Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Scanmikroskop
sowie ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie mit einem derartigen
Scanmikroskop anzugeben, wonach eine besonders hohe Auflösung mit
konstruktiv einfachen Mitteln erreicht ist.
Erfindungsgemäß wird die
voranstehende Aufgabe durch ein Scanmikroskop mit den Merkmalen
des Patentanspruchs 1 gelöst.
Danach ist das Scanmikroskop der eingangs genannten Art derart ausgestaltet
und weitergebildet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils
mindestens ein Objektiv angeordnet ist und dass mindestens zwei
einander bezüglich
der Probenebene gegenüberliegende
Objektive aufeinander zu gerichtet sind, so dass durch ein Objektiv
zur Probe geführtes
Beleuchtungslicht durch das gegenüberliegende Objektiv auffangbar und
als Detektionslicht zum Positionsdetektor führbar ist.
Erfindungsgemäß ist erkannt
worden, dass die voranstehende Aufgabe durch die Führung des durch
die Probe hindurchgetretenen Beleuchtungslichts über ein weiteres Objektiv zum
Positionsdetektor auf überraschend
einfache Weise gelöst
ist. Im Konkreten ist hierzu auf beiden Seiten der Probenebene jeweils
mindestens ein Objektiv angeordnet, wobei mindestens zwei einander
bezüglich
der Probenebene gegenüberliegende
Objektive aufeinander zu gerichtet sind. Durch ein Objektiv zur
Probe geführtes
Beleuchtungslicht kann somit durch das gegenüberliegende Objektiv aufgefangen
und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt werden.
Mit
dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop wird
unabhängig
von der Dicke der Probe, insbesondere bei lebenden biologischen
Präparaten,
eine besonders hohe Auflösung
erreicht, wobei des Weiteren auch die Untersuchung von polarisationsbeeinflussenden – insbesondere
doppelbrechenden – Proben
ermöglicht
ist. Folglich ist mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop ein Scanmikroskop
angegeben, wonach eine besonders hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen
Mitteln erreicht ist.
Eine
weitere Verbesserung der Auflösung kann
erreicht werden, wenn das Beleuchtungslicht durch zwei einander
bezüglich
der Probenebene gegenüberliegende
und aufeinander zu gerichtete Objektive geführt und durch das jeweils gegenüberliegende
Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor
geführt
wird. Mit anderen Worten wird hierbei das Beleuchtungslicht nicht
nur durch ein Objektiv, sondern durch zwei einander bezüglich der
Probenebene gegenüberliegende
Objektive geführt,
die aufeinander zu gerichtet sind. Die Probe wird hierbei von zwei
Seiten beleuchtet. Das durch die Probe hindurchgetretene Beleuchtungslicht
des einen Objektivs wird dabei vom jeweils gegenüberliegenden Objektiv auf gefangen
und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt. Der
Positionsdetektor empfängt
dabei sowohl das Detektionslicht, das von dem einen Objektiv aufgefangen
worden ist, als auch das Detektionslicht, das vom gegenüberliegenden Objektiv
aufgefangen worden ist.
Weiterhin
zur Gewährleistung
einer besonders hohen Auflösung
könnte
im Strahlengang des Detektionslichts vor dem Positionsdetektor eine
Detektionslochblende angeordnet sein. Mit einer derartigen Detektionslochblende
kann gewährleistet
werden, dass ausschließlich
Detektionslicht, das im Fokus der Objektive durch die Probe moduliert
wird, durch die Detektionslochblende und damit auf den Positionsdetektor
gelangt. Sowohl bei einer einseitigen Beleuchtung der Probe als
auch bei der alternativen beidseitigen Beleuchtung der Probe ist
hierdurch ein sehr eng begrenzter Fokuspunkt betrachtbar. Dieser
Vorteil ergibt sich insbesondere bei einem konfokalen Betrieb des
Scanmikroskops. Letztendlich werden durch die Detektionslochblende
Detektionslichtanteile, die nicht aus dem gewünschten, eng begrenzten Fokusbereich
stammen, herausgefiltert.
Im
Hinblick auf eine besonders einfache Realisierung der Beleuchtung
der Probe von zwei Seiten könnte
im Strahlengang des Beleuchtungslichts vor dem Objektiv oder vor
den Objektiven ein Strahlteiler angeordnet sein. Der Strahlteiler
dient zur Aufspaltung des Beleuchtungslichts und zur Zusammenführung des
Detektionslichts.
