DE4416558C2 - Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1, wie aus der WO 92/18850 A1 bekannt.

Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe zur Durchführung des Verfahrens nach dem Oberbegriff des Anspruchs 3, wie ebenfalls aus der WO 92/18850 A1 bekannt.

Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe, bei denen ein Anregungslichtstrahl auf den zu messenden Probenpunkt mittels eines Objektivs fokussiert wird und dort einen Energiezustand anregt, und bei dem das von dem Probenpunkt aufgrund der Anregung des Energiezustands spontan emittierte Emissionslicht heraussepariert und nachgewiesen wird, und Vorrichtungen zur Durchführung eines solchen Verfahrens sind beispielsweise aus der US 4 631 581 bekannt. Sie finden ihre Anwendung beispielsweise bei Mikroskopen und insbesondere bei Rastermikroskopen. Mit einem Rastermikroskop werden einzelne Probenpunkte abgetastet und gemessen. Auf diese Weise kann die Probe dreidimensional vermessen werden. Es werden lumines­ zierende, insbesondere fluoreszierende oder phosphoreszierende Proben oder mit entsprechenden Farbstoffen versehene Proben verwendet.

Bei solchen Verfahren und solchen Vorrichtungen ist es wünschenswert, eine gute Ortsauflösung zu erreichen. Die Ortsauflösung ist durch die räumliche Ausdehnung der sogenannten effektiven Punkt-Abbildungsfunktion gegeben. Dies ist eine ortsabhängige Funktion, die die Wahrscheinlichkeit quanti­ fiziert, mit der aus einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs ein Photon spontan emittiert wird. Sie ist mit der räumlichen Verteilung der Wahrscheinlichkeit, daß an einem bestimmten Punkt des Fokalbereichs der Energiezustand angeregt wird, identisch. Bei herkömmlichen Raster-Fluoreszenzmikroskopen ist die effektive Punkt-Abbildungsfunktion identisch mit der Punkt­ abbildungsfunktion des Objektivs bei der Wellenlänge des Anregungslichtstrahls, welche die Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls im Fokalbereich des Objektivs angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quanti­ fiziert, mit der ein Beleuchtungsphoton in einem bestimmten Bereich des Fokalbereichs anzutreffen ist. Bei einem Rastermikroskop ist die Unterteilung der Rasterung durch die Ortsauflösung begrenzt. Bei einer besseren Ortsauflösung kann daher eine feinere Unterteilung gewählt werden, mit der eine bessere Auflösung des rekonstruierten Bilds erzielt werden kann.

Beispielsweise ist aus der eingangs genannten WO 92/18850 A1 bekannt, daß bei einem Rastermikroskop die Auflösung dadurch verbessert werden kann, daß das von der Probe emittierte Licht auf einen Punktdetektor abgebildet wird, der in einer zu der Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist. Eine solche Anordnung wird als konfokale Anordnung bezeichnet. Die bessere Auflösung kommt dadurch zustande, daß zwei Punktabbildungsfunktionen die Abbildung in dem konfokalen Rastermikroskop bestimmen: die Rasterpunkt-Abbildungsfunktion und die Detektionspunkt- Abbildungsfunktion, welche die Abbildung des von der Probe emittierten, zu detektierenden Lichts in den Punktdetektor beschreibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrschein­ lichkeit quantifiziert, mit der ein aus dem Fokalbereich emittiertes Photon in den Punktdetektor gelangt. Da sowohl Beleuchtung und als auch Detektion stattfinden müssen, ist die Punktabbildungsfunktion eines konfokalen Rastermikroskops das Produkt aus beiden Wahrscheinlichkeitsverteilungen, d. h. aus der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion und der Detektionspunkt- Abbildungsfunktion. Dies führt zu einem deutlich schmaleren Hauptmaximum der konfokalen Punktabbildungsfunktion im Vergleich zu einem nichtkonfokal angeordneten Mikroskop. Dies entspricht einer höheren Auflösung des konfokalen Mikroskops und bewirkt eine Diskriminierung aller Punkte, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung des Fokus befinden. Letzteres ist Voraussetzung für die Erstellung dreidimensionaler Bilder im Rasterverfahren.

Die WO 92/18850 A1 beschreibt weiterhin ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 3. Hier bildet die zwei Wellenlängen aufweisende Lichtstrahlung zwei Anregungslichtstrahlen mit jeweils einer der beiden Wellenlängen aus. Jeder der Anregungs­ lichtstrahlen regt einen seiner Wellenlänge entsprechenden Energiezustand des Probenpunkts an. Die Wellenlänge des einen Anregungslichtstrahls fällt in den UV-Bereich und die des anderen Anregungslichtstrahls in den sichtbaren Bereich. Jeder der Anregungslichtstrahlen wird von einem Laser einer Licht­ quellenanordnung emittiert. Die Strahlengänge der beiden Laser werden mit einem Strahlteiler zusammengeführt. Das aufgrund der Anregung spontan emittierte Emissionslicht wird für jeden Energiezustand mit einem separaten Punktdetektor nachgewiesen.

