DE10206004A1

DE10206004A1 - Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse

Info

Publication number: DE10206004A1
Application number: DE2002106004
Authority: DE
Inventors: Norbert Czarnetzki
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2002-02-14
Filing date: 2002-02-14
Publication date: 2003-08-28
Also published as: WO2003069391A1

Abstract

Eine Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse umfaßt einen Objekttisch (1), der zur optischen Abtastung eines Objekts in einer X-Y-Ebene bewegbar ist, eine Beleuchtungseinrichtung (2) zur Beleuchtung des Objekts, eine zwischen dem Objekttisch (1) und der Beleuchtungseinrichtung (2) angeordnete Beleuchtungsoptik mit einem ersten Array (10) aus einer Vielzahl von optischen Mikroelementen (7) zur Erzeugung eines Rasters aus einer Vielzahl von Beleuchtungspunkten an dem zu untersuchenden Objekt und eine Empfangseinrichtung (12) mit einer Vielzahl von Empfängerzellen (13) zur Aufnahme des von dem Objekt nach Wechselwirkung abgegebenen Lichts in Zuordnung zu den einzelnen Beleuchtungspunkten. Der Empfangseinrichtung (12) ist ein zweites Array (14) aus rasterförmig angeordneten optischen Mikroelementen (15) zugeordnet, welche das an dem Objekt reflektierte Licht auf die Empfängerzellen (13) richten. Die Vorrichtung ermöglicht die Erfassung großer Objektfelder bei Optimierung der Seiten- und Tiefenauflösung. Sie eignet sich insbesondere zur Analyse fluoreszierender Substanzen, wobei eine Vielzahl von Proben gleichzeitig untersucht werden können.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse, umfassend einen Objekttisch zur Aufnahme eines zu untersuchenden Objekts, der zur optischen Abtastung des Objekts in einer X-Y-Ebene bewegbar ist, eine Beleuchtungseinrichtung mit einer oder mehreren Lichtquellen zur Beleuchtung eines an dem Objekttisch anordenbaren Objektes, eine zwischen der Beleuchtungseinrichtung und dem Objekttisch angeordnete Beleuchtungsoptik mit einem Array aus einer Vielzahl von rasterförmig angeordneten, optisch - nämlich refraktiv, diffraktiv und/oder reflektiv - wirksamen Mikroelementen zur Erzeugung eines Rasters aus einer Vielzahl von Beleuchtungspunkten an dem zu untersuchenden Objekt, und eine Empfangseinrichtung mit einer Vielzahl von Empfängerzellen zur Aufnahme des von dem Objekt zurück kommenden Lichts in individueller Zuordnung zu den einzelnen Beleuchtungspunkten.

Eine derartige Vorrichtung ist aus DE 40 35 799 C2 bekannt. Mit der dort beschriebenen Vorrichtung können in relativ kurzer Zeit Oberflächenprofile eines mikroskopisch zu untersuchenden Objektes aufgenommen werden. Dazu wird das Objekt mit rasterförmig angeordneten Lichtpunkten beleuchtet. Die Lichtpunktstruktur ist durch eine im Beleuchtungsstrahlengang vorgesehene Blende mit einer Vielzahl von rasterförmig angeordneten Öffnungen vorgegeben. Das Beleuchtungsraster wird mit einem Rastermaß auf eine Empfangseinrichtung, nämlich einen CCD-Empfänger abgebildet, das dem Rastermaß der lichtempfindlichen Bereiche des CCD- Empfängers entspricht oder ein ganzzahliges Vielfaches davon ist.

Weiterhin offenbart die DE 40 35 799 C2 die Möglichkeit, das Beleuchtungsraster mittels eines Arrays aus einer Vielzahl von Linsen zu erzeugen, welches durch hinreichend gute Abbildungseigenschaften von einer nahezu punktförmigen Lichtquelle kleine Lichtpunkte erzeugt.

Zur Erzielung einer hohen Lichtausbeute ist bei dieser Vorrichtung jedoch eine sehr genaue Abstimmung des Linsenarrays in bezug auf die Positionen der Empfängerzellen der Empfangseinrichtung notwendig, was unerwünschte Einschränkungen der Gestaltungsfreiheit zur Folge hat.

Von diesem Stand der Technik ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art weiter zu verbessern. Insbesondere soll eine Vorrichtung für schnelle Analyseverfahren zur Verfügung gestellt werden, bei der einerseits eine hohe Effizienz der Beleuchtung zu gewährleisten ist, andererseits mit einer differenzierten Transformation der Bildinformationen von dem zu untersuchenden Objekt in eine Bildebene eine Auswertung mit elektronischen Methoden möglich ist.

Erfindungsgemäß ist bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art der Empfangseinrichtung ein zweites Array aus einer Vielzahl von rasterförmig angeordneten optischen Mikroelementen zugeordnet, welche das von den Beleuchtungspunkten an dem Objekt zurück kommende Licht auf die Empfängerzellen der Empfangseinrichtung richten.

Durch eine Verschiebung des Objekttisches und damit eines auf den Objekttisch aufgelegten Objektes wird dieses bei feststehender Beleuchtungsoptik zeilenförmig abgescannt. Die während eines Scannvorgangs synchron zur Bewegung des Objekttisches an den Empfängerzeiten der Empfangseinrichtung einzeln ausgelesenen Bildinformationen können auf elektronischem Wege zu einem Gesamtbild zusammengesetzt werden. Eine Bewegung der Arrays ist hierbei nicht erforderlich. Vielmehr bleiben diese während eines Scannvorgangs stationär.

