DE102013005927A1

DE102013005927A1 - Verfahren zum optisch hochaufgelösten Rasterscanning eines Objekts

Info

Publication number: DE102013005927A1
Application number: DE201310005927
Authority: DE
Inventors: Rainer Heintzmann; Stephan Roth; Collin Sheppard; Kai Wicker
Original assignee: INST fur PHOTONISCHE TECHNOLOGIEN E V; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Institut fur Photonische Technologien EV
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-10-02

Abstract

Aufgabe war es, beim Rasterscanverfahren eine flexible Abbildung mit hoher Auflösung, mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis sowie mit hoher Rastergeschwindigkeit auf einem array-Detektor oder unmittelbar im menschlichen Auge zu ermöglichen. Erfindungsgemäß erfährt ein zu einem Zeitpunkt emittiertes Signal von der Nähe eines Fokus ein anderes Abbildungsverhältnis als das gerasterte Bild, beschrieben durch die nominellen Position(en) eines oder mehrerer Beleuchtungsfokusse.

Description

Welches technische Problem soll durch Ihre Erfindung gelöst werden?
Abbildung in einem konfokalen System ist ineffizient und weist die Photonen nicht den Stellen im Bild zu, an dem ein Emitter (bzw. Streuzentrum) am wahrscheinlichsten zu erwarten ist.
Auf welche Weise wurde das Problem bisher gelöst? Wie ist der gegenwärtige Stand der Technik?
Durch Dekonvolution der Bilder im Computer kann etwas gewonnen werden, allerdings hat dies Nachteile für das Signal-Rausch-Verhältnis (signal to noise ratio, SNR). Das Problem wurde bisher im Prinzip durch die Aufnahme von Einzelbildern bei jeder Scanposition und entsprechende Verrechnung gelöst [Sheppard et al., Enderlein et al. Shroff et al.]. Dies hat allerdings den Nachteil, dass für jede Scanposition ein ortsaufgelöstes Bild in der Lochblenden-Ebene aufgenommen werden muss, was den Scan langsam macht und zu zusätzlichem Ausleserauschen führt.
Welche Nachteile besitzen die bekannten Lösungen?
Verlangsamung der Bildaufnahme, da für jede Scanposition ein ortsaufgelöstes Bild aufgenommen werden muss. Zusätzlich sind mehr Photonen für qualitativ gleichwertige Bilder nötig, da sich bei dieser Lösung des Problems das SNR verschlechtert.
Welche Aufgabe liegt Ihrer Erfindung zugrunde?
Die Aufgabe ist es, ein effizientes, hochauflösendes Scansystem zu schaffen, welches die off-axis-Photonen direkt an geeignetere Stellen im Bild sendet.
Wie wird diese Aufgabe durch Ihre Erfindung gelöst?
Durch Veränderung des off-axis Abbildungsmaßstabes, bei gleichzeitigem Beibehalten des Maßstabes der Scanabbildung.
Was ist das wesentlich Neue an Ihrer Erfindung? Worin liegt der Kern der Erfindung?
Die computerbasierte Verrechnung des bekannten Verfahrens wird in dem neuen Ansatz direkt durch geschickte Optik realisiert.
Welche wesentlichen bzw. zusätzlichen Vorteile werden durch Ihre Erfindung erzielt?
Es wird eine Auflösungserhöhung bei verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und höherer Aufnahmegeschwindigkeit erreicht.
Mit welchen Schlagworten (deutsch und englisch) können Sie Ihre Erfindung beschreiben?