In der nachveröffentlichten DE 43 24 681 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, bei denen eine Lichtquellen­ anordnung Anregungslichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellen­ längen aussendet. Der zu detektierende Energiezustand der Probe kann nur durch Photonen der verschiedenen Wellen gemeinsam angeregt werden. Dadurch wird die Punktabbildungsfunktion durch das Produkt der Rasterpunkt-Abbildungsfunktionen der unter­ schiedlichen Wellenlängen bestimmt. Hierdurch wird eine verbesserte Ortsauflösung gegenüber einem einfachen Mikroskop erreicht. Eine weitere Verbesserung der Ortsauflösung wird dadurch erreicht, daß zwischen der Lichtquellenanordnung und dem Objektiv ein Filterelement angeordnet ist, welches für mindestens einen Anregungslichtstrahl einer Wellenlänge einen undurchlässigen Mittenbereich und einen durchlässigen Außenbereich aufweist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen weiteren Weg aufzuzeigen, um bei einem Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und einer Vorrichtung zur Durchführung des Ver­ fahrens nach dem Oberbegriffs des Anspruchs 3 eine verbesserte Ortsauflösung zu erzielen.

Diese Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens durch die Merk­ male des Anspruchs 1 und hinsichtlich der Vorrichtung durch die Merkmale des Anspruchs 3 gelöst.

Durch die durch den Stimulationslichtstrahl induzierte sti­ mulierte Emission der von dem Anregungslichtstrahl angeregten Probe in dem Deckungsbereich der Intensitätsverteilungen des Anregungslichtstrahls und des Stimulationslichtstrahls im Fokalbereich des Objektivs wird bewirkt, daß die angeregten Energiezustände im Deckungsbereich abgeregt werden und nicht mehr zu der zu detektierenden spontan emittierten Strahlung beitragen können. Die Rasterpunkt-Abbildungsfunktionen, die im normalen Raster-Fluoreszenzmikroskop identisch mit der Punkt­ abbildungsfunktion des Objektivs bei der Wellenlänge des Anregungslichts ist, wird dadurch verschmälert. Dies entspricht einer erhöhten räumlichen Auflösung. Die Verbesserung der Ortsauflösung ist von der Art der Deckung der Intensitäts­ verteilungen abhängig. Es kann sowohl eine laterale als auch eine axiale Verbesserung in der Ortsauflösung erzielt werden.

Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Probe auf einem Positioniertisch angeordnet ist, mit dem eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchführbar ist. Die Vorrichtung entspricht dann einem Rastermikroskop, bei dem die Probe zumindest entlang der optischen Achse abgerastert werden kann. In diesem Fall ist eine Verbesserung der Ortsauflösung in axialer Richtung besonders vorteilhaft, da dann in dieser Richtung durch feineres Rastern eine bessere Auflösung erzielt werden kann. Ein weiterer Vorteil kann erreicht werden, wenn zwischen der Lichtquellen­ anordnung und dem Objektiv eine Strahlrastereinrichtung zum gesteuerten Abrastern der Probe mit dem Anregungslichtstrahl und dem Stimulationslichtstrahl vorgesehen ist. Die Vorrichtung wird als Rastermikroskop verwendet, bei dem die Probe lateral oder dreidimensional abgerastert werden kann. Bei einem solchen Rastermikroskop kann durch Verkleinern der Rasterung auch in lateraler Richtung eine bessere Ortsauflösung erzielt werden.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn der Stimulationslichtstrahl hinsichtlich des Anregungslichtstrahls in der Fokalebene lateral versetzt ist. Durch diese Anordnung wird eine Verschmälerung der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion der Vorrichtung in lateraler Richtung bewirkt. Auch kann es günstig sein, wenn der Stimulationslichtstrahl hinsichtlich des Anregungslichtstrahls entlang der optischen Achse versetzt ist. Dann wird eine Verbesserung der Ortsauflösung der Vorrichtung in axialer Richtung bewirkt.

Vorteilhafterweise kann wenigstens ein weiterer von der Lichtquellenanordnung kommender Stimulationslichtstrahl vorgesehen sein, dessen Intensitätsverteilung im Fokalbereich des Objektivs von der Intensitätsverteilung der übrigen Stimulationslichtstrahlen verschieden ist, insbesondere indem er an einer anderen Stelle fokussiert ist. Bei dieser Anordnung werden die Intensitätsverteilungen der zusätzlichen Stimulationslichtstrahlen ebenfalls der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahl im Fokalbereich des Objektivs überlagert, wodurch eine weitere Verschmälerung der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion der Vorrichtung erzielt wird. Die Art der Verschmälerung der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion kann durch die räumliche Anordnung der Stimulationslichtstrahlen entsprechend gewählt werden. Günstigerweise können die Stimulationslichtstrahlen hinsichtlich des Anregungslichtstrahls räumlich symmetrisch angeordnet werden. Dann wird eine räumlich symmetrische Verschmälerung des Hauptmaximums der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion im Fokalbereich erzielt. Zum Beispiel können die Stimulationslichtstrahlen derart angeordnet werden, daß sie durch einen zu dem Anregungslichtstrahl konzentrischen Kreisring verlaufen. Dabei können die Stimulationslichtstrahlen zueinander jeweils einen gleichen Abstand aufweisen. Auf diese Weise wird das Hauptmaximum der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls sozusagen von mehreren Seiten gleichmäßig verschmälert. Auch weitere Anordnungen der Stimulationslicht­ strahlen sind möglich und die genaue Auswahl der Anordnung ist dem Fachmann überlassen.

