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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betrieb einer Mikroskopieranordnung mit einem ersten Mikroskop und mindestens einem weiteren Mikroskop sowie eine Mikroskopieranordnung.
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Sollen zu untersuchende Proben mittels unterschiedlicher Mikroskope und/oder unterschiedlicher Mikroskopieverfahren untersucht werden, ist beispielsweise das (Wieder-)Auffinden einer zu untersuchenden Region der Probe (region of interest, ROI) bei einem Überführen der Probe von einem Mikroskop zu einem weiteren Mikroskop problematisch.
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In einem als „klassisch“ bezeichneten Arbeitsablauf (workflow) bei der mikroskopischen Untersuchung einer Probe wird diese auf einem geeigneten Objektträger aufgelegt und bezüglich einer optischen Achse des Mikroskops eingerichtet. Es kann anschließend ein Übersichtbild der Probe mit niedriger Vergrößerung und großem Sichtfeld (field of view, FoV), gegebenenfalls zunächst mittels Okulareinblick, aufgenommen werden, um interessante Probenbereiche (region of interest, ROI) zu identifizieren. Im Weiteren kann die Probe unter Verwendung unterschiedlicher Untersuchungsmethoden, beispielsweise (Fluoreszenz-) Kontrastverfahren, DIC (Differentialinterferenzkontrast, Polarisationskontrast, Phasenkontrast, Hoffmann-Modulationskontrast, Dunkelfeldbeleuchtung, etc., untersucht werden.
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Sollen unterschiedliche Untersuchungsmethoden mit nur einem Mikroskopsystem angewandt werden, muss dieses einen Okularstrahlengang und wenigstens einen Kamerastrahlengang aufweisen. Ferner sind beispielsweise eine Auflicht- und Durchlichtbeleuchtung, eine Objektivwechseleinrichtung, eine Filterwechseleinrichtung, Pupilleneingriff(e) beispielsweise für DIC-Komponenten (DIC = Differential Interference Contrast) usw. erforderlich.
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Ein für das Mikroskop verwendetes Stativ kann eine inverse oder aufrechte Anordnung des Mikroskops ermöglichen. Um die Anwendung unterschiedlicher Untersuchungsmethoden zu erlauben benötigt das Stativ weitere Schnittstellen beispielsweise für Laserscanningmikroskope (LSM), für die Interne Totalreflexionsmikroskopie (total internal reflection fluorescence microscopy; TIRF-microscopy), für Fluoreszenzverfahren (z. B. fluorescence recovery after photobleaching; FRAP), Vivatom für die Aperturkorrelation, Spinning Disc, Einheiten zur Erzeugung strukturierter Beleuchtung, z. B. Apotom, etc. oder Kombinationen davon. Bei diesen Systemen verbleibt die Probe im Wesentlichen an der gleichen Position, sodass der gleiche Probenbereich mit verschiedenen Objektiven und/oder Methoden untersucht werden kann. Nachteilig daran ist, dass viele Schnittstellen beziehungsweise viele optische Pfade und Umschalteinrichtungen sowohl beleuchtungsseitig als auch detektionsseitig vorgehalten werden müssen, um alle Auswahlmöglichkeiten (Methoden, Modalitäten) bedienen zu können. Zudem muss bei den klassischen Stativen immer eine Objektivwechselvorrichtung, beispielsweise ein Objektivrevolver, vorhanden sein, um die unterschiedlichen Modalitäten bedienen zu können (z. B. für einen Wechsel zwischen der Bereitstellung eines Übersichtsbilds und eines Bildes mit Hochauflösung). Eine solche Objektivwechselvorrichtung bedingt naturgemäß Einbußen an der Stabilität des optischen Systems (sogenannte Drift) gegenüber einem einzelnen, fest montierten Objektiv.
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Dem gegenüber stehen dedizierte Mikroskopsysteme mit speziellen Objektivanordnungen, die sehr spezifisch für eine Untersuchungsmethode wie SPIM gestaltet sind. Diese erlauben beispielsweise keinen Objektivwechsel. Auch alternative Kontrastverfahren wie DIC, Polarisationskontrast etc. sind mit diesen Objektivanordnungen nur sehr eingeschränkt möglich.
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Soll ein und dieselbe Probe sowohl mit einer dedizierten Untersuchungsmethode als auch beispielsweise mit klassischer Mikroskopie untersucht werden, so muss auf einen korrelativen Ansatz zurückgegriffen werden, wie dieser aus der Kombination Licht- und Elektronenmikroskopie bekannt ist.
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Dabei transportiert man die Probe vom dedizierten System zum klassischen Mikroskop oder umgekehrt, wobei das Problem besteht, die ROI in der Probe wiederzufinden. Diese Vorgehensweise wird auch als „shuttle-and-find“ bezeichnet. Dies kann entweder unter Verwendung hochgenau gefertigter Probenrahmen erfolgen, die das Referenz-Koordinatensystem bilden oder über markierte Probengefäße, die z. B. ein nummeriertes Raster aufweisen, anhand dessen die gewünschte Stelle im jeweils anderen Mikroskopsystem wiedergefunden werden kann. Dieses Vorgehen ist jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv und stellt einen schnellen und wiederholten Wechsel zwischen den Modalitäten nicht zufriedenstellend sicher.
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Aus dem Stand der Technik sind mikroskopische Anordnungen bekannt, die zur Untersuchung einer Probe mit verschiedenen Untersuchungsmethoden ausgebildet sind.
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In der
DE 10 2012 014 768 B4 ist ein Mikroskop beschrieben, das eine erste und zweite Abbildungsoptik aufweist, die voneinander beabstandet angeordnet sind. Diese dienen zur Abbildung eines ersten und eines zweiten Objektfeldes in ein erstes und zweites Bildfeld unter Verwendung einer ersten Beleuchtungsstrahlung. Ferner ist eine dritte Abbildungsoptik zur Abbildung eines dritten Objektfeldes in ein drittes Bildfeld unter Verwendung einer zweiten Beleuchtungsstrahlung vorhanden. Dabei sind das erste, das zweite und das dritte Objektfeld in einer Objektebene angeordnet, wobei das erste und das zweite Bildfeld überlappend in einer Bildebene angeordnet sind. Die Wellenlänge der ersten Beleuchtungsstrahlung ist größer als die Wellenlänge der zweiten Beleuchtungsstrahlung. Die Mittelpunkte der Objektfelder liegen auf einer Geraden und das erste und zweite Objektfeld umgeben das dritte Objektfeld.
