DE102019110157B4

DE102019110157B4 - Fluoreszenz-Rastermikroskop und Verfahren zur Abbildung einer Probe

Info

Publication number: DE102019110157B4
Application number: DE102019110157.3A
Authority: DE
Inventors: Jonas Fölling; Lars Friedrich
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-06-17
Anticipated expiration: 2039-04-18
Also published as: WO2020212563A1; EP3956710A1; CN113711101A; US11650158B2; DE102019110157A1; US20220196554A1

Abstract

Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) umfassend:eine Anregungslichtquelle (102), die ausgebildet ist, eine Anregungslichtverteilung (E) zu erzeugen, welche in einer Probe (104) vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzphotonen anregt,eine Abregungslichtquelle (106), die ausgebildet ist, eine Abregungslichtverteilung (D) zu erzeugen, welche die durch die Anregungslichtverteilung (E) in der Probe (104) angeregten Fluorophore im Wege einer stimulierten Emission von Fluoreszenzphotonen abregt,eine Beleuchtungseinheit (108), die ausgebildet ist, die Anregungslichtverteilung (E) und die Abregungslichtverteilung (D) zu einer über mehrere Beleuchtungszielpunkte der Probe (104) rasternden Lichtverteilung derart zusammenzuführen, dass ein Intensitätsmaximum (M) der Anregungslichtverteilung (E) und ein Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt einander räumlich überlagert sind,einen Detektor (110), der ausgebildet ist, die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit ihrer Ankunftszeiten zu erfassen, undeinen Prozessor (112), der ausgebildet ist,die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen hinsichtlich ihrer Ankunftszeiten auszuwerten,auf Basis dieser Auswertung einen ersten Bildpunkt und einen zweiten Bildpunkt zu erzeugen, die den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt repräsentieren,die ersten Bildpunkte zu einem ersten Probenbild (P1) und die zweiten Bildpunkte zu einem zweiten Probenbild (P2) zusammenzusetzen, undan Hand der beiden Probenbilder (P1, P2) einen räumlichen Versatz (dx) zwischen dem Intensitätsmaximum (M) der Anregungslichtverteilung (E) und dem Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) zu bestimmen.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenz-Rastermikroskop sowie ein Verfahren zur Abbildung einer Probe unter Verwendung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops.
Hintergrund der Erfindung
Auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie kommt zur höchstauflösenden Abbildung einer Probe häufig das sogenannte STED-Verfahren zur Anwendung, bei dem die Probe mit einer Lichtverteilung beleuchtet wird, die aus einer Überlagerung von Anregungslicht und Abregungslicht generiert wird. STED steht hierbei für „Stimulated Emission Depletion“. Dabei ist das Anregungslicht darauf ausgelegt, in der Probe vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen. Demgegenüber dient das Abregungslicht, dessen Wellenlänge verschieden von der Wellenlänge des Anregungslichtes ist, der Abregung der durch das Anregungslicht angeregten Fluorophore im Wege einer stimulierten Emission von Fluoreszenzlicht. Zur Steigerung der Bildauflösung wird dem Anregungslicht, das in Form eines Laserstrahls auf den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt in der Probe fokussiert wird, das Abregungslicht mit einer speziellen Lichtverteilung überlagert. Diese Abregungslichtverteilung weist eine Intensitätsnullstelle und daran anschließend möglichst steil ansteigende Intensitätsflanken auf. Um die bestmögliche Bildauflösung zu erzielen, muss die Abregungslichtverteilung der Anregungslichtverteilung so überlagert werden, dass die Nullstelle der Abregungslichtverteilung präzise mit dem Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung zusammenfällt. Ist dies gewährleistet, so wird in dem Beleuchtungszielpunkt die spontane Emission von Fluoreszenzstrahlung in den Außenbereichen der Anregungslichtverteilung unterdrückt, so dass spontan emittiertes Fluoreszenzlicht nur aus einem Bereich um die Nullstelle der Abregungslichtverteilung herum detektiert wird. Wird dieser Probenbereich in einem rasternden Verfahren über eine Vielzahl von Beleuchtungszielpunkten der Probe bewegt, so kann durch die Detektion des durch die Abregungslichtverteilung nicht unterdrückten Fluoreszenzlichtes ein hochaufgelöstes Bild der Probe gewonnen werden.
Ist nicht sichergestellt, dass die Nullstelle der Abregungslichtverteilung mit dem Maximum der Anregungslichtverteilung zusammenfällt, so treten zwei Effekte auf, durch welche die Bildqualität herabgesetzt wird. Zum Ersten verursacht eine Fehljustage in der Überlagerung von Abregungslicht und Anregungslicht eine Verringerung der Bildhelligkeit. Zum Zweiten betont eine solche Fehljustage unerwünschte Nebenmaxima in der Anregungslichtverteilung. Beide Effekte sind in der 1 veranschaulicht, wobei dort der Einfachheit halber von einer eindimensionalen Lichtverteilung in Richtung x ausgegangen wird.
1a zeigt den Fall einer optimalen Überlagerung von Abregungslicht und Anregungslicht. Dabei ist eine Anregungslichtverteilung E durch eine durchgezogene Linie und eine Abregungslichtverteilung D durch eine gestrichelte Linie dargestellt. In diesem optimalen Fall ist die mit N bezeichnete Nullstelle der Abregungslichtverteilung D dem Maximum M der Anregungslichtverteilung E in Richtung x präzise überlagert.
1c zeigt die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt detektierte Fluoreszenzlichtverteilung, die aus der optimalen Überlagerung von Abregungslicht und Anregungslicht gemäß 1a resultiert. Diese Fluoreszenzlichtverteilung zeigt ein intensitätsstarkes und scharfes Maximum, dessen geringe Halbwertsbreite die räumliche Auflösung in Richtung x bestimmt.
Demgegenüber ist in 1b der Fall einer Fehljustage dargestellt, bei der die Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D nicht mit dem Maximum M der Anregungslichtverteilung E zusammenfällt. Aus dieser Fehljustage resultiert eine Fluoreszenzlichtverteilung, die in 1d veranschaulicht ist. Wie im Vergleich zu 1c zu erkennen ist, führt die unpräzise Überlagerung von Abregungslicht und Anregungslicht zu einer deutlichen Verringerung des Maximums der Fluoreszenzlichtverteilung. Zudem treten in der Fluoreszenzlichtverteilung signifikante Nebenmaxima auf, wie in 1d durch den Pfeil angedeutet ist. Solche Nebenmaxima treten in Richtung x an Stellen auf, an denen die Fluoreszenzanregung durch die Abregungslichtverteilung nicht in ausreichendem Maße gelöscht wird.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Lösungen bekannt, die sicherstellen sollen, dass das Anregungsmaximum und die Abregungsnullstelle örtlich zusammenfallen. Ein erstes Verfahren ist in Fachkreisen unter dem Begriff „easy STED“ bekannt und beschrieben in der Druckschrift EP 2 158 475 A2 sowie in Reuss, M., „Simpler STED setups", Ruperto-Carola University of Heidelberg, 2010 (PHD Thesis). Die in diesen Druckschriften offenbarte Grundidee besteht darin, das Anregungslicht und das Abregungslicht durch eine gemeinsame Monomode-Lichtleitfaser auf die Probe zu führen. Dadurch ist sichergestellt, dass sich die beiden Lichtverteilungen in der Probe immer präzise in der gewünschten Weise überlagern. Problematisch ist jedoch, dass zwischen dem Austrittsende der Lichtleitfaser und dem Objektiv eine Phasenmaske angeordnet werden muss, die das Abregungslicht derart beeinflussen soll, dass es in dem Beleuchtungszielpunkt die gewünschte Lichtverteilung aufweist. Im Unterschied zu üblichen STED-Konfigurationen, in denen eine solche Phasenmaske allein im Strahlengang des Abregungslichtes wirkt, tritt bei diesem Verfahren aber auch das Anregungslicht durch die Phasenmaske. Um eine Beeinflussung des Anregungslichtes durch die Phasenmaske weitestgehend zu vermeiden, muss die Phasenmaske in aufwändiger Weise aus unterschiedlichen Materialien gefertigt werden. Dabei muss gewährleistet bleiben, dass die Phasenmaske bei der Wellenlänge des Abregungslichtes die gewünschte Phasenveränderung bewirkt. Somit besteht ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens darin, dass die Phasenmaske speziell für eine bestimmte Kombination von Wellenlängen des Anregungs- und des Abregungslichtes optimiert sein muss. Aus diesem Grund ist der resultierende Mikroskopaufbau unflexibel bezüglich der einsetzbaren Wellenlängen und damit der verwendbaren Fluorophore. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass in der Regel auch das detektierte Fluoreszenzlicht die Phasenmaske passiert und dadurch abgeschwächt wird.
