DE102015116435A1

DE102015116435A1 - Hochauflösende Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier Spektralbereiche

Info

Publication number: DE102015116435A1
Application number: DE102015116435.3A
Authority: DE
Inventors: Ingo Kleppe; Ralf Wolleschensky; Yauheni Novikau
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2017-03-30
Also published as: US20190056580A1; WO2017055405A1; JP6753935B2; CN108139578B; JP2018531433A; CN108139578A; US10401607B2

Abstract

Zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie wird eine Probe (2) mit Beleuchtungsstrahlung (5) derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt, dass die Beleuchtungsstrahlung (5) an einen Punkt in oder auf der Probe (2) zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) gebündelt wird. Der Punkt wird beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild (17) auf einen Detektor (19) abgebildet, wobei der Detektor (19) Detektorelemente (25) mehrere Ortskanäle (21) hat, die eine Beugungsstruktur des Beugungsbildes (17) auflösen. Die Probe (2) wird mittels verschiedener Scanpositionen mit einer Schrittweite abgetastet, die kleiner sind als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks (14). Aus den Daten des Detektors (19) und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen wird ein Bild der Probe (2) erzeugt, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist. Zum Unterscheiden von mindestens zwei vorbestimmten Spektralkanälen (R, G) in der Fluoreszenzstrahlung von der Probe (2) besteht für jeden Ortskanal (21) ein unabhängiger Strahlengang bis zu einem Trennelement (30), das diese Strahlengänge in die Spektralkanäle (R, G) spektral aufteilt, die Spektralkanäle (R, G) der verschiedenen Ortskanäle wieder zu einer gleichen Anzahl an weiteren unabhängigen Strahlengängen (28) so mischt, dass mehrere der weiteren unabhängigen Strahlengänge (28) die Strahlung in verschiedenen Spektralkanälen (R, G) und von verschiedenen Ortskanälen (21) erhält, und jeden dieser weiteren unabhängigen Strahlengänge (28) zu einem der Detektorelemente (25) leitet.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe, wobei die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird, der Punkt beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf eine ortsauflösende Detektoreinrichtung abgebildet wird, die eine Ortsauflösung aufweist, welche eine Beugungsstruktur des Beugungsbildes auflöst, der Punkt relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, von der Detektoreinrichtung für jede Scanposition Intensitätsdaten ausgelesen und aus den Intensitätsdaten und den ihnen zugeordneten Scanpositionen ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung des Punktes gesteigert ist.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die ein im Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt, einer Abbildungseinrichtung zum beugungsbegrenzten Abbilden des Punktes in der Fokalebene durch die Optik in ein Beugungsbild auf eine Detektoreinrichtung, deren Detektionsfläche in einer zur Fokalebene konjugierten Detektorebene liegt, wobei die Detektoreinrichtung eine Ortsauflösung aufweist, die eine Beugungsstruktur des Beugungsbildes auflöst, einer Scaneinrichtung zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als ein halber Durchmesser des Beleuchtungsflecks, einer Auswerteeinrichtung zum Auslesen von Intensitätsdaten der Detektoreinrichtung und zum Erzeugen eines Bildes der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze gesteigert ist, aus den Intensitätsdaten und den ihnen zugeordneten Scanpositionen.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z. B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird mit Anregungsstrahlung darstellender Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und die dadurch angeregte Lumineszenzstrahlung mit geeigneten Detektoren erfasst. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Mikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren.
Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfasst also beide Prozesse. Soweit hier von Fluoreszenz gesprochen wird, ist das pars pro toto und nicht einschränken zu verstehen.
Zur Probenuntersuchung ist es auch bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene abbilden, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es, ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird.
Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskops, auch die eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Der Begriff „hochauflösend” wird hier für Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze verwendet.
Die US 5043570 beschreibt einen Versuch, die Auflösung durch ”oversampling” zu erhöhen. Dies führt nicht zu einer deutlich verbesserten Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze des Mikroskops.
Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 gegenüber einem beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der US 5866911 beschrieben. Für die Entvölkerungsprozesse sind verschiedene Ansätze bekannt, beispielsweise wie in der DE 4416558 C2 , US 6633432 oder DE 10325460 A1 beschrieben.
Ein weiteres hochauflösendes Mikroskopieverfahren wird in US 5867604 angesprochen, in der ein Objekt mit einer periodischen Struktur abgetastet wird. Ein ähnliches Verfahren zur Auflösungssteigerung wird in der EP 1157297 B1 angesprochen. Strukturierte Beleuchtung nutz nichtlineare Prozesse, z. B. eine Sättigung der Fluoreszenz. Der Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild.
Ein Verfahren, das im Weitfeld eine Hochauflösung erreicht, ist aus der WO 2006127692 und der DE 10 2006 021 317 bekannt. Dieses mit PALM abgekürzte Verfahren (Photo Activated Light Microscopy) verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen Aktivierungssignals aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz mit Anregungsstrahlung zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Die Aktivierung wird so vorgenommen, dass zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet sind, dass sie gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt oder nachträglich trennbar sind. Nach Aufnahme der Lumineszenzstrahlung wird für diese isolierten Moleküle dann das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter Strahlungsverteilung ermittelt und daraus rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmt, als es die optische Abbildung eigentlich zulässt. Zur Abbildung der gesamten Probe wird die Isolierung der Markierungsmoleküle der Teilmenge durch Einbringen der Aktivierungsstrahlung, nachfolgende Anregung und Fluoreszenzstrahlungsabbildung so lange wiederholt, bis möglichst alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge enthalten und isoliert waren.
Weitere hochauflösende Verfahren sind in Hell, "Far-Field Optical Nanoscopy"., Science 316, 1153–1158, 2007, beschrieben.
Ein gattungsgemäßes Verfahren und Mikroskop ist aus der EP 2317362 A1 bekannt; es ist als Airy-Scan-Mikroskopie bekannt. Diese gattungsbildende Druckschrift kombiniert in der dort in 5 dargestellten und beschriebenen Ausführungsform eine beugungsbegrenzte Beleuchtung der Probe mit einem Flächendetektor, der das Beugungsbild des beleuchteten Punktes auflöst. Der Detektor liegt damit in einer Ebene, in der bei einem herkömmlichen LSM das Pinhole wäre. Eine Scaneinrichtung verschiebt Beleuchtungsspots über die Probe und ist so ausgebildet, dass das Beugungsbild des mit dem Beleuchtungsfleck beleuchteten Punktes auf dem Flächendetektor ruht. Im Konzept der EP 2317362 A1 ist der Flächendetektor in der Pinhole-Ebene mit einer Ortsauflösung versehen, die bezogen auf den Abbildungsmaßstab eine Überabtastung des Beugungsbildes bewirkt und es somit zusammen mit einer besonderen Signalverarbeitung erlaubt, die Beugungsstruktur des Beugungsbildes abzutasten.
Die EP 2317362 A1 sieht eine Ausführungsform vor, bei der eine Farbanalyse möglich ist. Dazu werden mehrere Detektoren vorgesehen, die in entsprechenden Spektralkanälen liegen, welche durch einen dichroitischen Farbteiler gebildet werden. Dieser Ansatz ist für die Laser-Scanning-Mikroskopie schon seit langem bekannt. Er hat jedoch den Nachteil, dass für jeden Farbkanal ein entsprechender Farbteiler mit entsprechendem Detektor nötig ist. Bei der herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskopie, die einen nicht ortsauflösenden Detektor hinter einer konfokalen Lochblende (Pinhole) verwendet, ist diese Anforderung weitgehend unproblematisch; bei der Verwendung eines überabtastenden Flächendetektors gemäß EP 2317362 A1 entsteht jedoch ein erheblicher Aufwand, zumal solche Flächendetektoren teuer sind. Zudem müssten im Überabtastungsprinzip gemäß EP 2317362 A1 diese mehreren Flächendetektoren sub-pixelgenau zueinander justiert werden, da ansonsten ein Farbfehler zwischen den erzeugten Bildern der einzelnen Farbkanäle entstünde, der dadurch herrührt, dass für die hochauflösenden Bilder die Daten der Flächendetektoren auf die Scanposition, welche in Schritten verschoben wird, die klein gegen den Durchmesser des Beleuchtungsflecks sind, verschoben wird. Nur wenn die Flächendetektoren in allen Farbkanälen zur optischen Achse sub-pixelgenau justiert sind, passen die Bilder der einzelnen Farbkanäle übereinander.
