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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beleuchtung und Detektion in der RESOLFT-Mikroskopie mit gepulster oder kontinuierlicher Lichtquelle für Anregungslicht und Schaltlicht. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Die RESOLFT-Mikroskopie (REversible Saturable OpticaL (Fluorescence) Transitions = reversibel sättigbare optische (Fluoreszenz-)Übergänge) umfasst eine Gruppe von lichtmikroskopischen Verfahren, bei der man besonders scharfe Bilder bei hohen Vergrößerungen erhält. Trotz Verwendung herkömmlicher Objektive und gebeugter Strahlen lässt sich eine Auflösung weit jenseits der Beugungsgrenze bis herunter auf die molekulare Skala erzielen (siehe dazu Stefan W. Hell, Marcus Dyba und Stefan Jakobs: Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microskopy. Current Opinion in Neurobiology 2004, 14: S. 599–609; Stefan W. Hell: Microscopy and its focal switch. SPECIAL FEATURES PERSPECTIVE, VOL. 6 NO. 1, January 2009, Nature Methods.)
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Bei herkömmlichen Lichtmikroskopen liegt die Unterscheidbarkeit eng beieinander liegender Details bei ca. 200 nm. Dies beruht auf der Wellennatur des Lichts. So ist bei herkömmlichen Lichtmikroskopen die Auflösungsgrenze im Wesentlichen durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts und die Numerische Apertur bestimmt. Bei der RESOLFT-Mikroskopie wird diese Grenze überschritten, nämlich dadurch, dass Farbstoffe vorübergehend in einen Zustand geschaltet werden, in dem sie nicht in der Lage sind, nach Beleuchtung mit einem (Fluoreszenz-)Signal zu antworten.
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Entsprechend den voranstehenden Ausführungen handelt es sich bei der RESOLFT-Mikroskopie um eine Variante der Lichtmikroskopie, bei der die Beugungsgrenze überwunden wird. So lassen sich mittels RESOLFT-Mikroskopie Details eines Präparats erkennen bzw. abbilden, die eigentlich viel zu dicht beieinander liegen, um gerade noch aufgelöst zu werden.
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Gemäß RESOLFT-Mikroskopie werden die Prinzipien der STED-Mikroskopie (siehe Stefan W. Hell, Jan Wichmann: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. In: Optics Letters. 19, Nr. 11, 1994, S. 780–782; Thomas A. Klar, Stefan W. Hell: Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. In: Optics Letters. Vol. 24, Nr. 14, 1999, S. 954–956.) und der GSD-Mikroskopie (siehe Volker Dose: Peer review. In: EPL, A Letters Journal Exploring the Frontiers of Physics. Vol. 89, 2009; Stefan W. Hell M. Kroug: Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. In: Applied Physics B: Lasers and Optics. Vol. 60, Nr. 5, 1995, S. 495–497; Stefan Bretschneider, Christian Eggeling, Stefan W. Hell: Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. In: Physical Review Letters. Vol. 98, Nr. 5, 2007, S. 218103) auf beliebige Molekülarten verallgemeinert, die zwischen zwei unterscheidbaren Zuständen im weitesten Sinne reversibel schaltbar sind. Das „Schalten“ der Farbmoleküle in mindestens einen von zwei möglichen Zuständen lässt sich durch die Beeinflussung mittels Licht herbeiführen. Der Begriff „Schalten“ ist dabei im weitesten Sinne zu verstehen.
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Im Rahmen der RESOLFT-Mikroskopie werden die zu untersuchenden Präparate mit speziellen Molekülen, regelmäßig Fluoreszenzfarbstoffen, markiert. Es werden optisch getriebene, unterscheidbare Zustände in den Farbmolekülen genutzt. Dabei werden die Farbmoleküle zwischen mindestens zwei Zuständen hin- und her bzw. rauf und runter geschaltet. Bei den Zuständen kann es sich um einen signalgebenden hellen Zustand und einen nicht signalgebenden dunklen Zustand handeln. Das Schalten der Farbmoleküle in mindestens einen der beiden Zustände wird durch Lichteinwirkung erreicht.
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Der Begriff „RESOLFT-Mikroskopie“ ist als Dachbegriff zu verstehen, unter dem unterschiedliche Verfahren zu subsumieren sind, die nach einem ähnlichen Prinzip arbeiten. So gehört zu der RESOLFT-Mikroskopie die STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion Microscopy). Dabei kann ein Fluoreszenzfarbstoff zwischen einem elektronischen Grundzustand und einem angeregten Zustand hin und her pendeln und dabei fluoreszieren. Im dunklen Zustand wird der Farbstoff durch stimulierte Emission permanent in seinem Grundzustand gehalten. Somit gibt es zwei Konfigurationen der Fluoreszenzfarbstoffe, wonach diese nämlich im signalgebenden Zustand fluoreszieren und im dunklen Zustand keinerlei Emissionen wahrnehmbar sind.
