EP2912510A1

EP2912510A1 - Mikroskop mit mindestens einem beleuchtungsstrahl in form einer lichtscheibe

Info

Publication number: EP2912510A1
Application number: EP13762402.9A
Authority: EP
Inventors: Jens OTTE; Uwe STRÄHLE; Andrey KOBITSKIY; Gerd Ulrich Nienhaus
Original assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-09-02
Also published as: WO2014063764A1; DE102012110077A1; US9829691B2; US20150253560A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsobjektiv (10) zur Führung mindestens eines Beleuchtungsstrahls (33) in Form einer Lichtscheibe zur Beleuchtung mindestens eines zu untersuchenden Objekts (1), und mit mindestens einem Detektionsobj ektiv (20) zur Aufnahme mindestens eines Detektionsstrahls (35), der von dem zu untersuchenden Objekt (1) ausgeht (Lichtscheibenmikroskop). Erfindungsgemäß nimmt die optische Achse (11) des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs (10) einen Winkel α, der von 90° verschieden ist, zur optischen Achse (21) des mindestens einen Detektionsobjektivs (20) ein und der Eintritt des mindestens einen Beleuchtungsstrahls (33) in das mindestens eine Beleuchtungsobjektiv (10) erfolgt vorzugsweise außerhalb dessen optischer Achse (11) derart unter einem Eintrittswinkel β, dass die Lichtscheibe in der Fokusebene des mindestens einen Detektionsobjektivs (20) liegt. Mit dem erfindungsgemäßen Lichtscheibenmikroskop wird die bisher übliche rechtwinklige Anordnung des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs (10) zum mindestens einen Detektionsobjektiv (20), die mit räumlichen Einschränkungen einhergeht, überwunden. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Anordnung der Objektive in Bezug auf die Aufnahmetechnik als auch darin, das zu untersuchende Objekt auf einem Objekttisch abzulegen bzw. das Objekt samt Tisch zu bewegen.

Description

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Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl in

Form einer Lichtscheibe

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der einen quer zur Achse des Beleuchtungsstrahls ausgedehnten Objektbeleuchtungsbereich (Lichtscheibe) aufweist, zur Beleuchtung eines zu untersuchenden dreidimensionalen Objekts, das insbesondere aus dem Bereich der Biologie, vornehmlich der Entwicklungs- und Zellbiologie, stammt.

Mit bestehender konventioneller konfokaler Mikroskopie wird ein dreidimensionales Objekt in zweidimensionalen optischen Ebenen Punkt für Punkt abgetastet. Dieses Verfahren ist für die Erfassung eines dreidimensionalen Objektes sehr zeitintensiv, insbesondere dann, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis optimiert werden soll, und stößt bei einer schnellen zeitlichen Abfolge von dreidimensionalen Abbildungen eines Objektes an ihre Grenzen.

Die WO 2004/053558 AI offenbart das Verfahren der so genannten Lichtscheiben-Mikroskopie , bei dem durch eine homogene Ausleuchtung einer optischen Ebene senkrecht zum Detektionsobj ek- tiv eine optimale Abbildung einer zweidimensionalen Ebene des dreidimensionalen Objekts erreicht. Wird nun ein Objekt durch die Lichtscheibe bewegt, so ergibt dies eine Serie zweidimensionaler Abbildungen und damit eine dreidimensionale Abbildung des Objekts. Die Vorteile dieser Technik liegen in einer^' hohen Aufnahmegeschwindigkeit, hoher lateraler Auflösung, großer Eindringtiefe in das Objekt und einer geringen Anregungsenergie, vor allem bei Fluoreszenzaufnahmen.

Ein Problem existierender Aufbauten liegt insbesondere in der Positionierung von Objekten in der Lichtscheibe. Hierzu ist es am einfachsten, das Objekt festzuhalten und vor dem Objektiv zu positionieren. Alternativ wird das Objekt in einen Zylinder eingebettet, vorzugsweise in Agarose mit geringem Schmelzpunkt, oder in einem durchsichtigen Container, bevorzugt aus Agarose mit geringem Schmelzpunkt oder aus einem transparenten Polymer, fixiert. Alternativ werden Zellen, auf einem Deckgläschen fixiert, in die Lichtscheibe gehalten werden, siehe E.G. Reynaud et al . , Light sheet-based fluorescence microsco- py: more dimensions, more photons, and less photodamage, HFSP J. 2008, 2, 266-275.

Diese Art der Positionierung ist vor allem für große Objekte, z.B. Embryos, von Nachteil, da sie jeweils in eine Matrix eingebettet werden, die üblicherweise andere optische Eigenschaften als das Objekt selbst und als die betreffende Umgebung, z.B. Luft, Wasser oder Salzlösung, aufweist. Weiterhin behindert eine vollständige Einbettung das Wachstum von biologischen Objekten, z.B. Embryonen, bei Zeitrafferaufnahmen über mehrere Stunden, was insbesondere nachteilig für die in vivo- Mikroskopie von mikroskopisch großen Objekten ist.