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Die
WO 2014/173547 betrifft ein Mikroskopieverfahren und eine Vorrichtung zur multidimensionalen Lokalisierung von interessierenden Objekten. Dabei werden wenigstens zwei Referenzmarken eines Referenzkoordinatensystems benutzt, um eine Position des betreffenden Objekts in dem Referenzkoordinatensystem zu ermitteln. Diese so ermittelte Position kann von einem zweiten Mikroskop verwendet werden, um das Objekt zu relokalisieren.
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Aus einer Presseinformation des Fraunhofer-Instituts für Optronik, Systemtechnik und Bildauswertung (Presseinformation vom 24. Januar 2014) ist eine Mikroskopieranordnung bekannt, bei der eine Anzahl unterschiedlicher Mikroskope durch einen Roboter bedient werden. Der Roboter verfügt über eine zentrale Steuereinheit und übergibt eine jeweilige Probe positionsgenau an die verschiedenen Mikroskope.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde eine alternative Möglichkeit zur Untersuchung einer Probe mit unterschiedlichen Untersuchungsmethoden vorzuschlagen, wobei bei einem Wechsel zwischen den Untersuchungsmethoden ein genaues Relokalisieren von interessierenden Probenbereichen ermöglicht wird. Zugleich soll eine apparative Möglichkeit vorgeschlagen werden, die hohe Relokalisationsgenauigkeit sicherzustellen.
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Die Aufgabe wird hinsichtlich der Möglichkeit zur genauen Relokalisation durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und hinsichtlich einer Mikroskopieranordnung nach Anspruch 5 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Das Verfahren ist zum Betrieb einer Mikroskopieranordnung mit einem ersten Mikroskop und mindestens einem weiteren Mikroskop ausgelegt, wobei jedes der Mikroskope eine optische Achse aufweist und die optischen Achsen nicht zusammenfallen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte A bis F. In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens können weitere Zwischenschritte ausgeführt werden.
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In einem Schritt A wird ein dreidimensionales Referenzkoordinatensystem festgelegt, bei dem die Koordinaten des Verlaufs der optischen Achse des ersten Mikroskops und die Koordinaten des Verlaufs der weiteren optischen Achse des weiteren Mikroskops bekannt sind oder ermittelt werden. Die bekannten oder ermittelten Koordinaten werden abgespeichert und dienen als Bezugsachsen. Ein Festlegen des Referenzkoordinatensystems erfolgt beispielsweise, indem die optische Achse des ersten Mikroskops mit einer der Achsen des Referenzkoordinatensystems zusammenfällt und beispielsweise der Punkt, an dem die optische Achse eine Frontlinse eines Objektivs des ersten Mikroskops durchstößt, als ein definierter Punkt des Referenzkoordinatensystems, beispielsweise des Null- oder Ursprungspunkts, festgelegt wird.
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Weist die Mikroskopieranordnung genau zwei Mikroskope auf, ist das weitere Mikroskop das zweite vorhandene Mikroskop. Sind dagegen mehr als zwei Mikroskope vorhanden, so ist das weitere Mikroskop ein als nächstes zu verwendendes Mikroskop. Dieses muss dem ersten Mikroskop nicht zwingend das räumlich nächstliegende Mikroskop sein.
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Die Koordinaten des Verlaufs einer der optischen Achsen können in einer dem Fachmann bekannten Weise erfasst und gespeichert werden. Beispielsweise sind die Koordinaten des Verlaufs als Vektor (Punkt und Richtung) ausgedrückt.
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Die erste optische Achse ist durch das erste Objektiv gegeben, wenn sich dieses in Arbeitsstellung in dem ersten Mikroskop befindet, so dass mittels des ersten Objektivs Bilddaten einer Probe erfasst werden beziehungsweise erfassbar sind. Entsprechend ist die zweite optische Achse durch das weitere, in Arbeitsstellung befindliche weitere Objektiv des weiteren Mikroskops gegeben.
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In einem Schritt B wird eine zur Aufnahme und Halterung eines Probenträgers ausgebildete Trägervorrichtung in eine von der ersten optischen Achse durchstoßene Probenebene des ersten Mikroskops und in die optische Achse des ersten Mikroskops eingebracht.
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Zur Ausführung des Verfahrens ist vorzugsweise ein abzubildendes Objekt, beispielsweise eine Probe, in oder auf dem Probenträger angeordnet.
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Die Probenebene ist ein intrinsisches Merkmal des jeweiligen Mikroskops bzw. der aktuell verwendeten Objektive und ist vorzugsweise durch eine jeweilige Fokalebene des Mikroskops gegeben.
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Der Schritt C beinhaltet das Festlegen eines mit der optischen Achse zusammenfallenden Referenzpunkts und das Ermitteln von Koordinaten des festgelegten Referenzpunkts.
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In einem Schritt D wird die Trägervorrichtung zu dem weiteren Mikroskop zugestellt, wobei fortlaufend die aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts erfasst und mit den Koordinaten der optischen Achse des weiteren Mikroskops verglichen werden.
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In Abhängigkeit der mittels des Vergleichs ermittelten Differenzen zwischen den aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts und den Koordinaten der optischen Achse des weiteren Mikroskops werden in einem Schritt E Steuerbefehle generiert, mittels denen in einem Schritt F die weitere Zustellbewegung der Trägervorrichtung gesteuert wird, so dass die Trägervorrichtung derart positioniert wird, dass der Referenzpunkt mit der weiteren optischen Achse zusammenfällt.