Hochauflösendes konfokales System
Photon-Reassignment
Decoupled Scanning
Demagnified Rescanning
Emission magnification changer
Erläutern Sie Ihre Erfindung an Hand einer Zeichnung. Siehe unten
Hintergrund
Eine Reihe von modernen mikroskopischen Verfahren erlauben eine Auflösungserhöhung, indem sie mit fokussiertem Licht beleuchten und den Focus über die Probe rastern (”Rasterscan-Methode”). Dabei gibt es bisher zwei Arten, die Daten aufzuzeichnen: Ein integrierender Detektor misst die Signalintensität in schneller Folge und ordnet sie der nominellen Scanposition zu. Dieses Prinzip wird im konventionellen konfokalen Mikroskop genutzt, wobei das Rückgestreute oder die Fluoreszenzemission durch eine Lochblende (engl. einhole) (konjugiert zur Fokalebene im Objekt) geleitet wird, um Licht ausserhalb der Fokalebene zu unterdrücken. Die Lochblende kann hierbei in der Größe einstellbar sein. Um die Probe abzurastern, kann hier entweder die Probe bewegt werden oder der Beleuchtungsstrahl geeignet gesteuert werden. Das von der Probe emittierte (z. B. Fluoreszenz- oder Streu-)Licht wird im letzteren Fall dem umgekehrten Verfahren (”descanning”) unterworfen, so dass die nominelle Fokusposition nach dem Descannen wieder stationär erscheint. Hier lässt sich dann einfach eine Lochblende platzieren. Für das Descannen werden üblicherweise dieselben optischen Elemente verwendet, die auch zum Abrastern der Probe („scannen”) verwendet werden. Dies sind z. B. resonante oder nicht resonante galvanometrische Spiegel, rotierende Polygonspiegel oder akusto-optische Deflektoren.
Ein weiteres Verfahren der Datenaufzeichnung besteht darin, das emittierte Licht auf einen ortsaufgelösten Detektor (”array-Detektor”, z. B. eine CCD oder CMOS Kamera) abzubilden. Dieses hat sich insbesondere für die 2-Photonenmikroskopie bewährt, da hier das optische Schneiden direkt durch das Anregungslicht erreicht wird [Beispiel: LaVision Mikroskop]. Es sind auch Anordnungen bekannt, bei denen das Licht zunächst degescannt wird und dann, oft unter Benutzung derselben optischen Elemente (oder deren Rückseite) nun über den array-Detektor geraster wird. Ein solches Verfahren ist (als Multi-Punkt-Version) bekannt aus dem Gerät „VT-Infinity” von der Firma „Visitech International (VTI)”.
Bekannte Veröffentlichungen [Sheppard 1988, Optik 80, 53–54, Müller&Enderlein PRL 104, 198101 (2010), York et al., Nature Methods 8, 327–333, 2011] beschreiben Verfahren, die in den Rasterpositionen die Lichtverteilung mit Hilfe ortsaufgelöster Detektoren in der Bildebene (konjugiert zur Fokalebene im Objekt) aufzeichnen. Aus diesen Daten lassen sich dann Bilder errechnen, die das emittierte Licht effizienter nutzen als die oben beschriebenen Verfahren und so zu einer Auflösungssteigerung fuhren. Hier hat sich insbesondere herausgestellt, dass es sinnvoll ist, ein Photon, das nicht exakt auf der nominellen Scan-Achse detektiert wird, weder der nominellen Scan-Position noch der nominellen detektierten Bildposition zuzuordnen, sondern idealerweise einem Wert dazwischen. In bisherigen Veröffentlichungen ist dieser Wert als die mittlere Position zwischen der nominellen Anregungsposition und der nominellen Probenposition des Detektionspunktes (pixels) angegeben.
Eine Reihe von modernen Mikroskopieverfahren (z. B. STED) erlauben es, die Lichtemission auf einen Bereich einzuschränken, der weit unterhalb der Beugungsgrenze liegt („hochauflösende Rasterverfahren”). Dies geschieht z. B. durch gezieltes Verhindern der spontanen Emission aus den Randbereichen des Anregungslichts durch Erzwingen von Stimulierter Emission unter Einsatz einer ringförmigen Lichtverteilung (einer sogenannten „Doughnut-Mode”). Bisher ist noch kein Verfahren bekannt, welches im Stande ist, die Auflösung eines hochauflösenden Rasterverfahrens auf einen array-Detektor oder auf die Netzhaut des Auges abzubilden. Mit dem neuen Verfahren wäre eine direkte Abbildung der hochauflösenden Bilder möglich.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, welche die Probe mit mehreren Strahlen gleichzeitig abtasten (z. B. Nipkow Disc, Yokagawa Disc, LaVision Multi beam scanning, VT-Infinity) und das Emissionslicht auf einen Array-Detektor oder die Netzhaut abbilden. Diese Abbildung geschieht üblicherweise entweder ohne Benutzung der Scan-Einrichtung (das rotierende Rad) oder durch Abbildung durch diese (z. B. das rotierende Lochrastermuster bei Yokagawa). Im VT-Infinity system ist ein scanning-descanning-rescanning Prozess realisiert.
