DE102013022538B3 - Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes und Mikroskopievorrichtung - Google Patents

Abstract

Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes zumindest eines Teiles eines Objektes, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
a. Aussenden von Anregungslicht (4) einer Anregungswellenlänge λ_ex durch eine Lichtquelle (2),
b. rasterndes Beleuchten einer Mehrzahl von Beleuchtungsstellen (36) an dem Objekt mit dem Anregungslicht (4), die eine vorbestimmte Anordnung mit vorbestimmten Abständen zueinander aufweisen,
c. Detektieren eines Raster-Teilbildes (38) einer vorbestimmten Vergrößerung für jede beleuchtete Beleuchtungsstelle (36) durch Lenken von Emissionslicht (16) einer Emissionswellenlänge λ_em auf einen optischen Sensor (26), das von dem Objekt als Reaktion auf die Beleuchtung mit dem Anregungslicht (4) an der jeweiligen Beleuchtungsstelle (36) emittiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass Bildpositionen, an denen Mittelpunkte der Raster-Teilbilder (38) auf dem optischen Sensor (26) detektiert werden, der Anordnung der entsprechenden Beleuchtungsstellen (36) auf dem Objekt entsprechen, wobei Bildabstände zwischen Bildpositionen jeweils zweier Raster-Teilbilder (38) den Abständen der entsprechenden Beleuchtungsstellen (36) multipliziert mit der vorbestimmten Vergrößerung und mit einem Korrekturfaktor a entsprechen, wobei der Korrekturfaktor a größer ist als 1, wobei das Anregungslicht (4) durch eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung (10) für das rasternde Beleuchten umgelenkt wird, wobei das Anregungslicht (4) um einen Raster-Kippwinkel aus einer optischen Achse heraus abgelenkt wird, und wobei das Emissionslicht (16) derart auf die Raster-Kippspiegelanordnung (10) gelenkt wird, dass es nach der Reflexion an der Raster-Kippspiegelanordnung (10) um einen mit dem Korrekturfaktor a multiplizierten Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt ist.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes zumindest eines Teiles eines Objektes, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
1. a) Aussenden von Anregungslicht einer Anregungswellenlänge durch eine Lichtquelle,
2. b) rasterndes Beleuchten einer Mehrzahl von Beleuchtungsstellen an dem Objekt mit dem Anregungslicht, die eine vorbestimmte Anordnung mit vorbestimmten Abständen zueinander aufweisen,
3. c) Detektieren eines Rasterteilbildes einer vorbestimmten Vergrößerung für jede beleuchtete Beleuchtungsstelle durch Lenken von Emissionslicht einer Emissionswellenlänge auf einen optischen Sensor, das von dem Objekt als Reaktion auf die Beleuchtung mit Anregungslicht an der jeweiligen Beleuchtungsstelle emittiert wird.
• Die Erfindung betrifft zudem eine Mikroskopievorrichtung zum Durchführen eines derartigen Verfahrens.
• Optische Mikroskopie und insbesondere hochauflösende optische Mikroskopie findet in vielen naturwissenschaftlichen Bereichen, insbesondere im Bereich der sogenannten „Life-Science“ eine Anwendung. Die zwei Hauptmerkmale eines optischen Mikroskops sind dabei seine Vergrößerung und sein räumliches Auflösungsvermögen. Während die numerische Vergrößerung durch entsprechende Linsensysteme nahezu beliebig groß eingestellt werden kann, wurde bereits im 19. Jahrhundert gezeigt, dass das Auflösungsvermögen eines optischen Mikroskops prinzipiell durch die Beugung des Lichtes beschränkt ist. Die berühmte Abbesche Auflösungsgrenze bezieht sich dabei auf sogenannte Weitfeldmikroskope, bei denen durch das Mikroskop ein Abbild des zu beobachteten Objektes auf einen Weitfelddetektor, beispielsweise das menschliche Auge oder eine CCD-Kamera abgebildet wird.
• Um immer kleinere Strukturen beobachten zu können, ist es von großem Interesse, das Auflösungsvermögen optischer Mikroskope zu verbessern. Dazu sind aus dem Stand der Technik unterschiedliche Ansätze bekannt.
• Eine Möglichkeit, erhebliche Verbesserungen der räumlichen Auflösung zu erreichen besteht in der sogenannten 4pi-Mikroskopie, bei der das zu beobachtende Objekt durch zwei gegenüberliegende Objektive mit zwei zueinander kohärenten Lasern angestrahlt und das von dem Objekt ausgesandte Emissionslicht von beiden Objektiven gesammelt und kohärent überlagert auf einem Detektor fokussiert wird. Ein derartiges Mikroskop wird beispielsweise in der US RE 38,307 E beschrieben.
• Interessanterweise lässt sich die laterale und axiale Auflösung verbessern, wenn die Probe mit einer periodisch strukturierten Beleuchtung beleuchtet wird („Structured IIlumination Microscopy SIM“). Dies kann beispielsweise ein Lichtgitter sein, das auf unterschiedliche Weise erzeugt werden kann. Ist das Objekt mit der periodisch strukturierten Beleuchtung beleuchtet worden, werden unterschiedliche Weitfeldbilder bei verschiedener relativer Anordnung und Orientierung zwischen dem strukturierten Beleuchtungsmuster und dem Objektiv aufgenommen. Über komplexe numerische Algorithmen kann aus diesen unterschiedlichen Weitfeldbildern ein finales Bild mit einer ca. zweifach verbesserten räumlichen Auflösung in allen Raumrichtungen errechnet werden. Ein derartiges System ist beispielsweise in der DE 696 20 613 T2 beschrieben. Nachteilig ist jedoch, dass zum einen eine Vielzahl separater Weitfeldbilder aufgenommen werden muss und dass zum anderen ein komplexer numerischer Algorithmus benötigt wird, um aus diesen Weitfeldbildern das finale Bild zu errechnen. Die Herstellung entsprechender Bilder ist folglich zeitaufwändig und damit teuer. Bei der Structured Illumination Microscopy müssen die einzelnen aufzunehmenden Bilder kompliziert erzeugt werden, da insbesondere das Lichtgitter auf der Probe exakt positioniert, ggf. verschoben und um vorher fest definierte und möglichst exakt einzuhaltende Winkel gedreht werden muss.
• Neben der sogenannten Weitfeldmikroskopie sind aus dem Stand der Technik auch Laser-Raster-Mikroskope bekannt, bei welchen das zu beobachtende Objekt mit einem beugungsbegrenzt fokussierten Laser abgerastert wird, so dass eine Vielzahl von wohldefiniert zueinander positionierten Beleuchtungsstellen auf dem Objekt mit dem Licht des Lasers beleuchtet wird. Die von dem Objekt zurückgeworfene Lichtintensität des Emissionslichtes wird als Funktion der jeweiligen Rasterposition registriert. Diese Mikroskope lassen sich ebenfalls konfokal ausbilden und sind in laterale Richtung weiterhin auf die von Abbe beschriebene Auslösungsgrenze beschränkt, ermöglichen jedoch aber ebenfalls eine räumliche Auflösung in axialer Richtung. Konfokale Laser-Raster-Mikroskope werden in der Literatur auch als Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) beschrieben. Die erreichbare laterale Auflösung entspricht etwa der eines 4pi-Mikroskopes.
• Bei konfokaler Mikroskopie wird beispielsweise vorgeschlagen, das aus dem Objekt gesammelte Emissionslicht im Detektionsstrahlengang durch eine konfokale Blende zu fokussieren. Durch eine konfokale Blende wird im Optimalfall nur der Teil des vom Objekt ausgesandten Emissionslichtes auf den Detektor weitergeleitet, der aus der Fokalebene des Objektives stammt. Damit ist zwar die laterale Auflösung eines Konfokalmikroskops weiterhin der Abbeschen Auflösungsgrenze unterworfen, mit einem derartigen Konfokalmikroskop ist jedoch nun eine räumliche Auflösung in axialer Richtung möglich. Ein derartiges Verfahren ist beispielsweise in der Zeitschrift „Optik“, 80 Nr. 2 (1988) 53-54, „Super-resolution in confocal imaging“ von C.J.R. Sheppard beschrieben. Um ein vollständiges Bild zu erreichen, muss die Probe rasternd beleuchtet werden.
• Bei einem sogenannten Image-Scanning Microscope (ISM) wird das zu beobachtende Objekt wie bei einem herkömmlichen LSCM rasternd an einer Vielzahl von relativ zueinander wohldefiniert positionierten Beleuchtungsstellen beleuchtet. Anders als bei einem LSCM wird an jeder dieser Beleuchtungsstellen ein vollständiges Bild der mit dem Anregungslicht angeregten Region aufgenommen und abgespeichert. Es entstehen vier- bzw. fünf-dimensionale Datensätze, bei denen zwei bzw. drei Dimensionen der Position des Laserfokus auf der Probe und zwei weitere Dimensionen den Koordinaten des an jeder Rasterposition aufgenommenen Bildes entsprechen. Aus diesen Datensätzen lässt sich ebenfalls ein finales Bild mit erhöhter Auflösung errechnen. Die auf diese Weise erreichbare maximale Auflösung entspricht exakt der mit einem Structured-Illumination Microscope (SIM) erreichbaren. Ein derartiges Mikroskop und ein entsprechendes Verfahren ist beispielsweise in der EP 2 317 362 A1 dargestellt. Detailliert beschrieben wird das Verfahren beispielsweise auch im Artikel von Müller und Enderlein, „Image Scanning Microscopy“, Physical Review Letters, Vol. 104, 198101 (2010). Die in dem Artikel beschriebene Realisierung eines ISM weist jedoch den Nachteil auf, sehr langsam zu sein. Für jede Beleuchtungsstelle, an der das Objekt mit dem Anregungslicht beleuchtet wird, muss ein Bild der angeleuchteten Region aufgenommen werden, wodurch die maximale Rastergeschwindigkeit auf die maximal möglich Ausleserate der verwendeten Kamera bzw. des optischen Sensors beschränkt ist. Diese liegt typischerweise ein bis zwei Größenordnungen unterhalb der Rastergeschwindigkeiten moderner kommerziell erhältlicher Laser-Rastermikroskope.