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Ebenso gehört die GSD-Mikroskopie (Grundzustandsentvölkerungsmikroskopie = Ground State Depletion Microscopy) zu der RESOLFT-Mikroskopie. Hier werden Fluoreszenzfarbstoffe als Marker verwendet. Der Farbstoff kann im hellen Zustand zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand hin und her pendeln und dabei fluoreszieren. Für den dunklen Zustand wird der Grundzustand des Moleküls entvölkert. Dies bedeutet, dass das Molekül in einen langlebigen Zustand angeregt wird, von dem aus keine Fluoreszenz stattfindet. Solange sich das Molekül in einem langlebigen Dunkelzustand befindet, steht es nicht im Grundzustand zur Verfügung, kann demnach nicht zur Fluoreszenz angeregt werden. Die Rückkehr in den hellen Zustand erfolgt spontan.
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Auch bei SPEM (Saturated Pattern Excitation Microscopy) und SSIM (Saturated Structured Illumination Mikroskopy) handelt es sich um Vertreter der RESOLFT-Mikroskopie, wonach zunächst Negativ-Bilder aufgenommen werden und eine mathematische Bildrekonstruktion stattfindet. Der Grundzustand tritt an die Stelle des dunklen Zustands entsprechend den voranstehenden Erörterungen. Der erste angeregte Zustand entspricht dem hellen Zustand.
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Im Rahmen der RESOLFT-Mikroskopie sei des Weiteren die Upcoversion-Mikroskopie erwähnt (vgl. D. H. Kim and J. U. Kang: Upconversion microscopy for biological applications, Microscopy: Science, Technology, Applications and Education, S. 571–582). Auch die STAQ-Mikroskopie ist unter RESOLFT zu subsumieren.
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An dieser Stelle sei angemerkt, dass sich die Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung bezieht, die sich zur Beleuchtung und Detektion in der RESOLFT-Mikroskopie ganz allgemein verwenden lässt, und zwar ungeachtet der konkreten Methode. Wesentlich ist die Nutzung des Grundprinzips nach RESOLFT, wobei sich die Anwendung auf alle nur denkbaren Vertreter des Grundprinzips bezieht.
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Zur Vereinfachung einer Erörterung der erfindungsgemäßen Lehre sei die sich grundsätzlich auf die RESOLFT-Mikroskopie bezogene Lehre am Beispiel der STED-Mikroskopie erörtert, wonach nämlich mit einer gepulster oder kontinuierlicher Lichtquelle für Anregungslicht und Stimulationslicht (entspricht dem Schaltlicht) gearbeitet wird.
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Eine entsprechende gattungsbildende Vorrichtung ist insbesondere in Bezug auf die konfokale Fluoreszenz-Rastermikroskopie aus der
DE 44 16 558 C2 bekannt. Bei dieser Vorrichtung wird zur Erhöhung der lateralen Auflösung ein Probenpunkt mit einem Anregungslichtstrahl beleuchtet, wodurch die mit Anregungslicht beaufschlagten Fluoreszenzmoleküle in einen angeregten Zustand versetzt werden. Der Probenpunkt wird darüber hinaus mit einem Stimulationslichtstrahl geeigneter Wellenlänge beleuchtet, wodurch Fluoreszenzmoleküle, die sich im angeregten Zustand befinden, durch den Prozess der stimulierten Emission wieder in den Grundzustand versetzten lassen. Der Anregungslichtstrahl und der Stimulationslichtstrahl (Schaltlichtstrahl) sind derart angeordnet, dass ihre Intensitätsverteilungen bzw. Beleuchtungsmuster im Objektbereich sich zumindest teilweise überdecken. Die in dem Überdeckungsbereich liegenden Fluoreszenzmoleküle werden nach der Anregung mit dem Anregungslichtstrahl durch stimulierte Emission sofort in den Grundzustand überführt, so dass ausschließlich von den Fluoreszenzmolekülen ausgehendes Fluoreszenzlicht detektiert wird, wobei sich die Fluoreszenzmoleküle im Beleuchtungsmuster des Anregungsstrahls, jedoch nicht im Beleuchtungsmuster des Stimulationsstrahls bzw. im Überdeckungsbereich der beiden Beleuchtungsmuster, befinden.
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Das stimulierte Emissionslicht bzw. das reflektierte Stimulationslicht kann beispielsweise mit Hilfe optischer Filter aus dem Detektionsstrahlengang des Rastermikroskops ausgefiltert werden, so dass lediglich Fluoreszenzlicht aus dem Bereich des Beleuchtungsmusters des Anregungsstrahls detektiert wird, der um den Überdeckungsbereich der beiden Beleuchtungsmuster reduziert ist. Diese Reduktion ermöglicht die Verkleinerung des zur Fluoreszenzemission beitragenden Objektbereichs unter die Grenzen der beugungsbegrenzten Abbildung, und stellt somit eine Auflösungsverbesserung dar.
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Aus der
DE 103 13 138 B4 ist auch bereits eine Vorrichtung zur Beleuchtung und Detektion eines Objekts bei der STED-Mikroskopie bekannt, bei der der Hauptstrahlteiler als schaltbarer Strahlteiler ausgeführt ist, der in Abhängigkeit der angestrahlten Lichtleistung des Stimulationslichts dann auf Transmission schaltbar ist, wenn das Anregungsniveau im Bereich der Stimulationslichtverteilung vernachlässigbar geworden ist. Hier spricht man ganz allgemein von Gating.