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Der Kerngedanke der Erfindung besteht darin, dass die Koordinaten der Trägervorrichtung -und mit dieser gegebenenfalls die Koordinaten einer Probe- fortlaufend erfasst werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe das Referenzkoordinatensystem nie verlässt und ohne spezielle Markierungen und/oder ohne Ansätze im Sinne eines „shuttle-and-find“-Vorgehens jeder Bereich der Probe wiedergefunden und angesteuert werden kann.
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Eine fortlaufende Erfassung von Koordinaten ist gegeben, wenn die Koordinaten in sehr kurzen Abständen, insbesondere mehrmals pro Sekunde, erfasst werden. Beispielsweise erfolgt die Erfassung mit einer Frequenz von mindestens fünf, zehn, zwanzig, fünfzig, hundert oder eintausend Erfassungen pro Sekunde.
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Die Frequenz der fortlaufenden Erfassung kann beispielsweise in Abhängigkeit einer Verfahrgeschwindigkeit der Trägervorrichtung gewählt und angepasst werden. So kann bei einer geringen Verfahrgeschwindigkeit auch eine geringe Erfassungsfrequenz - und vice versa - gewählt werden.
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Eine fortlaufende Erfassung kann auch durch Zählen von Bewegungseinheiten der Trägervorrichtung erfolgen, indem beispielsweise drehrichtungsabhängig Umdrehungen von Stellmotoren und/oder richtungsabhängig Schritte von Schrittmotoren erfasst, ausgewertet und gegebenenfalls gespeichert werden.
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Dieses Konzept ist vor allem vorteilhaft für die Kombination von Mikroskopieverfahren, die sehr spezielle optische oder mechanische Anordnungen erfordern, mit eher konventionellen Verfahren. So sind beispielsweise die Vorteile einer feststehenden und damit sehr stabilen Optik mit einer hohen Flexibilität in der Wahl der Untersuchungsmethoden bei gleichzeitig hoher Genauigkeit der Relokalisation erreicht.
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Zudem ist die Zeit, die ein Wechsel der Probe zwischen verschiedenen Untersuchungsmethoden benötigt, nur durch die zurückzulegende Verfahrstrecke und die Verfahrgeschwindigkeit beschränkt, mit der die Trägervorrichtung bewegt wird. Die benötigte Zeit für einen Wechsel ist daher vorab bekannt und standardisierbar, was wiederum einer verbesserten Wiederholbarkeit von Experimenten dient.
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In einer vorteilhaften weiteren Ausgestaltung des Verfahrens werden in dem Schritt D die Koordinaten des Referenzpunkts mit Soll-Koordinaten eines anzusteuernden Zielpunkts auf der optischen Achse des weiteren Mikroskops verglichen. In dem Schritt E werden in Abhängigkeit der mittels des Vergleichs ermittelten Differenzen zwischen den aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts und den Koordinaten des Zielpunkts Steuerbefehle generiert und in dem Schritt F wird mittels der Steuerbefehle die weitere Zustellbewegung der Trägervorrichtung gesteuert, so dass die Trägervorrichtung derart positioniert wird, dass der Referenzpunkt mit dem Zielpunkt zusammenfällt. Dadurch werden die Trägervorrichtung und eine gegebenenfalls darauf befindliche Probe auch in einer Richtung entlang der optischen Achse des weiteren Mikroskops, üblicherweise als z-Richtung bezeichnet, in eine eindeutig bestimmte Lage zueinander gebracht.
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In einer weiteren möglichen Ausgestaltung des Verfahrens werden in dem Schritt C Bilddaten eines Objektbereichs erfasst und der Referenzpunkt wird innerhalb des erfassten Objektbereichs festgelegt. Die Koordinaten des Objektbereichs sind bekannt oder werden ermittelt und gespeichert. Nach dem Schritt F werden Bilddaten eines weiteren Objektbereichs mittels des weiteren Mikroskops erfasst, wobei der Referenzpunkt in dem weiteren Objektbereich liegt.
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Optional wird das zur Bilderfassung verwendete Mikroskop vor oder während der Erfassung der Bilddaten entlang der optischen Achse fokussiert.
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Die vorstehenden Ausgestaltungen des Verfahrens können miteinander kombiniert werden.
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Die Aufgabe wird hinsichtlich der apparativen Gestaltung mittels einer Mikroskopieranordnung gelöst, die ein erstes Mikroskop und mindestens ein weiteres Mikroskop umfasst, wobei jedes der Mikroskope eine optische Achse aufweist und die optischen Achsen nicht zusammenfallen. Es ist eine zur Aufnahme und zum Halten eines Probenträgers ausgebildete Trägervorrichtung vorhanden. Außerdem ist eine Rechnereinheit vorhanden, die zum Einrichten eines dreidimensionalen Referenzkoordinatensystems ausgebildet ist und in der die Koordinaten des Verlaufs der optischen Achse des ersten Mikroskops und die Koordinaten des Verlaufs der weiteren optischen Achse des weiteren Mikroskops bekannt und abgespeichert sind oder die mittels vorhandener Messmittel ermittelten Koordinaten des Verlaufs der optischen Achse des ersten Mikroskops und die Koordinaten des Verlaufs der weiteren optischen Achse des weiteren Mikroskops abgespeichert werden und als Bezugsachsen dienen. Zum Zustellen der Trägervorrichtung zu einer der optischen Achsen ist eine Transportvorrichtung vorhanden. Es sind Koordinatenmessvorrichtungen vorhanden, mittels denen fortlaufend die aktuellen Koordinaten der Trägervorrichtung erfasst werden beziehungsweise erfassbar sind. Außerdem ist die Rechnereinheit weiterhin dazu ausgebildet, mittels der Koordinatenmessvorrichtungen erfasste aktuelle Koordinaten der Trägervorrichtung mit Koordinaten der optischen Achse des weiteren Mikroskops zu vergleichen, wobei der Vergleich zwischen Koordinaten eines auf der optischen Achse des ersten Mikroskops festgelegten Referenzpunkts und den Koordinaten der optischen Achse des weiteren Mikroskops erfolgt. Zur Erzeugung von Steuerbefehlen ist eine Steuereinheit vorhanden, die zur Erzeugung von Steuerbefehlen in Abhängigkeit der mittels des Vergleichs ermittelten Differenzen zwischen den aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts und den Koordinaten der optischen Achse ausgebildet ist. Zudem ist die Steuereinheit zur Steuerung der Zustellbewegung der Trägervorrichtung in Abhängigkeit der Steuerbefehle ausgebildet, so dass die Trägervorrichtung derart positioniert wird, dass der Referenzpunkt mit der weiteren optischen Achse zusammenfällt.