Ein weiteres Verfahren ist in der Druckschrift DE 10 2007 011 305 A1 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird ein Kalibrierpräparat verwendet, um die relative Lage von Anregungslichtverteilung und Abregungslichtverteilung zu vermessen. Mit Kenntnis der relativen Lage kann dann die Überlagerung mittels einer oder mehrerer Stellelemente in einem der separaten Strahlengänge für Anregungs- und Abregungslicht optimiert werden. Eine Besonderheit dieses Verfahrens besteht darin, dass das Kalibrierpräparat nicht anstelle der Probe eingelegt wird, sondern in eine Zwischenbildebene eingeschwenkt wird. Auf diese Weise ist es nicht erforderlich, die Probe zu entfernen, um die Justage zu überprüfen oder zu optimieren. Nachteilig an diesem Verfahren ist jedoch, dass das Kalibrierpräparat in eine Zwischenbildebene eingeschwenkt und das Mikroskop so umkonfiguriert werden muss, dass es im Reflexionsmodus arbeitet. Damit wird dieses Verfahren langsam.
Eine Justage eines STED-Mikroskops ist auch in der Druckschrift DE 10 2013 227 107 A1 offenbart. Bei diesem Verfahren geht es allerdings vorrangig um die Ausrichtung der Phasenmaske im Strahlengang des Abregungslichtes, nicht jedoch um die Überlagerung von Anregungs- und Abregungslicht.
Alle vorgenannten Verfahren haben zudem den Nachteil, dass der Einfluss der Probe auf die relative Lage von Anregungslicht und Abregungslicht nicht berücksichtigt werden kann. So beeinflusst insbesondere die Variation des Brechungsindex innerhalb der Probe die Lage der Lichtverteilungen. Eine Lösung hierfür ist beschrieben in Gould, T. J.; Kromann, E. B.; Burke, D.; Booth, M. J. & Bewersdorf, J. „Auto-aligning stimulated mission depletion microscope using adaptive optics", Opt. Lett., 2013, 38, 1860-1862. Bei diesem Verfahren wird die optimale Überlagerung von Anregungs- und Abregungslicht anhand des hochaufgelösten Bildes selbst bestimmt. Dabei wird auf Grundlage der Bildhelligkeit und der Bildschärfe eine Maßzahl ermittelt, welche die Bildqualität bewertet. In einem Optimierungsprozess wird dann im Strahlengang des Abregungslichtes ein räumlicher Lichtmodulator, kurz SLM, so gesteuert, dass die Maßzahl maximiert wird. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass eine Reihe von Iterationsschritten zur Optimierung nötig sind, da die Maßzahl keine Information über die Richtung enthält, in der die Abregungslichtverteilung bewegt werden muss, um eine optimale Überlagerung zu erreichen.
Zum Stand der Technik wird zudem auf ein Verfahren verwiesen, dass in Fachkreisen als „Time-Gated STED" bekannt und beispielsweise beschrieben ist in Vicidomini, G.; Moneron, G.; Han, K. Y.; Westphal, V.; Ta, H.; Reuss, M.; Engelhardt, J.; Eggeling, C. & Hell, S.W. „Sharper low-power STED nanoscopy by time gating" Nat Methods, 2011, 8, 571-573. Dieses Verfahren arbeitet mit einer gepulsten Laserlichtquelle zur Erzeugung des Anregungslichts und einer Dauer-Laserlichtquelle, d.h. einem kontinuierlich angeregten Laser, zur Erzeugung des Abregungslichts. Dabei berücksichtigt das Verfahren, dass die erfassten Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen eine Information darüber beinhalten, ob die Photonen aus dem Bereich der Nullstelle der Abregungslichtverteilung stammen oder nicht.
Das Dokument WO 2018/042056 A1 offenbart ein Verfahren, bei dem zur korrekten Justierung des Intensitätsmaximums des Anregungslichts relativ zu dem Intensitätsminimum des Abregungslichts zwei Bilder erzeugt werden, die jeweils bei unterschiedlicher Intensität des Abregungslichts erfasst werden.
Zum Stand der Technik wird noch auf die folgenden Patentschriften verwiesen: DE 11 2014 001 147 T5 , US 2019 / 0 235 219 A1 , WO 2018/ 045 014 A1 , WO 2017/ 011 878 A2 , US 2012 / 0 236 398 A1 , US 2015/0 226 950 A1 , WO 2013/ 144 898 A2 und CN 105 043 988 A . Es wird ferner auf die Dokumente Auksorius, E. et al.: Stimulated emission depletion microscopy with a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging In: Optics Lett., Vol. 33, No. 2, 1. Januar 2008, Seiten 113-115 und Bückers, J. et al.: Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. In: Optics Express, Vol. 19, No. 4, 14. Februar 2011, Seiten 3130-3143 verwiesen.
Kurzdarstellung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Fluoreszenz-Rastermikroskop und ein Verfahren zur Abbildung einer Probe unter Verwendung eines solchen Fluoreszenz-Rastermikroskops anzugeben, die es ermöglichen, in einfacher Weise einen räumlichen Versatz zwischen dem Maximum der Anregungslichtverteilung und dem Minimum der Abregungslichtverteilung zu bestimmen.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Es wird ein Fluoreszenz-Rastermikroskop, insbesondere ein STED-Rastermikroskop vorgeschlagen, umfassend eine Anregungslichtquelle, die ausgebildet ist, eine Anregungslichtverteilung zu erzeugen, welche in einer Probe vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzphotonen anregt, und eine Abregungslichtquelle, die ausgebildet ist, eine Abregungslichtverteilung zu erzeugen, welche die durch die Anregungslichtverteilung in der Probe angeregten Fluorophore im Wege einer stimulierten Emission von Fluoreszenzphotonen abregt. Das Fluoreszenz-Rastermikroskop umfasst ferner eine Beleuchtungseinheit, die ausgebildet ist, die Anregungslichtverteilung und die Abregungslichtverteilung zu einer über mehrere Beleuchtungszielpunkte der Probe rasternden Lichtverteilung derart zusammenzuführen, dass ein Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung und ein Intensitätsminimum der Abregungslichtverteilung in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt einander räumlich überlagert sind. Ferner umfasst das Fluoreszenz-Rastermikroskop einen Detektor, der ausgebildet ist, die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit ihrer Ankunftszeiten zu erfassen. Das Fluoreszenz-Rastermikroskop umfasst zudem einen Prozessor, der ausgebildet ist, die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen hinsichtlich ihrer Ankunftszeiten auszuwerten. Der Prozessor ist ferner ausgebildet, auf Basis dieser Auswertung einen ersten Bildpunkt und einen zweiten Bildpunkt zu erzeugen, die den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt repräsentieren. Der Prozessor ist zudem ausgebildet, die ersten Bildpunkte zu einem ersten Probenbild und die zweiten Bildpunkte zu einem zweiten Probenbild zusammenzusetzen. Schließlich ist der Prozessor ausgebildet, an Hand der beiden Probenbilder einen räumlichen Versatz zwischen dem Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung und dem Intensitätsminimum der Abregungslichtverteilung zu bestimmen.
Die hier vorgeschlagene Lösung sieht also die Erzeugung zweier Probenbilder vor, die sich hinsichtlich der detektierten Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen, die zur Erzeugung des jeweiligen Probenbildes herangezogen werden, voneinander unterscheiden. Damit macht sich das beanspruchte Fluoreszenz-Rastermikroskop den Umstand zu Nutze, dass die Verweildauer der Fluorophore im angeregten Zustand, die im weiteren auch als Lebenszeit der Fluorophore bezeichnet wird, davon abhängt, ob sich das jeweilige Fluorophor im Bereich der Nullstelle der Abregungslichtverteilung befindet oder nicht. So ist im Bereich der Nullstelle der Abregungslichtverteilung die Lebenszeit allein durch die Rate der spontanen Emission des Fluorophors bestimmt. Demgegenüber kommt in Bereichen, in denen die Abregungslichtverteilung ungleich Null ist, zur Rate der spontanen Emission noch die Rate der stimulierten Emission hinzu. Dadurch verkürzt sich in den vorgenannten Bereichen die Lebenszeit. Somit beinhalten die durch den Detektor erfassten Ankunftszeiten auch eine Information über die räumliche Verteilung der Fluorophore. Diese Information geht in die beiden erfindungsgemäß erzeugten Probenbilder ein, da die Probenbilder sich hinsichtlich der Ankunftszeiten der ihnen zugeordneten Fluoreszenzphotonen voneinander unterscheiden. Aus dieser Information lässt sich im Ergebnis der räumliche Versatz zwischen dem Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung und dem Intensitätsminimum der Abregungslicht im Wege eines Bildvergleichs bestimmen.
Besonders vorteilhaft ist dabei, dass es der Vergleich der beiden Probenbilder unmittelbar ermöglicht, sowohl die Richtung als auch die Distanz zu bestimmen, in welche die Abregungslichtverteilung relativ zur Anregungslichtverteilung zu bewegen ist, um den Versatz zu kompensieren und somit eine optimale Überlagerung der Lichtverteilungen zu erzielen. Richtung und Distanz des Versatzes sind algorithmisch bestimmbar, so dass nur eine geringe Zahl an Iterationen zur Beseitigung des Versatzes erforderlich sind, möglicherweise sogar nur eine einzige Iteration. Auf diese Weise können die eingangs erläuterten, aus einer fehlerhaften Justage resultierenden Nachteile wie die Verringerung der Bildhelligkeit und die Betonung unerwünschter Nebenmaxima in der Anregungslichtverteilung vermieden werden.