Zur
sicheren Führung
des Beleuchtungslichts über
die Probe könnte
im Strahlengang des Beleuchtungslichts vor dem Objektiv oder den
Objektiven eine Scaneinrichtung angeordnet sein. Eine derartige
Scaneinrichtung kann durch Spiegel realisiert sein. Dabei könnte das
durch die Probe hindurchgetretene Beleuchtungslicht als Detektionslicht über die Scaneinrichtung
und/oder eine weitere Scaneinrichtung zum Positionsdetektor führbar sein.
Bei
einer konstruktiv besonders vorteilhaften Ausgestaltung könnte der
Positionsdetektor ein RDC-Detektor – Refractive Differential Contrast-Detektor – sein.
Der
Positionsdetektor könnte
eine Vielzahl von Einzeldetektoren aufweisen, die eine wesentlich kleinere
optisch wirksame Detektionsfläche
aufweisen als die Quer schnittsfläche
eines Detektionslichtstrahls. Im Konkreten könnten die Einzeldetektoren in
einer Zeile oder in einem Array oder in einer Matrix angeordnet
sein. Hierbei bietet sich eine Photodiodenzeile oder ein Photodiodenarray
an.
Bei
einer weiteren Ausgestaltung könnte
der Positionsdetektor einen Photomultiplier aufweisen. Hierbei wäre ein Mehrkanal-
oder Mehranoden-Photomultiplier besonders vorteilhaft. Der Photomultiplier könnte in
weiter vorteilhafter Weise als Resistive-Anode-Photomultiplier ausgebildet
sein. Bei einer weiteren Variante könnte der Positionsdetektor
eine Micro-Chanel-Plate aufweisen. Bei der Wahl des geeigneten Photomultipliers
ist auf den jeweiligen Anwendungsfall abzustellen.
Weiterhin
könnte
der Positionsdetektor mindestens einen CCD-Chip oder einen positionssensitiven
Detektor – PSD – aufweisen.
Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
könnte
der Positionsdetektor eine im Wesentlichen stetige Punktauflösungsfunktion
aufweisen. Hierbei könnte
der Positionsdetektor in vorteilhafter Weise als PSD – Position
Sensitive Detektor oder Device – ausgestaltet
sein. Ein positionsempfindlicher Detektor – PSD – arbeitet ähnlich wie eine übliche Photodiode.
Das auf das aktive Gebiet fallende Licht generiert einen Photostrom,
der in Richtung des p- und des n-Gebiets abfließt. Im Gegensatz zu einer Photodiode
verfügt
ein PSD jedoch über
mehrere elektrische Kontakte. Dadurch kommt es zu einer Aufteilung
des Photostroms unter die Kontakte in Abhängigkeit von der Position des
Lichtflecks. Die Position wird durch Bildung der Stromdifferenz
zwischen zwei gegenüberliegenden
Kontakten ermittelt. Ein eindimensionaler PSD erlaubt die kontinuierliche Positionsbestimmung
eines Lichtflecks entlang einer Achse. Besonders vorteilhaft ist
eine Ausgestaltungsvariante, bei der der Positionsdetektor einen zweidimensionalen
PSD aufweist, der eine kontinuierliche Positionsbestimmung entlang
von zwei Achsen – beispielsweise
X- und Y-Richtung – ermöglicht.
Bei
einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform mit einem zweidimensional
detektierenden Positionsdetektor könnte die Scherungsrichtung durch
vorzugsweise elektronische Verarbeitung der Signale der ersten und
der zweiten Dimension gedreht werden. In der einfachsten Variante
wird durch Vertauschen der Signale eine Drehung der Scherungsrichtung
um 90° erzielt.
Es ist auch möglich, durch
gewich tetes Verrechnen der Signale der ersten und zweiten Dimension
eine Drehung der Scherungsrichtung um einen beliebigen Winkel zu
erzielen.