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Das Referenzkoordinatensystem kann beispielsweise virtuell eingerichtet werden, indem ein tatsächlich vorhandener Raumpunkt als ein bestimmter Punkt des Referenzkoordinatensystems definiert wird und als Referenz für alle erfolgenden Bewegungen (Koordinatenänderungen) und Lagekoordinaten technischer Elemente sowie optischer Achse dient. Es ist auch möglich, dass eine aktuell vorliegende relative Lage mindestens zweier, zur Definition räumlicher Beziehungen besser mindestens dreier, technischer Elemente der Mikroskopieranordnung als Bezugskoordinaten des Referenzkoordinatensystems genutzt sind beziehungsweise genutzt werden. Die als Bezugsachsen genutzten optischen Achsen werden nach Einrichtung des Referenzkoordinatensystems bestimmt und dienen dann als wesentliche, nicht notwendigerweise als alleinige, Bezugsgrößen.
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Die laufende Erfassung der Koordinaten kann beispielsweise durch Erfassen und Auswerten der jeweils realisierten Zustellwege verwendeter Antriebe, d.h. Nutzung eines Wegmesssystems in der Aktorik und/oder der laufenden Erfassung von Referenzmarken (tracking) der Trägervorrichtung erfolgen.
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Der Probenträger ist beispielsweise ein Deckglas, eine Platte oder eine Petrischale. Sie besteht vorteilhaft aus einem für eine verwendete Beleuchtungsstrahlung und/oder zu erfassende Detektionstrahlung transparenten Material wie Glas oder transparentem Kunststoff. Durch den Probenträger ist eine Probenebene gegeben, in der eine zu untersuchende Probe angeordnet oder anordenbar ist. Die Probenebene erstreckt sich vorzugsweise horizontal, kann aber in weiteren Ausführungen der Mikroskopieranordnung auch in anderen Raumebenen vorgesehen sein.
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Wenigstens ein Mikroskop der Mikroskopieranordnung kann mehrere Objektive aufweisen, die mittels einer Objektivwechselvorrichtung, beispielsweise mittels eines Objektivrevolvers oder eines Langmagazins (linear slider), in die jeweilige optische Achse einschwenkbar sind beziehungsweise eingeschoben werden können. Der reduzierten Stabilität steht eine erhöhte Flexibilität der möglichen Vergrößerungen und/oder Untersuchungsmethoden gegenüber.
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Es ist auch möglich, dass wenigstens eines der Mikroskope der Mikroskopieranordnung mehrere Objektive aufweist, die gemeinsam und gleichzeitig in die Probenebene gerichtet sind.
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In einer möglichen Ausführung weist das erste Mikroskop und/oder das weitere Mikroskop jeweils ein Beleuchtungsobjektiv und ein Detektionsobjektiv auf, deren optische Achsen senkrecht aufeinander stehen und in die Probenebene gerichtet sind. Das Beleuchtungsobjektiv kann dazu ausgebildet sein, ein die Probenebene durchdringendes Lichtblatt zu erzeugen.
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Die erfindungsgemäße Mikroskopieranordnung kann in einer weiteren Ausführungsmöglichkeit invers ausgeführt sein. Dabei sind die optischen Achsen durch einen verwendeten Probenträger und/oder durch die Trägervorrichtung hindurch auf beziehungsweise in die Probe gerichtet.
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Die optischen Achsen können in weiteren Ausführungen der Mikroskopieranordnung mit der Probenebene und einer Normalen der Probenebene jeweils einen von Null verschiedenen Winkel einschließen.
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Die vorgenannten Möglichkeiten können miteinander kombiniert werden. Beispielsweise kann ein zur Lichtblattmikroskopie ausgebildetes Mikroskop vorhanden sein. Dieses kann in einer aufrechten oder in einer inversen Ausrichtung ausgeführt sein.
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In weiteren Ausführungen der Mikroskopieranordnung kann neben den mindestens zwei Mikroskopen ein Arbeitsplatz mit einer Arbeitsposition vorhanden sein. Durch die Arbeitsposition kann eine Arbeitsachse verlaufen. Die Koordinaten der Arbeitsposition und gegebenenfalls die Koordinaten der Arbeitsachse innerhalb des Referenzkoordinatensystems sind bekannt. Die Trägervorrichtung kann der Arbeitsposition beziehungsweise der Arbeitsachse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zugestellt werden.
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Der Arbeitsplatz kann beispielsweise zusätzlich oder ausschließlich einer nicht-optischen Untersuchung oder Bearbeitung der Probe dienen und beispielsweise als eine Füllstation zum Befüllen von Probengefäße mittels eines Pipettierautomats oder zum Wechseln von Pufferlösung ausgebildet und eingerichtet sein.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
- 1a eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Mikroskopieranordnung in einer Seitenansicht;
- 1b eine schematische Darstellung des ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Mikroskopieranordnung in der Draufsicht;
- 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Mikroskopieranordnung;
- 3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Mikroskopieranordnung und
- 4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines Mikroskops zur Lichtblattmikroskopie.
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Die Ausführungsbeispiele einer Mikroskopieranordnung M sind nachfolgend schematisch und beispielhaft in inversen Ausführungen dargestellt. Als wesentliche Elemente der Mikroskopieranordnung M sind ein erstes Mikroskop 1 mit einem ersten Objektiv 2 und einer ersten optischen Achse 2.1 und ein weiteres Mikroskop 3 mit einem weiteren Objektiv 4 und einer zweiten optischen Achse 4.1 vorhanden, wobei die optischen Achsen 2.1 und 4.1 zueinander parallel verlaufen und nicht zusammenfallen (1a).
