DE4113279C2 - Konfokales optisches Rastermikroskop - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein konfokales optisches Rastermi­ kroskop.

Es sind sogenannte konfokale optische Raster-Mikroskope in Form von Laserscannern bekannt (KLS - Konfokaler La­ ser-Scanner), bei denen die Objekte von einem fein fokus­ sierten Laserstrahl Punkt für Punkt abgetastet werden. Das vom Objekt zurückgestreute Auf-Licht wird detektiert, beispielsweise von Fotomultipliern und dient zur Ansteue­ rung eines zur Laser-Rasterbewegung synchronisierten Bild­ schirms. Dort entsteht ein Bild des Objekts. Der Laser­ strahl wird durch ein Mikroskopobjektiv auf das Objekt bzw. in eine Objektebene (konfokal) abgebildet. Die Rasterung bzw. das Scannen kann zum einen dadurch erfolgen, daß das Objekt selbst, z. B. mit Hilfe eines Scan-Tisches, in der Ebene senkrecht zur optischen Achse bewegt wird, so daß optische. Parameter als Funktion des Ortes gemessen werden können. Statt dessen kann zwischen Lichtquelle, wie Laser oder Sekundärlichtquelle oder wie ein von einem Laser beleuch­ tetes sehr kleines Loch bzw. eine sehr kleine Blende und Objekt eine Scan-Anordnung vorgesehen ist, die den Laserstrahl senkrecht zur optischen Achse über das ruhende Objekt bewegt. Dies geschieht mittels Galvanome­ terspiegeln, die von einem Rastergenerator angesteuert werden. In den meisten Fällen werden zwei Spiegel verwendet, deren Bewegung über unterschiedlich gerichtete Achsen erfolgt, so daß der eine Spiegel Zeilen abtastet, der andere den Zeilenvorschub bewirkt. In jedem Falle wird also das Bild der einzigen Lichtquelle (eventuell die Lochblende als Sekundärlichtquelle) durch mechanische Bewegungen, des Objekttisches oder Teilen der Scan-Anordnung, relativ zum Objekt im Raume bewegt.

Nachteilig ist, daß zwischen der Lichtquelle und dem Objekt, einschließlich desselben, mechanisch bewegliche Teile vorhanden sind, nämlich entweder das Objekt selbst oder aber die Abtastspiegel, was aufgrund der Trägheit der bewegten Teile, durch äußere Erschütterungen etc. zu Feh­ lern und Störungen führt; die erforderliche hohe Abtast­ geometrie wird dejustiert, so daß keine reproduzierbare Abtastgeometrie gegeben ist. Tatsächlich führt wiederholtes Abtasten ein und desselben unveränderlichen Gegenstandes zu unterschiedlichen Bildern. Die bekannten Vorrichtungen müssen aufwendig und voluminös sein, um zumindest eine noch vertretbare Genauigkeit zu erhalten. Es ist in jedem Fall eine aufwendige Elektronik erforderlich, obwohl sich herausgestellt hat, daß die Benutzer in vielen Fällen neben dem klassischen Bild nur das Mikroskopbild von einzelnen Objektebenen visuell betrachten oder fotographisch bzw. mit einem Videosystem (als Bilderfolgen einzelner Ebenen) aufnehmen wollen, ohne daß eine Weiterverarbeitung erfor­ derlich ist. In diesem Falle ist dann sogar für den Benut­ zer ein erhöhter Aufwand erforderlich, da zunächst das Bild optoelektrisch aufgenommen und dann elektrooptisch wiedergegeben werden muß. Selbst nachdem der Laser-Raster- Scanner über einen Strahlenteiler oder Spiegel dem Objek­ tiv eines herkömmlichen Mikroskops zugeordnet wird, kön­ nen keine visuellen Beobachtungen über Laser-Raster-Scan­ ner durchgeführt werden, ohne eine Signalverarbeitung einzusetzen.

Die DE 36 10 165 C2 zeigt ein Rastermikroskop, bei dem ein Objekt mit einem einzigen Laserstrahl zweidimensional abgetastet wird, wobei zwei linear unabhängige Galvanome­ terspiegel oder akusto-optische Deflektoren den Scan-Vor­ gang gewährleisten. Das Objektlicht wird über einen Strahl­ teiler zu einem hinter einer Lochblende angeordneten De­ tektor ausgeblendet und durchläuft im wesentlichen den gleichen Weg wie das Beleuchtungslicht. Der Detektor ist in mehrere, unabhängig voneinander registrierende Detek­ torelemente unterteilt, die einen Rechner ansteuern, der die einzelnen Signale auswertet oder elektronisch ein Bild auf einem Bildschirm erzeugt. Die Unterteilung des elektro-optischen Detektors in Einzelelemente dient zur Erzeugung eines Differenzsignals. Es muß in jedem Fall eine elektronische Verarbeitung der Signale vorgenommen werden, so daß eine Beobachtung nur über einen Bildschirm, nicht aber direkt möglich ist.

Die DE 37 34 691 A1 zeigt lediglich eine Beleuchtungsvor­ richtung für ein nicht gattungsgemäßes, herkömmliches optisches Mikroskop, wobei zur gleichmäßigen Ausleuchtung des Mikroskopobjektivs mehrere zweidimensional angeordne­ te Leucht- oder Laserdioden vorgesehen sind, welche zwecks unterschiedlicher Beleuchtungsmodi (Hellfeld, Dunkelfeld, Schräglicht) gruppenweise ansteuerbar sind.

