der Bilderfassungsvorrichtung 1 und des Mikroskops 2 weist abweichend zu 1 als Lichtleitelement 6 eine Faserplatte 6.2 mit zueinander parallel verlaufend angeordneten Fasern als Lichtleitkanäle 7 auf. Die Filterschicht 10 ist auf der zweiten Seitenfläche 11.2 (siehe 1 und 3) des Objektträgers 11 aufgebracht. Das Koppelmedium 12 befindet sich zwischen der Lichteintrittsfläche 8 und der beschichteten zweiten Seitenfläche 11.2.
Die von einer Strahlungsquelle 16.1 der Beleuchtungseinrichtung 16 bereitgestellte Beleuchtungsstrahlung 15 ist mittels einer nicht dargestellten Optik auf zwei Strahlengänge aufgeteilt, wobei jeder der Strahlengänge in eines der Koppelprismen 14.1 gerichtet ist. Die Beleuchtungsstrahlung 15 wird mittels des jeweiligen Koppelprismas 14.1 in den Wellenleiter 13 eingekoppelt und breitet sich in diesem unter Totalreflexion an den Grenzflächen des Wellenleiters 13 in dem Wellenleiter 13 aus.
Auf der ersten Seitenfläche 11.1 ist eine Probe 17 aufgebracht, in der mit Fluorophoren markierte Moleküle enthalten sind. Die Beleuchtungsstrahlung 15 trifft auch in dem Bereich auf die erste Seitenfläche 11.1, auf der die Probe 17 aufgebracht und so ein Einkoppelbereich 18 für die Beleuchtungsstrahlung 15 in die Probe 17 gebildet ist.
Die Beleuchtungsstrahlung 15 tritt an dem Einkoppelbereich 18 in die Probe 17 ein und bewirkt in dieser ein evaneszentes Feld 19. Fluorophore die sich in dem evaneszenten Feld 19 befinden werden zur Emission von Fluoreszenzstrahlung angeregt, wenn diesen durch die Beleuchtungsstrahlung 15 eine hinreichende Energiemenge zugeführt wird. Die emittierte Fluoreszenzstrahlung tritt als Detektionsstrahlung 20 durch den Objektträger 11 sowie durch die Filterschicht 10 und das Koppelmedium 12 und fällt auf die Lichteintrittsfläche 8. Die Detektionsstrahlung 20 breitet sich ausgehend von einem Ursprungsort U mit der dreidimensionalen Position P_X,Y,Z in der Probe 17 aus. Es tritt nur derjenige Anteil der Detektionsstrahlung 20 in die Lichtleitkanäle 7 ein, der unter einem Abstrahlwinkel α gleich oder kleiner dem Akzeptanzwinkel der Lichtleitkanäle 7 abgestrahlt wird.
Derjenige Anteil der Detektionsstrahlung 20, der auf einen Lichteingang 7.1 fällt, wird in dem betreffenden Lichtleitkanal 7 geleitet und tritt an dem Lichtausgang 7.2 an der Lichtaustrittsfläche 9 aus, wo der Anteil der Detektionsstrahlung 20 auf ein Sensorelement 5 trifft, dem der Lichtleitkanal 7 eineindeutig zugeordnet ist (siehe 5). Der auf dem Sensorelement 5 auftreffende Anteil der Detektionsstrahlung 20 wird durch das Sensorelement 5 als ein Messwert erfasst und sowohl dem jeweiligen Sensorelement 5 als auch einem Erfassungszeitpunkt zugeordnet gespeichert.
Das TIRF-Verfahren wird beispielsweise bei lokalisierungsbasierten Hochauflösungsverfahren wie PALM (Photoactivated Light Microscopy; photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) eingesetzt, um das sogenannte „Sectioning“, also die selektive Anregung einer dünnen Schicht in Z-Richtung Z, zu erreichen.
Dazu werden üblicherweise vorhandene Mikroskope modifiziert, indem spezielle TIRF-Objektive mit einer hohen numerischen Apertur und sehr vielen Linsengruppen verwendet werden. Die so geschaffenen optischen Systeme sind optisch komplex und erfordern Erfahrung und Geschick bei der Bedienung. Dabei sind beispielsweise die Qualität der erfassten Daten sowie die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes subjektiven Einschätzungen und Vorgehensweisen des jeweiligen Bedieners des Mikroskops unterworfen.
Automatisierte Anwendungen der vorstehend genannten modifizierten Mikroskope sind aufgrund des hohen subjektiven Einflusses des Bedieners nicht möglich.