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In der 1a ist eine Trägervorrichtung 6 vorhanden, auf der ein Probenträger 7 aufgelegt ist. Auf dem Probenträger 7 befindet sich eine zu untersuchende Probe 8. Durch die Oberseite des Probenträgers 7 ist eine Probenebene 9 gegeben, die im Ausführungsbeispiel horizontal verläuft und die im Folgenden auch als Bezugsebene verwendet wird.
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In weiteren Ausführungen der Erfindung kann die Probenebene 9 in einer Ebene der Trägervorrichtung 6 definiert sein, um eventuelle Unregelmäßigkeiten des Probenträgers 7 nicht beachten zu müssen.
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Die Trägervorrichtung 6 befindet sich an einer ersten Beobachtungs-, Untersuchungs- oder Messposition P1 (durch einen Pfeil symbolisiert; fortan als Messposition bezeichnet), an der die Probe 8 in der ersten optischen Achse 2.1 liegt und mittels des ersten Objektivs 2 unter Ausführung einer Untersuchungsmethode mindestens ein Bild der Probe 8 oder eines Bereichs der Probe 8 erfasst wird oder erfasst werden kann.
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Weiterhin ist eine Recheneinheit 13 vorhanden, die zum Einrichten eines dreidimensionalen Referenzkoordinatensystems mit den Achsen x, y und z ausgebildet ist. In der Recheneinheit 13 sind die Koordinaten des Verlaufs der ersten optischen Achse 2.1 des ersten Mikroskops 1 und die Koordinaten des Verlaufs der weiteren optischen Achse 4.1 des weiteren Mikroskops 3 bekannt und abgespeichert. In einer weiteren Ausführungsmöglichkeit sind die Verläufe der optischen Achsen 2.1 beziehungsweise 4.1 mittels vorhandener Messmittel, insbesondere mittels wenigstens einer Koordinatenmessvorrichtung 16 ermittelt und die ermittelten Koordinaten der Verläufe der optischen Achsen 2.1 beziehungsweise 4.1 abgespeichert. Die Verläufe der optischen Achsen 2.1 und 4.1 dienen als Bezugsachsen.
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Die Trägervorrichtung 6 ist mitsamt dem Probenträger 7 und der Probe 8 mittels einer Transportvorrichtung 10 gesteuert verschiebbar. Dazu weist die Transportvorrichtung 10 wenigstens einen Antrieb 15 auf, der durch Steuerbefehle einer Steuereinheit 14 ansteuerbar ist. Mittels der Transportvorrichtung 10 kann die Trägervorrichtung 6 zu einer der optischen Achsen 2.1 beziehungsweise 4.1 zugestellt werden. Dabei sind die aktuellen Koordinaten der Trägervorrichtung 6 mittels der Koordinatenmessvorrichtung 16 fortlaufend erfasst beziehungsweise erfassbar.
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Die Recheneinheit 13, die Steuereinheit 14, der Antrieb 15 oder die Antriebe 15 (siehe z. B. 4) sowie die wenigstens eine Koordinatenmessvorrichtung 16 stehen miteinander in einer für den Austausch von Daten geeigneten Verbindung (angedeutet dargestellt).
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Die bereits angesprochene Recheneinheit 13 ist weiterhin dazu ausgebildet, mittels der Koordinatenmessvorrichtung 16 erfasste aktuelle Koordinaten der Trägervorrichtung 6 mit aktuellen Koordinaten der optischen Achsen 2.1, 4.1 zu vergleichen. Im dargestellten Falle des Verschiebens der Trägervorrichtung 6 von der ersten optischen Achse 2.1 zur zweiten optischen Achse 4.1 erfolgt ein Vergleich der erfassten aktuellen Koordinaten der Trägervorrichtung 6 mit Koordinaten der zweiten optischen Achse 4.1.
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Insbesondere erfolgt der Vergleich zwischen Koordinaten eines auf der ersten optischen Achse 2.1 festgelegten Referenzpunkts 11 und den (Lage-)Koordinaten der zweiten optischen Achse. In Abhängigkeit der mittels des Vergleichs ermittelten Differenzen zwischen den aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts 11 und den Koordinaten der zweiten optischen Achse 4.1 werden in der Steuereinheit 14 Steuerbefehle erzeugt und zur Steuerung der Zustellbewegung der Trägervorrichtung 6 an den mindestens einen Antrieb 15 übermittelt, wodurch dieser entsprechend angesteuert ist. Die Steuerung erfolgt so, dass die Trägervorrichtung 6 derart positioniert wird, dass der Referenzpunkt 11 mit der zweiten optischen Achse 4.1 zusammenfällt. Die Trägervorrichtung 6 befindet sich dann an einer zweiten Messposition P2 (mit unterbrochenen Linien beispielhaft gezeigt und durch einen Pfeil symbolisiert).
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Derselbe Vorgang ist vereinfacht in der 1b in einer Draufsicht dargestellt.
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Das in den 1a und 1b gezeigte erste Ausführungsbeispiel weist eine Transportvorrichtung 10 auf, die dem ersten Mikroskop 1 und dem weiteren Mikroskop 3 gemeinsam ist. Die Transportvorrichtung 10 ist beispielhaft als ein Schienensystem ausgebildet.
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Die beiden Mikroskope 1, 3 können in voneinander verschiedenen Gehäusen oder Gehäuseteilen (durch die Strichlinie zwischen beiden Mikroskopen 1, 3 angedeutet) untergebracht sein. Dies ist beispielsweise dann von Vorteil, wenn die Mikroskope 1 beziehungsweise 3 bei unterschiedlichen Umgebungsbedingungen betrieben werden sollen.