Die US 48 06 004 zeigt ein Abtastmikro­ skop, bei dem ein Laser ein mechanisch bewegtes Lochraster beleuchtet und damit das zu untersuchende Objekt durch die gleichzeitig durchgelassenen Lichtstrahlen großflächig ausgeleuchtet wird. Zur Verbesserung des Kontrasts und der Auflösung bildet das Beleuchtungsraster eine bewegte Ab­ tasteinheit.

Die nicht vorveröffentlichte DE 40 35 799 A1 beschreibt ein gattungsgemäßes optisches Rastermikroskop, bei dem ein Beleuchtungsraster auf die Oberfläche eines zu unter­ suchenden Objekts fokussiert und das reflektierte Licht auf einen CCD-Empfänger fokussiert wird, so daß auch hier eine unmittelbare, vermittelte optische Betrachtung nicht möglich ist.

Der Artikel "Imaging Properties and Applications of Scanning Optical Microscopes", T. Wilson, Applied Physics, 22, 119-128 (1980), insbesondere S. 120 f und 126, beschreibt Abbildungseigenschaften und Anwendungs­ möglichkeiten eines konfokalen, lasergestützten Rastermi­ kroskops, das als Reflexionsmikroskop oder Transmissions­ mikroskop eingesetzt wird. Am Transmissionsmikroskop wird ein Interferenzbetrieb beschrieben, bei dem ein Strahl­ teiler das durch die Objektivlinse hindurchgetretene Ob­ jektlicht unmittelbar vor der Detektoranordnung mit Refe­ renzlicht, das noch vor der Kondensorlinse ausgekoppelt wird, überlagert und zur Interferenz bringt. Die Detektor­ anordnung ist in zwei zueinander senkrecht liegende De­ tektoren unterteilt, deren Signaldifferenz proportional zum Realteil des komplexen Produkts aus der Objektwelle und der konjugierten Referenzwelle ist, so daß differen­ tielle Phasenkontrastbilder erstellt werden können. Hin­ sichtlich des Rastervorgangs ist alternativ vorgesehen, Lichtablenkelemente anzubringen oder aber eine mechanisch­ horizontale Objekt-Bewegung zu realisieren. Das Detektor­ signal wird auf jeden Fall elektronisch aufgenommen und auf einem Oszillographen ausgegeben, wobei auch an eine Bildverarbeitung zwecks Kontrasterhöhung gedacht ist. Auch hier ist eine direkte optische Beobachtung nicht vorgesehen und nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein konfokales optisches Rastermikroskop zu schaffen, bei dem auf einfache Weise auch ein direkt be­ trachtbares Bild erzeugt werden kann.

Erfindungsgemäß wird dieses Problem durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Hierdurch wird eine hohe Strahlungsstabilität bei gesicherter konfokaler Detektion erreicht. Soweit aller­ dings nur eine Detektor-Matrix verwendet wird, ergeben sich Unsymmetrien, die insofern nur begrenzte Anwendungen erlauben.

Um universelle Einsatzmöglichkeiten zu erlauben und Stö­ rungen und Fehler aufgrund mechanischer Bewegungen völ­ lig auszuschließen und eine hohe absolute Strahlungssta­ bilität zu gewährleisten, sieht daher eine äußerst bevor­ zugte Ausgestaltung vor, daß eine Punktlichtquellen-Matrix mit einer Vielzahl von Punktlichtquellen vorgesehen ist, von denen jede der Reihe nach eingeschaltet wird. Hierbei können daher das Objekt und sämtliche optischen Elemente zwischen Punktlichtquellen-Matrix und Detektor-Matrix einschließlich derselben in Ebenen senkrecht zur optischen Achse fest und unbeweglich angeordnet sein.

Durch die zum Objekt in Richtungen senkrecht zur opti­ schen Achse feste Anordnung von Punktlichtquellen, die einzeln sukzessiv angesteuert, d. h. zum Leuchten gebracht werden, sowie ei­ ner ebenfalls fest angeordnet und zu der Punktlichtquellen- Matrix korrespondierenden Detektor-Matrix wird zwischen den Punktlichtquellen und über das Objekt zu der Detektor- Matrix eine feste reproduzierbare Abtastgeometrie im Rah­ men eines absoluten Koordinatensystems und damit eine absolute Strahlungsstabilität geschaffen. Weder das Ob­ jekt noch optische Elemente zwischen Objekt und Punkt­ lichtquellen- bzw. Detektor-Matrix werden mechanisch be­ wegt. Die einzelnen Punktlichtquellen der Matrix (die gegebenenfalls Sekundärlichtquellen sein können) werden lediglich sukzessiv ein- und ausgeschaltet. Es werden demnach zeitlich verschoben, also sukzessiv die einzel­ nen starren oder festen Punktlichtquellen der Matrix auf das Objekt abgebildet. Das vom Objekt gestreute Licht wird über den gleichen Lichtweg (konfokal) auf entspre­ chende matrixartig angeordnete Punktdetektoren gerichtet.

Diese Weiterbildung der Erfindung vermeidet die durch die Ablenkung des Laserstrahls bzw. die Verschiebung des Ob­ jekts beim Stande der Technik bedingten Fehler; auch die wellenoptische Qualität des Strahls wird dadurch verbessert, daß zwischen Lichtquelle und Objekt keine beweglichen Ablenkelemente, wie Ablenkspiegel und dazugehörige Optik, angeordnet sind. Durch das absolute Koordinatensystem wird eine reproduzierbare Abtastgeometrie gesichert. Die opti­ schen Komponenten können verringert werden; es ist eine Geräteverkleinerung erreichbar. Die Integration mit klas­ sischen Geräten ist einfach. Die (elektronische) Hardware kann - je nach Einsatz - wesentlich reduziert werden.