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Wie bereits zuvor erwähnt, wird bei der STED-Mikroskopie die Probe zunächst mit einem Anregungslichtstrahl, beispielsweise mit gepulstem grünen Laserlicht, optisch angeregt. Anschließend erfolgt das sogenannte Quenchen, nämlich durch Bestrahlung mittels Stimulationslicht, so dass eine stimulierte Emission der Probe in einem Teilbereich des angeregten Fokusbereichs mit einer Wellenlänge erfolgt, die mit dem Fluoreszenzspektrum des angeregten Farbstoffs überlappt. Typischerweise liegt die stimulierte Emission im Bereich zwischen 700 und 800 mm. Die abseits der STED-Beleuchtung liegenden Bereiche emittieren im Rahmen der „normalen“ Fluoreszenz.
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Bei der STED-Mikroskopie handelt es sich um eine Technologie, mit der eine Auflösung jenseits der klassischen Beugungsgrenze erreichbar ist, während in einem typischen Mikroskop die Auflösung durch die Lichtwellenlänge auf Grund von Beugung begrenzt ist.
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In einem konfokalen Mikroskop kann der scannende Laserpunkt nicht kleiner als eine bestimmte Größe sein, typischerweise um die 200 nm. Strukturen in der Probe, die kleiner sind als dieser Wert, lassen sich folglich nicht mehr abbilden.
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Um die Auflösungsgrenze in der STED-Mikroskopie zu überwinden, wird in einem konfokalen Mikroskop der scannenden, fokussierten Lichtverteilung, die der Anregung der Farbstoffe im Objekt dient („Anregungslicht“), eine weitere Lichtverteilung überlagert. Diese Lichtverteilung ist typischerweise ringförmig, mit einem Intensitätsminimum in der Mitte. Die Wellenlänge dieser Lichtverteilung ist so gewählt, dass sie bei den Farbstoffen, die von dem Anregungslicht angeregt werden, stimulierte Emissionen induziert („STED-Licht“). Somit lässt sich erreichen, dass auf dem Gebiet, das von der Anregungslichtverteilung getroffen wird, in der Praxis nur der Bereich tatsächlich Fluoreszenzlicht emittiert, der sich in der Mitte der STED-Lichtverteilung befindet. Denn hier hat die STED-Lichtverteilung ihr Minimum, bewirkt also keine stimulierte Emission. In allen anderen Bereichen, die von dem Anregungslicht beleuchtet werden, wird kein Fluoreszenzlicht emittiert, da die Fluoreszenz unverzüglich vom STED-Licht durch sofortige stimulierte Emission unterbunden wird.
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Das Licht, das durch stimulierte Emission emittiert wird, kann durch geeignete Filter herausgefiltert werden, so dass nur dieses Licht aus dem Zentrum der Anregungslichtverteilung übrig bleibt. Die so entstehende effektive neue Anregungslichtverteilung ist wesentlich kleiner als die ursprüngliche. Somit lassen sich deutlich kleinere Strukturen in der Probe erkennen.
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In Bezug auf das allgemeine Prinzip der STED-Mikroskopie wird ergänzend auf Hell, S. W., „Far-Field Optical Nanoscopy", Science, 316, 2007 und Hell, S. W., „Far-Field Optical Nanoscopy", Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology, Springer Verlang, 2010 verwiesen. Deren Inhalt betreffend die STED-Mikroskopie wird als in Fachkreisen bekannt vorausgesetzt.
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Eine wesentliche Rolle spielt bei der STED-Mikroskopie die zeitliche Koordination des Anregungslichts und des Stimulationslichts (STED-Licht).
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Eine besondere Ausführung der STED-Methode ist die gepulste STED-Methode. Hier wird das Anregungslicht in einem sehr kurzen Puls, typischerweise mit weniger als 150 Pikosekunden, zur Probe hin eingestrahlt. Unmittelbar danach, in einem Zeitraum der viel kleiner ist als die typische Lebensdauer des angeregten Zustands eines Farbstoff-Moleküls, wird das Stimulationslicht eingestrahlt, ebenfalls in einem Puls, der üblicherweise länger ist der Anregungslichtpuls, beispielsweise mit einer Pulslänge von einigen hundert Pikosekunden bis einigen Nanosekunden. Die „Lebensdauer“ eines angeregten Zustandes beträgt typischerweise einige Nanosekunden. Die Abregung und das Aussenden des assoziierten Photons ist ein stochastischer Prozess, der diese mittlere Lebensdauer besitzt. Beleuchtet man also eine Anordnung an Molekülen mit einem kurzen Anregungspuls, lässt sich eine Fluoreszenz detektieren, die exponentiell abfällt, und zwar mit einer charakteristischen „Zerfallskonstante“ von einigen Nanosekunden. Daher ist es wichtig, dass das Stimulationslicht sofort nach dem Fluoreszenzpuls eingestrahlt wird, denn nur so lässt sich sicherstellen, dass die Fluoreszenz möglichst vollständig durch das STED-Licht unterbunden wird. Ließe man hier zu viel Zeit verstreichen, würden nicht nur Photonen aus dem Zentrum der Anregungslichtverteilung registriert werden, sondern auch aus den anderen Bereichen. Diese Photonen sind unerwünscht, denn sie führen zu einer schlechten Auflösung.