In diesem Zusammenhang ist es vorteilhaft, die optischen Mikroelemente des ersten Arrays rhombisch anzuordnen. Entsprechendes gilt für die Mikroelemente des zweiten Arrays. Bei einer Verschiebung des zu untersuchenden Objektes wird so ein kontinuierliches Führen der konfokalen Lichtbündel über das Objekt erreicht und ein komplettes Bild des zu untersuchenden Objektes nach einem bestimmten Verschiebeweg aufgebaut.

Die rhombische Anordnung der optischen Mikroelemente begünstigt überdies eine hohe Lichtausbeute bei der Beleuchtung. Vorzugsweise beträgt der Anteil der optischen Mikroelemente an der Fläche des jeweiligen Arrays 80% oder mehr.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung ist die Empfangseinrichtung eine Flächenkamera oder Zeilenkamera, wobei der Objekttisch synchron zur Auslesung der Empfangseinrichtung bewegbar ist. Bei größeren Beobachtungsobjekten wird vorzugsweise eine Flächenkamera in Form einer strukturierten TDI-Kamera (TDI: Time Delayed Integration) verwendet, deren Zeilenabtastrate mit der Verfahrgeschwindigkeit des Objekttisches abgestimmt wird und die dann ein kontinuierliches, digitalisiertes Bild des zu untersuchenden Objektes aus einer Vielzahl von Teilbildern bzw. Einzelzeilen liefert. Die hohe Sensitivität von TDI-Kameras erlaubt es, über die Anzahl der Integrationslevel die Belichtungszeit für die einzelnen Bildpunkte zu vergrößern, womit sich auch lichtschwache (fluoreszierende) Objektpunkte nachweisen lassen.

Die optischen Mikroelemente des ersten Arrays können beispielsweise als sphärische oder asphärische Mikrospiegel ausgebildet werden. Hierdurch läßt sich insbesondere eine farbrichtige Abbildung der Lichtquelle(n) (z. B. mehrere Laser) gewährleisten. Überdies ist der sphärische Abbildungsfehler bei nicht so großen Öffnungen der Beleuchtungsstrahlenbündel im Vergleich zu refraktiven Mikroelementen gleicher Brechkraft geringer. Ein für Abbildungen mit geformten Mikrospiegeln vorteilhafter senkrechter Einfall der Beleuchtungsstrahlenbündel läßt sich beispielsweise durch geeignete polarisationsoptische oder dichroitische Teilerelemente erreichen.

Bei der Verwendung von unpolarisierten Weißlichtquellen in der Beleuchtungseinrichtung wird vorzugsweise ein Polarisator vorgesehen, um die Wirkung eines polarisationsoptischen Teilerelements nutzbar zu machen. Es ist jedoch auch möglich, als Lichtquelle in der Beleuchtungseinrichtung einen oder mehrere Laser zu verwenden, bei denen eine intrinsische lineare Polarisierung ohne zusätzlichen Verlust an Lichtleistung möglich ist. Die Einkopplung des Laserlichts in den Beleuchtungsstrahlengang erfolgt bevorzugt über polarisationserhaltende Lichtleitfasern.

Bei einer Verwendung von asphärischen Mikrospiegeln wird beleuchtungsseitig vorzugsweise so dimensioniert, daß die Beleuchtungspunkte an dem Objekt die Größe der aufzulösenden Objektstrukturen an demselben nicht überschreiten und die Beleuchtungskegel die bildseitig aufnehmbare Apertur der optischen Mikroelemente des zweiten Arrays jeweils ausleuchtet.

Der freie Durchmesser der Mikrospiegel wird vor allem den Bedürfnissen einer hohen Flächenabdeckung angepaßt, wobei der Abstand zwischen den Mikrospiegeln jedoch den Anforderungen an die Konfokalität Rechnung tragen muß. Das Verhältnis der Spiegeldurchmesser zum mittleren Krümmungsradius ist für die praktisch interessanten Anwendungsfälle sehr klein, so daß die Abbildung über die Spiegel im paraaxialen Raum stattfindet.

Anstelle von reflektiven Mikroelementen können selbstverständlich auch refraktive oder diffraktive Mikroelemente eingesetzt werden, wobei diese vorzugsweise für mehrere Wellenlängen (Fluoreszenz-Anregung) optimiert sind. Dazu sind auch holographische Mikroelemente zu rechnen.

Für Anordnungen mit refraktiven Arrays aus Einzellinsen gelingt eine farbliche Korrektur für die Abbildung von Lichtquellen in die Bildebene für zwei Wellenlängen durch Berücksichtigung von dispersiven Eigenschaften des Linsenmaterials sowie diffraktive Effekte der Linsenränder.

Weiterhin ist es möglich, zwischen dem ersten Array und dem Objekttisch ein Pinholearray vorzusehen, das eine Vielzahl von rasterförmig angeordneten Pinholes aufweist. Das Raster der Pinholes entspricht dabei dem Raster der Mikroelemente des ersten Arrays und ist dazu konjugiert. Durch das Pinholearray lassen sich vor allem Falschlichteinflüsse gering halten.