Die DE 10 2013 019 378 A1 schlägt für das aus der EP 2317362 A1 bekannte Mikroskop eine Weiterbildung zur Farbanalyse vor, bei der die zwei ortsauflösenden Flächendetektoren durch zwei Lichtleitfaserbündel gebildet werden, die die Strahlung zu einem Detektor führen, der mehrere Detektorelemente hat. Eine Hälfte der Detektorelemente sind mit einer Lichtleitfaser verbunden, die andere Hälfte mit der anderen Lichtleitfaser. Ein spektral aufgliederndes Element sorgt dafür, dass die beiden Lichtleitfasern Strahlungen unterschiedlicher Spektralkanäle erhalten. Die Farbinformation wird somit auf Kosten einer stark verringerten Ortsauflösung erreicht. Dies Problematik verschärft sich mit der Zahl der Farben. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bzw. ein Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass eine Farbinformation gewonnen werden kann, wobei der Justieraufwand für mehrere Farbkanäle gemindert ist oder sogar entfällt und zugleich die erzielbare Ortsauflösung möglichst nicht reduziert ist, so dass auch eine Vielzahl von Farbkanälen möglich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe, wobei die Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird, der Punkt beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf eine Detektionsfläche einer ortsauflösenden Detektoreinrichtung abgebildet wird, wobei die Detektionsfläche Ortskanäle aufweist, die eine Ortsauflösung der Detektoreinrichtung festlegen, welche eine Beugungsstruktur des Beugungsbildes auflöst, die Detektoreinrichtung mindestens so viele Detektorelemente wie Ortskanäle aufweist, wobei die Strahlung des Beugungsbildes, die auf die Ortskanäle fällt, auf die Detektorelemente geleitet wird, die Detektoreinrichtung eine spektrale Trenn- und Mischeinrichtung aufweist, welche die in jedem Ortskanal aufgenommene Strahlung in mehrere Spektralkanäle spektral auftrennt, wobei für jeden der Spektralkanäle eine individuelle Zuordnung von Ortskanälen zu Detektorelementen so erfolgt, dass mehrere der Detektorelemente Strahlung in verschiedenen Spektralkanälen und von verschiedenen Ortskanälen empfangen, der Punkt relativ zur Probe in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, von den Detektorelementen für jede Scanposition Intensitätsdaten ausgelesen und aus den Intensitätsdaten und den ihnen zugeordneten Scanpositionen ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung des Punktes gesteigert ist, wobei für jedes Detektorelement die ihm zugeordneten Spektralkanäle und Ortskanäle berücksichtigt werden und das Bild der Probe multispektral erzeugt wird.
Die Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Mikroskop zur hochauflösenden Scanning Mikroskopie mit einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe, die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, einer Optik, die ein im Probenraum liegende Fokalebene und eine Auflösungsgrenze hat, einer Beleuchtungseinrichtung, die einen Eingang zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung aufweist und die über die Optik den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung derart beleuchtet, dass die Optik die Beleuchtungsstrahlung an einem Punkt in der Fokalebene zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck bündelt, einer Abbildungseinrichtung zum beugungsbegrenzten Abbilden des Punktes in der Fokalebene durch die Optik in ein Beugungsbild, eine ortsauflösende Detektoreinrichtung mit einer Detektionsfläche, die in einer zur Fokalebene konjugierten Detektorebene liegt, wobei die Detektionsfläche Ortskanäle aufweist, die eine Ortsauflösung der Detektoreinrichtung festlegen, welche eine Beugungsstruktur des Beugungsbildes auflöst, die Detektoreinrichtung mindestens so viele Detektorelemente wie Ortskanäle aufweist, wobei die Strahlung des Beugungsbildes, die auf die Ortskanäle fällt, auf die Detektorelemente geleitet ist, die Detektoreinrichtung eine spektrale Trenn- und Mischeinrichtung aufweist, welche die in jedem Ortskanal aufgenommene Strahlung in mehrere Spektralkanäle spektral auftrennt, wobei die Trenn- und Mischeinrichtung für jeden der Spektralkanäle eine individuelle Zuordnung von Ortskanälen zu Detektorelementen so bewirkt, dass mehrere der Detektorelemente Strahlung in verschiedenen Spektralkanälen und von verschiedenen Ortskanälen empfangen, einer Scaneinrichtung zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks, einer Auswerteeinrichtung zum Auslesen von Intensitätsdaten von den Detektorelementen und den ihnen zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe aus den Intensitätsdaten und den ihnen zugeordneten Scanpositionen erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze der Optik gesteigert ist, wobei die Auswerteeinrichtung für jedes Detektorelement die ihm zugeordneten Spektralkanäle und Ortskanäle berücksichtigt und das Bild der Probe multispektral erzeugt.
Das aus der EP 2317362 A1 bekannte und auch dem hier beschriebenen Mikroskop bzw. Verfahren zugrundeliegende Prinzip nimmt in der Detektionsebene die Strahlung in einer Vielzahl an Ortskanälen auf, die so bemessen sind, dass die Beugungsstruktur des Beugungsbildes aufgelöst wird. Zum Erreichen einer spektralen Auflösung wird die Strahlung eines jeden Ortskanals in einem eigenen Strahlengang geführt. Ein Trennelement trennt die Strahlung der Mehrzahl der Ortskanäle in mehrere Spektralkanäle und mischt dann die getrennten Strahlungen aus verschiedenen bevorzugt verschiedenen Ortskanälen und verschiedenen Spektralkanälen zu neuen unabhängigen Strahlengängen, also gemischten Kanälen, zusammen. Damit enthalten die gemischten Kanäle gleichzeitig Strahlungen in verschiedenen Spektralkanälen und aus verschiedenen Ortskanälen. Jeder der gemischten Kanäle führt dann zu einem Detektorelement, das die Summenintensität der Strahlung in diesem gemischten Kanal misst. Für jedes Detektorelement ist bekannt, aus welchen Ortskanälen und Spektralkanälen die Strahlung kombiniert ist, die das Detektorelement empfängt. Mit dieser bekannten Information kann dann in der Auswertung sowohl eine Ortsinformation, die über die Beugungsgrenze der Abbildung hinausgeht, als auch eine Farbinformation gewonnen werden.
Die Mischung wird dadurch bewirkt, dass für die Mehrzahl der Ortskanäle die aufgenommene Strahlung in mehrere Spektralkanäle spektral aufgetrennt wird. In diesem Zustand liegen für jeden Ortskanal mehrere Spektralkanäle vor. Diese Spektralkanäle werden dann wieder zu den gemischten Kanälen zusammengeführt, wobei natürlich nicht die Spektralkanäle eines Ortskanals wieder zusammengefasst werden, sondern es werden Spektralkanäle unterschiedlicher Ortskanäle und/oder Ortskanäle unterschiedlicher Spektralkanäle zusammengefasst. Dadurch bewirkt die Trenn- und Mischeinrichtung für jeden der Spektralkanäle eine individuelle Zuordnung von Ortskanälen zu Detektorelementen. Mehrere, insbesondere alle Detektorelemente empfangen dann Strahlung in den verschiedenen Spektralkanälen und aus verschiedenen Ortskanälen.
Dieses Mischen oder Umverteilen der spektralen Information und der Ortskanäle kann physikalisch als Manipulation der Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) aufgefasst werden. An der Detektionsfläche liegt die Punktbildverwaschungsfunktion so vor, wie sie beugungsbegrenzt von der Abbildung bzw. der Optik bereitgestellt ist, beispielsweise in Form des eingangs genannten Airy-Scheibchens. Diese Punktbildverwaschungsfunktion wird nun beim Weiterleiten auf die strahlungsempfindlichen Detektorelemente durch die Umverteilung der Ortskanäle und der Spektralinformation so manipuliert, dass auf den strahlungsempfindlichen Detektorelemente die Farbinformation und die Ortsinformation gemischt werden, so dass sie anders verteilt sind, als in der Detektionsfläche/Pinholeebene. Die Entmischung und Rekonstruktion ist dann immer noch unproblematisch möglich, da aufgrund der geringen Schrittweite, mit der die Scanpositionen auseinander liegen, jedes Beugungsbild eines punktförmigen Emitters in der Probe mehrere Male in unterschiedlichen Lagen auf der Detektionsfläche abgebildet und mit der durch die Umverteilung manipulierten Punktbildverwaschungsfunktion erfasst wird.
Die Güte der spektralen Trennung wird im Wesentlichen durch die Güte der spektralen Aufspaltung im spektralen Trenn- und Mischelement dominiert, nicht jedoch von Fehlern bei der Bildinformationsgewinnung, also dem datentechnischen Entmischen. Das Mischen kann beispielsweise durch eine Faserkopplung in der Detektorebene, also in der Ebene, in welcher die Detektionsfläche liegt, geschehen, wodurch die Strahlengänge der Ortskanäle quasi crosstalk-frei parallelisiert und beliebig umsortiert werden können. Anschließend erfolgt die spektrale Trennung, also eine chromatische Aufspaltung für die einzelnen Ortskanäle.