Besonders vorteilhaft ist auch, dass der Versatz zwischen Anregungs- und Abregungslichtverteilung an der abzubildenden Probe selbst und nicht etwa unter Verwendung eines Kalibrierpräparats bestimmt wird. Dadurch ist inhärent schon dem Einfluss Rechnung getragen, den die Probe selbst etwa infolge ihres variierenden Brechungsindex auf die relative Lage von Anregungs- und Abregungslichtverteilung hat.
Da die beiden Probenbilder, die der Bestimmung des räumlichen Versatzes zugrundegelegt werden, die unterschiedlichen Ankunftszeiten der jeweils erfassten Fluoreszenzphotonen repräsentieren und die jeweilige Ankunftszeit wiederum vom Ort des das zugehörige Fluoreszenzphoton emittierenden Fluorophors abhängt, haben die beiden Probenbilder unterschiedliche Auflösungen. Insbesondere weist dasjenige Probenbild, das frühe Fluoreszenzphotonen, d.h. Photonen mit vergleichsweise kurzer Ankunftszeit, repräsentiert, eine geringere Auflösung auf als das Probenbild, das späte Fluoreszenzphotonen repräsentiert, d.h. Photonen mit vergleichsweise langer Ankunftszeit.
Der räumliche Versatz zwischen Anregungs- und Abregungslichtverteilung kann insbesondere anhand zweidimensionaler Probenbilder bestimmt werden. Es ist jedoch ebenso möglich, den Versatz in allen drei Raumrichtungen zu erfassen. In diesem Fall wird anstelle eines zweidimensionalen Probenbildes ein dreidimensionaler Bilderstapel aufgenommen. In allen Fällen enthält das Probenbild bzw. der Bilderstapel, der die frühen Fluoreszenzphotonen repräsentiert, eine Information über den Ort des Maximums der Anregungslichtverteilung, während das Probenbild bzw. der Bilderstapel, der die späten Fluoreszenzphotonen repräsentiert, eine Information über den Ort der Nullstelle der Abregungslichtverteilung beinhaltet. Der Versatz kann in der Weise bestimmt werden, dass die beiden Probenbilder bzw. Bilderstapel beispielsweise über eine Kreuzkorrelation in Beziehung zueinander gebracht werden.
Die hier vorgeschlagene Lösung hat auch den Vorteil, dass zur Bestimmung des räumlichen Versatzes zwischen Anregungs- und Abregungslichtverteilung die Konfiguration des Fluoreszenz-Rastermikroskops nicht geändert werden muss, da die hierfür benötigten Messdaten gleichsam als Nebenprodukt der eigentlichen hochaufgelösten Bildaufnahme generiert werden.
Vorzugsweise ist der Detektor ausgebildet, die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung in Abhängighkeit ihrer Ankunftszeiten zu erfassen. Die Anwendung einer solchen zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung ermöglicht eine besonders präzise Erfassung der Ankunftszeiten. Der Detektor kann jedoch die Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen auch in anderer Weise detektieren, beispielswiese indem er die Lichtstärke, d.h. die einfallenden Fluoreszenzphotonen in mindestens zwei einzelnen aufeinanderfolgenden Zeitintervallen aufsummiert, wobei diese mindestens zwei Intervalle nach einer Startzeit, auf welche die Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen bezogen sind, im Bereich der Fluoreszenzlebensdauer liegen. Die auf das eine Zeitintervall bezogenen Fluoreszenzphotonen sind dann dem einen Probenbild und die auf das andere Zeitintervall bezogene Fluoreszenzphotonen dem anderen Probenbild zugeordnet.
Vorzugsweise umfasst das Fluoreszenz-Rastermikroskop ein Einstellelement, das durch den Prozessor steuerbar ist, die Anregungslichtverteilung und/oder die Abregungslichtverteilung zur Kompensation des räumlichen Versatzes zu beeinflussen. Durch die Verwendung eines solchen Einstellelementes ist es möglich, während der eigentlichen Bildaufnahme automatisch eine präzise Überlagerung von Anregungs- und Abregungslichtverteilung zu erzielen, wodurch eine hohe Abbildungsqualität sichergestellt ist.
Vorzugsweise ist das Einstellelement durch den Prozessor steuerbar, die Anregungslichtverteilung und/oder die Abregungslichtverteilung zur Kompensation des räumlichen Versatzes für verschiedene Regionen eines Bildfeldes individuell zu beeinflussen. Auf diese Weise ist es möglich, die Optimierung der Überlagerung der Lichtverteilungen adaptiv vorzunehmen, sofern gewährleistet ist, dass das Verstellelement mit ausreichend hoher Geschwindigkeit arbeitet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Einstellelement ein im Strahlengang der Abregungslichtverteilung oder im Strahlengang der Anregungslichtverteilung verstellbar angeordnetes Lichtablenkelement. Ein solches Lichtablenkelement kann beispielsweise in Form eines schnellen Kippspiegels ausgeführt sein. Um bei einer dreidimensionalen Korrektur der Überlagerung der Lichtverteilungen auch die axiale Richtung verstellen zu können, ist eine als Einstellelement verstellbare Linse oder eine verstellbares Linsensystem vorstellbar, das dafür sorgt, dass eine der beiden Lichtverteilungen in axialer Richtung gegenüber der anderen Lichtverteilung verstellbar ist. Ebenfalls ist die die Verwendung eines räumlichen Lichtmodulators (SLM: Spatial Light Modulator) denkbar, der diese Aufgabe übernimmt. Hiermit kann in gewissen Grenzen die laterale Ablenkung und gleichzeitig die axiale Position einer Lichtverteilung beeinflusst werden. Zudem kann auch noch die Phaseninformation, die zur Erzeugung der räumlich speziellen Abregungslichverteilung nötig ist, mit diesem Element erzeugt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist mindestens eine der beiden Lichtquellen eine gepulste oder modulierte Laserlichtquelle, wobei der Detektor ausgebildet ist, die Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen in Bezug auf eine Startzeit zu erfassen, die durch einen Lichtpuls oder eine Lichtmodulation der Laserlichtquelle festgelegt ist. Dabei hat die Verwendung einer gepulsten Laserlichtquelle gegenüber einer modulierten Quelle gewisse Vorteile, da die hier betrachteten Lebenszeiten der Fluorophore in der Regel so kurz sind, dass eine sehr schnelle Lichtmodulation erforderlich ist.
Vorzugsweise wertet der Prozesser die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen aus, indem er die Ankunftszeiten mit einem vorbestimmten Schwellwert vergleicht und diejenigen Fluoreszenzphotonen, deren Ankunftszeiten kleiner oder gleich dem vorbestimmten Schwellwert sind, dem ersten Bildpunkt zuordnet und diejenigen Fluoreszenzphotonen, deren Ankunftszeiten größer als der vorbestimmte Schwellwert sind, dem zweiten Bildpunkt zuordnet. In dieser Ausführungsform werden die Fluoreszenzphotonen an Hand eines einzigen Schwellwertes gleichsam in frühe und späte Photonen klassifiziert. Dabei wird auf Basis der frühen Fluoreszenzphotonen das Probenbild mit der geringeren Auflösung und auf Basis der späten Fluoreszenzphotonen das hierzu räumlich versetzte Probenbild mit der höheren Auflösung erzeugt. Grund für die unterschiedlichen Auflösungen ist, dass die Wirkung der Abregungslichtverteilung mit der Dosis, mit der die Fluorophore beaufschlagt werden, zunimmt. Mit anderen Worten ist die Wirkung der Abregungslichtverteilung auf die Fluorophore umso größer, je länger die Probe mit der Abregungslichtverteilung beleuchtet wird. Somit entsprechen die frühen Fluoreszenzphotonen eher einem Fluoreszenzsignal, das man ohne Verwendung des Abregungslichtes erhalten würde, während die späten Fluoreszenzphotonen ein Fluoreszenzsignal repräsentieren, das dem in einem herkömmlichen STED-Verfahren erfassten Signal entspricht. Dementsprechend liefern die frühen Fluoreszenzphotonen hauptsächlich eine Information über die Anregungslichtverteilung, insbesondere deren Maximum, während die späten Fluoreszenzphotonen vor allem die Abregungslichtverteilung, insbesondere deren Nullstelle widerspiegeln.
Die vorstehend erläuterte Ausführungsform, bei der die Fluoreszenzphotonen an Hand eines einzigen Schwellwertes in frühe und späte Fluoreszenzphotonen klassifiziert werden, stellt ein besonders einfaches Verfahren zur Bestimmung des räumlichen Versatzes der Lichtverteilungen dar.