Problemstellung
Gesucht ist ein Verfahren für Rasterscanverfahren, welches eine flexible Abbildung mit hoher Auflösung auf einem array-Detektor (z. B. CCD- oder CMOS-Kamera) oder direkt im menschlichen Auge erreicht und das zur Verfügung stehende Licht effizient nutzt.
Lösung des Problems
Die Erfindung besteht darin, Verfahren analog zu in der Literatur beschriebenen photon reassignment [Sheppard 1988, Optik 80, 53–54, Müller&Enderlein PRL 104, 198101 (2010), York et al., Nature Methods 8, 327–333, 2011] auf rein optische Weise zu realisieren, so dass die Summation der verschobenen Detektionsereignisse automatisch auf dem Detektor oder im menschlichen Auge geschieht. Ermöglicht wird dies durch ein unterschiedliches Abbildungsverhältnis der Scanposition auf dem Detektor im Vergleich zum Abbildungsverhältnis des momentanen Bildes um die jeweiligen Scan-Position (1). Dieses lässt sich sowohl für Einzelstrahl-Scan-Verfahren als auch, z. B. mit Hilfe von Mikrolinsen für Mehrstrahl Scan-Verfahren realisieren. Eine erfindungsgemäße Losung besteht darin, ein Descanning, gefolgt von einem Rescanning durchzuführen, wobei die nominelle Position des Rescannings mit einer anderen Geschwindigkeit (relativ zur jeweilig korrespondierenden Objektposition) als der des Scannings geschieht, so dass sich eine zeitaufgelöste Detektion des Emissionslichts pro jeweiliger Scan-Position vermeiden lässt und somit die Photonen besser genutzt werden als die einfache Abbildung auf einen nicht so effizienten Punktdetektor (z. B. ein Sekundärelektronenvervielfacher, PMT) erreichen würde.
Dieses kann erfindungsgemäß technisch realisiert werden durch den Einsatz mehrerer zueinander synchronisierter Scanner, welche sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen, oder insbesondere auch durch eine Optik, die den Strahldurchmesser nach dem Descannen aber vor dem Rescannen gezielt verändert, so dass sich die Größe des momentanen Bildes der Probe auf dem array-Detektor (oder der Netzhaut) unabhängig von der Bildgröße, die durch das Scannen beschrieben wird, beeinflussen lässt. Bei konventionellen Scanverfahren gekoppelt mit einer Abbildung ohne Scan oder bei einem konventionellem Rescanning-System mit Relativmasstab eins, wird eine Emission, die im Abstand d von der Scan-Achse stattfindet entsprechend der Gesamtvergrößerung M des Systems im Bild erscheinen. Dieser Punkt wird also einfach an der Position Md von der nominellen Scanposition im Bild abgebildet (nach Faltung mit der Emissions-PSF). Im Gegensatz dazu ist erfindungsgemäß der Scan-Prozess vom Abbildungsprozess entkoppelt und die Emission im Abstand d von der Scan-Achse kann mit einem anderen Vergrößerungsmaßstab M₂ bei M₂ d von der nominellen Scanposition im Bild abgebildet werden. Da die Wahrscheinlichkeit einer detektierten Emission nun von der Anregungswahrscheinlichkeit und der Detektionswahrscheinlichkeit abhängt, kann M₂ ≠ M verbesserte Abbildungseigenschaften des Gesamtsystems aufweisen. Die so behandelten Photonen können die wahre Position der Emitter besser wiedergeben als bei M₂ = M.
Durch Anpassen der so erreichten abweichenden Emissionsvergrösserung lässt sich zum einen eine optimale Auflösung und Ausnutzung des emittierten Lichts erreichen (wenn der mögliche Emissionsbereich in der Probe ungefähr in der Größenordnung der vorgegebenen Beugungsgrenze liegt, die für die Abbildung von der Probe zum Detektor gilt). Die emittierten Photonen werden auf diese Weise bevorzugt an die Stellen des ortauflösenden Detektors gebracht, die am Wahrscheinlichsten für deren Emissionsposition in der Probe unter Berücksichtigung von Beleuchtung und Detektionsposition ist [siehe Sheppard 1988].