Die Erfindung kann insbesondere im Bereich der Halblei­ terprüfung und -Fertigung, bei Oberflächen- und Struktur­ messungen, im Bereich der biologischen und medizinischen Mikroskopie, wie bei der Zellforschung, eingesetzt werden.

Es wird ein konfokaler strahlungsgangstabiler Laserscan­ ner bzw. ein entsprechendes Mikroskop geschaffen. Die Punktlichtquellen der Punktlichtquellen-Matrix werden durch ein Mikroskopobjektiv konfokal auf das Objekt bzw. eine Objektebene abgebildet. Zwischen den Punktlicht­ quellen und dem Mikroskopobjektiv können gegebenenfalls weitere optische Elemente, nämlich Linsen, auch Strah­ lungsteiler oder Filter und Polarisatoren, vorgesehen sein, die sämtlich zueinander in einer fest vorgegebenen Beziehung stehen und keinen Relativbewegungen senkrecht zur optischen Achse zugänglich sind. Es kann lediglich vorgesehen sein, daß zur Verstellung der zu beobachten­ den Objektebene in die Fokusebene des Objektivs der Ob­ jektträger in Richtung der optischen Achse (Z-Achse) verstellt wird, dies geschieht aber nicht während des Scannens oder Abtastens einer Objektebene in Richtungen senkrecht zur optischen Achse, sondern jeweils zwischen Abtastvorgängen, so daß auch diese Einstellbewegung keine Störung oder Beeinträchtigung hinsichtlich der Auflösung oder Qualität der Bildabbildung bewirkt.

Die Punktlichtquellen-Matrix kann in einfachster Aus­ führung eine Laserdioden-Anordnung sein, vorausgesetzt, daß die Lichtintensität in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse kreisförmig ist und eine Gauß-Verteilung aufweist. Derartige lichtemittierende Laser- Matrixstrukturen sind an sich bekannt.

Die Erfindung erlaubt insbesondere nicht nur das Arbei­ ten im Auflicht, sondern insbesondere auch im Durchlicht.

Wenn, wie verbreiteter, die Laserdioden-Anordnung "recht­ eckige" Laserdioden mit einer anderen als der vorgenann­ ten Intensitätsverteilung aufweist, so bilden diese vor­ zugsweise nicht die Punktlichtquellen sondern sind vielmehr vor einer Lochrasteranordnung (im einfachsten Fall einer Loch-Matrix bzw. einem Lochraster), also relativ zum Objekt auf der gegen­ überliegenden Seite dieser Matrix angeordnet und beleuch­ ten diese Lochrasteranordnung, so daß von den einzelnen Löchern, die dann wellenoptisch als Sekundärlichtquellen für das Objekt wirken, das Licht ausgeht. Die Kohärenz des Lichts der genannten Lichtquellen ist im übrigen wichtig für die Qualität der Abbildung.

Statt durch Laser- oder Leuchtdioden-Matrizen kann auch die Beleuchtung einer solchen Sekundärlichtquellen-Matrix durch einen einzelnen Laser erfolgen. Des­ sen Strahl kann zunächst aufgeweitet werden, so daß er die gesamte Matrix beleuchtet. In diesem Falle muß ent­ weder zwischen dem Laser und der Sekundärlichtquellen- Matrix eine Schalteinrichtung vorgesehen sein oder aber die Sekundärlichtquellen-Matrix derart ausgebildet sein, daß die einzelnen Sekundärlichtquel­ lenpunkte nicht gleichzeitig, sondern-sukzessiv auf­ leuchten. Im einfachsten Fall kann dies eine zwischen Laserstrahl und dessen Aufweiteoptik sowie der Sekundär­ lichtquellen-Matrix angeord­ nete, bewegliche Lochscheibe sein, die sich vorzugsweise dreht und sukzessiv den Lichtweg zu einzelnen Punkten der Lochmatrix freigibt. Statt dessen kann aber auch eine elektrooptische Schalt-Matrix vorgestehen sein oder aber die Sekundärlichtquellen-Matrix selbst als elektrooptische Schalt-Matrix ausgebildet sein, bei der einzelne Punk­ te zum Durchlaß bzw. Sperren des Lichts angesteuert werden können.

Die Loch-Matrix kann ebenfalls in unter­ schiedlicher Weise hergestellt sein, beispielsweise durch mechanisches oder Laser-Bohren oder aber durch lithographi­ sche Bearbeitung von Glas- oder Quarzplatten. Auch andere Materialien und Verfahren zur Herstellung der Matrix sind möglich, wie z. B. die Mikrostrukturtechnik.

Die sukzessive Ansteuerung der einzelnen Sekundärlicht­ quellen kann aber auch durch Abtasten der Löcher mittels des Laserstrahls erfolgen, und zwar zunächst in der unter Bezug auf den Stand der Technik beschriebenen Weise mittels Galvanometerspiegeln, wobei grundsätzlich auch statt zwei Spiegel ein Spiegel, der um zwei nicht übereinstimmende Achsen verschwenkbar ist, vorgesehen sein kann. Obwohl dann ebenfalls mecha­ nisch bewegliche Teile vorgesehen werden, bedingen die­ se keinerlei störenden Einfluß, wie dies bei den bekann­ ten konfokalen Laserscan-Mikroskopen der Fall ist. Dies liegt darin begründet, daß die mechanisch beweglichen Teile nicht zwischen der vom Objekt gesehenen Lichtquel­ le und dem Objekt angeordnet sind, sondern vor den vom Objekt gesehenen punktförmigen Sekundärlichtquellen der Punktlichtquellen-Matrix, die eben aus den genannten elektrooptischen Gründen selbst als (Sekundär-)Licht­ quellen wirken. Auf diese haben mechanische Störungen der Scannereinheit, die im Lichtweg vor ihnen angeord­ net ist, keinen Einfluß. In bevorzugter Ausgestaltung kann darüber hinaus vorgesehen sein, daß zwischen der (Sekundär-)Punktlichtquellen-Matrix und dem Objekt ein Strahlteiler, vorzugsweise in Form eines halbdurchlässi­ gen Spiegels, zum Abtrennen eines Lichtanteils der ein­ zelnen Strahlen als Referenzstrahlen und eine Detektoranord­ nung für diese Referenzstrahlen vorgesehen sind.