Sind Zellen auf einer Glasplatte fixiert, so werden diese samt der Glasplatte in der Lichtscheibe positioniert. Die Glasplatte wird entweder im spitzen Winkel, etwa 45°, oder parallel zur Lichtscheibe positioniert. Erfolgt bei der Positionierung im spitzen Winkel die gleichzeitige Beleuchtung von zwei Seiten, so resultiert eine zusätzliche Durchdringung der Glasplatte von einer der zwei Beleuchtungsseiten in veränderten optischen Eigenschaften. Dies ist insofern problematisch, als bei einer optimalen zweiseitigen Beleuchtung gleiche Eigenschaften von beiden Beleuchtungsseiten wünschenswert sind.

Wird die Glasplatte mit den Zellen parallel zur Lichtscheibe orientiert, so tritt bei einer Beleuchtung und einer Detektion nahe der Glasoberfläche vermehrt Streulicht auf, das ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis hervorruft. Daher sind insbesondere Elemente eines Zytoskeletts, die sich nahe an der Glasoberfläche befinden, optisch nicht zugänglich.

Ein weiterer Nachteil bestehender Einrichtungen für die Lichtscheiben-Mikroskopie ist die schnelle und korrekte Positionierung des freien oder eingebetteten Objekts in der Lichtscheibe. Mit bestehenden Aufbauten wird in der Regel zu Beginn der Messung ein Objekt korrekt ausgerichtet und eine (Zeitraffer-) Aufnahme gestartet. Ein schneller Wechsel zwischen zwei oder mehreren Objekten, d.h. ein sog. Screening von mehreren Objekten zur gleichen Zeit am selben Gerät, und deren korrekter Ausrichtung zur Lichtscheibe ist aus verschiedenen Gründen aufwändig oder unmöglich. Zum einen muss jedes Objekt in allen drei Raumkoordinaten mikrometergenau positioniert werden, wobei für eine lange Messreihe, d.h. über mehrere Stunden, diese Genauigkeit gewährt werden muss. Außerdem ist auch die Beibehaltung sämtlicher Rotationsachsen zu beachten. Die aus den genannten Vorgaben resultierenden Probleme sind in der Praxis der Lichtscheibenmikroskopie hinderlich, jedoch mit entsprechend hohem Aufwand lösbar.

Es sind jedoch weitere Vorgaben zu beachten. Aus der Anordnung der Objektive und dem Aufbau der Probenkammer ergeben sich beengte räumliche Bedingungen, die dazu führen, dass bei einem Objektwechsel ein Herausnehmen des Objekts aus der Flüssigkeit und eine Lagerung außerhalb der Probenkammer erforderlich werden, was unerwünschte Einflüsse auf ein empfindliches Objekt mit sich bringt, die gerade über längere Zeiträume nicht akzeptabel sind. Eine wiederkehrende, mikrometergenaue Positionierung einer Reihe von Objekten für Zeitrafferaufnahmen mit gleichzeitiger Unversehrtheit der Proben kann nicht gewährleistet werden. Eine Automatisierung zur einmaligen seriellen Aufnahme mehrerer Objekte oder zur wiederkehrenden seriellen Aufnahme einer bestimmten Zahl an Objekten über einen Zeitraum ist damit nicht möglich.

Ein Wechsel eines Detektionsobj ektivs und/oder eines Beleuchtungsobjektivs ist beim jetzigen Stand der Technik nicht einfach zu vollziehen und bedarf, insbesondere für einen automatisierten Wechsel, spezieller Vorrichtungen für die Lichtscheibenmikroskopie. Eine hierzu geeignete Vorrichtung wird in der DE 10 2007 018 862 AI offenbart. Nachteilig hieran ist, dass ein Objektivwechsel nur in einer Achse möglich ist. Sollen mehrere Objektive eingesetzt werden, so müssen diese in einer Reihe angeordnet werden, was in der Regel Platzprobleme nach sich zieht. Ein einfacher Wechsel zwischen Luft- und Immersionsobjektiven ist ausgeschlossen. Handelt es sich bei allen Objektiven um Immersionsobjektive, ist es erforderlich, diese vollständig innerhalb der Objektkammer anzuordnen, was insbesondere bei mehreren Objektiven nicht praktikabel ist. Schließlich sind Objektivrevolver, die bei Lichtmikroskopen üblich sind, für die Lichtscheiben-Mikroskopie gegenwärtig nicht einsetzbar.

Eine Kombination und damit eine Synergie eines Lichtscheiben- Mikroskops mit einem bestehenden Lichtmikroskop sind im Gegensatz zur Konfokal- und Mehrphotonenmikroskopie schwer zu realisieren. Beschreibungen zu einem verbesserten Ob ektivhalter und der Kombination mit einem aufrechten Mikroskop befinden sich in der DE 10 2007 015 061 AI sowie in Zanacchi et al . , Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples, Nature Methods 2011, 8, 1047-1050.

F. Cutrale und E. Gratton beschreiben in Inclined Selective Plane Illumination Microscopy Adaptor for Conventional Micro- scopes, Microscopy Research and Technique, am 27. Juni 2012 elektronisch veröffentlicht unter doi : 10.1002/jemt .22089, eine Vorrichtung für die Lichtscheiben-Mikroskopie. Hierbei wird dasselbe Objektiv in einer Weise, die als Highly inclined and laminated optical sheet microscopy (HILO) bekannt ist, so-wohl als Beleuchtungsobjektiv als auch als Detektionsobj ektiv eingesetzt. Der wesentliche Nachtteil hieran, nämlich das enge Sichtfeld, wird hier durch eine Einrichtung zur sog. Oblique plane microscopy (OPM) aufgehoben, in der die Fokusebene des Bildes refokussiert und erneut aufgenommen wird unter Einsatz von zwei zusätzlichen Luftobjektiven, die unter einem Winkel zueinander, der von 90° verschieden ist, angeordnet sind.

Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl in Form einer Lichtscheibe vorzuschlagen, das die genannten Nachteile und Einschränkungen nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand des Anspruchs 1 gelöst. Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Ein erfindungsgemäßes Lichtscheiben-Mikroskop weist kumulativ mindestens die folgenden Merkmale a) bis f) auf. a) Es ist mindestens ein Beleuchtungsstrahl vorhanden, der in Form eines mit einem quer zur Achse des Beleuchtungsstrahls und gleichzeitig in der Fokusebene des Detektionsobj ektivs ausgedehnten Objektbeleuchtungsbereich (Lichtscheibe) ausgestaltet ist. b) Es ist mindestens ein Beleuchtungsobjektiv zur Führung des mindestens einen Beleuchtungsstrahls vorhanden. In einer besonderen Ausgestaltung sind mindestens zwei Beleuchtungsobjektive vorhanden, die vorzugsweise in Form eines Objektrevolvers angeordnet sind. Bei den Beleuchtungsobjektiven handelt es sich bevorzugt entweder um Eintauch- oder um Luftobjektive. c) Es ist mindestens eine Detektionseinrichtung vorhanden, die mindestens einen Detektionsstrahl aufnimmt, der von einem zu untersuchenden Objekt ausgeht, das sich ganz oder teilweise innerhalb des Objektbeleuchtungsbereichs befindet und daher von dem mindestens einen Beleuchtungsstrahl beleuchtet wurde. d) Es ist mindestens ein Detektionsobj ektiv zur Führung des mindestens einen Detektionsstrahls vorhanden. Hierbei wird der mindestens eine Detektionsstrahl besonders bevorzugt in der optischen Achse des mindestens einen Detektionsobj ektivs geführt. In einer besonderen Ausgestaltung sind mindestens zwei Detektionsobj ektive vorhanden, die in Form eines Objektrevolvers angeordnet sind. e) Die optische Achse des mindestens einen Detektionsobj ektivs steht nicht senkrecht zur optischen Achse des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs, sondern nimmt einen Winkel α dazu ein, der bevorzugt einen Wert von 100° bis 170°, besonders bevorzugt einen Wert von 120° bis 150°, insbesondere eine Wert von annähernd 135° annimmt. f) Um sicherzustellen, dass der mindestens eine Beleuchtungsstrahl unter einem solchen Ausgangswinkel in Bezug auf die optischen Achse des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs aus dem mindestens einen Beleuchtungsobjektiv austritt, dass der Objektbeleuchtungsbereich (Lichtscheibe) in der Fokusebene des mindestens einen Detektionsobj ektivs zu liegen kommt, ist es erforderlich, dass der mindestens eine Beleuchtungsstrahl in das mindestens eine Beleuchtungsobjektiv außerhalb der optischen Achse des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs unter einem Eintrittswinkel ß eintritt. Nur auf diese Weise ist gewährleistet, dass trotz des Aufbaus des vorliegenden Lichtscheibenmikroskops, der von der bisher üblichen rechtwinkligen Anordnung des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs zu dem mindestens einen Detektionsobj ektivs abweicht, die Lichtscheibe senkrecht zur optischen Achse des mindestens einen Detektionsobj ektivs steht sowie sich genau mit der Fokusebene des mindestens einen Detektionsobj ektivs deckt.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung werden für das mindestens eine Beleuchtungsobjektiv und das mindestens eine Detektionsobj ektiv jeweils baugleiche Objektive eingesetzt. Dies ermöglicht insbesondere, den Lichtweg umzukehren und das mindestens eine Detektionsobj ektiv als Beleuchtungsobjektiv einzusetzen und umgekehrt, wodurch - bei Vorhandensein einer entsprechenden Anzahl von Detektionseinrichtungen - eine erhöhte Aufnahmegeschwindigkeit und/oder eine erhöhte Lichtausbeute ermöglicht werden.

In einer besonderen Ausgestaltung sind mindestens zwei Lichtquellen, insbesondere Pumplaser, vorhanden, die unterschiedliche Wellenlängen abstrahlen, die von mindestens zwei Detektionseinrichtungen, die jeweils für eine dieser Wellenlängen empfindlich sind, nachgewiesen werden. Das zu untersuchende Objekt befindet sich auf einem Objekttisch. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung befindet sich zwischen dem Objekt und dem Objekttisch ein Objektträger (Halterung) .

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist eine erste Bewegungsanordnung vorhanden, die zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Objektbeleuchtungsbereich und dem zu untersuchenden Objekt dient. Auf diese Weise wird das Objekt durch die Lichtscheibe bewegt, um eine Serie zweidimensionaler Abbildungen und damit eine dreidimensionale Abbildung des Objekts zu erhalten.