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Des Weiteren ist von Bedeutung, dass der Anregungspuls kurz ist im Vergleich zur Lebensdauer des angeregten Zustandes. Wäre er lang, dann würde der STED-Puls für diejenigen Moleküle zu spät kommen, die bereits zu Beginn des Anregungspulses angeregt werden. Diese könnten dann wieder Lichts aussenden, bevor ihr Fluoreszenzlicht unterdrückt wird und würden somit zur schlechten Auflösung beitragen. Auch ist zu beachten, dass der STED-Puls üblicherweise um Größenordnungen intensiver ist als der Anregungspuls. Folglich sind insoweit leistungsfähige Laser mit hoher Pulsenergie erforderlich.
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Eine weitere bekannte Ausführungsform der STED-Methode ist ein STED-Verfahren mit kontinuierlichem Stimulationslicht (CW-STED = Continuous Wave-STED). Hier wird das Stimulationslicht nicht gepulst, vielmehr kontinuierlich zur Anregung emittiert. Entsprechend wird das Stimulationslicht kontinuierlich eingestrahlt.
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Das STED-Verfahren mit kontinuierlichem Stimulationslicht hat in der Praxis ganz erhebliche Vorteile. So muss keine Rücksicht auf die kritische zeitliche Abfolge der Pulse genommen werden. Der Pulsabstand wie auch die Pulslängen beim gepulsten Stimulationslicht sind äußerst kritische Parameter. Insbesondere ist es nicht einfach, ausreichend kurze Anregungspulse zu erzeugen. Lichtquellen, die dies leisten, sind regelmäßig sehr teuer. Auch geeignete gepulste Lichtquellen für das Stimulationslicht sind teuer und stehen nur in begrenzter Auswahl zur Verfügung. Bei CW-Lasern als Lichtquelle verhält sich dies anders. Sowohl für die Anregungslichtquellen als auch für STED-Lichtquellen gibt es eine große Auswahl an kostengünstigen und dabei zuverlässigen CW-Laserquellen, die kontinuierliches Licht zur Verfügung stellen.
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Die CW-STED-Methode hat jedoch auch ganz erhebliche Nachteile. Die Auflösung ist längst nicht so gut wie beim gepulsten STED-Verfahren. Dies ist darauf zurückzuführen, dass zu jeder beliebigen Zeit Farbstoffe angeregt werden können. Das Stimulationslicht wiederum wird nicht direkt nach der Anregung mit höchster Intensität in gepulster Form eingestrahlt, sondern kontinuierlich. Daher „sieht“ ein Farbstoffmolekül, welches zu einem Zeitpunkt t0 angeregt worden ist und dessen Anregungszeit äußerst kurz ist, nur wenig Stimulationslicht und hat damit nur eine geringe Chance, durch stimulierte Emission abgeregt zu werden. Ein Farbstoffmolekül, das eine längere Lebenszeit hat, „sieht“ mehr Stimulationslicht und wird daher effektiver abgeregt. Somit trägt zwar auch das CW-STED-Verfahren zu einer verbesserten Auflösung bei, jedoch führen die an erster Stelle genannten Farbstoffmoleküle zur Verschlechterung der Auflösung.
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Da die Anregung kontinuierlich eingestrahlt wird, besteht immer eine Mischung aus den beiden zuvor genannten Fällen. Somit ist zwar die Auflösung grundsätzlich erhöht, nicht jedoch ideal und schon längst nicht optimal.
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Eine weitere STED-Methode ist die so genannten „Gated-STED-Methode“. Dazu sei verwiesen auf Vicidomini, G., et. al., Nature Methods, 8(7), 2011 und Moffitt, J R, et. al., Optics Express, 19(5), 2011. Bei der Gated-STED-Methode handelt es sich um eine Mischung aus den beiden erstgenannten STED-Methoden. Das Stimulationslicht wird kontinuierlich eingestrahlt, während das Anregungslicht in kurzen Pulsen eingestrahlt wird.
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Um zu verhindern, dass „schlechte“ Photonen detektiert werden, also solche, die kurz nach dem Anregungspulse emittiert werden, werden nun alle diese Photonen verworfen. Dies kann z. B. dadurch geschehen, dass der Detektor für eine kurze Zeit abgeschaltet wird, beziehungsweise das Signal des Detektors für diesen Zeitraum nicht weiter verarbeitet wird. Dadurch, dass nur Photonen detektiert werden, die nach einer gewissen Zeit nach dem Anregungspulse emittiert werden, lässt sich sicherstellen, dass diese Photonen tatsächlich die zur Auswertung gewünschten Photonen sind, nämlich die aus der Mitte der Anregungslichtverteilung, wo also überhaupt kein Stimulationslicht eingestrahlt wird und die dann zur hohen Auflösung beitragen. Alle anderen Moleküle, also diejenigen, die außerhalb des unmittelbaren Zentrum der Anregungslichtverteilung liegen, haben auf diese Weise lange genug das STED-Licht „gesehen“, so dass sie mit hoher Wahrscheinlichkeit abgeregt sind und keine Photonen aussenden.