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In den 1a und 1b ist ein zentraler Gedanke und Vorteil der erfindungsgemäßen Mikroskopieranordnung M veranschaulicht. Die beiden Mikroskope 1 und 3 teilen sich eine gemeinsame Transportvorrichtung 10. Diese erlaubt sowohl die Positionierung der Probe 8 relativ zur optischen Achse 2.1, 4.1 an der jeweiligen Messposition P1, P2 als auch das Transportieren der Probe 8 zwischen den Messpositionen P1, P2. Die Probe 8 verlässt so nie das Referenz-Koordinatensystem ihres Probenhalters 7. Durch Festlegungen und fortlaufendes Ermitteln beispielsweise des Referenzpunktes 11 ist die dreidimensionale Positionierung der Probe 8, also relativ zu den Achsen x, y und z, ermöglicht.
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Lediglich beispielhaft seien einige mögliche Ausführungen des ersten Mikroskops 1 und des weiteren Mikroskops 3 genannt. Das erste Mikroskop 1 und/oder das weitere Mikroskop 3 ist beispielsweise als ein inverses Lichtblattmikroskop, ein aufrechtes Lichtblattmikroskop oder als ein Mikroskop mit einer sehr hohen Auflösung und beispielsweise nur einem Objektiv ausgebildet. Gerade bei letzterer Ausführung kann eine Drift reduziert oder gar vermieden werden. Das erste Mikroskop 1 und/oder das weitere Mikroskop 3 kann auch zur Inkubation der Probe 8 beispielsweise unter vorbestimmten Temperaturbedingungen oder-regimen, athmosphärischen Bedingungen und/oder Beleuchtungsbedingungen oder-regimen ausgebildet sein. Weiterhin kann beziehungsweise können das erste Mikroskop 1 und/oder das weitere Mikroskop 3 zur Erfassung eines Übersichtsbilds und/oder als ein Mikroskop mit einer Objektivwechselvorrichtung ausgebildet sein. Ferner kann das erste Mikroskop 1 und/oder das weitere Mikroskop 3 als ein Scanningmikroskop, insbesondere ein Laserscanningmikroskop (LSM), als ein Mikroskop mit einer Manipulationseinheit zur Manipulation der Probe 8 mittels Strahlen, mittels akustischer und/oder mechanischer Elemente ausgebildet sein.
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Die Messpositionen P1, P2 sind vorzugsweise voneinander optisch unabhängig und nur durch die gemeinsame Transportvorrichtung 10 verbunden. Es ist jedoch möglich, die Beleuchtungs- und/oder Detektionsstrahlengänge mittels geeigneter optischer Elemente teilweise zu überlagern und so Lichtquellen, Baugruppen, Module, Detektoren oder Kameras für beide Messpositionen P1, P2 zu verwenden.
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Die 2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel der Mikroskopieranordnung M, bei der Elemente der Mikroskopieranordnung M für beide dargestellten Messpositionen P1 und P2 in Funktion treten. Im Ausführungsbeispiel werden die Detektionsstrahlengänge beider Mikroskope 1 und 3 mittels eines halbdurchlässigen Spiegels als Strahlvereiniger 20 überlagert und auf einen gemeinsamen Detektor 17, beispielsweise eine Kamera, gebracht. Je nach Abstand der Messpositionen P1, P2 voneinander kann dies durch zwei Tubuslinsen T1, T2 unterschiedlicher Brennweite oder durch eine Relay-Optik (nicht gezeigt) erfolgen. Der Strahlvereiniger 20 und die Tubuslinse T2 können als eine Gruppe ausgeführt sein, was durch die Umrandung mit einer Punktlinie symbolisiert ist. Die Relay-Optik (nicht eingezeichnet) kann z. B. anstelle der Gruppe aus Tubuslinse T2 und Strahlvereiniger 20 in den Detektionsstrahlengang eingebracht werden, wenn von der Messposition P1 kommende Detektionsstrahlung auf den Detektor 17 abgebildet werden soll.
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Die Mikroskopieranordnung M ermöglicht vorteilhaft eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten der vorhandenen Mikroskope 1, 3, ...n. An der ersten Messposition P1 des in der 3 dargestellten dritten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Mikroskopieranordnung M ist ein Lichtblattmikroskop vorhanden. Mittels eines Beleuchtungsobjektivs BO, das zur Erzeugung eines Lichtblatts 5 (vereinfachend als Balken gezeigt) entlang der Beleuchtungsachse BO.1 ausgebildet ist, wird das Lichtblatt 5 in dem Bereich erzeugt, in dem sich die Probe 8 befindet beziehungsweise abgelegt werden kann. Dabei kann das Lichtblatt 5 dynamisch durch Scannen eines Lichtstrahls in einer Ebene, hier in einer unter etwa 45° zur Probenebene 9, erzeugt werden. In weiteren Ausführungen kann das Lichtblatt 5 mittels einer vor dem Beleuchtungsobjektiv BO angeordneten optischen Einheit, beispielsweise einer Zylinderlinse, erzeugt sein. Vereinfachend ist stellvertretend für beide Möglichkeiten das Element 21 dargestellt. Ein ebenfalls in dem ersten Mikroskop 1 vorhandenes erstes Objektiv 2 dient als Detektionsobjektiv. Die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs BO verläuft unter einem Winkel von etwa 45° zur Probenebene 9. Die durch das erste Objektiv 2 gegebene erste optische Achse 2.1 verläuft ebenfalls unter einem Winkel von etwa 45° zur Probenebene 9 und steht senkrecht auf der optischen Achse (Beleuchtungsachse BO.1) des Beleuchtungsobjektivs BO und schneidet diese in dem Bereich des erzeugten Lichtblatts LB.
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Das weitere Mikroskop 3 weist eine Objektivwechselvorrichtung (durch die zusätzlichen Objektive angedeutet gezeigt) auf. Eines der darin enthaltenen Objektive ist in Arbeitsstellung auf der zweiten optischen Achse 4.1 und stellt das weitere Objektiv 4 dar.
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In dem in der 3 gezeigten Ausführungsbeispiel wird an der ersten Messposition P1 ein Lichtblatt 5 erzeugt und mittels des ersten Objektivs 2 die derart beleuchtete Probe 8 beobachtet. Weiter sind ein oder mehrere Korrekturelemente 22, beispielsweise geeignet ausgebildete Meniskuslinsen, Alvarezplatten und/oder eine Relay-Optik, zur Korrektur des schiefen Durchgangs durch den Probenträger 7 vorgesehen. Alternativ kann dieses Mikroskop 1 mit speziellen Probengefäßen betrieben werden, die den schiefen Durchgang vermeiden.