Gemäß einer günstigen Weiterbildung der Erfindung kann die Lichtquellenanordnung einen Laser umfassen, der Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlängen emittiert. Das Licht der einen Wellenlänge wird dann als Anregungslichtstrahl verwendet. Die Wellenlänge des Lichtes ist dabei so zu wählen, daß der Energie­ zustand der Probe angeregt werden kann. Der Lichtanteil mit der anderen Wellenlänge wird für den mindestens einen Stimulations­ lichtstrahl gewählt. Die Wellenlänge muß so gewählt sein, daß die Probe in dem angeregten Zustand über stimulierte Emission abgeregt werden kann.

Auch kann es vorteilhaft sein, wenn die Lichtquellenanordnung wenigstens zwei Laser umfaßt, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren. Dann dient der eine Laser zum Erzeugen des Anregungslichtstrahls und der/die andere(n) Laser zum Erzeugen des/der Stimulationslichtstrahls/en. Es können entweder mit einem Laser mehrere Stimulationslichtstrahlen erzeugt werden, was etwa durch eine geeignete Blende oder durch geeig­ netes Anordnen von Spiegeln möglich ist, oder es können mehrere Laser zum Erzeugen je eines oder mehrerer Stimulationslicht­ strahlen verwendet werden. Die Verwendung von Lasern in der Lichtquellenanordnung hat ferner den Vorteil, daß räumlich stark lokalisierbare Lichtstrahlen mit hoher Intensität zur Verfügung stehen.

Günstigerweise kann ein Dauerstrichlaser vorgesehen sein, der den Anregungslichtstrahl aussendet. Durch das Verwenden von Dauerstrichlasern wird die Lichtquellenanordnung kostengünstig. Es kann wenigstens ein Laser vorgesehen sein, der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet. Günstigerweise erzeugt ein Laser, der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet, den bzw. die Stimulationslichtstrahl(en).

Eine vorteilhafte Anordnung besteht darin, daß ein Dauerstrich­ laser zum Erzeugen des Anregungslichtstrahls und wenigstens ein Laser, der Lichtpulse in zeitlicher Abfolge ausstrahlt, zur Erzeugung des mindestens einen Stimulationslichtstrahls verwendet wird. Dabei wird die Zeit, innerhalb der das Lumineszenzlicht vom Detektor erfaßt werden soll, durch die Pulsdauer des mindestens einen Stimulationslichtstrahls bestimmt. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Pulsdauer des Lasers, der den mindestens einen Stimulationslichtstrahl ausstrahlt, 10^-10 bis 10^-5 s beträgt.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Anordnung wird sowohl der Anregungslichtstrahl als auch der mindestens eine Stimulations­ lichtstrahl von Lasern erzeugt, die Lichtpulse in zeitlicher Abfolge aussenden. Die Pulsdauer des Anregungslichtstrahls und des mindestens einen Stimulationslichtstrahls sollen in diesem Fall kleiner sein als die charakteristischen Zeiten für die spontane Emission der Probe in dem angeregten Energiezustand. Die Pulsdauer des mindestens einen Stimulationslichtstrahls soll größer sein als die charakteristische Zeit für einen Zerfalls­ prozeß des Endzustands, in dem sich die Probe nach Abregen des Energiezustands durch stimulierte Emission befindet, in einen noch tiefer liegenden Grundzustand. Von letzterem aus wird die Probe typischerweise in den Energiezustand angeregt. Die Pulsdauer des Anregungslichtstrahls beträgt vorteilhafterweise 10^-15 bis 10^-9 s; die Pulsdauer des mindestens einen Stimula­ tionslichtstrahls beträgt günstigerweise 10^-12 bis 10^-9 s.

Vorteilhafterweise kann der Laser zur Erzeugung des mindestens einen Stimulationslichtstrahls einen Lichtstrahl mit gauß­ förmiger Intensitätsverteilung aussenden. Dadurch wird in der Fokalebene ebenfalls eine gaußförmige räumliche Intensitäts­ verteilung erzielt. Eine solche Intensitätsverteilung hat den Vorteil, daß sie keine Nebenmaxima aufweist, durch welche die Auflösung verschlechtert werden könnte. Dies ist insbesondere bei den Stimulationslichtstrahlen vorteilhaft, da diese dem Anregungslichtstrahl dann so überlagert werden können, daß sie sich dem Hauptmaximum der Intensitätsverteilung des Anregungs­ lichtstrahls lateral überlagern. In diesem Fall werden eventuell in der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls vorhan­ dene Seitenmaxima aufgrund der Wirkung der Stimulationslicht­ strahlen in der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion eliminiert. Dabei können die Stimulationslichtstrahlen der Intensitäts­ verteilung des Anregungslichtstrahls von außen her überlagert werden, ohne daß in der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion neue Nebenmaxima entstehen. In diesem Fall wird eine deutliche Verschmälerung des Hauptmaximums der effektiven Punkt- Abbildungsfunktion erzielt, ohne daß Nebenmaxima auftreten. Ferner kann es vorteilhaft sein, wenn zwei gepulste Laser verwendet werden, wobei die optischen Wegstrecken so dimensioniert sind, daß der Puls der Stimulationslichtstrahlen um ein Zeitintervall, das kleiner als die Lebensdauer des angeregten Zustands des Farbstoffs ist, dem Puls des Anregungslichtstrahls hinterherläuft.