Auf technischer Seite treten bei der Verwendung von TIRF-Objektiven bei hohen Anregungsleistungen der Beleuchtungsstrahlung aufgrund des komplexen Aufbaus des TIRF-Objektivs Probleme mit Streulicht und Reflexionen auf, die sich bei einer Detektion einzelner Moleküle störend auswirken.
Gegenüber dem Stand der Technik ist die erfindungsgemäße Mikroskopanordnung A, das Mikroskop 2 und/oder die Bilderfassungsvorrichtung 1 einfacher aufgebaut, leicht montier- und demontierbar und erlaubt eine starke Reduzierung von Streulicht und Reflexionen, sowie eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Auflösung.
In dem in der 3 dargestellten dritten Ausführungsbeispiel der Mikroskopanordnung A sind die beiden Lichtquellen 16.1 vor der zweiten Seitenfläche 11.2 angeordnet. Die jeweils von den Lichtquellen 16.1 abgegebene Beleuchtungsstrahlung 15 durchdringt den Objektträger 11, gelangt in jeweils eine der Einkoppelstrukturen 14, wird durch diese reflektiert und unter einem flachen Winkel als eine Weitfeldbeleuchtung auf die erste Seitenfläche 1.1 beziehungsweise auf eine dort positionierte Probe 17 (siehe 4) gerichtet.
Der Winkel, unter dem die Beleuchtungsstrahlung 15 auf die erste Seitenfläche 1.1 gerichtet ist, ist größer als ein Akzeptanzwinkel der Lichtleitkanäle 7 an deren jeweiligen Lichteingängen 7.1, wodurch eine direkte Einkopplung von Beleuchtungsstrahlung 15 in die Lichtleitkanäle 7 wesentlich reduziert ist.
Der Detektor 4 steht über die Datenschnittstelle 23 mit einer Auswerteeinheit 24 in einer für einen Datentransfer geeigneten Verbindung. Die Auswerteeinheit 24 ist derart konfiguriert, dass die Detektionsstrahlung 20 jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung 20 in der X-Y-Ebene XY (siehe 5) erfassbar ist; eine zweidimensionale Ausdehnung und/oder Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene XY erfassbar ist und eine dreidimensionale Position P_X,Y,Z des Objekts in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung 20 in der X-Y-Ebene XY ermittelbar ist.
In der 4 ist schematisch die Beleuchtung der Probe 17 mit der zu 3 beschriebenen Weitfeldbeleuchtung eines vierten Ausführungsbeispiels der Bilderfassungsvorrichtung 1, des Mikroskops 2 und der Mikroskopanordnung A dargestellt. Das beispielhaft dargestellte und als Emitter wirkende Objekt befindet sich an einer dreidimensionalen Position P_X,Y,Z die zugleich ein Ursprungsort U der Detektionsstrahlung 20 ist. Die in der Probe 17 erzeugte Detektionsstrahlung 20 wird abgestrahlt, wobei derjenige Anteil, der unter einem Abstrahlwinkel gleich oder kleiner dem Akzeptanzwinkel der Lichtleitkanäle 7 in Richtung der Faserplatte 6.2 abgestrahlt wird, in die Lichtleitkanäle 7 eingekoppelt wird. Die eingekoppelte und in den Lichtleitkanälen 7 geleitete Detektionsstrahlung 20 gelangt auf den EMCCD-Chip 4.1 und wird mittels des Detektors 4 erfasst.
In dem in den 5a und 5b dargestellten fünften Ausführungsbeispiel der Bilderfassungsvorrichtung 1 und des Mikroskops 2 ist mindestens eine der Stirnseiten 14.2 des Wellenleiters 13 als Einkoppelstruktur 14 ausgebildet. Die Beleuchtungsstrahlung 15 ist in der Beleuchtungseinrichtung 16 durch die als eine Hochleistungslaserdiode ausgebildete Strahlungsquelle 16.1 erzeugt. Die Strahlungsquelle 16.1 ist unmittelbar an der Stirnseite 14.2 angeordnet und die optische Achse der Strahlungsquelle 16.1 ist in den Wellenleiter 13 gerichtet, so dass die Beleuchtungsstrahlung 15 direkt in den Wellenleiter 13 eingekoppelt ist.
Wie in der 5a dargestellt, werden durch die einzelnen Lichtleitkanäle 7 unterschiedlich große Anteile der Detektionsstrahlung 20 geleitet, was durch die unterschiedlich starken Pfeile symbolisiert ist.