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An der Messposition P1 befindet sich im dargestellten Ausführungsbeispiel ein dediziertes Mikroskop 1, welches klassische Mikroskopie-Verfahrensschritte wie Objektivwechsel, Aufnahme eines Übersichtsbilds, alternative Kontraste (DIC, Phasenkontrast, Polarisationskontrast etc.) nicht oder nur eingeschränkt erlaubt. Diese Verfahrensschritte werden an Messposition P2 ermöglicht. Dazu befindet sich das weitere Objektiv 4 in klassischer Anordnung, d.h. die optische Achse 4.1 verläuft senkrecht zum Probenträger 7, an der Messposition P2. In diesem Ausführungsbeispiel wird für beide Messpositionen P1, P2 ein gemeinsamer Detektor 17 in Form einer Kamera genutzt. Die Detektionsstrahlengänge sind einander überlagert und die Abstände der Messpositionen P1, P2 sind so gewählt, dass die Probenebenen 9 von Messpositionen P1, P2 durch die Tubuslinsen T1 und T2, die unterschiedliche Brennweite aufweisen, auf eine gemeinsame Bildebene (Strichlinie) auf den Detektor 17 abgebildet werden.
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Befindet sich die zu untersuchende Probe 8 an der Messposition P1, ist die aus dem Strahlvereiniger 20 und der Tubuslinse T2 gebildete Gruppe aus dem Strahlengang entfernt, so dass der Detektionsstrahlengang von dem ersten Objektiv 2 zu dem Detektor 17 gerichtet ist, ohne die Gruppe zu durchlaufen.
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Wird die Probe 8 an der zweiten Messposition P2 untersucht, wird die aus dem Strahlvereiniger 20 und der Tubuslinse T2 gebildete Gruppe in den gemeinsamen Strahlengang eingebracht. Der Detektionsstrahlengang des Objektivs 4 durchläuft die besagte Gruppe und wird auf den Detektor 17 gelenkt.
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Es können in weiteren Ausführungen auch Filtereinrichtungen für beide Strahlengänge gemeinsam genutzt werden, die beispielsweise manuell oder motorisch in die beziehungsweise aus den jeweiligen Strahlengängen gebracht werden können. Für eine gemeinsame Nutzung von optischen Elementen kann ein zusätzlicher gemeinsamer Unendlichraum geschaffen werden.
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Die Probe 8 ist mittels der gemeinsamen Transportvorrichtung 10 zwischen den Messpositionen P1 und P2 bewegt werden. In weiteren Ausführungen der Mikroskopieranordnung M können weitere Messpositionen Pn (n = 3, 4, ...., n; nicht gezeigt) vorhanden sein. Die Transportvorrichtung 10 erlaubt in einer vorteilhaften Ausgestaltung sowohl den Positionswechsel in x-Richtung als auch die Feinpositionierung der Probe 8 an den jeweiligen Messpositionen P1, P2 in x, y und z-Richtung. So können mit einem Minimum an Aktorik-Freiheitsgraden alle Positionieraufgaben an den Messpositionen P1, P2, ...Pn durchgeführt werden. Dies schließt auch die Fokussierung (z-Richtung) mit ein, so dass mit der erfindungsgemäßen Lösung z. B. zwei dedizierte Messpositionen P1, P2 verknüpft werden können und auf den z-Trieb, beispielsweise zur Fokussierung der Objektive 2, 4 oder einer Objektivwechseleinrichtung verzichtet werden kann.
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In der schematisch in 3 dargestellten Mikroskopieranordnung M kann eine Durchlicht-Beleuchtungseinheit 23 bestehend aus Lichtquelle 24 und Kondensor 25 vorgesehen sein, mit der die Probe 8 von oben beleuchtet wird beziehungsweise beleuchtet werden kann. Die Beleuchtungseinheit 23 kann entweder an beiden Messpositionen P1, P2 vorgesehen sein oder sie wird an die Transportvorrichtung 10 gekoppelt und mit dieser von Messposition P1 zu Messposition P2 und umgekehrt bewegt. An Messposition P2 kann zusätzlich eine Fluoreszenz-(Auflicht-)beleuchtung über einen dichroischen Strahlteiler 18 eingekoppelt werden.
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Sollen in weiteren Ausführungen der Erfindung keine Tubuslinsen T1, T2 mit unterschiedlichen Brennweiten verwendet werden und/oder sind die zu überbrückenden Distanzen zwischen den gemeinsamen Strahlengängen zu groß, kann auch eine entsprechend ausgebildete Relay-Optik eingesetzt werden.
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Der Aufbau eines weiteren Beispiels eines Mikroskops zur Lichtblattmikroskopie ist in der 4 schematisch dargestellt. Wie zu 3 ausgeführt, sind ein Beleuchtungsobjektiv BO zur Erzeugung des Lichtblatts 5 sowie ein erstes Objektiv 2 vorhanden. Eine Beleuchtungsstrahlung wird mittels eines AOTF 19 (akustooptischer Filter) gesteuert geformt und mittels eines Scanners 21 abgelenkt. Der AOTF 19 steht dazu mit der Steuereinheit 14 in Verbindung, die wiederum mit der Recheneinheit 13 verbunden ist. Die mittels des AOTF 19 abgelenkte Beleuchtungsstrahlung wird mittels des Beleuchtungsobjektivs BO zu einem Lichtblatt 5 geformt, wobei die Ausdehnung des Lichtblatts 5 im Wesentlichen, insbesondere in Richtung der y-Achse durch die Auslenkung des Scanners 21 bestimmt ist. Statt eines AOTF 19 können in weiteren Ausführungen beispielsweise auch räumliche Lichtmodulatoren (spatial light modulator, SLM), Mikrospiegelarrays (digitalized micromirror device, DMD) oder adaptive Spiegel verwendet sein. Als Lichtquelle der Beleuchtungsstrahlung können beispielsweise Laser und/oder (Laser-)dioden dienen.