• Um die Bilderstellung zu beschleunigen wurde beispielsweise eine Multifokusanregung unter Verwendung eines programmierbaren Digital-Spiegel-Systems vorgeschlagen, womit die ISM-Bildrate in den Bereich von ca. ein Bild pro Sekunde gebracht wurde (Andrew G. York et al. „Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy“, Nature Methods Vol. 9, No. 7, 749-54, Jan. 2012). Noch immer ist jedoch der numerische Aufwand, der für die Erstellung eines finalen Bildes nötig ist, enorm, da noch immer eine Vielzahl von separaten Raster-Teilbildern aufgenommen, abgespeichert und weiterverarbeitet werden muss.
• Durch die Beleuchtung einer Beleuchtungsstelle an dem Objekt mit dem Anregungslicht wird Emissionslicht von dem Objekt emittiert. Dieses Emissionslicht kann beispielsweise die gleiche Wellenlänge wie das Anregungslicht haben oder, insbesondere für biologische Anwendungen, eine von der Anregungswellenlänge verschiedene Emissionswellenlänge aufweisen, die beispielsweise durch die Anregung einer Fluoreszenz hervorgerufen wird. Befindet sich ein Emissionszentrum, das Emissionslicht der Emissionswellenlänge emittiert, im Zentrum der Beleuchtungsstelle, befindet sich das dadurch hervorgerufene Intensitätsmaximum auch im aufgenommenen Raster-Teilbild in dessen zentralem Bereich. Für den Fall, dass das Emissionszentrum jedoch nicht im zentralen Bereich der Beleuchtungsstelle angeordnet ist, verschiebt sich die Position des Intensitätsmaximums im aufgenommenen Raster-Teilbild. Um dies auszugleichen, ist es nötig, die verschiedenen aufgenommen Raster-Teilbilder numerisch zu verschieben und anschließend zu überlagern, wobei von einer Koordinaten-Neuzuordnung „coordinate reassignment“ gesprochen wird. Aus dem Stand der Technik ist es mittlerweile bekannt, diese Neuzuordnung auf optischem Weg, also durch geschickte Anordnung von Hardware-Elementen zu erreichen (S. Roth et al „Optical Photon Reassignment Microscopy (OPRA)“ arXiv: 1306.6230, 26. Juni 2013). Dabei werden die aufgenommenen Raster-Teilbilder optisch verkleinert und anschließend an der ursprünglichen Position der integrierten Kamera abgebildet. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, die Raster-Teilbilder nachträglich durch eine geeignete Software zu verkleinern. Dadurch konnte die Bildgeschwindigkeit, mit der einzelne Bilder ermittelt werden, stark verbessert werden. Allerdings ist der apparative Aufwand zur Durchführung dieses Verfahrens enorm, wodurch das Verfahren zwar schnell, jedoch aufwändig und damit teuer wird. Bei der von Roth et al. beschriebenen Ausführungsform wird das Emissionslicht durch die Scanvorrichtung entrastert. Anschließend wird der Strahl des Emissionslichtes aufgeweitet und in diesem Zustand erneut über die Scanvorrichtung geführt, wobei nun jedoch ein anderer Einfallswinkel verwendet wird. Dadurch wird die Scanvorrichtung über einen deutlich größeren Winkelbereich des einfallenden Lichtes verwendet, so dass es hier zu Abschattungeffekten kommen kann. Rastervorrichtungen, die über einen großen Winkelbereich des einfallenden Lichtes verwendbar sind, sind zudem sehr kostenintensiv.
• Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Erstellen eines derartigen Mikroskop-Bildes so weiter zu entwickeln, dass es schnell, einfach und dennoch mit einer sehr guten Auflösung der Mikroskop-Bilder durchführbar ist.
• Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe durch ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, das sich dadurch auszeichnet, dass die Bildpositionen, an denen Mittelpunkte der Raster-Teilbilder auf dem optischen Sensor detektiert werden, der Anordnung der entsprechenden Beleuchtungsstellen auf dem Objekt entsprechen, wobei Bildabstände zwischen Bildpositionen jeweils zweier Raster-Teilbilder den Abständen der entsprechenden Beleuchtungsstellen multipliziert mit der vorbestimmten Vergrößerung und mit einem Korrekturfaktor a entsprechen, wobei der Korrekturfaktor a größer ist als 1, wobei das Anregungslicht durch eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung für das rasternde Beleuchten umgelenkt wird, wobei das Anregungslicht um einen Raster-Kippwinkel aus einer optischen Achse heraus abgelenkt wird, und wobei das Emissionslicht derart auf die Raster-Kippspiegelanordnung gelenkt wird, dass es nach der Reflexion an der Raster-Kippspiegelanordnung um einen mit dem Korrekturfaktor a multiplizierten Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt ist.
• Die Beleuchtungsstellen, die rasternd an der Oberfläche des Objektes beleuchtet werden, weisen eine vorbestimmte Anordnung mit vorbestimmten Abständen zueinander auf. Derartige Anordnungen können beispielsweise auf einem Quadratgitter oder einem Dreiecksgitter liegen, wobei die einzelnen Beleuchtungsstellen äquidistant oder mit unterschiedlichen Abständen ausgebildet sein können. Jede dieser Beleuchtungsstellen wird beim rasternden Beleuchten mit dem Anregungslicht beleuchtet. Das Objekt wird in diesem Bereich angeregt, Emissionslicht einer Emissionswellenlänge auszusenden, das anschließend als Raster-Teilbild detektiert wird. Die Raster-Teilbilder werden dabei so auf den optischen Sensor gelenkt, der beispielsweise eine CCD-Kamera sein kann, dass der Sensor selbst bereits die Integration über die unterschiedlichen Beleuchtungsstellen durchführt. Anders als aus dem Stand der Technik bekannt muss dafür jedoch nicht auf optischem Wege jedes einzelne Raster-Teilbild verkleinert werden, wodurch der apparative Aufwand für eine Vorrichtung zum Durchführung dieses Verfahrens deutlich reduziert werden kann.
• Vielmehr wird bei einem erfindungsgemäßen Verfahren das nicht verkleinerte Raster-Teilbild, das einem um die vorbestimmte Vergrößerung vergrößerten Abbild des jeweiligen beleuchteten Bereiches des Objektes entspricht, auf eine vorbestimmte Stelle des optischen Sensors gelenkt. Die Anordnung der Mittelpunkte dieser Raster-Teilbilder, die im weiteren Bildpositionen genannt werden, entspricht dabei der Anordnung der Beleuchtungsstellen auf dem Objekt. Befinden sich die Beleuchtungsstellen beispielsweise auf einem Quadrat- oder einem Dreiecksgitter, werden auch die Bildpositionen auf dem Quadrat- bzw. Dreiecksgitter angeordnet. Lediglich der Abstand zwischen den einzelnen Bildpositionen ist gegenüber dem Abstand der entsprechenden Beleuchtungsstellen an dem Objekt vergrößert. Dabei wird jedoch der Abstand nicht nur mit der gewünschten Vergrößerung multipliziert, sondern zusätzlich mit einem Korrekturfaktor a, der größer ist als 1. Durch die Wahl dieses Korrekturfaktors wird dabei erreicht, dass alle so aufgenommenen Raster-Teilbilder an einer Stelle des optischen Sensors fokussiert werden, die es ermöglicht, dass der optische Sensor, der beispielsweise die CCD-Kamera ist, bereits die Integration durchführt. Der Sensor muss folglich nicht nach jedem Raster-Teilbild ausgelesen und die so erhaltene Raster-Teilbilder abgespeichert und später weiter bearbeitet werden, sondern der optische Sensor wird nach dem Ende des rasternden Beleuchtens, nachdem also alle Beleuchtungspunkte beleuchtet wurden, ausgelesen. Dabei wird ein Rohbild erhalten, das anschließend, wie aus dem Stand der Technik per se bekannt, nachbearbeitet werden kann.
• Als vorteilhaft hat sich dabei herausgestellt, dass die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge gleich groß sind und der Korrekturfaktor a = 2 ist.
• Alternativ dazu sind die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge voneinander verschieden und der Korrekturfaktor a berechnet sich zu $$\text{a}=\underset{{\mathrm{\lambda }}_{\text{em}}{}^2}{\overset{{\mathrm{\lambda }}_{\text{em}}{}^2+{\mathrm{\lambda }}_{\text{ex}}{}^2}{{\displaystyle \cdots \cdots \cdots \cdots }}}.$$