Dabei bestimmt die Dicke D des Objektträgers 11 und die Abstrahlcharakteristik der Emitter, in diesem Falle der markierten Moleküle, an der Grenzfläche von Probe 17 und Objektträger 11 sowie die Numerische Apertur der Lichtleitkanäle 7 die Abbildung der Punktquelle auf dem Detektor 4.
Beispielsweise ergibt sich bei einer Auslegung der Faserplatte 6.2 mit Lichtleitkanälen 7 mit einer Numerischen Apertur von 0,66 ein Akzeptanzwinkel von 41,3°.
Die Substratdicke D ist an den Abstrahlwinkel α der Moleküle angepasst, so dass ein für lokalisierungsbasierte Hochauflösung optimales räumliches oversampling erreicht wird.
Die Dicke D ist anhand der jeweiligen Anwendungsbedingungen bestimmbar. Beispielsweise soll der Durchmesser der Lichtleitkanäle 7 an die Größe eines Sensorelements 5 von zum Beispiel 16 µm (Pixelgröße) angepasst werden, um eine 1:1-Kopplung zu erreichen. Die Zentren der Lichtleitkanäle 7 würden zueinander einen Abstand von 16 µm aufweisen. Ein Punktbild oder Spot 21 eines mit einem Fluorophor markierten Moleküls soll von einer 5 × 5-Anordnung von Sensorelementen 5 mit fünf Zeilen i und fünf Spalten j erfasst werden. Die sich aufgrund der vorgenannten Bedingungen ergebende Dicke D des Objektträgers 11 berechnet sich nach ((5 × 16 µm) × 0,5/tan α = 45,5 µm.
Die 5 × 5-Anordnung von Sensorelementen 5 ist Teil eines 7 × 7 Sensorelemente 5 großen Arrays, das zur besseren Erläuterung in der 5b in der Draufsicht dargestellt ist.
Zu einem beispielhaft betrachteten Erfassungszeitpunkt wird die Detektionsstrahlung 20 erzeugt, indem die Beleuchtungsstrahlung 15 wie oben beschrieben in die Probe 17 eingekoppelt wird und die markierten Moleküle in dem derart bewirkten evaneszenten Feld 19 zur Emission der Fluoreszenzstrahlung als Detektionsstrahlung 20 angeregt werden. Ein Anteil der Detektionsstrahlung 20 wird mittels des Lichtleitelements 6 zu den Sensorelementen 5 geleitet, wobei jeder der Lichtleitkanäle 7 je einem der Sensorelemente 5 eineindeutig zugeordnet ist. Die Detektionsstrahlung 20 wird als ein Spot 21 in Form einer räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung 20 in der X-Y-Ebene XY, d. h. auf dem Array abgebildet.
Infolge der eineindeutigen Zuordnung der Lichtleitkanäle 7 zu den Sensorelementen 5 erfolgt zu dem Erfassungszeitpunkt eine ortsaufgelöste Erfassung der Detektionsstrahlung 20, wobei zudem Form und Größe, also die zweidimensionale Ausdehnung des Spots 21, erfasst und an der Datenschnittstelle 23 bereitgestellt werden beziehungsweise bereitstellbar sind.
Die optional vorhandene Auswerteeinheit 24 erhält über die Datenschnittstelle 23 die erfassten Messwerte zur Auswertung. Aufgrund der Ergebnisse der Auswerteeinheit 24 können die Bilderfassungsvorrichtung 1, das Mikroskop 2 und/oder die Mikroskopanordnung A (siehe 1 bis 4) regel- und/oder steuerbar sein.
Auf ein im Zentrum der 5 × 5-Anordnung von Sensorelementen 5 befindliches Sensorelement 5 _3,3 trifft der größte Anteil der Detektionsstrahlung 20. Auf die dem Sensorelement 5 _3,3 benachbart angeordneten Sensorelemente 5 treffen geringere Anteil der Detektionsstrahlung 20 auf, was durch die abnehmende Intensität der Musterung der Sensorelemente 5 dargestellt ist. Der erfasste Spot 21 ist im Beispiel der Einfachheit halber mit einer quadratischen Form dargestellt und besitzt eine zweidimensionale Ausdehnung in der X-Y-Ebene XY von 5 × 5 Sensorelementen 5.
Das Erfassen von Anteilen der von einem Ursprungsort U in der Probe 17 stammenden Detektionsstrahlung 20 mittels einer Vielzahl von Sensorelementen 5 wird auch als räumliches oversampling bezeichnet.