Die Auswertung lässt sich jedoch dahingehend erweitern, dass die Fluoreszenzphotonen nicht nur in zwei Klassen, nämlich in eine frühe Klasse und eine späte Klasse gemäß ihrer Ankunftszeiten am Detektor eingruppiert werden, sondern die tatsächlichen Ankunftszeiten aller Fluoreszenzphotonen individuell berücksichtigt werden. Dazu kann der Prozessor beispielsweise die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen auswerten, indem er eine Modellfunktion, die einen ersten Fitparameter und einen zweiten Fitparameter enthält, an eine durch die erfassten Ankunftszeiten gegebene zeitliche Verteilung der Fluoreszenzphotonen anpasst und dadurch den ersten Fitparameter und den zweiten Fitparameter ermittelt. Der Prozessor erzeugt dann den ersten Bildpunkt auf Basis des ersten Fitparameters und den zweiten Bildpunkt auf Basis des zweiten Fitparameters. Auf diese Weise wird für jeden Bildpunkt eine Modellfunktion an die zeitliche Verteilung der detektierten Fluoreszenzphotonen angepasst.
Die Modellfunktion ist beispielsweise durch folgende Beziehung (1) gegeben: $m (t) = a 0 * exp (- t/t 0) + a 1 * exp (- t/t 1)$
Darin bezeichnet t die Ankunftszeit des jeweiligen Fluoreszenzphotons, t0 eine mittlere Lebenszeit der Fluorophore bei Abwesenheit der Abregungslichtverteilung, t1 eine mittlere Lebenszeit der Fluorophore bei Anwesenheit der Abregungslichtverteilung, a0 den ersten Fitparameter und a1 den zweiten Fitparameter.
Die Fitparameter a0 und a1 werden separat für jeden Beleuchtungszielpunkt bestimmt. Durch die Berücksichtigung der tatsächlichen Ankunftszeiten wird mehr Information genutzt als wenn die Ankunftszeiten lediglich in zwei Klassen eingruppiert werden. Dementsprechend kann der räumliche Versatz auch präziser bestimmt werden.
Vorzugsweise ist die Anregungslichtquelle die gepulste oder modulierte Laserlichtquelle, welche die Startzeit festlegt. Dies hat den Vorteil, dass auch in herkömmlichen STED-Verfahren mit gepulsten Anregungslichtquellen gearbeitet wird. Insoweit müssen deshalb keine Änderungen an schon vorhandenen STED-Konfigurationen vorgenommen werden.
Die Abregungslichtquelle kann als Dauerstrich-Laserlichtquelle oder aber auch als gepulste oder modulierte Laserlichtquelle ausgeführt sein. Die Ausführung als Dauerstrich-Laserlichtquelle hat jedoch den Vorteil, dass eine solche Quelle deutlich günstiger ist als eine gepulste Quelle, insbesondere wenn Letztere wie in üblichen STED-Applikationen mit hohen Laserleistungen arbeiten soll.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, die eine Kombination von gepulster Anregung und Dauerstrich-Abregung oder eine Kombination von gepulster Anregung und gepulster Abregung vorsehen. Es ist jedoch ebenso möglich, eine Kombination von Dauerstrich-Anregung und gepulster Abregung vorzusehen.
Vorzugsweise umfasst das Fluoreszenz-Rastermikroskop eine Verzögerungseinheit, die durch den Prozessor steuerbar ist, die Abregungslichtquelle derart mit der Anregungslichtquelle zeitlich abzustimmen, dass der Lichtpuls oder die Lichtmodulation der Abregungslichtquelle am Ort des jeweiligen Beleuchtungszielpunktes eine vorbestimmte Verzögerung gegenüber dem Lichtpuls oder der Lichtmodulation der Anregungslichtquelle aufweist. Eine solche Ausführungsform kommt insbesondere dann vorteilhaft in Betracht, wenn sowohl die Anregungslichtquelle als auch die Abregungslichtquelle als gepulste oder modulierte Laserlichtquelle ausgeführt sind.
Werden die Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen am Detektor an Hand des weiter oben erwähnten Schwellwertes in zwei Klassen eingeteilt, so entspricht in der vorstehend erläuterten Ausführungsform dieser Schwellwert der Verzögerung, die der Lichtpuls oder die Lichtmodulation der Abregungslichtquelle am Ort des jeweiligen Beleuchtungszielpunktes gegenüber dem Lichtpuls oder der Lichtmodulation der Anregungslichtquelle aufweist.
Insbesondere wenn sowohl die Anregungslichtquelle als auch die Abregungslichtquelle als gepulste Laserlichtquelle ausgeführt sind, ist die Pulslänge der Abregungslichtquelle vorzugsweise größer als die Pulslänge der Anregungslichtquelle. Alternativ oder zusätzlich kann die Pulslänge der Abregungslichtquelle im Bereich der mittleren Lebensdauer des angeregten Zustands der Fluorophore liegt, insbesondere in einem Bereich von 0,1 bis 6,0 ns.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Prozessor ausgebildet sein, an Hand der beiden Probenbilder zusätzlich zu dem räumlichen Versatz eine weitere Fehlanpassung der Abregungslichtverteilung zu bestimmen. In dieser Ausführungsform wird der räumliche Versatz zwischen dem Maximum der Anregungslichtverteilung und der Nullstelle der Abregungslichtverteilung als Spezialfall einer allgemeinen Fehljustage der Abregungslichtverteilung angesehen, die neben dem vorgenannten Versatz weitere Fehlanpassungen berücksichtigt. Ein Beispiel hierfür ist etwa eine Fehlanpassung, die durch eine sphärische Aberration verursacht wird. Letztere kann z.B. dadurch verringert werden, dass die Helligkeiten der beiden Probenbilder mit niedriger bzw. hoher Auflösung miteinander verglichen werden und anhand dieses Vergleichs beispielsweise ein räumlicher Lichtmodulator (oder Spatial Light Modulator, kurz SLM) im Strahlengang des Abregungslichtes oder auch ein Stellglied im Mikroskopobjektiv zur Minimierung der sphärischen Aberration entsprechend angesteuert wird.
Dies ist insbesondere dann von praktischer Relevanz, wenn eine solche sphärische Aberration die Abregungslichtverteilung nachteilig beeinflusst. So hat vor allem die Güte der Nullstelle der Abregungslichtverteilung einen erheblichen Einfluss auf die Abbildungsqualität. Das STED-Verfahren ist nämlich infolge seiner Nichtlinearität darauf angewiesen, dass die Intensität der Abregungslichtverteilung in deren Minimum tatsächlich Null ist und mit Abstand von diesem Minimum steil ansteigt. Somit wirkt sich eine sphärische Aberration im Abregungsstrahlengang deutlich nachteiliger aus als im Anregungsstrahlengang. Dennoch ist es möglich, das Probenbild, das durch den Anregungsstrahl allein erzeugt wird, als Referenz zu nutzen, z.B. als Referenz für die Bildhelligkeit. Dabei ist es durch den Helligkeitsvergleich der beiden Probenbilder nicht erforderlich, ein aufwändig zu bestimmendes Gütemaß heranzuziehen, an Hand dessen erst beurteilt werden muss, wie gut die Korrektion der sphärischen Aberration gelungen ist. Durch die Berücksichtigung zweier Probenbilder ist der Korrektion gleichsam eine Referenz inhärent, was beispielsweise nicht der Fall ist, wenn die Güte der Korrektion an Hand eines einzigen Bildes zu beurteilen ist.
Aus dem vorstehend Erläuterten ergibt sich unmittelbar, dass das Intensitätsminimum der Abregungslichtverteilung vorzugsweise eine Intensitätsnullstelle ist.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Abbildung einer Probe unter Verwendung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops vor. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Erzeugen einer Anregungslichtverteilung, welche in der Probe vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzphotonen anregt; Erzeugen einer Abregungslichtverteilung, welche die durch die Anregungslichtverteilung in der Probe angeregten Fluorophore im Wege einer stimulierten Emission von Fluoreszenzphotonen abregt; Zusammenführen der Anregungslichtverteilung und der Abregungslichtverteilung zu einer über mehrere Beleuchtungszielpunkte der Probe rasternden Lichtverteilung derart, dass ein Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung und ein Intensitätsminimum der Abregungslichtverteilung in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt einander räumlich überlagert sind; Erfassen der aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit ihrer Ankunftszeiten durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung; Auswerten der in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen hinsichtlich ihrer Ankunftszeiten; Erzeugen eines ersten Bildpunktes und eines zweiten Bildpunktes, die den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt repräsentieren, auf Basis dieser Auswertung; Zusammenfassen der ersten Bildpunkte zu einem ersten Probenbild und der zweiten Bildpunkte zu einem zweiten Probenbild; und Bestimmen eines räumlichen Versatzes zwischen dem Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung und dem Intensitätsminimum der Abregungslichtverteilung an Hand der beiden Probenbilder.