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In der Praxis hat sich die Gated-STED-Methode als vorteilhaft erwiesen, da man relativ günstige und zuverlässige CW-Laser zur Erzeugung des Stimulationslichts verwenden kann. Allerdings müssen auch bei dieser Methode für das Anregungslicht teure kurzpulsige Laser verwendet werden. Diese ist insbesondere unter dem zunehmenden Kostendruck nachteilig.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, sowohl ein Verfahren als auch eine Vorrichtung zur Beleuchtung und Detektion in der RESOLFT-Mikroskopie anzugeben, wonach auf zuverlässige Weise mit hinreichend guter Auflösung die RESOLFT-Mikroskopie betreibbar ist. Insbesondere in Bezug die erforderlichen Lichtquellen sollen die Kosten so gering wie möglich gehalten sein.
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Voranstehende Aufgabe ist durch die Merkmale der nebengeordneten Patentansprüche 1 und 12 gelöst.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist entsprechend den Merkmalen des Patentanspruchs 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht gepulst eingestrahlt wird und dass der Puls des Anregungslichts länger als 150 Pikosekunden, vorzugsweise bis zu einigen hundert Pikosekunden bis hin zu einigen Nanosekunden lang ist.
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In Bezug auf die erfindungsgemäße Vorrichtung ist die Aufgabe durch die Merkmale des nebengeordneten Patentanspruchs 12 gelöst. Danach ist die erfindungsgemäße Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass zum gepulsten Einstrahlen des Anregungslichts eine gepulste Lichtquelle vorgesehen, die mit einem Puls länger als 150 Pikosekunden, vorzugsweise bis zu einigen hundert Pikosekunden bis hin zu einigen Nanosekunden, insbesondere im Bereich von 400 Pikosekunden bis 10 Nanosekunden, pulst.
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Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass es in raffinierter Weise möglich ist, das Anregungslicht gepulst einzustrahlen und dabei den Puls des Anregungslichts in einem besonders vorteilhaften zeitlichen Bereich aufrecht zu erhalten, nämlich den Puls länger als 150 Pikosekunden bis hin zu einigen Nanosekunden zu definieren. Dadurch lassen sich preiswerte Laser-Lichtquellen verwenden.
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Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass bei geeigneter Umsetzung des Signalfilters die Benutzung von kurzen Anregungspulsen, die sich nur durch äußerst teure Lichtquellen generieren lassen, nicht erforderlich ist. Ganz im Gegenteil sind solche kurzen Anregungspulse nachteilig. So ist es sinnvoll und insoweit von besonderem Vorteil, Anregungspulse einzustrahlen, die länger sind als die üblicherweise kurzen Pulslängen von weniger als 150 Pikosekunden, wie dies im Stand der Technik üblich ist. Die Dauer des Anregungspulses kann in vorteilhafter Weise einige hundert Pikosekunden bis zu einigen Nanosekunden lang sein, wobei die Länge der Anregungspulse in etwa der Lebensdauer (Halbwertszeit) des Fluoreszenzzustands eines durch das Anregungslichts zur Emission angeregten Farbstoffmoleküls in der Probe entsprechen kann. Diese Maßnahme führt völlig überraschend zu einem erhöhten Signal und zusätzlich zu einer besseren Auflösung.
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Der in erfindungsgemäßer Weise realisierte Unterschied in der Pulslänge des Anregungslichts führt neben einem verbesserten Signal zu einer erheblichen technischen Vereinfachung bei den Anregungslichtquellen. So lassen sich Pulsdauern im Bereich von einigen Nanosekunden bis einigen hundert Pikosekunden kostengünstig realisieren, nämlich durch geeignete Lichtquelle, die gegenüber den Lichtquellen für Pulslängen von weniger als 150 Pikosekunden wesentlich preiswerter sind.
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Unter Zugrundelegung der erfindungsgemäßen Lehre ist es des Weiteren nicht erforderlich, wie bei dem aus dem Stand der Technik bekannten kurzpulsigen Anregungen eine steil ansteigende Flanke der Lichtintensität in den Anregungspulsen zu haben. Von Vorteil ist lediglich, dass die abfallende Flanke des Anregungspulses einigermaßen steil ist. Folglich sind asymmetrische Pulse möglich und hinreichend, wodurch eine weitere technische Vereinfachung in Bezug auf die Lichtquellen zur Erzeugung des Anregungslichtpulses realisierbar ist.
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Ein schnelles Ausschalten des Lichts, d. h. ein Erzeugen einer steil abfallenden Flanke des Lichtpulses, lässt sich nämlich mit einfachen Mitteln realisieren, beispielsweise durch eine schnelle Umpolung der Spannungsversorgung. Ein steiler Anstieg der Lichtintensität hingegen ist bei vielen Lasern problematisch, wobei ein solcher steiler Anstieg der Lichtintensität nach der erfindungsgemäßen Lehre nicht erforderlich ist. Dies spricht abermals für eine Kostenreduktion in Bezug auf die Lichtquelle.