Durch eine deutliche Zwischenverkleinerung zwischen Descannen und Rescannen (entspricht einer Vergrößerung des Strahldurchmessers vor dem Rescannen) oder aber z. B. durch die Wahl eines geeignet schnellen Descans in die gegensätzliche Richtung im Vergleich zum Scan kann erreicht werden, dass man Array-Detektoren ohne gravierenden Auflösungsverlust auch für hochauflösende Rasterscanverfahren einsetzen kann, bei denen die Grösse der möglichen Emissionsverteilung deutlich kleiner ist als das Beugungslimit der Detektion. Als Beispiele seien hier angeführt die stimulierte Emissions Mikroskopie (STED), die Ground State Depletion Mikroskopie (GSD), ähnliche Verfahren, die durch Ausnutzen photoschaltbarer Dunkelzustände den Bereich möglicher Emission einengen. Das Verfahren ist aber auch sinnvoll bei optischen Systemen, bei denen die Beleuchtungsapertur grösser ist als die Detektionsapertur oder bei denen sich die Beleuchtungs- und Emissionswellenlängen stark unterscheiden (z. B. Röntgenfluoreszenz). In dieser Variante des Verfahrens ist es also ausreichend, wenn man eine genügend große Änderung der Relativvergrößerung herbeiführt, so dass sich die gemessene Photonenposition im Wesentlichen als Position der nominellen momentanen scan-Achse interpretieren lässt und eben nur noch schwach von der aktuellen Position des emittierten Lichts abhängt. Im Allgemeinen gibt es für jede durch das Mikroskopverfahren bestimmte Festlegung des typischen Volumens, das zur Emission des Signallichts beitragen kann (d. h. kleiner als das Beugungslimit bei STED) und eine durch die Abbildungsoptik festgelegte Größe des Beugungsscheibchens eines Punktobjekts im Bild eine optimale Wahl für die Vergrößerung M₂ im Vergleich zu der durch den Scan bestimmten Vergrößerung M.
Bei entsprechend schnellen Scans kann das Bild nach dem Rescan direkt auf der Netzhaut beobachtet werden, was es erlaubt, die hochauflösenden Verfahren auch in der direkten Beobachtung einzusetzen. Weiterhin sind Array-Detektoren (z. B. CCD, iCCD, CMOS, sCMOS) oft in Quanteneffizienz, Dunkelrauschen, spektralem Empfindlichkeitsbereich, Auslesegeschwindigkeit und insbesondere in der maximal zulässigen Photonenrate den Einzelpixeldetektoren (z. B. PMT, APD) überlegen.
Descannen und Rescannen hat im Vergleich zur direkten Abbildung (ohne Descannen) oder im Vergleich zum Descannen mit anderer (z. B. entgegengesetzter Bewegung) den Vorteil, dass eine (variable) Lochblende zur Unterdrückung von Licht von außerhalb der Fokalebene eingeführt werden kann. Hierbei sollte die Lochblende nicht zu klein gewählt werden um die Lichteffizienz des Verfahrens nicht zu stören.
Verfahren im Sinne der Erfindung können das Prinzip in einer Dimension (z. B. X), in 2 Dimensionen (z. B. X und Y) oder in 3 Dimensionen (X, Y und Z) verwirklichen. Dementsprechend lassen sich Kombinationen von mehreren ein, zwei oder dreidimensionalen Rasterscaneinrichtungen einsetzen. Auch kann das Rescannen teilweise unter Verwendung derselben optischen Scanelemente (z. B. X-Galvo Spiegel) und teilweise unter Verwendung eines weiteren Scanelement (z. B. Y-Galvo) nur für das rescannen welches z. B. mit der Objektbewegung entlang Y synchronisiert ist, geschehen.
Wenn man mit mehreren Foci gleichzeitig die Probe abrastert, hat man den Vorteil eines erhöhten Durchsatzes, also kann mehr Signal pro Zeiteinheit detektiert werden. Um im Sinne der Erfindung einen Vorteil zu erreichen, muss die Vergrößerung der Abbildung jedes Einzelnen Fokus im Vergleich zu den Fokalpositionen für das emittierte Signal geändert werden. Dies lässt sich z. B. durch Einsatz zweier Multifokuseinrichtungen mit verschiedener Fokallänge und/oder (bei unterschiedlichem Vergrößerungsverhältnis zwischen Beleuchtung und Detektion) verschiedenem Multifokusabstand, jeweils für Beleuchtung und Detektion realisieren.
Der Einsatz eines 2-Photonenlasers kann hilfreich sein, um ein inhärenten optisches Schneiden zu erreichen. Insbesondere ist dies nützlich, wenn in dem abbildenden Strahlengang keine konfokale Lochblende Verwendung findet.