In einer alternativen Ausgestaltung ist das zu untersuchende Objekt auf einem fest stehenden Objekttisch aufgebracht. Um dennoch das Objekt durch die Lichtscheibe zu bewegen, um eine Serie zweidimensionaler Abbildungen und damit eine dreidimensionale Abbildung des Objekts zu erhalten, ist mindestens eine Einrichtung vorhanden, die der Änderung des Winkels ß dient, und die Fokusebene des mindestens einen Detektionsobj ektivs ist nachführbar.

In einer weiteren Ausgestaltung sind mindestens eines der vorhandenen Beleuchtungsobjektive und mindestens eines der vorhandenen Detektionsobj ektive jeweils als Immersionsobjektive ausgeführt und befinden sich zumindest teilweise zusammen mit dem zu untersuchenden Objekt in einem Immersionsmedium.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist eine zweite Bewegungsanordnung vorhanden, die die Bewegung des Objekttischs in einer Ebene ermöglicht.

Der Aufbau des erfindungsgemäßen Lichtscheiben-Mikroskops überwindet die bisher übliche rechtwinklige Anordnung von Be- leuchtungs- und Detektionsobj ektiven, die mit räumlichen Einschränkungen einhergeht. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Objektive in Bezug auf die Aufnahmetechnik als auch darin, das beobachtete Objekt auf einem Objekttisch abzulegen und/ oder das Objekt samt Tisch zu bewegen. Auf diese Weise entste- hen neue Anwendungsmöglichkeiten.

Insbesondere weist das erfindungsgemäße Lichtscheiben-Mikroskop die folgenden Vorteile auf.

Eine einfache Positionierung des Objekts auf einem Objekttisch wird möglich. Bei einem Wechsel des Objekts verbleibt das Objekt im Medium und verlässt dieses nicht. Ein schneller und einfacher Wechsel zwischen verschiedenen Objektiven sowohl für die Beleuchtung als auch für die Detektion werden ermöglicht.

Eine erhöhte Aufnahmegeschwindigkeit und/oder eine erhöhte Lichtausbeute werden möglich als Folge von gleichzeitiger Beleuchtung und Detektion in zwei baugleichen Objektiven.

Eine Kombination mit marktüblichen inversen Mikroskopen wird möglich und erzeugt Synergien. Eine Kombination mit anderen Mikroskoptechniken, insbesondere Epifluoreszenz oder PALM, wird leicht möglich, da der erfindungsgemäße

Aufbau den Wechsel von Objektiven schnell und einfach

ermöglicht .

Ein einfacher Objektivwechsel zusammen mit einer einfachen Positionierung auf einem Objekttisch ermöglicht ein sehr vielseitiges Mikroskop für sehr unterschiedliche Anwendungen sowohl für große als auch für kleine Objekte, von normal bis hochauflösend, von der Untersuchung einzelner Objekte bis hin zu einem sog. high throughput Screening.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und der Figuren näher erläutert. Hierbei zeigen:

Fig. 1 Schematische Darstellung des Aufbaus und der Funktionsweise von erfindungsgemäßen Lichtscheiben- Mikroskopen mit einem Beleuchtungsstrahl/-obj ektiv und mit einem Detektionsstrahl/-objektiv;

Fig. 2 Schematische Darstellung des Aufbaus und der Funktionsweise eines erfindungsgemäßen Lichtscheiben- Mikroskops mit zwei Beleuchtungsstrahlen/-obj ektiven und mit zwei Detektionsstrahlen/-objektiven;

Fig. 3 Führen einer Reihe zu untersuchender Objekte auf einem in einer Ebene beweglichen Objekttisch unter einem erfindungsgemäßen Lichtscheiben-Mikroskops mit einem Beleuchtungsstrahl/-objektiv und mit einem Detek- tionsstrahl/-obj ektiv;

Fig. 4 Typische biologische Objekte auf einem Objektträger;

Fig. 5 Schematische Darstellung des Aufbaus und der

Funktionsweise des erfindungsgemäßen Lichtscheiben- Mikroskops mit zwei Beleuchtungsstrahlen/-obj ektiven und einem Detektionsstrahl/-obj ektiv mit festen Objekttisch;

Fig. 6 Zu untersuchende biologische Objekte

a) in Form einer zweidimensionalen in vitro

Zellkultur auf einer Schicht Agarose, b) in Form einer dreidimensionalen Zellkultur in einem Medium;

Fig. 7 Schematische Darstellung des Aufbaus und der Funktionsweise eines erfindungsgemäßen Lichtscheiben-Mikroskops mit zwei Beleuchtungsstrahlen/-obj ektiven und mit einem Objektivrevolver zur Aufnahme des

Detektionsstrahls .

Die Fig. la) , lc) und le) zeigen schematisch drei bevorzugte Ausgestaltungen für Anordnungen der Objektive 10, 20 im

erfindungsgemäßen Lichtscheiben-Mikroskop. In den Fig. 1 b) , ld)und lf) ist jeweils eine Vergrößerung des Objektbereichs aus den Fig. la) , lc) bzw. le) dargestellt.

In allen drei Ausgestaltungen werden, wie in den Fig. la) , lc) und le) dargestellt, zwei Objektive 10, 20 derart

angeordnet, dass die optischen Achsen 11, 21 der beiden

Objektive 10, 20 einen Winkel α von annähernd 135° zueinander annehmen. Das Objekt (Probe) 1 befindet sich auf einer

geeigneten Halterung, bevorzugt Agarose, als Objektträger 2, der auf einem Objekttisch 3 mittels einer Bewegungsanordnung 4 in allen Raumrichtungen bewegt werden kann. Die beiden

Objektive 10, 20 sind fest installiert.