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An dieser Stelle sei angemerkt, dass die Erfindung sowohl für gepulste Stimulationslichtquellen (STED-Lichtquellen) als auch für CW-Stimulationslichtquellen (CW-STED-Lichtquellen) geeignet ist.
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Sofern das Stimulationslicht (STED-Licht) gepulst eingestrahlt wird, ist es von ganz besonderem Vorteil, wenn während des Pulses des Anregungslichts kein Stimulationslicht zur Probe geführt wird, wobei in dieser Phase sämtliche von der Probe kommenden Photonen zur Detektion bzw. Auswertung verworfen werden. Mit Aktivierung oder kurz nach Aktivierung des Stimulationspulses werden die von der Probe kommenden Photonen detektiert bzw. ausgewertet.
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Im Unterschied zum Stand der Technik wird nach der Lehre der Erfindung das Anregungslicht durch einen längeren Puls eingestrahlt, der ungefähr der Halbwertszeit der Lebensdauer des angeregten Fluoreszenzzustandes entspricht. Da es sich bei dem Anregungslicht um ein Licht aus einem gepulsten System handelt, ist zu diesem Zeitpunkt die Stimulationslichtquelle nicht aktiv bzw. wird kein Stimulationslicht eingestrahlt. Im Unterschied zum Stand der Technik werden sämtliche Photonen, die während des Anregungszeitraums eingestrahlt werden, verworfen. Sie fallen in den sogenannten „Gating-Bereich“. Dies ist darauf zurückzuführen, dass diese Photonen aus dem gesamten Anregungsbereich und nicht nur aus dem Zentrum stammen. Erst dann, wenn der Puls des Stimulationslichts aktiv ist, oder kurz nach Aktivierung des Stimulationslichtpulses, wird der Gating-Bereich deaktiviert und es können Photonen detektiert werden. Diese kommen dann mit großer Wahrscheinlichkeit ausschließlich aus dem Zentrum der Anregungslichtverteilung, wie dies gewünscht ist.
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Gegenüber dem Stand der Technik hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass eine langpulsige Anregungslichtquelle nutzbar ist, die auf Grund ihrer sehr vereinfachten Ansteuerelektronik und der Nutzbarkeit von sehr kostengünstigen Laserquellen einfach und dabei preiswert herstellbar ist.
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Ein weiterer Vorteil gegenüber dem Stand der Technik ist darin zu sehen, dass der Anregungszeitraum länger ist und damit mehr Photonen auf den Detektor gelangen. Da der Anregungspuls in etwa der Halbwertszeit der Lebensdauer des angeregten Zustands der Farbmoleküle entsprechen kann, werden eine erhebliche Anzahl an Molekülen, die ganz zu Anfang des Anregungspulses angeregt wurden, nach Beendigung der Gating-Phase Photonen emittieren, die nutzbar sind. Eine große Anzahl der nutzbaren Photonen wird erst nach Beendigung der Gating-Phase emittiert, so dass auch sie detektierbar sind. Noch mehr Photonen lassen sich von Molekülen detektieren, die im mittleren Bereich des Anregungslichts angeregt werden. Auch die ganz am Ende des Anregungspulses emittierten Photonen sind nutzbar.
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Während nach dem Stand der Technik viele Photonen verworfen würden, sind in erfindungsgemäßer Weise zahlreiche weitere Photonen nutzbar, um ein besseres Signal zu erzeugen.
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Wie bereits zuvor erwähnt, lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren ebenso dann nutzen, wenn das Stimulationslicht kontinuierlich eingestrahlt wird, nämlich nach der sogenannten CW-STED-Methode. Hier ist wesentlich, dass bereits während des Pulses des Anregungslichts Stimulationslicht zur Probe geführt wird, wobei in dieser Phase sämtliche von der Probe kommenden Photonen solange verworfen werden, wie Anregungslicht eingestrahlt wird. Mit Beendigung des Anregungspulses oder kurz nach Beendigung des Anregungspulses werden die von der Probe kommenden Photonen detektiert bzw. ausgewertet.