Auch ist es günstig, wenn die Lichtquellenanordnung zur Erzeugung der Stimulationslichtstrahlen von hoher Intensität ist, so daß zwischen dieser Intensität und der Besetzung des Energiezustands der Probe ein nichtlinearer Zusammenhang besteht. Dadurch kann mit den Stimulationslichtstrahlen der angeregte Energiezustand im Deckungsbereich der Intensitäts­ verteilungen des Anregungslichtstrahls und der Stimulations­ lichtstrahlen durch stimulierte Emission räumlich sehr scharf begrenzt abgeregt werden, so daß auch die Rasterpunkt- Abbildungsfunktion räumlich sehr scharf begrenzt wird und zugleich die Verminderung der gesamten Lumineszenzintensität minimiert wird.

Gemäß einem vorteilhaften Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt die Separationseinrichtung eine Zeitsteuerungsein­ richtung, mit der der Detektor unmittelbar nach dem Abklingen eines Pulses der Stimulationslichtstrahlen eingeschaltet werden kann. Wenn bei dieser Anordnung sowohl zum Erzeugen des Anregungslichtstrahls als auch zum Erzeugen der Stimulations­ lichtstrahlen Laser verwendet werden, die Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussenden, kann die Zeitsteuereinrichtung auch die Laser derart steuern, daß ein Puls der Stimulationslichtstrahlen ausgesendet wird, sobald ein Puls des Anregungslichtstrahls abgeklungen ist. Das Betätigen des Detektors nach Abklingen des Pulses der Stimulationslichtstrahlen kann dann mit der gleichen Zeitsteuerungseinrichtung erfolgen. Die bevorzugten Pulsdauern der Laser wurden oben bereits genannt. Es ist ein einfaches und sauberes Heraustrennen des Emissionslichts der Probe möglich, auch dann, wenn der Anregungslichtstrahl gleiche Wellenlänge wie das Emissionslicht aufweist. Der Aufbau der Vorrichtung wird mechanisch einfach, da keine weiteren Filterelemente verwendet werden müssen. Auch ist es vorteilhaft, bei der Benutzung gepulsten Lichts für den Anregungslichtstrahl und die Stimula­ tionslichtstrahlen die zeitliche Abfolge der Pulse über unterschiedlich lange optische Laufwege abzustimmen.

Gemäß einem anderen vorteilhaften Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Separationseinrichtung einen dem Objektiv vorgeschalteten Polarisator zum Polarisieren des mindestens einen Stimulationslichtstrahls und einen dem Objektiv nach­ geschalteten Polarisator zum Polarisieren des zum Detektor gehenden Emissionslichts mit einer orthogonalen Durchlaßrichtung zu derjenigen des dem Objektiv vorgeschalteten Polarisators umfassen. Vor- bzw. nachgeschaltet bedeutet hier sowohl räumlich als auch in Laufrichtung des Lichts vor bzw. nach dem Objektiv. Dadurch ist es möglich, das Emissionslicht von dem mindestens einen Stimulationslichtstrahl bei gleichen Wellenlängen zuver­ lässig voneinander zu trennen. Es kann auch ein Polarisator zum Polarisieren des Anregungslichtstrahls dem Objektiv vorgeschal­ tet angeordnet sein und ein weiterer Polarisator dem Objektiv nachgeschaltet sein, welcher zu dem Polarisator zum Polarisieren des zum Detektor gehenden Lichts eine orthogonale Durchlaßrich­ tung aufweist. So kann das von der Probe emittierte Licht auch von dem Anregungslicht getrennt werden. Auch ist es vorteilhaft, wenn die Separationseinrichtung wenigstens einen Wellenlängen­ filter aufweist. Mit den Wellenlängenfiltern kann das von der Probe emittierte Licht von dem Anregungslicht abgetrennt werden, wenn unterschiedliche Wellenlängen vorliegen. Ein Wellenlängen­ filter ist dem Objektiv nachgeschaltet. Als Wellenlängenfilter können Farbfilter, dichroitische Filter, Monochromatoren, Prismen etc. verwendet werden. Ferner kann die Separations­ einrichtung einen dichroitischen Spiegel aufweisen. Der Spiegel ist dann zwischen der Lichtquellenanordnung und dem Objektiv angeordnet, so daß von der Probe emittiertes Licht von dem dichroitischen Spiegel, wenn es eine bestimmte Wellenlänge aufweist, in den Detektor gelenkt wird.

Gemäß einer günstigen Weiterbildung der Erfindung kann der Detektor ein Punktdetektor sein. Dem Detektor können ein Fokussierungselement und eine Blende vorgeschaltet sein, wobei die Blende in einer zur Fokalebene des Objektivs optisch konjugierten Ebene angeordnet ist. Die Blende ist beispielsweise eine Lochblende, wobei ihr Durchmesser vorzugsweise so groß ist, daß ihr Bild im Probenbereich, das man bei der Wellenlänge des zu detektierenden Lichtes erhält, von der Größenordnung der Ausdehnung der Punktabbildungsfunktion ist. Die Punktabbildungs­ funktion der Vorrichtung ergibt sich aus dem Produkt der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion und der Detektionspunkt- Abbildungsfunktion. Aufgrund des Punktdetektors wird also eine zusätzliche Verschmälerung des Hauptmaximums der Punkt­ abbildungsfunktion der Vorrichtung und damit eine weitere Verbesserung der Auflösung erzielt.