Die Spektralkanäle der Ortskanäle werden idealerweise dann so wieder zusammengemischt, dass sich die effektiven Punktbildverwaschungsfunktionen für die in einem gemischten Kanal zusammengeführten Spektralkanäle möglichst maximal unterscheiden. Auf diese Weise besitzt das für die Gewinnung der Orts- und Farbinformation (Entmischen) gebildete Gleichungssystem viele linear unabhängige Gleichungen.
Das erfindungsgemäße Vorgehen erlaubt es, mit einer Detektoreinrichtung eine Spektralinformation zu gewinnen, ohne dass die Zahl der Ortskanäle reduziert wäre. Die Zahl der Ortskanäle wirkt sich letztlich darauf aus, wie stark das erzeugte Bild über die Ortsauflösung der Optik hinaus aufgelöst ist. Bei den Ansätzen des Standes der Technik, bei denen für jeden Spektralkanal ein eigenständiger Detektor verwendet wird, ist die Zahl der Detektorelemente gleich dem Produkt aus Anzahl der Ortskanäle und Anzahl der Spektralkanäle. Es ist für die Erfindung hingegen bevorzugt, dass die Zahl der verwendeten Detektorelemente kleiner ist als dieses Produkt. Besonders bevorzugt ist die Zahl der Detektorelemente gleich der Zahl der Ortskanäle.
Es ist im Rahmen der Erfindung möglich, einzelne Detektorelemente mit Strahlung aus nur einem Spektralkanal oder Ortskanal zu beaufschlagen, beispielsweise um ein spektrales oder ein neutrales Referenzsignal zu erzeugen, das beispielsweise für Normierungen verwendet werden kann. Im Hinblick auf eine möglichst maximale Orts- und Spektralauflösung ist es jedoch bevorzugt, dass jedes Detektorelement Strahlung von mindestens zwei, bevorzugt von allen Spektralkanälen empfängt.
Eine im Stand der Technik bekannte Methode, um Detektoren einsetzen zu können, deren Geometrie von dem Bildfeld abweicht, das in der Detektionsfläche zur Aufnahme des Beugungsbildes benötigt wird, ist es, ein Umverteilungselement in Form eines Lichtleitfaserbündels vorzusehen, wobei die Eintrittsfacetten in einer Eintrittsfläche des Bündels liegen, welche die Detektionsfläche bildet. Die Eintrittsfacetten der Lichtleitfasern legen damit die Ortskanäle fest. In Weiterbildung dieses bekannten Konzeptes, ist die spektrale Trenn- und Mischeinrichtung den Lichtleitfasern nachgeordnet und weist Einzeltrennelemente auf, wobei jedem Ortskanal ein Einzeltrennelement zugeordnet ist, so dass jede Lichtleitfaser die von ihr geführte Strahlung des jeweiligen Ortskanals zu einem der Einzeltrennelemente leitet und das Einzeltrennelement die Strahlung dieses Ortskanals in die Spektralkanäle aufteilt. Anschließend kann die Strahlung als Freistrahloptik dann auf einen Detektor, der die Detektorelemente aufweist, geleitet werden, wobei die Geometrie, in welcher die Detektorelemente angeordnet sind und die Geometrie, in welcher die Einzeltrennelemente angeordnet sind, aufeinander abgestimmt sind. Wird beispielsweise als Detektor eine Detektorzeile verwendet, werden auch die Einzeltrennelemente zeilenförmig aufgereiht. Alternativ ist es möglich, die Strahlung nach den Einzeltrennelementen wieder in Lichtleitfasern einzukoppeln, und jede Lichtleitfaser führt dann zu einem der Detektorelemente.
Ein Beugungsscheibchen entsteht bei der Beugung eines optischen Strahls an einer kreisförmigen Blende. Es erscheint ein zentrales Maximum, das Beugungsscheibchen, das umgeben ist von Ringen abnehmender Strahlungsintensität. Selbst ein nach den Gesetzen der geometrischen Optik perfektes Mikroskop, also auch ohne Abbildungsfehler, kann einen Punkt nicht genau auf einen Punkt abbilden, sondern durch die Beugung des Lichts an der Apertur nur auf einen unscharfen Fleck. Dies wird als beugungsbegrenzte Abbildung bezeichnet. Gleiches gilt bei beugungsbegrenzter Beleuchtung eines Punktes. Zwei Punkte lassen sich in klassischer Strahlenoptik nach dem sog. Rayleigh-Kriterium trennen, wenn die Maxima ihrer Abbilder im Beugungsbild mindestens um den Radius r des Beugungsscheibchens auseinander liegen. Die Form des Flecks hängt reziprok von der Form der Apertur ab, insbesondere ist seine Größe umgekehrt proportional zur Größe der Apertur. Die Größe des Beugungsscheibchens ergibt sich aus der ersten Nullstelle der Besselfunktion erster Art, die bei etwa r = 0,6098 liegt. Das Beugungsscheibchen (also der zentrale Beugungsfleck) wird nach dem englischen Astronomen George Biddell Airy auch Airy-Scheibchen genannt. Im Scanning-Mikroskop ist sowohl bei Beleuchtung als auch bei Abbildung die Apertur, gegeben durch die runde Fassung der Optiken, kreisförmig. Da Größe des Beugungsscheibchens zudem von der Wellenlänge abhängt, ist es bei der zu Anregung dienenden beugungsbegrenzten Beleuchtung kleiner als bei der stokesverschobenen, also langwelligeren Fluoreszenzstrahlung. Der Begriff „beugungsbegrenzt” soll hier nicht auf die Beugungsgrenze gemäß der Abbe'schen Theorie beschränkt sein, sondern auch Fälle erfassen, in denen auf Grund realer Unzulänglichkeiten oder Einschränkungen das theoretische Maximum um 20% verfehlt wird. Auch dann hat das Einzelbild eine Struktur, die hier als Beugungsstruktur bezeichnet wird. Sie wird überabgetastet.
Da im Rekonstruktionsverfahren gemäß EP 2317362 A1 aufgrund der scannenden Verschiebung mit einer Schrittweite, die kleiner ist als die Größe des Beleuchtungsflecks, eine Vielzahl an Messungen für jeden einzelnen Punkt in der Probe vorliegt, ergibt sich eine Überbestimmtheit im aufzustellenden und zu lösenden Gleichungssystem, so dass nicht nur die Ortsangaben und Intensitäten für die einzelnen Punkte mit einer Hochauflösung angegeben werden können, sondern auch die Angabe der Spektralbereiche, d. h. der Farbe.
Das erfindungsgemäße Konzept kann auch in parallelisierter Form für mehrere Flecken gleichzeitig durchgeführt werden, wie dies für die Laserscanningmikroskopie bekannt ist. Es werden dann mehrere Spots auf der Probe scannend abgetastet, und die Einzelbilder der mehreren Spots liegen ruhend in der Detektionsebene nebeneinander. Die nachfolgende Beschreibung konzentriert sich exemplarisch auf die Abtastung mit einem einzelnen Punkt-Fleck. Dies soll jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden, und die erläuterten Merkmale und Grundsätze gelten sinngemäß auch für die parallel Abtastung mehrerer Punkt-Flecken wie auch für die Verwendung eines Linienflecks. Letzterer ist natürlich nur quer zur Linienerstreckung beugungsbegrenzt, so dass die diesbezüglichen Merkmale dieser Beschreibung dann nur in einer Richtung (quer zur Linienerstreckung) gelten.
Die Abbildung eines gewünschten Bereichs der Probe erfolgt wie in einem üblichen LSM scannend. Da Beleuchtung und die Abbildung bzw. die entsprechenden Einrichtungen eine gemeinsame optische Scaneinrichtung haben, welche den Beleuchtungsfleck über die Probe führt und zugleich den mit dem Beleuchtungsfleck zusammenfallenden Punkt, an dem die Probe abgebildet wird, in Bezug auf den Detektor wieder descannt, kann man eine Zoomoptik in den gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Abbildungseinrichtung setzen. Sie erlaubt es, eine Anpassung des Beugungsbildes an die Größe des Flächendetektors vorzunehmen und zusätzlich die verfügbare Beleuchtungsstrahlung ohne Randverluste vollständig in die Objektivpupille, welche sich mit Wahl des Objektives ändern kann, einzukoppeln.