Gemäß der in Fig. la) dargestellten ersten Ausgestaltung wird mit aus dem Stand der Technik bekannten Einrichtungen im ersten Objektiv, das als Beleuchtungsobjektiv 10 dient, eine Lichtscheibe erzeugt. Diese Lichtscheibe verläuft

allerdings nicht, wie im Stand der Technik beschrieben, parallel zur op- tischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10, sondern tritt in das Beleuchtungsobjektiv 10 unter einem hohen Eintrittswinkel ß und außerhalb dessen optischer 11

Achse ein. Durch diese Anordnung ist sichergestellt, dass auch bei einem Winkel α von annähernd 135° der optischen

Achsen 11, 21 der Objektive 10,20 zueinander die

Lichtscheibe dennoch senkrecht zur optischen Achse 21 und innerhalb der Fokusebene des zweiten Objektivs, das als

Detektionsobj ektiv 20 dient, verläuft. Der Nachweis

des vom Objekt 1 ausgehenden Detektionsstrahls 35, der das Detektionsobj ektiv 20 entlang dessen optischer Achse 21

durchläuft, erfolgt mittels eines Detektors 36, wozu insbesondere eine schnelle CCD-Kamera oder eine sCMOS-Kamera eingesetzt wird.

In der in Fig. lc) dargestellten zweiten Ausgestaltung wird mit aus dem Stand der Technik bekannten Einrichtungen im zweiten Objektiv, das jetzt als Beleuchtungsobjektiv 10 dient, eine Lichtscheibe erzeugt. Auch hier verläuft die Lichtscheibe nicht, wie im Stand der Technik beschrieben, parallel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10, sondern tritt in das Beleuchtungsobjektiv 10 unter einem hohen Eintrittswinkel ß ein. Durch diese Anordnung ist auch hier sichergestellt, dass bei einem Winkel α von annähernd 135° der optischen Achsen 11, 21 der Objektive 10, 20 zueinander die Lichtscheibe dennoch senkrecht zur optischen Achse 21 des ersten Objektivs, das hier als Detektionsobj ektiv 20 dient, verläuft. Der Nachweis des vom Objekt 1 ausgehenden Detektionsstrahls 35, der das Detektionsobj ektiv 20 entlang dessen optischer Achse 21 durchläuft, erfolgt auch hier mittels eines Detektors 36.

Gemäß der in Fig. le) dargestellten dritten Ausgestaltung wird im ersten Objektiv, das als Beleuchtungsobjektiv 10 dient, eine Lichtscheibe erzeugt. Die auch hier nicht parallel zur optischen Achse des Beleuchtungsob ektivs 10 verläuft, sondern in das Beleuchtungsobjektiv 10 unter einem hohen Eintrittswinkel ß und außerhalb dessen optischer 11 Achse eintritt. Dadurch verläuft auch bei einem Winkel α von annähernd 135° der optischen Achsen 11, 21 der Objektive 10, 20 zueinander die Lichtscheibe senkrecht zur optischen Achse 21 und innerhalb der Fokusebene des zweiten Objektivs, das als erstes Detektionsobj ektiv 20 dient. Der vom Objekt 1 ausgehende erste Detektionsstrahl 35 durchläuft das erste Detektionsobj ektiv 20 entlang dessen optischer Achse 21 und wird mittels eines ersten Umlenkspiegels 37 auf einen Detektor 36 geführt. Gleichzeitig wird ein vom Objekt 1 ausgehender zweiter Detektionsstrahl 35 ^Λ durch das erste Objektiv, das hierzu als zweites Detektionsobjektiv 20 dient, entlang dessen optischer Achse 21 ^λ mittels eines zweiten Umlenkspiegels 37 und eines umgekehrten Strahlteilers 39 auf denselben Detektor 36 geführt. Da in dieser Anordnung die Lichtscheibe nicht senkrecht zur optischen Achse 21 ^λ und somit nicht innerhalb der Fokusebene des zweiten Detektionsobjektiv 20 ^Λ verläuft, ist es jedoch erforderlich, um die beiden Abbildungen eindeutig zu überlagern, den zweiten Detektionsstrahl 35 ^Λ zuvor durch eine Einrichtung 38 zur Oblique plane icroscopy (OPM) nach Cutrale et al., a.a.O., zu schicken. Mit der Anordnung nach Fig. le) wird es möglich, den Lichtweg umzukehren und das Beleuchtungsobjektiv 10 gleichzeitig als zweites Detektionsobjektiv 20 ' einzusetzen, wodurch hier eine erhöhte Lichtausbeute erzielt wird .

Die in Fig. 1 dargestellten Ausgestaltungen der Anordnung von erfindungsgemäßen Lichtscheiben-Mikroskopen ermöglichen insbesondere die im Folgenden dargestellten Untersuchungsverfahren. A. Lichtscheiben-Mikroskopie mit denselben Objektiven

Zur Lichtscheiben-Mikroskopie von großen Objekten, insbesondere von Fischembryos oder Pflanzen, und von kleinen Objekten, wozu Zellen und subzelluläre Strukturen gezählt werden, mit denselben Objektiven werden zwei gleiche Objektive mit mittlerer bis hoher numerischer Apertur eingesetzt, die wie in Fig. 1 in einem Winkel α von annähernd 135° zueinander angeordnet sind, wodurch zwei Kanäle gleichzeitig angeregt und nachgewiesen werden können.