Figurenliste
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren erläutert. Darin zeigen:

1 Diagramme zur Veranschaulichung, wie die räumliche Überlagerung einer Abregungslichtverteilung und einer Anregungslichtverteilung die Erfassung eines Fluoreszenzsignals beeinflusst;
2 eine schematische Darstellung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops gemäß einem Ausführungsbeispiel;
3 ein Diagramm, das die räumliche Verteilung von Fluoreszenzsignalen zeigt, die gemäß einem Ausführungsbeispiel frühe Fluoreszenzphotonen und späte Fluoreszenzphotonen repräsentieren;
4 ein Diagramm, das die räumliche Verteilung von Fitparametern zeigt, die gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel zur Auswertung genutzt werden;
5 ein Fluoreszenz-Rastermikroskop gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel; und
6 Diagramme mit Beispielen zur Erläuterung, wie gepulstes Anregungslicht und gepulstes Abregungslicht zeitlich aufeinander abzustimmen sind.

Detaillierte Beschreibung
2 zeigt eine schematische Darstellung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops 100 gemäß Ausführungsbeispiel. Im Folgenden sollen zunächst der grundlegende Aufbau und die grundlegende Funktionsweise des Fluoreszenz-Rastermikroskops 100 kurz umrissen werden, bevor anschließend eine konkrete Realisierung gemäß dem gezeigten Ausführungsbeispiel näher erläutert wird.
Das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100 umfasst eine Anregungslichtquelle 102, die ausgebildet ist, eine Anregungslichtverteilung E der in 1 gezeigter Art zu erzeugen, die in einer Probe 104 vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzlicht anregt. Die Wellenlänge der von der Anregungslichtquelle 102 erzeugten Anregungslichtverteilung E ist somit auf die in der konkreten Anwendung verwendeten Fluorophore ausgelegt.
Das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100 umfasst ferner eine Abregungslichtquelle 106, die ausgebildet ist, eine Abregungslichtverteilung D der in 1 gezeigtne Art zu erzeugen, welche die durch die Anregungslichtverteilung in der Probe 104 angeregten Fluorophore durch stimulierte Emission von Fluoreszenzlicht abregt. Auch die Wellenlänge der von der Abregungslichtquelle 106 generierten Abregungslichtverteilung D ist auf die in der konkreten Applikation verwendeten Fluorophore abgestimmt. Insbesondere ist die Wellenlänge der Abregungslichtverteilung D so zu wählen, dass die in der Probe 104 vorhandenen Fluorophore bei Bestrahlung mit der Abregungslichtverteilung D durch stimulierte Emission zuverlässig veranlasst werden, aus ihrem angeregten Zustand in den Grundzustand zurückzukehren. Zu diesem Zweck weist die Abregungslichtverteilung D vorzugsweise eine Wellenlänge auf, die ungefähr gleich der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts ist, das die Fluorophore beim Übergang aus dem angeregten Zustand in den Grundzustand emittieren.
Das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100 weist ferner eine in 2 allgemein mit 108 bezeichnete Beleuchtungseinheit auf. Letztere ist so ausgebildet, dass sie die Anregungslichtverteilung E und die Abregungslichtverteilung D zu einer überlagerten Lichtverteilung zusammenführt und mit der so generierten Lichtverteilung eine Vielzahl von Beleuchtungszielpunkten der Probe 104 abrastert. Die Zusammenführung erfolgt derart, dass in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt ein Intensitätsmaximum M der Anregungslichtverteilung E und ein Intensitätsminimum N der Abregungslichtverteilung D einander räumlich überlagert sind. Angestrebt wird dabei eine räumliche Überlagerung, wie sie beispielhaft in der eingangs erläuterten 1a dargestellt ist. Da jedoch eine gewisse Fehljustage in der Regel nicht vermeidbar ist, tritt häufig ein nicht vernachlässigbarer räumlicher Versatz zwischen dem Intensitätsmaximum M der Anregungslichtverteilung E und dem Intensitätsminimum N der Abregungslichtverteilung D auf, wie er beispielhaft in 1b dargestellt ist.
Das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100 weist ferner einen Detektor 110 auf, der die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen erfasst. Der Detektor 110 ist darauf ausgelegt, zeitlich schnell variierende Lichtintensitäten zu messen. Somit ist er imstande, die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen im Wege einer zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung zu detektieren.
Schließlich enthält das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100 einen Prozessor 112, der es ermöglicht, den räumlichen Versatz zwischen der Anregungslichtverteilung E und der Abregungslichtverteilung D zu bestimmen. Hierzu wertet der Prozessor 112 die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen hinsichtlich ihrer durch den Detektor 110 bestimmen Ankunftszeiten aus. Auf Basis dieser Auswertung erzeugt der Prozessor 112 dann einen ersten Bildpunkt und einen zweiten Bildpunkt, die beide denselben Beleuchtungszielpunkt repräsentieren. In gleicher Weise geht der Prozessor 112 für sämtliche Beleuchtungszielpunkte vor, die mit der aus der Anregungslichtverteilung E und der Abregungslichtverteilung D zusammengesetzten Lichtverteilung abgerastert werden. Somit generiert der Prozessor 112 eine Vielzahl von ersten Bildpunkten, die er zu einem ersten Probenbild zusammensetzt, und eine Vielzahl von zweiten Bildpunkten, die er zu einem zweiten Probenbild zusammensetzt. Auf diese Weise werden zwei Probenbilder generiert, an Hand derer der Prozessor 112 dann den räumlichen Versatz zwischen dem Intensitätsmaximum M der Anregungslichtverteilung E und dem Intensitätsminimum N der Abregungslichtverteilung D bestimmt.
Der in 2 konkret gezeigte Aufbau stellt lediglich eine beispielhafte Ausführungsform zur Umsetzung des vorstehend erläuterten Funktionsprinzips dar und soll insbesondere das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100 nicht auf diese spezielle Ausführungsform beschränken. In der Ausführungsform nach 2 ist beispielsweise die Anregungslichtquelle 102 als gepulste Laserlichtquelle ausgeführt, während die Abregungslichtquelle 106 eine Dauerstrich-Laserlichtquelle ist. Die beiden Lichtquellen 102, 106 führen ihr Licht jeweils der Beleuchtungseinheit 108 zu, der in dem Ausführungsbeispiel nach 2 sämtliche Mikroskopkomponenten mit Ausnahme der beiden Lichtquellen 102, 106, des Detektors 110 und des Prozessors 112 zuzuordnen sind.
Im Speziellen emittiert die Anregungslichtquelle 102 Anregungslicht L1, das über einen feststehenden Spiegel 114 auf einen ersten wellenlängenselektiven Strahlteiler 116 reflektiert wird. Der erste wellenlängenselektive Strahlteiler 116 reflektiert das Anregungslicht L1 auf einen zweiten wellenlängenselektiven Strahlteiler 118, der das Anregungslicht L1 in Richtung einer Rastervorrichtung 120 transmittiert. Demgegenüber emittiert die Abregungslichtquelle 106 Abregungslicht L2 auf eine Phasenmaske 122, die das Abregungslicht L2 derart beeinflusst, dass die in der Probe 104 aus dem Anregungslicht L1 erzeugte Abregungslichtverteilung D die gewünschte Nullstelle N aufweist. Nach Durchtritt durch die Phasenmaske 122 wird das Abregungslicht L2 an einem durch den Prozessor 112 ansteuerbaren Einstellelement 124, beispielsweise einem beweglichen Kippspiegel auf den zweiten wellenlängenselektiven Strahlteiler 118 reflektiert. Alternativ kann z.B. auch ein SLM als Einstellelement 124 verwendet werden. Außerdem können die Phasenmaske 112 und das Einstellelement 124 auch durch ein- und dasselbe Element, z.B. einen SLM, gebildet sein. Der wellenlängenselektive Strahlteiler 118 reflektiert das Abregungslicht L2 in Richtung der Rastervorrichtung 120, die ebenfalls durch den Prozessor 112 gesteuert wird.
Durch den zweiten wellenlängenselektiven Strahlteiler 118 werden also das Anregungslicht L1 und das Abregungslicht L2 einander überlagert und der Rastervorrichtung 120 zugeführt. Ausgehend von dieser wird die überlagerte Lichtverteilung durch ein Objektiv 126 auf den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt fokussiert, wodurch in diesem Beleuchtungszielpunkt die Lichtverteilung in der gewünschten Form generiert wird, welche die räumliche Überlagerung des Intensitätsmaximums M der Anregungslichtverteilung E und des Intensitätsminimums N der Abregungslichtverteilung D vorsieht. Die Rastervorrichtung 120 sorgt dabei dafür, dass diese überlagerte Lichtverteilung über die Probe 104 bewegt wird, so dass eine Vielzahl von Beleuchtungszielpunkten der Probe 104 mit dieser Lichtverteilung abgerastert werden.
Die mit der überlagerten Lichtverteilung beleuchtete Probe 104 emittiert Fluoreszenzlicht L3, welches über das Objektiv 126 auf die Rastervorrichtung 120 zurückgeführt wird. In dem Ausführungsbeispiel nach 2 ist somit eine sogenannte Descanned-Detektion des Fluoreszenzlichtes L3 vorgesehen. Anschließend passiert das Fluoreszenzlicht L3 nacheinander die beiden wellenlängenselektiven Strahlteiler 118, 116 und fällt auf den Detektor 110, der das Fluorszenzlicht L3 detektiert und ein entsprechendes Ausgangssignal S an den Prozessor 112 ausgibt.