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Zwischen dem Beleuchtungsobjektiv BO beziehungsweise dem ersten Objektiv 2 und dem Probenträger 7 ist eine sogenannte Relay-Optik als Korrekturelement 22 angeordnet, durch deren Wirkung Aberrationen verringert werden, die beim Durchgang von Beleuchtungsstrahlung beziehungsweise Detektionsstrahlung durch den Probenträger 7 auftreten.
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In Abwandlung der vorgenannten Ausführungsbeispiele kann die Nutzung bestimmter Elemente, beispielsweise der Lichtquellen der Beleuchtungsstrahlung, für mehrere Mikroskope 1, 3 vorgesehen und entsprechende Strahlwege und/oder Schalt- und Auswahlmöglichkeiten vorhanden sein.
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Anhand der 2 wird die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Betrieb der Mikroskopieranordnung M beschrieben. In einem Schritt A wird das dreidimensionale Referenzkoordinatensystem als kartesisches Koordinatensystem mit den Achsen x, y und z festgelegt. In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens können auch andere Referenzkoordinatensysteme wie Polarkoordinatensysteme, Zylinderkoordinatensysteme festgelegt werden. Die Koordinaten des Verlaufs der optischen Achse 2.1 des ersten Mikroskops 2 und die Koordinaten des Verlaufs der weiteren optischen Achse 3.1 des weiteren Mikroskops 3 oder der optischen Achse eines als nächstes zu verwendenden Mikroskops sind bekannt oder werden ermittelt und in einem Speicher, beispielsweise in der Recheneinheit 13, abgespeichert. Die optischen Achsen 2.1, 3.1, ... dienen als Bezugsachsen.
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In dem Schritt B wird der Probenträger 7 mit der Probe 8 auf die Probenebene 9 und in die erste optische Achse 2.1 eingebracht. Danach wird ein mit der ersten optischen Achse 2.1 zusammenfallender Referenzpunkt 11 festgelegt und die Koordinaten des Referenzpunkts 11 in dem Referenzkoordinatensystem ermittelt (Schritt C). Der Referenzpunkt 11 liegt beispielsweise in einem zu untersuchenden Bereich (region of interest, ROI) der Probe 8. Die Probe 8 kann anschließend mit dem ersten Mikroskop 2 und der Untersuchungsmethode beziehungsweise den Untersuchungsmethoden analysiert werden, für die das erste Mikroskop 2 ausgebildet ist. Nach erfolgter Analyse wird durch die Recheneinheit 13 ein Signal an die Steuereinheit 14 gegeben, worauf durch die Steuereinheit 14 mindestens ein Steuerbefehl generiert und an den Antrieb 15 der Transportvorrichtung 10 übermittelt wird, wodurch der Antrieb 15 entsprechend des erhaltenen Steuerbefehls angesteuert und die Probenhalterung 7 mit der Probe 8 transportiert wird.
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Während die Trägervorrichtung 6 zu dem weiteren Mikroskop 3 zugestellt wird, werden fortlaufend die aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts 11 erfasst und mit den aktuellen Koordinaten der optischen Achse 4.1 des weiteren Mikroskops 3 verglichen. Dazu wird die Recheneinheit 13 verwendet. In Abhängigkeit der mittels des Vergleichs ermittelten Differenzen zwischen den aktuellen Koordinaten des Referenzpunkts 11 und den Koordinaten der optischen Achse 4.1 des weiteren Mikroskops 3 werden durch die Steuereinheit 14 Steuerbefehle generiert, nachdem die Recheneinheit 13 eine entsprechende Information an die Steuereinheit 14 gesendet hat. Die generierten Steuerbefehle werden an wenigstens einen der Antriebe 15 übermittelt und eine dem jeweiligen Steuerbefehl entsprechende weitere Zustellbewegung der Trägervorrichtung gesteuert. Im Ergebnis der fortlaufenden Erfassung der aktuellen Koordinaten und deren Vergleich mit den aktuellen Daten der Bezugsachsen, insbesondere der im Beispiel genannten zweiten optischen Achse 4.1 sowie der daraufhin generierten Steuerbefehle wird die Trägervorrichtung derart positioniert, dass der Referenzpunkt 11 mit der weiteren optischen Achse 4.1 zusammenfällt.
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In einer weiteren Ausgestaltung wird der Referenzpunkt 11 mit einem Zielpunkt 12 auf der zweiten optischen Achse 4.1 in Übereinstimmung gebracht, wodurch eine Positionierung der Probe 8 auch in Richtung der z-Achse erfolgt.
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Bezugszeichenliste
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- M
- Mikroskopieranordnung
- 1
- erstes Mikroskop
- 2
- erstes Objektiv
- 2.1
- erste optische Achse
- 3
- weiteres Mikroskop
- 4
- weiteres Objektiv
- 4.1
- zweite optische Achse
- 5
- Lichtblatt
- 6
- Trägervorrichtung
- 7
- Probenträger
- 8
- Probe
- 9
- Probenebene
- 10
- Transportvorrichtung
- 11
- Referenzpunkt
- 12
- Zielpunkt
- 13
- Recheneinheit
- 14
- Steuereinheit
- 15
- Antrieb
- 16
- Koordinatenmessvorrichtungen /Sensor
- 17
- Detektor
- 18
- dichroischer Strahlteiler
- 19
- akustooptischer Filter
- 20
- Strahlvereiniger
- 21
- Scanner/Zylinderlinse
- 22
- Korrekturelement
- 23
- Beleuchtungseinheit
- 24
- Lichtquelle
- 25
- Kondensor
- BO
- Beleuchtungsobjektiv
- BO.1
- Beleuchtungsachse
- T1
- Tubuslinse
- T2
- Tubuslinse
- P1
- erste Messposition
- P2
- zweite Messposition
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102012014768 B4 [0010]
- WO 2014/173547 [0011]