Neben der genannten galvanometrischen Abtastung mittels Galvanometerspiegeln kann die Abtastung auch mittels Dreh­ prismen oder durch piezoelektrische Materialien erfolgen.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele der Erfindung unter Bezugnah­ me auf die Zeichnung im einzelnen erläutert sind. Dabei zeigt bzw. zeigen:

Fig. 1 eine Prinzipdarstellung des Erfindungsgegenstandes;

Fig. 2 eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung;

Fig. 3a-e verschiedene Einsatzmöglichkei­ ten der Erfindung;

Fig. 4 Optik und Strahlengang für ei­ ne konkrete Ausführung der Er­ findung;

Fig. 5-9 konkrete Ausgestaltungen für die Beleuchtung bzw. die Reali­ sierung der Punktlichtquellen- Matrix;

Fig. 10-11 prinzipielle Darstellungen zur Realisierung der Empfängerein­ richtung im Rahmen der Erfin­ dung;

Fig. 12 eine Darstellung zur Erhöhung der Punktlichtquellen- bzw. De­ tektordichte über die an sich geometrisch möglichen hinaus;

Fig. 13 eine grundsätzliche schemati­ sche Darstellung des Erfindungs­ gegenstands mit verschiedenen Möglichkeiten der Beleuchtung sowie der Beobachtung des Ob­ jekts.

Bei der in Fig. 1 dargestellten schematischen Vorrich­ tung ist mit Q eine einzige Lichtquelle, wie ein Laser oder dergleichen bezeichnet. Zur Strahlablenkung ist ein XY-Scanner, wie beispielsweise eine Anordnung von Galva­ nometerspiegeln vorgesehen (hierzu auch Fig. 5). Dem XY-Scanner folgt in der dargestellten Ausführungsform unmittelbar ein Mikroskop-Objektiv MO, das die Licht­ quelle Q auf eine Objektebene O_oo, O_ÿ abbildet (grundsätzlich können zwischen Scanner und Mikroskop-Ob­ jektiv auch weitere Linsen oder Abbildungsspiegel vorge­ sehen sein). Bei der in Fig. 1 dargestellten Ausführungs­ form erfolgt die Betrachtung in Durchlicht. Demgemäß sind auf der dem Mikroskop-Objektiv MO gegenüberliegenden Sei­ te der Objektebene O_oo, O_ÿ ein weiteres Mikroskop- Objektiv MO′ nachgeordnet, dem eine Lochblendenebene mit einer Lochblenden-Matrix M_oo, M_ÿ folgt (auch hier kön­ nen zwischen MO′ und der Lochblenden-Matrix weitere Abbil­ dungselemente angeordnet sein). Unmittelbar hinter der Lochblendenebene ist eine Detektoranordnung mit geeigneten optoelektrischen Wandlern angeordnet. Durch die Anordnung der Loch­ blenden-Matrix M_oo, M_ÿ mit der der Anzahl der Scan­ punkte bzw. der Anzahl der abgetasteten Objektpunkte O_oo, O_ÿ entsprechenden Anzahl von Durchbrüchen M_oo, M_ÿ kann eine konfokale Detektion der Objektebene erfolgen. Grundsätzlich kann die Anordnung der Fig. 1 mit einer Lichtquelle Q, einem herkömmlichen XY-Scanner und einer Lochblenden-Matrix M_oo, M_ÿ auch in Auf-Licht-Anordnung vorgesehen sein. Hierzu muß dann im Strahlenweg zwischen Objekt O_oo, O_ÿ und Lichtquelle Q sowie XY-Scanner einerseits und zwischen der Objektebene O_oo, O_ÿ und der Lochblenken-Matrix M_oo, M_ÿ andererseits ein halbdurchlässiger Spiegel unter 45° zur Objektebene angeordnet sein, der beispielsweise die einfallenden Strahlen auf das Objekt reflektiert und die vom Objekt gestreuten Strahlen zur Lochblendenebene durchläßt oder vice versa.