Die Auflösung der Beugungsstruktur des Einzelbildes erlaubt es zusätzlich, eine Bewegungsrichtung des Flecks zu ermitteln, entlang dieser während des Abtastens der Probe verschoben wird. Diese Bewegungsrichtung ist zwar grundsätzlich aus der Mechanik des Scanners (beispielsweise eines Scanspiegels oder eines beweglichen Probentisches) bekannt, jedoch ergeben sich hier mechanisch bedingte Restungenauigkeiten. Diese können eliminiert werden, indem Signale einzelner Pixel des Detektorarrays mittels Kreuzkorrelation ausgewertet werden. Dabei macht man sich zunutze, dass sich, bezogen nebeneinanderliegende Bildpixel in der Probe aufgrund der beugungsbegrenzten Abbildung des beleuchteten Punktes in einem gewissen Maß überlappen, ihre Zentren jedoch nebeneinander liegen. Unterzieht man die Signale solcher Bildpixel einer Kreuzkorrelation, kann man eine Restungenauigkeit, welche aufgrund unvermeidlicher Toleranzen der Scanmechanik verbleibt, reduzieren bzw. vollständig eliminieren.
Soweit hier ein Verfahren beschrieben wird, realisiert eine Auswerteeinrichtung, z. B. ein Steuergerät, diese Verfahrensschritte im Betrieb des Mikroskops.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops zur hochauflösenden Mikroskopie,
2 eine Schemadarstellung, wie Strahlung aus verschiedenen Ortskanälen und verschiedenen Spektralkanälen auf Detektorelementen des Mikroskops der 1 gemischt ist,
3 eine Schemadarstellung der Punktbildverwaschungsfunktion am Eingang einer Detektoreinrichtung des Mikroskops der 1, wobei die Punktbildverwaschungsfunktion für zwei Farben eingetragen ist,
4 eine Schemadarstellung der sich durch Wirkung einer Trenn- und Mischeinrichtung des Mikroskops der 1 ergebenden Punktbildverwaschungsfunktion,
5 eine Schemadarstellung einer Ausführungsform des Trenn- und Mischelementes des Mikroskops der 1, und
6 ein Ablaufdiagramm für ein vom Mikroskop der 1 durchgeführtes Mikroskopieverfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier Spektralbereiche.
1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das zum Mikroskopieren einer Probe 2 ausgebildet ist. Das Laserscanningmikroskop (nachfolgend als LSM abgekürzt) 1 wird von einem Steuergerät C gesteuert und umfasst einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4. Der Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet einen Spot in der Probe 2, und der Abbildungsstrahlengang 4 bildet diesen Spot beugungsbegrenzt zur Detektion ab. Beleuchtungsstrahlengang 3 und Abbildungsstrahlengang 4 teilen sich eine Optik.
Die Beleuchtung der Probe 2 erfolgt im LSM 1 mittels eines bereitgestellten Laserstrahls 5, der über einen nicht weiter funktionell erforderlichen Umlenkspiegel 6 und eine Linse 7 auf einen Spiegel 8 eingekoppelt wird. Der Spiegel 8 sorgt dafür, dass der Laserstrahl 5 unter einem Reflexionswinkel auf ein Einkoppelelement, z. B. einen Emissionsfilter 9 fällt. Zur übersichtlicheren Darstellung ist für den Laserstrahl 5 lediglich dessen Hauptachse eingezeichnet.
Nach Reflexion am Emissionsfilter 9 wird der Laserstrahl 5 von einem Scanner 10 zweiachsig abgelenkt und mittels Linsen 11 und 12 durch ein Objektiv 13 als beugungsbegrenzter Beleuchtungsfleck 14 in eine Fokalebene 29 in der Probe 2 fokussiert. Der Beleuchtungsfleck 14 ist dabei in der Darstellung der 1 punktförmig, es ist jedoch auch ein linienförmiger Beleuchtungsfleck möglich. Fluoreszenzstrahlung, die am Ort (z. B. Punkt) des Beleuchtungsfleck 14 angeregt wurde, wird aus der Fokalebene 29 über das Objektiv 13, die Linsen 11 und 12 wieder zum Scanner 10 geleitet, nachdem in Abbildungsrichtung wiederum ein ruhender Lichtstrahl vorliegt. Dieser fällt durch das Emissionsfilter 9, welches hier zusätzlich die Funktion hat, die Fluoreszenzstrahlung im Beleuchtungsfleck 14 hinsichtlich ihrer Wellenlänge zu selektieren und der Beleuchtungsstrahlung des Laserstrahls 5, die beispielsweise als Anregungsstrahlung dienen kann, abzublocken. Zusätzlich ist optional ein Emissionsfilter 15 zum Abblocken der Beleuchtungsstrahlung vorgesehen. Eine Linse 16 sorgt dafür, dass insgesamt der Ort des Beleuchtungsflecks 14 in ein beugungsbegrenztes Beugungsbild 17 abgebildet wird, welches in einer Detektionsebene 18 liegt. Die Detektionsebene 18 ist eine konjugierte Ebene zur Fokalebene 29, in welcher der Beleuchtungsfleck 14 in der Probe 2 liegt.
Das Beugungsbild 17 des Beleuchtungsflecks 14 wird in der Detektionsebene 18 von einer Detektoreinrichtung 19 aufgenommen. Sie löst das beugungsbegrenzte Bild 17 des Spots 14 in der Detektionsebene 18 räumlich auf, bewirkt also eine Überabtastung in der Pinhole-Ebene.
Ein Steuergerät C steuert alle Komponenten des LSM 1, insbesondere Scanner 10 und Detektoreinrichtung 19. Das Steuergerät nimmt für verschiedene Scanstellungen die Daten jedes einzelnen Bildes 17 auf, analysiert dessen Beugungsstruktur und erzeugt ein hochaufgelöstes Gesamtbild der Probe 2, wie nachfolgend noch erläutert werden wird.
Das LSM 1 der 1 ist exemplarisch für einen einzigen Beleuchtungsfleck 14, der auf der Probe abgetastet wird, dargestellt. Es kann jedoch zugleich auch zur Abtastung gemäß einem Linien-Beleuchtungsfleck verwendet werden, der sich beispielsweise senkrecht zur Zeichnungsebene der 1 erstreckt. Auch ist es möglich, das LSM 1 der 1 so auszuführen, dass mehrere nebeneinanderliegende Punkt-Beleuchtungsflecke in der Probe abgetastet werden. Ihre entsprechenden Beugungsbilder 17 liegen dann in der Detektionsebene 18 ebenfalls nebeneinander. Die Detektoreinrichtung 19 ist dann entsprechend ausgestaltet, um die nebeneinanderliegenden Beugungsbilder 17 in der Detektionsebene 18 zu erfassen.
Die Detektoreinrichtung 19 weist ein Lichtleitfaserbündel 20 auf, welches unter Zwischenschaltung einer Trenn- und Mischeinrichtung 30 ein Detektorarray 24 speist. Das Lichtleitfaserbündel 20 ist aus Einzellichtfasern 21 aufgebaut. Eintrittsfacetten 26 der Lichtleitfasern 21 bilden den Lichtleitfaserbündeleingang, der in der Detektionsebene 18 liegt. Die Eintrittsfacetten 26 der Lichtleitfasern 21 stellen somit den Eingang von Ortskanälen oder Pixeln dar, mit denen das Beugungsbild 17 des Beleuchtungsflecks 14 aufgenommen wird.
Da der Beleuchtungsflecks 14 in der Ausführungsform der 1 exemplarisch ein Punkt-Spot ist, ist das Beugungsbild 17 ein Airy-Scheibchen, dessen Ausdehnung innerhalb des Kreises liegt, welcher in 1 die Detektionsebene 18 veranschaulicht. Es sei darauf hingewiesen, dass 1 in dieser Hinsicht eine Vereinfachung enthält. Die Ausdehnung des Lichtleitfaserbündeleingangs ist so groß, dass damit die Ausdehnung des Beugungsbildes 17 abgedeckt wird.