  
• Dabei bezeichnet Aexdie Anregungswellenlänge und Aem die Emissionswellenlänge. Dieser Korrekturfaktor liefert das exakt gewünschte Ergebnis, sofern eine Mikroskopievorrichtung die zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird, für beide verwendeten Wellenlängen die gleichen Abbildungseigenschaften, Punktverbreiterungsfunktionen („Point Spread Function: PSF“) und optische Übertragungsfunktionen („Optical Transfer Function: OTF“) aufweist, abgesehen von genau dem Einfluss der Wellenlänge auf die vorgenannten Größen. Dabei sind die Punktverbreiterungsfunktion das Abbild einer Punktlichtquelle und die optische Übertragungsfunktion die Fourier-Transformierte der Punktverbreiterungsfunktion.
• In den allermeisten Fällen wird durch die Näherung, dass diese Größen für die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge identisch sind, eine ausreichend gute Qualität des erhaltenden Rohbildes erreicht. Dies gilt umso mehr, da für den Fall, dass die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge unterschiedlich sind, die Differenz zwischen beiden Wellenlängen relativ gering ist.
• Sollte die Mikroskopievorrichtung für die beiden verwendeten Wellenlängen deutlich unterschiedliche Abbildungseigenschaften aufweisen, muss der Korrekturfaktor a entsprechend angepasst werden, um diesem Umstand Rechnung zu tragen.
• Vorteilhafterweise legt das Emissionslicht einen Teil des Strahlengangs, den das Anregungslicht zurücklegt, in umgekehrter Richtung zurück und wird dann durch einen Strahlteiler geführt, wodurch es den Strahlengang des Anregungslichtes verlässt. Dies lässt sich für voneinander verschiedene Anregungswellenlängen und Emissionswellenlängen, insbesondere auf besonders einfache Weise durch einen dichroitischen Strahlteiler erreichen, der beispielsweise Anregungslicht der Anregungswellenlängen geradlinig passieren lässt und Emissionslicht der Emissionswellenlänge ablenkt und somit aus dem Strahlengang des Anregungslichtes entfernt.
• Das aus dem Strahlengang des Anregungslichtes entfernte Emissionslicht wird nun umgeleitet und beispielsweise bereits auf den optischen Sensor oder Detektor geleitet, auf dem die Raster-Teilbilder detektiert werden sollen. Dabei hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn das Emissionslicht durch eine Umlenkeinrichtung mit einer Umlenk-Kippspiegelanordnung umgelenkt wird, wobei jedem Raster-Teilbild ein konstanter Umlenk-Kippwinkel zugeordnet ist. Vorzugsweise wird zudem das Anregungslicht durch eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung für das rasternde Beleuchten umgelenkt, wobei jeder Beleuchtungsstelle ein Raster-Kippwinkel zugeordnet ist. Alternativ dazu könnte die Rastereinrichtung beispielsweise auch eine Nipkow-Scheibe sein, die beispielsweise stroboskopisch beleuchtet wird. Insbesondere für den Fall, dass jedoch sowohl die Rastereinrichtung als auch die Umlenkeinrichtung jeweils eine Kippspiegelanordnung aufweisen, lässt sich eine besonders einfache Realisierung der gewünschten Abstände der Bildpositionen auf dem optischen Sensor erreichen, indem eine Differenz zweier Umlenk-Kippwinkel für zwei unterschiedliche Raster-Teilbilder der Differenz der Raster-Kippwinkel für die entsprechenden Beleuchtungsstellen multipliziert mit dem Korrekturfaktor a entspricht. Die beiden Kippspiegelanordnungen können auf diese Weise besonders einfach synchron angesteuert und bewegt werden. Der apparative Aufwand für diese Anordnung ist äußerst gering, so dass einerseits die Herstellungs- und damit auch die Mikroskopiekosten gering gehalten werden und zudem wenige Bauteile benötigt werden, die die Qualität des aufgenommenen Bildes durch Produktionsfehler oder Beugungseigenschaften verschlechtern könnten.
• Erfindungsgemäß wird das Anregungslicht durch eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung für das rasternde Beleuchten umgelenkt, wobei das Anregungslicht um einen Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt wird. Dabei wird das Emissionslicht derart auf die Raster-Kippspiegelanordnung gelenkt, dass es nach der Reflexion an der Raster-Kippspiegelanordnung um den mit dem Korrekturfaktor a multiplizierten Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt wird. Wie bereits dargelegt, ist jeder Beleuchtungsstelle ein Raster-Kippwinkel zugeordnet. Das Anregungslicht wird von der Rastereinrichtung bzw. der darin enthaltenden Raster-Kippspiegelanordnung um einen Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse des Systems heraus abgelenkt. Es trifft daher an der gewünschten Beleuchtungsstelle auf das abzubildende Objekt.
• Insbesondere für den Fall, dass der Korrekturfaktor a genau dem Wert 2 entspricht, ist es folglich sinnvoll, das Emissionslicht, das von dem Objekt durch das Objektiv zurückgesendet wird, um genau den zweifachen Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abzulenken. Dies geschieht in einer besonderes geschickten und apparativ wenig aufwendigen Ausgestaltung dadurch, dass das Emissionslicht erneut auf die Raster-Kippspiegelanordnung gelenkt wird. Dies geschieht jedoch nicht in einer dem Anregungslicht entgegen gesetzten Richtung, was zu einer Entrasterung („descanning“) des Lichtes führen würde. Vielmehr wird das Emissionslicht so auf die Raster-Kippspiegelanordnung geleitet, dass es erneut um den Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt wird. Dadurch wird auf besonderes einfache Weise erreicht, dass das Emissionslicht um den zweifachen Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse des Systems heraus abgelenkt wird, so dass es die gewünschten Eigenschaften für das erfindungsgemäße Verfahren aufweist.
• Mit dieser einfachen Ausgestaltung ist es jedoch auch möglich, Korrekturfaktoren a, die nicht exakt dem Wert 2 entsprechen müssen, zu realisieren. Dafür wird das Emissionslicht durch eine Linsenanordnung geleitet, die eine andere Brennweite aufweist, als beispielsweise die Linsenanordnung, durch die das Anregungslicht geleitet wird. Dadurch trifft das Emissionslicht nicht exakt unter dem Raster-Kippwinkel auf die Raster-Kippspiegelanordnung, sondern unter einem leicht von diesem abweichenden Winkel. Das Emissionslicht wird dann von der Raster-Kippspiegelanordnung um den Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt, so dass insgesamt eine Ablenkung erzeugt wird, die nicht exakt dem zweifachen Raster-Kippwinkel entspricht.
• Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Mikrokopiervorrichtung zum Durchführen eines derartigen Verfahrens, die wenigstens eine Lichtquelle zum Aussenden von Anregungslicht, eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung zum rasternden Beleuchten der Mehrzahl von Beleuchtungsstellen, einen optischen Sensor und eine Umlenkeinrichtung zum Umlenken des Emissionslichtes aufweist, wobei die Raster-Kippspiegelanordnung derart angeordnet und eingerichtet ist, dass auf sie gelenktes Licht nach der Reflexion an der Raster-Kippspiegelanordnung um einen mit dem Korrekturfaktor a multiplizierten Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt ist.
• Vorzugsweise verfügt die Mikroskopievorrichtung zudem über einen Strahlteiler, der derart angeordnet und eingerichtet ist, dass das Anregungslicht und das Emissionslicht in unterschiedlichen Richtungen durch den Strahlteiler geführt werden und dass das Emissionslicht zu der Umlenkeinrichtung gelenkt wird. Das Emissionslicht, das von dem zu beobachtenden Objekt als Antwort auf die Beleuchtung mit dem Anregungslicht ausgesandt wird, durchläuft dabei bis zu diesem Strahlteiler den Strahlengang des Anregungslichtes in umgekehrter Reihenfolge. Insbesondere für die Ausgestaltungen, bei denen der Strahlteiler für das Anregungslicht vor der Rastereinrichtung angeordnet ist, so dass das Emissionslicht die Rastereinrichtung in umgekehrter Richtung relativ zum Anregungslicht durchläuft, wird auf diese Weise das Licht „entrastert“ („descanned“), so dass insbesondere in diesem Fall die bereits beschriebene bis auf den Korrekturfaktor a korrespondierende Ansteuerung einer Umlenk-Kippspiegelanordnung in der Umlenkeinrichtung erfolgen kann.