Eine weitere Verbesserung der Ortsauflösung der Vorrichtung kann dadurch erzielt werden, daß zwischen der Lichtquellenanordnung und dem Objektiv ein für die Wellenlänge des mindestens einen Stimulationslichtstrahls durchlässiges Filterelement angeordnet ist, welches für die Wellenlänge des Anregungslichtstrahls einen undurchlässigen Mittenbereich und einen durchlässigen Außen­ bereich aufweist. Ein solches Filterelement verlagert in der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls im Fokalbereich Licht aus dem Hauptmaximum in die Beugungsnebenmaxima, wobei das Hauptmaximum deutlich verschmälert wird. Dies führt zu einer weiteren Verschmälerung der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion. Die Intensitätszunahmen in den Nebenmaxima der Intensitäts­ verteilung des Anregungslichtstrahls ist in diesem Fall nicht störend, da diese aufgrund der Intensitätsverteilung der Stimulationslichtstrahlen in der effektiven Punkt-Abbildungs­ funktion unterdrückt werden, da sich die Intensitätsverteilungen teilweise überlappen.

In folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 ein schematische Darstellung eines Ausrührungs­ beispiels der Vorrichtung zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe,

Fig. 2 ein Beispiel für die Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls und für die Intensitäts­ verteilungen der Stimulationslichtstrahlen in der Fokalebene des Objektivs der Vorrichtung und

Fig. 3 die Rasterpunkt-Abbildungsfunktion in der Fokalebene des Objektivs der Vorrichtung.

Fig. 1 zeigt als Ausführungsbeispiel der Vorrichtung zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe die Anordnung eines Rastermikroskops. Das Rastermikroskop umfaßt eine Lichtquellenanordnung 1 mit einem Laser 2 zum Aussenden eines Anregungslichtstrahls 16 und einem Laser 3 zum Aussenden von Stimulationslichtstrahlen 17. Ferner sind dichroitische Spiegel 4 und 5 und ein Objektiv 6 vorgesehen, mit denen der von dem Lasern 2 kommende Anregungslichtstrahl und die von dem Laser 3 kommenden Stimulationslichtstrahlen auf einen Probenpunkt 7 der Probe 8 gelenkt bzw. fokussiert werden. Der Probenpunkt 7 hat dabei eine Ortsausdehnung, welche hier eine Flächenausdehnung ist. Ein Detektor ist zum Nachweis des von der Probe 8 emittierten Emissionslichts 18 angeordnet, welches mit dem dichroitischen Spiegel 5 aus dem Anregungslichtstrahl 16 heraussepariert wird. Die Probe ist auf einem Positioniertisch 10 angeordnet. Zwischen der Lichtquellenanordnung 1 und dem Objektiv 6 ist eine Strahlrastereinrichtung 11 zum gesteuerten Abrastern der Probe 8 mit dem Anregungslichtstrahl 16 und den Stimulationslichtstrahlen 17 vorgesehen. Die Lichtquellen­ anordnung 1 umfaßt zusätzlich zu den Lasern 2 und 3 Linsen 12 und 13 sowie eine Blende 14. Mit der Linse 12 wird der von dem Laser 2 kommende Anregungslichtstrahl 16 auf die Blende 14 fokussiert. Die Linse 13 dient zur Anpassung der Divergenz des Anregungslichtstrahls 16 und der Stimulationslichtstrahlen 17, damit sie in der gleichen Ebene mit Hilfe des Objektivs 6 fokussiert werden können. Als Blenden werden üblicherweise Lochblenden verwendet. Hinter dem Laser 3 sind ein Strahlteiler 23 und ein Spiegel 24 zum Aufteilen des von dem Laser 3 kommenden Strahls in zwei Stimulationslichtstrahlen 17 angeordnet. Die Anordnung ist so gewählt, daß der Anregungs­ lichtstrahl 16 und die Stimulationslichtstrahlen 17 derart auf den dichroitischen Spiegel 4 auftreffen, daß sich die Intensitätsverteilung der Lichtstrahlen nach Umlenken an dem Spiegel und Durchlaufen des Objektiv 6 im Fokalbereich des Objektivs 6 teilweise decken.

In dem gezeigten Ausführungsbeispiel sind zwei Stimulations­ lichtstrahlen 17 gezeigt. Es können aber auch nur ein Stimulationslichtstrahl oder noch weitere Stimulationslichtstrahlen 17 verwendet werden. Hierzu können entweder weitere Laser mit zu dem Strahlengang des Lasers 3 analogen Strahlengängen verwendet werden, wobei die Strahlen in geeigneter Weise auf den dichroitischen Spiegel 4 und von dort über den dichroitischen Spiegel 5 und das Objektiv 6 auf den Probenpunkt 7 gelenkt werden. Es kann aber auch wie gezeigt ein Laser 3 verwendet werden und der von dem Laser 3 kommende Strahl über weitere Strahlteiler in einzelne Stimulationslichtstrahlen zerlegt werden. Wichtig ist, daß die Stimulationslichtstrahlen 17 alle derart angeordnet sind, daß sich ihre Intensitätsverteilungen im Fokalbereich des Objektiv 6 teilweise mit der Intensitätsvertei­ lung des Anregungslichtstrahls 16 decken. Die Laser 3 bzw. die dazugehörigen nicht dargestellten Strahlelemente, wie Strahl­ teiler, Linsen etc. müssen derart angeordnet sein, daß sich eine gewünschte vorherbestimmte Anordnung der Intensitätsverteilungen im Fokalbereich des Objektivs 6 ergibt. Zum Beispiel können verschiedene Stimulationslichtstrahlen 17 auf einem Kreisring angeordnet sein, durch dessen Mittelpunkt der von dem Laser 2 kommende Anregungslichtstrahl 16 verläuft.