Bei der Beleuchtung von Mikrolinsen-Arrays (wie z. B. ) ist es sinnvoll, die Lochblenden-Abstände so zu wählen, dass nur die höchsten Beugungsordnungen durch das Objektiv gehen. Das hat bei der kohärenten Beleuchtung den Vorteil eines erhöhten Kontrastes des Beugungsmusters in der Probe bei höchster Raumfrequenz der Beleuchtung. Bei größeren Lochabständen kann auch der Kontrast durch geschickte Wahl der Lochabstände und den Einsatz von z. B. hexagonaler Anordnung verbessert werden.
In ist das Prinzip nach dem Hauptanspruch an einem einzelnen Focus verdeutlicht. Beispielhaft sind hier Zeiten t1 (obere Reihe) und t2 (untere Reihe) während des Scans gezeigt. Ein Scanpunkt (blau) ist zum Zeitpunkt t1 an der Position d1 in der Probe (linke Spalte). Der Übersichtlichkeit halber ist nur die x-Komponente d1, x eingezeichnet. Der Scanpunkt bewegt sich, so dass er sich zur Zeit t2 an der Position d2 in der Probe befindet. Der Scanpunkt wird unter dem Abbildungsverhältnis M1 in die Bildebene abgebildet, befindet sich also zum Zeitpunkt t1 bei Position M1d1 und zum Zeitpunkt t2 bei M1d2. Ein Emitter (grün) in der Probe (oder ein beliebiger benachbart gewählter Punkt in der Probe) mit Abstand D1 zur nächsten benachbarten Scanposition zum Zeitpunkt t1 wird nun optisch mit einem anderen Abbildungsverhältnis M2 so abgebildet dass seine Distanz zum benachbarten Scanpunkt nicht M1D1 beträgt, sondern M2D1. Analog verhält es sich zum Zeitpunkt t2. Die Nullpunkte der Koordinatensysteme seien so gewählt, dass sie zum Zeitpunkt 0 aufeinander abgebildet werden.
In ist ein Rasterscanverfahren gezeigt, welches ein Musterbeispiel im Sinne der Erfindung darstellt. L1–L6: achromatische Linsen mit verschiedenen Fokallängen (L1 – 50 mm; L2 – 75 mm; L3 – 60 mm; TL (tubelens) – 400 mm; L4 – 200 mm; L5 – 400 mm; L6 – 200 mm); optionale Lochblende 1 wird als Strahlreinigung für den Laser benutzt. Optionale Lochblende 2 mit einstellbarer Größe wirkt als konfokale Apertur, M1–M5: Spiegel, M4 und M5 sind präferentiell in D-Form um Strahlen mit nur geringer Winkeldifferenz trennen zu können. Der Dichromatische Strahlteiler reflektiert in der hier gezeigten Fluoreszenzanordnung das Laser-Anregungslicht und lässt das Fluoreszenzlicht passieren. Der Laser Filter unterdrückt unerwünschtes noch vorhandenes Laserlicht mit hoher Effizienz; die Scan-Einheit kann den Laserstrahl zweidimensional steuern. Sie kann durch einen Spiegel mit 2D Winkelscanmöglichkeit realisiert werden, durch zwei dicht benachbarte Scanspiegel, durch drei Scanspiegel, die die Pupillenlage gegenseitig korrigieren oder durch 2 Scanspiegel mit zwischengeschalteter Abbildung.
In ist eine Realisierung mit 3 Scanspiegeln gezeigt, von denen sich einer in der konjugierten Pupillenebene befindet, während die beiden anderen durch geeignete Steuerung dafür sorgen, dass die Pupillenlage konstant bleibt.
In ist eine Realisierung im Sinne des Verfahrens dargestellt, die einen Hohlspiegel verwendet, um die Änderung des Abbildungsmaßstabes zu erreichen.
In ist erfindungsgemäß ein Verfahren dargestellt, bei dem die Scan- und die Descan-Vorrichtung aus zwei jeweils einzeln kontrollierbaren Einheiten besteht. Die Scanner können hier in unterschiedliche Richtungen laufen und mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten laufen. Der erste Spiegel rastert die Probe ab und descannt das Licht von der Probe. Das durch den dichromatischen Spiegel abseparierte Licht wird nun durch Scaneinheit 2 auf der Kamera gescannt („rescan”). Durch geeignete Wahl der Scangeschwindigkeiten lässt sich das gewünscht unterschiedliche Abbildungsverhältnis M1 und M2 erreichen. Der Vorteil dieser Anordnung ist, dass dies variabel geschehen kann, so dass man z. B. auch für den Einfluss der Stoksschen Verschiebung optimieren kann.