Die Abbildung des Spots 21 wird durch die Größe der Sensorelemente 5 (Pixelgröße), die Dicke D des Objektträgers 11 und den Abbildungsmaßstab des Lichtleitelements 6 gewählt und/oder eingestellt, um ein für die lokalisierungsbasierte Hochauflösungsmikroskopie optimales räumliches oversampling zu erreichen.
In Abhängigkeit der Messwerte der Detektionsstrahlung 20, insbesondere der Anteile der Detektionsstrahlung 20, die durch benachbarte Sensorelemente 5 _i,j zu dem wenigstens einem Erfassungszeitpunkt erfasst worden, wird eine dem Erfassungszeitpunkt zugeordnete räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Messwerte ermittelt. Anhand der räumlichen Verteilung der Messwerte wird ein Ursprungsort U der Detektionsstrahlung 20 ermittelt. Dazu werden Verfahren wie die Schwerpunktbestimmung, ein Gauss-Fit, ein Gauss-Mask-Fit und/oder eine mit Punktlichtquellen experimentell ermittelte Intensitätsverteilung genutzt. Mit der experimentell ermittelten Intensitätsverteilung kann auch eine nicht-eineindeutige Zuordnung von Lichtleitkanal 7 und Sensorelement 5 berücksichtigt und/oder korrigiert werden.
Anhand der Form und zweidimensionalen Ausdehnung des Spots 21 kann sowohl der Ursprungsort U als auch dessen Position in Richtung der Z-Achse Z in der Probe 17 ermittelt werden.
Unter Beachtung der oben genannten Beziehungen beispielsweise der Abstrahlcharakteristik des markierten Moleküls und der Numerischen Apertur des Lichtleitkanals 7, wird der korrespondierenden Ursprungsort U in Richtung mindestens einer der Achsen X, Y und Z eines kartesischen Koordinatensystems und dessen dreidimensionale Position P_X,Y,Z ermittelt.
Die 6 zeigt beispielhaft eine Abbildung zweier erfasster Spots 21, von denen einer einen Spotdurchmesser d1 und der anderen einen Spotdurchmesser d2 besitzt. Die Spotdurchmesser d1 und d2 werden beispielsweise anhand der Intensitätsverteilung in Richtung einer der Achsen X und/oder Y ermittelt. Die ermittelten Spotdurchmesser d1 und d2 werden anschließend beispielsweise mit einer zuvor experimentell ermittelten Intensitätsverteilung verglichen und der jeweilige Abstand der Objekte, welche die jeweiligen Spots 21 verursachen, in Richtung der Z-Achse Z ermittelt und die dreidimensionale Position P_X,Y,Z (siehe z.B. 5a) des jeweiligen Spots 21 ermittelt.
Bezugszeichenliste

1: Bilderfassungsvorrichtung
2: Mikroskop
3: Objektiv
4: Detektor
4.1: EMCCD-Chip
5: Sensorelement
6: Lichtleitelement
6.1: Faser-Taper
6.2: Faserplatte
7: Lichtleitkanal
7.1: Lichteingang
7.2: Lichtausgang
8: Lichteintrittsfläche
9: Lichtaustrittsfläche
10: Filterschicht
11: Objektträger
11.1: erste Seitenfläche
11.2: zweite Seitenfläche
12: Koppelmedium
13: Wellenleiter
14: Einkoppelstruktur
14.1: Koppelprisma
14.2: Stirnseite
15: Beleuchtungsstrahlung
16: Beleuchtungseinrichtung
16.1: Strahlungsquelle
17: Probe
18: Einkoppelbereich
19: evaneszentes Feld
20: Detektionsstrahlung
21: Spot
22: Halterung
23: Datenschnittstelle
24: Auswerteeinheit
A: Mikroskopanordnung
D: Dicke
U: Ursprungsort
X: Achse X
Y: Achse Y
Z: Achse Z
XY: X-Y-Ebene
P_X,Y: zweidimensionale Position
P_X,Y,Z: dreidimensionale Position
α A: bstrahlwinkel
d1: erster Spotdurchmesser
d2: zweiter Spotdurchmesser

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2006/127692 [0003]
EP 0909947 A2 [0006]

Claims