Die einzelnen Lichtleitfasern 21 im Lichtleitfaserbündel 20 sind mit ihren Ausgängen an die Trenn- und Mischeinrichtung 30 angeschlossen, für die eine Ausführungsform in 5 gezeigt ist. Von dort läuft ein weiteres Lichtleitfaserbündel 27 mit Lichtleitfasern 28 zu einem z. B. längserstreckten Stecker 23, in dem die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern 28 nebeneinander liegen. Der Stecker 23 ist passend zur geometrischen Anordnung der Detektorzeile 24 ausgebildet, d. h. jedes ausgangsseitige Ende einer Lichtleitfaser 28 liegt genau vor einem Detektorelement 25 der Detektorzeile 24.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Ausführung der Detektoreinrichtung 19 hinsichtlich der Ankopplung und Einbindung der Trenn- und Mischeinrichtung 30 exemplarisch ist. Grundsätzlich genügt für das Mikroskop 1 eine Detektoreinrichtung 19, die in der Detektionsebene 18 eine Überabtastung des Beugungsbildes 17 vornimmt und die derart geschaffenen Ortskanäle über die Trenn- und Mischeinrichtung 30 zu Detektorelementen 25 leitet. Insbesondere kann es sich bei diesen auch um eine rechteckige Detektorfläche mit die Detektorelemente realisierenden Pixeln handeln.
Ohne die Trenn- und Mischeinrichtung 30 entstünde bei der beugungsbegrenzten Abbildung des mit dem Beleuchtungsfleck 14 beleuchteten Punktes in der Fokalebene 29 in der zugeordneten konjugierten Detektionsebene 18 ein Beugungsbild 17, das aufgrund der kreisförmigen Appertur des Objektivs 13 ein Beugungsscheibchen ist. Die Entstehung solcher Beugungsscheibchen wurde im Allgemeinen bei der Beschreibung bereits erläutert. Bei der Mikroskopietechnik, wie sie in der EP 2317362 A1 beschrieben ist, wird durch Überabtastung des Beugungsbildes 17 dessen Struktur analysiert, und im Zusammenhang mit den Scanpositionen, die eine Schrittweite haben, welche klein gegen die minimale Abmessung des Beleuchtungsflecks 14 ist, kann eine Strukturaufklärung erfolgen, die über die Auflösungsgrenze der beugungsbegrenzten Abbildung hinausgeht.
Zur Erläuterung dieses Prinzips seien gedanklich zwei Stellen betrachtet, die in der Fokalebene 29 so eng beieinander liegen, dass sie mit der beugungsbegrenzten Auflösung nicht erfasst werden können. Beim Scannen des Beleuchtungsflecks 14 mit Schrittweiten, die klein gegen den Durchmesser des (in diesem Gedankenexperiment kreisförmigen) Beleuchtungsflecks sind, gelangt zuerst eine der beiden Stellen in den Beleuchtungsfleck. Die Strahlungsintensität im Beugungsbild 17 steigt je mehr diese erste Stelle in den Beleuchtungsfleck 14 gerät. Der Beleuchtungsfleck 14 hat aufgrund seiner beugungsbegrenzten Eigenschaften eine Intensität, die zum Zentrum hin steigt. Somit steigt die Intensität der Strahlung im Beugungsbild 14 in dem Maß, in dem die betrachtete erste Stelle mehr und mehr ins Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Wenn das Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 über die betrachtete Stelle hinweggewandert ist, nimmt die Intensität der Strahlung von dieser ersten Stelle wieder ab. Wäre die gedanklich angenommene zweite Stelle nicht benachbart, würde die Strahlungsintensität im Beugungsbild 17 wieder abklingen, wobei das Ansteigen und das Abnehmen der Strahlungsintensität im Beugungsbild 17 exakt mit dem Verlauf der Beleuchtungsintensität des Beleuchtungsflecks 14 (unter Berücksichtigung der Schrittweite und der Fluoreszenzempfindlichkeit der ersten Stelle) korreliert. Da nun aber eine zweite Stelle in enger Nachbarschaft vorhanden ist, beginnt diese zweite Stelle ebenfalls Fluoreszenzstrahlung zum Beugungsbild 17 beizusteuern, und zwar umso mehr, je näher ihr das Zentrum des Beleuchtungsflecks 14 rückt. Ansonsten gilt für die zweite Stelle natürlich genau das gleiche, wie für die erste Stelle. Im Ergebnis erhält man für die Schrittpositionen Beleuchtungsintensitäten im Beugungsbild 17, die anders sind, als wenn nur eine einzelne fluoreszierende Stelle vorhanden wäre. Durch die Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 und Berücksichtigung der aktuellen Scanposition lässt sich damit mathematisch ermitteln, dass und auch in welchem Abstand zwei Stellen in der Fokalebene 29 fluoreszierten, obwohl diese zwei Stellen mit einer beugungsbegrenzten Auflösung für sich alleine nicht identifizierbar wären. In der dem Fachmann technisch bekannten Umsetzung wird zur Auswertung der Daten des Flächendetektors 19 für jede Scanposition eine Gleichung aufgestellt, die mehrere Unbekannte enthält, insbesondere Intensität und Abstand der Stellen in der Fokalebene 29. Durch die Vielzahl an Scanpositionen erhält man ein Gleichungssystem, das überbestimmt ist und es erlaubt, Strahlungsintensität und Abstand, d. h. damit auch die Lage, der fluoreszierenden Stellen zu ermitteln. Dies wird nachfolgend noch erläutert werden.
Die Trenn- und Mischeinrichtung 30 bewirkt eine Manipulation der Punktbildverwaschungsfunktion, wie sie in der Detektorebene 18 vorliegt. Das Strahlprofil wird ortskanalweise, d. h. pixelweise, umsortiert. Um dieses Umsortieren leichter verständlich zu machen, sei als einfaches Beispiel eine zweifarbige Spektralinformation, d. h. die Verwendung von zwei Spektralkanälen in einem Fall mit zehn Ortskanälen betrachtet. Die Ortskanäle werden mit den arabischen Nummern 1 bis 10 bezeichnet. Die zehn Ortskanäle entsprechen zehn Detektorelementen 25, die für die Erläuterung mit I bis X durchnummeriert werden. Gleichermaßen hat dann das Lichtleitfaserbündel 20 eine Anzahl von zehn Eingangsfacetten 26, es führen also zehn Ortskanäle zur Trenn- und Mischeinrichtung 30. Die Trenn- und Mischeinrichtung 30 trennt jeden dieser Ortskanäle in zwei Spektralkanäle auf, z. B. einen roten Spektralkanal R und einen grünen Spektralkanal G. Die Trenn- und Mischeinrichtung 30 mischt dann zwei verschiedene Spektralkanäle aus zwei verschiedenen Ortskanälen immer paarweise zusammen und bildet so zehn gemischte Kanäle. Diese werden dann an die Detektorelemente 25 geleitet. 2 zeigt schematisch den dann erhaltenen Zustand. Hier sind die zehn Detektorelemente 25 mit den Nummern I...X schematisch als Kästchen eingetragen, auf denen jeweils der Spektralkanal R und der Spektralkanal G aus verschiedenen Ortskanälen zusammengefasst sind. Unter der Detektorzeile 25 sind die Nummern 1 bis 10 der Ortskanäle aufgetragen, aus denen die Strahlung des Spektralkanales G stammt. Über der Detektorzeile 24 die entsprechenden Nummern 1 bis 10 des Ortskanals, aus dem der Spektralkanal R stammt. Beispielsweise enthält das Detektorelement 25 mit der Nummer I den grünen Spektralkanal G aus dem Ortskanal Nummer 1 und den roten Spektralkanal R aus dem Ortskanal Nummer 6.
Die 3 und 4 zeigen die Wirkung dieser ortskanalweisen Umsortierung. 3 zeigt die Punktbildverwaschungsfunktion in der Detektorebene 18, vereinfacht als lineare Schnittdarstellung über Ortskanälen mit Nummern 1 bis 10. Die Punktbildverwaschungsfunktion 32a gilt dabei für den roten Spektralkanal R, die Punktbildverwaschungsfunktion 32b für den grünen Spektralkanal G. Die Wirkung der Trenn- und Mischeinrichtung auf diese Punktbildverwaschungsfunktion ist in 4 zu sehen. Die Punktbildverwaschungsfunktion für den roten Spektralkanal R unterscheidet sich nun grundsätzlich von der des grünen Spektralkanals G.
Wandert beispielsweise ein Beleuchtungsspot während des Scannvorgangs über die Detektionsfläche 18, unterscheidet sich die Reihenfolge, in der die Intensität an den einzelnen Detektorelementen 25 mit den Nummer I bis X zu- oder abnimmt, deutlich für einen Objektpunkt, der im roten Farbkanal R fluoresziert von einem Objektpunkt, der im grünen Farbkanal G fluoresziert. Im Falle eines roten Farbkanals R würden beispielsweise die Detektorelemente 25 mit den Nummern I bis III zuerst eine hohe Strahlungsintensität anzeigen und danach die anderen Detektorelemente 25, wohingegen bei einem Objektpunkt, der im grünen Farbkanal G fluoresziert, zuerst die Detektorelemente Nr. IV bis VI zuerst eine hohe Intensität anzeigen würden.