In ist ein System ähnlich zu gezeigt, bei dem die Lochblende und zwei Linsen nicht vorhanden sind. Dies erhöht ggf. die optische Effizienz.
In ist eine Anordnung gezeigt, bei der das Emissionslicht vor dem Erreichen des „descans” ausgekoppelt wird und nun mit einer zweiten Scaneinheit, die Scanposition auf der Kamera festgelegt wird. Eine konfokale Lochblende ist hier nicht möglich, aber der gewünschte Auflösungseffekt lässt sich dennoch erzielen.
Vorteilhafte Ausführungsform, die es erlaubt, ein vorhandenes Scansystem zu verwenden. Bei Fluoreszenz wird das Emissionslicht einer zusätzlichen Spiegelung unterworfen, bevor es auf dem Rückweg den Scanner durchläuft. Dadurch wird es in die Gegenrichtung zur herkömmlichen Anordnung gescannt, was einer relativen Scan-Geschwindigkeit im Bild (hier direkt an der Sonst-Lochblenden-Ebene) von 2× gleichkommt. Das Emissionslicht nimmt vor dem Descan einen anderen optischen Weg als das eingestrahlte Licht. Als Resultat ergibt sich eine Bildspiegelung, was statt des üblichen Descans ein Scannen mit doppelter Geschwindigkeit im Bild zur Folge hat. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass keine Modifikationen am Scansystem nötig sind. Es ist also durch einen geeigneten Einschub in existierende Systeme oder durch geringe Modifikation der Systeme möglich, den gewünschten Auflösungseffekt zu erhalten.
und zeigen Detailansichten des Einschubs und von dessen Funktionsprinzip
zeigt beispielhaft, wie mit Mikrolinsen-Arrays eine parallele Version ähnlich eines Nipkow-Disk oder Yokagawa-Systems mit verbesserter Auflösung realisiert werden kann. Hier sind drei Mikrolinsen-Arrays (z. B. in Scheibenform wie beim Yokagawa System) miteinander mechanisch stabil verbunden. Die Mikrolinsen-Arrays haben verschiedene Fokallängen, um den gewünschten Effekt der variablen lokalen Vergrößerung zu erreichen. Wichtig ist, dass das Bild der Lochblenden, bei anderer Zwischenvergrößerung trotzdem aufrecht steht. Dies lässt sich durch geeignete Wahl der Abstände a1, a2 und a3 zwischen den Mikrolinsen-Arrays und geeignete Wahl der Fokallängen f1, f2 erreichen, wie z. B. beschrieben in http://www.livephysics.com/problems-and-answers/optics/lens-system-image-distancemagnification/ Das Zwischenbild in der Bildebene (vom Lochblendenarray) wird dann über einen Strahlteiler ausgespiegelt (Farbteiler für Fluoreszenz) und mit konventioneller Optik (hier nicht gezeigt) auf eine Kamera oder in das beobachtende Auge abgebildet. Zur Beleuchtung ist ein drittes gekoppeltes Mikrolinsenarray vorgesehen, dass in die Zwischenbildebene projiziert und dort beugungsbegrenzte Foci erzeugt.

Bei dieser Anordnung lässt sich durch Verschieben der Mikrolinsenarrays auf der Achse in vorteilhafter Weise die Lokalvergrößerung variieren. Weiterhin (wie aus dem Yokagawa-System bekannt) lassen sich die mechanisch verbundenen Scheiben sehr schnell scannen, so dass hohe Bildraten erzielt werden können. Definitionen

emittiertes Signal	jede Form von Welle, die Abbildung erlaubt. Z. B. sichtbares Licht, IR Licht, UV-Licht, Röntgenstrählen, Ultraschall. Hierbei ist es unerheblich, ob die Emission dieselbe Wellenlänge wie ein Beleuchtungsfokus hat, es kohärent oder incohärent zu diesem ist. Es kann sich z. B. um Fluoreszenz oder auch Streulicht handeln.