In
jedem Fall könnte
der Positionsdetektor an eine elektronische Verarbeitungseinrichtung
gekoppelt sein, wobei eine Wechselspannungskopplung besonders vorteilhaft
ist. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform sind zur Beseitigung
der bildbeeinträchtigenden
Folgen von Schwankungen der Lichtleistung des Beleuchtungslichts,
wie sie beispielsweise bei der Verwendung von Gaslasern auftreten,
logarithmische Strom-Spannungs-Wandler vorgesehen, um die Signale
des Positionsdetektors im Rahmen der Verarbeitungseinrichtung weiter
zu verarbeiten. Hierzu könnte
die Verarbeitungseinrichtung mindestens einen logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler
aufweisen. Insbesondere in der konfokalen Fluoreszenzrastermikroskopie,
in der die Lichtleistung des Beleuchtungslichts variiert werden muss,
um eine ausreichende Fluoreszenzanregung zu erreichen, ist die Verwendung
von logarithmischen Strom-Spannungs-Wandlern besonders vorteilhaft,
wobei in der Variante, in der der Positionsdetektor einen PSD aufweist,
vorteilhafterweise nach der Strom-Spannungs-Wandlung die Differenz
der Signale bezüglich
der beiden Messrichtungen erzeugt wird. Diese Variante ist besonders
vorteilhaft, um simultan ein Phasenkontrastbild und mindestens ein
Fluoreszenzbild der Probe aufzunehmen. In jedem Fall könnte mittels
des Positionsdetektors ein Phasenkontrastbild aufgenommen werden,
wobei gleichzeitig andere Beobachtungstechniken eingesetzt werden
könnten,
beispielsweise im Rahmen der Zweiphotonenanregung, FRET oder CARS.
Die
gleichzeitige Aufnahme eines Fluoreszenz- und eines Phasenkontrastbilds
ermöglicht
es beispielsweise, Mikropipetten oder Mikro-Patch-Clamps bei Sichtkontrolle
in einer Fluoreszenzprobe zu positionieren.
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Positionsdetektor – wie
bereits erwähnt – an eine elektronische
Verarbeitungseinrichtung gekoppelt. Vorzugsweise handelt es sich
bei der Kopplung um eine Wechselspannungskopplung, wodurch die Anforderung
an die Zentrierung des Positionsdetektors in Bezug auf die optische
Achse erheblich verringert wird, da sich bei einer solchen Anordnung
systematische laterale Ablagen nicht in einem Offsetstrom manifestieren.
Vorzugsweise
ist der Positionsdetektor in einer zu der Probenebene oder Fokalebene
konjugierten Ebene – Fourierebene – angeordnet.
Der aus dem Mikroskopobjektiv austretende fokussierte Beleuchtungslichtkegel
wird durch das Phasenobjekt in der Brennebene des Objektivs abgelenkt,
so dass der divergente von der Brennebene ausgehende Kegel gegenüber dem
einfallenden Beleuchtungslichtkegel eine eher gekippte Mittelachse
aufweist. Der Grad der Kippung ist ein direktes Maß für die Variation
des Brechungsindex an der Stelle des zu beobachtenden Pixels. In
einer zur Brennebene konjugierten Ebene wirkt sich diese Kippung
der Mittelachse als Parallelverschiebung des kollimierten durch
die Probe getretenen Beleuchtungslichtbündels aus. Es ist besonders
vorteilhaft, den Positionsdetektor in einer solchen konjugierten
Ebene zu positionieren, um dort die erzeugte Parallelverschiebung
zu messen.
Bei
einer weiter vorteilhaften Ausgestaltung könnte im Strahlengang eine DIC-Optik – Differential Interference
Contrast-Optik – angeordnet
sein.
Bei
einer weiter alternativen Ausgestaltung könnte im Strahlengang vor dem
Objektiv oder den Objektiven und nach der Probe jeweils ein Wollaston-Prisma
angeordnet sein.
Bei
einer konkreten Ausgestaltung könnte das
Scanmikroskop ein 4Pi-Mikroskop sein. Hierdurch kann ein konfokales
Transmissions-Bild erzeugt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop
kann aus einer Phaseninformation – beispielsweise Brechungsunterschiede – ein Amplitudenkontrast
ohne störende
Hintergrundinformation erzeugt werden.
Im
Gegensatz zu einem üblichen
Durchlichtdetektor kann mit Hilfe des zweiten Objektivs das transmittierte
Licht wieder aufgesammelt werden, über den Rückweg über den Scanspiegel der Rastervorgang
wieder aufgehoben werden und somit das Licht auf die Detektionslochblende
fokussiert werden. Licht, das in der Probe gestreut, gebrochen oder gebeugt
wurde, wird an der Lochblende ausgefiltert. Dies erlaubt eine komplett
neue Sichtweise der Transmissionsbilder, wobei nur Information aus
der Fokusebene abgebildet wird. Die Unschärfe aus den anderen Fokusebenen
wird durch die Detektionslochblende unterdrückt.