Durch diese drastische farbabhängige Modulation der Punktbildverwaschungsfunktion ist ein einfaches Entmischen der Farbinformation auf der Detektorzeile 25 bei der Aufstellung des Gleichungssystems möglich. Dem Steuergerät C, das als Auswerteeinrichtung fungiert, ist die Zuordnung, welche die Trenn- und Mischeinrichtung 30 beim Trennen und Mischen vornimmt, bekannt, so dass das Steuergerät C bei der Bilderzeugung nicht nur ein Bild mit einer Ortsauflösung erzeugt, die über die optische Auflösung des Mikroskops 1 hinausgeht, sondern zugleich auch Informationen über die Spektralkanäle liefert.
Natürlich ist die Erläuterung anhand der 2 und 4 mit zwei Farbkanälen und zehn Ortskanälen bzw. zehn Detektorelementen 25 rein exemplarisch und soll nur dem Verständnis des verfolgten Prinzips dienen. Selbstverständlich kann auch eine größere Anzahl an Farbkanälen und eine andere Anzahl an Ortskanälen und Detektorelementen verwendet werden.
5 zeigt exemplarisch eine mögliche Realisierung für die Trenn- und Mischeinrichtung 30. Sie verfügt über einen Eingangskoppler 31, an dem die Lichtleitfasern 21 des Lichtleitfaserbündels 20 angekoppelt werden. Wie in 5 veranschaulicht ist, können die Lichtleitfasern 21 dabei bereits eine Umsortierung vornehmen, so dass gewünschte Ortskanäle am Eingangskoppler 31 nebeneinanderliegen. Das Lichtleitfaserbündel 20 ist in dieser Hinsicht funktionaler Bestandteil der Trenn- und Mischeinrichtung 30.
Vom Eingangskoppler 31 wird die Strahlung 32 in jedem Ortskanal auf eine Zeile 33 aus Einzeltrennelementen geleitet, beispielsweise unterschiedlichen Prismen 34 und 35. Diese Prismen leiten die Strahlung, die hier exemplarisch wieder für zwei Farbkanäle R und G eingezeichnet ist, auf einen Ausgangskoppler 34, an der die Lichtleitfasern 28 angeschlossen sind. Diese führen in der Bauweise der 5 zu einzelnen Detektorelementen 25. Dies soll veranschaulichen, dass anstelle einer Detektorzeile 24 auch eine Gruppe an einzelnen, d. h. eigenständigen Detektorelementen 25 verwendet werden kann. Alternativ ist es auch möglich, anstelle des Ausgangskopplers 34 direkt eine Detektorzeile zu setzen. Die Zeile 33 an Einzeltrennelementen 34, 35 ist dann gegebenenfalls um eine nachgeschaltete Optik, beispielsweise eine Minilinsenoptik etc. zu ergänzen, welche die Strahlung auf die Detektorzeile leitet.
Die Trenn- und Mischeinrichtung 30 trennt die Strahlung aus den Ortskanälen in verschiedene Spektralkanäle, hier R und G, auf und mischt diese wieder zusammen, so dass gemischte Kanäle entstehen. Der unterste Kanal in der Darstellung der 5 enthält beispielsweise den roten Spektralkanal R aus der Strahlung 32, welche aus demjenigen Ortskanal stammt, der am untersten Anschluss des Eingangskopplers 31 angeschlossen ist. Weiter enthält dieser gemischte Kanal den grünen Spektralanteil G, der aus der Strahlung 32 desjenigen Ortskanals stammt, der am direkt darüber liegenden Anschluss des Eingangskopplers 31 eingespeist wurde. In Kombination mit der Umsortierung durch das Lichtleitfaserbündel 30 ist damit eine im Wesentlichen frei vorgebbare Trennung und Umsortierung durch das Trenn- und Mischelement 30 realisiert.
Zur genaueren Erläuterung der mathematischen Analyse der Aufstellung des Gleichungssystems sei zur Einführung zuerst der Fall betrachtet, dass die Trenn- und Mischeinrichtung 30 nicht vorhanden sei. Bezeichnet man mit O(r) das Objekt, mit E(r) die Punktbildverwaschungsfunktion (PSF) der Anregung und mit H(r) die PSF der Detektion, erhält man als Signal D(r, p) für jeden Bildpunkt folgende Gleichung, wobei r den Abstand vom Ort p des Beleuchtungsflecks bezeichnet:
Eine Fourier-Transformation von D(r, p) bezüglich des Ortes p liefert: D(r, ω) = O(ω)FT_r'{E(r')H(r' + r)}
Das Produkt im Realraum wird im Fourier-Raum die folgende Faltung:
Führt man eine Trägerfunktion am Ort r ein: EH(r, ω) = FT_r'{E(r')H(r' + r)} ergibt sich aus Gleichung (2) D(r, ω) = O(ω)EH(r, ω) (3)
Unterschiedliche Orte r am Flächendetektor werden mittels eines Wiener-Filters (vgl. http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution) kombiniert
wobei 〈|O(ω)|²〉 und 〈|n(ω)|²〉 die entsprechenden spektralen Leistungsdichten des Signals (”O”) und des Rauschens (n) sind.
Die Gleichung (2) der Rekombination in der Airy-Scan-Mikroskopie gilt für eine Farbe (der Begriff „Farbe” wird nachfolgend als einfacherer Ausdruck für den Begriff „Spektralkanal” verwendet. Mehrere Farben sind an jedem Ort r gemischt, wobei Gewichtungsfaktoren eine Rolle spielen, mit welcher die Trenn- und Mischeinrichtung 30 die einzelnen Spektralkanäle und Ortskanäle in den gemischten Kanälen zusammenfasst. Man erhält dann:
Dabei ist b ein Versatz und B(ω) ein Versatzspektrum:
Der Versatz kann als zusätzliche Farbe O_c+1(ω) = b angesehen werden, deren Gewicht EH_c+1(r, ω) = B(ω) beträgt. Damit kann man Gleichung (5) umschreiben in folgende Form:
Für jede Frequenz EH_c+1(r, ω) = B(ω) können die Farben mittels einer linearen Regression entmischt werden:
Das Minimieren der Gleichung (8) im Hinblick auf den Wert von O_x(ω) führt zu einem System linearer Gleichungen für jede Frequenz EH_c+1(r, ω) = B(ω):
Schreibt man den Versatz aus, erhält man
wobei x durch alle aufzulösenden Farben läuft. Gleichung (9) schreibt sich in Matrixform folgendermaßen: [D(r, ω)]_r[EH_ĉ(r, ω)] * / ĉ,r = [O_ĉ(ω)]_ĉ[X(ω)]_ĉ,ĉ. (11)
Hier gilt [X(ω)]_ĉ,ĉ = ([EH_ĉ(r, ω)]_ĉ,r[EH_ĉ(r, ω) * / ĉ,r ). Die Lösung für [O_ĉ(ω)]_ĉ liefert: [O_ĉ(ω)]_ĉ = [D(r, ω)]_r[EH_ĉ(r, ω)] * / ĉ,r[X(ω)] –1 / ĉ,ĉA(ω) (12)
Hier ist A(ω) ein Apodisationsfilter, beispielsweise
Wäre nur eine Farbe vorhanden, würde man analog zu Gleichung (4) erhalten:
Das Farbauflösevermögen wird durch die Matrix [X(ω)]_ĉ,ĉ definiert. Bei nicht rauschbehafteten Daten müssen zur Farbauflösung die Reihen/Spalten der Matrix [X(ω)]_ĉ,ĉ linear unabhängig sein. Dies ist bereits dann erfüllt, wenn sich die Punktbildverwaschungsfunktionen für die verschiedenen Farben unterscheiden. Am Beispiel von zwei Farben wurde dies bereits anhand der 3 und 4 erläutert. In diesem Fall ist die Zahl der auflösbaren Farben um eins geringer als die Zahl der Schrittstellungen r.
Im Falle rauschbehafteter Daten wird die Robustheit der Lösbarkeit durch die Konditionszahl der Matrix [X(ω)]_ĉ,ĉ. Die Konditionszahl einer Matrix S ist generell definiert als κ(S) = ∥S∥∥S^–1∥ Hierin bezeichnet ∥.∥ die Norm der Matrix. Umso größer die Konditionszahl ist, umso weniger ist die Lösung hinsichtlich Fehlern in den Eingabedaten, d. h. hinsichtlich rauschen, belastbar.