• Als vorteilhaft hat sich herausgestellt, wenn der Strahlteiler ein dichroitischer Strahlteiler ist. Damit lässt sich für den Fall, dass die Anregungswellenlänge und die Emissionswellenlänge verschieden voneinander sind, das Anregungslicht und das Emissionslicht auf besonderes einfache Weise voneinander trennen. Natürlich sind auch andere Strahlteiler denkbar, die beispielsweise auf verschiedene Polarisationen des Anregungs- und Emissionslichtes reagieren. So ist es beispielsweise denkbar, das Anregungslicht zunächst durch einen Polarisationsfilter zu polarisieren, so dass es mit einer festgelegten Polarisation durch den Strahlteiler verläuft. Zwischen dem Strahlteiler und dem Objekt durchläuft das Anregungslicht in diesem Fall vorteilhafter Weise ein optisches Element, das die Polarisation des Anregungslichtes verändert, beispielsweise ein Lambda-Viertelplättchen. Das Emissionslicht, das vom Objekt ausgesandt wird, durchläuft auf dem Weg zurück zum Strahlteiler ebenfalls dieses optische Element, so dass das Emissionslicht, das auf den Strahlteiler trifft, eine andere Polarisation als das Anregungslicht am Strahlteiler aufweist.
• Vorteilhafterweise verfügen sowohl die Umlenkeinrichtungen als auch die Rastereinrichtungen jeweils über eine Kippspiegelanordnung. Damit lässt sich das bereits beschriebene synchrone Ansteuern der verschiedenen Kippspiegelanordnungen erreichen, wobei die Umlenk-Kippspiegelanordnung mit dem Korrekturfaktor a multipliziert verkippt wird.
• Insbesondere für den Fall, dass der Strahlteiler zwischen der Rasteranordnung und dem Objekt angeordnet ist, hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Umlenkeinrichtung eine Linsenanordnung aufweist, die eine 2f-Optik bildet. Vorzugsweise ist die Linsenanordnung derart angeordnet, dass das Emissionslicht nach dem Durchlaufen dieser Linsenanordnung auf einen zweiten Strahlteiler trifft, durch den es wieder in den Strahlgang des Anregungslichtes eingekoppelt wird, so dass es danach auf die Rastereinrichtung trifft. Durch die 2f-Optik wird ein Ausbreitungswinkel des Emissionslichtes relativ zur optischen Achse des Systems umgekehrt. Anschließend wird das Emissionslicht durch den zweiten Strahlteiler wieder in den Strahlenteil des Anregungslichtes eingekoppelt und trifft auf die Rastereinrichtung. Dadurch, dass der Ausbreitungswinkel des Emissionslichtes zur optischen Achse nun ein anderes Vorzeichen aufweist, wird das Emissionslicht an der Rastereinrichtung nicht mehr „entrastert“, sondern es erhält erneut den von der Rastereinrichtung vermittelten Kippwinkel, so dass es nun relativ zum Anregungslicht einen Ausbreitungswinkel relativ zur optischen Achse aufweist, der doppelt so groß ist wie der des Anregungslichtes. Damit wird der Korrekturfaktor a gleich 2 realisiert, so dass das so abgelenkte Emissionslicht über einen dritten Strahlteiler aus dem Strahlengang des Anregungslichtes entfernt und auf den Detektor geleitet werden kann.
• Alternativ kann das Emissionslicht nach dem Durchlaufen der 2f-Optik auch durch eine separate Rastereinrichtung geführt werden, die für die nötige zusätzliche Ablenkung des Emissionslichtes sorgt. Dabei wird diese zusätzliche Rastereinrichtung vorzugsweise synchron mit der ersten Rastereinrichtung, die insbesondere das Anregungslicht ablenkt, angesteuert.
• Für den Fall, dass der Korrekturfaktor a nicht exakt 2 sein soll, lässt sich durch geschickte Wahl des Linsensystems erreichen, dass der Ausbreitungswinkel des Emissionslichtes nicht exakt zur optischen Achse umgekehrt wird. Auf diese Weise lässt sich durch eine Wahl des Linsensystems auch ein anderer Korrekturfaktor a erreichen.
• Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Umlenkeinrichtung für eine Mikroskopievorrichtung der hier beschriebenen Art. Diese umfasst insbesondere den Strahlteiler sowie die Umlenkeinrichtung, so dass auch bestehende Laser-Rastermikroskope nachgerüstet werden können und somit die Vorteile der hier beschriebenen Erfindung nutzen können.
• Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Umlenkeinrichtung, die eingerichtet ist, durch einen Eingang einfallendes Anregungslicht einer Rastereinrichtung zuzuführen, an der Rastereinrichtung abgelenktes Licht einem ersten Ausgang zuzuführen und durch den ersten Ausgang einfallendes Emissionslicht der Rastereinrichtung derart zuzuführen, dass es von der Rastereinrichtung in die gleiche Richtung aus der optischen Achse heraus abgelenkt wird, wie das Anregungslicht. Vorteilhafterweise ist eine derartige Umlenkeinrichtung eingerichtet, um von der Rastereinrichtung abgelenktes Emissionslicht einem von dem ersten Ausgang verschiedenen zweiten Ausgang zuzuführen.
• Durch eine derartige Umlenkeinrichtung wird einfallendes Anregungslicht, das insbesondere Laserlicht sein kann, einer Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung zugeführt. Diese Rastereinrichtung kann ein herkömmlicher aus dem Stand der Technik bekannter und kommerziell erhältlicher Scanner sein. An der Raster-Kippspiegelanordnung dieses Scanners wird das einfallende Anregungslicht abgelenkt und über gegebenenfalls vorhandene optische Elemente einem ersten Ausgang zugeführt. An diesem kann ein Objektiv vorhanden sein, das gegebenenfalls auch Teil der Umlenkeinrichtung sein kann. Von dort beleuchtet das Licht rasternd die Oberfläche eines abzubildenden Gegenstandes. Das vom Gegenstand ausgesandte Emissionslicht tritt durch den ersten Ausgang in die Umlenkeinrichtung ein. Dazu passiert es gegebenenfalls das vorhandene Objektiv, das, wie bereits dargelegt, auch Teil der Umlenkeinrichtung sein kann. Das Emissionslicht wird nun aus dem Strahlengang des Anregungslichtes beispielsweise durch einen Strahlteiler, insbesondere einem dichroitischen Strahlteiler, entfernt und über separate optische Elemente der Rastereinrichtung und der Raster-Kippspiegelanordnung innerhalb der Rastereinrichtung wieder zugeführt. Dabei handelt es sich um die gleiche Rastereinrichtung, der bereits zuvor das einfallende Anregungslicht zugeführt wird. Anders als beim aus dem Stand der Technik bekannten Entrastern („descanning“), bei dem das auf die Rastereinrichtung fallende Emissionslicht wieder in die optische Achse zurück umgelenkt wird, wird im vorliegenden Fall das Emissionslicht so auf die Rastereinrichtung geleitet, dass es von der Rastereinrichtung und der darin enthaltenden Raster-Kippspiegelanordnung in die gleiche Richtung aus der optischen Achse heraus abgelenkt wird, wie das Anregungslicht. Als besonders vorteilhaft hat sich dabei herausgestellt, wenn das Emissionslicht beispielsweise über einen Strahlteiler, insbesondere einen dichroitischen Strahlteiler wieder in den Strahlengang des Anregungslichtes vor der Rastereinrichtung eingeleitet wird. Auf diese Weise ist gewährleistet, dass das Emissionslicht nachdem es von der Rastereinrichtung umgelenkt wird, um den zweifachen Rasterkippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt ist. Anschließend wird das so abgelenkte Emissionslicht vorteilhafterweise über einen weiteren Strahlteiler, der insbesondere ebenfalls ein dichroitischer Strahlteiler sein kann, einem zweiten Ausgang zugeführt, der vom ersten Ausgang verschieden ist. An dieser Stelle lässt sich ein optischer Sensor, beispielsweise eine CCD-Kamera anordnen, die ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt und kommerziell erhältlich ist. Mit einer derartigen Umlenkeinrichtung lassen sich folglich auch bestehende Mikroskope leicht um- bzw. aufrüsten, so dass sie von der hier beschriebenen Erfindung Gebrauch machen können.
• Um die Aufnahme der Bilder zu beschleunigen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die hier beschriebenen Verfahren parallelisiert werden. Dies kann durch eine sogenannte Multifokusanordnung geschehen, bei der mehrere Beleuchtungsstellen gleichzeitig auf dem abzubildenden Objekt beleuchtet werden. Dies kann einerseits dadurch geschehen, dass das Anregungslicht einer einzigen Lichtquelle, beispielsweise eines Lasers, in mehrere Anregungslichtstrahlen aufgeteilt wird. Alternativ oder zusätzlich ist es natürlich auch möglich, mehrere Lichtquellen vorzuhalten und auf diese Weise mehrere Anregungslichtstrahlen zu erzeugen. Jeder der so erzeugten Anregungslichtstrahlen wird nun rasternd über die Oberfläche des abzubildenden Objektes geführt. Die daraus entstehenden Emissionslichtstrahlen, die vom Objekt ausgesandt werden, werden den hier beschriebenen Verfahren entsprechend auf den optischen Sensor, beispielsweise die CCD-Kamera geleitet. Durch jeden der Anregungslichtstrahlen bzw. die von diesem Anregungslichtstrahl hervorgerufenen Emissionslichtstrahlen wird dabei ein Teilbild des abzubildenden Gegenstandes bzw. eines Bereichs des Gegenstandes auf dem optischen Sensor abgebildet.
• Dabei hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn durch jeden Anregungslichtstrahl ein separater Bereich auf der Oberfläche des abzubildenden Gegenstandes abgerastert bzw. rasternd beleuchtet wird, um zu verhindern, dass sich auf dem optischen Sensor die dadurch erzeugten Teilbilder überlappen.