Alternativ oder ergänzend können die neutralen, optisch unwirksamen Zonen zwischen den Mikroelementen geschwärzt oder aus lichtabsorbierendem Material ausgebildet sein, um Reflexionen zu vermeiden und einen Beleuchtungshintergrund zu unterbinden. Bei rhombischer Grundform der Mikroelemente läßt sich sogar ein Beleuchtungsgrad von nahe 100% erreichen.

Zur Trennung der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlenbündel werden beispielsweise Polarisationsteiler oder auch dichroitische Teiler in Form von vorzugsweise optischen Würfeln vorgesehen. In Verbindung mit Polarisationsteilern ermöglicht eine λ/4-Platte in Beleuchtungsrichtung eine gute Trennung von Beleuchtungs- und Abbildungslicht. In diesem Zusammenhang ist eine steilkantige Ausbildung der spektralen Trennungskante der Polarisationsteilerschicht bzw. der dichroitschen Teilerschicht vorteilhaft. Dies kann ergänzt werden durch geeignete Anregungskantenfilter auf Seiten der Beleuchtungseinrichtung.

Wie bereits erwähnt, wird mittels der Beleuchtungseinrichtung monochromatisches Licht oder aber Licht definierter, jedoch unterschiedlicher Wellenlängen erzeugt. Bei Verwendung einer Weißlichtquelle werden die Anregungswellenlängen durch geeignete Bandfilter fixiert. Möglich ist jedoch auch die Verwendung von Laserlichtquellen oder von Bogenlampen mit extrahierten Linien unterschiedlicher Wellenlänge. Gegebenenfalls auftretende Farblängsfehler für verschiedene Anregungswellen werden durch wellenlängenabhängige Fokussierung des zu untersuchenden Objekts, z. B. durch Fokussierung des Objekttisches ausgeglichen. Möglich ist auch eine Korrektur durch eine Fokussierung der beiden Arrays.

Alternativ oder ergänzend zu den vorgenannten Lichtquellen können auch die Enden einer oder mehrerer Beleuchtungsfasern als Punktlichtquellen eingesetzt werden, die achromatisch kollimiert sind.