Für rauschfreie Daten wäre eine endliche Konditionszahl, d. h. ein Wert beliebiger Größe kleiner Unendlich, zur Farbauflösung bereits ausreichend. In der Realität liegen jedoch rauschbehaftete Messwerte vor, weshalb die Matrix [X(ω)]_ĉ,ĉ so ausgelegt wird, dass sie eine möglichst geringe Konditionszahl hat. Um dies zu erreichen, sollten die Unterschiede der Beiträge verschiedener Farben, welche durch die einzelnen Punktbildverwaschungsfunktionen der Farben aufgrund der Trennung und Mischung erzeugt werden, an jeder Detektorstelle so groß wie möglich sein. Im Beispiel der 4 ist dies durch eine annähernd orthogonale Gestaltung der Punktbildverwaschungsfunktionen erreicht.
Als allgemeinere Regel wird für jede Farbe eine Zuordnungsfunktion angegeben, die den Ort der Detektion innerhalb der Punktbildverwaschungsfunktion, r, mit der Nummer des Detektorelementes 25 verknüpft, die durch n: n = M_c(r) gegeben sei. Auf die Geometrie der Detektorelemente kommt es dabei nicht an, insbesondere sind die beschriebenen zeilenförmigen Detektorelemente möglich. Dann ergibt sich als Signal der gemischten Kanäle auf den Detektorelementen n folgendes:
Hier ist die Zuordnungsfunktion noch nicht festgelegt. Um die Zuordnungsfunktion M_c(r) auszuwählen bzw. deren in Gleichung (15) erscheinenden invertierten Form, M –1 / c (n), ist die Wahl so zu treffen, dass die Konditionszahl der Matrix [X(ω)]_ĉ,ĉ möglichst gering ist. Dies wird dann erreicht, wenn der Unterschied der Beiträge der verschiedenen Farben über alle Detektorelemente n, und über alle Frequenzen ω hinsichtlich der Zuordnungsfunktion
(n), i = 1, ... maximal wird. Dies führt zu folgender Gleichung:
Anhand dieser Gleichung kann die Zuordnungsfunktion, d. h. die Wirkung der Trenn- und Mischeinrichtung 30 einfach festgelegt werden. Beispielsweise wird in der Bauweise der 5 die Vertauschung der einzelnen Lichtleitfasern 21, d. h. ihre Zuordnung am Eingangsstecker 31 sowie die Wirkung der Einzeltrennelemente 33 so gewählt, dass die Gleichung 16 maximiert ist.
Das durch die Gleichung (16) gegebene Maß ist eine mögliche Bedingung für die Wahl der Zuordnung. Andere, alternative Zuordnungskriterien sind ebenfalls geeignet. Beispielsweise kann man anstelle einer Integration über die Frequenzen ω auch bestimmte Frequenzbänder festlegen, bei denen die Farbtrennung empfindlicher sein soll, als bei anderen. Letztlich gibt die Gleichung (16) bzw. geben alternative Vorgehensweisen eine klare, für den Fachmann umzusetzende Zuordnungsregel, wie die Trenn- und Mischeinrichtung die spektral aufgeteilten Ortskanäle zu den gemischten Kanälen zusammenfügt und wie das Entmischen zu erfolgen hat.
6 zeigt exemplarisch ein Ablaufdiagramm für das Mikroskopieverfahren, das beispielsweise mit dem Mikroskop der 1 ausgeführt werden kann. In einem Schritt S1 wird die herkömmliche Airy-Scan-Mikroskopie ausgeführt, wie sie aus der bereits genannten EP 2317362 A1 dem Fachmann bekannt ist. D. h., ein Punkt auf der Probe wird beugungsbegrenzt beleuchtet und in einer Vielzahl von Scanpositionen auf eine zur Fokalebene konjugierte Ebene beugungsbegrenzt abgebildet.
In einem Schritt S2 wird das Beugungsbild in verschiedenen Ortskanälen aufgelöst. Dieser Schritt S2 kann auch als Pixelierung verstanden werden. Für jeden Ortskanal entsteht somit ein eigener Strahlengang.
In einem Schritt S3 werden diese einzelnen Strahlengänge der Ortskanäle chromatisch geteilt, wobei die Anzahl an Teilungen die gewünschte Anzahl an Spektralkanälen festlegt.
In einem Schritt S4 werden die Spektralkanäle auf vorgegebene Art und Weise wieder zu gemischten Kanälen zusammengeführt. Die Kriterien für die Auswahl dieses Mischvorgangs wurden vorstehend anhand der Herleitung der Gleichung (16) erläutert.
Abschließend erfolgt in einem Schritt S5 die Detektion der Strahlung aus den gemischten Kanälen und die Signalauswertung zur Erzeugung des hochaufgelösten multispektralen Bildes.
Für das zuvor geschilderte Konzept sind folgende Abweichungen bzw. Erweiterungen möglich: Soweit vorstehend nur zwei Farbkanäle R, G beschrieben wurden, ist dies rein exemplarisch. Natürlich kann eine größere Anzahl an Farbkanälen gleichermaßen verwendet werden.
Die Aufteilung in Ortskanäle im Schritt S2, die chromatische Teilung im Schritt S3 und das definierte Mischen im Schritt S4 kann auch in Kombinationen zusammengefasst werden oder in zum Teil anderer Reihenfolge ausgeführt werden. Anhand der 5 wurde erläutert, dass das Umsortieren der Ortskanäle durch entsprechende Ausgestaltungen des Lichtleitfaserbündels 20 und seine Zuordnung zur Trenn- und Mischeinrichtung 30 bereits Teil des definierten Mischens des Schrittes S4 sein kann. Wesentlich ist, dass ortskanalunabhängige Strahlengänge gebildet, chromatisch geteilt und unterschiedlich wieder gemischt werden. Dieser Mischvorgang ist in der Ausführungsform der 5 bereits vorbereitet durch die Mitwirkung des Lichtleitfaserbündels 20. Das ist jedoch optional. Beispielsweise ist es auch möglich, nach der spektralen Auftrennung ein weiteres Lichtleitfaserbündel einzuschalten, das die unterschiedlichen Spektralkanäle in der gewünschten Mischung zusammenführt, beispielsweise durch den Einsatz von Faservereinigern.
Die Verwendung der Faserkopplung in der Ebene, die zur Fokalebene 29 konjugiert ist, erlaubt es, die Ortskanäle crosstalk-frei zu parallelisieren. Zuerst die Ortskanäle zu bilden und dann das spektrale Trennen und Mischen auszuführen hat zudem den Vorteil, dass die Aufteilung in eine große Vielzahl von Spektralkanälen einfacher ist. Es ist aber auch möglich, die Reihenfolge des spektralen Trennens und des Bildens der Ortskanäle, d. h. die Schritte S3 und S2 zu vertauschen, indem die Strahlung vor der zur Fokalebene 29 konjugierten Ebene über einen Farbteiler in mehrere Spektralbänder aufgespalten wird. Diese können dann mit Mikrolinsen in ein Faserbündel abgebildet und dann räumlich neu zusammengemischt werden, beispielsweise durch eine Mehrfachbelegung an den Detektorelementen 25.
Vorstehend wurden Ausführungsformen beschrieben, in denen alle Ortskanäle, d. h. sämtliche Strahlung des Beugungsbildes 17 dem Vorgang des spektralen Trennens und Mischens unterzogen wurde. Es ist aber auch möglich, einzelne oder mehrere Ortskanäle unverändert zu lassen, entweder indem sie gar nicht über die Trenn- und Mischeinrichtung 30 geleitet werden, oder indem die Trenn- und Mischeinrichtung 30 die Spektralinformation die Strahlung eines oder mehrerer Ortskanäle wieder in einem gemischten Kanal zusammenführt. Dies kann vorteilhaft sein, beispielsweise um eine Intensitätsreferenzierung vorzunehmen.
Vorstehend wurde weiter erläutert, dass jeder gemischte Kanal Strahlung verschiedener Spektralkanäle erhält. Dies ist im Hinblick auf das Entmischen vorteilhaft, wobei es besonders günstig ist, wenn jeder gemischte Kanal nur Strahlung aus verschiedenen Spektralkanälen erhält. Es kann jedoch aber auch hier für eine Referenzierung oder Signalnormierung von Vorteil sein, wenn in einzelnen gemischten Kanälen mehrere gleiche Spektralkanäle mit Strahlung, die aus verschiedenen Ortskanälen stammt, zusammengefasst wird.