• Dadurch, dass sich bei den hier beschriebenen Verfahren der Abstand zwischen den Teilbildern in einem größeren Maß vergrößert als der Abstand zwischen einzelnen Punkten innerhalb eines Teilbildes muss beim rasternden Beleuchten mit mehreren Anregungslichtstrahlen darauf geachtet werden, dass diese Beziehung auch für die Teilbilder, die von unterschiedlichen Emissionslichtstrahlen erzeugt werden, gilt. Dies kann auf unterschiedlichste Weisen geschehen. Eine Möglichkeit besteht beispielsweise darin, mit unterschiedlichen Anregungslichtstrahlen unterschiedliche Bereiche der abzulenkenden Oberfläche des Objektes rasternd zu beleuchten und die auf diese Weise erzeugten unterschiedlichen Emissionslichtstrahlen unterschiedlichen optischen Sensoren oder zumindest streng voneinander getrennten Bereichen eines optischen Sensors zuzuführen und die auf diese Weise in diesen unterschiedlichen Bereichen des Sensors entstehenden Teilbilder anschließend beispielsweise an einer Datenverarbeitungsanlage nachzubearbeiten und aneinander beispielsweise mit einem sogenannten „stitching“-Verfahren aneinander zu fügen. Auf diese Weise lassen sich auch großflächigere Objekte erfassen und/oder die Dauer der Aufnahme eines Bildes drastisch reduzieren. Der Anzahl der verwendeten Anregungslichtstrahlen ist dabei zumindest theoretisch keine Grenze gesetzt.
• Um auf elegante Weise zu verhindern, dass sich die einzelnen Teilbilder auf dem optischen Sensor überlappen, kann eine Lasersteuerung verwendet werden, die dafür sorgt, dass der Laser an geeigneter Stelle ausgeschaltet wird, so dass es bei einer bestimmten Raster-Position nicht zum Beleuchten des Objektes und damit auch nicht zum Erzeugen eines Teilbildes auf dem optischen Sensor kommt. Natürlich ist es auch möglich, nur einzelne oder einige der Anregungslichtstrahlen oder der daraus auf der zu beleuchtende Probe entstehenden Emissionslichtstrahlen beispielsweise durch eine sich schließende Blende oder auf andere Weise darin zu hindern, als Emissionslicht auf den optischen Sensor zu treffen. Auf diese Weise werden die Vorteile der Multifokusanwendung, die insbesondere in der beschleunigten Bildaufnahme liegen, voll verwirklicht, und gleichzeitig erreicht, dass ohne eine Nachbearbeitung bereits ein Rohbild auf dem optischen Sensor, insbesondere dem CCD-Sensor, entsteht, ohne dass für eine erste Begutachtung eine Nachbearbeitung nötig ist. Dies wird dadurch erreicht, dass die einzelnen Teilbilder, die aus Emissionslicht für jeden separaten Anregungslichtstrahl bestehen, exakt aneinander gesetzt werden können.
• Mit Hilfe der Zeichnungen wird nachfolgend ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung näher erläutert. Es zeigt
• 1 die schematische Darstellung einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
• 2 die schematische Darstellung einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
• 3 die schematische Darstellung einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
• 4 die schematische Darstellung von Raster-Teilbildern auf dem optischen Sensor,
• 5 die schematische Darstellung einer Mikroskopievorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
• 6 bis 8 schematische 3D-Darstellungen der in 5 schematischen dargestellten Mikroskopievorrichtung aus unterschiedlichen Blickwinkeln.
• 1 zeigt die schematische Darstellung einer Mikroskopievorrichtung 1 gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Durch eine Lichtquelle 2, die beispielsweise ein Laser sein kann, wird Anregungslicht 4 ausgesandt und durch einen Anregungsfilter 6 auf einen Strahlteiler 8 geleitet. Durch den Anregungsfilter 6, der optional vorgesehen sein kann, kann beispielsweise das von der Lichtquelle 2 ausgesandte Anregungslicht 4 so gefiltert werden, dass es nur noch eine einzige Anregungswellenlänge aufweist. Das Anregungslicht 4 passiert den Strahlteiler 8 und trifft auf eine Raster-Kippspiegelanordnung 10. Dort wird es umgeleitet und durch zwei Linsen 12 in eine hintere Fokalebene eines Objektivs 14 fokussiert. Das Objektiv 14 ist entlang der Strahlrichtung des Anregungslichtes 4 verschiebbar, so dass die Fokalebene relativ zum in Strahlrichtung hinter dem Objektiv 14 angeordneten, in 1 nicht dargestellten, zu beobachtenden Objekt verschoben werden kann. Auf diese Weise lassen sich Aufnahmen des Objektes in unterschiedlichen axialen Abständen aufnehmen.
• Von dem nicht gezeigten Objekt wird Emissionslicht ausgesandt, das den Strahlengang des Anregungslichtes 4 in umgekehrter Richtung durchläuft. Es trifft folglich auf die Raster-Kippspiegelanordnung 10 und wird hier entrastert („descannt“), wodurch die durch die Raster-Kippspiegelanordnung 10 erreichte Verkippung rückgängig gemacht wird. Das Emissionslicht 16 gelangt in den Strahlteiler 8 und wird hier so umgelenkt, dass es den Strahlengang des Anregungslichtes 4 verlässt und durch einen ggf. vorhandenen Emissisionsfilter 18 auf eine Fokuslinse 20 trifft, durch die es auf eine konfokale Blende 22 fokussiert wird. Durch die konfokale Blende 22 wird der Teil des Emissionslichtes 16 herausgefiltert, der nicht aus der Fokalebene des Objektives 14 stammt. Damit wird die axiale Auflösung des Mikroskops deutlich erhöht.
• Durch eine weitere Linse 12 gelangt das so gefilterte Emissionslicht 16 anschließend auf eine Umlenk-Kippspiegelanordnung 24, die das Emissionslicht 16 durch eine weitere Linse 12 auf den optischen Sensor 26 ablenkt. Die Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 und die Raster-Kippspiegelanordnung 10 werden vorteilhafter Weise parallel zueinander angesteuert, wobei der Betrag, um den die Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 verkippt wird, dem Betrag der Verkippung der Raster-Kippspiegelanordnung 10 entspricht, multipliziert mit dem Korrekturfaktor a. Dabei wird als Nullstellung die in 1 gezeigte 45°-Ablenkung angenommen. Letztendlich kann aber auch jede andere Ablenkung als Nullstellung angesetzt werden.
• Da es sich bei dem Emissionslicht 16, das auf die Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 fällt, um einen kollimierten Strahl handelt, führt eine beispielsweise Verdoppelung des Ablenkwinkels von der optischen Achse, also von der in 1 gezeigten Nullstellung (45°-Ablenkung) zu einer Verdoppelung des Abstandes des auf dem optischen Sensors 26 abgebildeten Bildes, so dass das gewünschte Kriterium erreicht wird. Das Verhältnis zwischen der Verkippung der Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 zu der der Raster-Kippspiegelanordnung 10 entspricht dabei vorteilhafter Weise genau dem Korrekturfaktor a.
• Vor dem Auftreffen auf dem optischen Sensor 26 durchläuft das abgelenkte Emissionslicht 16 vorteilhafterweise ein sogenanntes fΘ-Objektiv. Damit wird erreicht, dass das abgelenkte Emissionslicht 16 auf die Sensorebene des optischen Sensors 26 fokussiert wird. Abbildungsfehler, die ohne ein derartiges Objektiv durch die unterschiedlichen Weglängen, die das abgelenkte Emissionslicht 16 bei unterschiedlichen Winkeln von der Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 zum optischen Sensor 26 zurücklegen muss, hervorgerufen werden, werden auf diese Weise vermieden. Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, wenn ein sogenanntes telezentrisches fΘ-Objektiv verwendet wird. Dieses Objektiv sorgt dafür, dass das abgelenkte Emissionslicht 16 nicht nur in der Sensorebene des optischen Sensors 26 fokussiert ist, sondern gleichzeitig auch senkrecht auf den optischen Sensor 26 auftrifft. Die Verwendung von fΘ-Objektiven und insbesondere telezentrischen fΘ-Objektiven ist für alle hier beschriebenen Ausführungsformen von Vorteil.
• Wie bereits in 1 zu erkennen ist, kommt das System mit einer relativ geringen Anzahl von optischen Bauelementen aus, so dass die Herstellung und Anordnung kostengünstig erfolgen kann. Der optische Sensor 26 der beispielsweise eine CCD-Kamera sein kann, wird nach dem vollständigen rasternden Beleuchten des Objektes ausgelesen und das so ausgelesene Bild entspricht einem ISM-Rohbild.
• 2 zeigt eine weitere Ausführungsform einer Mikroskopievorrichtung 1 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Auch hier wird Anregungslicht 4 von einer Lichtquelle 2 zu einem Anregungsfilter 6 geleitet, bevor es dem Strahlteiler 8 zugeführt wird. Das Anregungslicht 4 passiert den Strahlteiler 8 geradlinig und wird über die Raster-Kippspiegelanordnung 10 und die entsprechenden Linsen 12 wie im in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel auf die hintere Fokalebene des Objektivs 14 geleitet. Im Unterschied zu der in 1 gezeigten Ausführungsform durchläuft das Anregungslicht 4 jedoch zwei weitere Strahlteiler 28, ohne jedoch von ihnen abgelenkt zu werden.