Die vorstehend erläuterte Vorrichtung eignet sich insbesondere zur optischen Analyse von in einer Objektebene angeordneten Substanzen, die dort lediglich in geringen Mengen vorliegen. Im Hauptstrahlengang der Vorrichtung wird das Licht in Wechselwirkung mit diesen Substanzen in Licht mit anderen Eigenschaften, beispielsweise verändertem Polarisationszustand oder veränderter Wellenlänge, umgewandelt, wenn bestimmte Substanzeigenschaften vorliegen (z. B. Fluoreszenzlabel). Die multiplen Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengänge ermöglichen beispielsweise Einzeluntersuchungen an einer Vielzahl von Probenbehältnissen, die an einem Probenträger in verhältnismäßig großem Abstand angeordnet sind. Der Probenträger und die Probenbehältnisse bilden dann gemeinsam das auf dem Objekttisch anzuordnende Abbildungsobjekt.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit Zeichnungen näher erläutert. Die Zeichnungen zeigen in:
Fig. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Verwendung eines ersten Arrays aus Mikrospiegeln,
Fig. 2 ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem ersten Array aus refraktiven oder diffraktiven optischen Mikroelementen,
Fig. 3 ein drittes Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer telezentrischen Mikrolinsenpaarung der Arrays,
Fig. 4 ein viertes Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem Pinholearray,
Fig. 5 ein Beispiel für ein rhombisches Raster von Mikroelementen im Beleuchtungsstrahlengang, und in
Fig. 6 ein Beispiel für ein rhombisches Raster von Empfängerelementen im Abbildungsstrahlengang.
Fig. 1 zeigt in einem ersten Ausführungsbeispiel eine Vorrichtung zur optischen Mikroanalyse mit konfokaler Beleuchtung und Abbildung. Diese umfaßt einen Objekttisch 1 zur Halterung eines zu untersuchenden Objektes, beispielsweise einen Träger mit einer Vielzahl von zu analysierenden Substanzen. Der Objekttisch 1 ist in den Koordinaten X, Y (mäanderförmig) eines Koordinatensystems X, Y, Z bewegbar, so daß das Objekt bzw. die einzelnen Proben punktweise abgetastet und dabei optisch gescannt werden können. Im Hinblick auf den Ausgleich von Farblängsfehlern ist überdies die Möglichkeit vorgesehen, den Objekttisch 1 senkrecht zu der X-Y-Ebene, d. h. in Z-Richtung zu fokussieren.
Weiterhin umfaßt die Vorrichtung eine Beleuchtungseinrichtung 2, mit welcher monochromatisches Licht erzeugt wird. Die Beleuchtungseinrichtung 2 weist eine Weißlichtquelle 3 auf, der in Beleuchtungsrichtung auf den Objekttisch 1 hin ein Kollimator 4, ein Polarisator 5 und ein wellenlängenselektiver Filter 6 nachgeschaltet sind.
In dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen der Beleuchtungseinrichtung 2 und dem Objekttisch 1 befindet sich eine Beleuchtungsoptik, mit welcher das Licht der Beleuchtungsquelle 2 in Form einer Vielzahl von nebeneinander verlaufenden Beleuchtungsstrahlenbündeln konfokal auf den Objekttisch 1 gerichtet wird, so daß sich dort in einer Objektebene ein Raster aus einer Vielzahl von Beleuchtungspunkten einstellt. In Fig. 1 ist beispielhaft lediglich ein einziger Beleuchtungsstrahlengang und der zugehörige Abbildungsstrahlengang dargestellt.
Die Beleuchtungsoptik umfaßt ein erstes Array 10 aus einer Vielzahl von optischen Mikroelementen 7 in Form von Mikrospiegeln, die an einer Trägerplatte 8 rasterförmig angeordnet sind. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel sind sämtliche Mikrospiegel 7 gleichartig ausgebildet und rhombisch zueinander angeordnet. Beispiele für rhombische Strukturen sind in Fig. 5 und Fig. 6 gezeigt. Bei derartigen Anordnungen ergibt sich eine hohe Flächenausnutzung und damit eine gute Lichtausbeute bei der Beleuchtung.
Die Trägerplatte 8 mit den Mikrospiegeln 7 ist der Beleuchtungseinrichtung 2 gegenüberliegend angeordnet. Ein Polarisationsteiler 9 sorgt für die konfokale Beleuchtung des Objektfeldes an dem Objekttisch 1. Die Beleuchtungseinrichtung 2 beleuchtet mit einem kollimierten Strahlenbündel durch den vorzugsweise schmalbandigen Polarisationsteiler 9 hindurch das erste Array 10 aus Mikrospiegeln 7, welche die Lichtquelle 3 vielfach parallelisiert in die Objektebene abbilden. Dazu wird das von den Mikrospiegeln 7 reflektierte Licht über den Polarisationsteiler 9 auf den Objekttisch 1 umgelenkt. Zur Erzielung der 180° Phasenverschiebung ist zwischen dem Polarisationsteiler 9 und dem Array 10 eine λ/4-Platte 11 angeordnet.
Die einzelnen Mikrospiegel 7 weisen eine lichtkonzentrierende Wirkung auf und sind derart dimensioniert, daß die Bilder der Lichtquelle 3 innerhalb der gewünschten Analysevolumina an dem zu untersuchenden Objekt liegen.
Das von dem Objekt reflektierte Licht der einzelnen Beleuchtungspunkte gelangt, wiederum durch den Polarisationsteiler 9 hindurch, zu einer Empfangseinrichtung 12 mit einer Vielzahl von rasterförmig angeordneten Empfängerzellen 13. Das Raster der Empfängerzellen 13 ist dabei dem Raster des ersten Arrays 10 spiegelbildlich konjugiert, so daß einzelne oder Gruppen von Empfängerzellen 13 jeweils einem Beleuchtungspunkt zugeordnet sind.