Bei der in der Fig. 2 dargestellten Vorrichtung zum Ab­ bilden eines Objekts ist ein Objektträger T, wie ein Mikroskop-Tisch, vorgesehen, auf dem sich das zu beobach­ tende Objekt befindet. Vor dem Objekt ist ein Mikroskop- Objektiv MO angeordnet. Mit Abstand zum Objektiv MO unter einem Winkel von 45° zur optischen Achse A des Objektivs MO bzw. der gesamten Anordnung ist ein halbdurchlässiger Spiegel ST vorgesehen, durch ,den einerseits das Objekt O von einer Punktlichtquellen-Matrix Q mit in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse A angeordneten Punktlicht­ quelle Q_oo, Q_ÿ beleuchtet wird und von dem anderer­ seits von dem Objekt O gestreutes Licht einer Lochblenden- Matrix M zugeführt wird. Das Objekt O wird durch die Punktlichtquellen Q_ÿ konfokal beleuchtet, diese- wer­ den also auf das Objekt O abgebildet. Es wird jeweils die Objektebene senkrecht zur optischen Achse A betrach­ tet, auf die der Strahl der Punktlichtquellen Q_ÿ fo­ kussiert ist. Um mehrere senkrecht zur optischen Achse A stehende Objektebenen zu betrachten, kann der Abstand zwischen Objektiv MO und Objekt verändert werden, bei­ spielsweise durch Bewegen des Objektträgers T in Rich­ tung der optischen Achse A. Wesentlich ist, daß die Punktlichtquellen-Matrix Q und die Lochblenden-Matrix M in Richtungen senkrecht zur optischen Achse relativ zum Objekt O fest angeordnet sind, d. h. die optische Anord­ nung aus Punktlichtquellen-Matrix, Lochblenden-Matrix M und Objektiv O fest ist und keine mechanisch beweglichen Ele­ mente aufweist (genauso wenig wie der Tisch) und in der Ebene senkrecht zur optischen Achse A, also ei­ ner beobachteten Objektebene unbeweglich ist und dement­ sprechend auch nicht bewegt wird.

Dies führt dazu, daß bei der Beobachtung einer Objekt­ ebene keinerlei mechanisch bewegliche Teile zu Störun­ gen führen können, beispielsweise aufgrund ihres mecha­ nischen Antriebs, ihrer Trägheit etc.

Die Position von Punktlichtquellen-Matrix Q und Lochblenden- Matrix M in der Fig. 2 kann grundsätzlich auch vertauscht sein (Fig. 3a).

Statt der Betrachtung mit Auflicht, wie in den Fig. 2 und 3a dargestellt, kann auch eine Betrachtung in Durch­ licht erfolgen (Fig. 3b). Während grundsätzlich die Beobachtung durch die Lochblenden-Matrix unmittelbar op­ tisch erfolgen kann, kann im Rahmens der Erfindung auch zusätzlich ein klassisches Mikroskop KM vorgesehen sein, wie dies schematisch in der Fig. 3c bei einem durch­ sichtigen Objekt erfolgt. Grundsätzlich kann auch bei den Ausgestaltungen der Fig. 3a und b durch Einsatz eines (weiteren) teildurchlässigen Spiegels eine Betrachtung mittels über ein klassisches Mikroskop erfolgen.

Die in den Fig. 3d und e dargestellten Doppelauflicht­ methoden dienen insbesondere zum Vergleich zweier Objek­ te.

Die Fig. 4 zeigt den konkreten optischen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Punktlichtquellen Matrix Q sowie die Lochblenden-Matrix M sind - unter Zwi­ schenschaltung des halbdurchlässigen Spiegels ST - in der Brennebene eines ersten Objektivs O₁ angeordnet. Demgemäß werden die von der Punktlichtquellen-Matrix Q ausgehen­ den Strahlen parallelisiert. Die Strahlen der Punktlicht­ quellen Q_oo, Q_ÿ werden dann über ein weiteres Objektiv O₂ sowie das Mikroskopobjektiv als Punkte Q′_oo, Q′_ÿ auf die zu untersuchende Objektebene abgebildet. Das von dort gestreute Licht wird durch die Linse O₂ wieder parallelisiert und durch die Linse O₁ auf die Ebene der Lochblenden-Matrix M abgebildet.

Bei einer ersten Ausgestaltung zur Realisierung der Punkt­ lichtquellen-Matrix Q der erfindungsgemäßen Vor­ richtung gemäß der Fig. 5 wird der Strahl eines Lasers L über Linsen O_a, O_b, O_g mittels Scanner-Spiegel S₁, S₂ über die Punkt­ lichtquellen-Matrix Q geführt. Die Punktlichtquellen-Matrix Q ist dabei eine Lochplatte mit in einer regelmäßigen Matrix angeordneten Löchern Q_oo, Q_ÿ. Die Platte kann dabei eine Platte aus üblichem Material sein, die bis auf die Löcher Q_oo, Q_ÿ nicht transparent ist, so kann es sich um eine Metallplatte handeln, in welche die Löcher Q_oo, Q_ÿ als Durchbrüche eingebracht sind, beispielsweise durch Bohren. Es kann sich um eine Glas­ platte handeln, bei der in lithographischer Weise die Loch- Matrix geschaffen wurde. In jedem Fall wirken die Löcher Q_oo, Q_ÿ als Sekundär-Punktlichtquellen, werden also aufgrund der oben beschriebenen Anordnung vom Objekt als Punktlichtquellen gesehen. Dies ist auch der Grund, daß Ungenauigkeiten der Scanner-Spiegel S₁, S₂ unbeachtlich sind und das Meßergebnis nicht beeinflussen. Im dargestell­ ten Ausführungsbeispiel sind zwei Scanner-Spiegel S₁, S₂ vorgesehen, die jeweils um eine von zueinander orthogena­ len Achsen verschwenkbar sind, so daß der vom Laser L ausgehende Lichtstrahl senkrecht zur Ebene der Punkt­ lichtquellen-Matrix über diese von einem Loch derselben zu einem anderen bewegt werden kann. Die Scanner-Spie­ gel S₁, S₂ können in beliebiger an sich bekannter Weise ausgebildet bzw. angetrieben sein. Es kann sich um fein positionierbare Galvanometerspiegel handeln. Die Spie­ gel können als drehende Polygone ausgebildet sein. Es können piezo-elektrische oder elektrooptische Ablenk­ einheiten vorgesehen sein. Statt zweier Ablenkeinheiten, wie in der Fig. 5 dargestellt, kann auch eine Ablenk­ einheit S_XY vorgesehen sein, die alleine den Strahl über eine Ebene senkrecht zur optischen Achse vor der Punktlichtquellen-Matrix Q scannen kann (Fig. 6).