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Im Falle der CW-STED-Methode erstreckt sich der Bereich, in dem keine Photonen detektiert werden, über den Bereich, in dem Anregungslicht eingestrahlt wird, hinaus, bis zu einem gewissen Bereich nach Beendigung des Anregungspulses. Dadurch lassen sich auch diejenigen Moleküle, die erst zum Ende des Anregungspulses angeregt werden, lange nutzen, da sie das Stimulationslicht ausreichend lange „sehen“.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung einerseits des Standes der Technik und andererseits zweier bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 in einem schematischen Diagramm den zeitlichen Verlauf der Intensität von Anregungslichtpuls und Stimulationslichtpuls bei der geplusten STED-Methode gemäß Stand der Technik,
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2 in einem schematischen Diagramm den zeitlichen Verlauf der Intensität von Anregungslicht und Stimulationslicht bei der CW-STED-Methode gemäß Stand der Technik,
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3 in einem schematischen Diagramm den zeitlichen Verlauf der Intensität von Anregungslichtpulsen und Stimulationslicht bei der Gated-STED-Methode gemäß Stand der Technik,
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4 in einem schematischen Diagramm den zeitlichen Verlauf der Intensität von Anregungslichtpuls und Stimulationslichtpuls, wobei dort das erfindungsgemäße Verfahren bei gepulsten Anregungslicht und gepulsten Stimulationslicht im Rahmen der gepulsten STED-Methode gezeigt ist, und
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5 in einem schematischen Diagramm den zeitlichen Verlauf der Intensität von Anregungslichtpuls und Stimulationslicht, wobei dort das erfindungsgemäße Verfahren bei gepulsten Anregungslicht und kontinuierlichen Stimulationslicht im Rahmen der CW-STED-Methode gezeigt ist.
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1 zeigt im Rahmen eines vereinfachten Diagramms die aus dem Stand der Technik bekannte gepulste STED-Methode, dabei den zeitlichen Verlauf des Anregungslichtpulses 1 und des STED-Pulses (Stimulationslichtpuls) 2.
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In Bezug auf den Anregungslichtpuls 1 ist wesentlich, dass er im Vergleich zur Lebendauer des angeregten Zustandes der Farbstoffmoleküle kurz ist. Wäre dieser Impuls länger, dann würde der Stimulationslichtpuls 2 zu spät kommen für diejenigen Moleküle, die bereits zu Beginn des Anregungslichtpulses angeregt worden sind. Diese würden dann wieder Licht aussenden, bevor ihre Fluoreszenz auf Grund des Stimulationslichtpulses 2 unterdrückt wird, wodurch eine schlechte Auflösung entsteht.
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Die mit Bezugszeichen 3 gekennzeichnete Kurve zeigt den Abfall der Fluoreszenz, wenn kein Stimulationslicht eingestrahlt würde.
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2 zeigt ebenfalls im Rahmen eines Diagramms eine weitere aus dem Stand der Technik bekannte Ausführung, nämlich die CW-STED-Methode. Hier werden weder das Anregungslicht 4 noch das Stimulationslicht 5 (STED-Licht) gepulst. Vielmehr wird hier kontinuierlich angeregt bzw. wird das Licht kontinuierlich eingestrahlt.
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3 zeigt ebenfalls im Rahmen eines Diagramms den Stand der Technik, nämlich die sogenannte Gated-STED-Methode. Das Stimulationslicht 5 wird hier kontinuierlich eingestrahlt, während das Anregungslicht 4 als Anregungslichtpuls 1 in kurzen Pulsen eingestrahlt wird. Mit Bezugszeichen 6 ist der jeweils verworfene Bereich bzw. sind die verworfenen Photonen gekennzeichnet. Die Kurve 3 kennzeichnet den Abfall der Fluoreszenz, würde kein Stimulationslicht eingestrahlt werden.
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4 zeigt ebenfalls in einem Diagramm die Zusammenhänge beim gepulsten Stimulationslicht 5 gemäß Erfindung.
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Im Unterschied zum Stand der Technik gemäß 1 wird das Anregungslicht 4 durch einen längeren Anregungslichtpuls 1 eingestrahlt, der ungefähr der Halbwertszeit der Lebensdauer des angeregten Fluoreszenzzustandes entspricht. Da es sich entsprechend der Darstellung in 4 um ein gepulstes System handelt, ist zum Zeitpunkt der Aktivierung des Anregungslichts 4 keinerlei Stimulationslicht bzw. STED-Licht 5 aktiv. Sämtliche Photonen, die während des Anregungszeitraumes eingestrahlt werden, werden entsprechend der schraffierten Fläche 6, verworfen. Sie fallen in den verworfenen Gating-Bereich. Diese Photonen kommen nämlich aus dem gesamten Anregungsbereich und nicht nur aus dem Zentrum des Anregungslichtflecks. Erst dann, wenn der Stimulationslichtpuls 2 aktiv ist oder kurz nach Aktivierung des Stimulationslichtpulses 2, wird der Gating-Bereich 6 deaktiviert und es können Photonen detektiert werden. Diese kommen dann mit hoher Wahrscheinlichkeit ausschließlich aus dem Zentrum der Anregungslichtverteilung, wie dies gewünscht ist.
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Gegenüber dem Stand der Technik ist vorteilhaft, dass zur Erzeugung des Anregungslichts 4 bzw. des Anregungslichtpulses 1 eine langpulsige Anregungslichtquelle verwendet werden kann, die auf Grund ihrer sehr einfachen Ansteuerelektronik und der Verwendbarkeit von kostengünstigen Lasern preiswert ist.