Auf dem Weg zu der Empfangseinrichtung 12, die beispielsweise eine CCD-Kamera ist, durchtritt das reflektierte Licht ein zweites Array 14 aus einer Vielzahl von rasterförmig angeordneten optischen Mikroelementen 15. Die Mikroelemente 15 des zweiten Arrays 14 sind hier als refraktive oder diffraktive optische Elemente ausgebildet und konzentrieren das von den Beleuchtungspunkten an dem Objekt kommende Licht auf die jeweils zugeordneten Empfängerzellen 13 an der Empfangseinrichtung 12. Zu diesem Zwecke ist auch das Raster der optischen Mikroelemente 15 an dem zweiten Array 14 zu dem Raster der Bildpunkte bzw. demjenigen des ersten Arrays 10 konjugiert zugeordnet. Allerdings ist die rhombische Grundanordnung spiegelbildlich zu dem ersten Array 10 ausgerichtet. Wiederum sind sämtliche Mikroelemente 15 gleichartig ausgebildet. Sie weisen hier alle die gleiche Brennweite sowie den gleichen Durchmesser auf und sind gleichmäßig an einer Trägerplatte 16 ausgebildet. Infolge der guten Flächenausnutzung an den beiden Arrays 10 und 14 entsteht eine parallele konfokale Beleuchtung und Abbildung, die bis zu 75% der Leuchtenergie der Beleuchtungsquelle 2 ausnutzt.
Bei der Untersuchung fluoreszierender Substanzen entsteht das eigentliche Bild des zu analysierenden Objektes bzw. der zu analysierenden Proben vorrangig als Fluoreszenzbild in Reflexion, d. h. die Beleuchtungspunkte fluoreszieren in den Raum zurück. Jedes Mikroelement 15 des zweiten Arrays 14 transformiert entsprechend seiner aufnehmenden Apertur das Fluoreszenzlicht vom zugeordneten Beleuchtungspunkt in die Bildebene der Empfangseinrichtung 12.
Durch die abbildende Wirkung der Mikroelemente 15 werden lediglich die Beleuchtungspunkte der Objektebene in konjugierte Rasterpunkte der Bildebene übertragen. In der Wirkung ergibt sich eine konfokale Übertragung, die definierte dünne Schichten aus der Tiefe und Breite des transformierbaren Objektraums ausschneidet und nur diese zum Bildaufbau beitragen läßt. Das Gesamtbild eines bestimmten Objektfeldes wird durch Bewegen des Objekttisches 1 in der XY-Ebene erzielt. Mittels bekannter Methoden der Bilddatenverarbeitung werden die rhombisch strukturierten Rasterbilder zu einem Gesamtbild zusammengefügt bzw. können in der Summenbildung auch verstärkt werden.
Bei ausgedehnten Objekten wird das vollständige Objektfeld dadurch erfaßt, daß der Objekttisch 1 mäanderförmig das Scannen fortsetzt. Die hierbei erreichbare Stepgeschwindigkeit der Verschiebung des Objektes sowie der synchron dazu durch Auslesen der jeweiligen Empfängerzellen erfolgenden Bildentstehung hängt u. a. von der Empfindlichkeit der verwendeten Empfangseinrichtung 12 bzw. Kamera, der Helligkeit des fluoreszierenden Untersuchungsobjektes sowie der Abstände der Beleuchtungspunkte ab. In einer besonders vorteilhaften Variante der Empfangseinrichtung 12 wird als Empfangseinrichtung 12 eine TDI-Kamera verwendet, deren Empfängerfläche rhombisch strukturiert ist, wobei die Struktur zu dem ersten Array 10 spiegelbildlich ausgerichtet ist. Vorzugsweise entsprechen dabei die Durchmesser der "lichtempfindlichen Inseln" der Empfängerfläche den durch die Mikroelemente 15 des Arrays 14 fokussierbaren Airyscheibchen. Durch die Verschiebung des Objekttisches 1 läuft das Bild des Objektes quer zur Zeilenrichtung der TDI-Kamera, wobei die opto-elektrisch erzeugten Ladungen der Objektpunkte mit gleicher Geschwindigkeit wie die scannenden Objektpunkte quer zu den Zeilen durchgeschoben werden. Eine Steigerung der Sensitivität der Zeilenkamera ergibt sich somit durch Verlängerung der Belichtungszeit eines jeden Bildpunktes, d. h. dessen Aufenthaltsdauer auf der Empfangseinrichtung 12. Ein entsprechend schneller Bildaufbau folgt aus der laufenden Zusammensetzung der jeweils komplett ausbelichteten Endzeile der TDI-Kamera zu einem quasi beliebig langen Bildformat.
In einer weiteren Variante dieses Ausführungsbeispiels kann anstelle des Polarisationsteilers 9 auch ein dichroitischer Teiler in Form eines Teilerwürfels vorgesehen werden. In jedem Fall wird die breitbandige, langwelligere Fluoreszenzstrahlung durch eine geeignete Wahl der Bandbreite des Polarisationsteilers 9 bzw. der Langpaß-Reflexionskante des dichroitischen Teilers transmittiert, so daß eine entsprechende Abbildung der langwelligeren Bildpunkte an der Empfangseinrichtung 12 erhalten wird.
Ein zweites Ausführungsbeispiel zeigt in Fig. 2 eine Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse, die sich von derjenigen des ersten Ausführungsbeispiels durch die Beleuchtungsoptik unterscheidet. Der Objekttisch 1, die Beleuchtungseinrichtung 2 sowie die Empfangseinrichtung 12 können wie in dem ersten Ausführungsbeispiel ausgebildet sein, so daß hier lediglich die Unterschiede der Beleuchtungsoptik näher erläutert werden müssen. Diese umfaßt wiederum ein erstes Array 17 zur Erzeugung eines Beleuchtungspunktrasters in einem Objektfeld. Im Unterschied zu dem ersten Ausführungsbeispiel weist dieses erste Array 17 anstelle von Mikrospiegeln eine Vielzahl von refraktiven oder diffraktiven optischen Mikroelementen 18 auf. Möglich sind insbesondere auch holographische Mikroelemente 18. Die optischen Mikroelemente 18 sind in rhombischer Anordnung zueinander an einer Trägerplatte ausgebildet, wobei Abstand und Apertur derart gewählt sind, daß das Licht der Beleuchtungseinrichtung 2 vervielfacht direkt in die Objektebene fokussiert wird.
Bei dem zweiten Ausführungsbeispiel ist zu diesem Zweck ein Teilerelement 19 vorgesehen, welches das von der Beleuchtungseinrichtung 2 kommende und durch das erste Array 17 hindurchtretende Licht auf den Objekttisch 1 lenkt. Das von dem Objekt reflektierte Licht wird durch das Tellerelement 19 ohne Ablenkung hindurch auf die Empfangseinrichtung 12 reflektiert. Zur Konzentration der einzelnen Abbildungsstrahlen der Beleuchtungspunkte auf die Empfängerzellen 13 der Empfangseinrichtung 12 ist dem Teilerelement 19 ein zweites Array 20 aus einer Vielzahl von optischen Mikroelementen 21, die refraktiv oder auch diffraktiv wirken, nachgeschaltet. Die optischen Mikroelemente 21 im Abbildungsstrahlengang sind wiederum an einer Trägerplatte 22 ausgebildet und weisen eine spiegelbildlich rhombisch Grundanordnung zu dem ersten Array 17 auf. Dabei sind sämtliche Mikroelemente 21 gleichartig ausgebildet. Insbesondere weisen diese alle die gleiche Brennweite sowie den gleichen spezifischen Durchmesser auf.