Während des Abtastens der Sekundärlichtquellen-Matrix Q in Form der Lochscheibe kann auch vorgesehen sein, daß ein Lichtstrahl, wie ebenfalls der Strahl eines Lasers, durch eine geeignete Optik O_c, O_g aufgeweitet wird, so daß er die gesamte Fläche der Loch-Matrix beleuchtet (Fig. 7). Da das Objekt O gleichzeitig nur von einem Lichtstrahl eines Loches und nacheinander von sämtlichen getroffen werden soll, muß eine Schalteinheit SCH vorgesehen sein, die die Beleuchtung nur eines Loches Q_oo, Q_ÿ der Sekundärlichtquellen-Matrix Q freigibt, die anderen Lö­ cher aber abdeckt. Hierzu kann zusätzlich vor der Sekun­ därlichtquellen-Matrix Q eine angeordnete, bewegliche, bei­ spielsweise sich drehende Lochscheibe U vorgesehen sein, die jeweils nur die Beleuchtung eines Loches der Sekundär­ punktlichtquellen-Matrix Q gestattet, die anderen Durch­ brüche der Matrix aber abdeckt. Beidseitig der Lochschei­ be U sind Linsen-Matrizen L angeordnet, die das durch die Linsen O_c, O_g aufgeweitete Laserlicht auf die Durchbrüche sowohl der beweglichen Lochscheibe U als auch der Sekun­ därpunktlichtquellen-Matrix Q abbilden (Fig. 7).

In weiterer Ausgestaltung kann auch statt der Loch-Ma­ trix als Sekundärpunktlichtquellen-Matrix Q oder aber zusätzlich zu dieser und dann statt der Lochscheibe U eine geeignete elektrooptische Matrixanordnung vorgese­ hen sein, mittels der einzelne Durchlaßpunkte derart an­ steuerbar sind, daß sie das aufgeweitete Laserlicht hin­ durchlassen, während die anderen geschlossen sind.

Eine andere Ausgestaltung ist in der Fig. 8 dargestellt. Hier erfolgt die Beleuchtung der Loch-Matrix U durch ei­ ne Laserdioden-Anordung (LDA), bei der die einzelnen Laserdioden einzeln zum Leuchten ansteuer­ bar sind. Zwischen der Laserdioden-Anordnung LDA und der Punktloch-Matrix Q ist eine Strahlumform-Matrix SUA vor­ gesehen, die im wesentlichen ebenfalls eine Linsen-Matrix entsprechend der bei der Fig. 6 erwähnten aufweist, bei­ spielsweise ein mit einer Vielzahl kleiner Linsen gepreß­ tes Teil oder lithographisch bzw. holographisch herge­ stelltes Linsen-Array für die kohärente Bildübertragung.

Durch dieses wird der von einer Laserdiode LD_oo, LD_ÿ jeweils ausgehende Strahl auf das entspre­ chende Loch Q_oo, Q_ÿ der Punktloch-Matrix Q fokussiert.

Dies ist notwendig, da die von einem herkömmlichen La­ serdioden-Array ausgehenden Strahlen in der Regel keine kreissymmetrische Intensitätsverteilung aufweisen, son­ dern vielmehr im Schnitt senkrecht zur Strahlrichtung eher Rechteckform zeigen.

Die Lochblenden-Matrix M ist eine Loch-Matrix mit Durch­ brüchen M_oo, M_ÿ, die in gleicher Weise wie die Punktlichquellen- Matrix Q hergestellt wurde. Hinter der Lochblenden-Matrix M ist eine Detektoranordnung oder Empfangsoptik aus Linsen O_e, O_f (Fig. 10) (oder eine Lichtwellenleiter-Anordnung) mit einem Lichtempfänger D_e vorgesehen. Letzterer kann zu­ nächst eine Foto-, Video-, CCD-Kamera oder auch ein Okular sein. Der Lichtempfänger kann ein einzelner Detektor D_e sein, in diesem Falle ist eine Datenverarbeitung notwendig, die die zu einem Zeitpunkt empfangende Lichtintensität dem entsprechenden Abtastpunkt bzw. der einzelnen Punktlicht­ quelle der Punktlichtquellen-Matrix Q zuordnet. Wenn das Abtasten bzw. das Scannen mit hinreichender Geschwindigkeit erfolgt, so kann die Empfängeroptik auch ein herkömmliches Okular zur direkten Beobachtung aufweisen. In diesem Falle ist die Abtastfrequenz lediglich so hoch zu wählen, daß das Auge nicht mehr einzelne angezeigte Bildpunkte unter­ scheiden kann, es soll sich eine Bildwiederholfrequenz von mehr als 50 Hertz ergeben. Bei den elektronischen Aufnahmeverfahren kann zur direkten oder unmittelbaren Beobachtung der aufgenommene Bildpunkt in elektronischer Weise hinreichend festgehalten werden, so daß dem Betrach­ ter immer ein vollständiges Bild gezeigt wird, selbst wenn die Abtastfrequenz geringer liegt. Bei einer Fotokamera kann die Belichtung so lange erfolgen, bis sie bei der gegebenen Filmempfindlichkeit ausreichend ist.