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Ein weiterer Vorteil gegenüber dem Stand der Technik gemäß 1 ist darin zu sehen, dass der Anregungszeitrum länger ist und damit mehr Photonen auf den Detektor gelangen, wie dies nach dem Stand der Technik grundsätzliche möglich ist. Da der Anregungslichtpuls 1 der Halbwertszeit der Lebensdauer des angeregten Zustands des Farbstoffmoleküls entsprechen kann, werden immer noch eine signifikante Anzahl an Molekülen, die selbst ganz zu Anfang des Anregungslichtpulses angeregt wurden, auch nach Beendigung des Gating-Bereichs 6 Photonen emittieren. Dies ist mit der Kurve 7 gekennzeichnet, die die Wahrscheinlichkeit der Emission von Photonen durch Moleküle darstellt, die am Anfang des Anregungslichtpulses 1 angeregt wurden. Eine große Anzahl von ihnen wird erst nach Beendigung des Gating-Bereichs 6 emittiert, so dass auch sie detektiert werden. Noch mehr Photonen können von Farbmolekülen detektiert werden, die im mittleren Bereich des Anregungslichtpulses 1 angeregt werden. Dies ist mit Kurve 8 verdeutlicht. Kurve 9 stellt den Emissionszeitraum der Farbstoffmoleküle dar, die erst ganz am Schluss des Anregungslichtpulses 1 angeregt werden. Dies entspricht allen Molekülen, die Stand der Technik angeregt würden. Nach Stand der Technik werden also viele Photonen verworfen, die man für ein besseres Signal nutzen kann, wie dies nach der erfindungsgemäßen Lehre stattfindet.
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5 zeigt ebenfalls im Rahmen eines Diagramms ein weiteres Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen der CW-STED-Methode. Hier wird das Anregungslicht entsprechende dem Ausführungsbeispiel aus 4 gepulst. Das Stimulationslicht 5 bzw. STED-Licht wird kontinuierlich eingestrahlt.
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Die Kurven 7, 8 und 9 zeigen den Abfall der Fluoreszenz, wenn kein Stimulationslicht eingestrahlt würde.
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Auch in 5 weist der schraffierte Bereich auf einen verworfenen Bereich 6 hin, in dem keine Photonen detektiert werden. Er erstreckt sich über den Bereich, in dem Anregungslicht 4 eingestrahlt wird, bis zu einem gewissen Bereich nach Beendigung des Anregungslichtpulses 1. Dies ist erforderlich, da auch diejenigen Moleküle, die erst zum Ende des Anregungslichtpulses angeregt werden, ausreichend lange das Stimulationslicht 5 bzw. das STED-Licht „sehen“ müssen.
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Es sei noch einmal ausdrücklich darauf hingewiesen, dass sich sowohl das erfindungsgemäße Verfahren als auch die erfindungsgemäße Vorrichtung grundsätzlich auf die RESOLFT-Mikroskopie bezieht, und zwar ungeachtet der konkreten Methode, die unter den Begriff „RESOLFT“ zu subsumieren ist. Wesentlich ist dabei, dass es um lichtmikroskopische Verfahren geht, bei der auf raffinierte Weise die Auflösungsgrenze bewunden wird, nämlich unter Nutzung lichtoptisch schaltbarer bzw. beeinflussbarer Zustände von Farbmolekülen.
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Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Anregungslichtpuls
- 2
- Stimulationslichtpuls, STED-Puls
- 3
- Kurve
- 4
- Anregungslicht
- 5
- Schaltlicht
- 6
- verworfener Bereich, Gating-Bereich, schraffierte Fläche
- 7
- Kurve
- 8
- Kurve
- 9
- Kurve
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 4416558 C2 [0013]
- DE 10313138 B4 [0015]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Stefan W. Hell, Marcus Dyba und Stefan Jakobs: Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microskopy. Current Opinion in Neurobiology 2004, 14: S. 599–609 [0002]
- Stefan W. Hell: Microscopy and its focal switch. SPECIAL FEATURES PERSPECTIVE, VOL. 6 NO. 1, January 2009, Nature Methods. [0002]
- Stefan W. Hell, Jan Wichmann: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. In: Optics Letters. 19, Nr. 11, 1994, S. 780–782 [0005]
- Thomas A. Klar, Stefan W. Hell: Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. In: Optics Letters. Vol. 24, Nr. 14, 1999, S. 954–956. [0005]
- Volker Dose: Peer review. In: EPL, A Letters Journal Exploring the Frontiers of Physics. Vol. 89, 2009 [0005]
- Stefan W. Hell M. Kroug: Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. In: Applied Physics B: Lasers and Optics. Vol. 60, Nr. 5, 1995, S. 495–497 [0005]
- Stefan Bretschneider, Christian Eggeling, Stefan W. Hell: Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. In: Physical Review Letters. Vol. 98, Nr. 5, 2007, S. 218103 [0005]
- vgl. D. H. Kim and J. U. Kang: Upconversion microscopy for biological applications, Microscopy: Science, Technology, Applications and Education, S. 571–582 [0010]
- Hell, S. W., „Far-Field Optical Nanoscopy“, Science, 316, 2007 [0021]
- Hell, S. W., „Far-Field Optical Nanoscopy“, Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology, Springer Verlang, 2010 [0021]
- Vicidomini, G., et. al., Nature Methods, 8(7), 2011 [0029]
- Moffitt, J R, et. al., Optics Express, 19(5), 2011 [0029]