Zusätzlich zum beschriebenen Betriebsmodus, in dem ein hochaufgelöstes Bild erzeugt wird, kann das Mikroskop 1 auch auf eine Art und Weise betrieben werden, die kein hochauflösendes Bild, sondern ausschließlich ein Spektrum erzeugt. Dazu werden für eine Scanposition Intensitätsdaten der Detektorelemente 25 ausgelesen und unter Berücksichtigung der jedem Detektorelement 25 zugeordneten Spektralkanäle ein Spektrum der Probe gewonnen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

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US 5866911 [0008]
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WO 2006127692 [0010]
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EP 2317362 A1 [0012, 0012, 0013, 0013, 0013, 0014, 0017, 0026, 0049, 0080]
DE 102013019378 A1 [0014]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Hell, ”Far-Field Optical Nanoscopy”., Science 316, 1153–1158, 2007 [0011]
http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution [0063]

Claims

Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), wobei – die Probe (2) mit Beleuchtungsstrahlung (5) derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe (2) zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) gebündelt wird, – der Punkt beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild (17) auf eine Detektionsfläche (18) einer ortsauflösenden Detektoreinrichtung (19) abgebildet wird, wobei – die Detektionsfläche (18) Ortskanäle (21) aufweist, die eine Ortsauflösung der Detektoreinrichtung (19) festlegen, welche eine Beugungsstruktur (30–33) des Beugungsbildes (17) auflöst, – die Detektoreinrichtung (19) Detektorelemente (25) zur Detektion der Strahlung des Beugungsbildes (17) aufweist, – für die Mehrzahl der Ortskanäle (21) die dort geführte Strahlung (32) jeweils in mehrere Spektralkanäle (R, G) spektral aufgetrennt und zu gemischten Kanälen (28) wieder zusammengeführt wird, wobei in jedem gemischten Kanal (28) Strahlung, die aus verschiedenen Ortskanälen (21) stammt, und in die Mehrzahl der gemischten Kanäle (28) auch Strahlung aus verschiedenen Spektralkanälen (R, G) zusammengeführt werden, und jeder gemischte Kanal (28) auf eines der Detektorelemente (25) geleitet wird, – der Punkt relativ zur Probe (2) in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite verschoben wird, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks (14), – von den Detektorelementen (25) für jede Scanposition Intensitätsdaten ausgelesen und aus den Intensitätsdaten und den ihnen zugeordneten Scanpositionen ein Bild der Probe (2) erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung des Punktes gesteigert ist, wobei für jedes Detektorelement (25) die Spektralkanäle (R, G) und Ortskanäle (21) der Strahlung (32) berücksichtigt werden und das Bild der Probe (2) multispektral erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei k Ortskanäle (21), n Spektralkanäle (R, G) und j Detektorelemente (25) verwendet werden und wobei j < k·n gilt, bevorzugt j = k.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Anzahl der gemischten Kanäle (28) gleich der Anzahl der Ortskanäle (21), die spektral aufgetrennt werden, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei – die Detektionsfläche (18) durch eine Eintrittsfläche eines Bündels (20) aus Lichtleitfasern (21) mit Eintrittsfacetten (26) gebildet ist, wobei an den Eintrittsfacetten (26) der Lichtleitfasern (21) in der Eintrittsfläche die Ortskanäle beginnen, – eine spektrale Trenn- und Mischeinrichtung (30) Einzeltrennelemente (34, 35) aufweist, wobei die Anzahl der Einzeltrennelemente (34, 35) der Anzahl an aufgetrennten Ortskanälen entspricht, und – jede Lichtleitfaser (21) die Strahlung zu einem der Einzeltrennelemente (34, 35) leitet und das Einzeltrennelement (34, 35) die Strahlung in die Spektralkanäle (R, G) aufteilt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mehrzahl der Ortskanäle (21) und/oder die Mehrzahl der gemischten Kanäle (28) mind. 60%, 80%, 90%, oder 95% ist oder alle Ortskanäle (21) bzw. Kanäle (28) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei zur Schnellaufnahme eines Spektrums der Fluoreszenzstrahlung von den Detektorelementen (25) die Intensitätsdaten für eine Scanposition ausgelesen und aus den Intensitätsdaten und unter Berücksichtigung der jedem Detektorelement (25) zugeordneten Spektralkanäle (R, G) ein Spektrum der Probe (2) an der Scanposition erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das multispektrale Bild der Probe (2) erzeugt wird, indem – für jede Scanposition ein Gleichungssystem aufgestellt wird, das für jedes Detektorelement (25) eine Gleichung enthält, wobei die jedem Detektorelement (25) zugeordneten Spektralkanäle (R, G) und Ortskanäle (21) in jeder Gleichung enthalten sind, und – das Gleichungssystem nach Intensitäts- und Spektralinformation für die Probe gelöst wird.
Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie mit – einem Probenraum zur Aufnahme einer Probe (2), die zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, – einer Optik (11–13), die ein im Probenraum liegende Fokalebene (29) und eine Auflösungsgrenze hat, – einer Beleuchtungseinrichtung (3), die einen Eingang (6) zum Zuführen von Beleuchtungsstrahlung (5) aufweist und die über die Optik (11–13) den Probenraum mit der Beleuchtungsstrahlung (5) derart beleuchtet, dass die Optik (11–13) die Beleuchtungsstrahlung (5) an einem Punkt in der Fokalebene (29) zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck (14) bündelt, – einer Abbildungseinrichtung (4) zum beugungsbegrenzten Abbilden des Punktes in der Fokalebene (29) durch die Optik (11–13) in ein Beugungsbild (30–33), – eine ortsauflösende Detektoreinrichtung (19) mit einer Detektionsfläche (18), die in einer zur Fokalebene (29) konjugierten Ebene liegt, wobei – die Detektionsfläche (18) Ortskanäle aufweist, die eine Ortsauflösung der Detektoreinrichtung (19) festlegen, welche eine Beugungsstruktur (30–33) des Beugungsbildes (17) auflöst, – die Detektoreinrichtung (19) Detektorelemente (25) zur Detektion der Strahlung des Beugungsbildes (17) aufweist, – die Detektoreinrichtung (19) eine Trenn- und Mischeinrichtung (30) aufweist, welche für die Mehrzahl der Ortskanäle (21) die dort geführte Strahlung (32) jeweils in mehrere Spektralkanäle (R, G) spektral auftrennt und zu gemischten Kanälen (28) wieder zusammenführt, wobei die Trenn- und Mischeinrichtung (30) in jeden gemischten Kanal Strahlung (32), die aus verschiedenen Ortskanälen (21) stammt, und in der Mehrzahl der gemischten Kanäle (28) auch Strahlung aus verschiedenen Spektralkanälen (R, G) zusammenführt, und jeden gemischten Kanal (28) auf eines der Detektorelemente (25) leitet, – einer Scaneinrichtung (10) zur Verschiebung des Punktes in verschiedene Scanpositionen mit einer Schrittweite, die kleiner ist als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks (14), – einer Auswerteeinrichtung (C) zum Auslesen von Intensitätsdaten von den Detektorelementen (25) und den ihnen zugeordneten Scanpositionen und zum Erzeugen eines Bildes der Probe (2) aus den Intensitätsdaten und den ihnen zugeordneten Scanpositionen erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über die Auflösungsgrenze der Optik (11–13) gesteigert ist, wobei die Auswerteeinrichtung (C) für jedes Detektorelement (25) die Spektralkanäle (R, G) und Ortskanäle (21) der ihm zugeführten Strahlung berücksichtigt und das Bild der Probe (2) multispektral erzeugt.
Mikroskop nach Anspruch 8, das k Ortskanäle (21), n Spektralkanäle (R, G) und j Detektorelemente (25) aufweist, wobei j < k·n gilt, bevorzugt j = k.
Mikroskop nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Anzahl der gemischten Kanäle (28) gleich der Anzahl der Ortskanäle (21), die spektral aufgetrennt werden, ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Mehrzahl der Ortskanäle (21) und/oder die Mehrzahl der gemischten Kanäle (28) mind. 60%, 80%, 90%, oder 95% ist oder alle Ortskanäle (21) bzw. Kanäle (28) umfasst.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei – die Detektionsfläche (18) durch eine Eintrittsfläche eines Bündels (20) aus Lichtleitfasern (21) mit Eintrittsfacetten (26) gebildet ist, wobei die Eintrittsfacetten (26) der Lichtleitfasern (21) den Beginn der Ortskanäle (21) festlegen, – die spektrale Trenn- und Mischeinrichtung (30) Einzeltrennelemente (34, 35) aufweist, wobei die Anzahl der Einzeltrennelemente (34, 35) der Anzahl an aufgetrennten Ortskanälen entspricht, und – jede Lichtleitfaser (21) die Strahlung zu einem der Einzeltrennelemente (34, 35) leitet und das Einzeltrennelement (34, 35) die Strahlung in die Spektralkanäle (R, G) aufteilt.