Array-Detektor	charge coupled device (CCD), electron Multiplying CCDs (emCCDs), intensified CCDs oder intensified CMOS, electron Bombardment cameras, CMOS, scientific CMOS (sCMOS), ortsaufgelöste Einzelphotonenzählung (Europhoton, Leibnitz Inst. für Neurobiologie Magdeburg), Film-Detektion. Hierbei muss kein tatsächliches „array” existieren, nur eine Ortsauflösung muss vorhanden sein.
Beleuchtungsfoci	jede Form von Einfluss auf das Objekt, dass das emittierte Signal zu beeinflussen imstande ist und sich räumlich lokalisieren lässt. Dies kann z. B. Beleuchtungslicht zur Erzeugung von Fluoreszenz in der Probe sein, aber auch eine magnetische Spitze, welche die Probe abrastert.
Bild	Das Bild kann zweidimensional aber auch eindimensional sein.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sheppard et al. [0002]
Enderlein et al. [0002]
Shroff et al. [0002]
Sheppard 1988, Optik 80, 53–54, Müller&Enderlein PRL 104, 198101 (2010) [0012]
York et al., Nature Methods 8, 327–333, 2011 [0012]
Sheppard 1988, Optik 80, 53–54, Müller&Enderlein PRL 104, 198101 (2010) [0016]
York et al., Nature Methods 8, 327–333, 2011 [0016]
Sheppard 1988 [0018]
http://www.livephysics.com/problems-and-answers/optics/lens-system-image-distancemagnification/ [0035]

Claims

Verfahren, welches das abzubildende Objekt mit einem oder mehreren Beleuchtungsfoci abrastert und das emittierte Signal direkt ein Bild auf einem Array-Detektor oder im Auge erzeugt, unter besonderer Berücksichtigung, dass ein zu einem Zeitpunkt emittiertes Signal von der Nähe eines Focuses ein anderes Abbildungsverhältnis erfährt als das gerasterte Bild, beschrieben durch die nominellen Position(en) eines oder mehrerer Beleuchtungsfoci.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest eine Achse des Gesamtbildes durch Scannen des/der Beleuchtungsfoci und Descannen und Rescannen des emittierten Signals verwirklicht ist, wobei zwischen Descannen und Rescannen Mittel eingeführt werden, die das emittierte Signal derart beeinflussen, dass dies zu der gewünschten Änderung des Abbildungsmaßstabes kommt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, die die Änderung des Abbildungsmaßstabes durch mehrfache Benutzung der Scaneinrichtung erreichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei die Änderung des Abbildungsmaßstabes durch eine verkleinernde optische Abbildung zwischen dem Descan und dem Rescan Vorgang verwirklicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei räumlich getrennte Descan und Rescan Mittel eingesetzt werden. Der Maßstab lässt sich somit elektronisch variieren. Eine Lochblende kann, aber muss nicht verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei räumlich getrennte Scan und Descan Mittel eingesetzt werden. Der Maßstab lässt sich somit elektronisch variieren. Eine Lochblende kann, aber muss nicht verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei der Scanvorgang durch ein Mikrolinsenarray und/oder Lochblendenarray realisiert ist und die Veränderung des Abbildungsmaßstabes durch ein Mikrolinsenarray mit anderer Fokallänge mit oder ohne Lochblendenarray realisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei der Scanvorgang durch ein Mikrolinsenarray und/oder Lochblendenarray realisiert ist und die Veränderung des Abbildungsmaßstabes durch eine geeignete Zwischenvergrößerung und ein Mikrolinsenarray mit gleicher Fokallänge, aber anderem Linsenabstand, mit oder ohne Lochblendenarray realisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, wobei der Scanvorgang durch ein Mikrolinsenarray und/oder Lochblendenarray realisiert ist und ein Mikrolinsenarray hinter einem Lochblendenarray zum Einsatz kommt, um die Vergrößerungsänderung zu realisieren.
Verfahren nach einem der vorigen Ansprüche, wobei es zur Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei zur Beleuchtung während das Scanvorgangs eine Lichtquelle verwendet wird, die eine 2-photonen Absorption in der Probe ermöglicht. Damit kann man das Problem des extended-Focus Effektes umgehen. Die Anregung definiert die Schnitttiefe.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Emissionslicht vor dem Descannen durch geeignete optische Mittel derart beeinflusst wird, dass sich der optische Abbildungsmaßstab des Objekts ändert bzw. im Sinne einer Spiegelung umdreht.