Statt einer Empfängeranordnung mit einem einzelnen Detektor (mit zeitlicher und nicht-geometrischer Diskriminierung der einzelnen Meßpunkte), oder einer Video- oder CCD-Kamera können auch matrixartig angeordnete einzelne Detektoren D^o, D^ÿ vorgesehen werden. In diesem Falle ist lediglich die Optik O_e, O_f oder der Lichtwellenleiter hinter der Lochblenden-Matrix M derart zu wählen, daß sie den durch die einzelnen Detektoren D^o, D^ÿ gegebenen Abständen derselben gerecht werden (Fig. 11).

Es kann wünschenswert sein, die Löcher der Sekundärlichtquellen-Matrix Q bzw. der Lochblenden-Matrix M hinsichtlich ihrer Größe und ihres Abstandes so zu wäh­ len, daß ihr Durchmesser gleich oder größer des gewünsch­ ten Mittelpunktabstandes ist. Dann wären auf einem der­ artigen Lochblendenträger keine diskreten Löcher mehr nebeneinander anordbar. Es können sich auch andere Si­ tuationen aus praktischen Gründen ergeben, bei denen die Punktlöcher nicht mit der gewünschten Dichte nebeneinander anordbar sind. Für diesen Fall schlägt die Erfindung die schematisch in Fig. 12 dargestellte Aus­ führung vor. Diese zeigt zur besseren Veranschaulichung lediglich eine Auftrennung der Löcher von Sekundärlicht­ quellen-Matrix Q und Lochblenden-Matrix M in einer Richtung senkrecht zu den auf die Punktlöcher auffallenden Strah­ len. Da die Punktlöcher auf den Matrizen zweidimensional angeordnet sind, müssen auch die senkrecht zu der Blatt­ ebene der Fig. 12 nebeneinander angeordneten Punktlöcher in der noch zu beschreibenden Weise aufgelöst bzw. ge­ trennt werden. Dies kann durch halbdurchlässige Spiegel (wie sie noch erläutert werden) geschehen, die unter ei­ nem Winkel von 45° zur Blattebene der Zeichnung angeord­ net sind.

Der Fig. 12 ist zu entnehmen, daß der von einer Pri­ mär-Lichtquelle, wie einem Laser kommende Strahl S, mag er in der oben beschriebenen Weise aufgespalten oder ab­ gelenkt sein (Fig. 3 bis 6) über die Linse O_g zu­ nächst auf einen halbdurchlässigen Spiegel ST₁ gerich­ tet wird. Unter Winkeln von 45° zu diesem und damit un­ ter einem Winkel von 90° zueinander sind zwei sekundär­ lichtquellen-Matrizen Q₁, Q₂ angeordnet, deren Lochab­ stand (in der dargestellten Richtung) doppelt so groß ist, wie der der gewünschten, eigentlichen Sekundärlicht­ quellen-Matrix Q, wobei die Löcher jeweils um die Hälfte des Abstandes jeder der Matrizen Q₁, Q₂ versetzt sind.

In der Richtung senkrecht zur Papierebene erfolgt bei der realen Ausgestaltung einer solchen Anordnung selbst­ verständlich ebenfalls eine solche Lochabstandverände­ rung in ähnlicher Weise, wie schon vorstehend erwähnt. Dies führt dazu, daß beispielsweise der Strahl S₁ durch ein Loch der Matrix Q₁ gerichtet wird, während der Strahl S₂, der zu einem späteren Zeitpunkt auf dem (Objekt- Tisch OT) gerichtet werden soll, durch ein Loch der Ma­ trix Q₂ fällt. Anschließend werden die Strahlen (die nicht gleichzeitig, son­ dern sukzessiv nacheinander auf das Objekt gerichtet wer­ den) wieder vereinigt, so daß sie als Parallelstrahl auf das Objekt O fallen (wie in Fig. 12 ersichtlich ist). Die Lochblenden-Matrix M kann in gleicher Weise aus Teil- Matrizen M₁, M₂, . . . (auch hier ist die zweidimensio­ nale Anordnung der Punktlöcher zu berücksichtigen) bestehen, wobei auch hier wiederum ein halbdurchlässiger Spiegel ST₂ sowie Spiegel SP₃ und SP₄ verwendet werden, um die vom Objekt gestreuten Strahlen trotz des Durchgangs durch die unterschiedlichen Matrizen M₁, M₂, . . . wieder zu vereinen, so daß sie gegebenenfalls auf einen einzigen Detektor fallen können. Insgesamt wird also durch diese Ausgestaltung eine größere Dichte der Lichtrasterpunkte erreicht, als dies aus mechanischen Gründen möglich wäre, wenn man lediglich eine einzige Sekundärlichtquellen-Matrix bzw. Detektor-Matrix verwen­ den würde.

Bei der gegebenen Anordnung kann ein vom halbdurchlässi­ gen Spiegel ST₁ ausgehender Halbstrahl HS als Referenz­ strahl für Vergleichszwecke verwendet werden.

Es ist möglich, auf eine Vereinigung der von Spiegel SP₃ und SP₄ ausgehende Strahlen zu verzichten. In diesem Fall sind zwei Detektoren erforderlich.