In dem Probenpunkt 7 wird der Energiezustand der Probe 8 mit dem dort auftreffenden Anregungslichtstrahl 16 angeregt. Die Wellenlänge des Anregungslichtstrahls ist geeignet zum Anregen dieses Energiezustands gewählt. Durch Auftreffen der von dem Laser 3 kommenden Stimulationslichtstrahlen 17 wird der mit dem Anregungslichtstrahl angeregte Energiezustand der Probe 8 über stimulierte Emission in einen tieferliegenden Zustand abgeregt. Hierzu kann der Laser 3 die Stimulationslichtstrahlen als Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussenden. Das von der Probe 8 spontan emittierte Emissionslicht 18 wird durch das Objektiv 6 und den dichroitischen Spiegel 5 in den Detektor 9 gelenkt und dort nachge­ wiesen. In der gezeigten Darstellung wird das Emissionslicht zum Nachweis in dem Detektor 9 von dem Anregungslicht durch den dichroitischen Spiegel 5 getrennt. Dies ist möglich, da in der Regel der Anregungslichtstrahl 16 eine andere Wellenlänge aufweist als das Emissionslicht 18. Zur weiteren Verbesserung der Selektion des Emissionslichts 18 aufgrund seiner Wellenlänge ist vor dem Detektor 9 eine Farbfilter 19 angeordnet.

Ferner ist ein dem Objektiv 6 vorgeschalteter Polarisator 20 zum Polarisieren des Stimulationslichtstrahls 17 und ein dem Objektiv 6 nachgeschalteter Polarisator 21 zum Polarisieren des zum Detektor gehenden Emissionslichts 18 vorgesehen. Die Polarisatoren 20 und 21 haben eine zueinander orthogonale Durchlaßrichtung. Mit Hilfe der Polarisatoren 20 und 21 läßt sich das von der Probe 8 kommende Emissionslicht von dem Stimulationslicht trennen. Die zueinander orthogonal angeordneten Polarisatoren 20, 21 sind vorteilhaft, um eine bessere Unterdrückung des Stimulationslichts im Detektor zu erreichen. Ferner ist dem Farbfilter 19 und dem Polarisator 21 eine Lochblende 15 vorgeschaltet, die sich in einer zur Fokalebene des Objektivs 6 optisch konjugierten Ebene befindet. Alternativ kann das von der Probe 8 kommende Emissionslicht 18 von dem Stimulationslicht bzw. dem Anregungslicht durch eine nicht dargestellte Zeitsteuerungseinrichtung getrennt werden. Dies ist dann möglich, wenn der Laser 3 die Stimulations­ lichtstrahlen als Pulse in zeitlicher Abfolge und der Laser 2 den Anregungslichtstrahl als Pulse in zeitlicher Abfolge aussendet. Die Zeitsteuerungseinrichtung muß den Detektor 9 unmittelbar nach Abklingen eines Pulses der Stimulations­ lichtstrahlen einschalten. Auf diese Weise kann das Emissions­ licht 18 einfach und zuverlässig von dem Stimulationslicht getrennt werden. Das Farbfilter 19 und die Polarisatoren 20, 21 können je nach Bedarf zusätzlich, wie in Fig. 1 gezeigt, angeordnet werden.

Der Strahlrastereinrichtung 11 ist eine Linse 22 vorgeschaltet, mit der der Anregungslichtstrahl 16 und die Stimulationslicht­ strahlen 17 in die Strahlrastereinrichtung 11 fokussiert werden. Mit der Strahlrastereinrichtung 11 werden der Anregungslicht­ strahl 16 und die Stimulationslichtstrahlen 17 so gesteuert, daß sie die Probenpunkte 7, 7′, . . . der Probe 8 in einer gewünschten Reihenfolge abrastern. In jedem der Probenpunkte 7, 7′ wird die oben beschriebene Messung durchgeführt.

In Fig. 2 sind die Intensitätsverteilung 25 des Anregungslicht­ strahls 16 und die Intensitätsverteilungen 26 zweier Stimula­ tionslichtstrahlen 17 dargestellt. Die Intensitätsverteilungen des Anregungslichtstrahls 16 ist die Rasterpunkt-Abbildungsfunk­ tion des herkömmlichen Raster-Fluoreszenzmikroskops. Die Intensitätsverteilung 25 des Anregungslichtstrahls 16 hat ein Hauptmaximum und dazu symmetrische Nebenmaxima in lateraler Richtung. Die Intensitätsverteilung 26 der Stimulationslicht­ strahlen 17 sind jeweils gaußförmig. Die Maxima der Gauß­ verteilungen der Stimulationslichtstrahlen sind hinsichtlich des Maximums der Intensitätsverteilung 25 des Anregungslichtstrahls lateral versetzt. Es ist eine symmetrische Anordnung gewählt, bei der die beiden Stimulationslichtstrahlen 17 in entgegen­ gesetzter Richtung mit gleichem Abstand hinsichtlich der Mittelachse durch die Intensitätsverteilung 25 des Anregungs­ lichtstrahls 16 verschoben sind. Die Intensität der Stimula­ tionslichtstrahlen ist deutlich größer als die Intensität des Anregungslichtstrahls. Die Intensität der Stimulationslicht­ strahlen ist so gewählt, daß zwischen dieser Intensität und der Besetzung des Energiezustands der Probe ein nichtlinearer Zusammenhang besteht.