Erfindungsgemäß wird die
obige Aufgabe des Weiteren durch ein Verfahren zur Phasenkontrastmikroskopie
mit den Merkmalen des Patentanspruchs 24 gelöst. Danach ist das Verfahren
derart ausgestaltet, dass auf beiden Seiten der Probenebene jeweils
mindestens ein Objektiv angeordnet wird und dass mindestens zwei
einander bezüglich
der Probenebene gegenüberliegende
Objektive aufeinander zu gerichtet werden, so dass durch ein Objektiv
zur Probe geführtes
Beleuchtungslicht durch das gegenüberliegende Objektiv aufgefangen
und als Detektionslicht zum Positionsdetektor geführt wird.
Bei
einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens könnte das
Beleuchtungslicht durch zwei einander bezüglich der Probenebene gegenüberliegende
und aufeinander zu gerichtete Objektive geführt und durch das jeweils gegenüberliegende
Objektiv aufgefangen und als Detektionslicht zum Positionsdetektor
geführt
werden.
Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren könnte mittels
des Positionsdetektors ein Phasenkontrastbild aufgenommen werden,
wobei simultan ein Phasenkontrastbild und mindestens ein Fluoreszenzbild
aufgenommen werden könnten.
Hinsichtlich
der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die voranstehend beschriebenen
Vorteile eines entsprechenden Scanmikroskops zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen.
Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
der erfindungsgemäßen Lehre
anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung
des bevorzugten Ausführungsbeispiels
der erfindungsgemäßen Lehre anhand
der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
1 in
einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops
und
2 in
einer weiteren schematischen Darstellung eine an das Scanmikroskop
angeschlossene Verarbeitungseinrichtung mit einem Monitor.
1 zeigt
ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop
mit einer Lichtquelle 1, die als Mehrlinienlaser ausgeführt ist.
Das Scanmikroskop ist als konfokales Scanmikroskop ausgebildet.
Die Lichtquelle 1 erzeugt ein Beleuchtungslicht 2,
das von einer Optik 3 auf eine Beleuchtungslochblende 4 fokussiert wird.
Das durch die Beleuchtungslochblende 4 getretene Beleuchtungslicht 2 gelangt
zu einem Hauptstrahlteiler 5 und wird von diesem über eine
weitere Optik 6 zu einer Scaneinrichtung 7 gelenkt,
die einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 8 aufweist. Die Scaneinrichtung 7 lenkt
das Beleuchtungslicht 2 durch eine Scanoptik 9, über einen
Umlenkspiegel 12, durch eine Tubusoptik 14, über einen
Umlenkspiegel 15 und durch ein Objektiv 17 hindurch
auf eine Probe 19, die beispielsweise ein Gehirnschnitt sein
kann. Die Pupille des Objektivs 17 ist mit der Bezugsziffer 16 gekennzeichnet.
Optiken 10 und 11 sind
für die
Anpassung des 4Pi-Moduls an den konfokalen Strahlengang notwendig,
wobei ein Strahlteiler 13 das Beleuchtungslicht 2 in
Richtung Objektiv 17 und/oder 21 aufteilt. Das
4Pi-Modul, das an die restlichen Bestandteile des Scanmikroskops
angeflanscht werden kann, wird im Wesentlichen durch den Strahlteiler 13 und
die im nachfolgenden Strahlengang vorgesehenen Bauteile, insbesondere
Optiken 14 und 24 sowie Objektive 17 und 21,
gebildet.
Die
Probe 19 befindet sich auf einem Objektträger 20 und
ist mit einem ersten Immersionsmittel 18, das beispielsweise
Wasser, Glyzerin oder Öl
sein kann, optisch an das Objektiv 17 angekoppelt. Auf der
der Probe 19 abgewandten Seite des Objektträgers 20 ist
ein Objektiv 21 angeordnet, das mit einem weiteren Immersionsmittel,
das beispielsweise Wasser, Öl
oder Glyzerin sein kann, optisch angekoppelt ist.
Das
Objektiv 21 kollimiert das durch die Probe 19 getretene
Beleuchtungslichtbündel 2 in
einer zur hinteren Fokalebene 22 des Objektivs 21 korrespondierenden
Ebene 25 sowie in einer weiteren korrespondierenden Ebene 29,
und zwar über einen Umlenkspiegel 23 mit
Hilfe einer Linse 24, der Optiken 11 und 10,
der Scanoptik 9, der Optik 6 und einer weiteren
Linse 27.