Wie schon erläutert, detektiert der Detektor 110 die das Fluorszenzlicht L3 repräsentierenden Fluoreszenzphotonen im Wege der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung. Dabei erfasst der Detektor 110 die Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen in Bezug auf eine Startzeit, die in dem Ausführungsbeispiel nach 2 durch einen Lichtpuls festgelegt ist, den die als gepulste Laserlichtquelle ausgeführte Anregungslichtquelle 102 emittiert. Hierzu gibt die Anregungslichtquelle 102 ein elektrisches Triggersignal T an den Prozessor 112 aus, aus dem die Zeitpunkte der einzelnen Laserpulse und damit die vorgenannten Startzeiten bestimmt werden können.
Auf Basis der von dem Prozessor 112 ausgewerteten Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen steuert der Prozessor 112 das Einstellelement 124, um die Abregungslichtverteilung D so zu beeinflussen, dass der räumliche Versatz zwischen dem Intensitätsmaximum M der Anregungslichtverteilung E und dem Intensitätsminimum N der Abregungslichtverteilung D kompensiert wird. In dem Ausführungsbeispiel nach 2 befindet sich das Einstellelement 124 im Strahlengang des Abregungslichtes L2. Es ist jedoch ebenso denkbar, ein entsprechendes Einstellelement im Strahlengang des Anregungslichtes E anzuordnen. Das im Ausführungsbeispiel nach 2 als Kippspiegel ausgebildete Einstellelement 124 bietet, sofern es sich schnell genug von dem Prozessor 112 ansteuern lässt, auch die Möglichkeit, die Abregungslichtverteilung D für verschiedene Regionen eines aufgenommenen Bildfeldes in einem adaptiven Prozess individuell zu beeinflussen.
Wie weiter oben erläutert, generiert der Prozessor 112 auf Basis der Auswertung der Fluoreszenzphotonen zwei Probenbilder, an Hand derer sich der räumliche Versatz zwischen Anregungs- und Abregungslichtverteilung bestimmen lässt. In dem Ausführungsbeispiel nach 2 wertet der Prozessor 112 hierzu die in jedem Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen aus, indem er die Ankunftszeiten mit einem vorbestimmten Schwellwert vergleicht. Diejenigen Fluoreszenzphotonen, deren Ankunftszeiten kleiner oder gleich dem vorbestimmten Schwellwert sind, ordnet der Prozessor 112 einem dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt entsprechenden ersten Bildpunkt zu. Demgegenüber ordnet der Prozessor 112 diejenigen Fluoreszenzphotonen, deren Ankunftszeiten größer als der vorbestimmte Schwellwert sind, einem demselben Beleuchtungszielpunkt entsprechenden zweiten Bildpunkt zu. Auf diese Weise erzeugt der Prozessor 112 die beiden Probenbilder, von denen eines frühen Fluoreszenzphotonen und das andere späten Fluoreszenzphotonen zugeordnet ist. Diese Art der Auswertung ist für den eindimensionalen Fall beispielhaft in 3 veranschaulicht.
In 3 zeigt die gestrichelte Linie P1 den Verlauf des aus den frühen Fluoreszenzphotonen generierten Fluoreszenzsignals eines Punktobjekts längs der Richtung x. Demgegenüber zeigt die durchgezogene Linie P2 das zugehörige Fluoreszenzsignal, das aus den späten Fluoreszenzphotonen gewonnen wird. Das Fluoreszenzsignal P2 weist die geringere Halbwertsbreite auf und ist deshalb zur Erzeugung eines hochaufgelösten Probenbildes geeignet.
Die Halbwertsbreiten der Fluoreszenzsignale P1, P2 sind darin begründet, dass das durch die frühen Fluoreszenzphotonen repräsentierte Fluoreszenzsignal P1 noch wenig von der Abregungslichtverteilung D beeinflusst wird. Demgegenüber ist die Abregungslichtverteilung D für die späten Photonen voll wirksam, so dass die Halbwertsbreite des Fluoreszenzsignals P2 auflösungssteigernd verringert ist.
In dem Beispiel nach 3 ist die Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D um einen räumlichen Versatz dx gegenüber dem Maximum M der Anregungslichtverteilung E versetzt. Aus den in 3 gezeigten Fluoreszenzsignalen P1, P2 lassen sich sowohl die absolute Distanz als auch die Richtung des räumlichen Versatzes dx bestimmen.
Hinsichtlich der Darstellung nach 3 ist darauf hinzuweisen, dass die dort gezeigten Fluoreszenzsignale P1, P2 normiert sind. Durch diese Normierung ist der Intensitätsabfall, der durch den räumlichen Versatz dx bedingt und eingangs unter Bezugnahme auf 1d erläutert wurde, herausgerechnet.
Das Beispiel nach 3 stellt eine besonders einfache Art der Auswertung der Fluoreszenzphotonen dar. Eine demgegenüber erweiterte Auswertung ist in der Darstellung nach 4 veranschaulicht. In diesem Beispiel wertet der Prozessor 112 die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen aus, indem er beispielsweise die weiter oben angegebene Modellfunktion gemäß Beziehung (1) an die detektierte zeitliche Verteilung der Fluoreszenzphotonen anpasst und daraus zwei Fitparameter a0, a1 bestimmt. Auf Basis der beiden Fitparameter a0, a1 generiert der Prozessor 112 dann zwei auf denselben Beleuchtungszielpunkt bezogene Bildpunkte und anschließend an Hand einer Vielzahl solcher Bildpunkte die beiden Probenbilder, aus denen der räumliche Versatz dx bestimmt wird.
4 zeigt beispielhaft den Verlauf der beiden Fitparameter a0 und a1 längs der Achse x bei Annahme eines räumlichen Versatzes dx zwischen dem Maximum M der Anregungslichtverteilung E und der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D. Dabei zeigt die durchgezogene Linie den Verlauf des Fitparameters a1 und die gestrichelte Linie den Verlauf des Fitparameters a0. Der Verlauf von a1 ähnelt dem Fluoreszenzsignal P2 in 3, das durch die späten Photonen repräsentiert ist. Dies liegt daran, dass der Fitparameter a1 ein Maß für die Menge an langlebigen Fluorophoren ist und nur diese Fluorophore späte Fluoreszenzphotonen erzeugen können. Demgegenüber ähnelt der Verlauf des Fitparameters a0 dem Fluoreszenzsignal P1 in 3, das durch die frühen Photonen repräsentiert ist. Jedoch weist der Fitparameter a0 im Unterschied dazu an der Stelle der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D ein Minimum auf. Dies liegt daran, dass der Fitparameter a0 ein Maß für die kurzlebigen Fluorophoren ist und am Ort der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D keine kurzlebigen Fluorophore existieren.
In 5 ist ein Fluoreszenz-Rastermikroskop 200 gezeigt, dass eine gegenüber 3 abgewandelte Ausführungsform dargestellt. In dieser abgewandelten Ausführungsform ist nicht nur die Anregungslichtquelle 102, sondern auch die Abregungslichtquelle 106 als gepulste Laserlichtquelle ausgeführt.
Das Ausführungsbeispiel nach 5 verfügt zusätzlich über eine Verzögerungseinheit 228, die durch den Prozessor 112 steuerbar ist. Dabei steuert der Prozessor 112 die Verzögerungseinheit 228 so an, dass die Abregungslichtquelle 106 zeitlich auf die Anregungslichtquelle 102 abgestimmt ist. Insbesondere sorgt die Verzögerungseinheit 228 dafür, dass der jeweilige Lichtpuls der Abregungslichtquelle 106 am Ort des betrachteten Beleuchtungszielpunktes eine vorbestimmte Verzögerung gegenüber dem Lichtpuls der Anregungslichtquelle 102 aufweist.
Um die gewünschte zeitliche Abstimmung zu erzielen, gibt die Anregungslichtquelle 102 das Triggersignal T sowohl an den Prozessor 112 als auch an die Verzögerungseinheit 228 aus. Die Verzögerungseinheit 228 generiert ein gegenüber dem Triggersignal T verzögertes Triggersignal T'. Dabei kann die Verzögerung durch den Prozessor 112 eingestellt werden. Das verzögerte Triggersignal T' wird genutzt, um die Lichtpulse der Abregungslichtquelle 106 mit denen der Anregungslichtquelle 102 zu synchronisieren.
Die Auswertung der in dem Ausführungsbeispiel nach 5 detektierten Fluoreszenzphotonen kann entsprechend dem in den 3 und 4 veranschaulichten Verfahren vorgenommen werden. Im Falle der einfacheren Auswertung, bei der die Fluoreszenzphotonen lediglich in frühe und späte Photonen klassifiziert werden, kann die Verzögerung T' so eingestellt werden, dass sie dem für diese Klassifizierung angewandten Schwellwert entspricht.