In Fig. 3 ist die Rasterpunkt-Abbildungsfunktion in der Fokalebene des Objektivs 6 dargestellt, in welche die Intensitätsverteilungen der Fig. 2 eingehen. Die Rasterpunkt- Abbildungsfunktion, welche die Auflösung des Rastermikroskops bestimmt, ergibt sich aus dem Zusammenwirken der Intensitätsverteilung des Anregungslicht­ strahls und der/des Stimulationslichtstrahls/en. Wie man der Figur entnimmt, weist die resultierende Rasterpunkt­ abbildungsfunktion ein Maximum auf, dessen Halbwertsbreite deutlich schmaler ist als die Halbwertsbreite der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls, vergleiche Fig. 2. Zudem sind durch die Gesamtwirkung der in Fig. 2 dargestellten Intensitätsverteilungen die in dem Anregungs­ lichtstrahl enthaltenen Nebenmaxima eliminiert. Aufgrund des Zusammenwirkens des Anregungslichtstrahls und der Stimula­ tionslichtstrahlen erhält man also eine Rasterpunkt- Abbildungsfunktion mit einer erheblichen Verbesserung in der lateralen Auflösung, da sowohl die Halbwertsbreite der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion erheblich reduziert wird, als auch die in der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls enthaltenen Nebenmaxima eliminiert werden, verglichen mit der effektiven Punkt-Abbildungsfunktion eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops, die identisch mit der Intensitätsverteilung des Anregungslichtstrahls im Fokalbereich des Objektivs ist. Das Verfahren kann die laterale Auflösung eines Rastermikroskops um etwa einen Faktor 5 verbessern. Die in den Fig. 2 und 3 dargestellten Kurven sind eine prinzipielle, nicht maßstabsgetreue Darstellung.

Im folgenden wird das Verfahren anhand der Fig. 1 beschrieben. In dem dort gezeigten Rastermikroskop wird mit dem Positioniertisch 10 die Probe 8 in eine bestimmte Position der optischen Achse A gebracht. Die Laser 2, 3 sowie die Linsen 12, 13, die Blende 14, der Strahlteiler 23 und der Spiegel 24 werden so angeordnet, daß die Stimulationslicht­ strahlen 17 und der Anregungslichtstrahl 16 von dem dichroitischen Spiegel 5 und dem Objektiv 6 auf einen gewählten Probenpunkt 7 gelenkt werden. Die Stimulationslichtstrahlen 17 werden so ausgerichtet, daß ihre Intensitätsverteilungen sich im Fokalbereich des Objektivs 6 mit der Intensitätsverteilung des Anregungslicht­ strahls 16 auf eine gewünschte Weise decken. Das Filter 19 und die Polarisatoren 20, 21 werden so angeordnet, daß das von der Probe in dem Probenpunkt emittierte Emissionslicht 18 von dem Anregungslicht und dem Stimulationslicht heraussepariert und in den Detektor 9 gelenkt und dort nachgewiesen wird. Nach dieser Messung wird ein neuer Probenpunkt 7′ ausgewählt. Hierzu werden der Anregungslichtstrahl 16 und die Stimulationslichtstrahlen 17 auf den Probenpunkt 7′ gelenkt. Dort erfolgt die Messung auf die gleiche Weise wie in dem Probenpunkt 7. Danach werden der Anregungslichtstrahl 16 und die Stimulationslichtstrahlen 17 von der Strahlrastereinrichtung 11 auf einen weiteren Probenpunkt gelenkt, bis die Probe 8 in dem gewünschten Bereich in lateraler Richtung abgerastert und gemessen ist. Dann wird der Positio­ niertisch 10 in Richtung der optischen Achse A verschoben. In dieser Stellung der Probe 8 beginnt wiederum der gesamte Meßablauf. Auf diese Weise kann die Probe 8 dreidimensional abgerastert und gemessen werden.

Claims (23)

1. Verfahren zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe mit einer zwei Wellenlängen aufweisenden Lichtstrahlung, bei dem die Lichtstrahlung der einen Wellenlänge als Anregungs­ lichtstrahl auf den zu messenden Probenpunkt mittels eines Objektivs fokussiert wird und dort einen Energiezustand anregt und bei dem das von dem Probenpunkt aufgrund der Anregung des Energiezustands spontan emittierte Emissionslicht heraus­ separiert und nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß zum Erzielen einer hohen Ortsauflösung die andere Wellenlänge der Lichtstrahlung zur Erzeugung mindestens eines Stimulations­ lichtstrahls (17) derart gewählt wird, daß die von dem Anre­ gungslichtstrahl (16) in dem Probenpunkt (7) angeregte Probe (8) durch den mindestens einen Stimulationslichtstrahl (17) in Teilbereichen zu stimulierter Emission veranlaßt wird, wobei sich im Fokalbereich des Objektivs (6) das Hauptmaximum des mindestens einen Stimulationslichtstrahls (17) und das Haupt­ maximum des Anregungslichtstrahls (16) teilweise überdecken.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (8) mit dem Anregungslichtstrahl (16) und dem Stimula­ tionslichtstrahl (17) abgerastert wird.