Bilderfassungsvorrichtung (1) für eine Mikroskopanordnung (A) umfassend – einen Detektor (4) mit einem Array von Sensorelementen (5), – ein Lichtleitelement (6) aufweisend eine Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle (7), wobei jeder der Lichtleitkanäle (7) mit einem Lichteingang (7.1) an einer gemeinsamen Lichteingangsfläche (8) der Lichtleitkanäle (7) und mit einem Lichtausgang (7.2) an einer gemeinsamen Lichtaustrittsfläche (9) der Lichtleitkanäle (7) endet und das Array von Sensorelementen (5) der Lichtaustrittsfläche (9) zur Erfassung einer in wenigstens einer Teilmenge der Mehrzahl von Lichtleitkanälen (7) geleiteten und aus der Lichtaustrittsfläche (9) austretenden Detektionsstrahlung (20) zugewandt angeordnet sind, – eine Beleuchtungseinrichtung (16), mittels der mindestens eine zur Erzeugung der Detektionsstrahlung (20) in einer Probe (17) geeignete Beleuchtungsstrahlung (15) erzeugt oder erzeugbar ist, wobei die Beleuchtungsstrahlung (15) anteilig durch in der Probe (17) befindliche Objekte als Detektionsstrahlung (20) reflektiert und/oder die Objekte durch die Beleuchtungsstrahlung (15) zur Fluoreszenz angeregt werden können; dadurch gekennzeichnet, dass – eine Auswerteeinheit (24) vorhanden ist, die derart konfiguriert ist, – dass die Detektionsstrahlung (20) jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) erfassbar ist, – eine zweidimensionale Ausdehnung und/oder der Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene (XY) erfassbar ist und – eine dreidimensionale Position (P_X,Y,Z) des Objekts in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) ermittelbar ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wellenleiter (13) zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung (15) in eine vorhandene Probe (17) und mindestens eine zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung (15) in den Wellenleiter (13) ausgebildete Einkoppelstruktur (14) vorhanden sind und die Beleuchtungsstrahlung (15) in einen vor der Lichteingangsfläche (8) liegenden Einkoppelbereich (18) des Wellenleiters (13) in die Probe (17) eingekoppelt oder einkoppelbar ist und der Einkoppelbereich (18) und die Lichteingangsfläche (8) derart zueinander ausgerichtet und beabstandet sind, dass die durch die Beleuchtungsstrahlung (15) in der Probe (17) bewirkte oder bewirkbare Detektionsstrahlung (20) auf mindestens einen der Lichteingänge (7.1) trifft.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtleitelement (6) ein Faser-Taper (6.1) oder eine Faserplatte (6.2) mit einer Anzahl lichtleitender Fasern als Lichtleitkanäle (7) ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jedem der Sensorelemente (5) der Lichtausgang (7.2) mindestens eines Lichtleitkanals (7) zugeordnet ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Wellenleiter (13) flächig an einer ersten Seitenfläche (11.1) eines Objektträgers (11) ausgebildet ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Einkoppelstruktur (14) ein Koppelprisma (14.1), ein Gitter und/oder eine zur Einkopplung der Beleuchtungsstrahlung (15) ausgebildete Stirnfläche (14.2) ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (16) direkt an den Wellenleiter (13) angekoppelt ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Lichtaustrittsfläche (9) und einer zweiten Seitenfläche (11.1) des Objektträgers (11) mindestens eine Filterschicht (10) ausgebildet ist, mittels der gestreute Beleuchtungsstrahlung (15) reduziert oder reduzierbar ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Objektträger (11) und das Lichtleitelement (6) über mindestens eine Schicht eines optischen Koppelmediums (12) miteinander optisch gekoppelt sind.