In einem Ausführungsbeispiel erfolgt die Anregung mit einem ersten Beleuchtungsstrahl 33 mit einer ersten Wellenlänge (hier: 488 nm) im ersten Objektiv 10, während das Fluoreszenzsignal als erstes Detektionssignal 35 mit den beiden Objektiven 10, 20 erfasst, zusammengeführt und mittels einer ersten Detektionseinrichtung 36 nachgewiesen wird. Hierzu gleichzeitig erfolgt eine zweite Anregung mit einem zweiten Beleuchtungsstrahl 33 mit einer zweiten Wellenlänge (hier: 561 nm) im zweiten Objektiv 20, während das hierbei resultierende Fluoreszenzsignal als zweites Detektionssignal 35 ^λ wieder mit den beiden Objektiven 10, 20 erfasst, zusammengeführt und mit einer zweiten Detektionseinrichtung 36 ^λ nachgewiesen wird.

Wird eine Zeitreihe aufgenommen, so kann in einer ersten Ausgestaltung die Zuordnung der beiden Anregungswellenlängen zu den Objektiven beibehalten werden. In einer zweiten Ausgestaltung wird dagegen die Zuordnung der beiden Anregungswellenlängen zu den Objektiven alternierend festgesetzt. Die alternierende Art der Beleuchtung stellt eine verbesserte Ausleuchtung aus unterschiedlichen Blickwinkeln sicher.

Die gleichzeitige Anregung und Detektion von zwei Wellenlängen ermöglicht einen erheblichen Zeitgewinn für die Lichtscheiben- Mikroskopie. Durch die gleichzeitige Detektion mittels zwei Objektiven 10, 20 mit einer Detektionseinrichtung 36 wird das nachweisbare Signal gesteigert. Ein weiterer Vorteil dieser Anordnung besteht in der Ausleuchtung von Objekten, die auf einer Seite optisch schlecht durchdringbar sind. Die beschriebene Anordnung eignet sich insbesondere zur optimalen Ausleuchtung und für den Nachweis von derartigen Strukturen z.B. in Fischembryos, die sich in der Nähe des Dotters befinden.

B. Lichtscheiben-Mikroskopie mit Objektiven unterschiedlicher numerischer Apertur und Vergrößerung

In den Fig. 2 bis 4 ist dargestellt, wie sich die Lichtscheiben-Mikroskopie von großen Objekten, insbesondere von Fischembryos oder Pflanzen, mit Objektiven unterschiedlicher numerischer Apertur und Vergrößerung mit Möglichkeit und Vorrichtung zur Beobachtung mehrerer Proben in einer Zeitrafferaufnahme ausgestalten lässt.

Gemäß Fig. 2 erfolgt die Beleuchtung der Probe durch einer erstes Beleuchtungsobjektiv 10 mit geringer numerischer Apertur (NA < 0,2) und einem sehr großen Arbeitsabstand (> 3 mm) . Die Lichtscheibe wird unter einem Eintrittswinkel ß des ersten Beleuchtungsstrahls 33 in das erste Beleuchtungsobjektiv 10 erzeugt und mit einem Detektionsobj ektiv 20 nachgewiesen. Um eine Beleuchtung von zwei Seiten zu erhalten, wird ein zweites Beleuchtungsobjektiv 10 ^Λ hinzugezogen, in das ein zweiter Beleuchtungsstrahl 33 ^Λ unter einem Eintrittswinkel β^Λ eintritt.

Ist der Arbeitsabstand zwischen den Beleuchtungsobjektiven 10, 10 ^λ ausreichend, so kann optional (und in Fig. 2 nicht dargestellt) ein zweites Detektionsobj ektiv 20 ^v hinzugenommen werden, um mittels des zweiten Detektionsobj ektivs 20 eine De- tektion von zwei Seiten mit jeweils einer eigenen Detektions- einrichtung 36, 36 zu erreichen. Um das Objekt durch die Lichtscheibe zu bewegen, bleiben alle Objektive 10, 10', 20, 10* fest, nur der Objekttisch 3 wird mikrometergenau bewegt.

In Fig. 2 ist exemplarisch der Einsatz von Eintauchobjektiven als Beleuchtungsobjektive 10, 10 ^λ dargestellt. Sollen dagegen Luftobj ektive verwendet werden, so ist es vorteilhaft, zwi^¬ schen dem Objekt (das in Fig. 2 nicht dargestellt ist) und de Beleuchtungsobjektiven 10, 10 ^Λ jeweils eine dünne Glasscheibe einzubauen .