• Von dem in 2 ebenfalls nicht gezeigten Objekt wird Emissionslicht 16 ausgesandt, das vom ersten Strahlteiler 28, auf den es trifft, umgelenkt wird, so dass es auf ein Linsensystem 30 trifft, das insbesondere zwei System linsen 32 aufweist. Die Systemlinsen 32 bilden gemeinsam eine sogenannte 2f-Optik, die einen Ausbreitungswinkel des Emissionslichtes 16 relativ zur optischen Achse umkehrt. Über zwei Umlenkspiegel 34 wird lediglich die Richtung des Lichtes geändert.
• Der untere in 2 gezeigte Strahlteiler 28 koppelt das Emissionslicht 16 mit dem nun umgekehrten Winkel relativ zur optischen Achse wieder in den Strahlengang des Anregungslichtes 4 ein, so dass es auf die Raster-Kippspiegelanordnung 10 trifft. Anders als im in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel wird das Emissionslicht 4 hier jedoch nicht entrastert, sondern der Ablenkwinkel des Emissionslichtes relativ zur optischen Achse des Systems wird durch das nochmalige Ablenken durch die Raster-Kippspiegelanordnung 10 verdoppelt.
• Das so abgelenkte Emissionslicht 16 gelangt in den Strahlteiler 8 und wird von diesem abgelenkt. Durch einen Emissionsfilter 18 und eine weitere Linse 12 wird das Emissionslicht 16 nun auf einen optischen Sensor 26 geleitet. Wie im in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel wird folglich auch im in 2 gezeigten Beispiel der Verkippungswinkel des Emissionslichtes 16 relativ zur optischen Achse des Systems gegenüber dem Verkippungswinkel des Anregungslichtes 4 verdoppelt bzw. je nach Bedarf mit dem Korrekturfaktor a multipliziert. Dies wird in dem in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel durch eine geschickte Wahl der Systemlinsen 32 erreicht. Während im in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel eine konfokale Mikroskopanordnung dargestellt ist, kommt die in 2 gezeigte Ausführungsform ohne Fokuslinse und konfokale Blende aus.
• Eine Umlenkeinrichtung für eine Mikroskopievorrichtung 1 gemäß einem der beiden Ausführungsbeispiele umfasst dabei insbesondere den Teil, der für eine Umlenkung bzw. Ablenkung des Emissionslichtes 16 relativ zum Anregungslicht 4 sorgt. Bei einer Ausführungsform gemäß 1 könnte eine derartige Umlenkeinrichtung beispielsweise die Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 und ggf. eine elektrische Steuerung umfassen, die eingerichtet ist, verfahrensgemäß die Kippspiegelanordnung 24 anzusteuern. Bei einer Ausführungsform gemäß 2 ist es ausreichend, wenn die Umlenkeinrichtung die beiden Strahlteiler 28 sowie das Linsensystem 30 und ggf. die Umlenkspiegel 34 umfasst. Derartige Umlenkeinrichtungen können in bestehende Mikroskopievorrichtungen eingebaut und diese somit nachgerüstet werden.
• 3 zeigt eine weitere schematische Darstellung einer Mikroskopievorrichtung 1 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Das von der Lichtquelle 2 ausgesandte Anregungslicht 4 durchläuft den Anregungsfilter 6 und wird von der Raster-Kippspiegelanordnung 10 umgelenkt. Nachdem es die Linsen 12 und den Strahlteiler 28 durchlaufen hat, wird es vom Objektiv 14 auf das in 3 nicht gezeigte abzubildende Objekt gelenkt. Das vom Objekt ausgesandte Emissionslicht 16 durchläuft wieder einen Teil des Strahlengangs des Anregungslichtes 4 in umgekehrter Richtung, wird jedoch im in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel wie in der in 2 gezeigten Anordnung durch den Strahlteiler 28 aus dem Strahlengang des Anregungslichtes 4 entfernt und durchläuft das aus den beiden Systemlinsen 32 bestehende Linsensystem 30. Wie im in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel handelt es sich bei dem Linsensystem 30 um eine 2f-Optik, so dass auch hier der Ausbreitungswinkel des Emissionslichtes 16 relativ zur optischen Achse umgekehrt wird. Wie auch im in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel kann durch geschickte Wahl der Systemlinsen 32 auch eine nicht vollständige Umkehrung dieses Winkels erreicht werden, wodurch Korrekturfaktoren a realisiert werden können, die ungleich dem Wert 2 sind.
• Im in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel wird das so abgelenkte Emissionslicht 16 jedoch nicht wieder in den Strahlengang des Anregungslichtes 4 eingekoppelt, sondern trifft direkt auf die Umlenk-Kippspiegelanordnung 24, die in diesem Fall synchron mit der Raster-Kippspiegelanordnung 10 angesteuert wird. Anschließend durchläuft es den Emissionsfilter 18 und eine weitere Linse 12, bevor es auf den optischen Sensor 26 trifft. Im Vergleich zu der in 2 gezeigten Ausführungsform verfügt die in 3 gezeigte Ausgestaltung über den Vorteil, dass insbesondere für den Fall, dass das Anregungslicht 4 und das Emissionslicht 16 über unterschiedliche Wellenlängen verfügen, die unterschiedlichen durchlaufenden Linsen und Kippspiegelanordnungen 10, 24 auf die jeweilige Wellenlänge optimiert ausgewählt und ausgebildet sein können. Nachteilig im Vergleich zu der in 2 gezeigten Ausführungsform ist jedoch, dass die beiden Kipp-Spiegelanordnungen 10, 24 synchron zueinander angesteuert und verkippt werden müssen, um eine optimale Abbildung auf dem optischen Sensor 26 zu erreichen. Bei der in 2 gezeigten Ausführungsform wird dies automatisch dadurch erreicht, dass sowohl das Anregungslicht 4 als auch das Emissionslicht 16 die gleiche Kipp-Spiegelanordnung 10 durchlaufen.
• Die verschiedenen Linsen 12, 32 sind in den hier dargestellten Ausführungsformen als einfache Konvexlinsen dargestellt. Natürlich handelt es sich dabei um eine vereinfachte Darstellung. Um Abbildungsfehler, Koma, etc. ausgleichen zu können, können hier insbesondere speziell auf die jeweilige Wellenlänge des Anregungslichtes 4 bzw. des Emissionslichtes 16 angepasste Spezialoptiken verwendet werden.
• 4 zeigt schematisch, wie Beleuchtungsstellen 36 auf dem zu beobachtenden Objekt angeordnet werden können. Dies ist im oberen Bereich der 4 dargestellt. Man erkennt, dass die Beleuchtungsstellen 36 kreisförmige Beleuchtungsflecken sind, die einander überlappen und auf einem Quadratgitter mit einem festgelegten Abstand zueinander angeordnet sind. Herkömmlicherweise würde man zum Abbilden des aus diesem Beleuchtungsstellen 36 emitierten Emissionslichtes 16 die entsprechenden Raster-Teilbilder in analoger Weise lediglich vergrößert auf dem optischen Sensor 26 anordnen. Auch die Raster-Teilbilder 38 müssten sich daher auf dem optischen Sensor 26 überlappen. Dies ist bei einem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch nicht zwangsläufig der Fall, wie im unteren Bereich der 4 dargestellt ist. Man erkennt, dass die Raster-Teilbilder 38 die gleiche Anordnung wie die Beleuchtungsstellen 36 aufweisen. Auch die Raster-Teilbilder 38 sind auf einem Quadratgitter zueinander angeordnet. Allerdings sind die Bildabstände zwischen den Mittelpunkten der Raster-Teilbilder 38, den sogenannten Bildpositionen, mit dem Korrekturfaktor a multipliziert worden, der größer ist als 1. Daher wird in diesem gezeigten Ausführungsbeispiel erreicht, dass die Raster-Teilbilder 38 einander nicht überlappen. Durch die geschickte Wahl des Korrekturfaktors a wird erreicht, dass ein auf diese Weise mit dem optischen Sensor 26 aufgenommenes Gesamtbild, das sich aus allen Rasterteilbildern 38 gemeinsam zusammensetzt, bereits das ISM-Rohbild ist, das anschließend in aus dem Stand der Technik bekannter Weise numerisch nachbearbeitet werden kann.
• Entscheidend dabei ist, dass zwar der Abstand zwischen den Raster-Teilbildern 38 über die gewünschte Vergrößerung hinaus vergrößert wird, die einzelnen Raster-Teilbilder 38 jedoch nicht nochmals mit dem Korrekturfaktor a skaliert werden. Jedes Raster-Teilbild 38 entspricht folglich dem aus der entsprechenden Beleuchtungsstelle 36 emittierten Emissionslicht 16, das um die gewünschte Vergrößerung vergrößert dargestellt wird.
• 5 zeigt schematisch eine Mikroskopievorrichtung 1 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Über den bereits in den 1 bis 3 dargestellten Vorrichtungen wird Anregungslicht 4 von der Lichtquelle 2 durch einen Anregungsfilter 6 geleitet und tritt durch den ersten Strahlteiler 8, bevor es auf die Raster-Kippspiegelanordnung 10 trifft. Von dort durchläuft es unbeeinflusst einen weiteren Strahlteiler 8, die beiden Linsen 12 für den Beleuchtungsstrahlengang sowie einen dritten Strahlteiler 8, von dem es ebenfalls nicht beeinflusst wird. Es trifft anschließend auf das Objektiv 14 und von dort auf das auch in 5 nicht gezeigte Objekt.