Damit wird sowohl eine konfokale Beleuchtung als auch eine konfokale Abbildung gewährleistet. Jedem Beleuchtungspunkt an dem Objekt ist genau ein Mikroelement 18 des ersten Arrays 17 und genau ein Mikroelement 21 des zweiten Arrays 20 zugeordnet. Wechselwirkungen zwischen den Strahlenbündeln der einzelnen Beleuchtungspunkte sind dabei weitestgehend ausgeschaltet. Falls erforderlich, werden die nicht für die optische Wirkung benötigten Zonen zwischen den Mikroelementen an den Arrays 17 und 20 geschwärzt bzw. mit einer lichtabsorbierenden Schicht versehen.
Insbesondere für Fluoreszenzapplikationen kann auch in dem zweiten Ausführungsbeispiel das Teilerelement 19 wiederum als schmalbandiger Polarisationsteiler ausgeführt sein, wodurch sich der Beleuchtungsstrahlengang und der Abbildungsstrahlengang gut trennen lassen. Alternativ ist auch die Verwendung eines dichroitischen Teilers möglich. Im Zusammenhang mit einem Polarisationsteiler kann wiederum eine λ/4-Platte 27 zwischen dem Teilerelement 19 und dem Objekttisch 1 vorgesehen sein.
Die Generierung eines Gesamtbildes aus einer Vielzahl von Rasterbildern erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel.
Das dritte Ausführungsbeispiel zeigt in Fig. 3 eine weitere Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse in Form eines konfokalen Mikroanalysegerätes mit telezentrischen Teilstrahlengängen. Der Objekttisch 1, die Beleuchtungseinrichtung 2 sowie die Empfangseinrichtung 12 können ebenso wie in den ersten beiden Ausführungsbeispielen ausgebildet sein. Abweichungen ergeben sich jedoch für die Beleuchtungsoptik.
Bei diesem dritten Ausführungsbeispiel wird das von der Beleuchtungseinrichtung 2 kommende, kollimierte Licht über ein Teilerelement 23 auf den Objekttisch 1 gelenkt. Zur Aufteilung des Beleuchtungslichtes in eine Vielzahl von rasterförmig angeordneten Beleuchtungspunkten ist dem Teilerelement 23 in Richtung auf den Objekttisch 1 ein erstes Array 24 mit einer Vielzahl von optischen Mikroelementen 25, insbesondere refraktiven oder diffraktiven Mikroelementen nachgeschaltet. Diese Mikroelemente 25 sind an einer Trägerplatte 26 ausgebildet, die zwecks Fokussierung in Richtung der optischen Achse verstellbar ist. Gegebenenfalls wird, je nach Zweck der Analyse, wiederum eine λ/4- Platte 27 in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen dem Tellerelement 23 und dem Objekttisch 1 vorgesehen.
Von einem Objekt reflektiertes Licht gelangt durch das erste Array 24, das Teilerelement 23 sowie eine zweites Array 28 auf die Empfangseinrichtung 12. Das zweite Array 28 umfaßt wiederum eine Vielzahl von optischen Mikroelementen 29, die an einer Trägerplatte 30 ausgebildet sind. Diese Trägerplatte ist zwischen dem Teilerelement 23 und der Empfangseinrichtung 12 angeordnet. Auch hier ist eine eindeutige Zuordnung der Mikroelemente 25 bzw. 29 zu jeweils einem Beleuchtungspunkt gewährleistet. Die Mikroelemente 25 und 29 können wiederum rhombisch angeordnet werden, wobei an der Empfangseinrichtung 12 dann ebenfalls eine entsprechende Strukturierung der Empfängerzellen 13 vorgenommen ist.
Die telezentrische Anordnung ermöglicht eine einfache Justierung der beiden Arrays 24 und 28, die in Richtung der optischen Achse zum Zweck der Fokussierung bewegbar sind. Zudem kann der Abbildungsmaßstab leicht verändert werden.
Erfolgt die Beleuchtung mit einer Weißlichtquelle, kann diese als eine modifizierte Köhlersche Beleuchtung ausgelegt werden, so daß eine Vielzahl von Bildern einer gleichmäßig ausgeleuchteten Leuchtfeldblende durch die optischen Mikroelemente 25 des ersten Array 24 in der Objektebene entstehen. Eine achromatische Korrektur für zwei Linien wird durch eine geeignete Wahl der dispersiven Eigenschaften des Materials der refraktiven optischen Mikroelemente 25 in Relation zu deren diffraktiv wirkenden Linsenberandungen erzielt.
Bei Verwendung von Beleuchtungslicht mit nicht-achromatisierten Wellenlängen wird zur Fokussierung vorzugsweise die Objektebene bzw. der Objekttisch 1 in Richtung der optischen Achse, d. h. hier in Richtung Z, verstellt. Die rückwärtig entstehenden Abbildungsstrahlenbündel laufen durch die optischen Mikroelemente 25 des ersten Arrays 24 und werden dabei annähernd kollimiert. Infolge der an dem Objekt auftretenden sprektralen Veränderungen des Beleuchtungslichts wird dieses an dem Teilerelement 23 nun nicht mehr abgelenkt, sondern tritt vielmehr durch dieses hindurch und fällt auf das zweite Array 28. Über dieses wird das telezentrische Abbildungsstrahlenbündel auf die Empfangseinrichtung 12 abgebildet. Erforderlichenfalls wird hierzu an dem zweiten Array 28 eine Feinfokussierung in Richtung der optischen Achse durch eine Bewegung des zweiten Arrays 28 relativ zu der Empfangseinrichtung 12 vorgenommen. Eine Bewegung der Arrays 24 und 28 quer zur optischen Achse zum Zwecke des Scannens unterschiedlicher Bildpunkte ist jedoch nicht vorgesehen. Vielmehr wird das Scannen allein durch eine Bewegung des Objekttisches 1 und die synchrone Auslesung der den Objektpunkten zugeordneten Empfängerzellen verwirklicht.