Bilderfassungsvorrichtung (1) einer Mikroskopanordnung (A) umfassend einen Detektor (4) mit einem Array von Sensorelementen (5) und ein Lichtleitelement (6) aufweisend eine Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle (7), wobei jeder der Lichtleitkanäle (7) mit einem Lichteingang (7.1) an einer gemeinsamen Lichteingangsfläche (8) der Lichtleitkanäle (7) und mit einem Lichtausgang (7.2) an einer gemeinsamen Lichtaustrittsfläche (9) der Lichtleitkanäle (7) endet und das Array von Sensorelementen (5) der Lichtaustrittsfläche (9) zur Erfassung einer aus der Lichtaustrittsfläche (9) austretenden Detektionsstrahlung (20) zugewandt angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass – eine Beleuchtungseinrichtung (16) vorhanden ist, mittels der mindestens eine zur Erzeugung eines evaneszenten Feldes (19) in einer Probe (17) geeignete Beleuchtungsstrahlung (15) erzeugt oder erzeugbar ist, wobei die Beleuchtungsstrahlung (15) anteilig durch in der Probe (17) befindliche Objekte als Detektionsstrahlung (20) reflektiert und/oder gestreut und/oder die Objekte durch die Beleuchtungsstrahlung (15) zur Fluoreszenz angeregt werden können; – ein Wellenleiter (13) zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung (15) in eine vorhandene Probe (17) und mindestens eine zum Einkoppeln der Beleuchtungsstrahlung (15) in den Wellenleiter (13) ausgebildeten Einkoppelstruktur (14) ausgebildet sind und die Beleuchtungsstrahlung (15) in einen vor der Lichteingangsfläche (8) liegenden Einkoppelbereich (18) des Wellenleiters (13) in die Probe (17) eingekoppelt oder einkoppelbar ist, – der Einkoppelbereich (18) und die Lichteingangsfläche (8) derart zueinander ausgerichtet und beabstandet sind, dass die durch die Beleuchtungsstrahlung (15) in der Probe (17) bewirkte oder bewirkbare Detektionsstrahlung (20) auf mindestens einen der Lichteingänge (7.1) trifft und – eine zur Verbindung mit einer Auswerteeinheit (24) ausgebildete Datenschnittstelle (23) vorhanden ist.
Bilderfassungsvorrichtung (1) nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch eine über die Datenschnittstelle (23) verbundene Auswerteeinheit (24), die derart konfiguriert ist, – dass die Detektionsstrahlung (20) jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) erfassbar ist, – eine zweidimensionale Ausdehnung und/oder der Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene (XY) erfassbar ist und – eine dreidimensionale Position (P_X,Y,Z) des Objekts in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) ermittelbar ist.
Mikroskopanordnung (A) mit einer Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Mikroskopanordnung (A) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Achse mindestens eines weiteren Mikroskops (2) auf die Probe (17) gerichtet oder richtbar ist.
Mikroskopanordnung (A) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Mikroskop (2) zur Multiphotonenmikroskopie oder zur 2-Photonen-Mikroskopie ausgebildet ist.
Mikroskopanordnung (A) nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Mikroskop (2) als ein punktscannendes Mikroskop ausgebildet ist.
Verwendung der Bilderfassungsvorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder der Mikroskopanordnung (A) nach einem der Ansprüche 12 bis 15 für ein Screening der Probe (17).
Mikroskopieverfahren umfassend die Schritte: – Beleuchten einer Probe (17) mit einer Beleuchtungsstrahlung (15), – Erzeugen einer Detektionsstrahlung (20), wobei die Beleuchtungsstrahlung (15) anteilig durch in der Probe (17) befindliche Objekte reflektiert und/oder die Objekte durch die Beleuchtungsstrahlung (15) zur Fluoreszenz angeregt werden, – Leiten eines Anteils der Detektionsstrahlung (20) mittels eines Lichtleitelements (6) zu Sensorelementen (5) eines Detektors (4), wobei das Lichtleitelement (6) mit einer Mehrzahl voneinander optisch getrennter Lichtleitkanäle (7) gewählt wird, von denen jeder Lichtleitkanal (7) einem Sensorelement (5) zugeordnet wird, so dass die Detektionsstrahlung (20) jedes Objekts ortsaufgelöst als eine räumlich begrenzte Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY) erfasst wird, – Erfassen einer zweidimensionalen Ausdehnung und/oder einer Form der Intensitätsverteilung in der X-Y-Ebene (XY) und – Ermitteln einer dreidimensionale Position (P_X,Y,Z) des Objekts in Z-Richtung (Z) in Abhängigkeit von der zweidimensionalen Ausdehnung und/oder der Form der räumlich begrenzten Intensitätsverteilung der Detektionsstrahlung (20) in der X-Y-Ebene (XY).
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass in Abhängigkeit von Messwerten der Detektionsstrahlung (20), die durch Sensorelemente (5) zu wenigstens einem Erfassungszeitpunkt erfasst worden, eine dem Erfassungszeitpunkt zugeordnete räumliche Verteilung der Messwerte ermittelt wird und anhand der räumlichen Verteilung die erfasste Detektionsstrahlung (20) einem Lichtleitkanal (7) und einem zu der Position des Lichteingangs (7.1) des Lichtleitkanals (7) korrespondierenden Ursprungsort (U) in der Probe (17) zugeordnet wird.