In der Fig. 13 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit verschiedenen Beleuchtungsverfahren und verschiedenen Detektormethoden noch einmal schematisch dargestellt. Die Beleuchtung kann von einem Laser (mittels A) durch Aufweitung oder über einem X-Y-Scanner Sc in den be­ schriebenen Ausgestaltungen erfolgen. Es kann, eine Be­ leuchtung durch eine Laserdioden-Anordnung LDA vorgesehen sein. In beschriebener, geeigneter Weise erfolgt eine Strahltransformation (über SCH) derart, daß das Objekt lediglich durch eine Punktlichtquelle der Punktlicht­ quellen-Matrix Q beleuchtet wird. Diese Punktlichtquelle wird dann über den halbdurchlässigen Spiegel ST sowie das Mikroskopojek­ tiv MO auf das, Objekt O abgebildet. Der von diesem ge­ streute Strahl tritt durch die Lochblenden-Matrix M, unter­ liegt gegebenenfalls ebenfalls einer Strahltransforma­ tion und kann dann in geeigneter Weise aufgenommen wer­ den, nämlich direkt über ein Okular, eine Fotokamera, eine Video- oder CCD-Kamera, einen Detektor D oder eine Detektoranordnung DA.

Bei den bevorzugten Ausgestaltungen ist wesentlich, daß zwischen der Punktlichtquellen-Matrix Q (und der Detektor­ anordnung) einerseits sowie dem Objekt O während des Abtastens (das in der Ebene senkrecht zur optischen Achse A erfolgt) eben in dieser Ebene keine mechanischen Bewegungen durchgeführt werden, so daß zwi­ schen Punktlichtquellen-Matrix Q (und der Detektoranordnung) und dem Objekt ein stabiler konfokaler Strahlengang gegeben ist. Zur konfokalen Detektion sind die Lochblendenöffnun­ gen M_oo, M_ÿ auf der Detektionsseite erforderlich, auf die abgebildet wird. Es reicht insbesondere nicht aus, ein Objekt konfokal zu beleuchten, sondern es kommt darauf an, daß derart eine konfokale Detektion gesichert ist, die eine dreidimensionale Rekonstruktion ermöglicht.

Claims (13)

1. Konfokales optisches Rastermikroskop,

• - mit einer Punktlichtquellenanordnung und einem Objektiv, das eine Punktlichtquelle auf das zu beobachtende Objekt fokussiert,
• - wobei einzelne Objektpunkte der Reihe nach durch die Punktlichtquelle beleuchtet werden,
• - und mit einer Detektoranordnung, auf welche der von der Punktlichtquelle gerade beleuchtete Objektpunkt abgebildet wird,

dadurch gekennzeichnet,

• - daß die Detektoranordnung (D_oo, . . . , D_ÿ, . . . ) eine Lochblendenmatrix (M) aufweist,
• - welche im Fokus des den gerade beleuchteten Objektpunkt auf die Detektoranordnung (D_oo, . . . , D_ÿ, . . . ) abbildenden Objektivs (MO, MO′) angebracht ist,
• - so daß eine unmittelbare Beobachtung des Objekts (O) auch ohne elektronische Bilderzeugung möglich ist.

2. Rastermikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß eine Punktlichtquellen-Matrix (Q) mit einer Vielzahl von Punktlichtquellen vorgesehen ist, von denen jede der Reihe nach eingeschaltet wird.

3. Rastermikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Punktlichtquellen-Matrix (Q) eine Laserdioden-Anordnung (LDA) ist.

4. Rastermikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Punktlichtquellen-Matrix (Q) eine Sekundärlichtquellen-Matrix ist, daß auf deren dein Objekt (O) abgewandten Seite eine Anordnung zur gleichzeitigen, flächigen Beleuchtung der Sekundär­ lichtquellen-Matrix vorgesehen ist und daß der Einrichtung zur flächigen Beleuchtung der Sekundär­ lichtquellen-Matrix eine Schalteinrichtung (SCH) zum sukzessiven Einschalten einzelner Sekundärlichtquel­ len nachgeordnet ist.

5. Rastermikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Punktlichtquellen-Matrix (Q) eine Sekundärlichtquellen-Matrix in Form mindestens eines Lochrasters ist und daß dieser Matrix (Q) eine Lichtquelle (L) sowie eine Abtasteinrichtung zum sukzessiven Ansteuern der einzelnen Löcher des Lochrasters vorgeordnet ist.

6. Rastermikroskop nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Sekundärlichtquellen-Matrix (Q) durch zwei, vier oder mehrere Lochraster (Q_, Q₂ . . . ) gebildet wird, wobei die Löcher jeweils eines Lochrasters (Q₁) zu denen des oder der anderen Lochraster(s) (Q₂) derart versetzt angeordnet sind, daß aufeinanderfolgende, das Objekt (O) beleuchtende Strahlen jeweils sukzessiv durch ein Loch jeweils eines Rasters (Q₁, Q₂) hindurchtreten.

7. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektor-Matrix (D) durch zwei, vier oder mehrere Lochraster (D₁, D₂ . . . ) gebildet wird, wobei die Löcher jeweils eines Lochrasters (D₁) zu denen des oder der anderen Lochraster(s) (D₂) derart versetzt ange­ ordnet sind, daß aufeinanderfolgende, zu detektierende Strahlen je­ weils sukzessiv durch ein Loch jeweils eines Rasters (D₁, D₂) hindurchtreten.

8. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (D) ein Okular aufweist.

9. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (D) eine Kamera aufweist.

10. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (D) einen einzelnen oder mehrere Detektor(en) auf­ weist und mit einer Datenverarbeitungseinrichtung verbunden ist.

11. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoranordnung (D) eine matrixförmige Anordnung einzelner Detekto­ ren (D_oo, D_ÿ, . . . ) aufweist.

12. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zur Detektoran­ ordnung ein konventionelles Mikro­ skop-Okular vorgesehen ist, dem das Objektlicht über einen Strahlteiler zugeleitet wird.