• Emissionslicht 16 tritt durch das Objektiv 14 in die Vorrichtung ein und wird durch den Strahlteiler 8 aus dem Pfad des Anregungslichtes 4 abgelenkt. Es trifft auf den Umlenkspiegel 34 und durchläuft die beiden Linsen 12 für den Emissionsstrahlengang, die auf das Emissionslicht 16 den gleichen Effekt haben wie die beiden vom Anregungslicht 4 durchlaufenden Linsen 12. Die Brennweiten der Linsen 12 des Emissionsstrahlenganges können sich dabei von den Brennweiten der Linsen 12 für den Beleuchtungsstrahlengang unterscheiden. Durch eine geeignete Wahl der Brennweiten kann dabei ein Korrekturfaktor a ungleich 2 eingestellt werden. Allerdings sind die vom Emissionslicht 16 durchlaufenden Linsen 12 auf die Emissionswellenlänge abgestimmt und optimiert. Das Emissionslicht 16 trifft anschließend wieder auf den ersten Strahlteiler 8 und wird vom diesem wieder in den Strahlengang des Anregungslichtes 4 eingekoppelt. Es trifft folglich erneut auf die Raster-Kippspiegelanordnung 10 und wird anders als beispielsweise im in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel erneut um einen Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse des Systems heraus abgelenkt. Beim nächsten Strahlteiler 8, der vom Emissionslicht 16 und vom Anregungslicht 4 durchlaufen wird, wird das Emissionslicht 16 erneut aus dem Strahlengang des Anregungslichtes entfernt und dem Emissionsfilter 18, einer weiteren Linse 12 und anschließend dem optischen Sensor 26 zugeführt.
• Der Vorteil dieser Ausgestaltung liegt darin, dass sowohl das Emissionslicht 16 als auch das Anregungslicht 4 die Raster-Kippspiegelanordnung 10 der Rastereinrichtung in der gleichen Richtung, bevorzugt sogar entlang des gleichen Lichtpfades, durchlaufen und somit auf besonders einfache Weise das Emissionslicht 16 dem doppelten Raster-Kippwinkel unterworfen wird wie das Anregungslicht 4. Es ist daher nicht nötig, komplizierte Linsensysteme aufzubauen, wie dies beispielsweise im in 2 gezeigten Ausführungsbeispiel der Fall ist oder einen zusätzlichen Scanner in Form einer Umlenk-Kippspiegelanordnung 24 vorzusehen, der synchron und parallel mit der Raster-Kippspiegelanordnung 10 betrieben werden muss.
• Die 6 bis 8 zeigen technische Zeichnungen einer konkreten Ausgestaltung auf Basis der in 5 schematisch vereinfacht dargestellten Vorrichtung in unterschiedlichen Blickwinkeln. Anregungslicht 4, das insbesondere kollimiertes Laserlicht ist, tritt durch den Eingang 40 in die Mikroskopievorrichtung 1 ein. In der in 6 gezeigten Ansicht wird es zunächst von einem nicht dargestellten Strahlteiler 8 nach unten auf einen Scanner 42 umgelenkt, in dem sich die Raster-Kippspiegelanordnung 10 befindet. Nachdem das Anregungslicht 4 an der Raster-Kippspiegelanordnung 10 beispielsweise um einen Winkel α aus der optischen Achse heraus umgelenkt wurde, tritt es durch den Strahlteiler 8 und wird über einen Umlenkspiegel 34 einem weiteren Strahlteiler 8 zugeführt. Dieser ist in 6 oben dargestellt und lenkt das ankommende Anregungslicht 4 in 6 nach rechts um, wo sich ein erster Ausgang 44 befindet. Vor und hinter dem Umlenkspiegel 34 befindet sich jeweils eine Relay-Linse 50, die den Ablenkwinkel a invertieren. Der Pivot-Punkt der Strahlablenkung wird in die Arbeitsebene einer Scan-Linse 52 abgebildet, die Teil der Strahlführung 46 ist. Der von dieser Scan-Linse 52 erzeugte Focus wird von einer Tubus-Linse 54 rekollimiert und über den bereits genannten weiteren Strahlteiler 8 dem Ausgang 44 zugeleitet. An diesem kann sich ein in 6 nicht gezeigtes Objektiv 14 befinden, durch dass das Anregungslicht 4 auf ein ebenfalls nicht dargestelltes Objekt geführt wird. Vorzugsweise handelt es sich bei den Strahlteilern 8 um dichroitische Spiegel.
• Durch den ersten Ausgang 44 tritt anschließend Emissionslicht 16 in die gezeigte Vorrichtung ein und durchläuft den Strahlteiler 8 ohne abgelenkt zu werden. Dabei wird ein Teil des Emissionslichtes 16 von dem Objektiv derart kollimiert, dass die Achse des Emissionslichtes 16 mit der des Anregungslichtes 4 identisch ist. Bei den Strahlteilern 8 handelt es sich insbesondere um dichroitische Strahlteiler, die immer dann sinnvoll sind, wenn das Anregungslicht 4 und das Emissionslicht 16 unterschiedliche Wellenlängen aufweisen. Das Emissionslicht 16 trifft auf einen weiteren Umlenkspiegel 34 und wird durch eine zweite Tubus-Linse 56 geleitet. Der dabei entstehende Fokus wird über ein Paar Umlenkspiegel 34 derart auf die optische Achse des Scanners 42, der beispielsweise ein Galvo-Scanner sein kann, gespiegelt, dass die Strahlachse und die optische Achse des Scanners 42 für einen Ablenkwinkel a = 0 identisch sind. Eine zweite Scan-Linse 58 kollimiert den Strahl und lenkt ihn in einem Winkel -β auf den Scanner 42. Das Emissionslicht 16 erhält durch den Scanner 42 eine weitere Ablenkung um den Winkel α und verlässt den Scanner 42 folglich unter einem Winkel von γ = α + β. Dieses abgelenkte Emissionslicht wird von dem Strahlteiler 8 auf eine dritte Tubus-Linse 60 gelenkt, die auf dem optischen Sensor 26 den Bildpunkt aufnimmt.
• Das Emissionslicht 16 wird im gezeigten Ausführungsbeispiel folglich nach unten, also senkrecht zur Zeichenebene abgelenkt und trifft dort auf den schematisch dargestellten optischen Sensor 26, der beispielsweise eine kommerziell erhältliche Kamera sein kann. 8 zeigt die Darstellung aus 6 um 90° gekippt. Man erkennt den Eingang 40, durch den Anregungslicht 4 in die Vorrichtung eintritt.
• In 7 wird dieses Anregungslicht 4 nach unten in Richtung auf den Scanner 42 umgelenkt bevor es den Kippspiegel 34 und der weiteren Strahlführung 46 zugeführt wird. Aus dieser tritt es aus und wird auf eine nicht gezeigten Strahlteiler 8 geleitet, von dem es nach oben aus der Zeichnungsebene heraus abgelenkt wird. In der in 7 dargestellten Ansicht ist folglich die Blickrichtung in den ersten Ausgang 44 hinein gezeigt. Man erkennt zudem den unterhalb dieses Eingangs 44 liegenden Umlenkspiegel 34, durch den das Emissionslicht 16, das durch den ersten Ausgang 44 in die Vorrichtung eintritt, umgeleitet wird. Auch dieses Emissionslicht 16 wird dem Scanner 42 zugeführt und verlässt die Umlenkeinrichtung durch den in 6 nicht dargestellten zweiten Ausgang 48, der in 6 nach unten aus der Zeichenebene heraus verläuft. Durch diesen zweiten Ausgang 48 gelangt das Emissionslicht auf die Kamera bzw. den optischen Sensor 26.
• 8 zeigt eine Schrägdarstellung der in den 6 und 7 gezeigten Vorrichtung. In den 6 bis 8 ist weder eine Lichtquelle 2 noch ein Objektiv 14 dargestellt. Die Umlenkeinrichtung selbst umfasst dabei alle in 6 bis 8 dargestellten Elemente mit Ausnahme des optischen Sensors 26. Mit einer derartigen Umlenkeinrichtung lassen sich bestehende Mikroskope leicht umrüsten, so dass sie von der erfindungsgemäßen Idee Gebrauch machen können.
• Die in den 6 bis 8 gezeigte Anordnung weist eine Reihe von Vorteilen auf. Durch die Entkopplung des Strahlengangs für das Anregungslicht 4 und das Emissionslicht 16 wird eine einfache und unabhängige Justage der Anordnung ermöglicht. Die Justage für das Anregungslicht 4 kann optimiert werden, indem beispielsweise zunächst eine unabhängige Detektion eines Fluoreszenzsignals, beispielsweise mit Hilfe eines non-descanned Detektors genutzt wird. Da dieser Teil der Anordnung ausschließlich für Anregungslicht 4 genutzt wird, müssen in diesem Fall keine Abstriche für eine Detektion dieses Lichtes gemacht werden. Im zweiten Schritt kann die Feinjustage des Detektionsstrahlengangs, durch den das Emissionslicht 16 geführt wird, erfolgen. Durch die beiden Umlenkspiegel 34 kann auf einfache Weise die Bildlage auf dem optischen Sensor 26 optimiert werden. Unabhängig davon kann die Kollimation des Emissionslichtes 16 durch Verschieben der zweiten Scan-Linse 58 relativ zur zweiten Tubus-Linse 56 optimiert werden.
• Der separat geführte Strahlengang für das Emissionslicht 16 kann zudem auf die spektralen Eigenschaften des Emissionslichtes 16, die insbesondere von der Fluoreszenz und der Probe abhängen, optimiert werden. Dieser Vorteil ist insbesondere bei einer 2-Photonenanregung von besonderer Wichtigkeit, da optische Bauteile, die für den sichtbaren Spektralbereich und den nahen Infrarot-Spektralbereich gleichermaßen optimiert sind, nicht verfügbar sind. Die gezeigte Ausführungsform liefert folglich neben der vereinfachten Handhabung und Justage eine deutlich bessere Performance.
• Hinzukommt, dass die gesamte gezeigte Anordnung als Umlenkeinrichtung in bereits bestehende Mikroskope integriert bzw. an entsprechende Mikroskope angebracht werden kann. Eine prinzipielle Einschränkung hinsichtlich der Kompatibilität zu bestimmten Herstellern besteht nicht. Ferner werden durch die Umlenkeinrichtung bei geeigneter Integration auch die sonstigen Funktionen eines genutzten Mikroskops nicht beschränkt.
• Bezugszeichenliste