Was die zeitliche Abstimmung der Lichtquellen 102, 106 in dem Ausführungsbeispiel nach 5 betrifft, ist zu vermeiden, dass die Lichtpulse derAbregungslichtquelle 106 sehr viel kürzer sind als die Lebenszeit der Fluorophore. Zudem ist es zwar grundsätzlich möglich, aber eher nachteilig, wenn die beiden Lichtpulse zeitlich genau koinzidieren. Denn in diesem Fall findet die stimulierte Emission von Fluoreszenzphotonen im Grunde zeitgleich mit der Anregung statt. Nach der stimulierten Emission haben aber alle noch angeregten Fluorophore dieselbe Lebenszeit, so dass die Fluorophore an Hand der Ankunftszeit ihrer Fluoreszenzphotonen am Detektor 110 nur schwer unterschieden werden können. Dieser Fall ist in 6a gezeigt.
Um diesen Fall zu vermeiden, kann die Verzögerungseinheit 228 in 5 beispielsweise so konfiguriert sein, dass der von der Abregungslichtquelle 106 emittierte Lichtpuls die Probe 104 um einen zeitlichen Abstand dt später erreicht als der Lichtpuls, den die Anregungslichtquelle 102 emittiert. Diese Lösung ist in 6b veranschaulicht. Innerhalb der Zeitspanne dt nach dem Anregungslichtpuls werden die Fluoreszenzphotonen gemäß der Anregungslichtverteilung E emittiert. Anschließend erfolgt die stimulierte Emission durch Abgabe des Abregungslichtpulses. Dabei wird ein Teil der Fluoreszenz gelöscht, so dass bevorzugt Fluorophore im Bereich der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D Photonen emittieren. Auf diese Weise gibt ein Probenbild, das aus den frühen Fluoreszenzphotonen generiert wird, Auskunft über die Position des Maximums M der Anregungslichtverteilung E, während ein Probenbild, das aus den späten Fluoreszenzphotonen generiert wird, Auskunft über die Positon der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D gibt.
Eine weitere Möglichkeit der zeitlichen Abstimmung ist in 6c dargestellt. So kann beispielsweise die Pulslänge des Abregungslichtpulses so eingestellt werden, dass sie im Bereich der mittleren Lebensdauer des angeregten Zustands der Fluorophore liegt, beispielsweise in einem Bereich von 0,1 bis 6,0 ns. In diesem Fall verteilt sich die stimulierte Emission über den Zeitbereich der Pulslänge des Abregungslichtpulses bzw. über den Teil des Abregungslichtpulses, der zeitlich nach dem Anregungslichtpuls die Probe 104 erreicht. Durch diese zeitliche Streckung der stimulierten Emission kann aus den frühen Photonen ein Probenbild gewonnen werden, das sich gemäß der Anregungslichtverteilung E aufbaut, während aus den späten Fluoreszenzphotonen ein Probenbild generiert werden kann, das sich hauptsächlich aus dem Bereich der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D aufbaut.
Die vorstehend erläuterten Ausführungsformen sind rein beispielhaft zu verstehen. Sie sind insbesondere auch nicht auf die konkret beschriebenen Kombinationen einer gepulsten Laserlichtquelle und einer Dauerstrich-Laserlichtquelle beschränkt. Beispielsweise kann das Fluoreszenz-Rastermikroskop 100, 200 auch in einem Betriebsmodus arbeiten, bei der die Anregung mittels einer Dauerstrich-Laserlichtquelle und die Abregung mittels einer gepulsten Laserlichtquelle erfolgt. In einer solchen Ausführungsform wird die Ankunftszeit der Fluoreszenzphotonen am Detektor 110 auf die Pulszeitpunkte des Abregungslichts D bezogen. Die Fluoreszenzphotonen, die kurz nach dem Abregungspuls detektiert werden, enthalten dann eine Information über die Lage der Nullstelle N der Abregungslichtverteilung D. Demgegenüber liefern die Fluoreszenzphotonen, die die kurz vor oder längere Zeit nach dem Abregungspuls detektiert werden, eine Information über die Lage des Maximums M der Anregungslichtverteilung E.
Obwohl einige Aspekte im Rahmen einer Vorrichtung beschrieben wurden, ist es klar, dass diese Aspekte auch eine Beschreibung des entsprechenden Verfahrens darstellen, wobei ein Block oder eine Vorrichtung einem Verfahrensschritt oder einer Funktion eines Verfahrensschritts entspricht. Analog dazu stellen Aspekte, die im Rahmen eines Verfahrensschritts beschrieben werden, auch eine Beschreibung eines entsprechenden Blocks oder Elements oder einer Eigenschaft einer entsprechenden Vorrichtung dar. Einige oder alle Verfahrensschritte können durch (oder unter Verwendung) einer Hardwarevorrichtung ausgeführt werden, wie es zum Beispiel ein Prozessor, ein Mikroprozessor, ein programmierbarer Computer oder eine elektronische Schaltung sein kann. In einigen Ausführungsbeispielen können ein oder mehrere der wichtigsten Verfahrensschritte durch eine solche Vorrichtung ausgeführt werden.
Abhängig von bestimmten Implementierungsanforderungen können Ausführungsbeispiele der Erfindung in Hardware oder Software implementiert werden. Die Implementierung kann mit einem nicht-flüchtigen Speichermedium wie einem digitalen Speichermedium, wie beispielsweise einer Diskette, einer DVD, einem Blu-Ray, einer CD, einem ROM, einem PROM und EPROM, einem EEPROM oder einem FLASH-Speicher, durchgeführt werden, auf dem elektronisch lesbare Steuersignale gespeichert sind, die mit einem programmierbaren Computersystem so zusammenwirken (oder zusammenwirken können), dass das jeweilige Verfahren durchgeführt wird. Daher kann das digitale Speichermedium computerlesbar sein.
Einige Ausführungsbeispiele gemäß der Erfindung umfassen einen Datenträger mit elektronisch lesbaren Steuersignalen, die mit einem programmierbaren Computersystem zusammenwirken können, so dass eines der hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt wird.
Im Allgemeinen können Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung als Computerprogrammprodukt mit einem Programmcode implementiert werden, wobei der Programmcode für die Ausführung eines der Verfahren wirksam ist, wenn das Computerprogrammprodukt auf einem Computer läuft. Der Programmcode kann beispielsweise auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert werden.
Weitere Ausführungsbeispiele umfassen das Computerprogramm zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren, das auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert ist.
Mit anderen Worten, ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist daher ein Computerprogramm mit einem Programmcode zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren, wenn das Computerprogramm auf einem Computer läuft.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist daher ein Speichermedium (oder ein Datenträger oder ein computerlesbares Medium), das ein darauf gespeichertes Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren umfasst, wenn es von einem Prozessor ausgeführt wird. Der Datenträger, das digitale Speichermedium oder das aufgezeichnete Medium sind in der Regel greifbar und/oder nicht übergangslos. Eine weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung, wie hierin beschrieben, die einen Prozessor und das Speichermedium umfasst.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist daher ein Datenstrom oder eine Signalfolge, die das Computerprogramm zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren darstellt. Der Datenstrom oder die Signalfolge kann beispielsweise so konfiguriert werden, dass sie über eine Datenkommunikationsverbindung, beispielsweise über das Internet, übertragen werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel umfasst ein Verarbeitungsmittel, zum Beispiel einen Computer oder eine programmierbare Logikvorrichtung, das konfiguriert oder angepasst ist, um eines der hierin beschriebenen Verfahren auszuführen.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel umfasst einen Computer, auf dem das Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren installiert ist.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel gemäß der Erfindung umfasst eine Vorrichtung oder ein System, das konfiguriert ist, um (zum Beispiel elektronisch oder optisch) ein Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren an einen Empfänger zu übertragen. Der Empfänger kann beispielsweise ein Computer, eine mobile Vorrichtung, eine Speichervorrichtung oder dergleichen sein. Die Vorrichtung oder das System kann beispielsweise einen Dateiserver zum Übertragen des Computerprogramms an den Empfänger umfassen.
In einigen Ausführungsbeispielen kann eine programmierbare logische Vorrichtung (z.B. eine feldprogrammierbare Gatteranordnung, FPGA) verwendet werden, um einige oder alle Funktionalitäten der hierin beschriebenen Verfahren auszuführen. In einigen Ausführungsbeispielen kann eine feldprogrammierbare Gatteranordnung mit einem Mikroprozessor zusammenarbeiten, um eines der hierin beschriebenen Verfahren durchzuführen. Im Allgemeinen werden die Verfahren vorzugsweise von jedem Hardwaregerät durchgeführt.