Bei Verwendung festgelegter Anregungs- und Analysewellenlängen können in einer Variante des dritten Ausführungsbeispiels zur Gewährleistung der Konjugation der Konfokalabbildung die beiden Arrays 24 und 28 fest mit dem Teilerelement 23 verbunden werden, so daß diese Bauelemente zusammen eine vorteilhafte gerätetechnische Einheit bilden.
Die Generierung eines Gesamtbildes aus einer Vielzahl von Rasterbildern erfolgt dann wiederum entsprechend den beiden vorstehend erläuterten Ausführungsbeispielen.
Ein weiteres Beispiel für eine Beleuchtungsoptik ist in dem vierten Ausführungsbeispiel dargestellt, dessen Objekttisch 1, Beleuchtungseinrichtung 2 und Empfangseinrichtung 12 wie oben bereits erläutert ausgebildet werden können. Bei der Beleuchtungsoptik nach dem vierten Ausführungsbeispiel wird der parallel konfokale Beleuchtungsstrahlengang bereits vor dem Teilerelement 31 erzeugt. Ein kollimiert beleuchtetes erstes Array 32 mit einer Vielzahl von refraktiven bzw. diffraktiven optischen Mikroelementen 33 erzeugt ein rhombisch gerastertes Konfokalbündel, das auf ein zu dem ersten Array 33 ähnlich gerastertes Pinholearray 34 scharf konfokal abgebildet wird. Durch das Pinholearray 34, eine Platte mit einer Vielzahl von Pinholeöffnungen 35, werden Falsch- und Streulichteffekte minimiert.
Nach der Umlenkung an dem Teilerelement 31 gelangt das Beleuchtungslicht durch ein zweites Array 36 mit einer Vielzahl von optischen Mikroelementen 37 hindurch zu dem Objekttisch 1. Das zweite Array 36 besitzt hier eine Doppelaufgabe, nämlich einmal die Aufgabe, das Pinholearray 34 in die Objektebene abzubilden und weiterhin die Aufgabe, die zu analysierenden Beleuchtungspunkte an dem Objekt in eine Empfängerebene, d. h. auf die Empfangseinrichtung 12 abzubilden.
Für unterschiedliche Beleuchtungswellenlängen auftretende axiale Farbaberrationen werden durch eine Fokussierung der Empfangseinrichtung 12 relativ zu dem Objekttisch 1 kompensiert. Die Erzeugung eines Gesamtbildes aus einer Vielzahl von Rasterbildern erfolgt dann wie bereits oben beschrieben.
In Fig. 5 ist ein Beispiel für ein Pinholearray 34 mit einer Vielzahl von Pinholes 35 dargestellt. Deren rhombische Anordnung beruht auf einer rechtsseitigen Versetzung der konfokalen Pinholezeilen um jeweils einen Pinholeradius. In dem dargestellten Beispiel wird nach zehn Pinholezeilen wieder eine der Ausgangszeile vollständig entsprechende Pinholeanordnung erreicht, die bei Bewegung eines zu untersuchenden Objektes eine Scannperiode, die einen Weg im Bildraum entspricht von 10.n.r (r: Pinholeradius; n.r: Abstand zwischen benachbarten Pinholes in ganzzahligen Vielfachen des Pinholeradius), nämlich den zehnfachen Zeilenabstand, jeden Objektpunkt eines linienartig gedachten Objektes mindestens einmal beleuchtet hat. Die Verschiebung des Objekttisches 1 erfolgt in Anpassung an diese Abstände, so daß nach einer solchen Länge, d. h. einer Scanperiode, in dem hier zugrundeliegenden Beispiel das Abscannen des linienförmig gedachten Objektes einmal vollständig erfolgt ist. Das 10.10er rhombische Pinholeraster kann periodisch in Länge und Breite vervielfacht werden, um die gewünschte Objektscannbreite bzw. -länge und die Anzahl der Scannvorgänge zu dimensionieren. In dem Beispiel ist n = 10 gewählt, was einem Bedeckungsgrad mit Pinholeflächen von ca. 3% entspricht.
Fig. 6 zeigt das zugehörige zweite Array 36 mit den Mikroelementen 37. Aufgrund der in Fig. 4 gewählten Anordnung ist die rhombische Rasterstruktur der Mikroelemente 37 zu derjenigen der Pinholes 35 spiegelbildlich. Im Beispielfall entsteht nach zehn Zeilen aus optischen Mikroelementen 37 wiederum eine der Ausgangszeile entsprechende Anordnung. Bei Bewegung des zu untersuchenden Objektes um 10.2.R (R: Radius eines Mikroelementes), nämlich dem zehnfachen Durchmesser der Mikroelemente 37, ist jeder Objektpunkt in einer gedachten Objektlinie mindestens einmal abgebildet worden. Im Beispielfall wird bei R.10 = 2R ein Bedeckungsgrad mit abbildender Fläche der Mikroelemente 37 von ca. 75% erreicht.
Vorteil aller hier beschriebenen Vorrichtungen ist die Möglichkeit der Erfassung großer, zu analysierender Objektfelder bei Anwendung eines parallel-konfokalen Beleuchtungs- und Abbildungsverfahrens unter Optimierung der erforderlichen lateralen Auflösung und notwendiger Tiefendiskriminierung. Anstelle der oben erläuterten Beleuchtungseinrichtung mit einer Weißlichtquelle können alternativ auch eine oder mehrere Laserlichtquellen oder Entladungslampen zur konfokalen Beleuchtung eingesetzt werden.
Die beschriebenen Vorrichtungen eignen sich insbesondere zur Untersuchung von Fluoreszenzeigenschaften. Durch die Aufteilung des Beleuchtungslichts in eine Vielzahl von unabhängigen Analysestrahlengängen können gleichzeitig eine Vielzahl von Proben untersucht werden. Bezugszeichenliste 1 Objekttisch
2 Beleuchtungseinrichtung
3 Lichtquelle
4 Kollimator
5 Polarisator
6 Filter
7 optische Mikroelemente
8 Trägerplatte
9 Teilerelement
10 erstes Array
11 λ/4-Platte
12 Empfangseinrichtung
13 Empfängerzellen
14 zweites Array
15 optische Mikroelemente
16 Trägerplatte
17 erstes Array
18 optische Mikroelemente
19 Teilerelement
20 zweites Array
21 optische Mikroelemente
22 Trägerplatte
23 Teilerelement
24 erstes Array
25 optische Mikroelemente
26 Trägerplatte
27 λ_i/4-Platte
28 zweites Array
29 optische Mikroelemente
30 Trägerplatte
31 Teilerelemente
32 erstes Array
33 optische Mikroelemente
34 Pinholearray
35 Pinhole
36 zweites Array
37 optische Mikroelemente