Der in Fig. 1 gewählte Aufbau ist sehr gut geeignet, um, wie in Fig. 3 dargestellt, mehrere große Objekte in einer Zeitraf feraufnahme nachzuweisen. Die Objekte 1, 1^λ, 1^, , 1^{Λ , λ} werden in einem geeigneten Abstand zueinander in einer Reihe auf dem Probentisch 3 positioniert. Dabei ist es vorteilhaft, wenn di größte Achse der Objekte 1, 1^λ, 1^Χ , 1 ^{, λ} möglichst nicht in die Richtung der Objektive 10, 10 20, 20 ... zeigt, um eine gute optische Durchdringung zu ermöglichen. In einem geeigneten zeitlichen Abstand werden die Objekte 1, 1 1^{λ Λ}, 1^{Λ λ λ} auf dem Objekttisch 3 nacheinander jeweils in den Fokus gefahren und detektiert. Die optimale Position jedes Objekts 1, 1^Λ, 1 ^Λ, 1^{λ λΛ} wurde dabei einmalig zu Beginn der Messung festgelegt und lässt sich nun wiederholt automatisch aufrufen und anfahren. Der Objekttisch 3 kann mittels einer Bewegungsanordnung 5 in allen drei Raumrichtungen bewegt werden. Auch beim Anfahren einer neuen Position bleiben die Objekte 1, 1 l , l an ihrem Platz und damit im Medium.

Mit der erfindungsgemäßen Anordnung lassen sich große Objekte einfach auf dem Objekttisch 3 positionieren und müssen nicht, wie im Stand der Technik beschrieben, in einen Agarosezylinde eingegossen, wodurch sie für eine spätere Manipulation unerreichbar werden. Vielmehr genügt hier ein kleiner Ständer aus Agarose, bevorzugt 2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt {low melting agarose) .

In Fig. 4a) ist schematisch auf diese Weise als Objekt 1 ein positioniertes Fischei dargestellt, während Fig. 4b) als Objekt 1 einen Fischembryo zeigt, der mit einem Tropfen Agarose positioniert wurde.

Fig. 4c) zeigt eine Seitenansicht eines Zebrabärblingsembryo als Objekt 1 in einer Kammer oder einer optisch sehr gut durchdringbaren Kammer als Objektträger 2, die Aussparungen an den Wachstumsstellen des Organismus aufweist. In Fig. 4d ist der Zebrabärblingsembryo als Objekt 1 in der als Objektträger

2 dienenden Kammer von oben dargestellt. Werden Fischembryonen eingesetzt, so sind diese zu betäuben.

C. Hochauflösende Lichtscheiben-Mikroskopie mit Objektiven gleicher oder unterschiedlicher numerischer Apertur und Vergrößerung

Der Aufbau für eine hochauflösende Lichtscheiben-Mikroskopie von kleinen Objekten, insbesondere von Zellen und subzellulären Strukturen, sowie von großen Objekten, wozu insbesondere Fischembryos und Pflanzen gehören, mit Objektiven gleicher oder unterschiedlicher numerischer Apertur und Vergrößerung folgt den schematischen Darstellungen in den Fig. 5 und 6.

Gemäß Fig. 5 erfolgt die Beleuchtung des Objekts durch ein Beleuchtungsobjektiv 10 mit hoher numerischer Apertur (NA > 0,8 μπι) , um eine möglichst dünne Lichtscheibe (d < 1 μπ\) zu erzeugen. Die Lichtscheibe wird unter einem hohen Austrittswinkel erzeugt und mit dem Detektionsobj ektiv 20 detektiert. Sofern es die Geometrie und der Arbeitsabstand zum Beleuchtungsobjektiv 10 erlaubt, kann, wie in Fig. 5 dargestellt, ein baugleiches Beleuchtungsobjektiv 10 ^λ für eine zweiseitige Beleuchtung hinzugezogen und damit eine zweiseitige Detektion erreicht werden. In Fig. 5 ist exemplarisch der Einsatz von Eintauchobjektiven dargestellt.

Um das Objekt durch die Lichtscheibe zu bewegen, bleiben das mindestens eine Beleuchtsobj ektiv 10, 10 und der Objekttisch

3 fest, während die Winkel der optischen Achse 11, 11 des mindestens einen Beleuchtsobj ektivs 10, 10 ^x in Bezug auf den

Objekttisch 3 mittels einer dafür vorgesehenen Einrichtung 15, 15 ^λ verändert wird. Zur optimalen Detektion wird das Detektionsobj ektiv 20 synchron der Bewegung der LichtScheibe nachgeführt. Die Präparation für große Objekte erfolgt, wie in Fig. 4 dargestellt. Eine zwei- bzw. dreidimensionale in vivo Zellkultur bzw. fixierte Zellen und subzelluläre Strukturen, bevorzugt ein Zellskelett, werden, wie in Fig. 6 dargestellt, für die hochauflösende Lichtscheiben-Mikroskopie präpariert.

Fig. 6a) zeigt hierbei die Präparation einer zweidimensionalen in vitro Zellkultur auf einer Schicht Agarose, während in Fig. 6 b) die Präparation einer dreidimensionalen Zellkultur in einem hierfür geeigneten Medium, insbesondere in Agarose, Kollagen, einem Hydrogel oder Perfluorethylenpropylen- Copolymer-Folie, dargestellt ist.

D . Lichtscheiben-Mikroskopie in Kombination mit Lichtmikroskopie

Alle unter den Punkten A. bis C. dargestellten Aufbauten lassen sich mit bekannten inversen Lichtmikroskopen kombinieren. Mit der gewählten Anordnung wird es möglich, den Objekttisch 3, vorzugsweise einschließlich eines Piezotisches, als auch das Detektionsobj ektiv 20 mit geringfügigen Änderungen direkt zu übernehmen.