Bezugszeichenliste

100: Fluoreszenz-Rastermikroskop
102: Anregungslichtquelle
104: Probe
106: Abregungslichtquelle
108: Beleuchtungseinheit
110: Detektor
112: Prozessor
114: Spiegel
116: wellenlängenselektiver Strahlteiler
118: wellenlängenselektiver Strahlteiler
120: Rastervorrichtung
122: Phasenmaske
124: Einstellelement
126: Objektiv
228: Verzögerungseinheit
D: Abregungslichtverteilung
E: Anregungslichtverteilung
N: Intensitätsminimum der Abregungslichtverteilung
M: Intensitätsmaximum der Anregungslichtverteilung
P1: Fluoreszenzsignal
P2: Fluoreszenzsignal
a0: Fitparameter
a1: Fitparameter
dx: Versatz
dt: zeitlicher Abstand
T: Triggersignal
T1: Triggersignal
L1: Anregungslicht
L2: Abregungslicht
L3: Fluoreszenzlicht

Claims

Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) umfassend: eine Anregungslichtquelle (102), die ausgebildet ist, eine Anregungslichtverteilung (E) zu erzeugen, welche in einer Probe (104) vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzphotonen anregt, eine Abregungslichtquelle (106), die ausgebildet ist, eine Abregungslichtverteilung (D) zu erzeugen, welche die durch die Anregungslichtverteilung (E) in der Probe (104) angeregten Fluorophore im Wege einer stimulierten Emission von Fluoreszenzphotonen abregt, eine Beleuchtungseinheit (108), die ausgebildet ist, die Anregungslichtverteilung (E) und die Abregungslichtverteilung (D) zu einer über mehrere Beleuchtungszielpunkte der Probe (104) rasternden Lichtverteilung derart zusammenzuführen, dass ein Intensitätsmaximum (M) der Anregungslichtverteilung (E) und ein Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt einander räumlich überlagert sind, einen Detektor (110), der ausgebildet ist, die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit ihrer Ankunftszeiten zu erfassen, und einen Prozessor (112), der ausgebildet ist, die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen hinsichtlich ihrer Ankunftszeiten auszuwerten, auf Basis dieser Auswertung einen ersten Bildpunkt und einen zweiten Bildpunkt zu erzeugen, die den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt repräsentieren, die ersten Bildpunkte zu einem ersten Probenbild (P1) und die zweiten Bildpunkte zu einem zweiten Probenbild (P2) zusammenzusetzen, und an Hand der beiden Probenbilder (P1, P2) einen räumlichen Versatz (dx) zwischen dem Intensitätsmaximum (M) der Anregungslichtverteilung (E) und dem Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) zu bestimmen.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 1, bei dem der Detektor (110) ausgebildet ist, die aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen durch zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung in Abhängigkeit ihrer Ankunftszeiten zu erfassen.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 1 oder 2, umfassend ein Einstellelement (124), das durch den Prozessor (112) steuerbar ist, die Anregungslichtverteilung (E) und/oder die Abregungslichtverteilung (D) zur Kompensation des räumlichen Versatzes (dx) zu beeinflussen.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 3, bei dem das Einstellelement (124) durch den Prozessor (112) steuerbar ist, die Anregungslichtverteilung (E) und/oder die Abregungslichtverteilung (D) zur Kompensation des räumlichen Versatzes (dx) für verschiedene Regionen eines Bildfeldes individuell zu beeinflussen.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 3 oder 4, bei dem das Einstellelement (124) ein im Strahlengang der Abregungslichtverteilung (D) oder im Strahlengang der Anregungslichtverteilung (E) verstellbar angeordnetes Lichtablenkelement ist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mindestens eine der beiden Lichtquellen (102, 106) eine gepulste oder modulierte Laserlichtquelle ist, und der Detektor (110) ausgebildet ist, die Ankunftszeiten der Fluoreszenzphotonen in Bezug auf eine Startzeit zu erfassen, die durch einen Lichtpuls oder eine Lichtmodulation der Laserlichtquelle festgelegt ist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 6, bei dem der Prozessor (112) die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen auswertet, indem er die Ankunftszeiten mit einem vorbestimmten Schwellwert vergleicht und diejenigen Fluoreszenzphotonen, deren Ankunftszeiten kleiner oder gleich dem vorbestimmten Schwellwert sind, dem ersten Bildpunkt zuordnet und diejenigen Fluoreszenzphotonen, deren Ankunftszeiten größer als der vorbestimmte Schwellwert sind, dem zweiten Bildpunkt zuordnet.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 6, bei dem der Prozessor (112) die in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen auswertet, indem er eine Modellfunktion, die einen ersten Fitparameter und einen zweiten Fitparameter enthält, an eine durch die erfassten Ankunftszeiten gegebene zeitliche Verteilung der Fluoreszenzphotonen anpasst und dadurch den ersten Fitparameter und den zweiten Fitparameter ermittelt, und der Prozessor (112) den ersten Bildpunkt auf Basis des ersten Fitparameters und den zweiten Bildpunkt auf Basis des zweiten Fitparameters erzeugt.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach Anspruch 8, bei dem die Modellfunktion durch folgende Funktion m(t) gegeben ist: $m (t) = a 0 * exp (- t/t 0) + a 1 * exp (- t/t 1)$
, worin t die Ankunftszeit des jeweiligen Fluoreszenzphotons ist, t0 eine mittlere Lebenszeit der Fluorophore bei Abwesenheit der Abregungslichtverteilung (D) ist, t1 eine mittlere Lebenszeit der Fluorophore bei Anwesenheit der Abregungslichtverteilung (D) ist, a0 der erste Fitparameter ist, und a1 der zweite Fitparameter ist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem die Anregungslichtquelle (102) die gepulste oder modulierte Laserlichtquelle ist, welche die Startzeit festlegt.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100) nach einem der Ansprüche 6 bis 10, bei dem die Abregungslichtquelle (106) eine Dauerstrich-Laserlichtquelle ist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (200) nach einem der Ansprüche 6 bis 10, bei dem die Abregungslichtquelle (106) eine gepulste oder modulierte Laserlichtquelle ist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (200) nach Anspruch 12 umfassend eine Verzögerungseinheit (228), die durch den Prozessor (112) steuerbar ist, die Abregungslichtquelle (106) derart mit der Anregungslichtquelle (102) zeitlich abzustimmen, dass der Lichtpuls oder die Lichtmodulation der Abregungslichtquelle (106) am Ort des jeweiligen Beleuchtungszielpunktes eine vorbestimmte Verzögerung gegenüber dem Lichtpuls oder der Lichtmodulation der Anregungslichtquelle (102) aufweist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (200) nach Anspruch 13, bei dem der Schwellwert der Verzögerung entspricht, die der Lichtpuls oder die Lichtmodulation der Abregungslichtquelle (106) am Ort des jeweiligen Beleuchtungszielpunktes gegenüber dem Lichtpuls oder der Lichtmodulation der Anregungslichtquelle (102) aufweist.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (200) nach Anspruch 12, bei dem die Pulslänge der Abregungslichtquelle (106) größer als die Pulslänge der Anregungslichtquelle (102) ist, und/oder bei dem die Pulslänge der Abregungslichtquelle (106) im Bereich der mittleren Lebensdauer des angeregten Zustands der Fluorophore liegt, insbesondere in einem Bereich von 0,1 bis 6,0 ns.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Prozessor (112) ausgebildet ist, an Hand der beiden Probenbilder zusätzlich zu dem räumlichen Versatz (dx) eine weitere Fehlanpassung der Abregungslichtverteilung (D) zu bestimmen.
Fluoreszenz-Rastermikroskop (100, 200) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) eine Intensitätsnullstelle ist.
Verfahren zur Abbildung einer Probe (104) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Rastermikroskops (100, 200) umfassend folgende Schritte: Erzeugen einer Anregungslichtverteilung (E), welche in der Probe (104) vorhandene Fluorophore zur spontanen Emission von Fluoreszenzphotonen anregt, Erzeugen einer Abregungslichtverteilung (D), welche die durch die Anregungslichtverteilung (E) in der Probe (102) angeregten Fluorophore im Wege einer stimulierten Emission von Fluoreszenzphotonen abregt, Zusammenführen der Anregungslichtverteilung (E) und der Abregungslichtverteilung (D) zu einer über mehrere Beleuchtungszielpunkte der Probe (104) rasternden Lichtverteilung derart, dass ein Intensitätsmaximum (M) der Anregungslichtverteilung (E) und ein Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt einander räumlich überlagert sind, Erfassen der aus dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt emittierten Fluoreszenzphotonen in Abhängigkeit ihrer Ankunftszeiten, Auswerten der in dem jeweiligen Beleuchtungszielpunkt erfassten Fluoreszenzphotonen hinsichtlich ihrer Ankunftszeiten, Erzeugen eines ersten Bildpunktes und eines zweiten Bildpunktes, die den jeweiligen Beleuchtungszielpunkt repräsentieren, auf Basis dieser Auswertung, Zusammensetzen der ersten Bildpunkte zu einem ersten Probenbild (P1) und der zweiten Bildpunkte zu einem zweiten Probenbild (P2), und Bestimmen eines räumlichen Versatzes (dx) zwischen dem Intensitätsmaximum (M) der Anregungslichtverteilung (E) und dem Intensitätsminimum (N) der Abregungslichtverteilung (D) an Hand der beiden Probenbilder (P1, P2).