Im
Strahlengang nach der Linse 27 ist ein Positionsdetektor 28 angeordnet,
der als Position-Sensitive-Device (PSD) ausgeführt ist. Die hintere Fokalebene 22 des
Objektivs 21 und die hierzu korrespondierende Ebene 29 sind
Fourierebenen zur Brennebene des Objektivs 17.
Der
Positionsdetektor 28 misst die laterale, durch die Probe 19 hervorgerufene
Ablenkung des Beleuchtungslichts 2, die sich am Ort des
Positionsdetektors 28 in einem im Wesentlichen Parallelversatz
des kollimierten durch die Probe 19 getretenen Beleuchtungslichts 2 zeigt.
Der Positionsdetektor 28 detektiert die laterale Ablenkung
in zwei Dimensionen – X-
und Y-Richtung –,
wobei in der 1 der Übersichtlichkeit halber nur
die Beschaltung für
eine Dimension dargestellt ist.
Bezüglich der
dargestellten Dimension weist das Position-Sensitive-Device (PSD)
zwei Kontakte auf, die jeweils an einen logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler
angeschlossen sind. Die Signale der beiden logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler werden einem
Differenzverstärker übergeben
und das von diesem erzeugte Ausgangssignal an einen PC zur weiteren
Bildverarbeitung und Darstellung weitergeleitet. Der PC ist in 1 der Übersichtlichkeit
halber nicht dargestellt. Die logarithmischen Strom-Spannungs-Wandler
sowie der Differenzverstärker
sind Bestandteil einer elektronischen Verarbeitungseinrichtung 30.
Als
Position-Sensitive-Device kann beispielsweise das Modell zwei L4SP
der Firma Sitek verwendet werden.
Das
in 1 gezeigte Scanmikroskop kann letztendlich auf
zwei Arten betrieben werden. Zum einen kann das Beleuchtungslicht 2 nur
durch ein Objektiv 17 oder 21 geführt werden
und nach seinem Durchgang durch die Probe 19 dann vom anderen Objektiv 21 oder 17 aufgefangen
und zum Positionsdetektor 28 geführt werden. Alternativ hierzu
kann eine Beleuchtung über
beide Objektive 17 und 21 und dann ein entsprechendes
Auffangen des durch die Probe 19 hindurchgetretenen Detektionslichts durch
die korrespondierenden Objektive 21 und 17 erfolgen.
In beiden Fällen erfolgt
eine Verarbeitung des Detektionslichts mittels des Positionsdetektors 28 und
mittels der Verarbeitungseinrichtung 30.
Das
von der Lichtquelle 1 ausgehende Beleuchtungslicht 2 umfasst
zusätzlich
eine Wellenlängenkomponente
zur optischen Fluoreszenzanregung der Probe 19. Das von
der Probe 19 ausgehende Fluoreszenzlicht gelangt durch
das Objektiv 17 und/oder das Objektiv 21, die
Tubusoptiken 14 und/oder 24, die Scanoptik 9 sowie
die weiteren Optiken 11 und 10 über die
Scaneinrichtung 8 und die Optik 6 zum Hauptstrahlteiler 5.
Das Fluoreszenzlicht passiert den Hauptstrahlteiler 5 und
die nachfolgende Detektionslochblende 26 und gelangt über einen
weiteren Strahlteiler 31 schließlich zu einem Detektor 32,
der als Photomultiplier oder APD ausgeführt ist. Der Detektor 32 erzeugt
elektrische, zur Leistung des Fluoreszenzlichts proportionale Signale,
die ebenfalls zur weiteren Bildverarbeitung und Darstellung an den nicht
gezeigten PC weiter gegeben werden.
Mit
dem gezeigten Scanmikroskop ist es somit möglich, gleichzeitig sowohl
ein Phasenkontrastbild als auch ein Fluoreszenzbild der Probe 19 zu
erzeugen, um diese getrennt und auch gegebenenfalls überlagert
darzustellen.
2 zeigt
in einer schematischen Darstellung die Linse 27, den Positionsdetektor 28 und
die Verarbeitungseinrichtung 30, wobei an die Verarbeitungseinrichtung 30 noch
eine Kontrollunit 33 und ein Monitor 34 angekoppelt
sind. Über
den Monitor 34 kann ein Phasenkontrastbild und/oder ein
Fluoreszenzbild der Probe 19 betrachtet werden.
Hinsichtlich
weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Lehre
wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil
der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
Schließlich sei
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel
lediglich zur Erörterung
der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel
einschränkt.