Wie aus Fig. 7 hervorgeht, wird auch der Einsatz eines Objektivrevolvers 40 möglich, der eine Reihe von Detektionsobj ek- tiven 20, 20 20 ^Λ * , 20 * ^{x λ} , 20 ^Λ , 20 ^x * * ^λ zur Aufnahme des Detektionsstrahls aufweist.

E. Lichtscheibenmikroskopie in Kombination mit Epifluoreszenz und/oder hochauflösender Mikroskopie

Alle bisher dargestellten Aufbauten und Kombinationen lassen sich mit Epifluoreszenz und/oder mit bekannten Vorrichtungen zur hochauflösenden Mikroskopie kombinieren. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird durch das zweite Beleuchtungsobjektiv 10 ^Λ Epifluoreszenz mit eingebunden In einer alternativen Ausgestaltung dient das zweite Beleuch^¬ tungsobjektiv 10 dazu, um sog. photoactivation localization microscopy (PALM) , ein aus der hochauflösenden Mikroskopie bekanntes Verfahren einzusetzen und mit Lichtscheiben-Mikroskopie zu kombinieren.

Bezugszeichenliste

Winkel zwischen der optische Achse 11, 11 ^λ eines Be leuchtungsobj ektivs 10, 10 zur optischen Achse 21, 21 ^λ eines Detektionsob ektivs 20, 20 ^λ

Eintrittswinkel in ein Beleuchtungsobjektiv 10, 10 ^Λ

Objekt (Probe)

Objektträger (Halterung)

Objekttisch (Probentisch)

Bewegungsanordnungen

Beleuchtungsobj ektive

zugehörige optische Achsen

Austrittskegel

Einrichtung zur Veränderung des Winkels ß , ß ^x

Detektionsobj ektive

zugehörige optische Achsen

Eintrittskegel

Lichtguelle (Anregungslaser)

Fokussieranordnung

Beleuchtungsstrahl

Obj ektbeleuchtungsbereich (LichtScheibe)

Detektionsstrahl

Detektionseinrichtung (Detektor; Kamera) Umlenkspiegel (dichromatisch oder normal) Einrichtung zur Oblique plane microscopy (OPM) nach Cutrale et al., s.o.)

umgekehrter Strahlteiler

40 Obj ektivrevolver

Claims

Patentansprüche

1. Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsobjektiv (10) zur Führung mindestens eines Beleuchtungsstrahls (33) in Form einer Lichtscheibe zur Beleuchtung mindestens eines zu untersuchenden Objekts (1) und mit mindestens einem Detek- tionsobj ektiv (20) zur Aufnahme mindestens eines Detekt- ionsstrahls (35), der von dem zu untersuchenden Objekt (1) ausgeht, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse (11) des mindestens einen Beleuchtungsobjektivs (10) einen Winkel a, der von 90° verschieden ist, zur optischen Achse (21) des mindestens einen Detektionsobj ektivs (20) einnimmt und der Eintritt des mindestens einen Beleuchtungsstrahls (33) in das mindestens eine Beleuchtungsobjektiv (10) der^¬ art unter einem Eintrittswinkel ß erfolgt, dass die Lichtscheibe in der Fokusebene des mindestens einen Detektions- objektivs (20) liegt.

2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Eintritt des mindestens einen Beleuchtungsstrahls (33) in das mindestens eine Beleuchtungsobjektiv (10) außerhalb dessen optischer Achse erfolgt.

3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Winkel α einen Wert von 120° bis 150° annimmt.

4. Mikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Winkel α einen Wert von annähernd 135° annimmt.

5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Beleuchtungsobjektive (10, 10') und/oder mindestens zwei Detektionsob ektive (20, 20') vorgesehen sind, die in Form eines Objektrevolvers angeord^¬ net sind. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass für das mindestens eine Beleuchtungsobjektiv (10) und für das mindestens eine Detektionsobjektiv (20) jeweils baugleiche Objektive eingesetzt werden.

Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Lichtquellen (31, 31'), die voneinander verschiedene Wellenlängen abstrahlen, und mindestens zwei Detektionseinrichtungen (36, 36' ) zum Nachweis der voneinander verschiedenen Wellenlängen vorgesehen sind.

Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Bewegungsanordnung (4) vorgesehen ist zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem

Objektbeleuchtungsbereich (34) und dem zu untersuchenden Objekt (1), das auf einem Objekttisch (3) aufgebracht ist.

Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das zu untersuchende Objekt (1) auf einem fest stehenden Objekttisch (3) aufgebracht ist, mindestens eine Einrichtung (15, 15') zur Änderung des Winkels ß vorgesehen ist und die Fokusebene des mindestens einen Detek- tionsobj ektivs (20) nachführbar ist.

Mikroskop nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Bewegungsanordnung (5) vorgesehen ist zur Bewegung des Objekttischs (3) in einer Ebene.

Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das zu untersuchende Objekt (1) mittels eines Objektträgers (2) auf dem Objekttisch (3) aufgebracht ist . Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, dass mindestens ein Beleuchtungsobjektiv (10) und mindestens ein Detektionsobj ektiv (20) jeweils als Immersionsobjektive ausgeführt sind und sich zumindest teilweise zusammen mit dem zu untersuchenden Objekt (1) in einem Immersionsmedium befinden.