1

Mikroskopievorrichtung

2

Lichtquelle

4

Anregungslicht

6

Anregungsfilter

8

Strahlteiler

10

Raster-Kippspiegelanordnung

12

Linse

14

Objektiv

16

Emissionslicht

18

Emissionsfilter

20

Fokuslinse

22

konfokale Blende

24

Umlenk-Kippspiegelanordnung

26

optischer Sensor

28

Strahlteiler

30

Linsensystem

32

System linse

34

Umlenkspiegel

36

Beleuchtungsstelle

38

Raster-Teilbild

40

Eingang

42

Scanner

44

erster Ausgang

46

Strahlführung

48

zweiter Ausgang

50

Relay-Linse

52

Scan-Linse

54

Tubus-Linse

56

zweite Tubus-Linse

58

zweite Scan-Linse

60

dritte Tubus-Linse

Claims (14)

1. Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes zumindest eines Teiles eines Objektes, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a. Aussenden von Anregungslicht (4) einer Anregungswellenlänge λ_ex durch eine Lichtquelle (2), b. rasterndes Beleuchten einer Mehrzahl von Beleuchtungsstellen (36) an dem Objekt mit dem Anregungslicht (4), die eine vorbestimmte Anordnung mit vorbestimmten Abständen zueinander aufweisen, c. Detektieren eines Raster-Teilbildes (38) einer vorbestimmten Vergrößerung für jede beleuchtete Beleuchtungsstelle (36) durch Lenken von Emissionslicht (16) einer Emissionswellenlänge λ_em auf einen optischen Sensor (26), das von dem Objekt als Reaktion auf die Beleuchtung mit dem Anregungslicht (4) an der jeweiligen Beleuchtungsstelle (36) emittiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass Bildpositionen, an denen Mittelpunkte der Raster-Teilbilder (38) auf dem optischen Sensor (26) detektiert werden, der Anordnung der entsprechenden Beleuchtungsstellen (36) auf dem Objekt entsprechen, wobei Bildabstände zwischen Bildpositionen jeweils zweier Raster-Teilbilder (38) den Abständen der entsprechenden Beleuchtungsstellen (36) multipliziert mit der vorbestimmten Vergrößerung und mit einem Korrekturfaktor a entsprechen, wobei der Korrekturfaktor a größer ist als 1, wobei das Anregungslicht (4) durch eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung (10) für das rasternde Beleuchten umgelenkt wird, wobei das Anregungslicht (4) um einen Raster-Kippwinkel aus einer optischen Achse heraus abgelenkt wird, und wobei das Emissionslicht (16) derart auf die Raster-Kippspiegelanordnung (10) gelenkt wird, dass es nach der Reflexion an der Raster-Kippspiegelanordnung (10) um einen mit dem Korrekturfaktor a multiplizierten Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungswellenlänge Aex und die Emissionswellenlänge Aem gleich sind und der Korrekturfaktor a gleich 2 ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungswellenlänge Aex und die Emissionswellenlänge Aem voneinander verschieden sind und sich der Korrekturfaktor a berechnet zu $$\text{a}=\underset{{\mathrm{\lambda }}_{\text{em}}{}^2}{\overset{{\mathrm{\lambda }}_{\text{em}}{}^2+{\mathrm{\lambda }}_{\text{ex}}{}^2}{{\displaystyle \cdots \cdots \cdots \cdots }}}.$$

   
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass Emissionslicht (16) einen Teil eines Strahlenganges, den das Anregungslicht (4) zurücklegt, in umgekehrter Richtung zurücklegt und dann durch einen Strahlteiler (8, 28) geführt wird, wodurch das Emissionslicht (16) den Strahlengang des Anregungslichtes (4) verlässt.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Emissionslicht (16) durch eine Umlenkeinrichtung mit einer Umlenk-Kippspiegelanordnung (24) umgelenkt wird, wobei jedem Raster-Teilbild (38) ein konstanter Umlenk-Kippwinkel zugeordnet ist, und das Anregungslicht (4) durch eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung (10) für das rasternde Beleuchten umgelenkt wird, wobei jeder Beleuchtungsstelle (36) ein Raster-Kippwinkel zugeordnet ist und wobei eine Differenz zweier Umlenk-Kippwinkel für zwei unterschiedliche Raster-Teilbilder (38) der Differenz der Raster-Kippwinkel für die entsprechenden Beleuchtungsstellen (36) multipliziert mit dem Korrekturfaktor a entspricht.
6. Mikroskopievorrichtung (1) zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Lichtquelle (2) zum Aussenden von Anregungslicht (4), eine Rastereinrichtung mit einer Raster-Kippspiegelanordnung (10) zum rasternden Beleuchten der Mehrzahl der Beleuchtungsstellen (36), einen optischen Sensor (26) und eine Umlenkeinrichtung zum Umlenken des Emissionslichtes (16), wobei die Raster-Kippspiegelanordnung (10) derart angeordnet und eingerichtet ist, dass auf sie gelenktes Licht nach der Reflexion an der Raster-Kippspiegelanordnung (10) um einen mit dem Korrekturfaktor a multiplizierten Raster-Kippwinkel aus der optischen Achse heraus abgelenkt ist.
7. Mikroskopievorrichtung (1) nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch einen Strahlteiler (8, 28), der derart angeordnet und eingerichtet ist, dass das Anregungslicht (4) und das Emissionslicht (16) in unterschiedlichen Richtungen durch den Strahlteiler (8, 28) geführt werden und dass das Emissionslicht (16) zu der Umlenkeinrichtung gelenkt wird.
8. Mikroskopievorrichtung (1) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (8, 28) ein dichroitischer Strahlteiler (8, 28) ist.
9. Mikroskopievorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Umlenkeinrichtung und die Rastereinrichtung jeweils eine Kipp-Spiegelanordnung (10, 24) aufweisen.
10. Mikroskopievorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Umlenkeinrichtung eine Linsenanordnung (30) aufweist, die eine 2f-Optik bildet.
11. Mikroskopievorrichtung (1) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Linsenanordnung (30) derart angeordnet ist, dass das Emissionslicht (16) nach dem Durchlaufen der Linsenanordnung (30) auf einen zweiten Strahlteiler (28) trifft, durch den es wieder in den Strahlengang des Anregungslichtes (4) eingekoppelt wird, so dass es danach auf die Rastereinrichtung trifft.
12. Umlenkeinrichtung für eine Mikroskopievorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 6 bis 11.
13. Umlenkeinrichtung, die eingerichtet ist, durch einen Eingang einfallendes Anregungslicht (4) einer Rastereinrichtung zuzuführen, an der Rastereinrichtung abgelenktes Licht einem ersten Ausgang zuzuführen und durch den ersten Ausgang einfallendes Emissionslicht (16) der Rastereinrichtung derart zuzuführen, dass es von der Rastereinrichtung in die gleiche Richtung aus der optischen Achse heraus abgelenkt wird, wie das Anregungslicht (4).
14. Umlenkeinrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie eingerichtet ist, von der Rastereinrichtung abgelenktes Emissionslicht (16) einem von dem ersten Ausgang verschiedenen zweiten Ausgang zuzuführen.

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