3. Vorrichtung zum optischen Messen eines Probenpunkts einer Probe zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, mit einer Lichtquellenanordnung zum Erzeugen einer Lichtstrah­ lung mit zwei Wellenlängen, wobei die Lichtstrahlung der einen Wellenlänge als Anregungslichtstrahl zum Anregen des Energie­ zustands des Probenpunkts der Probe dient, mit einem Objektiv zum Fokussieren der Lichtstrahlung auf den Probenpunkt der im Fokalbereich des Objektivs anordbaren Probe, mit einer Separa­ tionseinrichtung zum Herausseparieren des von dem Probenpunkt aufgrund der Anregung des Energiezustands spontan abgestrahlten Emissionslichts und mit einem Detektor zum Nachweis des Emis­ sionslichts, dadurch gekennzeichnet, daß zum Erzielen einer hohen Ortsauflösung die andere Wellenlänge der Lichtstrahlung als mindestens ein Stimulationslichtstrahl (17) derart gewählt ist, daß die von den Anregungslichtstrahl (16) in dem Probenpunkt (7) angeregte Probe (8) durch den mindestens einen Stimulationslichtstrahl (17) in Teilbereichen zu stimulierter Emission veranlaßt wird, und daß Mittel vorgesehen sind, um das Hauptmaximum des mindestens einen Stimulationslichtstrahls (17) und das Hauptmaximum des Anregungslichtstrahls (16) im Fokalbereich des Objektivs (6) teilweise zur Überdeckung zu bringen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (8) auf einem Positioniertisch (10) angeordnet ist, mit dem eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse (A) des Objektivs (6) durchführbar ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Lichtquellenanordnung (1) und dem Objektiv (6) eine Strahlrastereinrichtung (11) zum gesteuerten Abrastern der Probe (8) mit dem Anregungslichtstrahl (16) und dem Stimula­ tionslichtstrahl (17) vorgesehen ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß optische Mittel vorgesehen sind zur lateralen Versetzung des Stimulationslichtstrahls (17) hinsichtlich des Anregungslichtstrahls (16) in der Fokalebene des Objektivs (6).

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß optische Mittel vorgesehen sind zur axialen Versetzung des Stimulationslichtstrahls (17) hinsichtlich des Anregungslichtstrahls (16) entlang der optischen Achse (A).

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß wenigstens ein weiterer von der Licht­ quellenanordnung (1) kommender Stimulationslichtstrahl (17) vorgesehen ist, dessen Lage im Fokalbereich des Objektivs (6) von der Lage des vorgenannten Stimulationslichtstrahls (17) verschieden ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulationslichtstrahlen (17) hinsichtlich des Anregungs­ lichtstrahls (16) räumlich symmetrisch angeordnet sind.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) einen Laser umfaßt, der Lichtanteile der unterschiedlichen Wellenlängen emittiert.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) wenigstens zwei Laser (2, 3) umfaßt, die Licht der unterschiedlichen Wellen­ längen emittieren.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) wenigstens einen Dauerstrichlaser (2) aufweist, der den Anregungslichtstrahl (16) aussendet.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) wenigstens einen Laser (2, 3) aufweist, der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Laser (3), der Lichtpulse zeitlicher Abfolge aussendet, mindestens einen der Stimulationslichtstrahlen (17) erzeugt.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Laser (3) zur Erzeugung mindestens eines der Stimulationslichtstrahlen (17) einen Lichtstrahl mit einem Gauß-förmigen Profil aussendet.

16. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquellenanordnung (1) zur Erzeugung der Stimulationslichtstrahlen (17) von hoher Intensität ist, so daß zwischen dieser Intensität und der Besetzung des Energiezustands der Probe (8) ein nichtlinearer Zusammenhang besteht.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Separationseinrichtung eine Zeitsteuer­ einrichtung umfaßt, mit der der Detektor (9) unmittelbar nach Abklingen eines Pulses der Stimulationslichtstrahlen (17) eingeschaltet werden kann.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 17, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Separationseinrichtung einen der Licht­ quellenanordnung unmittelbar nachgeschalteten Polarisator (20) zum Polarisieren der Stimulationslichtstrahlen (17) und einen dem Detektor (9) unmittelbar vorgeschalteten Polarisator (21) zum Polarisieren des zum Detektor (9) gehenden Emissionslichts mit einer orthogonalen Durchlaßrichtung zu derjenigen des dem Objektiv (6) vorgeschalteten Polarisators (20) umfaßt.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 18, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Separationseinrichtung wenigstens ein Wellenlängenfilter (19) aufweist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 19, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Separationseinrichtung einen dichroiti­ schen Spiegel (5) aufweist.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Detektor (9) ein Punktdetektor ist, der in einer zur Fokalebene des Objektivs (6) optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 21, dadurch ge­ kennzeichnet, daß dem Detektor (9) ein weiteres Fokussierungs­ element und eine Blende (15) vorgeschaltet sind, wobei die Blende (15) in einer zur Fokalebene des Objektivs (6) optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 22, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zwischen der Lichtquellenanordnung (1) und dem Objektiv (6) ein für die Wellenlänge des mindestens einen Stimulationslichtstrahls (17) durchlässiges Filterelement angeordnet ist, welches für die Wellenlänge des Anregungs­ lichtstrahls (16) einen undurchlässigen Mittenbereich und einen durchlässigen Außenbereich aufweist.