Claims

1. Vorrichtung zur konfokalen optischen Mikroanalyse, umfassend
einen Objekttisch (1), der in Richtung der Koordinaten X, Y verstellbar ist,
eine Beleuchtungseinrichtung (2) mit einer oder mehreren Lichtquellen (3) zur Beleuchtung eines auf dem Objekttisch (1) abgelegten Objektes,
eine zwischen dem Objekttisch (1) und der Beleuchtungseinrichtung (2) angeordnete Beleuchtungsoptik mit einem ersten rasterförmigen Array (10; 17; 24; 32) aus einer Vielzahl optisch refraktiv, diffraktiv und/oder reflektiv wirksamer Mikroelemente (7; 18; 25; 33) zur Erzeugung eines Rasters von Beleuchtungspunkten an dem Objekt und
eine Empfangseinrichtung (12) mit einer Vielzahl von Empfängerzellen (13) zur Aufnahme des von dem Objekt zurück kommenden Lichts in Zuordnung zu den einzelnen Beleuchtungspunkten,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Empfangseinrichtung (12) ein zweites rasterförmiges Array (14; 20; 28; 36) aus einer Vielzahl von optischen Mikroelementen (15; 21; 29; 37) zugeordnet ist, durch welche das von den Beleuchtungspunkten an dem Objekt reflektierte Licht auf die Empfängerzellen (13) der Empfangseinrichtung (12) gerichtet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroelemente (7; 18; 25; 33) des ersten Arrays (10; 17; 24; 32) rhombisch angeordnet sind und die Mikroelemente (15; 21; 29; 37) des zweiten Arrays (14; 20; 28; 36) rhombisch spiegelbildlich zu dem ersten Array (10; 17; 24; 32) angeordnet sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der optischen Mikroelemente an der Fläche des ersten Arrays (10; 17; 24; 32) 75% oder größer ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Empfangseinrichtung (12) als Flächenkamera oder Zeilenkamera ausgebildet und der Objekttisch (1) synchron zur Auswertung der Empfängerzellen (13) der Empfangseinrichtung (12) bewegbar ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Mikroelemente (7) des ersten Arrays (10) als sphärische oder asphärische Mikrospiegel ausgebildet sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Mikroelemente (18; 25; 33) des ersten Arrays (17; 24; 32) als für mehrere Wellenlängen optimierte refraktive oder diffraktive optische Elemente ausgebildet sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine räumlich parallele und zeitgleiche Abbildung der Lichtquelle bzw. Lichtquellen (3) in eine Ebene an dem Objekt über ein rhombisch angeordnetes Array aus refraktiven Mikrolinsen mit achromatisierter Wirkung unter Berücksichtigung diffraktiver Wirkungen durch die Linsenberandung erfolgt.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem ersten Array (32) und dem Objekttisch (1) ein Pinholearray (34) vorgesehen ist, das eine Vielzahl von rasterförmig angeordneten Pinholes (35) aufweist, wobei das Raster der Pinholes (35) dem Raster der Mikroelemente (33) des ersten Arrays (32) entspricht.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die neutralen Zonen zwischen den optischen Mikroelementen (7, 15; 18, 21; 25, 29; 32, 37) geschwärzt sind oder aus lichtabsorbierendem Material bestehen.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Trennung von Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlenbündeln ein Polarisationsteiler (9; 19; 23; 31) vorgesehen ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Trennung von Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlenbündeln ein dichroitischer Teiler in Form eines optischen Würfels vorgesehen ist.

12. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Beleuchtungseinrichtung (2) und dem Objekttisch (1) in dem Beleuchtungsstrahlengang eine λ_i/4-Platte (11; 27) für die Beleuchtungswellenlängen vorgesehen ist.

13. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung (2) monochromatisches Licht oder Licht mehrerer, definierter Wellenlängen λ_i abgibt.

14. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquellen (3) in der Beleuchtungseinrichtung (2) mehrere Laser oder Multilinienlaser mit fester, jedoch untereinander verschiedener Wellenlänge λ_i vorhanden sind.

15. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung (2) Bogenlampen mit extrahierten Linien unterschiedlicher Wellenlänge umfaßt.

16. Vorrichtung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Lichtquellen (3) durch die Enden einer oder mehrerer Beleuchtungsfasern gebildet werden, welche als Punktlichtquellen achromatisch kollimiert sind.